MX2008013354A

MX2008013354A - Moleculas de polinucleotidos aislados que corresponden a alelos mutantes y tipo salvaje del gen de maiz d9, y metodos para usarlas.

Info

Publication number: MX2008013354A
Application number: MX2008013354A
Authority: MX
Inventors: Dwight T Tomes; Shai Lawit; Suman Kundu; Aragula G Rao
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2007-04-18
Publication date: 2008-11-10
Also published as: US20090172841A1; BRPI0710455A2; US20070266458A1; EP2251349A1; CA2649734A1; AR060523A1; WO2007124312A3; US20100269229A1; WO2007124312A2; EP2007799A2; US7557266B2; US20120005786A1

Abstract

Moléculas de polinucleótidos aislados que codifican alelos mutantes y tipo salvaje del gen de maíz D9. Además, en la invención se proveen métodos para modificar el crecimiento de las plantas, que comprenden usar estas moléculas de polinucleótidos aislados, polipéptidos aislados, y plantas, semillas y células transformadas.

Description

MOLÉCULAS DE POLINUCLEÓTIDOS AISLADOS QUE CORRESPONDEN A ALELOS MUT ANTES Y TIPO SALVAJE DEL GEN DE MAÍZ D9, Y MÉTODOS PARA USARLAS REFERENCIAS Esta solicitud de utilidad reivindica el beneficio de las Solicitudes Provisorias de los EEUU Número 60/834024, presentada el 28 de Julio de 2006, y 60/793048, presentada el 19 de Abril de 2006, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la manipulación genética de organismos, particularmente plantas, con genes que controlan el crecimiento y el desarrollo. Además, la invención se relaciona con genes que controlan el crecimiento, incluyendo homólogos y formas mutantes, las proteínas codificadas por ellos, y las plantas transformadas con estos genes. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plantas enanas tienen un impacto importante sobre la agricultura. Las variedades enanas de trigo se usan ampliamente en América del Norte debido a su potencial de vuelco reducido y sus rendimientos elevados. Es posible obtener otros beneficios con el uso de plantas cultivo enanas, incluyendo reducciones en las cantidades de plaguicidas y fertilizantes necesarios, mayores densidades de siembra, y menores costos de laboreo. Teniendo en cuenta las tendencias actuales de incremento de la población humana y reducción del área apropiada para la agricultura, el incremento de la productividad agrícola es y seguirá siendo un desafío de gran importancia. Las plantas de cultivo enanas han sido y seguirán siendo componentes importantes del sistema de producción agrícola actual. Un uso creciente de plantas de cultivo enanas puede contribuir a satisfacer las demandas de producción agrícola en el futuro. Sin embargo, no hay variedades enanas aceptables para el uso comercial para todos los cultivos. Además del uso de plantas enanas para controlar la altura de las plantas, comúnmente se aplican sustancias químicas sintéticas a determinadas especies de importancia económica para reducir el crecimiento. Los reguladores del crecimiento vegetal conocidos como retardantes del crecimiento se usan para reducir la elongación de los tallos en una variedad de cultivos, incluyendo algodón, viñas vitivinícolas, árboles frutales, maníes, trigo y plantas ornamentales, tales como azaleas, crisantemos, hidrangeas, pensamientos y muchas plantas de decoración. Todos los retardantes del crecimiento de uso común son inhibidores de la biosíntesis de giberelina, y limitan el crecimiento del tallo o el brote al reducir la elongación. En los Estados Unidos, el retardante del crecimiento de uso más amplio es el cloruro de mepiquat, que está registrado para usar sobre algodón. Los beneficios atribuidos al uso del cloruro de mepiquat sobre algodón incluyen un rendimiento incrementado, una desfoliación mejorada, una tolerancia al estrés mejorada, una madurez de los cultivos más uniforme, y la posibilidad de realizar una cosecha más temprana. Con anterioridad, el retardante del crecimiento daminozide estaba registrado para usar en los Estados Unidos sobre manzanas, uvas y maníes bajo las marcas registradas ALAR y KYLAR, pero fue eliminado del uso sobre plantas de cultivo debido a riesgos para la salud humana. A pesar de las demandas de los productores agrícolas por un producto para reemplazar el diaminozide, no hay retardantes del crecimiento registrados para usar sobre uvas, árboles frutales y maníes en los Estados Unidos. Sin embargo, el daminozide aún se usa ampliamente en determinadas especies de plantas no alimenticias. El descubrimiento de los mecanismos moleculares que controlan los procesos de crecimiento de las plantas, tales como la división celular y la elongación celular, probablemente contribuya al desarrollo de nuevas variedades de plantas con estatura reducida y nuevos métodos para reducir el crecimiento de las plantas. Estas nuevas variedades de plantas y métodos pueden proporcionarle a los granjeros y los horticultores alternativas benignas para el ambiente para el uso de sustancias químicas sintéticas que demoran el crecimiento. La elongación de las células y los órganos vegetales es uno de los parámetros más críticos del crecimiento y el desarrollo de las plantas. Sin embargo, la regulación de este carácter en las plantas es un proceso bastante complicado, ya que se ve influido por factores externos e internos. El estímulo externo más importante es la luz, con su efecto normalmente represivo o negativo sobre la elongación celular (Quail, P.H. (1995) Science 268:675-680; Kende, ef al., (1997) Plant Cell 9: 1 197-1210). El control interno de la elongación celular es mediado por una cantidad de sustancias químicas, normalmente conocidas como reguladores del crecimiento vegetal u hormonas (Kende, et al. , (1997) Plant Cell 9: 1 197-1210). Entre estas hormonas vegetales clásicas, las auxinas y las giberelinas (GA) promueven la elongación celular, mientras que se ha demostrado que las citoquinas y el ácido abscísico tienen un efecto negativo sobre la elongación celular (Kende, eí al. , (1997) Plant Cell 9: 1 197-1210). Recientemente se identificó otra clase de reguladores del crecimiento vegetal, denominados brasinosteroides, que también promueven dramáticamente el crecimiento de las plantas (Yokota, T. (1997) Trends Plant Sci. 2: 137-143; Azpiroz, et al., (1998) Plant Cell 10:219-230; Choe, eí al., (1998) Plant Cell 10:231 -243). Sin embargo, los mecanismos a través de los cuales actúan las hormonas vegetales, en forma individual o combinada, para controlar la elongación celular, aún no están claros. Una forma de comprender mejor los mecanismos que median en la elongación celular comprende estudiar las mutantes que tienen este aspecto del crecimiento de la planta comprometido (Klee, et al. , (1991 ) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:529-551 ). Se han identificado numerosas mutantes de este tipo para la mayoría de las especies de plantas, incluyendo el maíz, en el que se han caracterizado más de 25 mutaciones de un solo gen que afectan la estatura de la planta (Coe, et al. , (1988) en: Corn & Corn Improvement, G. F. Sprague (editor) Madison, Wl; Sheridan, W.F. (1988) Annu. Rev. Genet. 22:353-385). Se considera que estas mutantes enanas están relacionadas con el GA, principalmente debido a que el GA es la única fitohormona cuya función en la regulación de la altura del maíz ha sido establecida de forma convincente (Phinney, et al. , (1985) Curr. Top. Plant Biochem. Physiol. 4:67-74; Fujioka, eí al. , (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:9031 -9035). En esta colección de mutantes de maíz se han encontrado ambos tipos de mutantes, las que responden al GA y las que no responden al GA. Si bien se han clonado genes para una cantidad de mutantes que responden al GA, y se ha descubierto que participan en la biosíntesis del GA (Bensen, et al. , (1995) Plant Ce// 7:75-84; Winkler, et al. , (1995) Plant Cell 7: 1307-1317), el conocimiento sobre la naturaleza de los defectos en las plantas de maíz mutantes que no responden al GA es menor. Las proteínas DELLA son elementos clave de la cascada de transduccíón de señales de la giberelina (GA), ya que actúan como reguladores negativos de la respuesta ante el GA que son degradados en presencia de concentraciones elevadas de GA (Silverstone, eí al. , (2001 ) Plant Cell 10: 155-169). Los dominios de las proteínas DELLA son particularmente interesantes, debido al fenotipo enano insensible a la giberelina de sus mutantes con ganancia de función, que fueron parcialmente responsables de la "Revolución verde" merced a su incremento en el índice de cosecha del trigo (Peng, et al., (1999) Nature 400:256- 261 ). Las mutaciones en el dominio N-terminal DELLA comúnmente producen un fenotipo insensible al GA dominante al incrementar en gran medida la estabilidad de este regulador negativo de la transducción de señales del GA (Silverstone, et al. , (2001 ) Plant Cell 10:155-169; Gubler, er a/. , (2002) Plant Physiol. 129:191 -200; Itoh, et al., (2002) Plant Cell 14:57-70). Recientemente, Griffiths, et al., ((2006) Plant Cell 18:3399-3414) demostraron que las regiones N-terminales I y II son necesarias para la interacción de las proteínas DELLA con GID1 a de Arabidopsis. Las mutaciones C-terminales del dominio GRAS conservado típicamente conducen a la pérdida de función (Dill, et al., (2004) Plant Cell 16:1392-1405), un fenotipo de respuesta de crecimiento ante el GA, con la excepción notable de una muíante de Brassica rapa identificada recientemente, Brrga1-d (Muangprom, et al., (2005) Plant Physiol. 137:931 -938) y la muíante de cebada sln lc (Gubler, et al., (2002) Plant Physiol. 129:191 -200). Para seguir a la par con la demanda de producción agrícola creciente, se necesiían nuevos blancos para modificar genéticamente plantas agrícolas y mejorar sus caracterísíicas agrícolas. El aislamiento y la caracíerización molecular de genes que codifiquen proteínas que participen en el control de la división celular y la elongación en plantas proporcionará nuevos blancos que podrán ser manipulados por los científicos agrícolas. BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para la expresión en plañías de genes que codifican formas íipo salvaje y variantes de la proteína DELLA, codificada por el gen de Zea mays D9 (Zm-D9). Las composiciones comprenden moléculas de polinucleótidos aislados que codifican formas íipo salvaje y variantes de proteínas Zm-D9. Además, las composiciones comprenden moléculas de polinucleótidos aislados del gen D9 de Zea mays. Las moléculas de polinucleótidos de la invención son úíiles, por ejemplo, para transformar plantas para obtener la expresión con preferencia tisular o constitutiva de formas tipo salvaje y variantes de proteínas Zm-D9, para la supresión antisentido del gen Zm-D9, y para aislar moléculas de polinucleótidos homólogos que codifican proteínas DELLA. Estas moléculas de polinucleótidos pueden usarse en métodos para alterar el crecimiento de las plantas, particularmente el crecimiento del tallo y las raíces de las plantas, más particularmente, para reducir o incrementar la altura de las plantas. En una realización de la invención, las moléculas de polinucleótidos pueden usarse para producir plantas enanas. Se proporcionan cassettes de expresión que comprenden las moléculas de polinucleótidos de la invención. Además, se proporcionan plantas transformadas, tejidos vegetales, células vegetales y semillas de éstas. Se proporcionan proteínas aisladas codificadas por las moléculas de polinucleótidos de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En la Figura 1 se ilustran plantas que no responden a GA3 (izquierda) y plantas que responden a GA3 (derecha), que son segregantes del alelo Zm-D9 MUT1 . En la Figura 2 se ¡lustra la localización cromosómica de los genes Dwarf 8 y Dwarf 9 de maíz. La PCR analítica de líneas de adición de avena demostró que el gen Zm-D9 probable efectivamente está localizado en el cromosoma 5 de maíz, como se esperaba a partir del mapeo genético. Se descubrió que este gen estaba en una localización distinta del producto de PCR del control positivo Zm-D8, del que se sabe que está en el cromosoma 1 . En las Figuras 3A-3F se ilustra la localización cromosómica de proteínas DELLA de maíz fusionadas a AC-GFP1 (GFP de Aequorea coerulescens). La Figura 3A es un control DSRED (proteína fluorescente roja de Discosoma sp.) EXPRESS. La Figura 3B es Zm-D8:ACGFP1 . La Figura 3C es una combinación de A y B. La Figura 3D es un control DSRED EXPRESS. La Figura 3E es Zm-D9:ACGFP1 . La Figura 3F es una combinación de D y E. Las barras verdes indican 10 µ?? en las imágenes. En la Figura 4 se ilustra el ecotipo de plantas de Arabidopsis thaliana Columbia T2, 56 días después de la germinación, que comprende los ADNc de DELLA de maíz dirigidos por el promotor MS-S2a. De izquierda a derecha: MS-S2A PRO::GUS; MS-S2A PRO::ZM-D8; MS-S2A PRO: :ZM-D9; MS-S2A PRO::MUT1 ZM-D9; MS-S2A PRO::ZM-D8 MPL; y MS-S2A PRO: :ZM-D8 MUT. En la Figura 5 se ilustran flores representativas disectadas a partir de plantas de Arabidopsis thaliana T1 , que comprenden los ADNc de DELLA de maíz dirigidos por el promotor MS-S2a. Se retiraron dos pétalos y dos sépalos de las flores anteriores. La Figura 6 es un alineamiento de secuencias de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de las proteínas Zm-D9 (SEQ I D N° 2) y MUT1 Zm-D9 (SEQ ID N° 4). Las Figuras 7a - 7d son un alineamiento de múltiples secuencias de aminoácidos de proteínas DELLA de maíz (ZM), Arabidopsis thaliana (AT), Brassica rapa (BR), Hordeum vulgare (HV), Oryza sativa (OS) y trigo (rht-D1 a/b). Las Figuras 8a -8c son un alineamiento de secuencias de nucleótidos de las secuencias de nucleótidos de Zm-D9 (SEQ ID N° 1 ) y UT1 Zm-D9 (SEQ ID N° 3). Las Figuras 9a - 9s son un alineamiento de múltiples secuencias de nucleótidos que corresponden a las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas DELLA de maíz (ZM), Arabidopsis thaliana (AT), Brassica rapa (BR), Hordeum vulgare (HV), Oryza sativa (OS) y trigo (rht-D1 a/b).

La Figura 10 representa los niveles de expresión relativa (en ppm) de los genes d8 y d9 en 32 tejidos y etapas de desarrollo diferentes de maíz, obtenidos con el sistema Lynx MPSS (Brenner, et al. , (2000) PNAS 97: 1665-1670 y Brenner, ef a/. , (2000) Nat Biotechnol 8:630-634). Las líneas verticales dividen la tabla en función del órgano del que derivaron las muestras. En las Figuras 1 1 a - 1 1 b se presentan mapas de clones de ingreso parciales d9 y D9, que representan las quimeras de intercambio de dominio producidas. En A se ¡lustran mapas parciales de los clones de ingreso d9 y D9, y se señalan las diferencias entre los aminoácidos codificados por cada región. La secuencia de aminoácidos de d9 INDEL es SGSGSGQPTDASPPA (SEQ ID N° 7). La secuencia de aminoácidos de MUT1 D9 INDEL es QPTDASSPAAG (SEQ ID N° 8). En B se ilustran mapas parciales de quimeras basadas en el alelo d9 (regiones blancas) con segmentos de MUT1 D9 en gris. En C se ilustran mapas parciales de quimeras basadas en el alelo MUT1 D9 (regiones grises) con segmentos de d9 en blanco. En la Figura 12 se detallan datos morfométricos de plantas T2 de Arabidopsis en la etapa de crecimiento 8.00 (Boyes, er a/. , (2001 ) Plant Cell 1 3: 1499-1510), que expresan ADNc de alelos dS y d9 de ocurrencia natural a partir del promotor MS-S2A. Las letras en superíndices indican grupos que no presentan diferencias significativas unos de otros, de acuerdo con un análisis de LSD con un nivel de confianza de 95%. Los datos se recolectaron a partir de un promedio de ocho réplicas de cuatro eventos de transformación independientes. En la Figura 13 se presentan datos sobre la transición al florecimiento en plantas T2 de Arabidopsis y GS3xGaspe Flint T0 de maíz. Las letras en superíndices indican grupos que no presentan diferencias significativas unos de otros, de acuerdo con un análisis de LSD con un nivel de confianza de 95%. Los datos se recolectaron a partir de un promedio de ocho réplicas de cuatro eventos de transformación independientes. Los datos de maíz se recolectaron a partir de una única réplica de 25 eventos de transformación independientes para cada construcción. En la Figura 14 se detallan los datos morfométricos y de tiempo de florecimiento para el intercambio de dominios d9/D9 en Arabidopsis T1 . Vale destacar que las letras en superindices indican grupos que no presentan diferencias significativas unos de otros, de acuerdo con un análisis de LSD con un nivel de confianza de 95%. ALT = alterado; las relaciones fenotípicas entre los alelos se cambian al intercambiar polimorfismos, de modo que las diferencias no son más significativas. REV = invertido; el polimorfismo produce una inversión de significación estadística de la relación fenotípica entre los alelos. Se usó el promotor MS-S2A para dirigir todas las secuencias codificantes (CDS) anteriores. Los datos se recolectaron a partir de un promedio de 16,3 eventos de transformación independientes por construcción. Se midió el diámetro de la roseta, la altura, la longitud del fruto y el ancho del fruto en la etapa de crecimiento principal 8.00 (Boyes, et al., (2001 ) Plant Cell 13: 1499-1510). Los días hasta el florecimiento y las hojas en roseta se midieron en la etapa de crecimiento principal 5.10. LISTADO DE SECUENCIAS Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos indicadas en el listado de secuencias adjunto se detallan usando abreviaturas con letras convencionales para las bases de nucleótidos y un código de tres letras para los aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos satisfacen los lineamientos convencionales de inicio en el extremo 5' de la secuencia y progresión hacia el extremo 3' (es decir, de izquierda a derecha en cada línea). Se índica solamente una cadena da cada secuencia de ácido nucleico, pero se interpreta que la cadena complementaria está incluida en cualquier referencia a la cadena ilustrada. Las secuencias de aminoácidos se presentan de acuerdo con los lineamientos convencionales, con el inicio en el extremo amino de la secuencia y la progresión hacia el extremo carboxilo (es decir, de izquierda a derecha en cada linea). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos indicadas en el listado de secuencias adjunto se detallan usando abreviaturas con letras convencionales para las bases de nucleótidos y un código de tres letras para los aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos satisfacen los lineamientos convencionales de inicio en el extremo 5' de la secuencia y progresión hacia el extremo 3' (es decir, de izquierda a derecha en cada línea). Se indica solamente una cadena da cada secuencia de ácido nucleico, pero se interpreta que la cadena complementaria está incluida en cualquier referencia a la cadena ilustrada. Las secuencias de aminoácidos se presentan de acuerdo con los lineamientos convencionales, con el inicio en el extremo amino de la secuencia y la progresión hacia el extremo carboxilo (es decir, de izquierda a derecha en cada línea). En SEQ ID N° 1 se detalla la secuencia codificante completa del alelo tipo salvaje del gen Zm-D9. En SEQ ID N° 2 se detalla la secuencia de aminoácidos Zm-D9 codificada por SEQ ID N° 1 . En SEQ ID N° 3 se detalla la secuencia codificante completa del alelo tipo salvaje del en Zm-D9, menos el codón de detención. Los nucleótidos 1 -1875 de SEQ ID N° 3 corresponden a los nucleótidos 1 -1875 de SEQ ID N° 1 . Si se lo desea, puede agregarse un codón de detención al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N° 3, o a cualquier otra secuencia codificante que carezca de un codón de detención. Estos codones de detención incluyen, por ejemplo, TAA, TAG, y TGA. En SEQ ID N° 4 se detalla la secuencia codificante completa del alelo muíante (MUT1 ) del gen Zm-D9. En SEQ ID N° 5 se detalla la secuencia de aminoácidos Zm-D9 codificada por SEQ ID N° 4. En SEQ ID N° 6 se detalla la secuencia codificante completa del alelo mutante (MUT1 ) del gen Zm-D9, menos el codón de detención. Los nucleótidos 1 -1866 de SEQ ID N° 6 corresponden a los nucleótidos 1 -1866 de SEQ ID N° 4. La secuencia de aminoácidos de INDEL d9 es SEQ ID N° 7. La secuencia de aminoácidos de INDEL D9 es SEQ ID N° 8. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para modificar el crecimiento de las plantas. Las composiciones incluyen moléculas de polinucleótidos aislados que comprenden las secuencias codificantes completas de los alelos tipo salvaje y mutantes del gen de maíz D9, que en la presente documentación se conoce como gen Zm-D9. Aunque Zm-D9 ha sido descripto en términos genéticos (Winkler y Freeling (1994) Plant 193:341 -348), el gen no ha sido caracterizado con anterioridad a nivel molecular. Además, en la invención se proveen las secuencias de aminoácidos de las proteínas DELLA codificadas por los alelos tipo salvaje y mutantes de Zm-D9. Los métodos de la presente invención comprenden transformar plantas con moléculas de polinucleótidos que codifican formas tipo salvaje y variantes de la proteína de Zea mays DELLA, codificada por Zm-D9. Las moléculas de polinucleótidos de la presente invención son útiles para modificar el crecimiento del tallo o el vástago de las plantas, con el fin de producir una planta transformada con un tallo o un vastago modificado. Más particularmente, las moléculas de polinucleótidos son útiles para disminuir o incrementar la altura del tallo o el vástago, con el fin de obtener plantas con una altura o una estatura disminuida o incrementada. Las moléculas de polinucleótidos también pueden usarse para modificar la arquitectura de la raíz y otros caracteres agrícolas de formas deseables en las plantas transformadas. Estos caracteres agrícolas incluyen, sin limitaciones, la puesta de semillas, la cantidad de semillas, el rendimiento de cosecha, la longitud de las mazorcas, la tolerancia a la sequía, la eficiencia del uso de agua, la eficiencia del uso de nitrógeno, la resistencia al vuelco, el área foliar, la acumulación de nitrógeno, la capacidad fotosintética y la distribución de carbono y nitrógeno, por consiguiente, en la presente invención se proveen plantas transformadas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas. Además, las moléculas de polinucleótidos pueden usarse en la construcción de cassettes de expresión para la transformación subsiguiente de plantas y células vegetales de interés, como sondas para aislar otros genes similares a D9, como marcadores moleculares, y semejantes. Las composiciones de la invención incluyen las moléculas de polinucleótidos Zm-D9 nativas tipo salvaje y MUT1 , y variantes y fragmentos de éstas. Además, las composiciones incluyen las secuencias de aminoácidos respectivas de las moléculas de polinucleótidos Zm-D9 nativas tipo salvaje y MUT1 , y también fragmentos y variantes de estas secuencias de aminoácidos. Las secuencias de Zm-D9 se indican en SEQ ID N° 1 -6. Las secuencias de nucleótidos, o las secuencias antisentido correspondientes, pueden usarse para modular la expresión de las proteínas Zm-D9 en una planta o una célula vegetal. Es decir, las secuencias codificantes pueden usarse para incrementar la expresión, mientras que las secuencias antisentido pueden usarse para disminuir la expresión. Se sabe que las proteínas DELLA regulan la elongación de las células vegetales, y pueden usarse para modificar, por ejemplo, la elongación de las células vegetales, la altura de las plantas y la elongación de las raíces. Véanse Itoh, ef al. , (2002) Plant Cell 14:57-70; Achard, ef al. , (2003) Plañí Cell 15:2816-2825; y Fu y Harberd (2003) Nature 421 :740-743; todos los cuales se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Por consiguiente, las moléculas de polinucleótidos de la invención pueden usarse en métodos para modificar el crecimiento de una planta. En una realización de la invención, las moléculas de polinucleótidos de la invención pueden usarse en métodos para modificar el crecimiento de las plantas. Con este fin, las moléculas de polinucleótidos de la invención pueden utilizarse en cassettes de expresión o construcciones de polinucleótidos unidas operativamente a cualquiera de una variedad de promotores vegetales. Los aspectos del crecimiento de las plantas que pueden ser afectados por los métodos de la invención incluyen, sin limitaciones, uno o más de los siguientes: altura de la planta; altura del tallo o el vastago; actividad metabólica del tallo o el vástago de la planta, uno o más aspectos de la arquitectura de la raíz (por ejemplo, profundidad de la raíz, ángulo de la raíz, ramificación de la raíz, cantidad de ápices de la raíz, diámetro de los nodos de la raíz, volumen de los nodos de la raíz, actividad metabólica de la raíz); tamaño, forma y cantidad de células y órganos; velocidad de división celular; velocidad de elongación celular; velocidad de crecimiento de la planta, sus órganos, sus tejidos y sus células; cronograma y localización del inicio de los órganos; expectativa de vida; y semejantes.

Los métodos de la invención comprenden la transformación de plantas con las moléculas de polinucleótidos de la invención para reducir el crecimiento de las plantas. En una realización de la invención, se transforma una planta con una molécula de polinucleótido Zm-D9 MUT1 , unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en una planta. Esta molécula de polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos detallada SEQ ID N° 4 ó 6, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido detallado en SEQ ID N° 5, o un fragmento o una variante de cualquiera de estas moléculas de polinucleótidos que codifica un polipéptido que retiene sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido MUT1 Zm-D9 nativo. Es posible producir una planta de estatura reducida, una planta enana, expresando esta molécula de polinucleótido MUT1 Zm-D9 en una planta. Por consiguiente, los métodos de la invención pueden usarse para producir variedades enanas de plantas de cultivo. Las plantas de cultivo enanas que tienen características agrícolas mejoradas, tales como, por ejemplo, un menor potencial de vuelco, una mayor eficiencia de uso de agua, un ciclo vital reducido, una mayor eficiencia de cosecha y un mayor rendimiento por unidad de área, se obtienen con estos métodos. "Enano" denota atípicamente pequeño. Una "planta enana" denota una planta atípicamente pequeña. En general, esta "planta enana" tiene una estatura o una altura que se halla reducida respecto de la de una planta típica en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o más. En general, pero no en forma exclusiva, esta planta enana se caracteriza por una longitud reducida del tallo, el vástago o el tronco, en comparación con la planta típica.

La invención abarca composiciones de moléculas de polinucleótidos o proteínas aisladas o sustancialmente purificadas. Una molécula de polinucleótido o una proteína "aislada" o "purificada", o una porción con actividad biológica de ésta, está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que habitualmente acompañan o interactúan con la molécula del polinucleótido o la proteína, tal como se los halla en su entorno natural. Por consiguiente, una molécula de polinucleótido o una proteína aislada o purificada está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando es producida mediante técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando es sintetizada con medios químicos. Preferiblemente, una molécula de polinucleótido "aislada" está libre de las secuencias (prefenblemente las secuencias que codifican proteínas) que habitualmente rodean los polinucleótidos (es decir, las secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el ADN genómico del organismo del cual deriva la molécula de polinucleótido. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de polinucleótido aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que habitualmente rodean el polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la cual deriva la molécula de polinucleótido. La proteína que está substancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas que poseen menos que un 30%, 20%, 10%, 5% o 1 % (en peso seco) de proteínas contaminantes. Cuando la proteína de la invención, o una porción con actividad biológica de ésta, es producida de forma recombinante, el medio de cultivo preferiblemente representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% o 1 % (en peso seco) de precursores químicos, o de sustancias químicas que no son las proteínas de interés.

Los fragmentos y las variantes de las moléculas de polinucleótidos descriptos, y las proteínas codificadas por éstos, también están comprendidos en la presente invención. El término "fragmento" denota una porción de la secuencia de la molécula de polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos, y por ende, de la proteína codificada por éste. Los fragmentos de una molécula de polinucleótido pueden codificar fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica de las proteínas Zm-D9 tipo salvaje y MUT1 descriptas en la presente documentación, por lo que retienen la actividad de represión de la respuesta a la giberelina. Como alternativa, los fragmentos de la molécula de polinucleótido que son de utilidad como sondas de hibridización en general no codifican fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica. Por ende, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden tener una longitud que varía entre al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta incluir la molécula de polinucleótido completa que codifica las proteínas de la invención. A menos que se lo indique de otro modo o que resulte obvio a partir del contexto, el término "Zm-D9" incluye moléculas de polinucleótidos que comprenden los alelos tipo salvaje y MUT1 del gen Zm-D9, y fragmentos y variantes de éstos. Preferiblemente, estos fragmentos y variantes de los alelos tipo salvaje y MUT1 del gen Zm-D9 codifican proteínas Zm-D9 que retienen la actividad biológica de una proteína Zm-D9 tipo salvaje o MUT1 completa, como se describe en la presente documentación. El término "Zm-D9" también puede usarse en la presente documentación para hacer referencia a las proteínas codificadas por las moléculas de polinucleótidos Zm-D9 de la presente invención. Un fragmento de una molécula de polinucleótido Zm-D9 que codifica una porción con actividad biológica de una proteína Zm-D9 de la invención codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 ó 600 aminoácidos contiguos, o hasta la cantidad total de aminoácidos presentes en una proteina Zm-D9 tipo salvaje o MUT1 completa de la invención (por ejemplo, 625 y 622 aminoácidos para SEQ ID N° 2 y 5, respectivamente). En general, no es necesario que los fragmentos de una molécula de polinucleótido Zm-D9 que son útiles como sondas de hibridización o cebadores de PCR codifiquen una porción con actividad biológica de una proteína Zm-D9. Por consiguiente, un fragmento de una molécula de polinucleótido Zm-D9 puede codificar una porción con actividad biológica de una proteína Zm-D9 tipo salvaje o MUT1 , o puede ser un fragmento que puede usarse como sonda de hibridización o cebador de PCR, de acuerdo con los métodos que se describirán más adelante. Es posible preparar una porción con actividad biológica de una proteína Zm-D9 aislando una porción de la molécula de polinucleótido Zm-D9 de la invención, la proteína Zm-D9 (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro), y evaluando la actividad de la porción de Zm-D9 de la proteína Zm-D9. Las moléculas de polinucleótidos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos Zm-D9 comprenden al menos 16, 20, 50, 75, 100, 1 50, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1 100, 1200, 1 300, 1400 1500, 1600, 1700, 1800 ó 1850 nucleótidos contiguos, o hasta la cantidad total de nucleótidos presentes en un polinucleótido Zm-D9 completo descripto en la presente documentación (por ejemplo, 1878, 1875, 1869 y 1866 nucleótidos para SEQ ID N° 1 , 3, 4 y 6, respectivamente). El término "variantes" denota secuencias sustancialmente similares. Para las moléculas de polinucleótidos, una vanante comprende la supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro de la molécula de polinucleótido nativo y/o la sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en dicho polinucleótido nativo. Tal como se lo utiliza en la presente documentación, una molécula de polinucleótido o un polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos natural, respectivamente. Para las moléculas de polinucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos Zm-D9 de la invención. Las vahantes alélicas naturales como las recién mencionadas pueden ser identificadas utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de hibridación que se describirán más adelante. Las variantes de las moléculas de polinucleótidos también incluyen polinucleótidos derivados por medios sintéticos, tales como aquellos generados, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a sitios específicos, pero que aún codifican una proteína Zm-D9 de la invención. En general, las variantes de una molécula de polinucleótido particular de la invención tendrán al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con dicha molécula de polinucleótido particular, determinada con los programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descriptos en otra parte la presente documentación. Las variantes de una molécula de polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también puede evaluarse mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una variante de la molécula de polinucleótido y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Por ende, por ejemplo, se describe una molécula de polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con un porcentaje de identidad de secuencia dado con el polipéptido de SEQ ID N° 2 y/o 5. El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos cualesquiera puede calcularse usando los programas de alineamiento de secuencia y los parámetros descriptos en otra parte de la presente documentación. Cuando se evalúa cualquier par dado de moléculas de polinucleótidos de la invención comparando el porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos que codifican, el porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia. El término "variante" de proteína significa una proteína derivada de la proteína nativa por supresión o adición de uno o varios aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína nativa y/o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las variantes de las proteínas incluidas en la presente invención tienen actividad biológica, es decir, siguen teniendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la actividad de la proteína Zm-D9 tipo salvaje o MUT1 descripta en la presente documentación. Dichas variantes pueden ser el resultado, por ejemplo, de polimorfismos genéticos o de la manipulación humana. Las variantes con actividad biológica de la proteína Zm-D9 nativa de la invención tendrán al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, determinada con los programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descriptos en otra parte de la presente documentación. Una vahante con actividad biológica de una proteína de la invención puede diferir de dicha proteína por tan poco como 1 - 1 5 residuos de aminoácidos, tan poco como 1 -10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o aún 1 residuo de aminoácido.

Las proteínas de la invención pueden alterarse de varias maneras, incluyendo substituciones, supresiones, cortes e inserciones de aminoácidos. Los métodos para dichas manipulaciones con conocidos en general en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos y los fragmentos de las proteínas Zm-D9 pueden prepararse realizando mutaciones en el ADN. Los métodos para llevar a cabo la mutagénesis y las alteraciones de los polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kunkel (1 985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel ef al. (1987) Métodos in Enzymol. 154: 367-382; Patente de los EEUU N° 4873192; Walker y Gaastra, editores (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York), y las referencias citadas en dichas publicaciones. Los lineamientos sobre las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se pueden consultar en el modelo de Dayhoff, eí al., (1978) Atlas de Protein Secuencia y Structure {Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporada en la presente documentación a modo de referencia. Las sustituciones conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido por otro con propiedades similares, son óptimas. Por consiguiente, los genes y moléculas de polinucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias naturales como las formas mutantes. Asimismo, las proteínas de la invención abarcan proteínas naturales, y también variaciones y formas modificadas de éstas. Estas variantes seguirán teniendo la actividad de Zm-D9 tipo salvaje o MUT1 . Obviamente, las mutaciones que se efectuarán en el ADN que codifica las variantes no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura, y en términos óptimos, no crearán regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Véase, la Publicación de la Solicitud de Patente EP N° 75444 No se espera que las supresiones, las inserciones y las sustituciones en las secuencias de proteínas abarcadas en la presente documentación produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, la supresión o la inserción antes de producirla, aquél entrenado en la técnica comprenderá que el efecto será evaluado por medio de ensayos de monitoreo de rutina. Vale decir, la actividad puede evaluarse a partir de los cambios en la morfología en las plantas transgénicas o sus raíces, tal como, por ejemplo, monítoreando los cambios en la elongación del tallo y/o las raíces en plantas transformadas con una molécula de polinucleótido Zm-D9 de la presente invención. Véanse, por ejemplo, el Ejemplo 1 más adelante y la Figura 4. Las variantes de moléculas de polinucleótidos y proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como recombinación de ADN. Con este procedimiento es posible manipular una o más secuencias codificantes de Zm-D9 diferentes para crear una nueva proteína Zm-D9 que posee las propiedades deseadas. De este modo, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de secuencias polinucleotídicas relacionadas, que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial, y éstas pueden recombinarse en forma homologa in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este abordaje, es posible combinar motivos de secuencia que codifican un dominio de interés de un gen Zm-D9 de la invención y otros genes Zm-D9 conocidos, para obtener un nuevo gen codificante de una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como una mayor Km en el caso de una enzima. En la técnica se conocen estrategias para este barajado de ADN. Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al. , (1 997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri, er al. , (1998) Nature 391 :288-291 ; y las Patentes de los EEUU N° 5605793 y 5837458. Las moléculas de polinucleótidos de la invención pueden usarse para aislar secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras plantas, más particularmente otras monocotiledóneas. De esta manera, es posible utilizar métodos, tales como PCR, hibridización y semejantes, para identificar dichas secuencias sobre la base de su homología de secuencia con las secuencias que se describen en la presente documentación. Las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con la secuencia Zm-D9 completa detallada en la presente documentación, o con variantes y fragmentos de ésta, están incluidas en la presente invención. Dichas secuencias incluyen secuencias que son ortóiogas de las secuencias descriptas. El término "ortólogos" hace referencia a genes derivados de un gen ancestral común que se encuentra en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes presentes en diferentes especies son considerados ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos, y/o las secuencias de proteínas codificadas por ellas, comparten al menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia o más. Las funciones de los ortólogos a menudo están muy conservadas entre las especies. Por consiguiente, las moléculas de polinucleótidos aislados que codifican una proteína Zm-D9, y que hibridizan bajo condiciones severas con las secuencias Zm-D9 descriptas en la presente documentación, o con variantes o fragmentos de éstas, están incluidas en la presente invención.

En un abordaje basado en PCR, pueden diseñarse oligonucleótidos cebadores para usar en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores para PCR y realizar una clonación por PCR son conocidos en general en la técnica, y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Véanse también: Innis et al. , editores (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, editores (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, editores (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, sin limitaciones, métodos para usar cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores individuales específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos para genes, cebadores específicos para vectores, cebadores con faltas de coincidencia parciales y semejantes En las técnicas de hibridización, se utiliza la totalidad o una parte de una molécula de polinucleótido conocido como una sonda, que hibridizará selectivamente con otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (es decir, bibliotecas de ADN genómico o ADNc) de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridización pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden estar marcadas con un grupo detectable, tal como 32P, o con cualquier otro marcador de detección. Asi, por ejemplo, las sondas de hibridización se pueden preparar mediante el marcado de oligonucleótidos sintéticos en base a los polinucleótidos Zm-D9 de la invención. Los métodos para preparar sondas de hibridización y construir de bibliotecas de ADNc y genómicas son conocidos en general en la técnica, y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Por ejemplo, una molécula de polinucleótido Zm-D9 descripta en la presente documentación completa, o una o más porciones de ésta, puede usarse como una sonda capaz de hibridizar específicamente con la molécula de polinucleótido Zm-D9 y los ARN mensajeros correspondientes. Para obtener una hibridización específica bajo diversas condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de polinucleótidos Zm-D9, y que preferiblemente tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente tienen al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Estas sondas pueden usarse para amplificar una molécula de polinucleótido Zm-D9 a partir de una planta seleccionada por PCR. « Este procedimiento puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales a partir de un organismo deseado, o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en una planta. Los procedimientos de hibridización incluyen el análisis de hibridización de bibliotecas de ADN plaqueadas (placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). La hibridización de dichas secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones severas. Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridización severas" hacen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda hibridizará con su secuencia blanco hasta un grado detectable mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces respecto del nivel basal). Las condiciones severas dependen de la secuencia y difieren bajo distintas circunstancias. Mediante el control de la severidad de la hibridización y/o las condiciones de lavado, es posible identificar secuencias blanco que son 100% complementarias con la sonda (análisis de homólogos). Como alternativa, es posible ajusfar las condiciones de severidad para permitir un cierto grado de falta de coincidencia entre las secuencias, con el fin de detectar grados de similitud menores (análisis de heterólogos). En general, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleotidos de longitud, a menudo menos de 500 nucleotidos de longitud. Típicamente, las condiciones severas son aquellas en las que la concentración de sal es menor que aproximadamente 1 ,5 M de iones Na, típicamente una concentración de entre aproximadamente 0,01 y 1 ,0 M de iones Na (o de otras sales), a un pH de entre 7,0 y 8,3, donde la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de entre 10 y 50 nucleotidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleotidos). También pueden obtenerse condiciones severas agregando agentes desestabilizadores, tales como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja severidad incluyen la hibridización con una solución amortiguadora de formamida al 30-35%, NaCI 1 M, SDS al 1 % (dodecilsulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en SSC 1 X-2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M/cítrato de trisodio 0,3 M) a 50-55°C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen la hibridización en formamida al 50-45%, NaCI 1 M, SDS al 1 % a 37°C, y un lavado en SSC 0.5X-1 X a 55-60°C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen la hibridización en formamida al 50%, NaCI 1 M, SDS al 1 % a 37°C, y un lavado en SSC 0, 1 X a 60-65°C. Opcionalmente, las soluciones amortiguadoras de lavado pueden comprender SDS entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 1 %. La duración de la hibridización generalmente es menor que aproximadamente 24 horas, comúnmente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será de un tiempo suficiente como para alcanzar el equilibrio. La especificidad es típicamente una función de los lavados post-hibridización, donde los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, puede estimarse el punto de fusión térmico (Tm) empleando la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 738:267-284: Tm = 81 ,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) -500/I; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH específico) a la que 50% de una secuencia blanco complementaria hibridiza con una sonda que coincide perfectamente. El Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de falta de coincidencia; por consiguiente, pueden ajustarse el Tm, las condiciones de hibridización y/o lavado para efectuar una hibridización con secuencias con una identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, puede reducirse el Tm en 10°C. Generalmente se seleccionan condiciones severas con temperaturas aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento, a una fuerza iónica y un pH específico. Sin embargo, las condiciones muy severas pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1 , 2, 3 ó 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja severidad pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 20°C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Usando la ecuación, las condiciones de hibridización y lavado deseadas, y el Tm deseado, aquellos entrenados en la técnica comprenderán que pueden efectuarse variaciones en la severidad de las soluciones de hibridización y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia deseado da como resultado una Tm menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC para que se pueda usar una temperatura más alta. Una extensa guía para la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I , capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York). Véase, Sambrook, et al. , (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polípéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Tal como se la utiliza en la presente documentación, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se utiliza como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, un segmento o la totalidad de la secuencia de un ADNc o un gen, o la secuencia completa del ADNc o el gen. (b) Tal como se la utiliza en la presente documentación, una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia o huecos) al compararla con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones), para un alineamiento óptimo de los dos polinucleótidos. En general, la ventana de comparación tiene al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100 o más. Aquellos entrenados en la técnica comprenden que, para evitar una similitud elevada con una secuencia de referencia debido a la inclusión de faltas de coincidencia en la secuencia de polinucleótidos, típicamente se introduce una penalidad de falta de coincidencia y se la sustrae de la cantidad de coincidencias. Los métodos para alinear secuencias de nucleótidos y aminoácidos con fines comparativos son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, puede realizarse la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualquiera usando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitativos de dichos algoritmos matemáticos comprenden el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 1 1 -17; el algoritmo de alineación local de Smith, et al., (1981 ) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda-de-alineación local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, modificado según Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873- 5877. Pueden usarse implementaciones informáticas de estos algoritmos matemáticos para comparar secuencias con el fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, sin limitaciones: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el conjunto de Software Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EEUU). Pueden prepararse alineamientos usando estos programas con los parámetros por omisión. El programa CLUSTAL está bien descrito en Higgins, et al. , (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins, et ai, (1989) CABIOS 5:1 51 -1 53; Corpet, et al. , (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881 -90; Huang, er a/. , (1992) CABIOS 8: 55-65; y Pearson, er a/. , (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331 . El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Cuando se comparan secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de ponderación de residuos PAM 120, una longitud de penalidad de falta de coincidencia de 12 y una falta de coincidencia de 4 con el programa ALIGN. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 21 5:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden efectuarse con el programa BLASTN, con una calificación = 100, una longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden efectuarse con el programa BLASTX, con una calificación = 50, una longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o un polipéptido de la invención. Con el fin de obtener alineamientos con faltas de coincidencia para efectuar una comparación, puede emplearse Gapped BLAST (en BLAST 2.0), como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, puede utilizarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda repetida que detecte interrelaciones distantes entre moléculas. Véase, Altschul, et al., (1997) supra. Cuando se emplea BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov. Los alineamientos también pueden realizarse en forma manual por inspección. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente documentación hacen referencia a los valores obtenidos utilizando GAP versión 10 con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un Peso de 50 y un Peso de Longitud de 3; y la matriz de calificación de nwsgapdna.cmp; % de identidad y % similitud para una secuencia de aminoácidos usando un Peso GAP de 8 y un Peso de Longitud de 2, y la matriz de calificación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente de los mismos. El término "programa equivalente" significa cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que presenta coincidencias de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos y una identidad de secuencia porcentual idéntica cuando se compara con la alineación correspondiente generada por el programa GAP Versión 10. GAP emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, para hallar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de faltas de coincidencias. GAP considera todos los alineamientos posibles y todas las posiciones de falta de coincidencia, y crea el alineamiento con la mayor cantidad de coincidencias de bases y la menor cantidad de faltas de coincidencia. Permite proveer una penalidad de creación de faltas de coincidencia y una penalidad de extensión de faltas de coincidencia en unidades de bases coincidentes. GAP debe crear una ganancia a partir de la cantidad de coincidencias, respecto de la penalidad de creación de faltas de coincidencia para cada falta de coincidencia que inserta. Si se selecciona una penalidad de extensión de falta de coincidencia mayor que cero, GAP debe crear además una ganancia para cada falta de coincidencia insertada, que abarca la longitud de la falta de coincidencia multiplicada por la penalidad de extensión de falta de coincidencia. Los valores predeterminados para la penalidad de creación de faltas de coincidencias y la penalidad de la extensión de las faltas de coincidencias en las secuencias de proteínas en la versión 10 del conjunto de software de Wisconsin Genetics GCG son de 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos, el límite de creación de falta de coincidencia predeterminado es de 50, en tanto que el límite de falta de coincidencia predeterminado es de 3. Los límites de creación de faltas de coincidencia y extensión de las faltas de coincidencia pueden expresarse como un número entero seleccionado del grupo de números enteros de 0 a 200. Entonces, por ejemplo, los valores de los límites de creación de faltas de coincidencia y extensión de faltas de coincidencia pueden ser de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineamientos. Pueden existir muchos miembros de esta familia, pero ningún otro tiene mejor calidad. GAP presenta cuatro cifras de mérito para los alineamientos: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada para el alineamiento de las secuencias. La Relación es la Calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que coinciden de hecho. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de símbolos que son similares. Los símbolos que están a lo largo de las faltas de coincidencia son ignorados. Se evalúa una similitud cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor o igual que 0,50, el umbral de similitud. La matriz de calificación usada en la Versión 10 del conjunto de software de Wisconsin Genetics GCG es BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915). (c) Tal como se la utiliza en la presente documentación, la "identidad de secuencia" o la "identidad", en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se las alinea para hallar una correspondencia máxima en la ventana de comparación especificada. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas comúnmente difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas, donde se sustituyen los residuos de aminoácidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad), y por ende, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, puede incrementarse el porcentaje de identidad de secuencia para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por dichas sustituciones conservativas poseen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Típicamente, esto comprende evaluar una sustitución conservativa como una falta de coincidencia parcial, en vez de total, lo que incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Por consiguiente, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le asigna un valor de 1 y a una sustitución no conservativa se le asigna un valor de cero, a una sustitución conservativa se le asigna un valor entre cero y 1 . El valor de las sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como se detalla en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). (d) Tal como se lo utiliza en la presente documentación, el "porcentaje de identidad de secuencia" denota el valor determinado mediante la comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima en una ventana de comparación, donde la porción de una secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia), en comparación con una secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones), para obtener un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando la cantidad de posiciones en las cuales existe una base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias, de modo de obtener la cantidad de posiciones de coincidencia, dividiendo la cantidad de posiciones de coincidencia por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando la cantidad total de posiciones por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. El uso del término "polinucleótido" no pretende limitar la presente invención a los polinucleótidos que comprenden ADN. Aquellos entrenados en la técnica comprenderán que los polinucleótidos puede comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas naturales como análogos sintéticos. Los polinucleótidos de la invención también abarcan todas las formas de secuencias, incluyendo, a modo de ejemplo, formas de cadena simple, formas de cadena doble, horquillas, estructuras de tallo y rizo, y semejantes. La molécula de polinucleótido Zm-D9 de la invención puede proporcionarse en cassettes de expresión para obtener la expresión en la planta Zm-D9 de interés. El cassette incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' unidas operativamente a una molécula de polinucleótido Zm-D9 de la invención. El término "unido operativamente" hace referencia a una unión funcional entre dos o más elementos.

Por ejemplo, un ligamiento operativo entre una molécula de polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión de la molécula de polinucleótido de interés. Los elementos unidos operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se lo usa con referencia a la unión de dos regiones que codifican proteínas, el término unido operativamente denota que las regiones codificantes están en el mismo marco de lectura. Además, el cassette puede contener al menos un gen adicional que será cotransformado en el organismo. Como alternativa, el o los genes adicionales pueden introducirse en múltiples cassettes de expresión. Este cassette de expresión contiene una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para insertar la molécula de polinucleótido Zm-D9 bajo la regulación de la transcripcional de las regiones reguladoras. Además, el cassette de expresión puede contener genes marcadores de selección. El cassette de expresión incluirá, en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de inicio de la transcripción y la traducción (es decir, un promotor), una molécula de polinucleótido Zm-D9 de la invención, y una región de terminación de la transcripción y la traducción (es decir, una región de terminación) funcional en plantas. Las regiones reguladoras (es decir, los promotores, las regiones reguladoras de la transcripción y las regiones de terminación de la traducción) y/o la molécula de polinucleótido Zm-D9 de la invención pueden ser nativas/análogas respecto de la célula huésped o unas de otras. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o la molécula de polinucleótido Zm-D9 de la invención pueden ser heterólogas respecto de la célula huésped o unas de otras. Como se la usa en la presente documentación, "heteróloga", en referencia a una secuencia, es una secuencia que se origina a partir de una especie extraña, o si es de la misma especie, está sustancialmente modificada en comparación con su forma nativa, en lo referente a su composición y/o su locus genómico, merced a la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a una molécula de polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que deriva la molécula de polinucleótido, o, si es de una especie igual/análoga, uno o ambos están sustancialmente modificados respecto de su forma y/o su locus genómico original, o el promotor no es el promotor nativo del polinucleótido unido operativamente. Tal como se lo utiliza en la presente documentación, un gen quimérico comprende una secuencia codificante unida operativamente a una región de inicio de la transcripción que es heteróloga respecto de la secuencia codificante. Si bien puede ser óptimo expresar las secuencias usando promotores heterólogos, pueden usarse las secuencias promotoras nativas. Dichas construcciones pueden cambiar los niveles de expresión de Zm-D9 en la planta o la célula vegetal. Por consiguiente, se altera el fenotipo de la planta o célula vegetal. La región de terminación puede ser nativa respecto de la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa respecto de la molécula de polinucleótido Zm-D9 de interés unida operativamente, puede ser nativa respecto de la planta huésped, o puede derivar de una fuente (es decir, extraña o heteróloga) de la del promotor, la molécula de polinucleótido Zm-D9 de interés, la planta huésped, o cualquier combinación de éstos. Existen regiones de terminación convenientes disponibles en el plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintetasa y la nopalina sintetasa. Véase también, Guerineau, et al. , (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262: 141 -144; Proudfoot (1991 ) Cell 64:671 -674; Sanfacon, et al. , (1991 ) Genes Dev. 5: 141 -149; Mogen, et al. , (1990) Plant Cell 2: 1261 -1272; Munroe, et al. , (1990) Gene 91 : 1 51 -1 58; Bailas, et al. , (1989) Nucleic Acids Res. 1 7:7891 -7903; y Joshi, et al. , (1987) Nucleic Acids Res. 1 5:9627-9639.

Cuando corresponda, los polinucleótidos pueden optimizarse para obtener una mayor expresión en la planta transformada. Es decir, los polinucleótidos pueden sintetizarse utilizando los codones vegetales preferidos para una mejor expresión. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowh (1990) Plant Physiol. 92: 1 -1 1 , para hallar una descripción del uso de codones preferidos por el huésped. En la técnica existen métodos disponibles para sintetizar genes con preferencia por plantas. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Número 5380831 y 5436391 , y Murray, eí al. , (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados en la presente documentación a modo de referencia. En la técnica se conocen otras modificaciones de secuencia para potenciar la expresión genética en una célula huésped. Éstas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitios de separación de exones-intrones, repeticiones tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas de este tipo, que puedan ser perjudiciales para la expresión genética. El contenido de G-C de la secuencia puede ser ajustado en niveles promedio para una célula huésped dada, y puede ser calculado con referencia a genes conocidos que se expresan en dicha célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia será modificada con el fin de evitar las estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas. Además, los cassettes de expresión pueden contener secuencias directrices 5'. Dichas secuencias directrices pueden servir para potenciar la traducción. Las directrices de la traducción son conocidas en la técnica e incluyen las siguientes: directrices de picornavirus, por ejemplo, la directriz del EMCV (región no codificante 5' de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc.

Nati. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); directrices de potivirus, por ejemplo, la directriz del TEV (virus etch de tabaco) (Gallie, eí al. , (1995) Gene 165(2):233-238), la directriz del MDMV (virus en mosaico enano de maíz) ( Virology 154:9-20), y la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak, eí al., (1991 ) Nature 353:90-94); la directriz no traducida del ARNm de la proteína de recubrimiento del virus en mosaico de alfalfa (AMV ARN 4) (Jobling, et al. , (1987) Nature 325:622-625); la directriz del virus en mosaico de tabaco (TMV) (Gallie, et al. , (1989) en Molecular Biology de RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), págs. 237-256); y directriz del virus moteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991 ) Virology 81 :382-385). Véase también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Cuando se prepara el cassette de expresión, pueden manipularse los diversos fragmentos de ADN con el fin de proveer las secuencias de ADN en la orientación apropiada, y según corresponda, en el marco de lectura adecuado. Con este fin, pueden emplearse adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN, o pueden utilizarse otras manipulaciones para proveer sitios de restricción convenientes, eliminar ADN superfluo, eliminar sitios de restricción o semejantes. Con este propósito, puede utilizarse mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, digestiones de restricción, alineamiento, resustituciones, por ejemplo transiciones y transversiones. En la práctica de la invención puede emplearse una cantidad de promotores, incluyendo el promotor nativo de la secuencia de polinucleótidos de interés. Los promotores pueden seleccionarse sobre la base del resultado deseado. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden combinar con promotores constitutivos, con preferencia por tejidos u otros promotores para su expresión en plantas.

Dichos promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor nuclear del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en WO 99/43838 y en la Patente de los EEUU N° 6072050; el promotor nuclear 35S CaMV (Odell, et al. , (1985) Nature 313:810-812); de actina de arroz (McEIroy, et al. , (1990) Plant Cell 2: 163-171 ); de ubiquitina (Christensen, eí al. , (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen, eí al. , (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last, eí al., (1 991 ) Theor. Appl. Genet. 81 :581 -588); MAS (Velten, eí al. , (1984) EMBO J. 3:2723-2730); el promotor ALS (Patente de los EEUU N° 5659026), y semejantes. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los de las Patentes de los EEUU N° 5608149, 5608144, 5604121 , 5569597, 5466785, 5399680, 5268463, 5608142 y 617761 1 . Es posible utilizar promotores regulados por compuestos químicos para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo a alcanzar, el promotor puede ser un promotor inducible por sustancias químicas, cuando la aplicación de la sustancia química induce la expresión del gen, o un promotor reprimible por compuestos químicos cuando la aplicación del compuesto químico reprime la expresión del gen. Los promotores ¡nducibles por compuestos químicos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados al promotor ln2-2 del maíz, que es activado por el herbicida bencensulfonamida, el promotor GST del maíz que es activado por compuestos electrofílicos hidrofóbicos que son utilizados como herbicidas pre-emergentes, y el promotor PR-1 a del tabaco, que es activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados por sustancias químicas de interés incluyen los promotores que responden a los esteroides (véase, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en Schena, eí a/., (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 10421 -10425 y McNellis, eí al., (1998) Plant J. 14(2):247- 257), y los promotores inducbles por tetraciclina y reprimióles por tetraciclina (véanse, por ejemplo, Gatz, et al., (1991 ) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y las Patentes de los EEUU Número 5814618 y 5789156), incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. Es posible utilizar promotores con preferencia por tejidos para incrementar la expresión de Zm-D9 en un tejido vegetal en particular. Los promotores con preferencia por tejidos incluyen los que se describen en Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata, ef al. , (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen, eí al. , (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell, ef al. , (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart, ef al., (1996) Plant Physiol. 1 12(3):1331 -1 341 ; Van Camp, et al. , (1996) Plant Physiol. 1 12(2):525-535; Canevascini, ef al., (1996) Plant Physiol. 1 12(2):513-524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5)773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181 -196; Orozco, ef al., (1993) Planta Mol Biol. 23(6): 1 129-1 138; Matsuoka, ef al., (1993) Proc Nati. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; y Guevara-García, et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505. De ser necesario, es posible modificar estos promotores para obtener una expresión débil. En determinadas realizaciones de la invención se hace uso de plantas transformadas con promotores con preferencia tisular, particularmente promotores con preferencia por el tallo, unidos operativamente a secuencias de nucleótidos que codifican proteínas Zm-D9. En una realización de la invención, el promotor MS-S2A (Abrahams, ef al. , (1995) Planta Mol Biol 27:513-28) está unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína Zm-D9 tipo salvaje o MUT1 . La elección del promotor, y de la especificidad tisular inherente, probablemente influirá en el grado o la intensidad de los cambios morfológicos en las plantas transgénicas que expresen la proteína Zm-D9 tipo salvaje o MUT1 de la invención. La preferencia por el tallo, en el caso del promotor MS-S2A, implica la expresión asociada con los elementos vasculares que ha sido documentada (datos no presentados). El promotor MS-S2A parece ser óptimo para la expresión MUT1 Zm-D9, mientras que el promotor de la actina, un promotor con expresión constitutiva, y con mayor expresión en tejido foliar, produce cambios muy modestos o leves en la morfología cuando se lo usa para expresar la proteína MUT1 ZM-D9. » En la técnica se conocen promotores con preferencia por hojas. Véanse, por ejemplo, Yamamoto, et al. , (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 05:357-67; Yamamoto, et al. , ( 994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco, ef al. , (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1 129-1 138; y Matsuoka, er al. , (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 (véase la descripción anterior). Los promotores específicos para la raíz son conocidos y pueden seleccionarse entre todos los que se encuentran disponibles de la literatura, o pueden aislarse de novo a partir de diversas especies compatibles. Véanse, por ejemplo, Hire, et al. , (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gen de glutamina sintetasa específico para raíz de soja); Keller y Baumgartner (1991 ) Plant Cell 3(10): 1051 -1061 (elemento de control específico para raíz del gen GRP 1 .8 del poroto francés); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor especifico para raíz del gen de manopina sintetasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); y Miao, et al., (1991 ) Plant Cell 3(1 ): 1 -22 (clon de ADNc completo que codifica glutamina sintetasa (GS) citosólica, que se expresa en raíces y nodulos de raíces de soja). Véase también, Bogusz, et al. , (1990) Plant Cell 2(7): 633-641 , donde se aislaron dos promotores específicos de raíces de los genes de hemoglobina de la no leguminosa que fija nitrógeno Parasponia andersonii y la no leguminosa que no fija nitrógeno relacionada Trema tomentosa. Los promotores de estos genes se ligaron a un gen informante ß-glucuronidasa y se introdujeron en la especie no leguminosa Nicotiana tabacum y en la especie leguminosa Lotus corniculatus y en ambos casos se conservó la actividad promotora específica de raíz. Leach y Aoyagi (1991 ) describen su análisis de los promotores de los genes inductores de raíz de gran expresión rolC y roID de Agrobacterium rhizogenes (véase Plant Science (Limerick) 79(1 ):69-76). Concluyeron que los determinantes de ADN potenciadores y con preferencia tisular están disociados en dichos promotores. Teeri, et al. , (1989) utilizaron una fusión de genes con lacZ para demostrar que el gen de ADN-T de Agrobacterium que codifica una octopina sintetasa es especialmente activo en la epidermis del ápice de la raíz, y que el gen TR2' es específico para raíces en la planta intacta, y que es estimulado por lesiones en el tejido foliar, una combinación de características especialmente deseable para su uso con un gen insecticida o larvicida (véase EMBO J 8(2):343-350). El gen TR1 ' fusionado a nptll (neomicina fosfotransferasa I I) presentó características similares. Otros promotores con preferencia por la raíz incluyen el promotor del gen VÍENOD-GRP3 (Kuster, et al. , (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772); y el promotor rolB (Capana, et al. , (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681 -691 . Véanse también las Patentes de los EEUU Número 5837876, 5750386, 5633363, 5459252, 5401836, 51 10732 y 5023179. Cuando se desean bajos niveles de expresión, se podrán utilizar promotores débiles. En general, un "promotor débil" se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación a un nivel bajo. Se propone como bajo nivel a niveles desde alrededor de 1 /1000 transcriptos a alrededor de 1 /100000 transcriptos, a alrededor de 1 /500000 transcriptos. Alternativamente, se reconoce que "promotores débiles" también abarca los promotores que se expresan sólo en unas pocas células y no en otras dando un nivel de expresión total bajo. Cuando un promotor se expresa a niveles inaceptablemente altos, se pueden eliminar porciones de la secuencia del promotor, se lo puede modificar para disminuir los niveles de expresión. Dichos promotores constitutivos débiles incluyen, por ejemplo, el promotor núcleo del promotor de Rsyn7 (WO 99/43838 y Patente de los EEUU N° 6072050), el promotor nuclear 35S CaMV, y semejantes. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los de las Patentes de los EEUU Número 5608149, 5608144, 5604121 , 5569597, 5466785, 5399680, 5268463 y 5608142. Véase también la Patente de los EEUU Número 61 7761 1 , incorporada en la presente documentación a modo de referencia. En general, el cassette de expresión comprenderá un gen marcador de selección para seleccionar las células transformadas. Los genes marcadores de selección se utilizan para la selección de las células o los tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tales como aquellos que codifican la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina fosfotransferasa (HPT), asi como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Otros marcadores seleccionares incluyen marcadores fenotipicos tales como las proteínas /?-galactosidasa y fluorescentes tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (Su, et al. , (2004) Biotechnol. Bioeng. 85:610-9 y Fetter, et al. , (2004) Plant Cell 16.2 5-28), la proteína cianofluorescente (CYP) (Bolte, et al. , (2004) J. Cell Science 1 17:943-54 y Kato, eí al. , (2002) Plant Physiol. 129:913-42), y la proteína fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen, véase Bolte, et al. , (2004) J. Cell Science 1 17:943-54). Para hallar otros marcadores de selección, véanse en general Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-51 1 ; Christopherson, ef al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao, ef al., (1992) Cell 71 :63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley, ef al., (1980) en The Operon, págs. 177-220; Hu, et al. , (1987) Cell 48:555-566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-612; Figge, et al. , (1988) Cell 52:713-722; Deuscle, et al. , (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst, et al. , (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuscle, et al. , (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Tesis Ph.D., Universidad de Heidelberg; Reines, et al. , (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:1917-1921 ; Labow, ef ai, (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim, et al., (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski, ef al. , ( 1991 ) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb, ef al., (1991 ) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1 591 -1595; Kleinschnidt ef al. (1988) Biochemistry 27:1094- 04; Bonin (1993) Tesis Ph.D., Universidad de Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 ; Oliva, ef al. , (1992) Antimicrob. Agentes Chemother. 36:913-919; Hlavka, ef al. , (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gill, ef al., (1988) Nature 334:721 -724. Dichas descripciones se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. La lista anterior de genes marcadores de selección no se ofreció en un sentido limitante. En la presente invención es posible utilizar cualquier gen marcador de selección. En una realización, la molécula de polinucleótido de interés se dirige al cloroplasto para la expresión. De este modo, cuando el polinucleótido de interés no se inserte directamente en el cloroplasto, el cassette de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codificará un péptido de tránsito para dirigir el producto génico de interés hacia los cloroplastos. Estos péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Von Heijne, ef al. , (1991 ) Plant Mol. ß/?/. Rep. 9:104-126; Clark, ef al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544- 7550; Della-Cioppa, ef al. , (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer, eí al., (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421 ; y Shah, ef al. , (1986) Science 233:478-481 . En la técnica se conocen secuencias de direccionamiento hacia el cloroplasto, e incluyen la subunidad pequeña de la ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) (de Castro Silva Filho, ef al., ( 1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell, ef al., (1991 ) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); la 5-(enolpiruvil)shikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) (Archer, ef al. , (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); la triptofano sintetasa (Zhao, ef al., (1995) J. Biol. Chem. 270(1 1 ):6081 -6087); la plastocianina (Lawrence, ef al., (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); la corismato sintetasa (Schmidt, ef al., (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); y la proteína que se une a clorofila capturadora de luz a/b (LHBP) (Lamppa, ef al., (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Véanse también Von Heijne, ef al., (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark, eí al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa, ef al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer, ef al., (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421 ; y Shah, ef al., (1986) Science 233:478-481 . En la técnica se conocen métodos para transformar cloroplastos. Véanse, por ejemplo, Svab, ef al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:91 3-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601 -606. Los métodos se basan en la administración por cañón de partículas de ADN que contiene un marcador de selección, y el direccionamiento del ADN hacia el genoma del plástido por recombinación homologa. Adicionalmente, puede efectuarse la transformación del plástido mediante la transactivación de un transgen silencioso perteneciente al plásmido, a través de la expresión con preferencia tisular de una ARN polimerasa codificada por el núcleo y dirigida hacia el plástido. Este sistema ha sido descripto en McBride, et al. , (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :7301 -7305. Podrá optimizarse la expresión en el cloroplasto de los polinucleótidos de interés que se desee dirigir, teniendo en cuenta las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y esta organela. De este modo, puede sintetizarse la molécula del polinucleótido de interés usando codones preferidos por el cloroplasto. Véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 5380831 , incorporada en la presente documentación a modo de referencia. Los métodos de la invención comprenden la introducción de un polipéptido o una molécula de polinucleótido en una planta. El término "Introducir" denota presentar a la planta la molécula de polinucleótido o el polipéptido, de modo que la secuencia logra acceder al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir la secuencia en una planta, sino solamente de que la molécula de polinucleótido o el polipéptido pueda acceder al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir moléculas de polinucleótidos o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica, e incluyen, sin limitaciones, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus. Una "transformación estable" denota que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y que puede ser heredada por la progenie de la misma. Una "transformación transitoria" denota que se introduce una molécula de polinucleótido en la planta, y que dicho polinucleótido no se integra en el genoma de la planta, o que se introduce un polipéptido en una planta.

Los protocolos de transformación, y también los protocolos para introducir secuencias de polipéptidos o polinucleótidos en plantas, pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal que se desea transformar, es decir monocotiledóneas o dicotiledóneas. Los métodos apropiados para introducir polipéptidos y polinucleótidos en células vegetales incluyen microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de los EEUU N° 5563055 y 5981840), transferencia directa de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración balística de partículas (véanse, por ejemplo, la Patente de los EEUU Número 4945050, la Patente de los EEUU Número 5879918, las Patentes de los EEUU Número 5886244 y 5932782; Tomes, et al. , (1995) en Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, editado por Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926); y transformación con Lec1 (WO 00/28058). También véanse Weissinger, er a/. , (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 -477; Sanford, er al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou, ef ai, (1988) Plant Physiol. 87:671 -674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991 ) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh, er a/. , (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, et al. , (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, ef al. , (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Patentes de los EEUU Número 5240855, 5322783 y 5324646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91 :440-444 (maíz); Fromm, et al. , (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren, er al., (1984) Nature (Londres) 31 1 :763-764; Patente de los EEUU N° 5736369 (cereales); Bytebier, et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, editado por Chapman, et al., (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler, er al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por fibras); D'Halluin, er al., (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (electroporación); L¡, er al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255, y Christou y Ford (1995) Annals o f Botan y 75:407-413 (arroz); Osjoda, er al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz con Agrobacterium tumefaciens); todos los cuales se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. En realizaciones específicas, las secuencias Zm-D9 de la invención pueden introducirse en una planta usando una variedad de métodos de transformación transitoria. Estos métodos de transformación transitoria incluyen, sin limitaciones, la introducción de la proteína Zm-D9, o variantes y fragmentos de ésta, directamente en la planta, o la introducción del transcripto de Zm-D9 en la planta. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, la microinyección o el bombardeo de partículas. Véase, por ejemplo, Crossway, er al. , (1986) Mol Gen. Genet. 202:179- 185; Nomura, et al., (1986) Planta Sci. 44:53-58; Hepler, er al. , (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. 91 :2176-2180 y Hush, er al. , (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784, todas las cuales se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Como alternativa, la molécula del polinucleótido Zm-D9 puede transformarse de forma transitoria en la planta, usando procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen sistemas de vectores virales y la precipitación de la molécula de polinucleótido, de un modo que provoca la liberación subsiguiente del ADN. Por consiguiente, puede ocurrir la transcripción del ADN unido a las partículas, pero la frecuencia con la que es liberado para integrarse en el genoma es muy reducida. Dichos métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEI; Sigma N° P3143). En otras realizaciones, la molécula de polinucleótido de la invención puede introducirse en las plantas poniendo en contacto dichas plantas con un virus o con ácidos nucleicos virales. En general, dichos métodos comprenden la incorporación de una construcción de nucleótidos de la invención en una molécula de ADN o ARN viral. Se reconoce que la secuencia de aminoácidos Zm-D9 de la invención puede sintetizarse inicialmente como parte de una poliproteína viral, que luego puede procesarse por proteólisis in vivo o in vitro para producir la proteína recombinante deseada. « Además, se considera que los promotores de la invención también abarcan los promotores utilizados para la transcripción por las ARN polimerasas virales. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada por ellos, que comprenden moléculas de ADN o ARN viral, son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU Número 5889191 , 5889190, 5866785, 5589367, 5316931 y Porta, et al., (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221 ; incorporados en la presente documentación a modo de referencia. En la técnica son conocidos los métodos para una inserción dirigida de una molécula de polinucleótido en una ubicación específica en el genoma de la planta. En una realización, la inserción de la molécula de polinucleótido en una ubicación genómica deseada se logra usando un sistema de recombinación específico del sitio. Véanse, por ejemplo, W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, todas las cuales se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Brevemente, la molécula de polinucleótido de la invención puede estar contenida en un cassette de transferencia rodeado por dos sitios de recombinación no recombínogénicos. El cassette de transferencia se introduce en una planta, que tiene incorporado en forma estable en su genoma un sitio blanco que está rodeado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos, que corresponden a los sitios del cassette de transferencia. Se provee una recombinasa apropiada y el cassette de transferencia se integra en el sitio blanco. De este modo, la molécula de polinucleótido de interés se integra en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta. Las células que han sido transformadas pueden cultivarse para obtener plantas de acuerdo con medios convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick, et al. , (1986) Plant Cell Reports 5:81 -84. Después, estas plantas pueden cultivarse, y pueden polinizarse con la misma cepa transformada o con distintas cepas, y puede identificarse la progenie resultante que presenta una expresión constitutiva de la característica fenotipica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotipica se mantenga y se herede en forma estable, y luego pueden cosecharse las semillas para asegurar que se haya obtenido la expresión de la característica fenotipica deseada. De esta manera, en la presente invención se proveen semillas transformadas (también denominadas "semillas transgénicas") que contienen una molécula de polinucleótido de la invención, por ejemplo, un cassette de expresión de la invención, incorporado de forma estable en su genoma. El cruzamiento de pedigrí comienza con el cruzamiento do dos genotipos, tal como una línea élite de interés y otra línea endocriada élite que tiene una o más características deseables (es decir, que tiene incorporada en forma estable una molécula de polinucleótido de la invención, que tiene una actividad y/o un nivel modulado del polipéptido de la invención, etcétera) que complementa la línea élite de interés. Si los dos progenitores originales no proveen todas las características deseadas, pueden incluirse otras fuentes en la población de cruzamiento. En el método de pedigrí, se autocruzan plantas superiores y se las selecciona en generaciones filiales sucesivas. En las generaciones filiales subsiguientes, la condición heterocigota da lugar a líneas homogéneas como resultado de la auto-polinización y la selección. Típicamente, en el método de cría de pedigrí, se practica autocruzamiento y selección en cinco o más generaciones filíales sucesivas: F1 ? F2; F2? F3; F3 ? F4; F4 ? F5, etc. Después de una endogamia suficiente, las sucesivas generaciones filiales servirán para incrementar las semillas del endogámico desarrollado. En realizaciones específicas, la línea endogámíca comprende alelos homocigotas en aproximadamente 95% o más de sus loci. Además de usarse para crear conversiones por retrocruza, también es posible recurrir a la retrocruza en combinación con cruzamientos de pedigrí para modificar una línea élite de interés, y para producir un híbrido usando la línea élite modificada. Tal como se discutió previamente, se puede emplear retrocruza para transferir una o más características específicamente deseables de una línea, el progenitor donante, a un endogámico denominado progenitor recurrente, que presenta características agronómicas generales buenas aunque no posee la o las características deseables. Sin embargo, puede emplearse el mismo procedimiento para mudar la progenie hacia el genotipo del progenitor recurrente y retener al mismo tiempo muchos componentes del progenitor no recurrente, deteniendo la retrocruza en una etapa temprana y avanzando con la autocruza y selección. Por ejemplo, se crea una F1 , tal como un híbrido comercial. Este híbrido comercial puede retrocruzarse con una de sus líneas progenitoras para crear una BC1 o una BC2. La progenie se autocruza y selecciona, de modo tal que el individuo endogámico recién desarrollado posee muchos de los atributos del progenitor recurrente, y además varios de los atributos deseados del progenitor no recurrente. Este abordaje permite relevar el valor y la fuerza del progenitor recurrente para usarlo en nuevos híbridos y cruzamientos. Por lo tanto, una realización de esta invención es un método para realizar una conversión por retrocruza de una línea endocriada de maíz de interés, que comprende los pasos de cruzar una planta de una línea endocriada de maíz de interés con una planta donante que comprende un gen muíante o un transgen que confiere un carácter deseado (es decir, altura o estatura reducida de la planta), seleccionar una planta de la progenie F1 que comprende el gen muíante o el transgen que confiere el carácter deseado, y retrocruzar la planta de la progenie F1 seleccionada con la plañía de la línea endocriada de maíz de iníerés. Este método puede comprender además el paso de obíener un perfil marcador molecular de la línea endogámica de maíz de iníerés y usar dicho perfil marcador molecular para seleccionar una planta de progenie con la caracterísíica deseada y el perfil marcador molecular de la línea endogámica de iníerés. De la misma manera, esíe méíodo puede usarse para producir semillas híbridas F1 con la adición de un paso final de cruza de la línea endogámica de maíz de iníerés, con la característica convertida deseada, con una planta de maíz diferente, para obtener una semilla híbrida F1 de maíz con un gen muíaníe o íransgen que confiere la característica deseada. La selección recurrente es un méíodo utilizado en un programa de cruzamienío de plañías para mejorar una población de plañías. El método comprende la polinización cruzada entre plañías individuales para formar la progenie. Se culííva la progenie y se selecciona una progenie superior utilizando numerosos métodos de selección, que incluyen plantas individuales, progenie de medio hermanas, progenie de hermanas completas, progenie autocruzada y cruzamienío superior. La progenie seleccionada es someíida a una polinización cruzada para formar la progenie de otra población. Esta población se siembra, y nuevamente se seleccionan plantas superiores para volver a someterlas a una polinización cruzada. La selección recurrente es un proceso cíclico, y por ello puede repetirse cuantas veces se desee. El objetivo de la selección recurrente es mejorar las características de una población. La población mejorada puede usarse posteriormente como fuente de material de cruzamiento para obtener líneas endogámicas, que se usarán como híbridos o progenitores para un cultivar sintético. Un cultivar sintético es la progenie resultante formada por el cruzamiento de varios endogámicos seleccionados. La selección en masa es una técnica útil cuando se usa junto con la selección mejorada por marcadores moleculares. En la selección en masa, las semillas individuales se seleccionan sobre la base del fenotipo y/o el genotipo. Estas semillas seleccionadas se agrupan y se usan posteriormente para obtener la siguiente generación. La selección en masa requiere del cultivo de una población de plantas en una parcela de cultivo, la autopolinización de las plantas, la cosecha de las semillas en masa y el posterior uso de una muestra de las semillas cosechadas en masa para plantar la generación siguiente. En lugar de autopolinización, podría usarse una polinización dirigida como parte del programa de cruzamiento. El cruzamiento por mutación es uno de los numerosos métodos que podría usarse para introducir características nuevas en una línea élite. Las mutaciones que tienen lugar espontáneamente, o que son inducidas artificialmente, pueden ser fuentes útiles de variabilidad para el encargado del cultivo de las plantas. La meta de la mutagénesis artificial es la de incrementar el índice de mutación para la característica deseada. Los índices de mutación pueden incrementarse de muchas maneras diferentes, incluyendo con la temperatura, el almacenamiento de semillas a largo plazo, condiciones de cultivo tisular, radiaciones, tal como rayos X, rayos gamma (por ejemplo, cobalto 60 o cesio 1 37), neutrones, (productos de fisión nuclear por uranio 235 en un reactor atómico), radiación beta (emitida por radioisótopos tales como fósforo 32 o carbono 14) o radiación ultravioleta (preferiblemente entre 2500 y 2900 nm) o mutágenos químicos (tales como análogos de bases (5-bromo-uracilo), compuestos relacionados (8-etoxi cafeína), antibióticos (estreptonigrina), agentes alquilantes (mostazas de azufre, mostazas de nitrógeno, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxílamina, ácido nitroso o acridinas. Una vez observada la característica deseada a través de mutagénesis, puede incorporarse dicha característica en un germoplasma existente mediante técnicas de cruzamiento tradicionales, tales como retrocruza. Los detalles sobre la cría por mutación se pueden consultar en la publicación de Fehr "Principies of Cultivar Development", 1993, Macmillan Publishing Company, cuyo contenido se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. Además, pueden usarse las mutaciones creadas en otras líneas para producir una conversión por retrocruza de una línea de élite que comprende dichas mutaciones. Como se lo usa en la presente documentación, el término "planta" incluye células vegetales, protoplastos de plantas, cultivos de células vegetales a partir de los cuales pueden regenerarse plantas, callos de planta, trozos de plantas y células vegetales intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, vainas, raíces, ápices de raíces, anteras, y semejantes. Los granos hacen referencia a las semillas maduras producidas en los cultivos comerciales, con propósitos distintos del desarrollo o la reproducción de la especie. La progenie, las variantes y los mutantes de las plantas regeneradas también están incluidos dentro del alcance de la invención, siempre que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos. La presente invención puede usarse para transformar cualquier especie de planta, incluyendo, sin limitaciones, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de especies vegetales de interés incluyen, a modo de ejemplo, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceites de semillas, alfalfa {Medicago sativa), arroz {Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria itálica), mijo ahusado (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo ( Triticum aestivum), soja (Glicine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), casava (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), avocado (Persea americana), higo (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardio (Anacardium occidentale), macadamía (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, verduras, plantas ornamentales y coniferas. Las verduras incluyen tomate (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías lima (Phaseolus limensis), arvejas (Lathyrus spp.), y miembros de los géneros Cucumis, tales como el pepino (C. sativus), el melón (C. cantalupensis) y el melón musk (C. meló). Las plantas ornamentales incluyen azalea {Rhododendron spp.), hidrangea {Macrophylla hidrangea), hibiscus (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), pastora roja (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo. Las coniferas que pueden emplearse en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos, tales como el pino loblolly, (Pinus taeda), el pino de incienso (Pinus elliotii), el pino ponderosa (Pinus ponderosa), el pino lodgepole (Pinus contorta) y el pino de Monterrey (Pinus radiata); el abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); la Tsuga del Oeste (Tsuga canadensis); el abeto Sitka (Picea glauca); la secuoya (Sequoia sempervirens); los abetos verdaderos, tales como el abeto de oro (Abies amabilis) y el abeto balsam (Abies balsamea); y los cedros, tales como el cedro rojo del Oeste (Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En realizaciones específicas, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, alazor, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etcétera). En otras realizaciones, se prefieren las plantas de maíz y soja, y en otras realizaciones, las plantas preferidas son de maíz. Otras plantas de interés incluyen plantas con granos que proveen semillas de interés, plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de granos, tal como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas de semillas oleaginosas incluyen algodón, soja, alazor, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palmera, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen habas y arvejas. Las habas incluyen guar, semilla de algarroba, fenogreco, soja, habas de jardín, caupí, habichuela, poroto pallar, haba común, lentejas, garbanzos, etcétera.

Se provee un método para modular la concentración y/o la actividad del polipéptido de la presente invención en una planta. En general, la concentración y/o actividad es incrementada o disminuida en al menos un 1 %, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con relación a la planta, parte de planta o célula control nativa que no contiene la secuencia de la invención introducida. La modulación en la presente invención puede tener lugar durante y/o después del crecimiento de la planta hasta la etapa deseada del desarrollo. En realizaciones específicas, los polipéptidos de la presente invención son modulados en monocotiledóneas, en particular en maíz. El nivel de expresión del polipéptido Zm-D9 puede medirse en forma directa, por ejemplo, evaluando el nivel del polipéptido Zm-D9 en la planta, o en forma indirecta, por ejemplo, midiendo la actividad de Zm-D9 del polipéptido Zm-D9 en la planta, por ejemplo, mediante la determinación de la altura total de la planta o la altura del tallo o el vastago. Los métodos para determinar la actividad de Zm-D9 se describen en otra parte de la presente documentación. En realizaciones especificas, el polipéptido o la molécula de polinucleótido de la invención es introducido en la célula vegetal. Posteriormente, la célula de planta que contiene la secuencia introducida de la invención se selecciona usando métodos conocidos por aquellos entrenados en la técnica, tales como, a modo de ejemplo, análisis de Southern blot, secuenciación de ADN, análisis con PCR o análisis fenotípico. Una planta o una parte de una planta alterada o modificada de acuerdo con las realizaciones anteriores se cultiva bajo condiciones de formación de plantas, por un tiempo suficiente como para modular la concentración y/o la actividad de los polipéptidos de la presente invención en la planta. Las condiciones formadoras de plantas son bien conocidas en la técnica, y se describen brevemente en otra parte de la presente.

Se considera también que el nivel y/o actividad del polipéptido puede ser modulado empleando una molécula de polinucleótido que no sea capaz de dirigir, en una planta transformada, la expresión de una proteína o un ARN. Por ejemplo, los polinucleótidos de la invención pueden usarse para diseñar construcciones de polinucleótidos que puedan emplearse en los métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótidos genómica en un organismo. Dichas construcciones de polinucleótidos incluyen, a modo de ejemplo, vectores de ARN:ADN, vectores de mutación de ARN:ADN, vectores de reparación de ARN:ADN, oligonucleótidos dobles mixtos, oligonucleótidos de ARN:ADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinogénicas. Estas construcciones de nucleótidos y métodos de uso son conocidos en la técnica. Véanse las Patentes de los EEUU Número 5565350, 5731 181 , 5756325, 576001 2, 5795972 y 5871984, todos incorporados en la presente documentación a modo de referencia. Véanse también WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821 y Beetam, et al. , (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:8774-8778; incorporados en la presente documentación a modo de referencia. Por ello, se considera que los métodos de la presente invención no dependen de la incorporación de todo el polinucleótido en el genoma, sino solamente de que la planta, o una célula de ésta, sea alterada como resultado de la introducción de la molécula de polinucleótido en una célula. En una realización de la invención, es posible alterar el genoma después de la introducción de la molécula de polinucleótido en una célula. Por ejemplo, puede incorporarse el polinucleótido, o cualquier parte de éste, en el genoma de la planta. Las alteraciones al genoma de la presente invención incluyen, a modo de ejemplo, adiciones, supresiones y sustituciones de nucleótidos en el genoma. En tanto los métodos de la presente invención no dependen de adiciones, supresiones y sustituciones de ninguna cantidad particular de nucleótidos, se considera que dichas adiciones, supresiones o sustituciones comprenden al menos un nucleótido. En una realización, se incrementa la actividad y/o el nivel del polipéptido Zm-D9 de la invención. Puede obtenerse un incremento en el nivel y/o actividad del polipéptido Zm-D9 de la invención introduciendo en la planta un polipéptido Zm-D9. Como se describió en otra parte de la presente documentación, en la técnica se conocen muchos métodos para introducir un polipéptido en una planta, incluyendo, sin limitaciones, la introducción directa del polipéptido en la planta, la introducción en la planta (en forma transitoria o estable) de una construcción de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene Zm-D9. También se reconoce que los métodos de la invención pueden emplear una molécula de polinucleótido que no es capaz de dirigir la expresión de una proteína o un ARN en la planta transformada. Por consiguiente, puede incrementarse el nivel y/o la actividad de un polipéptido Zm-D9 alterando el gen que codifica el polipéptido Zm-D9 o su promotor. Véase, por ejemplo, Kmiec, Patente de los EEUU N° 5565350; Zarling et al., PCT/US93/03868. Por consiguiente, se proporcionan plantas mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes Zm-D9, donde las mutaciones incrementan la expresión del gen Zm-D9 o incrementan la actividad Zm-D9 del polipéptido Zm-D9 codificado. En otras realizaciones, la actividad y/o el nivel del polipéptido Zm-D9 de la invención se reduce o se elimina introduciendo en una planta un polinucleótido que inhibe el nivel o la actividad del polipéptido Zm-D9 de la invención. El polinucleótido puede inhibir la expresión de Zm-D9 en forma directa, evitando la traducción del ARN mensajero de Zm-D9, o en forma indirecta, codificando un polipéptido que inhibe la transcripción o la traducción de un gen Zm-D9 que codifica una proteína Zm-D9. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son bien conocidos en la técnica, y en la presente invención puede usarse cualquiera de dichos métodos para inhibir la expresión de Zm-D9 en una planta. En otras realizaciones de la invención, la actividad del polipéptido Zm-D9 se reduce o se elimina transformando una célula vegetal con una secuencia que codifica un polipéptido que inhibe la actividad del polipéptido Zm-D9. En otras realizaciones, la actividad de un polipéptido Zm-D9 puede reducirse o eliminarse alterando el gen que codifica el polipéptido Zm-D9. En la invención se incluyen plantas mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes Zm-D9, donde las mutaciones reducen la expresión del gen Zm-D9 o inhiben la actividad de Zm-D9 del polipéptido Zm-D9 codificado. La reducción de la actividad de genes específicos (también conocida como silenciamiento genético o supresión genética) es deseable para diversos aspectos de al ingeniería genética en plantas. Aquellos entrenados en la técnica conocen muchos procedimientos de silenciamiento genético, incluyendo, sin limitaciones, tecnología antisentido (véanse, por ejemplo, Sheehy, et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:8805-8809; y las Patentes de los EEUU N° 5107065, 5453566 y 5759829); cosupresión (por ejemplo, Taylor (1997) Plant Cell 9:1245; Jorgensen (1990) Trends Biotech. 8(12):340-344; Flavell (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :3490-3496; Finnegan, et al., (1994) Bio/Technology 12:883-888; y Neuhuber, et al., (1994) Mol. Gen. Genet. 244:230-241 ); interferencia de ARN (Napoli, et al., (1 990) Plant Cell 2:279-289; Patente de los EEUU N° 5034323; Sharp (1999) Genes Dev. 13: 139-141 ; Zamore, et al., (2000) Cell 101 :25-33; y Montgomery, et al. , (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 1 5502-1 5507), silenciamiento genético inducido por virus (Burton, et al., (2000) Plant Cell 12:691 -705; y Baulcombe (1999) Curr. Op. Planta Bio. 2: 109-1 13); ribozimas específicas para ARN blanco (Haseloff, eí al., (1988) Nature 334:585-591 ); estructuras en horquilla (Smith, et al., (2000) Nature 407:319-320; WO 99/53050; WO 02/00904; WO 98/53083; Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk, eí al., (2002) Plant Physiol. 129: 1723-1731 ; Waterhouse y Helliwell (2003) Nal Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini, eí al. , BMC Biotechnology 3:7, Publicación de Patente de los EEUU N° 20030175965; Panstruga, eí al. , (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140; Wesley, et al. , (2001 ) Plant J. 27:581 -590; Wang y Waterhouse (2001 ) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-1 50; Publicación de Patente de los EEUU N° 20030180945; y WO 02/00904, donde todas estas publicaciones se incorporan en la presente documentación a modo de referencia); ribozimas (Steinecke, eí al., (1992) EMBO J. 1 1 : 1525; y Perriman, eí al. , (1993) Antisense Res. Dev. 3:253); modificación dirigida mediada por oligonucleótidos (por ejemplo, WO 03/076574 y WO 99/25853); moléculas dirigidas por dedos de Zn (por ejemplo, WO 01 /52620, WO 03/048345 y WO 00/42219); marca con transposones (Maes, eí al. , (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri y Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner, eí al. , (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat, eí al. , (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Planta Biol. 2: 103- 07; Gai, eí al. , (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, eí al. , (1999) Genetics 1 53: 1919-1928; Bensen, eí al. , (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, eí al. , (1996) Science 274: 1 537-1540; y Patente de los EEUU N° 5962764); donde cada una de estas publicaciones se incorpora en la presente documentación a modo de referencia; y otros métodos o combinaciones de los métodos anteriores conocidas por aquellos entrenados en la técnica. Se reconoce que con los polinucleótidos de la invención pueden construirse construcciones antisentido complementarias con al menos una porción del ARN mensajero (ARNm) de las secuencias Zm-D9. Los nucleótidos antisentido se construyen de modo que hibridicen con el ARNm correspondiente. Pueden realizarse modificaciones de las secuencias antisentido siempre que las secuencias hibridicen e interfieran con la expresión del ARNm correspondiente. De este modo, pueden usarse construcciones antisentido que tienen 70%, en términos óptimos 80%, en términos más óptimos 85% de identidad de secuencia con las secuencias antisentido correspondientes. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para alterar la expresión del gen blanco. En general, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden usarse en la orientación del marco de lectura, para suprimir la expresión de genes endógenos en plantas. En la técnica se conocen métodos para suprimir la expresión genética en plantas usando polinucleótidos en la orientación del marco de lectura. Los métodos generalmente comprenden transformar plantas con una construcción de ADN, que comprende un promotor que dirige la expresión en una planta, unido operativamente a al menos una porción de un polinucleótido que corresponde al transcripto del gen endógeno. Típicamente, una secuencia de nucleótidos como esta tiene una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcripto del gen endógeno, en términos óptimos más que aproximadamente 65% de identidad de secuencia, en términos más óptimos más que aproximadamente 85% de identidad de secuencia, en términos más óptimos más que aproximadamente 95% de identidad de secuencia. Véanse las Patentes de los EEUU N° 5283184 y 5034323; incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. Por consiguiente, pueden usarse muchos métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido Zm-D9. Es posible utilizar más de un método para reducir la actividad de un solo polipéptido Zm-D9. Además, pueden emplearse combinaciones de métodos para reducir o eliminar la actividad de los polipéptidos Zm-D9. En algunas realizaciones, la actividad de Zm-D9 se reduce o se elimina transformando una célula vegetal Zm-D9 con un cassette de expresión que expresa un polinucleótido que inhibe la expresión de Zm-D9. El polinucleótido puede inhibir la expresión de una o más proteínas Zm-D9 en forma directa, evitando la traducción del ARN mensajero de Zm-D9, o en forma indirecta, al codificar un polipéptido que inhibe la transcripción o la traducción de un gen de maíz que codifica una proteína Zm-D9. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son bien conocidos en la técnica, y cualquiera de estos métodos puede usarse en la presente invención para inhibir la expresión de una o más proteínas Zm-D9. De acuerdo con la presente invención, la expresión de Zm-D9 se inhibe sí el nivel de una proteína Zm-D9 es menor, desde el punto de vista estadístico, que el nivel de la misma proteína Zm-D9 en una planta que no ha sido modificada genéticamente o mutagenizada para inhibir la expresión de dicha proteína Zm-D9. En realizaciones particulares de la invención, el nivel de la proteína Zm-D9 en una planta modificada de acuerdo con la invención es menor que 95%, menor que 90%, menor que 80%, menor que 70%, menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10% o menor que 5% del nivel de la misma proteína Zm-D9 en una planta que no es una mutante o que no ha sido modificada genéticamente para inhibir la expresión de dicha proteína Zm- D9. El nivel de expresión de la proteína Zm-D9 puede medirse directamente, por ejemplo, evaluando el nivel de proteína Zm-D9 expresada en la célula o la planta de maíz, o en forma indirecta, por ejemplo, midiendo la actividad de Zm-D9 de la proteína Zm-D9 en la célula vegetal o la planta de maíz. Los métodos para determinar la actividad de Zm-D9 de proteínas Zm-D9 se describen en otra parte de la presente documentación. En otras realizaciones de la invención, la actividad de una o más proteínas Zm-D9 se reduce o se elimina transformando una célula de una planta de maíz con un cassette de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que inhibe la actividad de una o más proteínas Zm-D9. La actividad de Zm-D9 de una proteína Zm-D9 se inhibe de acuerdo con la presente invención sí la actividad de Zm-D9 de la proteína Zm-D9 es menor, desde el punto de vista estadístico, que la actividad de Zm-D9 de la misma proteína Zm-D9 en una planta que no ha sido modificada genéticamente para inhibir la actividad de Zm-D9 de dicha proteína Zm-D9. En realizaciones particulares de la invención, la actividad de Zm-D9 de la proteína Zm-D9 en una planta modificada de acuerdo con la invención es menor que 95%, menor que 90%, menor que 80%, menor que 70%, menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10%, o menor que 5% de la actividad de Zm-D9 de la misma proteína Zm-D9 en una planta que no ha sido modificada genéticamente para inhibir la expresión de dicha proteína Zm-D9. De acuerdo con la invención, la actividad de Zm-D9 de una proteína Zm-D9 se "elimina" cuando no puede detectarse con los métodos de ensayo descriptos en otra parte de la presente documentación. Los métodos para determinar la actividad de Zm-D9 de una proteína Zm-D9 se describen en otra parte de la presente documentación. En otras realizaciones, la actividad de una proteína Zm-D9 puede reducirse o eliminarse alterando el gen que codifica la proteína Zm-D9. La invención abarca plantas de maíz mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes Zm-D9, donde las mutaciones reducen la expresión del gen Zm-D9 o inhiben la actividad de Zm-D9 de la proteína Zm-D9 codificada.

Por lo tanto, pueden usarse muchos métodos para reducir o eliminar la actividad de una proteína Zm-D9. Puede usarse más de un método para reducir la actividad de una misma proteína Zm-D9. Además, pueden emplearse combinaciones de métodos para reducir o eliminar la actividad de dos o más proteínas Zm-D9 diferentes. A continuación se proporcionan ejemplos no limitantes de métodos para reducir o eliminar la expresión de una proteína Zm-D9. A. Métodos basados en polinucleótidos: En algunas realizaciones de la presente invención, se transforma una célula de una planta de maíz con un cassette de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de una proteína Zm-D9. El término "expresión", como se lo usa en la presente documentación, hace referencia a la biosíntesis de un producto genético, incluyendo la transcripción y/o la traducción de dicho producto genético. Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención, un cassette de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de al menos una proteína Zm-D9 en una planta de maíz es un cassette de expresión capaz de producir una molécula de ARN que inhibe la transcripción y/o la traducción de al menos una proteína Zm-D9 en una planta de maíz. La "expresión" o la "producción" de una proteína o un polipéptido a partir de una molécula de ADN hace referencia a la transcripción y la traducción de la secuencia codificante para producir la proteína o el polipéptido, al tiempo que la "expresión" o la "producción" de una proteína o un polipéptido a partir de una molécula de ARN hace referencia a la traducción de la secuencia codificante de ARN para producir la proteína o el polipéptido. A continuación se proporcionan ejemplos de polinucleótidos que inhiben la expresión de una proteína Zm-D9 en una planta de maíz. 1. Supresión en el sentido del marco de lectura/cosupresión En algunas realizaciones de la invención, puede obtenerse la inhibición de la expresión de la proteína Zm-D9 por supresión en el sentido del marco de lectura o cosupression. Para la cosupresión, se diseña un cassette de expresión para expresar una molécula de ARN que corresponde a la totalidad o una parte de un ARN mensajero que codifica una proteína Zm-D9 en la orientación "del marco de lectura". La sobreexpresión de la molécula de ARN puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo. Por ende, se analizan múltiples líneas de plantas transformadas con el cassette de expresión de cosupresión, para identificar aquellas que presentan la mayor inhibición de la expresión de la proteína Zm-D9. El polinucleótido usado para la cosupresión puede corresponder a la totalidad o una parte de la secuencia que codifica la proteína Zm-D9, la totalidad o una parte de la región no traducida 5' y/o 3' de un transcripto de una proteína Zm-D9, o la totalidad o una parte de la secuencia codificante y las regiones no traducidas de un transcripto que codifica una proteína Zm-D9. En algunas realizaciones donde el polinucleótido comprende la totalidad o una parte de la región codificante de la proteina Zm-D9, el cassette de expresión se diseña para eliminar el codón inicial del polinucleótido, de modo que no se transcriba ningún producto proteico. Es posible recurrir a la cosupresión para inhibir la expresión de genes vegetales y producir plantas con niveles indetectables de proteínas para las proteínas codificadas por estos genes. Véase, por ejemplo Broin et al (2002) Plant Cell 14: 1417-1432. También puede usarse la cosupresión para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU Número 5942657. Los métodos para usar la cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen en Flavell, et al., (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :3490-3496; Jorgensen, er a/. , (1996) Plant Mol. Biol. 31 :957-973; Johansen y Carrington (2001 ) Plant Physiol. 126:930-938; Broin, et al. , (2002) Plant Cell 14: 141 7-1432; Stoutjesdijk, et al. , (2002) Plant Physiol. 129: 1 723-1731 ; Yu, et al. , (2003) Phytochemistry 63:753-763; y las Patentes de los EEUU Número 5034323, 5283184 y 5942657; cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. Puede incrementarse la eficiencia de la cosupresión incluyendo una región de poli-dT en el cassette de expresión, en una posición 3' de la secuencia en el sentido del marco de lectura y 5' de la señal de poliadenilación. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los EEUU N° 20020048814, incorporada en la presente documentación a modo de referencia. Típicamente, una secuencia de nucleótidos como esta tiene una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcripto del gen endógeno, en términos óptimos más que aproximadamente 65% de identidad de secuencia, en términos más óptimos, más que aproximadamente 85% de identidad de secuencia, en términos más óptimos, más que aproximadamente 95% de identidad de secuencia. Véanse las Patentes de los EEUU N° 5283184 y 5034323; incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. 2. Supresión antisentido En algunas realizaciones de la invención, es posible obtener la inhibición de la expresión de la proteína Zm-D9 por supresión antisentido. Para la supresión antisentido, el cassette de expresión se diseña con el fin de expresar una molécula de ARN complementaria con al totalidad o una parte de un ARN mensajero que codifica la proteína Zm-D9. La sobreexpresión de la molécula de ARN antisentido puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo.

Por lo tanto, se analizan múltiples líneas de plantas transformadas con el cassette de expresión de supresión antisentido, para identificar aquellas que presentan la mayor inhibición de la expresión de la proteína Zm-D9. El polinucleótido para usar en la supresión antisentido puede corresponder a la totalidad o una parte del complemento de la secuencia que codifica la proteína Zm-D9, la totalidad o una parte del complemento de la región no traducida 5' y/o 3' del transcripto de la proteína Zm-D9, o la totalidad o una parte del complemento de la secuencia codificante y las regiones no traducidas de un transcripto que codifica la proteína Zm-D9. Además, el polinucleótido antisentido puede ser completamente complementario (es decir, 100% idéntico al complemento de la secuencia blanco) o parcialmente complementario (es decir, menos que 100% idéntico al complemento de la secuencia blanco) con la secuencia blanco. Puede usarse la supresión antísentido para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 5942657. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para interrumpir la expresión del gen blanco. En general, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más. Se describen métodos para usar la supresión antisentido con el objeto de inhibir genes endógenos en plantas, por ejemplo, en Liu ef al (2002) Plant Physiol. 129: 1 732-1743 y las Patentes de los EEUU N° 5759829 y 5942657, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. Es posible incrementar la eficiencia de la supresión antisentido incluyendo una región de poli-dT en el cassette de expresión, en una posición 3' de la secuencia antisentido y 5' de la señal de poliadenilación. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los EEUU N° 20020048814, incorporada en la presente documentación a modo de referencia. 3. Interferencia con ARN de cadena doble En algunas realizaciones de la invención, es posible obtener la inhibición de la expresión de una proteína Zm-D9 por medio de interferencia de ARN de cadena doble (dsARN). Para la interferencia con dsARN, en la misma célula se expresa una molécula de ARN en el sentido del marco de lectura, como aquella descripta previamente para la cosupresión, y una molécula de ARN antisentido, que es completa o parcialmente complementaria con la molécula de ARN en el sentido del marco de lectura, lo que resulta en la inhibición de la expresión del ARN mensajero endógeno correspondiente. Puede obtenerse la expresión de las moléculas en el sentido del marco de lectura y antisentido diseñando el cassette de expresión de modo que comprenda una secuencia en el sentido del marco de lectura y una secuencia antisentido. Como alternativa, pueden usarse cassettes de expresión separados para las secuencias en el sentido del marco de lectura y antisentido. Luego se analizan múltiples líneas de plantas transformadas con el o los cassettes de expresión de interferencia de dsARN, para identificar las líneas de plantas que presentan la mayor inhibición de la expresión de proteínas Zm-D9. Se describen métodos para usar interferencia de dsARN para inhibir la expresión de genes vegetales endógenos en Waterhouse et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:13959- 13964, Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129: 1732-1743, y WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631 y WO 00/49035; cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. 4. Interferencia con ARN en horquilla e interferencia con ARN en horquilla que contiene intrones En algunas realizaciones de la invención, es posible obtener la inhibición de la expresión de la proteína Zm-D9 por interferencia de ARN en horquilla o interferencia de ARN que contiene intrones (ihpARN). Estos métodos son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Véase Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38, y las referencias citadas en dicha publicación. Para realizar la interferencia de hpARN, se diseña un cassette de expresión que puede expresar una molécula de ARN que hibridiza consigo misma para formar una estructura en horquilla, la cual comprende un rizo de cadena simple y un tallo de bases apareadas. En algunas realizaciones, la región de tallo con bases apareadas comprende una secuencia en el sentido del marco de lectura que corresponde a la totalidad o una parte del ARN mensajero endógeno que codifica el gen cuya expresión se desea inhibir, y una secuencia antisentido que es completa o parcialmente complementaria con la secuencia en el sentido del marco de lectura. Por consiguiente, la región de tallo con bases apareadas de la molécula generalmente determina la especificidad de la interferencia del ARN. Las moléculas de hpARN son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos, y la interferencia de ARN que inducen es heredada por las generaciones de plantas subsiguientes. Véanse, por ejemplo, Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731 ; y Aguahouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Se describen métodos para usar interferencia de hpARN para inhibir o silenciar la expresión de genes, por ejemplo, en Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. , (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731 ; Aguahouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini, et al., BMC Biotechnology 3:7 , y la Publicación de Patente de los EEUU Número 20030175965; cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. En Panstruga et al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, incorporado en la presente documentación a modo de referencia, se describe un ensayo transitorio para la eficacia de construcciones de ARNh para silenciar la expresión genética in vivo. Para el ihpARN, las moléculas de interferencia tienen la misma estructura general que para el hpARN, pero la molécula de ARN comprende adicionalmente un intrón que puede cortarse en la célula donde se expresa el ihpARN. El uso de un intrón minimiza el tamaño del rizo en la molécula en horquilla después del corte, y esto incrementa la eficiencia de la interferencia. Véase, por ejemplo, Smith ef al. (2000) Nature 407:319-320. De hecho, Smith eí al. demostraron un 100% de supresión de la expresión del gen endógeno usando interferencia mediada por iARNhp. Los métodos para usar la interferencia con ARNhi para inhibir la expresión de genes endógenos vegetales se describen, por ejemplo, en Smith eí al. (2000) Nature 407:319-320; Wesley eí al. (2001 ) Plant J. 27:581 -590; Wang y Aguahouse (2001 ) Curr. Opin. Planta Biol. 5:146-150; Aguahouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell y Aguahouse (2003) Métodos 30:289-295, y la Publicación de Patente de los EEUU N° 20030180945, cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. El cassette de expresión para efectuar la interferencia con hpARN puede estar diseñado de modo tal que la secuencia en el sentido del marco de lectura y la secuencia antisentido no correspondan a ARN endógeno. En esta realización, las secuencias en el sentido del marco de lectura y antisentido rodean una secuencia de rizo que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a la totalidad o una parte del ARN mensajero endógeno del gen blanco. Por consiguiente, la región del rizo es la que determina la especificidad de la interferencia de ARN. Véase, por ejemplo, WO 02/00904, incorporada en la presente documentación a modo de referencia.

El silenciamiento transcripcional de genes (TGS) puede efectuarse mediante el uso de construcciones de hpARN, donde la repetición invertida de la horquilla comparte identidad de secuencia con la región promotora del gen que se desea silenciar. El procesamiento del hpARN en ARN cortos que pueden interactuar con la región promotora homologa puede desencadenar la degradación o la metilación, lo que provocará el silenciamiento (Aufsatz, et al. , (2002) PNAS 99(4): 16499-16506; Mette, et al. , (2000) EMBO J 19(1 9):5194-5201 ). 5. Interferencia mediada por amplicones Los cassettes de expresión de amplicones comprenden una secuencia derivada de un virus vegetal que contiene la totalidad o una parte del gen blanco, pero generalmente no todos los genes del virus nativo. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del cassette de expresión permiten que el producto de transcripción dirija su propia replicación. Los transcriptos producidos por el amplicón pueden hallarse en el sentido del marco de lectura o en orientación antisentido respecto de la secuencia blanco (es decir, el ARN mensajero de la proteína Zm-D9). Se describen métodos para usar amplicones para inhibir la expresión de genes vegetales endógenos, por ejemplo, en Angelí y Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angelí y Baulcombe (1999) Plant J. 20:357-362, y la Patente de los EEUU N° 6646805, cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. 6. Ribozimas En algunas realizaciones, el polinucleótido expresado por el cassette de expresión de la invención es ARN catalítico o tiene un actividad de ribozima específica para el ARN mensajero de la proteína Zm-D9. Por consiguiente, el polinucleótido produce la degradación del ARN mensajero endógeno, lo que resulta en la expresión reducida de la proteína Zm-D9. Este método se describe, por ejemplo, en la Patente de los EEUU N° 4987071 , incorporada en la presente documentación a modo de referencia. 7. Interferencia con ARN pequeño o micro ARN En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la proteína Zm-D9 puede obtenerse mediante la interferencia de ARN de la expresión de un gen que codifica un micro ARN (miARN). Los miARN son agentes reguladores que consisten en aproximadamente 22 ribonucleótidos. Los miARN son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Véase, por ejemplo, Javier, et al., (2003) Nature 425:257-263, incorporado en la presente documentación a modo de referencia. Para efectuar la interferencia con miARN, el cassette de expresión se diseña de modo que exprese una molécula de ARN modelada en un ARNm de un gen endógeno. El gen de miARN codifica un ARN que forma una estructura de horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria con otro gen endógeno (secuencia blanco). Para la supresión de la expresión de la proteína Zm-D9, la secuencia de 22 nucleótidos se selecciona entre secuencias de transcriptos de una proteína Zm-D9, y contiene 22 nucleótidos de la secuencia dicha proteína Zm-D9 en la orientación del marco de lectura y 21 nucleótidos de una secuencia antisentido correspondiente que es complementaria a la secuencia en el sentido del marco de lectura. Las moléculas de miRNA son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos, y la interferencia de ARN que inducen es heredada por generaciones de plantas subsiguientes. B. Inhibición de la expresión de genes basada en polipéptidos En una realización, el polinucleótido codifica una proteína de dedos de cinc que se une a un gen que codifica una proteína Zm-D9 en una planta o una célula de maíz, lo que resulta en una expresión reducida del gen. En realizaciones particulares, la proteína de dedos de cinc se une a una región reguladora de un gen de una proteína Zm-D9. En otras realizaciones, la proteína de dedos de cinc se une a un ARN mensajero que codifica una proteína Zm-D9 y evita su traducción. Se describen métodos para seleccionar sitios para dirigir proteínas de dedos de cinc, por ejemplo, en la Patente de los EEUU N° 6453242, y métodos para usar proteínas de dedos de cinc en la inhibición de la expresión de genes en plantas, por ejemplo, en la Publicación de Patente de los EEUU N° 20030037355; cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. C. Inhibición de la actividad proteica basada en polipéptidos En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido codifica un anticuerpo que se une a al menos una proteína Zm-D9, y reduce la actividad de Zm-D9 de la proteína Zm-D9. En otra realización, la unión del anticuerpo resulta en un mayor recambio del complejo de anticuerpo-proteína Zm-D9 merced a los mecanismos celulares de control de calidad. La expresión de anticuerpos en células vegetales, y la inhibición de vías moleculares mediante la expresión y la unión de anticuerpos a proteínas en células vegetales son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Conrad y Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21 :35-36, incorporado en la presente documentación a modo de referencia. D. Alteración de genes En algunas realizaciones de la presente invención, la actividad de una proteína Zm-D9 se reduce o se elimina alterando el gen que codifica la proteína Zm-D9. El gen que codifica la proteína Zm-D9 puede alterarse con cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en una realización, el gen se altera realizando una marcación con transposones. En otra realización, el gen se altera mutagenizando plantas de maíz con mutagénesis al azar o dirigida, y seleccionando las plantas que tienen una actividad de proteína Zm-D9 reducida o alterada. 1. Marcación con transposones En una realización de la invención, se usa una marcación con transposones para reducir o eliminar la actividad de Zm-D9 de la protema Zm-D9. La marcación con transposones comprende insertar un transposón dentro de un gen Zm-D9 endógeno para reducir o eliminar la expresión de la proteina Zm-D9. Un "gen Zm-D9" denota el gen que codifica una proteína Zm-D9 de acuerdo con la invención. En esta realización, la expresión de la proteína Zm-D9 se reduce o se elimina insertando un transposón dentro de una región reguladora o una región codificante del gen que codifica la proteína Zm-D9. Puede usarse un transposón que está dentro de un exón, un intrón, una secuencia no traducida 5' o 3', un promotor, o cualquier otra secuencia reguladora de un gen Zm-D9 para reducir o eliminar la expresión y/o la actividad de la proteína Zm-D9 codificada. Los métodos para efectuar la marcación con transposones de genes específicos en plantas son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Maes et al. (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri y Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 1 79:53-59; Meíssner, et al. , (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat, et al. , (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Planta Biol. 2: 103-107; Gai, et al. , (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, et al. , (1999) Genetics 1 53: 1919-1928). Además, el proceso TUSC para seleccionar inserciones Mu en genes seleccionados ha sido descripto en Bensen, er al. , (1995) Plant Cell 7:75- 84; Mena, er al. , (1996) Science 274: 537-1540; y la Patente de los EEUU Número 5962764, cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. 2. Plantas mutantes con actividad reducida En la técnica también se conocen otros métodos para disminuir o eliminar le expresión de genes endógenos en plantas, y puede aplicárselos de forma similar en la presente invención. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tales como la mutagénesis inducida por metansulfonato de etilo, la mutagénesis por supresión y la mutagénesis por supresión con neutrones rápidos, usada en un sentido de genética inversa (con PCR) para identificar líneas de plantas en las que se ha eliminado el gen endógeno. Para hallar ejemplos de estos métodos véanse, Ohshima, et al., (1998) Virology 243:472-481 ; Okubara, er al., (1994) Genetics 137:867-874; y Quesada, et al., (2000) Genetics 154:421 -436; cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. Además, en la presente invención también puede aplicarse un método rápido y automatizado para efectuar mutaciones inducidas por sustancias químicas, TILLING (direccionamiento de lesiones locales inducidas en genomas), el uso de HPLC desnaturalizante o digestión selectiva con endonucleasas de productos de PCR seleccionados. Véase McCallum et al (2000) Nal Biotechnol. 18:455-457, incorporado en la presente documentación a modo de referencia. Las mutaciones que afectan la expresión del gen, o que interfieren con la función (actividad Zm-D9) de la proteína codificada son bien conocidas en la técnica. Las mutaciones de inserción en los exones del gen habitualmente dan como resultado mutantes nulos. Las mutaciones en los residuos conservados son particularmente eficaces para inhibir la actividad Zm-D9 de la proteína codificada. Se han descripto residuos conservados de las proteínas vegetales DELLA son apropiados para realizar mutagénesis que permiten eliminar o reprimir la actividad de señalización de la giberelina. Véase, por ejemplo, Itoh, H., M. Ueguchi-Tanaka, er al. , (2002) Plant Cell 14:57-70. Estas mutantes pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos, y las mutaciones en distintos loci Zm-D9 pueden agruparse realizando cruzamientos genéticos. Véase, por ejemplo, Gruís, et al., (2002) Plant Cell 14:2863-2882. En otra realización de esta invención, pueden usarse mutantes dominantes para efectuar el silenciamiento de ARN debido a la inversión genética y la recombinación del locus de un gen duplicado. See, por ejemplo, Kusaba, et al., (2003) Plant Cell 15: 1455-1467. En la invención se incluyen otros métodos para reducir o eliminar la actividad de una proteína Zm-D9. En la técnica se conocen ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótidos genómica en una planta, los cuales incluyen, sin limitaciones, el uso de vectores de ARN: ADN, vectores de mutación de ARN: ADN, vectores de reparación de ARN: ADN, oligonucleótidos con dobletes mixtos, oligonucleótidos de ARN: ADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinogénicas. Estos vectores y métodos de uso son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU Número 5565350, 5731 181 , 5756325, 5760012, 5795972 y 5871984, cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. Véanse también WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821 y Beetam, eí al. , (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:8774-8778; cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. En determinadas realizaciones, las moléculas de polinucleótidos de la presente invención pueden agruparse con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés para crear plantas con un carácter deseado. Un carácter, como se lo usa en la presente documentación, hace referencia al fenotipo derivado de una secuencia o un grupo de secuencias en particular. Por ejemplo, las moléculas de polinucleótidos de la presente invención podrán agruparse con cualquier otra molécula de polinucleótido que codifique polipéptidos con actividad plaguicida y/o insecticida, tales como otras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descriptas en las Patentes de los EEUU N° 5366892, 5747450, 5737514, 5723756, 5593881 y Geiser, et al. , (1986) Gene 48: 109), lectinas (Van Damme, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (descripta en la Patente de los EEUU N° 5981722), y semejantes. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de cualquiera de las moléculas de polinucleótidos de interés. Las moléculas de polinucleótidos de la presente invención también pueden agruparse con cualquier otro o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de caracteres deseados, incluyendo, sin limitaciones, caracteres deseables para alimentos para animales, tales como genes ricos en aceite (por ejemplo, Patente de los EEUU Número 6232529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (Patentes de los EEUU Número 5990389, 5885801 , 5885802 y 5703409); cebada rica en lisina (Williamson, et al. , (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122) y proteínas ricas en metionina (Pedersen, er al. , (1986) J. Biol. Chem. 261 :6279; Kirihara, et al., (1988) Gene 71 :359; y Musumura, et al. , (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); mayor digestibilidad (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (Solicitud de los EEUU con Número de Acta 10/053410, presentada el 7 de Noviembre de 2001 ); y tiorredoxinas (Solicitud de los EEUU con Número de Acta 10/005429, presentada el 3 de Diciembre de 2001 )); cuyas descripciones se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Las moléculas de polinucleótidos de la presente invención también pueden agruparse con caracteres deseables para la resistencia a enfermedades o herbicidas (por ejemplo, genes de destoxificación de fumonisina (Patente de los EEUU N° 5792931 ); genes de avirulencia y resistencia a enfermedades (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262: 1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78: 1089); mutantes de acetolactato sintetasa (ALS) que proporcionan resistencia a herbicidas, tales como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintetasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar); y resistencia a glifosato (genes EPSPS)); y caracteres deseables para procesos o productos de procesamiento, tales como alto contenido de aceite (por ejemplo, Patente de los EEUU N° 6232529); aceites modificados (por ejemplo, genes de desaturasa de ácidos grasos (Patente de los EEUU N° 5952544; WO 94/1 516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidón sintetasas (SS), enzimas ramificadoras de almidón (SBE) y enzimas desramificadoras de almidón (SDBE)); y polímeros o bíoplásticos (por ejemplo, Patente de los EEUU N° 5602321 ; beta-cetotiolasa, políhidroxibutirato sintetasa, y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847), que facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs)), cuyas descripciones se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. También podrán combinarse los polinucleótidos de la presente invención con polinucleótidos que confieran caracteres de importancia agrícola, tales como esterilidad masculina (por ejemplo, véase la Patente de los EEUU N° 5583210), fuerza del tallo, tiempo de florecimiento, o caracteres de tecnología de transformación, tales como la regulación del ciclo celular o el direccionamiento de genes (por ejemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821 ), cuyas descripciones se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Estas combinaciones agrupadas pueden ser creadas mediante cualquier método, incluyendo por ejemplo, cruzamiento de plantas con cualquier metodología convencional o TopCross o transformación genética. Si las secuencias se combinan mediante la transformación genética de las plantas, es posible combinar las secuencias de polinucleótidos de interés en cualquier momento y cualquier orden. Por ejemplo, se puede usar una planta transgénica que comprende una o más de las características deseadas como blanco para introducir otras características mediante una posterior transformación. Las características se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con las moléculas de polinucleótidos de interés provistos por cualquier combinación de cassettes de transformación. Por ejemplo, si se introducirán dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en cassettes transformación separadas (trans) o pueden estar contenidas en el mismo cassette de transformación (cis). La expresión de las secuencias de interés puede ser dirigida por el mismo promotor o por promotores diferentes. En determinados casos, puede ser deseable introducir un cassette de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Esto se puede acompañar con cualquier combinación de otros cassettes de supresión o cassettes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de características en la planta. Además, se reconoce que las secuencias de los polinucleótidos pueden combinarse en cualquier localización genómica deseada, usando un sistema de recombinación específica para sitios determinados. Véanse, por ejemplo, W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, todas las cuales se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Son de interés varios cambios en el fenotipo, incluyendo la modificación de la composición de ácidos grasos en una planta, la alteración del contenido de ácidos grasos de una planta, la alteración del mecanismo de defensa a patógenos de la planta, y semejantes. Pueden obtenerse estos resultados proporcionando la expresión de productos heterólogos o incrementando la expresión de productos endógenos en plantas. Como alternativa, pueden obtenerse los resultados provocando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores, en la planta. Estos cambios resultan en un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Los genes de interés reflejan los mercados comerciales y los intereses de aquellos que participan en el desarrollo de los cultivos. Los cultivos y los mercados de interés cambian, y, a medida que las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, también emergen nuevos cultivos y tecnologías. Además, a medida que crece el conocimiento de caracteres y características agronómicas, tales como el rendimiento y la heterosis, varía la selección de genes a transformar en forma concordante. Las categorías generales de genes de interés incluyen, por ejemplo, aquellos genes que participan en la información, tales como los dedos de cinc, aquellos que participan en la comunicación, tales como quinasas, y aquellos que participan en el mantenimiento, tales como las proteínas de ataque calórico. Las categorías de transgenes más específicos incluyen, por ejemplo, genes que codifican caracteres de importancia agrícola, resistencia a insectos, resistencia enfermedades, resistencia a herbicidas, esterilidad, características de los granos y productos comerciales. En general, los genes de interés incluyen aquellos que participan en el metabolismo de aceites, almidón, hidratos de carbono o nutrientes, así como aquellos que afectan el tamaño de los granos, la carga de sacarosa, y semejantes. Pueden alterarse caracteres de importancia agrícola, tales como el contenido de aceite, almidón y proteínas, por modificación genética, además del uso de métodos de cruzamiento tradicionales. Las modificaciones incluyen el incremento del contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, niveles incrementados de lisina y azufre, proporción de aminoácidos esenciales, y también la modificación del almidón. Se describen modificaciones a proteínas de hordotionina en las Patentes de los EEUU N° 5703049, 5885801 , 5885802 y 5990389, incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. Otro ejemplo es la proteína de semilla rica en lisina y/o azufre codificada por 2S albúmina de soja descrito en la Patente de los EEUU N° 5850016, y el inihbidor de quimothpsina de cebada, descrito en Williamson et al. , (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyos contenidos se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Pueden prepararse derivados de las secuencias codificantes medíante mutagénesís dirigida a sitios específicos para incrementar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptído codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido rico en lisina de cebada (BHL) deriva del inhibidor de quimiotripsína de cebada, Solicitud de los EEUU con N° de Orden 08/740682, presentada el 1 o de Noviembre de 1996, y WO 98/20133, cuyas descripciones se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Otras proteínas incluyen las proteínas vegetales ricas en metionina, tales como las de semillas de girasol (Lilley, et al., (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization ¡n Human Foods and Animal Feedstuffs, editado por Applewhíte (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), pp. 497-502; incorporado en la presente documentación a modo de referencia); maíz (Pedersen, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261 :6279; Kirihara, er a/., (1988) Gene 71 :359; ambos incorporados en la presente documentación a modo de referencia); y arroz (Musumura, et al., (1989) Pía nt Mol. Biol. 12: 123, incorporado en la presente documentación a modo de referencia). Otros genes de importancia agrícola codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento en semillas y factores de transcripción.

Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que producen grandes mermas en el rendimiento, tales como la oruga de la raíz, la oruga cortadora, el taladro del maíz europeo y semejantes. Dichos genes incluyen, por ejemplo genes de las proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de los EEUU N° 5366892, 5747450, 5737514, 5723756, 5593881 , y Geiser ef al. , (1986) Gene 48:109); y semejantes. Los genes que codifican características de resistencia a enfermedades pueden incluir: genes de desintoxicación, tal como contra fumonisina (Patente de los EEUU N° 5792931 ); genes de avirulencia (avr) y genes de resistencia a enfermedades (R) (Jones et al., (1994), Science 266: 789; Martin et al., (1993) Science 262: 1432; Mindrinos et al., (1994), Cell 78: 1089); y semejantes. Los caracteres de resistencia a herbicidas pueden incluir genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan en la inhibición de la acción de la acetolactato sintetasa (ALS), en particular, los herbicidas del tipo de la sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintetasa (ALS), que contiene mutaciones que producen esta resistencia, en particular, las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo al acción de a glutamina sintetasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar); glifosato (por ejemplo, el gen EPSPS y el gen GAT; véanse, por ejemplo, la Publicación de los EEUU Número 20040082770 y WO 03/092360); u otros genes de este tipo conocidos en la técnica. El gen bar codifica resistencia al herbicida, el gen nptil codifica resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina, y las mutantes del gen ALS codifican resistencia al herbicida clorsulfurón. También puede haber genes de esterilidad codificados en un cassette de expresión, los cuales proporcionan una alternativa a la remoción física de espigas. Los ejemplos de genes usados de estas formas incluyen genes con preferencia por los tejidos masculinos y genes con fenotipos de esterilidad masculina, tales como QM, descripto en la Patente de los EEUU N° 5583210. otros genes incluyen quinasas y aquellos que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo de los gametofitos masculinos o femeninos. La calidad del grano se ve reflejada en caracteres tales como, por ejemplo, los niveles y los tipos de aceite, saturados o insaturados, la calidad y la cantidad de aminoácidos esenciales, y los niveles de celulosa. En maíz, las proteínas modificadas de la hordotionina se describen en las Patentes de los EEUU N° 5703049, 5885801 , 5885802 y 5990389. Los caracteres comerciales también pueden estar codificados por uno o más genes que, por ejemplo, pueden incrementar el contenido de almidón para producir etanol, o proporcionan la expresión de proteínas. . Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos tal como se describe en la Patente de los EEUU N° 5602321 . Los genes, tal como de /?-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxiburirato sintetasa) y acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert eí al., (1988) J. Bacterio!. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA). Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, así como aquellos de otras fuentes, incluyendo procariotas y otros eucariotas. Estos productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y semejantes. Puede incrementarse el nivel de proteínas, particularmente proteínas modificadas con una distribución de aminoácidos mejorada, para mejorar el valor nutritivo de la planta. Esto se logra expresando proteínas que tienen un mayor contenido de aminoácidos. "Una planta o una célula vegetal sujeto" es una en la que se ha efectuado una alteración genética, tal como una transformación, en un gen de interés, o es una planta o una célula vegetal que desciende de una planta o una célula alterada de esa forma, y que comprende dicha alteración. Un "control", una "planta control" o una "célula vegetal control" provee un punto de referencia para medir los cambios en el fenotipo de dicha planta o dicha célula vegetal sujeto. Una planta o una célula vegetal control puede comprender, por ejemplo: (a) una planta o una célula de tipo salvaje, es decir, del mismo genotipo que el material inicial usado para la alteración genética que dio como resultado la planta o célula sujeto; (b) una planta o una célula vegetal del mismo genotipo que el material inicial, pero que ha sido transformada con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene un efecto conocido sobre la característica de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador); (c) una planta o una célula vegetal que es aun segregante no transformada de la progenie de la planta o la célula vegetal sujeto; (d) una planta o una célula vegetal genéticamente idéntica a la planta o la célula vegetal sujeto, pero que no está expuesta a las condiciones o los estímulos que inducirían expresión del gen de interés; o (e) la propia planta o célula vegetal, bajo condiciones en las cuales no se expresa el gen de interés. Los siguientes ejemplos se ofrecen con fines ilustrativos, y no a modo de limitación. EJEMPLO 1 Aislamiento del gen de maíz D9 El maíz codifica dos proteínas DELLA (dwarf plante, D8 y dwarf plant9, D9), de las cuales se han aislado varias mutantes dominantes (Winkier y Freeling (1994) Plant 193:341 -348). Aunque Zm-D9 ha sido descripta desde un punto de vista genético (Winkier y Freeling (1994) Plant 193:341 -348), el gen no había sido caracterizado a nivel molecular con anterioridad. En el transcurso de este trabajo se aislaron y analizaron dos alelos Zm-D9. El alelo de Zm-D9 tipo salvaje fue aislado por RT PCR a partir de ARN de la línea de maíz B73. El alelo de Zm-D9 MUT1 fue aislado por PCR a partir de ADN genómico aislado a partir de retoños de una línea sin respuesta ante el GA denominada D9xB73 (Figura 1 ). Se predijo que Zm-D9 MUT1 carecería de ¡ntrones, como lo hacen otros genes DELLA descriptos. Para asegurar la obtención de una secuencia codificante correcta para Zm-D9 MUT1 , se verificó el ADNc por RT-PCR. Zm-D8 se localiza en BI N 1 .09, mientras que Zm-D9 se localiza en una región sintónica del cromosoma 5, BIN 5.00 (Helentjaris, et al. , (1988) Genetics 1 18:353-363; Winkler y Freeling (1994) Plant 193:341 -348; Lawrence, et al. , (2005) Plant Physiol. 138:55-58). Para verificar que los alelos aislados son formas de Zm-D9, se iniciaron múltiples proyectos, incluyendo el análisis de bibliotecas de BAC y la recapitulación de fenotipos a través de procedimientos transgénicos. Zm-D9 se mapeó en B73 BAC bacb.pk425.i4, que no pudo relacionarse con los mapas genéticos o físicos, aunque se relacionó con marcadores hallados en los cromosomas 1 y 5. Para demostrar que el Zm-D9 probable era diferente de Zm-D8, y para determinar su localización cromosómica, se realizó un análisis de PCR de líneas de adición de avena (Figura 2; Ananiev, et al. , (1997) Proc. Nati. Sci. USA 94:3524-3529), y se lo confirmó mediante la secuenciación de los productos de reacción. Este análisis permitió confirmar la localización del Zm-D9 probable en el cromosoma 5, diferente del locus de Zm-D8 en el cromosoma 1 . La localización subcelular de dos proteínas DELLA de maíz fue determinada con fusiones de proteínas fluorescentes (Figura 3). La localización probable de Zm-D9 fue similar a la de Zm-D8, y es consistente con la localización en el núcleo. La localización nuclear ha sido documentada para numerosas proteínas DELLA en otros sistemas vegetales (Silverstone, et al. , (2001 ) Plant Cell 10:155-169; Ogawa, ef al. , (2000) Gene 245:21 -29; Fleck y Harberd (2002) Plant J. 32:935-947; Gubler, et al. , (2002) Plant Physiol. 1 29: 191 -200; Wen y Chang (2002) Plant Cell 14:87-100). Se emplearon partículas de tungsteno recubiertas con las siguientes construcciones intermedias de Japan Tobacco adaptadas por Multisite Gateway (Invitrogen, EEUU) (Hiei, et al. , 1 994; Ishida, et al. , 1996): PHP23800, attB4:UBI PRO:attB1 :ZM-D8:attB2:AC-GFP1 :NOS TERM:attB3 o PHP25355, attB4:UBI PRO:attB1 :ZM-D9:attB2:AcGFP1 :NOS TERM:attB3. Tres días después de la germinación (DAG) en la oscuridad a RT, se bombardearon retoños etiolados HG1 1 con partículas con las construcciones anteriores, usando un sistema de administración de partículas Biolistic PDS-1000/He (BioRad, EEUU) y discos de ruptura de 650 psi. 6 DAG, los retoños bombardeados etiolados se visualizaron con un microscopio confocal con un disco giratorio CARV (Fryer Company, EEUU). Se produjeron plantas T2 de Arabidopsis que contenían ADNc de DELLA de maíz, dirigidas por el promotor con preferencia por las células de esclerénquima de la vasculatura de alfalfa MS-S2a. Los efectos de enanismo (desde los más severos hasta los menos severos) fueron los siguientes: Zm-D8 MUT > Zm-D8 MPL > Zm-D9 MUT1 > Zm-D8 = Zm-D9 (véase la Figura 4). Adicionalmente, los transgénicos parecieron tener una morfología floral alterada, como se observa en la Figura 5. En Zm-D8 MUT, Zm-D8 MPL, Zm-D9 y Zm-D9 MUT1 , los filamentos parecieron presentar un acortamiento preferencial, de modo que las anteras fueron más cortas que el estigma. Los transgénicos Zm-D8 MUT parecieron haber sido afectados en mayor medida, y los transgénicos Zm-D9 y Zm-D8 MPL fueron los menos afectados. Los filamentos de los transgénicos GUS y Zm-D8 parecieron no haber sido afectados. La línea transgéníca particular indicada Zm-D8 MUT también presenta esterilidad masculina, ya que no libera polen. Los resultados descriptos en las Figuras 2-5 demuestran de forma concluyente que los alelos Zm-D9 probables que fueron aislados son alelos bona fide de Zm-D9. El Zm-D9 aislado tipo salvaje está codificado en el cromosoma de maíz 5, como se ha determinado con anterioridad para Zm-D9 (Winkler y Freeling, 1994). Cuando la proteína codificada por Zm-D9 se somete a una fusión traduccional con una proteína marcadora fluorescente, se halla en una localización subcelular consistente con el núcleo, al igual que otras proteínas DELLA. Resulta más significativo que los transgénicos de Arabidopsis que contienen el alelo Zm-D9 MUT1 son enanos, mientras que aquellos que contienen Zm-D9 tipo salvaje presentan una estatura normal. Estos resultados demuestran que el alelo de la proteína muíante DELLA aislada a partir de los retoños de maíz enanos mutantes D9 efectivamente es responsable del enanismo del maíz, con lo que se verifica la identidad de este gen como Zm-D9. Los efectos sobre la arquitectura de la raíz de la expresión de proteínas DELLA de maíz también se estudiaron en las plantas T2 de Arabidopsis. Todas las plantas se cultivaron con una longitud de día de 18 horas con un sistema de bandeja de iluminación ArabiSun, en placas de Petri cuadradas verticales. Se determinó la longitud promedio de la raíz y la cantidad promedio de ápices de raíces por planta diez días después de la germinación, y los resultados se resumen en la Tabla 1 . Las plantas que contienen las construcciones Zm-D8 MPL, Zm-D8 MUT y MUT1 Zm-D9 tuvieron longitudes de raíz promedio significativamente más cortas, y presentaron significativamente menos ápices de raíces por planta que las plantas control (GUS). Por consiguiente, el gen Zm-D9, al igual que el gen Zm-D8, participa en el control de la arquitectura de la raíz, particularmente la longitud de la raíz y la ramificación de la raíz (como lo evidencia la cantidad promedio de ápices de raíces por planta). Tabla 1 . Efectos de la expresión de proteínas DELLA de maíz sobre la arquitectura de la raíz de plantas transgénicas (T2) de Arabidopsis en la etapa de crecimiento Los superíndices indican grupos que no presentan diferencias significativas en análisis de LSD con un nivel de confianza de 95%. Los datos se obtuvieron a partir de 4-15 réplicas de 4 eventos de transformación independientes. EJEMPLO 2 Transformación de plantas de maíz con Zm-D9 y regeneración de plantas transgénicas Se bombardean embriones de maíz inmaduros de plantas de invernadero donantes con un plásmido que contiene Zm-D9 unido operativamente al promotor MS-S2A (MS-S2a PRO) y el gen marcador de selección PAT (Wohlleben, et al., (1988) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialaphos. Como alternativa, se proporciona el gen marcador de selección en un plásmido separado. La transformación se llevó a cabo como se indica a continuación. Más adelante se proporcionan las recetas de los medios. Preparación del Tejido Blanco Las mazorcas se desvainan y esterilizan superficialmente en decolorante Clorox al 30%, más 0,5% de detergente Micro por 20 minutos, y se lava dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se recortan y se colocan con el eje embrionario hacia abajo (el escutelo hacia arriba), a razón de 25 embriones por placa, sobre medio 560Y durante 4 horas, y luego se alinean dentro de la zona blanco de 2,5 cm como preparación para el bombardeo. Se prepara un plásmido vector que comprende Zm-D9 unido operativamente a un promotor que se expresa en una planta. Este ADN de plásmido, más el ADN de plásmido que codifica un marcador de selección PAT, se precipita en pellets de tungsteno de 1 , 1 pm (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación con CaCI2, como se indica a continuación: 100 µ? de un preparado de partículas de tungsteno en agua; 10 µ? (1 pg) de ADN en buffer Tris EDTA (1 pg total de ADN); 100 il de CaCI2 2,5 M; y 10 il de espermidina 0, 1 M. Cada reactivo se agrega en forma consecutiva a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene esta última en un agitador para tubos múltiples. Las mezcla final se sónica brevemente y se incuba bajo agitación constante durante 10 minutos. Después del periodo de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se elimina el liquido, se lava con 500 mi de etanol al 100% y se centrifuga durante 30 segundos. Se elimina el líquido nuevamente y se agregan 105 µ? de etanol al 100% a los precipitados finales de partículas de tungsteno. Para realizar el bombardeo con cañón de partículas, se sonican brevemente las partículas de tungsteno/ADN, se introducen 10 µ? en el centro de cada macrotransportador y se deja secar por aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Las placas de muestra se bombardear a nivel N° 4 con un cañón de partículas. Todas las muestras reciben un único disparo a 650 PSI con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas preparadas/ADN. Luego del bombardeo, los embriones se mantienen en un medio 560Y durante 2 días, y luego se transfieren a un medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bíalafos, y se subcultivan cada dos semanas. Después de aproximadamente 10 días de selección, los clones de los cayos resistentes a la selección se transfieren a un medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Una vez completa la maduración de los embriones somáticos (2-4 semanas), los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren a un medio para germinación y se ubican en una recámara de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 días mas tarde, las plántulas desarrolladas se transfieren a un medio libre de hormona 272V en tubos durante 7-10 días, hasta que las plántulas se establecen correctamente. Luego se transfieren las plantas a injertos en planos (equivalentes a macetas de 2,5") que contienen tierra para macetas, y se las deja crecer por una semana en una recámara de cultivo, luego se desarrollan otras 1 -2 semanas en un invernadero, y después se las transfiere a macetas clásicas de 600 (1 ,6 galones) y se las deja crecer hasta la madurez. Las plantas se monítorean y se evalúa su altura. En esta etapa, las plantas MUT1 Zm-D9 presentan una altura reducida en aproximadamente 60%.

El medio de bombardeo (560Y) comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1 51 1 ), 0,5 mg/l de tiamina HCI, 120,0 g/l de sacarosa, 1 ,0 mg/l de 2,4-D, y 2,88 g/l de L-prolina (llevada a volumen con D-l H20 después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); 2,0 g/l de Geirite (agregado después de llevar a volumen con D-l H2O); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1 51 1 ), 0,5 mg/l de tiamina HCI, 30,0 g/l de sacarosa y 2,0 mg/l de 2,4-D (llevado a volumen con D-l H2O después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); 3,0 g/l de Geirite (agregado después de llevar a volumen con D-l H2O); y 0,85 mg/l de nitrato de plata y 3,0 mg/l de Bialaphos (ambos agregados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de regeneración de plantas (288J) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 1 1 1 17-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0, 100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCI, 0, 10 g/l de piridoxina HCI y 0,40 g/l de glicina, llevado a volumen con D-l H2O pulida) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Planta. 75:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarosa y ,0 ml/l de ácido abscísico 0,1 m (llevado a volumen con D-l H2O pulida después de ajustar el pH en 5,6); 3,0 g/l de Geirite (agregado después de llevar a volumen con D-l H2O); y 1 ,0 mg/l de ácido indolacético y 3,0 mg/l de Bialaphos (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a 60°C). El medio libre de hormonas (272V) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 1 1 1 17-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0, 100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCI, 0,10 g/l de piridoxina HCI y 0,40 g/l de glicina, llevado a volumen con D-l H2O pulida), 0, 1 g/l de mio-inositol y 40,0 g/l de sacarosa (llevado a volumen con D-l H2O pulida después de ajustar el pH en 5,6); y 6 g/l de bacto-agar (agregado después de llevar a volumen con D-l H20 pulida), esterilizado y enfriado a 60°C. Bombardeo y Medio de Cultivo El medio de bombardeo (560Y) comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1 51 1 ), 0,5 mg/l de tiamina HCI, 120,0 g/l de sacarosa, 1 ,0 mg/l de 2,4-D, y 2,88 g/l de L-prolina (llevada a volumen con D-l H20 después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); 2,0 g/l de Gelrite (agregado después de llevar a volumen con D-l H20); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1 51 1 ), 0,5 mg/l de tiamina HCI, 30,0 g/l de sacarosa y 2,0 mg/l de 2,4-D (llevado a volumen con D-l H20 después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); 3,0 g/l de Gelrite (agregado después de llevar a volumen con D-l H20); y 0,85 mg/l de nitrato de plata y 3,0 mg/l de Bialaphos (ambos agregados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de regeneración de plantas (288J) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 1 1 1 1 7-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0, 100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCI, 0, 10 g/l de piridoxina HCI y 0,40 g/l de glicina, llevado a volumen con D-l H20 pulida) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Planta. 75:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarosa y 1 ,0 ml/l de ácido abscísico 0, 1 mM (llevado a volumen con D-l H20 pulida después de ajustar el pH en 5,6); 3,0 g/l de Gelrite (agregado después de llevar a volumen con D-l H20); y 1 ,0 mg/l de ácido indolacético y 3,0 mg/l de Bialaphos (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a 60°C). El medio libre de hormonas (272V) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 1 1 1 17-074), 5,0 ml/l de solución preparada con vitaminas MS (0, 100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCI, 0, 10 g/l de piridoxina HCI y 0,40 g/l de glicina, llevado a volumen con D-l H20 pulida), 0, 1 g/l de mio-inositol y 40,0 g/l de sacarosa (llevado a volumen con D-l H20 pulida después de ajustar el pH en 5,6); y 6 g/l de bacto-agar (agregado después de llevar a volumen con D-l H20 pulida), esterilizado y enfriado a 60°C. EJEMPLO 3 Transformación mediada por Agrobacterium de maíz con Zm-D9 y regeneración de las plantas transformadas Para la transformación mediada por Agrobacterium de maíz con una o más moléculas de polinucleótidos Zm-D9 de la invención, se emplea el método de Zhao (Patente de los EEUU N° 5981840, y publicación de patente PCT W098/32326; cuyos contenidos se incorporan en la presente documentación a modo de referencia). Brevemente, se aislan embriones inmaduros de maíz y se los pone en contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias son capaces de transferir el o los polinucleótidos Zm-D9 de interés a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1 : etapa de infección). En esta etapa, los embriones inmaduros se sumergen en una suspensión de Agrobacterium para iniciar la inoculación. Los embriones se co-cultivan durante un tiempo con Agrobacterium (etapa 2: la etapa de co-cultivo). Preferentemente, los embriones inmaduros se cultivan sobre un medio sólido después del paso de infección. Luego de este período de co-cultivo, se contempla una etapa opcional de "reposo". En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en presencia de al menos un antibiótico del que se sabe que inhibe el crecimiento de Agrobacterium, sin la adición de un agente de selección para las plantas transformantes (etapa 3: etapa de reposo). Los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para eliminar el Agrobacterium y para la fase de reposo de las células infectadas. Luego, los embriones inoculados fueron cultivados en un medio que contenia un agente de selección y se hicieron crecer y se recuperaron los callos transformados (etapa 4: etapa de selección). Los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con un agente selectivo dando como resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. Luego se regeneran los callos para obtener plantas (etapa 5: el paso de regeneración) y los callos que crecen sobre el medio selectivo se cultivan sobre medio sólido para regenerar las plantas. EJEMPLO 4 Transformación de embriones de soja con Zm-D9 y regeneración de las plantas transformadas Condiciones de cultivo Se mantienen cultivos en suspensión de soja embriogénica (cv. Jack) en 35 mi de medio líquido SB196 (véanse las recetas más adelante) en un agitador rotativo, a 150 rpm y 26°C, con luces fluorescentes blancas frescas y un fotoperíodo de 16:8 horas de día/noche, a una intensidad de 60-85 /vE/m2/s. Los cultivos se subcultivan cada 7 días o dos semanas, inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de SB196 liquido fresco (el intervalo de subcultivo preferido es cada 7 días). Se transforman cultivos embriogénicos de soja en suspensión con los plásmidos y fragmentos de ADN que se describen en los siguientes ejemplos con el método de bombardeo con pistola de partículas (Klein et al., (1987) Nature, 327:70). Inicio de los cultivos embriogénicos de soja en suspensión Los cultivos de soja se inician dos veces por mes con 5-7 días entre cada inicio.

Se toman vainas con semillas inmaduras de plantas de soja disponibles 45-55 días después de plantarlas, se retiran de sus recubrimientos y se colocan en una caja magenta esterilizada. Las semillas de soja se esterilizan agitándolas durante 15 minutos en una solución de Clorox al 5% con 1 gota de jabón blanco (95 mi de agua destilada esterilizada en autoclave más 5 mi de Clorox y 1 gota de jabón). Mezclar bien. Las semillas se enjuagan usando 2 botellas de 1 litro de agua destilada estéril y las que son de menos de 4 mm se colocan sobre portaobjetos para microscopio individuales. Se corta el extremo pequeño de la semilla y los cotiledones son presionados fuera del recubrimiento de la semilla. Los cotiledones se transfieren a placas que contienen medio SB1 (25-30 cotiledones por placa). Las placas se envuelven con cinta y se guardan durante 8 semanas. Una vez transcurrido este tiempo se recortan los embriones secundarios y se colocan en medio líquido SB196 durante 7 días. Preparación del ADN para el bombardeo Para el bombardeo se usa ya sea un plásmido intacto o un fragmento de ADN de plásmido que contiene a los genes de interés y al gen marcador seleccionable. El ADN de plásmido para el bombardeo se prepara de forma rutinaria y se purifica usando el método descrito en la Guía de Protocolos y Aplicaciones de Promega™, Segunda Edición (página 106). Se obtienen fragmentos de los plásmidos que contienen el polinucleótido Zm-D9 por medio de un aislamiento en gel de plásmidos digeridos dos veces. En cada caso, se digieren 100 g de ADN de plásmido en 0,5 mi de la mezcla de enzimas específica que sea apropiada para el plásmido de interés. Los fragmentos de ADN resultantes se separan mediante electroforesis sobre gel con agarosa SeaPlaque GTG 1 % (BioWhitaker Molecular Applications) y se recortan los fragmentos de ADN que contienen al polinucleótido Zm-D9 del gel de agarosa. El ADN se purifica de la agarosa usando la enzima de digestión GELase según el protocolo del proveedor.

Se toma una alícuota de 50 µ? de agua destilada estéril que contiene 3 mg de partículas de oro (3 mg de oro) y se agrega a 5 µ\ de una solución de ADN 1 µg/µ\ (ya sea el plásmido intacto o fragmento de ADN preparado como se describió previamente), 50 µ\ de CaCI2 2,5 M y 20 µ\ de espermidina 0,1 M. La mezcla se agita durante 3 min en el nivel 3 de un agitador con vortexeo y se centrifuga durante 10 seg en una microcentrv/fuga de mesada. Después de un lavado con 400 µ? de etanol 100% el pelet se suspende por sonicación en 40 µ\ de etanol 100%. Se disponen cinco µ\ de suspensión de ADN en cada disco volador de los discos del instrumento Biolistic PDS1000/HE. Cada 5 µ? de alícuota contiene aproximadamente 0,375 mg de oro por bombardeo (es decir por disco). Preparación del tejido y bombardeo con el ADN Se colocan aproximadamente 150-200 mg de cultivos embrionarios en suspensión de 7 días en una caja de Petri de 60 x 15 mm vacía, estéril, y la caja se cubre con una malla de plástico. El tejido es bombardeado con 1 o 2 disparos por placa con la presión de ruptura de membrana definida en 1 100 psi y la cámara evacuada hasta un vacío de 27-28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 3,5 pulgadas de la malla de retención/detención. Selección de los embriones transformados Los embriones transformados fueron seleccionados usando ya sea higromicina (cuando se usaba el gen de la higromicina fosfotransferasa, HPT, como marcador seleccionare) o clorsulfurón (cuando se usaba el gen de la acetolactato sintetasa, ALS, como marcador seleccionare).

Selección con higromicina (HPT) Después del bombardeo, el tejido se coloca en medio SB196 fresco y se cultiva como se describió previamente. Seis días después del bombardeo, se cambio el medio SB196 por medio SB196 fresco que contiene al agente de selección higromicina 30 mg/l. El medio de selección se cambia una vez por semana. Cuatro a seis semanas después de la selección, se puede observar tejido verde, transformado creciendo desde las masas embriogénicas necróticas no transformadas. El tejido verde aislado se retira y se inocula en placas de múltiples cavidades para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénicos transformados, propagados por clonación. Selección sobre clorsulfurón (ALS) Después del bombardeo, el tejido se divide en 2 frascos con medio SB196 fresco y se cultiva como se describió previamente. Seis a siete días después del bombardeo, se cambia el medio SB196 por medio SB196 fresco que contiene al agente de selección clorsulfurón 100 ng/ml. El medio de selección se cambia una vez por semana. Cuatro a seis semanas después de la selección, se puede observar tejido verde, transformado creciendo desde las masas embriogénicas necróticas no transformadas. El tejido verde aislado se retira y se inocula en placas de múltiples cavidades que contienen medio SB196 para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénicos transformados, propagados por clonación. Regeneración de embriones somáticos de soja en plantas de soja Con el fin de obtener plantas completas a partir de los cultivos embriogénicos en suspensión, es necesario regenerar el tejido. Maduración de los embriones Los embriones se cultivan durante 4-6 semanas a 26°C en SB196 bajo luz fluorescente blanca fría (Phillips Cool White Econowatt F40/CW/RS/EW) y bulbos Agro (Phillips F40 Agro) (40 vatios) con un fotoperíodo de 16:8 hs con una intensidad lumínica de 90-120 uE/m2.s. Una vez transcurrido este período, las masas de embriones se llevan a un medio de agar sólido, SB166, durante 1 -2 semanas. Las masas se subcultivan luego en medio SB103 durante 3 semanas. Disección y germinación de los embriones Se disectan embriones individuales maduros colocándolos en una pequeña caja de Petñ vacía (35 x 10 mm) durante aproximadamente 4-7 días. Las placas se sellan con cinta (creando así una pequeña cámara húmeda). Los embriones disecados se plantan en medio SB71 -4 donde se dejan para que germinen bajo las mismas condiciones de cultivo que se describieron previamente. Las plántulas germinadas se retiran del medio de germinación y se enjuagan exhaustivamente con agua y luego se plantan en tierra Redi-Earth en una bandeja de 24 celdas, cubierta con un domo de plástico traslúcido. Después de 2 semanas, se retira el domo y se deja que las plantas maduren durante otra semana más. Si las plántulas tenían un aspecto maduro se transplantaban a macetas 10" de tierra Redi-Earth con hasta 3 plántulas por maceta. Después de 10 a 16 semanas, se cosecharon las semillas maduras, se cortaron y se analizaron por su contenido de proteínas. Recetas de los medios Medio de proliferación líquido SB 196 - FN Lite (por litro): MS FeEDTA: Solución madre 1 100x 10 mi MS Sulfato: Solución madre 2 100x 10 mi Haluros FN Lite: Solución madre 3 100x 10 mi FN Lite ?,?,?? - 100x Stock 4 10 mi Vitaminas B5 (1 ml/l) 1 ,0 mi 2,4-D (concentración final 10mg/l) 1 ,0 mi KN03 2,83 g (NH4 )2 SO 4 0,463 g Asparagina 1,0 g Sacarosa (1%) 10 g pH 5,8 Soluciones madre FN Lite N° de solución madre 1000 mi 500 mi 1 Solución madre MS Fe EDTA 100x Na2 EDTA* 3,724 g 1 ,862 g FeS04-7H20 2,784 g 1,392 g Agregar primero, disolver en botella oscura bajo agitación 2 Solución madre de MS Sulfato 100x MgS04-7H20 37,0 g 18,5 g MnS04-H20 1,69 g 0,845 g ZnS04 - 7H20 0,86 g 0,43 g CuS04-5H2O 0,0025 g 0,00125 g 3 Solución madre de haluros FN Lite 100x CaCI2-2H20 30,0 g 15,0 g Kl 0,083 g 0,0715 g CoCI2 - 6H20 0,0025 g 0,00125 g 4 FN Lite ?,?,?? 100x Stock KH2P04 18,5 g 9,25 g H3B03 0,62 g 0,31 g Na2Mo04 - 2H20 0,025 g 0,0125 g El medio sólido SB1 comprende (por litro): 1 paquete de sales MS (GIBCO/BRL: N° Cat. 1 1 1 17-066); 1 mi de solución madre de vitaminas B5 1000X; 31 ,5 g sacarosa; 2 mi de 2,4-D (concentración final 20mg/l); pH 5,7; y 8 g de agar TC. El medio sólido SB 166 comprende (por litro): 1 paquete de sales MS (GIBCO/BRL: N° Cat. 1 1 1 17-066); 1 mi de solución madre de vitaminas B5 1000X; 60 g de maltosa; 750 mg de MgCI2 hexahidrato; 5 g de carbón activado; pH 5,7; y 2 g de Gelrite. El medio sólido SB 103 comprende (por litro): 1 paquete de sales MS (GIBCO/BRL, N° Cat. 1 1 1 17-066); 1 mi de solución madre de vitaminas B5 1000X; 60 g de maltosa; 750 mg de MgCI2 hexahidrato; pH 5,7; y 2 g de Gelrite. El medio sólido SB 71 -4 comprende (por litro): 1 botella de sales B5 de Gamborg l sacarosa (Gibco/BRL - N° Cat. 21 153-036); pH 5,7; y 5 g de agar TC. La solución madre de 2,4-D se obtiene lista para usar de Phytotech N° Cat. D 295; la concentración es de 1 mg/ml. La solución madre de vitaminas B5 (por cada 100 mi) que se guarda en alícuotas a -20°C comprende: 10 g de mio-inositol; 100 mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HCI; y 1 g de tiamina. Si la solución no se disuelve con suficiente rapidez, se puede aplicar un bajo nivel de calor con la placa de agitación caliente. La solución madre de clorosulfurón comprende 1 mg/ml en hidróxido de amonio 0,01 N. EJEMPLO 5 Transformación de tejido meristemático de girasol con Zm-D9 y regeneración de las plantas transformadas Se transforman tejidos meristemáticos de girasol con un cassette de expresión que contiene una molécula de un polinucleótido Zm-D9 de la invención, unido operativamente al promotor MS-S2A, como se indica a continuación (véase también la Patente Europea Número EP 0 486233, incorporada en la presente documentación a modo de referencia, y Malone-Schoneberg, et al. , (1994) Plant Science 103:199-207). Se eliminan las cascaras de semillas de girasol maduras (Helianthus annuus L.) usando una trilladora con cabeza individual para trigo. Se esterilizan en forma superficial las semillas por 30 minutos en una solución de decolorante Clorox al 20%, con la adición de dos gotas de Tween 20 por cada 50 mi de solución. Se lavan las semillas dos veces con agua destilada estéril. Se preparan explantes de ejes embrionarios separados mediante una modificación de los procedimientos descriptos por Schrammeijer, et al., (Schrammeijer, et al. , (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Se embeben las semillas en agua destilada por 60 minutos, después de un procedimiento de esterilización superficial. Luego se separan los cotiledones de cada semilla para obtener una fractura clara en el plano del eje del embrión. Después de separar el extremo de la raíz, se disectan los explantes en forma longitudinal entre las hojas primordiales. Se colocan las dos mitades, con la superficie cortada hacia arriba, en un medio GBA que consiste en elementos minerales Murashige y Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Planta. 1 5:473-497), vitaminas de Shepard (Shepard (1980) en Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St.Paul, Minnesota), 40 mg/l de sulfato de adenina, 30 g/l de sacarosa, 0,5 mg/l de 6-bencil-aminopurina (BAP), 0,25 mg/l de ácido indol-3- acético (IAA), 0, 1 mg/l de ácido giberélico (GA3), pH 5,6, y 8 g/l de Phytagar.

Los explantes se someten a un bombardeo con microproyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium (Bidney, eí al. , (1992) Plant Mol. Biol. 18:301 -313). Para este tratamiento se colocan entre treinta y cuarenta explantes en un círculo en el centro de una placa de 60 x 20 mm. Se suspenden nuevamente aproximadamente 4,7 mg de microproyectiles de tungsteno de 1 ,8 mm en 25 mi de amortiguador TE estéril (Tris HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), y se usan alícuotas de 1 ,5 mi para cada bombardeo. Se bombardea cada placa dos veces a través de una pantalla de nytex de 150 mm, colocada a una altura de 2 cm de las muestras, en un dispositivo de aceleración de partículas PDS 1000®. Se usa la cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens EHA105 en todos los experimentos de transformación. Se introduce un plásmido vector primario, que comprende el cassette de expresión que contiene la molécula del polinucleótido Zm-D9, unido operativamente al promotor, en la cepa de Agrobacterium EHA105, mediante congelamiento-descongelamiento, como se describe en Holsters, et al. , (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 181 -187. Además, este plásmido comprende un gen marcador de selección con kanamicina (es decir, nptll). Las bacterias para los experimentos de transformación de plantas se cultivan durante la noche (a 28°C y con agitación continua a 100 rpm) en medio líquido YEP (10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de bactopeptona y 5 g/l de NaCI, pH 7,0), con los antibióticos apropiados necesarios para mantener la cepa bacteriana y los plásmidos binarios. La suspensión se usa cuando alcanza una OD600 de entre aproximadamente 0,4 y 0,8. Las células de Agrobacterium se precipitan y se suspenden nuevamente a una OD600 final de 0,5, en un medio de inoculación compuesto por MES 12,5 mM, pH 5,7, 1 gm/l de NH CI, y 0,3 gm/l de MgS0 .

Los explantes recién bombardeados se colocan en una suspensión de Agrobacterium, se mezcla y se deja reposar por 30 minutos. Luego se transfieren los explantes a un medio GBA y se los co-cultiva, con la superficie cortada hacia abajo, a 26°C y con días de 18 horas. Después de tres días de co-cultivo, los explantes se transfieren a un medio 374B (un medio GBA sin reguladores del crecimiento y con un nivel de sacarosa reducido de 1 %) suplido con 250 mg/l de cefotaxima y 50 mg/l de sulfato de kanamicina. Los explantes se cultivan por entre dos y cinco semanas en medio de selección, y luego se transfieren a un medio 374B fresco que carece de kanamicina, para que se desarrollen en forma continua por una o dos semanas. Los explantes con áreas de crecimiento diferenciadas, resistentes a antibióticos, que no han producido brotes apropiados para la escisión, se transfieren a un medio GBA que contiene 250 mg/l de cefotaxima, para efectuar un segundo tratamiento con fitohormonas de 3 días. En muestras de hojas de brotes verdes resistentes a kanamicina se evalúa la presencia de NPTII por ELISA y la presencia de expresión transgénica mediante la evaluación de la actividad de Zm-D9. Los brotes positivos para NPTII se injertan en brotes con raíces de híbridos Pioneer® 6440 de girasol cultivados in vitro. Se hacen germinar las semillas esterilizadas en forma superficial en medio 48-0 (sales Murashige y Skoog con media fuerza, 0,5% de sacarosa, 0,3% de Gelrite™ , pH 5,6), y se las cultiva bajo las condiciones descriptas para el cultivo de explantes. Se retira la porción superior del brote, se efectúa un corte vertical de 1 cm en el hipocótile y se inserta el brote transformado en el corte. Se envuelve el área entera con parafilm para asegurar la raíz. Las plantas injertadas pueden transferirse a la tierra después de una semana de cultivo ¡n vitro. » Los injertos en la tierra se mantienen bajo condiciones de humedad elevada, después de una aclimatación lenta al ambiente del invernadero. Los sectores transformados de las plantas T0 (generación progenitora) que maduran en el invernadero se identifican por medio de un ELISA de NPTII de extractos de hojas. EJEMPLO 6 Expresión y caracterización de Zm-D9 Los perfiles de expresión demuestran que, desde el punto de vista del desarrollo, d9 presenta preferencia por células maduras diferenciadas, particularmente aquellas asociadas con el tallo, mientras que d8 está más asociado con las células en división o meristemáticas (Figura 10). Por ejemplo, d8 se expresa en una medida significativamente mayor en meristemas, la región de división del tallo (internodo) y la zona de transición, mientras que d8 y d9 se expresan de forma aproximadamente pareja en la zona madura del internodo. Los mayores niveles de expresión de d8 y d9 se hallaron en las mazorcas y los haces vasculares, respectivamente. En general, los órganos/tejidos vasculares tuvieron una mayor expresión de ambos genes que los órganos/tejidos no vasculares. Esto es consistente con una presencia de ARNm y proteínas de DELLA en y cerca de la vasculatura en dicotiledóneas (Haywood, er a/., (2005) Plant Journal 42:49-68; Israelsson, et al., (2005) Plant Journal 44:494-504), y sugiere que la localización se ha conservado entre dicotiledóneas y monocotiledóneas. Para determinar con mayor precisión la naturaleza del alelo D9, se crearon construcciones de intercambio de dominios y se las transformó en Arabidopsis. Se intercambiaron cinco regiones genéticas entre los clones de ingreso d9 y D9 (Figura 1 1 ), y los clones quiméricos de ingreso resultantes se usaron para crear el intermediario S2A PRO::DELLA y los vectores co-integrados para la transformación descriptos para los alelos nativos de maíz. Se realizó un análisis morfométrico de los transgénicos con intercambio de dominios en la generación ?? (Figura 14). La mutación E600K de D9 es necesaria y suficiente para el enanismo y los cambios fenotípicos de florecimiento más temprano. d9 E600K y D9 K597E produjeron efectos morfológicos diferentes de los producidos por sus alelos de esqueleto (Figura 14). Las diferencias más notables se hallaron en la altura de la planta, la longitud del fruto, los días hasta el florecimiento y la cantidad de hojas en roseta en el florecimiento. En los cuatro casos, las plantas d9 (E600K) presentaron características similares a las D9. En promedio, la quimera d9 (E600K) produjo las plantas con los tallos y los frutos más cortos, que tuvieron menos hojas en roseta en el florecimiento que cualquiera de las diez construcciones. Por otro lado, D9 K597E se halló en el segundo o tercer lugar de importancia para la longitud del fruto, los días hasta el florecimiento y la cantidad de hojas en roseta en el florecimiento. Ningún otro polimorfismo presentó un patrón claro de cambios en la estatura o el tiempo de florecimiento. Por consiguiente, esta y otras mutaciones pueden tener una aplicación específica en el cambio de la estatura del maíz, para obtener un tipo de grano con una estructura con un gran potencial de rendimiento. Se descubrió que los alelos enanos DELLA aceleraban el florecimiento de Arabidopsis. D8 MPL y D8 MUT florecieron aproximadamente 6 días más temprano (Figura 12). Sorprendentemente, D9 aceleró el florecimiento en 1 1 días (26,5%). Este efecto parece estar relacionado con la insensibilidad a la giberelina, ya que los tiempos de florecimiento de los transgénicos d8 y d9 no fueron significativamente diferentes de los del control GUS. El gen D9 provoca un florecimiento tardío en TO GS3xGaspe Flint (Figura 1 3), mientras que d9 produjo un florecimiento más temprano (usando el total de nodos sobre la tierra como base para el cambio de madurez; Figura 12). No se observaron alteraciones en el tiempo de florecimiento en el maíz transgénico d8 o D8 MPL.

Se seleccionó el promotor MS-S2A para dirigir la expresión de cinco alelos DELLA de maíz en Arabidopsis transgénica. Se usó el promotor de actina 1 de arroz para dirigir estos alelos en Arabidopsis en un conjunto de trangsénicos tempranos. Las plantas T1 de estas transformaciones no presentaron un fenotipo visible, lo que sugiere que el promotor de actina 1 de arroz no expresaba las proteínas DELLA en los tejidos apropiados. Dado este resultado, los perfiles de expresión de d8 y d9 (Figura 10), y el trabajo de Haywood , et al., ((2005) Plant Journal 42:49-68), que demostraron una asociación de las proteínas y los ARNm de DELLA con la vasculatura de estas especies, se seleccionó el promotor MS-S2A para la expresión de DELLA de maíz en Arabidopsis y maíz. Se seleccionó un abordaje transgénico para efectuar una comparación directa de los alelos de maíz que no estuviera sesgada por los efectos dependientes del promotor. Estos datos establecen el uso de promotores específicos para tejidos como una estrategia para cambiar la arquitectura de una planta. EJEMPLO 7 Variantes de Zm-D9 A. Variantes de secuencias de nucleótidos de Zm-D9 (SEQ ID N° 1 , 3, 4 ó 6) que no alteran la secuencia de aminoácidos codificada La secuencia de nucleótidos Zm-D9 detallada en SEQ ID N° 1 , 3, 4 ó 6 se usa para generar variantes de secuencias de nucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos del marco abierto de lectura, con aproximadamente 70%, 76%, 81 %, 86%, 92% y 97% de identidad de secuencia nucleótidos respecto de la secuencia de nucleótidos del ORF original no alterado de SEQ ID N° 1 , 3, 4 ó 6. Estas variantes funcionales se generan usando una tabla de codones convencional. Si bien se altera la secuencia de nucleótidos de la variante, la secuencia de aminoácidos codificada por el marco abierto de lectura no cambia.

B. Variantes de las secuencias de aminoácidos Zm-D9 Se generan variantes de las secuencias de aminoácidos de Zm-D9. En este ejemplo se altera un aminoácido. Específicamente, se revisa la secuencia de aminoácidos detallada en SEQ ID N° 2 ó 5 para determinar la alteración de aminoácidos apropiada. La selección del aminoácido a cambiar se efectúa consultando el alineamiento de proteínas (con los otros ortólogos y con otros miembros de familias de genes de varias especies). Véase la Figura 7. Se selecciona un aminoácido del que no se considera que está bajo una presión de selección elevada (no muy conservado), que puede ser sustituido fácilmente por un aminoácido con características químicas similares (es decir, cadenas laterales funcionales similares). Usando el alineamiento de proteínas detallado en la Figura 7, puede cambiarse un aminoácido apropiado. Una vez que se identifica el aminoácido deseado, se sigue el procedimiento detallado en el Ejemplo 6A. Usando este método se generan variantes que tienen aproximadamente 70%, 75%, 81 %, 86%, 92% y 97% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con SEQ ID N° 1 , 3, 4 0 6. C. Otras Variantes de las secuencias de aminoácidos Zm-D9 En este ejemplo se crean secuencias de proteínas artificiales que tienen 82%, 87%, 92% y 97% de identidad respecto de la secuencia de la proteína de referencia. Este último esfuerzo requiere de la identificación de regiones conservadas y variables en el alineamiento presentado en la Figura 7, y luego es necesaria la aplicación apropiada de una tabla de sustituciones de aminoácidos. Estas partes se describen con mayor detalle a continuación. En gran medida, la determinación de cuáles secuencias de aminoácidos se alteran se basa en las regiones conservadas entre las proteínas Zm-D9 u otras proteínas DELLA. Véase la Figura 7. Sobre la base del alineamiento de secuencias, las diversas regiones de la proteína Zm-D9 que pueden alterarse se representan en letras minúsculas, mientras que las regiones conservadas se representan con letras mayúsculas. Se reconoce que pueden efectuarse sustituciones conservativas en las siguientes regiones conservadas sin alterar la función. Además, aquél entrenado en la técnica comprenderá que las variantes funcionales de una secuencia de aminoácidos Zm-D9 de la invención pueden tener alteraciones de secuencias de aminoácidos no conservadas menores en el dominio conservado. Las regiones conservadas se hallan aproximadamente entre los aminoácidos 37 y 109, 224 y 504, 528 y 625 de SEQ I D N° 2. Las regiones no conservadas están aproximadamente entre los aminoácidos 1 y 36, 1 10 y 223, 505 y 527 de SEQ ID N° 2. Luego se crean secuencias de proteínas artificiales que son diferentes de la original en los intervalos de 80-85%, 85-90%, 90-95% y 95-100% de identidad. Se buscan los puntos medios de estos intervalos, con intervalos de incertidumbre de más o menos 1 %, por ejemplo. Se efectuarán sustituciones de aminoácidos empleando un programa Perl modificado. En la Tabla 2 se proporciona la tabla de sustituciones.

Tabla 2. Tabla de sustitución puede cambiar No hay sustitutos H Na apropiados No hay sustitutos C Na apropiados No hay sustitutos P Na apropiados Primero, se identifican los aminoácidos conservados que no deberían cambiarse en la proteína, y se los "marca en forma negativa" para aislarlos de al sustitución. Por supuesto, se agrega la metionina inicial automáticamente a esta lista. Luego se efectúan los cambios. No se cambian H, C, y P bajo ninguna circunstancia. Los cambios tendrán lugar primero con isoleucina, pasando de N-terminal a C-terminal. Después la leucina, y así sucesivamente avanzando por la lista hasta obtener el blanco deseado. Pueden efectuarse sustituciones de cantidades intermedias para no provocar una inversión de los cambios. La lista se ordena de 1 a 17, con el objeto de comenzar con tantos cambios de isoleucina como sea posible antes de la leucina, y se sigue del mismo modo hasta la metionina. Claramente, no será necesario cambiar muchos aminoácidos de este modo. L, I y V comprenderán una sustitución 50:50 de las dos sustituciones óptimas alternadas. Se escriben las variantes de las secuencias de aminoácidos como salida del programa. Se usa el programa Perl para calcular los porcentajes de identidad. Usando este procedimiento, se generan vanantes de una proteína Zm-D9 que tienen aproximadamente 82%, 87%, 92% y 97% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de nucleótidos del ORF inicial no alterado de SEQ ID N° 1 , 3, 4 ó 6.

Los artículos "un" y "una" se usan en la presente para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. Todas las publicaciones y las solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de aquellos entrenados en la técnica a los cuales está dirigida esta invención. Todas las publicaciones y las solicitudes de patente se incorporan en la presente documentación a modo de referencia, en la misma extensión en que se indicó que se incorporaba cada publicación o solicitud de patente individual específica e individualmente en la presente documentación a modo de referencia. Aunque la invención precedente ha sido descripta con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo, con el fin de facilitar la compresión, será obvio que podrán practicarse determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Ejemplo 8 Expresión y caracterización de Zm-D9 en maíz Se evaluaron las construcciones de intercambio de dominios (véase el ejemplo 6) d9 E600k y D9 K597E en maíz (generación T0) para determinar su efecto sobre la altura de la planta, la cantidad de hojas, los días hasta la emergencia de espiguillas, los días hasta el primer polen liberado, y los días hasta la polinización. Los datos fenotípicos de d9 E600k y D9 K597E se compararon con los datos correspondientes al uso del alelo MUT1 Zm-D9 y el alelo Zm-D8 MPL. En todos los casos, se usó el promotor S2a para dirigir la expresión de los genes estructurales respectivos. La construcción del vector fue como se detalla en el ejemplo 6. La altura de la planta de D9 K597E no se vio alterada en comparación con las plantas de maíz no transformadas del mismo genotipo que crecieron al mismo tiempo en el invernadero. De forma similar, la cantidad de hojas, los días hasta la emergencia de espiguillas, los días hasta el primer polen liberado, y los días hasta la polinización de D9 K597E fueron similares a los de las plantas no transformadas. En promedio, los transgénicos MUT1 D9 y d9 E600K tuvieron una hoja adicional en comparación con D9 K597E. Los transgénicos d9 E600 K y MUT1 D9 tuvieron una altura dramáticamente reducida (reducción de 50% y 30%, respectivamente), en comparación con D9 K597E. Por otro lado, d9 E600k y MUT1 D9 presentaron una emergencia de espiguillas, una liberación de polen y una fecha de polinización demorada en comparación con D9 K597E. La liberación de polen se vio demorada hasta 14 días con MUT1 D9, y 10 días con d9 E600k. La demora de la polinización fue similar con estas plantas transgénicas. Además, estos transgénicos presentaron aproximadamente un nodo extra en comparación con D9 K597E. Estos datos indican un patrón similar al de Arabidopsis con relación a la altura (tallos más cortos), pero el fenotipo opuesto para el desplazamiento de la madurez, donde MUT1 D9 y d9 E600k presentan una madurez demorada. Estos datos confirman la significación de este polimorfismo para los cambios de estatura y tiempo de florecimiento en Arabidopsis y maíz. Las mutaciones MUT1 D9 y d9 E600k podrían tener una aplicación específica en el cambio de la estatura, la cantidad de nodos o la madurez en una arquitectura vegetal alternativa para un tipo de grano, una arquitectura con gran potencial en maíz.

Claims

REIVINDICACIONES: 1 . Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID N° 2 ó 5; (b) la secuencia de aminoácidos que comprende al menos 93% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2, donde dicho polipéptido tiene actividad de Zm-D9; (c) la secuencia de aminoácidos que comprende al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 5, donde dicho polipéptido tiene actividad de MUT1 Zm-D9; (d) la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de SEQ ID N° 1 ó 3, donde dichas condiciones severas comprenden una hibridización en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC 0,1 x a una temperatura de entre 60°C y 65°C; (e) la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de SEQ ID N° 4 ó 6, donde dichas condiciones severas comprenden una hibridización en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC 0,1 x a una temperatura de entre 60°C y 65°C; (f) la secuencia de aminoácidos que comprende al menos 124 aminoácidos consecutivos de SEQ ID N° 2, donde dicho polipéptido retiene la actividad de Zm-D9; y (g) la secuencia de aminoácidos que comprende al menos 124 aminoácidos consecutivos de SEQ ID N° 5, donde dicho polipéptido retiene la actividad de MUT1 Zm-D9. Una molécula de polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID N° 1 , 3, 4 ó 6; (b) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID N° 2 ó 5; (c) la secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a), donde dichas condiciones severas comprenden una hibridización en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC 0,1 x a una temperatura de entre 60°C y 65°C; (d) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 92% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 1 ó 3, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Zm- D9; (e) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 698 nucleótidos consecutivos de SEQ ID N° 1 ó 3, o un complemento de ésta; (f) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 93% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Zm-D9; y (g) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 4 ó 6, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de MUT1 Zm-D9; (h) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 395 nucleótidos consecutivos de SEQ ID N° 4 ó 6, o un complemento de ésta; y (i) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 5, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de MUT1 Zm-D9. Un cassette de expresión que comprende la molécula de polinucleótido de la reivindicación 2. El cassette de expresión de la reivindicación 3, donde dicha molécula de polinucleótido está unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en una planta. Una célula huésped no humana que comprende el cassette de expresión de la reivindicación 3 ó 4. La célula huésped de la reivindicación 5, donde dicha célula huésped es una célula vegetal, una célula bacteriana o una célula fúngica. Una planta que comprende una molécula de polinucleótido unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en la planta, donde dicha molécula de polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID N° 1 , 3, 4 ó 6; (b) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID N° 2 ó 5; la secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a), donde dichas condiciones severas comprenden una hibridización en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC 0,1 x a una temperatura de entre 60°C y 65°C; la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 92% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 1 ó 3, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Zm-D9; la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 698 nucleótidos consecutivos de SEQ ID N° 1 ó 3, o un complemento de ésta; la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 93% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Zm-D9; y la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 4 ó 6, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de MUT1 Zm-D9; la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 395 nucleótidos consecutivos de SEQ ID N° 4 ó 6, o un complemento de ésta; y la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 5, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de MUT1 Zm-D9. La planta de la reivindicación 7, donde dicha planta es una célula. La planta de la reivindicación 7, donde dicha planta es una monocotiledónea. La planta de la reivindicación 9, donde dicha monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, sorgo, centeno, mijo y cebada. La planta de la reivindicación 7, donde dicha planta es una dicotiledónea. La planta de la reivindicación 1 1 , donde dicha dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en Arabidopsis, soja, girasol, cártamo, alfalfa, Brassica, algodón y maní. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, donde dicha molécula de polinucleótido está incorporada en forma estable en el genoma de la planta. La planta de la reivindicación 13, donde dicha planta es una semilla. Un método para incrementar el nivel de un polipéptido en una planta, que comprende introducir en dicha planta una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID N° 1 , 3, 4 ó 6; (b) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID N° 2 ó 5; (c) la secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a), donde dichas condiciones severas comprenden una hibridización en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC 0,1 x a una temperatura de entre 60°C y 65°C; la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 92% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 1 ó 3, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Zm- D9; la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 698 nucleótidos consecutivos de SEQ ID N° 1 ó 3, o un complemento de ésta; la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 93% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Zm-D9; y la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 4 ó 6, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de MUT1 Zm-D9; la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 395 nucleótidos consecutivos de SEQ ID N° 4 ó 6, o un complemento de ésta; y la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 5, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de MUT1 Zm-D9. i método para modular el nivel de un polipéptido en una planta, que mprende introducir en dicha planta una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID N° 1 , 3, 4 ó 6; (b) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID N° 2 ó 5; (c) la secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a), donde dichas condiciones severas comprenden una hibridización en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC 0,1 x a una temperatura de entre 60°C y 65°C; (d) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 92% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 1 ó 3, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Zm- D9; (e) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 698 nucleótidos consecutivos de SEQ ID N° 1 ó 3, o un complemento de ésta; (f) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 93% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Zm-D9; y (g) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 4 ó 6, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de MUT1 Zm-D9; (h) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 395 nucleótidos consecutivos de SEQ ID N° 4 ó 6, o un complemento de ésta; y (i) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 5, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de MUT1 Zm-D9. El método de la reivindicación 1 5 ó 16, donde dicha molécula de polinucleótido está integrada en forma estable en el genoma de la planta. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 5-17, donde dicha planta es una célula vegetal. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 5-17, donde dicha planta es una dicotiledónea. El método de la reivindicación 19, donde dicha dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en Arabidopsis, soja, girasol, cártamo, alfalfa, Brassica, algodón y maní. El método de cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde dicha planta es una monocotiledónea. El método de la reivindicación 21 , donde dicha monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, sorgo, centeno, mijo y cebada. El método de cualquiera de la reivindicación 1 5, donde dicha planta es una semilla. Un método para modificar el crecimiento de una planta, donde dicho método comprende transformar un organismo con una construcción de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleotidos en dicho organismo, donde dicha secuencia de nucleotidos se selecciona del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleotidos que comprende SEQ ID N° 1 , 3, 4 ó 6; (b) la secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID N° 2 ó 5; (c) la secuencia de nucleotidos que hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la secuencia de nucleotidos de (a), donde dichas condiciones severas comprenden una hibridización en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC 0,1 x a una temperatura de entre 60°C y 65°C; (d) la secuencia de nucleotidos que comprende al menos 92% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 1 ó 3, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Zm- D9; (e) la secuencia de nucleotidos que comprende al menos 698 nucleotidos consecutivos de SEQ ID N° 1 ó 3, o un complemento de ésta; (f) la secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 93% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 2, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de Zm-D9; y (g) la secuencia de nucleotidos que comprende al menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 4 ó 6, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de MUT1 Zm-D9; (h) la secuencia de nucleótidos que comprende al menos 395 nucleótidos consecutivos de SEQ ID N° 4 ó 6, o un complemento de ésta; y (i) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID N° 5, donde dicha molécula de polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de MUT1 Zm-D9. El método de la reivindicación 24, donde dicha secuencia de nucleótidos está unida operativamente a dicho promotor para la producción de transcriptos antisentido. El método de la reivindicación 24, donde la altura de dicha planta es menor que la de una planta no transformada. El método de la reivindicación 24, donde la altura de dicha planta es mayor que la de una planta no transformada. El método de la reivindicación 27, donde la arquitectura de la raíz de dicha planta está modificada en comparación con una planta no transformada. El método de la reivindicación 24, donde dicha planta es una monocotiledónea. El método de la reivindicación 29, donde dicha monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, sorgo, centeno, mijo y cebada. El método de la reivindicación 24, donde dicha planta es una dicotiledónea. El método de la reivindicación 31 , donde dicha dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en Arabidopsis, soja, girasol, cártamo, alfalfa, Brassica, algodón y maní.