KR20040065235A

KR20040065235A - 키메라 단백질의 표현형질 스크리닝

Info

Publication number: KR20040065235A
Application number: KR1020047008726A
Authority: KR
Inventors: 김진수; 박경순; 이동기; 설원기; 이호림; 이성일; 양효영; 이양순; 장영순
Original assignee: 주식회사 툴젠
Priority date: 2001-12-07
Filing date: 2002-12-07
Publication date: 2004-07-21
Also published as: CA2469477A1; CN100463962C; US20030194727A1; WO2003048345A1; EP1451297A1; CN1610737A; US7514257B2; EP1451297A4; JP2005511049A; US20040209277A1; AU2002365796A1

Abstract

한 태양으로, 상이한 인공 키메라 단백질을 코딩하는 핵산의 라이브러리를 스크리닝하여 세포 또는 생물체의 표현형을 변화시키는 키메라 단백질을 동정한다. 키메라 단백질은 특정 표적 유전자 또는 경로에 대한 선행 지식 없이 동정될 수 있다. 어떤 키메라 단백질은 다수의 징크 핑거 도메인을 포함하며, 예를 들면, 열저항성, 용매 저항성, 변화된 세포 성장도, 인슐린 생산, 분화 및 약제 저항성을 유도할 수 있다.

Description

키메라 단백질의 표현형질 스크리닝{PHENOTYPIC SCREEN OF CHIMERIC PROTEINS}

대부분의 유전자는, 보통 프로모터 또는 인핸서 영역 내에 있는 그 유전자 내 특정 DNA 부위에 결합하는 폴리펩타이드 전사 인자에 의해 전사 수준에서 조절된다. 이 단백질들은 프로모터 부위에서 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시를 활성화 또는 억제함으로써 표적 유전자의 발현을 조절한다. 활성화인자(activator)든, 억제인자(repressor)든, 많은 전사 인자는 구조적으로 모듈(module)성을 갖는다. 그러한 모듈은 구조적으로 별개의 도메인으로 폴딩이 가능하며, DNA 결합, 이량체화 (dimerization) 또는 전사 기구(transcriptional machinery)와의 상호작용과 같은 특정 기능을 가진다. 활성화도메인 또는 억제 도메인과 같은 효과기(effector) 도메인들은 이종 전사 인자의 DNA－결합 도메인에 연결되어도 그 기능을 유지한다 (Brent 및 Ptashne, (1985)Cell43:729－36; Dawson 등, (1995)Mol. Cell Biol.15:6923－31).

인공전사인자는 징크 핑거 도메인 (zinc finger domain)의 키메라 단백질로 제작될 수 있다. 예를 들어, WO 01/60970 (Kim 등)은 징크 핑거 도메인의 특이성을 결정하는 방법과 특정 표적부위를 인식하는 인공전사인자의 제작 방법을 개시하고있다. 인공전사인자의 적용 중 하나로 특정 표적 유전자의 발현을 변화시키는 것을 들 수 있다. 표적 부위는 표적 유전자의 조절영역에서 동정되며, 인공전사인자는 하나 이상의 표적 부위를 인식하도록 조작된다. 이러한 인공전사인자가 세포 내로 도입되면, 이들은 해당하는 표적 부위에 결합하여 전사를 조절한다. 표적 유전자의 발현을 조절하는 이러한 방법은 때로 전사인자를 동정하기 위한 "표적－유도 (target－driven)" 접근법으로 언급되기도 한다.

발명의 요약

한 태양으로, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 방법을 특징으로 한다: (1) 제1 및 2 결합 도메인을 포함하는 인공 키메라 폴리펩타이드를 발현하는 이종 핵산을 갖는 다수의 세포를 포함하는 라이브러리로서, 이때, 제1 및 2 결합 도메인은 서로 이종이고, 다수의 세포 중 각 구성원의 제1 및 제2 결합 도메인은 다른 구성원의 것들과 상이한 라이브러리를 제공하는 단계; 및 (2) 대조세포에 비해 변형된 형질을 가지는 세포를 동정하는 단계. 결합 도메인은, 예를 들어, 징크 핑거 도메인과 같이 독립적으로 폴딩된(folded) 모듈일 수 있다. 많은 실시 태양에서 결합 도메인은 DNA 결합 도메인이며, 대조세포는 일반적으로 핵산 라이브러리를 포함하지 않거나 대조 핵산을 포함하는 세포이다. 대조 세포는 라이브러리가 만들어진 모세포이거나 또는 그의 유도 세포이다.

특정 형질은, 관찰, 선발, 추론 및/또는 정량될 수 있는, 측정 가능한 모든표현 형질이다. 본 발명에 사용되는 키메라 단백질은 서로 이종인 두 개 이상의 결합 도메인을 포함한다. 두 결합 도메인은 상이한 천연형 단백질에서 유래할 수 있다. 두 영역은 동일한 천연형 단백질로부터 유래할 수도 있지만, 키메라 단백질에서는 해당하는 천연형 단백질과는 다른 배열로 위치할 수도 있다.

많은 실시 태양에서, 세포는 리포터 유전자를 포함하지 않는다. 즉, 키메라 폴리펩타이드의 발현에 의해 조절되는 표적 유전자에 대한 선험적인 정보가 없더라도 세포를 선별할 수 있다. 또한, 세포는 특정 형질에 관련되거나 관련되지 않은 마커(marker)의 추가 표식자(indicator)로서 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 표적 유전자를 스크리닝 이전에 알 수도 있다.

다른 예로, 특정 형질은 화합물(예를 들어, 천연 또는 인공 화합물)의 생산일 수 있다. 상기 화합물은 항생제, 증식 억제제, 마취제, 단백질 등일 수 있다.

또 다른 예로, 특정 형질은 중금속, 염도, 환경독소, 생물 독소, 병원균, 기생물질, 다른 환경적 극한(예: 건조, 열, 추위) 등의 환경 조건에 대한 저항성일 수 있고, 스트레스(예: 열, 추위, 극한 pH, 암모니아와 같은 화학 물질, 약제, 삼투압, 전리방사선)에 대한 저항성 또는 약제 저항성일 수 있으며, 이때 특정 형질의 변화는 민감성 또는 저항성으로의 변화일 수 있다.

또 다른 예로, 세포는 식물, 동물(예: 포유류), 균류 또는 세균 세포이다. 포유류 세포의 경우, 특정 형질은 세포 증식; 사이토카인, 호르몬 또는 신호물질의 생산; 세포 신호 경로의 활성화 및 생리적 경로(예: 포도당 항상성, 대사, 비만)의 활성화일 수 있다.

DNA 결합 도메인은, 예를 들어 징크 핑거 도메인일 수 있다. 전형적으로, 제1 징크 핑거 도메인은 라이브러리의 핵산들 간에 다양하게 변하고, 제2 징크 핑거 도메인 역시 라이브러리의 핵산들 간에 다양하게 변한다. 핵산은 또한 적어도 제3 DNA 결합 도메인, 예를 들어 제3 징크 핑거 도메인을 발현할 수 있다.

발현되는 각 폴리펩타이드의 징크 핑거 도메인은 상이한 천연형 단백질에서 유래한 징크 핑거 도메인과 동일하거나, DNA 접촉위체에서의 돌연변이체와 같은 천연형 단백질의 유도체일 수 있다. 천연형 단백질은, 예를 들어 균류(예: 효모), 식물 또는 동물 유래 단백질(예: 사람이나 쥐의 단백질과 같은 포유류의 단백질)과 같이, 임의의 진핵생물의 징크 핑거 단백질일 수 있다. 각각의 폴리펩타이드는 제3, 제4, 제5 및/또는 제6 징크 핑거 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 각각의 징크 핑거 도메인은 사람 등의 포유류 유래 징크 핑거 도메인일 수 있다.

선택적으로, 다수의 세포의 핵산은 10, 20, 30, 40 또는 50개 이상의 서로 다른 3－염기쌍 DNA 부위를 인식하기에 충분한 수의 상이한 징크 핑거 도메인을 코딩한다. 한 실시 태양에서 다수의 핵산은 30, 20, 10 또는 5개 이하의 서로 다른 3－염기쌍 DNA 부위를 인식하기에 충분한 수의 상이한 징크 핑거 도메인을 코딩한다.

세포 라이브러리의 각 핵산으로부터 발현된 폴리펩타이드는, 전사 활성화 및 억제 도메인, 메틸화 도메인, 아세틸화 도메인 또는 탈아세틸화 도메인과 같은 기능성전사조절 도메인을 역시 포함할 수 있다. 또한, 많은 키메라 폴리펩타이드는 특정 전사 조절 도메인과의 융합 없이도 작동한다. 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 구조성(constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.

상기 방법은 동정된 세포에서 핵산을 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 분리된 핵산은 서열을 확인할 수 있고, 핵산에 코딩된 폴리펩타이드를 분리할 수도 있다. 상기 방법은 또한 폴리펩타이드가 특이적으로 인식하는 핵산 결합 부위를 동정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 결합부위는, 예를 들어, 컴퓨터를 이용한 일련의 서열(특히, 조절 서열(regulatory sequence)) 데이터베이스 검색을 통해 확인되거나, 시험관 내에서 폴리펩타이드에 결합하는 핵산을 선별하는 과정(예: SELEX)을 통해 확인된다. 핵산 염기서열의 컴퓨터 데이터베이스는 이미 동정된 핵산 결합 부위 또는 그와 유사한 부위를 검색함으로써 수행할 수 있다.

상기 방법은, 동정된 세포 내에서 하나 이상의 내생 유전자의 발현 또는 발현된 하나 이상의 내생 폴리펩타이드의 양/활성을, 예를 들어 mRNA 프로파일링(예: 미세배열(microarray)분석), 2－D 겔 전기영동, 단백질 리간드(예: 항체) 배열, 및/또는 질량 분광법(mass spectroscopy) 등을 이용하여 분석하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 하나 또는 소수의 유전자 또는 단백질이 역시 프로필될 수 있다. 한 실시태양에서, 프로필은 참조 프로필(reference profile)의 데이터베이스와 비교될 수 있다. 다른 실시태양에서, 동정된 키메라 폴리펩타이드의 발현에 의해 변화된 발현프로필을 가지는 유전자의 조절부위들을 비교하여 키메라 폴리펩타이드의 발현에 의해 직접 또는 간접적으로 발생하는 공동 조절(coodinate regulation)을 결정하는 후보 부위들을 동정한다.

상기 방법은 또한 변화된 형질을 나타내도록 세포를 배양하는 것을 포함한다. 예를 들어, 변화된 특성이 대사산물 생산량의 증가라면, 본 발명은 대사산물을 생산하기 위한 세포 배양을 포함할 수 있다. 세포는 라이브러리에서 분리된 세포, 또는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 재도입한 세포일 수 있다. 키메라 폴리펩타이드의 발현은, 예를 들어, 정교한 형질 변환을 위해 유도 프로모터를 사용하거나 다른 조건의 프로모터(예: 세포 형 특이적 프로모터(cell type specific promoter))를 사용하여 유도될 수 있다. 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 가진 세포는 유기체(organism)에 도입(예: 생체 외 처리(ex vivo treatment))되거나, 유전자전환 개체(transgenic organism) 제작에 사용될 수 있다.

한 실시 태양에서, 최소 몇몇 라이브러리 구성원들은 서로 다른 조절 도메인을 가지는 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 일부 라이브러리 구성원들은 활성화 도메인을, 다른 일부 요소들은 억제 도메인을 포함할 수 있다. 즉, DNA 결합 도메인의 개별적 조합이, 어떤 경우에는 활성화 도메인과의 융합 라이브러리를 의미하고, 다른 경우에는 억제 도메인과의 융합 라이브러리를 의미할 수 있다. 또한, 일부 라이브러리 구성원은 활성화 도메인을 포함하는 반면, 다른 구성원은 조절 도메인을 포함하지 않을 수 있다.

다음은 표현형의 몇 가지 예이다: 줄기 세포군(예: 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 또는 제대혈 줄기 세포) 및 시험관 내 제한된 확장 능력을 지닌 다른 세포들의 확장; 줄기 세포 분화 억제; 세포의 증대된 분화 능력(예: 분화된 세포 또는 줄기 세포); 변화된 스트레스 저항성(예: 열, 추위, 극단 pH, 세포 배양 시 생성되는 암모니아 같은 화학물질, 약제, 염(삼투압), 전리 방사선 등에 대하여 증대된 또는 감소된 저항성); 암세포 등에서 증대되는 것으로 나타나는, 전리 방사선 또는 독성물질(예: 항암제)에 대한 민감성; 바이러스 감염/증식 보조 능력(예: C형 간염 바이러스 증식); 바이러스, 세균 또는 원생생물 등의 병원균에의 저항능력; 세포 내 RNAi 효율성 증대; 형질도입 효율성 증대; 세포나 유기체의 노화 지연; 성장인자가 첨가되지 않은 무혈청(srum－free)의 화학적으로 정의된 배지에서의 성장, 세포 함유체(inclusion body)의 형성 지연 또는 제거; 및 세포 내 단백질 분비 증가.

상기 방법은 다음의 적용 예들을 포함한다: 병원체(예: 병원 세균) 내 필수 유전자 동정; 세균의 발병 원인인 (숙주 또는 병원체의) 유전자 동정; 약제 후보들의 표적 동정, 신호 전달 경로에서의 유전자 발굴, 미생물 제작 및 산업적 생명공학, 상업적 이용을 위한 대사산물의 생산량 증대, 및 성장 방식 조절(예: 미생물의 성장 촉진 또는 암세포의 생장 억제).

다른 태양에서, 본 발명은 (a) 단백질을 코딩하는 (세포 내생 또는 외생) 유전자, 및 (b) 인공 전사 인자를 포함하는 배양된 세포로서, 상기 세포가 상기 유전자는 포함하지만 상기 전사 인자는 포함하지 않는 동일한 세포에서 보다 높은 수준으로 상기 단백질을 생산하고, 상기 전사인자는 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 영역에 결합하는 것 외의 방식으로 단백질의 생산에 영향을 미치는, 배양된 세포를 특징으로 한다. 이때, "인공"은 천연형이 아님을 의미하며, "유전자"는 "코딩 서열"을 의미하며, 염색체(chromosomal) 또는 게놈(genomic)(즉, 인트론 포함) DNA일 수 있고, 내생 또는 (한시적으로 또는 안정적으로 유전자 도입된) 외생 유전자일 수 있다.

인공전사인자는 두 개, 세 개 또는 네 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 키메라 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. 인공전사인자는 또한 조절 도메인(요약서의 활성 및 억제 도메인 목록)을 포함할 수 있다. 최소한 하나 또는 두 개 이상의 개별 징크 핑거 도메인은 천연형(포유류, 식물 또는 사람) 유래일 수 있다. 한 실시태양에서 모든 징크 핑거 도메인은 천연형을 의미한다.

인공전사인자는 세포의 이종(異種) 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 이종 전사인자를 코딩하는 이종 유전자는 유도 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 또한, 세포는 최소 2개 이상의 인공전사인자를 포함할 수 있다.

예를 들어, (i) 인공전사인자는 제1 유전자가 결손된 동일한 세포 또는 배양 세포가 제1 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절영역과는 다른 조절영역에 작동 가능하게 연결된 제2 유전자에 의해 코딩된 제2 단백질을, 제2 유전자를 포함하지만 전사인자는 포함하지 않는 동일한 세포에서보다 높은 수준으로 생산하게 하고, (ii) 전사인자는 제2 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 영역에 결합하는 것 외의 방식으로 제2 단백질의 생산에 영향을 미친다. 다른 예에서, (i) 세포는 또한 제2 단백질을 코딩하는 제2 유전자를 추가로 포함하고, (ii) 세포는 제2 유전자를 포함하지만 전사인자는 포함하지 않는 동일한 세포에서보다 높은 수준으로 제2 단백질을 생산하며, (iii) 전사인자는 제2 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 영역에 결합하는 것 외의 방식으로 제2 단백질의 생산에 영향을 미칠 수 있다. 제1 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 영역은 제2 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 영역과 다를 수 있다.

제1 및 2 전사인자는 다음을 포함하는 군으로부터 선발된다:

a) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(FECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTHTGEKPYACPVESCDRRFSDSSNLTRHIRIHTGEKPYACPVESCDRRFSDSSNLTRHIRIH),

b) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(SCGICGKSFSDSSAKRRHCILHTGEKPYVCDVEGCTWKFARSDKLNRHKKRHTGEKPYVCDVEGCTWKFARSDELNRHKKRHTGEKPYECHDCGKSFRQSTHLTRHRRIH), 및

c) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(YECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTHTGEKPYRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIHTGEKPYRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIHTGEKPFACPECPKRFMRSDNLTQHIKTH).

다른 측면에서, 본 발명은 단백질을 생산하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 본원에 기술된(예: 상기의) 세포를 제공하는 단계; 상기 유전자를 포함하지만 전사인자는 포함하지 않는 동일한 세포에서보다 높은 수준(예: 2배, 3배, 5배, 10배 또는 100배 이상)의 단백질 생산을 허용하는 조건에서 세포를 배양하는 단계; 세포에 의해 생산된 단백질을 검출하고/하거나 세포 및/또는 세포 주위 배지로부터 발현된 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 유전자는 내생 또는 외생 유전자일 수 있고, 내생 유전자의 경우, 천연형 유전자 또는 천연형 유전자에 비해 유전적으로 변형된 유전자(예를 들어, 조절 서열의 삽입 또는 수정에 의해)일 수 있다. 또한내생 유전자는 호르몬, 세포 표면 수용체(receptor), 항체, 생장인자, 부착(adhesion) 단백질, 신경전달물질, 및 효소를 코딩하는 유전자 군을 포함한다. 외생 유전자는 CMV 또는 아데노바이러스 같은 바이러스 프로모터에 연결될 수 있고, 세포는 포유류 유래 세포일 수 있다.

상기 방법은 또한 세포를 대상(subject)에 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 이는 또한 정제된 단백질을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화(formulating)하는 것을 포함할 수 있다.

상기 방법은 다음과 같은 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 전사인자는 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자에 의해 코딩된 루시퍼라제 마커 단백질의 생산을 1.1 또는 2배 이상 증가시키기에 충분한 양으로 세포 내에 존재한다; 전사 인자는 SV40 프로모터에 연결된 유전자에 의해 코딩된 알칼린 포스파타제 마커 단백질의 발현을 2배, 5배, 7배, 10배 이상 증가시키기에 충분한 양으로 세포 내에 존재한다; 전사인자는 복수의 내생 유전자의 발현을 직접적으로 변화시킨다; 전사인자는 세포 분할율(rate of division)을 변화시킨다; 전사인자는 PB08, K_F02 또는 K_D10에 의해 특이적으로 인식되는 천연형 DNA 결합 부위에 결합하기 위해 경쟁하며, 50 nM 이하의 DNA 부위에 대한 해리상수를 갖는다; 전사인자는 PB08, K_F02 또는 K_D10에 의해 특이적으로 인식되는 DNA 결합부위와 부분 중복되는 DNA 부위를 특이적으로 인식한다; 전사인자는 QSNR－DSNR; DSNR－DSNR; DSAR－RDKR; RDKR－RDER; RDER－QTHR; QSHV－WSNR; WSNR－WSNR; WSNR－RDNQ, QSNR1－QSNK; QSNK－CSNR으로 이루어진 군으로부터 선발된 두 개의 연속하는 징크 핑거 도메인을 포함하며, 이때, 각각의 4 문자표지는, 징크 핑거 도메인의 －1, ＋2, ＋3 및 ＋6 DNA 접촉 잔기에 존재하는 아미노산을 의미한다; 전사인자는 서열번호: 21, 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함한다.

전사인자는 서열번호 21, 22, 또는 23에서 1 내지 8개의 아미노산이 치환, 삽입 또는 제거됨으로써 변형된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은, 예를 들어, 금속 배위 시스테인(Cysteine) 및 －1 위치 사이와 같은 DNA 접촉 잔기 이외의 위치에서 일어날 수 있으며, 보존적(conservative) 치환일 수도 있다. 전사인자는 도 17, 18 및 19에 나타낸 핵산에 의해 코딩되는 아미노산을 포함한다.

다른 예에서, 전사인자는 다음의 세 가지 징크 핑거 도메인을 포함한다:

a) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X－Ser－Asn－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His(서열번호: 24);

b) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Asp－X－Ser－Asn－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His (서열번호: 25); 및

c) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Asp－X－Ser－Asn－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His (서열번호: 26), 이때, 불변 부위에서 하나 내지 세 개의 치환을 포함한다.

다른 예에서, 전사인자는 다음 4개의 징크 핑거 도메인에서 3개 이상을 (이순서로) 포함하며, 이때, 불변 부위에서의 하나 내지 세 개의 치환을 포함한다:

a) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Asp－X－Ser－Ala－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His (서열번호: 27);

b) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Arg－X－Asp－Lys－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His (서열번호: 28);

c) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Arg－X－Asp－Glu－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His (서열번호: 29); 및

d) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X－Thr－His－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His (서열번호: 30).

다른 예에서, 전사인자는 다음 4개의 징크 핑거 도메인에서 3개 이상을 (이 순서로) 포함하며, 이때, 불변 부위에서의 하나 내지 세 개의 치환을 포함한다:

a) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X－Ser－His－X_b－X－Val－His－X_3－5－His (서열번호: 31);

b) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Trp－X－Ser－Asn－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His (서열번호: 32);

c) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Trp－X－Ser－Asn－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His (서열번호: 33); 및

d) Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Arg－X－Asp－Asn－X_b－X－Lys－His－X_3－5－His (서열번호: 34).

상기 목록에서, X_a는 임의의 아미노산이거나, 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이고; X_b는 임의의 아미노산이거나, 선택적으로 소수성 아미노산이다.

다른 측면에서, 본 발명은 세포 내(예: 시험관 내 또는 생체 내)에서 표적 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 포함하는 표적 단백질의 생산방법을 특징으로 하며, 이때, 세포는, 이종 전사인자를 포함하지 않는 세포에 비해 단백질의 생산량을 증가시키는 이종의 인공전사인자를 포함한다. 한 실시태양에서, 이종 전사인자는 표적 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 직접 조절하는 것 이외의 다른 방법으로 생산량을 증가시킨다. 예를 들어, 이종 전사인자는 표적 단백질을 코딩하는 핵산을 직접 조절하는 조절 영역에 결합하지 않는다. 전사인자는 단백질로서 세포내에 도입되거나 그것을 코딩하는 핵산의 도입 및 전사에 의해 도입될 수 있다. 상기 방법은 본원에 기재된 다른 특징들을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 전사인자를 동정하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 서로 다른 인공전사인자를 코딩하는 다수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리의 제공하는 단계로서, 이때, 각각의 인공전사인자가 서로 키메라를 이루는 2개의 징크 핑거 도메인을 포함하는 단계; 복수의 각 세포에 라이브러리 구성원을 도입하는 단계; 복수의 세포로부터 제1 표적 단백질의 생산 증대를 나타내는 세포의 동정하는 단계로서, 이때, 제1 표적 단백질은 제1 전사 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자에 의해 코딩되는 단계; 및 제1 전사 조절 서열과 다른 제2 전사 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자에 의해 코딩된 제2 표적 단백질의 생산을 증대시키는 라이브러리 구성원의 능력을 평가하는 단계.

상기 방법은 다음에 나열하는 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 제1 및 제2 표적 단백질은 동일하다; 라이브러리 구성원이 도입된 세포는 각각 제2 전사 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 표적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다; 세포는 진핵세포이다; 제1 및/또는 제2 전사 조절 서열은 바이러스 조절 서열을 포함한다; 상기 방법은, 제1 및 제2 표적 단백질의 생산을 증가시키는 라이브러리의 구성원에 의해 코딩된 전사인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 숙주세포를 제조하는 단계를 추가로 포함한다; 상기 방법은 숙주세포로부터 제1 및 제2 표적단백질과는 다른, 제3 표적 단백질을 생산하는 단계를 추가로 포함한다; 그리고 평가는동정된 세포의 평가를 포함한다. 제2 또는 제3 표적 단백질은, 예를 들어, 에리스로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 성장인자, 인터루킨(interleukin) 또는 케모카인(chemokine)과 같은, 분비 단백질일 수 있다. 다른 예로, 표적 단백질은 대사산물 생산 경로에서 반응을 촉진하는 효소일 수 있다. 본원에 기술된 다른 특징들 또한 포함될 수 있다.

관련되는 측면에서, 본 발명은 키메라 단백질을 동정하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 다음을 포함한다: 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리의 제공 단계로서, 이때, 각각의 핵산은 두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 상이한 인공 키메라 단백질을 코딩하는 단계; 특정 조건 하에서 제1 표적 단백질을 소정 수준으로 생산하는 시험용 세포를 제공하는 단계로서, 제1 표적 단백질이 제1 전사 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자에 의해 코딩되는 단계; 복수 핵산의 각 구성원을 시험 세포의 복제물에 도입하여 복수의 형질 전환 세포를 제공하는 단계; 복수의 형질전환된 세포 또는 그 자손세포로부터, 특정 조건 하에서 제1 표적 단백질을 소정 수준과는 다른 수준으로 생산하는 세포를 동정하는 단계; 및, 제1 전사 조절 서열과는 다른 제2 전사 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자에 의해 코딩된 제2 표적 단백질의 생산량 증대를 나타내는 동정된 세포 내 라이브러리 구성원의 능력을 평가하는 단계. 본원에 기술된 다른 특징들이 역시 포함될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 이종 유전자가 없는 표준 숙주 세포에 비해, 표적 유전자에 의해 코딩된 표적 단백질의 생산량을 30％ 이상 증가시키는 인공전사인자를 코딩하는 이종 유전자를 포함하는 유전 물질을 갖는 숙주 세포를 특징으로 한다. 한 실시 태양에서, 전사인자는 표적 단백질의 전사를 직접적으로 조절하지 않는다. 다른 실시 태양에서, 전사인자는 표적 단백질의 전사를 직접적으로 조절한다. 숙주세포는, 프로모터(예: 바이러스 프로모터)에 작동 가능하게 연결된, lacZ, 분비 알칼린 포스파타제(SEAP), GFP, 루시퍼라제 등을 코딩하는 서열과 같은 염기서열 또는 리포터 구조체(reporter construct)를 포함할 수 있다. 세포는 본원에 기술한 다른 특성을 가질 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 최소 두 개, 세 개 또는 네 개 이상의 징크 핑거 도메인으로 구성된 폴리펩타이드를 코딩하는 이종 유전자를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 이때, 폴리펩타이드는 50 nM 이하의 평형해리상수로 천연형 DNA에 결합하며, PB08, K_F02 또는 K_D10과 DNA 결합부위에 대하여 경쟁한다. 세포는 본원에 기술한 다른 특성을 가질 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 표적 단백질을 코딩하는 제1 이종 유전자, 및 제2 이종 유전자의 도입이 없을 경우보다 최소 30％ 이상으로 표적 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있는 인공전사인자를 코딩하는 제2 이종 유전자를 포함하는 세포를 특징으로 한다. 이때 전사인자는 표적 단백질의 전사를 직접 조절하지는 않는다. 세포는 본원의 기술한 다른 특성을 가질 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 다음의 서열을 가지는 분리된 폴리펩타이드를 특징으로 한다: X_a－X－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X₅－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His－X₁－6－X_a－X－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X₅－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His－X_1－6－X_a－X－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X₅－X_b－X－Arg－His－X_3－5－His(서열번호: 35), 이때, 상기 폴리펩타이드는 사람 293 세포에서 적정농도로 존재하는 경우, 다음과 같은 효과를 하나 이상 나타낼 수 있다: a) CMV 프로모터에 연결된 루시퍼라제를 코딩하는 유전자의 발현을 2배 이상 증가시킨다; b) SV40 프로모터에 연결된 SEAP을 코딩하는 유전자의 발현을 2배 이상 증가시킨다; 및 c) 세포의 증식 속도를 50％ 이상 증가 또는 억제시킨다.

다른 측면에서, 본 발명은 후생동물 유래 세포의 분화 상태를 변화시키는 방법을 특징으로 하며, 그 방법은 세포의 분화 상태를 변화시키기에 충분한 양의 인공전사인자를 세포에서 발현시키는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 분화된 상태는 신경(neuronal) 표현형(예: 신경돌기(neurite) 확장, 시냅스(synapse) 형성, 또는 신경세포 마커 발현) 또는 골세포 표현형(예: 골세포 마커 발현)으로 특정될 수 있다. 한 실시 태양에서, 분화된 상태는 세포의 분화능력을 증가시키도록, 예를 들면, 작동 가능하게 줄기세포 또는 전구세포와 같이, 덜 분화되도록 변화한다. 한 실시태양에서, 분화된 상태는 하나의 분화 상태에서 다른 분화 상태로 변한다(예: 근육세포 상태에서 골세포 상태로, 신경세포 상태에서 글리아(glia) 세포 상태로 등). 한 실시태양에서, 인공전사인자는 신경돌기 확장을 유도한다. 예를 들어, 세포는 줄기세포, 신경세포, 뉴랄 크레스트(neural crest) 세포 또는 신경 근원세포일 수 있다. 인공전사인자는 상기의 전사인자, 예를 들면,Neuro1－p65(Neuro1－p65) 또는 뉴로 1(Neuro1)일 수 있다. 인공전사인자는 천연형 DNA 결합 부위에 대한 결합을 위해 Neuro1－p65와 경쟁할 수 있다. 인공전사인자는 Neuro1－p65의 DNA 결합부위에 동일하게 또는 중복되게 결합할 수 있다.

다른 실시태양에서, 인공전사인자는, 근세포(Myoblast)와 같이 원래 골세포 가 아닌 세포에서, 골세포 특이적인 마커(marker)를 유도한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 전사인자를 동정하는 방법을 특징으로 한다: 최소 2개의 징크 핑거 도메인으로 구성된 서로 다른 인공전사인자를 코딩하는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계; 복수의 각 세포에 라이브러리의 구성원를 도입하는 단계; 및 복수의 세포로부터 분화상태가 변화한 세포를 선별하는 단계. 상기 방법은 다음과 같은 특성을 하나 이상 포함할 수 있다: 세포는 줄기세포이다; 세포는 신경세포, 뉴랄 크레스트(neural crest) 세포 또는 신경 근원세포이다; 그리고 분화된 상태는 신경 고도성장(outgrowth) 또는 신경돌기 형성을 포함한다. 또한, 다른 특성이 포함될 수도 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 복수의 전사인자를 동정하는 방법을 특징으로 한다. 그 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계로서, 이때, 복수의 핵산은 2개 이상의 징크 핑거 도메인으로 구성된 서로 다른 인공전사인자를 코딩하는 단계; 세포의 소정 형질을 변화시키는 라이브러리의 제1 구성원을 동정하는 단계; 및, 세포들을 선별하여 소정 형질이 더 변화한 세포를 동정하는 단계로서, 이때, 각 스크리닝된 세포는 라이브러리의 제1구성원에 의해 코딩되는 전사인자 및 동일한 핵산 라이브러리 또는 인공 전사 인자의 다른 핵산 라이브러리의 제2 구성원에 의해 코딩된 전사 인자를 발현하는, 단계. 상기 방법은 제1 및 제2 전사인자 존재 하의 추가 스크리닝을 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 상기 방법은 제1 구성원의 영향으로 인한 표현형의 변화를 역전시키는 제2 라이브러리 구성원을 동정하는 것을 포함한다. 그 방법은 본원에서 기술한 특징을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 변형된 세포를 제작하는 방법을 특징으로 한다: 2개 이상의 징크 핑거 도메인으로 구성된 각각 다른 인공전사인자를 코딩하는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계; 세포의 소정 형질을 변화시킬 수 있는 제1 및 제2 라이브러리 구성원을 동정하는 단계; 제1 및 제2 라이브러리 구성원에 의해 각각 코딩된 제1 및 제2 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 제조하는 단계. 상기 방법은 또한 제3 구성원과 같은 추가 구성원으로 확장될 수 있다. 상기 방법은 또한 제조된 세포의 소정 형질을 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법은 더 나아가 다음 특성 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 제조방법은, 제1 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 유전자 및 제2 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 유전자를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다; 제1 및 제2 유전자는 동일한 핵산의 구성요소이다; 여기서 제조방법은, 제1 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 유전자를 포함하는 제1 세포와 제2 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 유전자를 포함하는 제2 세포를 융합하는 것을 포함한다; 소정 형질은 대사산물의 생산이다; 소정 형질은 표적폴리펩타이드의 생산이다; 그리고 생산은 분비를 포함한다. 여기서 설명된 다른 특징도 사용될 수 있다.

다음 방법은 징크 핑거 단백질(ZFP) 라이브러리의 유기체적 성질을 스크리닝하기 위해 바이러스를 이용하는 방법에 관한 것이다. 전사인자를 동정하는 방법은 다음을 포함한다: 각가 두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 서로 다른 인공전사인자를 코딩하는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계; 복수의 바이러스 또는 바이러스 입자(viral particles)를 형성하기 위해, 포유 동물 세포를 감염시키는 바이러스 또는 바이러스 입자에 라이브러리 구성원을 포함(packing)시키는 단계; 복수의 비－인간 포유동물 실험체에 복수의 바이러스 또는 바이러스 입자를 도입하는 단계; 및 다수로부터 변형된 표현형을 나타내는 실험체를 동정하는 단계. 예를 들어, 각 실험체(subject)는 검출 가능한 장애(disorder)를 가진다; 복수의 바이러스 또는 바이러스 입자는 풀(pool)로 나뉘며, 각각의 풀은 복수의 실험체를 구성하는 개개의 실험체로 도입된다; 복수의 바이러스나 바이러스 입자는 개개의 시료(samples)를 포함하는데, 각 시료는 핵산 라이브러리 중 단일 핵산 내에 포함되어 있으며, 각 사료는 각 실험체로 도입된다.

한 측면에서, 본 발명은, 인공 전사인자를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 변형세포로서, 상기 인공 전사 인자가 상기 변형(modified) 세포와 실질적으로 동일하고 이종 핵산 및 인공전사인자가 결여된 대조 세포에 비해 변형 세포에 스트레스 저항성을 부여하는, 변형 세포를 특징으로 한다. 예를 들어, 인공전사인자는 2개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인은, 예를 들어, 하기 표 1에 나타낸 천연형 도메인일 수 있다. 대표적인 인공전사인자는, 예를 들어, 본원에 기재된 열 저항 또는 용제(solvent) 저항 단백질과 같이, 하나 이상의 연속적인 모티프(motifs)로 구성된 전사인자를 포함한다.

변형된 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 스트레스 저항성은 다음의 형질 중 하나 이상을 포함한다: 열 저항성, 용제 저항성, 중금속 저항성, 삼투압 저항성, 극단 pH 저항성, 화학 물질 저항성, 추위 저항성, 게놈 독성 물질에 대한 저항성 및 방사성 물질 저항성. 스트레스 저항성은 저항성이 없는 세포가 죽거나 생장할 수 없는 조건 하에서 생존 또는 생장하게 한다. 예를 들어, 변형된 세포는 인공전사인자를 발현할 수 있고, 동일한 배양조건의 인공전사인자가 없는 세포보다 스트레스에 대해 훨씬 더 잘 견뎌낸다. 본 발명은 또한 이 같은 인공 단백질을 제공하며, 단백질은 핵산을 포함하는 않는 동일한 세포에 비해 독성물질에 대한 세포의 감수성을 변화시킨다.

다른 측면에서, 상기 방법은 다음의 세포 생성물의 생산 방법을 포함한다: 인공전사인자를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 변형된 세포를 제공하는 단계; 인공전사인자가 생산되는 상태로 변형된 세포를 유지하는 단계; 및 배양된 세포에 의해 생산된 인공전사인자 외의 산물을 회수하는 단계. 예를 들어, 인공전사인자는 스트레스 저항성 또는 단백질 생산, 대사산물 생산의 변화 등과 같은 상기 다른 특성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 인공전사인자는 최소 두 개의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 하나 이상의 징크 핑거 도메인은 표 1에 표기된 것과 같은 천연형일 수 있다. 대표적인 인공전사인자는 상기 하나 이상의 연속적인 모티프(예: 최소한둘, 셋 또는 네 개의 연속적인 모티프, 또는 비연속 형태를 포함하면서 적어도 세 모티프가 같은 형태)로 구성된 전사인자를 포함한다.

대표적인 생성물은 대사산물 또는 단백질(예: 내생 또는 외생 단백질)을 포함한다. 예를 들어, 변형 세포는 인공전사인자 이외의 이종 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하며, 그 생성물은 이종단백질이다. 다른 예에서, 변형 세포는 또한 이종 단백질을 코딩하는 제2 핵산을 포함하며, 그 이종 단백질은 대사산물 생산에 관여한다. 변형 세포는 20 내지 40℃ 또는 37℃ 이상의 온도에서 유지될 수 있다. 한 실시태양에서, 인공전사인자가 결여된 실질적으로 동일한 세포의 성장이 억제되는 조건 하에서 변형된 세포를 유지한다.

한 실시태양에서, 징크 핑거 도메인은 하기 표 15에 기술된 징크 핑거 도메인의 DNA 접촉 잔기에 해당하는 DNA 접촉 잔기 세트를 포함한다. 관련된 실시태양에서, 인공전사인자는 최소 세 개 이상의 징크 핑거 도메인의 배열을 포함하며, 이때, 각 배열의 DNA 접촉 잔기는 하기 표 15의 한 열(row)에 나타낸 임의의 연속된 세 개의 징크 핑거 도메인의 DNA 접촉 잔기에 각각 해당한다. 또 다른 예에서, 인공전사인자는 하기 표 15의 한 열에 나타낸 징크 핑거 도메인 배열을 포함하는 단백질과 경쟁한다.

다른 측면에서, 본 발명은 표적 유전자를 코딩하는 유전자 및 인공 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 세포를 특징으로 한다. 이때, 인공 키메라 단백질은 (1) 이종 핵산을 포함하지 않는 세포에 비해 단백질 생산량을 증가시키고, (2) 표적단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 직접 조절할 수있는 전사 조절 영역에 결합하지 않는다. 예를 들어, 인공전사인자는, 예를 들어 DNA에 결합하는, 2개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 하나 이상의 징크 핑거 도메인은, 예를 들어 하기 표 1의 천연형 도메인과 같은 천연형일 수 있다. 대표적인 인공전사인자는 상기 하나 이상의 연속적인 모티프로 구성된 전사인자를 포함한다. 한 실시태양에서, 세포는 진핵세포이며, 인공 키메라 단백질은 게놈(genomic) DNA 결합 부위에 대해 PB08, K_F02 또는 K_D10과 경쟁한다.

한 실시태양에서, 인공 키메라 단백질은 세포 주기 진행 속도를 변화(예: 증가 또는 감소)시킨다. 본 발명은 또한 이러한 인공전사인자를 제공한다.

세포는 다음의 단계를 포함하는, 단백질의 생산 방법에 사용될 수 있다: 세포를 제공하는 단계; 및 인공 키메라 단백질이 이종 핵산을 포함하지 않는 세포에 비해 세포에 의한 표적 단백질의 생산량을 증가시키는 조건에서 세포를 배양하는 단계. 예를 들어, 단백질은 분비 단백질, 세포질 단백질 또는 핵 내 단백질일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 분비 단백질을 코딩하는 내생 유전자 및, 이종 핵산을 포함하지 않는 세포에 비해 세포에 의해 생산되는 분비 단백질의 양을 증가시키는 인공전사인자를 코딩하는 염기서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 세포를 특징으로 한다. 한 실시태양에서, 세포는 진핵 세포이며, 분비 단백질은 인슐린이다. 한 실시태양에서, 인공전사인자는 08_D04_p65에 의해 특이적으로 결합하는 내생 DNA 부위에 결합한다. 다른 실시태양에서, 인공전사인자는 세포 내 DNA 부위에 특이적으로 결합하며, 내생 DNA 부위에 대한 결합을 위해 08_D04_p65와 경쟁한다.예를 들어, 인공전사인자는 다음과 같은 아미노산 서열을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXRXSHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)H (서열번호: 45); 또는

CX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXVXSSJXRHX_(3－5)H (서열번호: 46)

이때, B는 페닐알라닌 또는 타이로신을 의미하고, J는 소수성 아미노산을 의미한다.

세포는 분비 단백질(예: 인슐린)을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는, 이종 핵산을 포함하지 않는 세포에 비해, 인공전사인자가 세포에 의한 인슐린의 생산량을 증가시키는 조건에서 배양된다. 유사하게, 본 발명은 2개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 전사인자를 제공하고, 이때, 인공전사인자는, 인공전사인자가 없는 상태에서는 세포 내생 인슐린 유전자를 발현하지 않는 포유동물 세포에서 내생 인슐린 유전자의 발현을 유도한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산을 포함하지 않는 동일한 세포에 비해 독성 물질(예: 약제(예: 항균제(예: 케토코나졸)))에 대한 민감성을 변화시키는 인공전사인자를 특징으로 한다. 민감성은 증가 또는 감소할 수 있다. 한 실시태양에서, 세포는 균류 세포이다. 예를 들어, 인공전사인자는 2개 이상(예: 3개 이상)의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 하나 이상의 징크 핑거 도메인은 표 1의 천연형 도메인과 같은 천연형일 수 있다. 대표적인 인공전사인자는 본원에 기재된 하나 이상의 연속적인 모티프를 가지는 전사인자를 포함한다. 예를 들어, 인공전사인자는 내생 DNA 부위에 결합하고, 세포 내 DNA 결합 부위에 대해 하기 표 5의 징크 핑거 단백질과 경쟁한다.

다른 측면에서, 본 발명은 균주 세포의 약제 저항성을 변화시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 AQY1, YJR147W, YLL052C, YLL053C 또는 YPL091W와 최소 70％ 이상 유사한 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 것을 포함한다. 발현은, 예를들면, 전사인자를 사용하여 변화될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 독성물질에 대한 세포의 민감성을 변화시키는 인공 키메라 단백질을 동정하는 방법을 특징으로 한다. 그 방법은 다음을 포함한다: 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계로서, 이때, 라이브러리의 각 핵산은, 두 개 이상의 인접한 징크 핑거 도메인은 천연형 단백질에서는 인접하여 나타내지 않는 3개 이상의 징크 핑거 도메인의 배열을 포함하고 이 중 키메라 단백질을 코딩하는, 단계; 형질 전환된 세포를 생산하기 위해 라이브러리 구성원을 시험 세포에 도입하는 단계; 형질감염된 세포를 독성물질의 존재 하에서 배양하는 단계; 및 형질 전환된 세포들로부터, 시험 세포에 비해 독성물질에 대한 민감성이 변한 세포를 선별하는 단계. 예를 들어, 시험 세포는 균주 세포이고, 독성물질은 항균주 제제이다. 다른 예에서, 시험 세포는 암세포이고, 독성물질은 항체세포분열(anti－mitotic) 제제이다. 복수의 각 핵산에 의해 코딩되는 키메라 단백질은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다.

상기 방법은 선별된 세포에서 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질의 징크 핑거 도메인 배열은 포함하지만, 동일한 세포의 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질의 전사 조절 도메인은 포함하지 않는 제2 키메라 단백질을 코딩하는 핵산을 제작하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 (i) 선별된 세포 내의 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질의 징크 핑거 도메인 배열, 및 (ii) 동정된 세포 내에서 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질의 전사 조절 도메인 이외의 전사 조절 도메인을 포함하는 제2 키메라 단백질을 코딩하는 핵산을 구성하는 것을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 세 개의 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공전사인자를 코딩하는 염기서열을 포함하는 핵산을 특징으로 하며, 이때, 인공전사인자의 발현은 최소 하나 이상의 척추동물 세포에서 신경세포 표현형을 유도한다. 한 예에서, 징크 핑거 도메인 중의 하나 이상은 다음의 염기서열을 가진다:

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His (서열번호: 250)

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His (서열번호: 251); 또는

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Cys－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His (서열번호: 252),

이때 X_a는 페닐알라닌 또는 타이로신이며, X_b는 소수성 아미노산이다. 예를 들어, 인공전사인자는 다음 서열을 포함한다.Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His－X_1－6－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His－X_1－6－Cys－X_2－5－Cys－X3－X_a－X－Cys－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His (서열번호 :253), 이때, X_a는 페닐알라닌 또는 타이로신이며, X_b는 소수성 아미노산이다.

한 방법은 핵산을 포함하는 척추동물 세포(예: 포유류 세포, 또는 인간 세포)를 제공하고, 인공전사인자가 발현되고 신경돌기가 형성되는 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 예에서, 척추동물 세포는 인공전사인자의 생산 전의 줄기 세포이다.

다른 측면에서, 본 발명은 세 개의 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공전사인자를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다. 이때, 인공전사인자의 발현은 하나 이상의 척추동물 세포에서 골세포화(osteogenesis)를 유도한다. 예를 들어, 하나 이상의 징크 핑거 도메인은 다음의 염기서열을 가진다:

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Arg－X_b－X－Asp－Lys－His－X_3－5－His (서열번호: 254);

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Thr－His－His－X_3－5－His (서열번호: 255);

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Val－X_b－X－Ser－Thr－His－X_3－5－His (서열번호: 256): 또는

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Arg－X_b－X－Asp－Lys－His－X_3－5－His (서열번호: 257),

이때, X_a는 페닐알라닌 또는 타이로신이며, X_b는 소수성 아미노산이다. 또는 인공전사인자는 다음 아미노산 염기서열을 포함할 수 있다:

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Arg－X_b－X－Asp－Lys－His－X_3－5－His－X_1－6－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Thr－His－His－X_3－5－His－X_1－6－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Val－X_b－X－Ser－Thr－His－X₃₅－His－X_1－6－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Arg－X_b－X－Asp－Lys－His－X_3－5－His (서열번호: 258), 이때, X_a는 페닐알라닌 또는 타이로신이며, X_b는 소수성 아미노산이다.

한 방법은 핵산을 포함하는 척추동물 세포를 제공하며, 인공전사인자가 발현되고 골세포화가 유도되는 조건 하에서 척추동물 세포를 배양하는 것을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 줄기세포의 분화능력을 변화시키는 방법을 특징으로 한다. 그 방법은 다음을 포함한다: 복수의 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공전사인자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산과 줄기 세포를 제공하는 단계로서, 이때, 인공전사인자는 줄기세포의 분화능력을 변화시키는, 단계; 핵산을 줄기세포로 도입하는 단계; 및 인공전사인자의 발현으로 줄기세포의 분화능력을 변화시키는 조건에서 줄기세포를 배양하는 단계. 예를 들어, 인공전사인자는 줄기세포의 분화를 유도한다. 다른 예에서, 인공전사인자는 줄기세포의 자가－복제(self－renewal) 능력을 증가시킨다. 줄기 세포는 태아줄기세포, 척추동물 줄기세포, 식물 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경근원세포 또는 근육근원세포가 될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 방법을 특징으로 한다: 각각 두 개 이상의 징크 핑거 도메인 및 전사를 활성화 또는 억제하는 조절 도메인의 배열을 포함하는 서로 다른 인공전사인자를 코딩하는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계; 소정 형질을 가지는 세포를 제공하는 단계; 핵산 라이브러리 성분을 세포에 도입하는 단계; 소정 형질을 가지는 세포를 제공하는 단계; 세포 내로 핵산 라이브러리 구성원을 도입하는 단계; 소정 형질을 변화시키는 라이브러리 구성원을 동정하는 단계; 및 동정된 구성원으로부터의 징크 핑거 도메인 배열을 포함하지만 동정된 구성원의 조절 도메인과 동일한 조절 도메인은 포함하지 않는, DNA 결합 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 코딩 핵산을 제조하는 단계. 예를 들어, DNA 결합 폴리펩타이드는 동정된 구성원의 조절 도메인이 결여되어 있다. 또 다른 예에서 DNA 결합 폴리펩타이드는 동정된 구성원의 조절 도메인이 돌연변이된 조절 도메인을 포함한다. 한 실시 태양에서, DNA 결합 폴리펩타이드는 동정된 구성원의 조절 도메인과 상반되게 기능화시킨 조절 도메인을 포함한다.

상기 방법은 또한 세포에 핵산을 도입하고, 세포의 소정 형질을 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 동정단계는 다음을 포함하는 군으로부터 선택된 특성을 가지는 세포를 동정하는 것을 포함할 수 있다: 주어진 환경 조건에 대한 저항성;분화; 탈분화(dedifferentiation); 증식;세포사멸(apoptosis); 혈청－독립성 (serum－independence); 병원균 저항성; 및 병원균 민감성.

다른 측면에서, 본 발명은, 인공전사인자를 생산하는 세포에서 과발현된 이종 단백질의 수용성을 향상시키는 인공전사인자를 코딩하는, 분리된 핵산을 특징으로 한다. 예를 들어, 인공전사인자는 복수의 징크 핑거 도메인을 포함한다. 세포는 세균 또는 진핵세포일 수 있다. 한 예에서, 단백질은 AKT 단백질과 같은 포유류 유래 단백질이다. 한 실시태양에서, 복수의 징크 핑거 도메인은 다음 도메인을 포함한다: QSTR－DSAR－RDHT－WSNR 또는 VSTR－DGNV－QSNR－QSNK. 본 발명은 또한 청구항 99 내지 104의 어느 하나에 해당하는 이종 핵산을 포함하는 변형 세포를 특징으로 한다. 본 발명은 또한 이종 표적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이종 표적 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 핵산을 포함하는 변형 세포를 제공하고, 변형 세포를 인공전사인자 및 이종 표적 단백질이 생산되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 변형 세포는 배양 세포 또는 대상체(subject) 내에 있는 것과 같은 생체세포일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 제1 세포로부터 제2 세포로 변화된 형질을 전이시키는 방법을 특징으로 한다. 그 방법은 다음을 포함한다: 최소 두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 서로 다른 인공 키메라 단백질을 코딩하는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계; 형질감염된 세포를 제공하기 위해, 핵산 라이브러리 구성원을 기본형질을 가진 세포에 도입하는 단계; 라이브러리 구성원에 의해 소정 형질이 변화된 세포를 형질감염된 세포로부터 선별하는 단계; 동정된 변형 세포로부터 핵산 라이브러리 구성원을 분리하는 단계; 라이브러리 구성원을 제2 세포에 도입하는 단계로서, 이때, 제2 세포는 소정 형질과는 다른 표현형질에 의해 제1 세포와 구별되는 단계; 및 핵산 라이브러리를 포함하며, 핵산 라이브러리 구성원이 코딩하는 인공 키메라 단백질을 발현하는 제2 세포를 평가하는 단계. 예를 들어, 제1 및 제2 세포는 효모 또는 포유류 세포와 같은 진핵세포이다. 제1 및 제2 세포는 증식 또는 분화의 특성으로 구별된다. 예를 들어, 제1 세포는 암세포인 반면 제2 세포는 암세포가 아니거나, 또는 그 반대이다. 평가된 제2 세포는 소정 형질의 변화로 평가될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 세 개의 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공전사인자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다. 예를 들어, 인공전사인자의 발현은 하나 이상의 진핵세포의 특성을 변화시키며, 이때, 특성은 바이러스 증식, 바이러스 생산 및 바이러스 감염을 포함하는 군으로부터 선택된다; 인공전사인자의 발현은, 진핵세포와 동시－배양(co－cultured)되거나 또는 진핵세포에 의해 조절된 배지에서 배양되는 줄기세포를 조절하는 진핵세포의 능력을 변화시킨다; 인공전사인자의 발현은, 분비 단백질(예: 항체)을 당쇄화하는 포유류 배양세포(예: CHO 세포)의 능력을 변화시킨다; 그리고 인공전사인자의 발현은, 외생 핵산을 받아들이는 세포의 능력을 변화시킨다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 전사인자를 동정하는 방법을 특징으로 한다. 그 방법은 다음을 포함한다: 각각 두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 서로 다른 인공전사인자를 코딩하는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계; 기본형질을 가진 세포에 핵산 라이브러리 구성원을 도입하는 단계; 소정 형질을 변화시키는 라이브러리 구성원을 동정하는 단계; 및 각각 (1) 하나 내지 여섯 개 아미노산의 치환, 삽입 또는 삭제에 의해, 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질과 구별되는 변이체, (2) 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질의 징크 핑거 도메인 및 추가 징크 핑거 도메인을 포함하고, 상기, 추가의 징크 핑거 도메인이 제2 라이브러리의 구성원들 간에 다양하게 변하는 키메라 단백질, (3) 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질의 변이체로서, 다른 징크 핑거 도메인으로 치환된 징크 핑거 도메인 위치들의 하위 집합(subset) 및 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질의 상응하는 위치에 있는 징크 핑거 도메인과 동일한 하나 이상의 불변 징크 핑거 도메인을 갖는 변이체, 및/또는 (4) 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질의 변이체로서, 제2 라이브러리의 구성원 중 하나 이상의 징크 핑거 도메인 위치가 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질 내의 그 위치에서의 특정 도메인이 그 위치에서의 다른 징크 핑거 도메인보다 높은 빈도로 나타나도록 변화된 변이체를 각각 코딩하는 다수의 핵산을 포함하는 제2 라이브러리를 제조하는 단계. 상기 방법은 상기의 다른 특성을 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 전사인자를 동정하는 방법을 특징으로 한다: 2개 이상의 징크 핑거 도메인 및 전사를 활성화 또는 억제하는 제1 전사 조절 도메인을 갖는 DNA 결합 요소를 포함하는 상이한 인공전사 인자를 코딩하는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계; 소정 형질을 가진세포에 핵산 라이브러리 구성원을 도입하는 단계; 소정 형질은 변화시키는 라이브러리 구성원을 동정하는 단계; 및 제1 조절 도메인과 다른 제2 조절 도메인 및 동정된 구성원의 DNA 결합 요소를 코딩하는 핵산을 제작하는 단계. 관련된 방법은 조절 도메인이 없는 전사인자를 동정하고, 조절 도메인을 첨가하는 것; 또는 조절 도메인을 포함하는 전사인자로부터 조절 도메인을 제거하는 것을 포함한다. 일부 전사인자들은 전사 조절 도메인 없이도 작용할 수 있다. 본 발명은 또한 복수의 징크 핑거 도메인 및 제1 조절 도메인으로 구성된 인공전사인자를 특징으로 한다. 인공전사인자는 세포 내에서 생산될 때 제1 형질을 나타내지만, 제1 조절 도메인이 불활성화되고 이 도메인과 반대의 특성을 가지는 제2 조절 도메인이 포함되면 제2 형질을 나타낸다.

한 예에서, 제1 조절 도메인은 전사를 활성화하고, 제2 조절 도메인은 전사를 억제한다. 다른 예에서, 제1 조절 도메인은 전사를 억제하고, 제2 조절 도메인은 전사를 활성화한다. 또 다른 예에서, 제1 조절 도메인은 제1 범위까지 전사를 활성화하고, 제2 조절 도메인은 제1 범위의 50％ 미만 범위까지 전사를 활성화한다. 상기 방법은 제작된 핵산을 시험세포에 도입하고, 시험세포의 소정 형질을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 동정된 구성원은 세포의 분할율을 증가시키고, 제작된 핵산은 세포 분할율을 감소시키는 전사인자를 코딩한다. 다른 실시태양에서, 동정된 구성원은 화합물에 대한 저항성을 야기하고, 제작된 핵산은 화합물에 대한 감수성을 야기하는 전사인자를 코딩한다.

다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 전사인자를 동정하는방법을 특징으로 한다: 제1 및 제2 복수의 핵산을 포함하는 라이브러리를 제공하는 단계로서, 이때, 제1 복수의 핵산은 각각 두 개 이상의 징크 핑거 도메인 및 전사를 활성화시키는 조절 도메인을 포함하는 서로 다른 인공전사인자를 코딩하며, 제2 복수의 핵산은 각각 두 개 이상의 징크 핑거 도메인 및 전사를 억제하는 조절 도메인을 포함하는 서로 다른 인공전사인자를 코딩하는 단계; 소정 형질을 가진 세포에 핵산 라이브러리 구성원을 도입하는 단계; 및 소정 형질을 변화시키는 라이브러리 구성원의 동정하는 단계.

본 발명은 또한 제1 세포에서 인공 징크 핑거 키메라 단백질의 표현형을 확인하고, 제2 세포에서 단백질을 발현하며, 제2 세포의 표현형을 확인하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 상기 방법은 제1 세포(예: 효모 균주(strain) 또는 293 세포와 같은 인간 세포주(cell line))에서 소정 표현형을 변화시키는 전사인자 라이브러리의 구성원을 동정하고, 그 구성원을 다른 세포(예: 다른 효모 균주 또는 Hela 세포)에서 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 제1 세포는 다른 균주 또는 세포주보다 스크리닝에 더 적합할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 항－진균 제제에 대한 진균 균주의 감수성을 변화시키는 방법을 특징으로 한다: 세 개 이상의 징크 핑거 도메인으로 구성된 인공 키메라 단백질을 코딩하는 핵산을 진균 세포에 도입하는 단계; 및 세포에 도입된 핵산이 발현되는 조건 하에서 진균 세포를 배양하는 단계. 예를 들어, 진균 세포는 칸디다(Candida), 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 히스토프라스마(Histoplasma) 또는 크립토코커스(Cryptococcus) 등의 효모 세포이다. 한 실시태양에서, 인공 키메라 단백질은 K1 내지 K11에서 선택된 단백질의 징크 핑거 배열의 아미노산 서열을 포함한다(실시예 3).

상기 방법은 다음 특징 중 하나 이상의 방법을 포함할 수 있다: 인공 키메라 단백질은 전사 조절 도메인(예: 전사 활성 또는 억제 도메인)으로 이루어진다; 세포 내 인공 키메라 단백질의 발현은 물 운반체(water transporter)의 전사 수준을 변화시킨다;S.세레비지애(S. cerevisiae) 세포 내 인공 키메라 단백질의 발현은 YLL053 유전자 또는 PDR5 유전자의 전사 수준을 변화시킨다; 인공 키메라 단백질은 K1 내지 K11 중에서 선별된 폴리펩타이드와 특정 DNA 결합 부위에 대해 경쟁한다.

다른 측면에서, 본 발명은 항－진균 제제에 대한 진균 균주의 감수성을 변화시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 YLL053, AQY1, YJR147W, YLL052C 또는 YPL091W와 30, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95％ 이상 동일한 50개 이상의 아미노산의 서열을 포함하는 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 진균 세포는 칸디다(Candida), 피키아 (Pichia), 한세눌라 (Hansenula), 히스토프라스마 (Histoplasma) 또는 크립토코커스 (Cryptococcus) 등과 같은 효모세포이다. 한 실시태양에서, 활성 또는 발현의 증가로 감수성이 감소된다. 즉, 저항성이 증가된다. 다른 실시 태양에서, 감수성을 감소시키기 위해, 즉 저항성을 증가시키기 위해 활성 또는 발현을 증가시킨다. 다른 실시태양에서, 감수성을 증가시키기 위해 활성 또는 발현을 감소시킨다. 활성 또는 발현을 변화시키는 것은 인공전사인자의 발현, YLL053, AQY1, YJR147W, YLL052C 또는 YPL091W 유전자에 상응하는 최소 20 개 염기의 서열을 포함하는 이중－가닥 RNA(dsRNA)를 세포에 접촉시킴, 또는 화학 물질을 세포에 접촉시킴을 포함할 수 있다.

관련된 방법은, 상기 단백질과의 상호작용에 대해 시험화합물(예: 작은 유기 화합물)을 스크리닝하여, 예를 들어, YLL053/AQY1 관련 단백질의 억제를 동정하거나 AQY1, YJR147W, YLL052C, YLL053C 또는 YPL091W의 활성 또는 발현을 변화시키는 시험 물질을 스크리닝하는 것을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 항－진균 제제에 대한 진균 균주의 민감성을 변화시키는 인공 키메라 단백질을 동정하는 방법을 특징으로 한다. 그 방법은 다음을 포함한다: 천연형 단백질과 서로 인접하지 않은 두 개 이상의 징크핑거 도메인을 포함하는 최소 세 개 이상의 징크 핑거 도메인 배열로 구성된 인공 키메라 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 복수의 핵산으로 구성된 핵산 라이브러리를 제공하는 단계; 형질감염된 진균세포를 생산하기 위해 진균세포에 복수의 각 핵산을 도입하는 단계; 항－진균 제제의 존재 하에 형질감염된 진균 세포를 배양(예: 배양(culturing))하는 단계; 및 형질감염된 진균 세포 중 대조세포에 비해 항－진균 제제에 대한 민감성이 변화된 세포를 선별하는 단계.

상기 방법은 다음 특성 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 대조 진균세포는 형질감염되지 않거나 또는 대조 핵산으로 형질감염된다; 복수의 각 핵산에 의해 코딩되는 키메라 단백질은 전사 조절 도메인을 포함한다; 진균세포는, 예를 들어, 칸디다(Candida), 히스토프라스마 (Histoplasma) 또는 크립토코커스 (Cryptococcus)와 같은 병원성 진균세포이다.

또한, 상기 방법은, 예를 들어, (i) 선별된 세포 내 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질의 징크 핑거 도메인 배열, 및 (ii) 선별된 세포 내 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질의 전사조절 도메인 이외의 전사조절 도메인으로 이루어진 제2 키메라 단백질을 코딩하는 핵산을 제작하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 다른 특성들을 포함할 수 있다.

다른 면에서, 본 발명은 항－진균 제제에 대한 진균세포의 저항성을 상쇄시키는 제제를 동정하는 방법을 특징으로 한다. 그 방법은 다음을 포함한다: YJR147W, YLL052C, YLL053C 또는 YPL091W를 포함하는 폴리펩타이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및, 시험 물질과 폴리펩타이드의 상호작용을 밝히는 단계, 이때, 상호작용이란 시험물질의 항－진균 제제에 대한 저항성을 상쇄시키는 제제로서의 유용성을 의미. 또한, 상기 방법은, 예를 들어, 시험 물질 및 항－진균 제제를 진균 세포와 접촉시키고 세포의 생존 또는 생장을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 세포는 항－진균 제제(예: 케토코나졸)에 대한 저항성을 가진 세포일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 인공전사인자에 의해 조절되는 표적 유전자를 동정하는 방법을 특징으로 한다: 두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 각각 포함하는 서로 다른 인공전사인자를 각각 코딩하는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계; 라이브러리의 각 구성원을 시험세포의 복제물에 도입하여 다수의 형질전환된 세포를 제공하는 단계; 형질 전환된 다수의 세포로부터, 시험세포에 비해 표현형이 변형된 다수의 표현형 변환 세포(phenotypically altered cell)를 동정하는 단계; 및, 다수 중 2개 이상의 표현형 변환 세포에서 그 양이 유사하게 변화된 하나 이상의 전사체 또는 단백질을동정하는 단계.

한 실시태양에서, 상기 방법은, 예를 들어, 시험세포 내에서의 유전자 변형(예: 돌연변이 또는 과발현) 또는 다른 방법(예: RNA 간섭(interference), 안티－센스(anti－sense) 또는 항체 결합)에 의해 2개 이상의 표현형 변환 세포에서 그 양이 유사하게 변화된 전사체 또는 단백질의 활성을 변화시키는 것을 포함한다. 어떤 경우에는, 복수의 전사체 또는 단백질의 활성이 변화된다.

한 실시 태양에서, 다수의 유사하게 변화된 전사체 또는 단백질은 각 표현형 변환 세포 내 전사체 또는 단백질 양을 프로파일링하여, 각 표현형 변환 세포의 프로필을 제공하고, 이 프로필을 서로 비교함으로써 동정한다. 프로필은, 예를 들어, 핵산 또는 단백질 배열(array), SAGE 표지(tag), 감별 전개(differential display) 또는 상쇄 혼성화(subtractive hybridization) 등을 사용하여 얻을 수 있다.

한 실시태양에서, 세포는 인간 암세포와 같은 암세포일 수 있다. 하나 이상의 동정된 전사체는 인공전사인자가 없는 세포에는 존재하지 않는 전사체일 수 있다.

동정된 전사체 중 하나에 의해 코딩되는 폴리펩타이드는 표적과 상호작용하는 시험 화합물을 검색하는 스크리닝에서 표적 폴리펩타이드로 사용될 수 있다. 시험 화합물은 표적 폴리펩타이드의 활성을 증대 또는 억제하는지를 결정하기 위해 분석될 수 있다. 한 실시태양에서, 시험 화합물은 10, 5, 또는 2 kDa 이하의 분자량을 가지는 소분자이다.

상기의 모든 방법에 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산 라이브러리가사용될 수 있다. "라이브러리"는 유사하지만 동일하지는 않는 생분자들(biomolecules)의 물리적 집합을 의미한다. 상기 집합은, 예를 들어, 하나의 용기(vessel)에 모이거나, 고체 지지체 상의 분리된 영역 또는 분리된 용기(vessels)에 (군으로 또는 개별로) 물리적으로 분리될 수 있다. 집합 내에 라이브러리의 개별 구성원은 이중으로 존재할 수 있다. 라이브러리는 10, 10², 10³, 10⁵, 10⁷또는 10⁹이상의 서로 다른 구성원 또는 10¹³, 10¹², 10¹⁰, 10⁹, 10⁷, 10⁵또는 10³미만의 서로 다른 구성원을 포함할 수 있다.

대표적인 제1 라이브러리는 복수의 핵산을 포함하며, 각 핵산은 최소 제1 , 제2 및 제3 징크 핑거 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다. 상기 "제1 , 제2 및 제 3"은 폴리펩타이드에서 어떤 순서로도 존재할 수 있는 세 개의 분리된 도메인을 의미한다: 예를 들어, 각 도메인은 다른 도메인 중 어느 하나 또는 양쪽의 N－말단 또는 C－말단에 위치할 수 있다. 제1 징크 핑거 도메인은 다수의 핵산들 간에 다양하게 변한다. 제2 징크 핑거 도메인도 다수의 핵산들 간에 다양하게 변한다. 최소 10개의 서로 다른 징크 핑거 도메인이 라이브러리에 나타난다. 한 실시태양에서, 라이브러리 구성원 중 최소 0.5, 1, 2, 5％, 10％, 또는 25％는 다음 특성 중 하나 또는 모두를 나타낸다. (1) 각각은 최소 하나 이상의 p1G 리포터 프라스미드의 전사를 생체내에서 최소 1.25배 억제한다. (2) 각각은 하나 이상의 표적 부위에 7, 5, 3, 2, 1, 0.5 또는 0.05 nM 이하의 해리 상수(dissociation constant)로 결합한다. 제1 및 제2 징크 핑거 도메인은 상이한 천연형 단백질에서유래하거나 천연형 단백질 내에서의 배열과는 상이한 배열로 위치할 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 징크 핑거 도메인은 폴리펩타이드 내에서 인접하거나, 천연형 단백질에서 하나 이상의 개재(intervening) 징크 핑거 도메인에 의해 분리되어 있을 수 있다.

대표적인 제2 라이브러리는 최소 제1 및 제2 징크 핑거 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 각 복수의 핵산을 포함한다. 각 폴리펩타이드의 제1 및 제2 징크 핑거 도메인은, (1) 서로 다른 천연형 단백질의 징크 핑거 도메인과 동일하다(그리고 일반적으로 같은 천연형 단백질 내에 존재하지 않거나 천연형 단백질 내의 상대적 위치와는 다른 배열로 위치한다), (2) 천연형 단백질의 도메인과 넷, 셋, 둘 또는 하나 이하의 아미노산기가 다르다, 또는 (3) 천연형 단백질에서 인접하지 않는 징크 핑거 도메인이다. 동일한 징크 핑거 도메인이란 제1 금속 배위 잔기(주로 시스테인) 내지 마지막 금속 배위 잔기(주로 히스티딘)에서 각 아미노산과 동일한 징크 핑거 도메인을 의미한다. 제1 징크 핑거 도메인은 복수의 핵산들 간에 다양하게 변화하며, 제2 징크 핑거 도메인도 복수의 핵산들 간에 다양하게 변화한다. 천연형 단백질은 진핵 세포 유래의 징크 핑거 단백질일 수 있다: 예를 들어, 진균(예: 효모), 식물, 또는 동물 단백질(예: 사람 또는 쥐 단백질 같은 포유류 단백질)이다. 각 폴리 펩타이드는 또한 제 3, 제 4, 제 5 및/또는 제 6 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다. 각 징크 핑거 도메인은 인간과 같은 포유류 유래 징크 핑거 도메인일 수 있다.

예를 들어 돌연변이된 징크 핑거 도메인을 포함하는 다른 형태의 라이브러리가 사용될 수 있다.

한 실시태양에서, 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산 라이브러리 또는 그러한 단백질 자체의 라이브러리는 다른 조절 도메인을 가진 구성원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 라이브러리는 활성화 도메인을 가진 최소 10％의 구성원과 억제 도메인을 가진 최소 10％ 다른 구성원을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 최소 10％는 활성 또는 억제 도메인을 가지며 다른 최소 10％는 조절 도메인을 갖지 않는다. 또 다른 예에서, 일부는 활성화 도메인을 포함하고; 다른 일부는 억제 도메인을 포함하며; 나머지는 조절 도메인을 전혀 포함하지 않는다. 예를 들어, 최소 20, 25, 30, 40, 50, 60％와 같은 다른 백분율이 사용될 수 있다.

1. Neuro1p65 및 관련된 분자들

또 다른 태양에서, 본 발명은 다음의 서열을 포함하는 인공 폴리펩타이드를 특징으로 한다:

CX_(2－5)CXXXBXQXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX(_2－5)CXXXBXQXSNJXKH X₍₃₅₎HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXCXSNJXRHX_(3－5)H (서열번호: 36),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이다; 또한 J는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 소수성 아미노산이다. 상기 배열은 또한 다음과 같이 약칭한다: QSNR－QSNK－CSNR. 다른 인공 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXQXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXSNJXKHX_(3－5)H (서열변호:37), 및

CX_(2－5)CXXXBXQXSNJXKHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXCXSNJXRHX_(3－5)H (서열번호: 38).

예를 들어, 폴리펩타이드는 쥐의 Neuro2a 세포에 효과적인 농도로 존재할 때 신경돌기를 유도할 수 있다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 2 내의 징크핑거 배열과 동일하거나 서열번호: 2 내에 존재하는 징크 핑거 도메인에서 8, 6, 4, 3 또는 2개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적(conservative) 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 2 내의 징크 핑거 배열과 최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10 nM 이하의 K_d를 가지고 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 Neuro1p 키메라 ZFP(서열번호: 2)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성화 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 추가 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다.

또한 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 2의 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 1의 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열,인핸서(enhancer) 서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역(untranslated) 조절 서열, 폴리 A 첨가 부위 등과 같은, 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 코딩 핵산은 유도 프로모터 또는 세포－형 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나, 염색체 내로 삽입될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 숙주세포(예: 포유류 숙주 세포)를 특징으로 한다. 숙주 세포는 상기 핵산을 포함하고 발현할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포는 (예: 적어도 부분적으로 폴리펩타이드의 결과로서) 신경돌기를 확장하는 신경세포일 수 있다.

2. Osteo1p65 및 관련된 분자들

또 다른 태양에서, 본 발명은 다음의 서열을 포함하는 인공 폴리펩타이드를 특징으로 한다.:

CX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXVXSTJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)H (서열번호: 39),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이며, J는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 소수성 아미노산이다. 또한, 상기 배열은 다음과 같이 약칭한다: RDKR－QTHR－VSTR－RDKR. 다른 인공 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXVXSTJXRHX_(3－5)H (서열번호: 40);

CX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXVXSTJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)H (서열번호: 41);

CX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX(_2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 42); 및

CX_(2－5)CXXXBXVXSTJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)H (서열번호: 43).

폴리펩타이드는, 예를 들어, C2C12 근세포주에 효과적인 농도로 존재할 때, 골아세포(osteoblasts)의 다른 표지 또는 알칼린 포스파타제를 유도할 수 있다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 4 내의 징크 핑거 배열과 동일하거나 서열번호: 4 내에 존재하는 징크 핑거 도메인 내 8, 6, 4, 3, 또는 2개 미만의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 4 내의 징크 핑거 배열과 최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 K_d10 nM 미만으로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 Osteo1p 키메라 ZFP(서열번호: 4)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성 또는 억제 도메인같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 추가 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다.

또한, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 4의 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 3의 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서 (enhancer)서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은, 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 코딩 핵산은 유도 프로모터 또는 세포－형 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나, 염색체 상에 삽입될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포)를 특징으로 한다. 숙주 세포는 상기 핵산을 포함하고 발현할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포는 적어도 부분적으로 인공 키메라 폴리펩타이드의 결과로서 골아세포의 표현형을 가지는 줄기세포일 수 있다.

3. 08_D04_6 및 관련된 분자들

또 다른 태양에서, 본 발명은 다음 서열을 포함하는 인공 폴리펩타이드를 특징으로 한다:

CX_(2－5)CXXXBXRXSHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXVXSSJXRHX_(3－5)H (서열번호: 44),

이때 B는 임의의 아미노산 또는 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이다; 또한 J는 임의의 아미노산 또는 선택적으로 소수성 아미노산이다. 상기 배열은 또한 다음과 같이 약칭한다: RSHR－RDHT－VSSR. 대표적인 다른 인공 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXRXSHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)H (서열번호: 45); 및

CX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXVXSSJXRHX_(3－5)H (서열번호 :46)

폴리펩타이드는, 예를 들어, 인간 293 세포에 효과적인 농도로 존재할 때 인슐린 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 6 내의 징크 핑거 배열과 동일하거나 서열번호: 6번 내에 존재하는 징크 핑거 도메인 내에서 8, 6, 4, 3, 또는 2개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 6 내의 징크 핑거 배열과 최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10 nM 미만의 K_d로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 08_D04_6 키메라 ZFP(서열번호: 6)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 추가 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다.

상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 6의 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 5의 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은, 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 코딩 핵산은 유도 프로모터 또는 세포－형 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 핵산은 벡터에 포함되거나 염색체 내로 삽입될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포)를 특징으로 한다. 숙주 세포는 상기 핵산을 포함하고 발현할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포는 적어도 부분적으로 인공 키메라 폴리펩타이드의 결과로서 인슐린 유전자를 발현하는 사람세포일 수 있다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 세포를 시험관 내에서 배양하는 것을 포함하는 인슐린 생산 방법, 또는 상기 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 대상의 세포 내로 도입함으로써 대상에서 인슐린을 생산하는 방법을 특징으로 한다.

4. P_B08 및 관련된 분자들

CX_(2－5)CXXXBXQXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXDXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXDXSNJXRHX_(3－5)H (서열번호: 47),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이며 J는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 소수성 아미노산이다. 또한 상기 배열은 다음과 같이 약칭한다: QSNR－DSNR－DSNR. 다른 인공 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXQXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXDXSNJXRHX_(3－5)H (서열번호: 48); 및

CX_(2－5)CXXXBXDXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXDXSNJXRHX_(3－5)H (서열번호: 49).

예를 들어, 이 폴리펩타이드는 효과적인 농도로 존재할 때 293 세포에서 SV40－SEAP 리포터 구조체에 의해 코딩되는 리포터 폴리펩타이드와 같은 이종 폴리펩타이드의 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 8의 징크 핑거 배열과 동일하거나 서열번호: 8 내에 존재하는 징크 핑거 도메인에서 8, 6, 4, 3, 또는 2개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 8 내의 징크 핑거 배열과 최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10 nM 이하의 K_d로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 P_B08 키메라 ZFP(서열번호: 8)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 추가 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다.

또한 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 8의 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 7의 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서 (enhancer)서열, 인슐레이터 (insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은, 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 코딩 핵산은 유도 프로모터 또는 세포－형 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나, 염색체 내로 삽입될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포)를 특징으로 한다. 숙주 세포는 상기 핵산을 포함하고 발현할 수 있다.

예를 들어, 숙주세포는 증가된 이종 폴리펩타이드의 생산을 가지는 포유류 세포일 수 있다.

5. K_D10 및 관련된 분자들

또 다른 태양에서, 본 발명은 다음의 서열을 포함하는 인공 폴리펩타이드를특징으로 한다:

CX_(2－5)CXXXBXQXSHJXVHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXWXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXWXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDNJXQHX_(3－5)H (서열번호: 50),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이다; J는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 소수성 아미노산이다. 상기 배열은 또한 다음과 같이 약칭한다: QSHV－WSNR－WSNR－RDNQ. 다른 인공 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXWXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXWXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDNJXQHX_(3－5)H (서열번호: 51); 및

CX_(2－5)CXXXBXQXSHJXVHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXWXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXWXSNJXRHX_(3－5)H (서열번호: 52).

폴리펩타이드는 포유류 세포 내에 충분한 농도로 존재할 경우 세포의 증식을 최소 30, 40, 50 또는 60％ 감소시킬 수 있다. 세포 증식은 예정된 배양(incubation) 시간 후의 세포 수에 의해 평가된다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 10 내의 징크 핑거 배열과 동일하거나 또는 서열번호: 10 내에 존재하는 징크 핑거 도메인에서 8, 6, 4, 3, 또는 2개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 10 내의 징크 핑거 배열과 최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10 nM 이하의 K_d로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 K_D10 키메라 ZFP(서열번호: 10)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성화 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다.

또한 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 10의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호: 9의 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은, 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 코딩 핵산은 유도 프로모터 또는 세포－형 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나, 염색체 내로 삽입될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포)를 특징으로 한다. 숙주 세포는 또한 핵산을 발현한다. 예를 들어, 숙주세포는 폴리펩타이드를 포함하지 않는 동일한 세포에 비해 세포 증식속도가 감소된 포유류 세포일 수 있다.

6. K_F02 및 관련된 분자들

CX_(2－5)CXXXBXDXSAJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDEJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 53),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이다; 또한 J는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 소수성 아미노산이다. 상기 배열은 다음과 같이 약칭한다: DSAR－RDKR－RDER－QTHR. 다른 인공 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDEJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)(서열번호: 54); 및

CX_(2－5)CXXXBXDXSAJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDEJXRHX_(3－5)H (서열번호: 55).

폴리펩타이드는 293 세포와 같은 포유류 세포에서 최소 50, 100 또는 120％까지 세포의 증식을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 12의 징크 핑거 배열과 동일하거나 서열번호: 12 내에 존재하는 징크 핑거 도메인에서 8, 6, 4, 3, 또는 2 개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 12 내의 징크 핑거 배열과 최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10 nM 이하의 K_d로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 K_F02 키메라 ZFP(서열번호: 12)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다.

상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산도 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 12의 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 11의 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은, 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 핵산은 유도 프로모터 또는 세포 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나, 염색체 내로 삽입될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포)를 특징으로 한다. 숙주 세포는 상기 핵산을 포함하고 발현할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포는 폴리펩타이드를 포함하지 않는 동일한 세포에 비해 증가된 세포 증식속도를 가진 포유류 세포일 수 있다.

7. K12_A11 및 관련된 분자들

CX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXSNJXVHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXFNJXRHX_(3－5)H (서열번호: 56),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이다; 또한 J는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 소수성 아미노산이다. 상기 배열은 다음과 같이 약칭한다: RDHT－QSNV－QTHR－QFNR. 다른 인공 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXSNJXVHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 57); 및

CX_(2－5)CXXXBXQXSNJXVHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXFNJXRHX_(3－5)H (서열번호: 58)

폴리펩타이드는 포유 동물 세포 내에서 바이러스 프로모터와 같은 강력한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자와 같은 이종 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 260의 징크 핑거 배열과 동일하거나 서열번호: 260 내에 존재하는 징크 핑거 도메인에서 8, 6, 4, 3, 또는 2개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 260 내의 징크 핑거 배열과 최소80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10 nM 이하의 K_d로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 K12_A_11 키메라 ZFP(서열번호: 260)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다. K12_A_11 키메라 ZFP는 억제 도메인을 포함하고 있으므로 이종 유전자의 프로모터에 직접 결합함으로써 이종 유전자의 발현을 증가시키지는 않을 것이다.

또한 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산도 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 260의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호: 259의 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 것을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 코딩 핵산은 유도 프로모터 또는 세포－형 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나 염색체 내로 삽입될 수 있다.

더불어, 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포)를 특징으로 한다. 숙주 세포는 상기 핵산을 포함하고 발현할 수 있다.

8. K44－16－E12 및 관련된 분자들

CX_(2－5)CXXXBXQXSHJXVHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXSSJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 59),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이다; 또한 J는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 소수성 아미노산이다. 상기 배열은 다음과 같이 약칭한다: QSHV－QSSR－QTHR. 다른 인공 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXQXSSJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 60); 및

CX_(2－5)CXXXBXQXSHJXVHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXSSJXRHX_(3－5)H (서열번호: 61).

폴리펩타이드는 포유 동물 세포 내에서 바이러스 프로모터와 같은 강력한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자와 같은 이종 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 262의 징크 핑거 배열과 동일하거나 서열번호: 262 내에 존재하는 징크 핑거 도메인에서 8, 6, 4, 3, 또는 2개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 262 내의 징크 핑거 배열과최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10 nM 이하의 K_d로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 K44－16－E12 키메라 ZFP(서열번호: 262)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다. K44－16－E12 키메라 ZFP는 억제 도메인을 포함하고 있으므로 이종 유전자의 프로모터에 직접 결합함으로써 이종 유전자의 발현을 증가시키지는 않을 것이다.

상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산도 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 262의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호: 261의 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은, 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 핵산은 유도 프로모터 또는 세포－형 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나 염색체 내로 삽입될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포)를 특징으로 한다. 숙주 세포는 상기 핵산을 포함하고 발현할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포는, 증가된 이종 단백질 생산의 표현형을 가지는 293 세포와 같은 포유류 세포일 수 있다(예: CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자에 의해 코딩되는 분비 및 세포 내 리포터 단백질)

9. K13_B08 및 관련된 분자들

CX_(2－5)CXXXBXQXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXSSJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)H (서열번호: 62),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이다; 또한 J는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 소수성 아미노산이다. 상기 배열은 다음과 같이 약칭한다: QSNR－QSSR－QTHR－RDKR. 다른 인공 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXQXSSJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDKJXRHX_(3－5)H (서열번호: 63); 및

CX_(2－5)CXXXBXQXSNJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXSSJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 64).

이 폴리펩타이드는 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종 유전자에 의해 코딩되는 SEAP 단백질에 대해 증가된 SEAP 생산을 야기할 수 있다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 264의 징크 핑거 배열과 동일하거나 또는 서열번호: 264 내에 존재하는 징크 핑거 도메인에서 8, 6, 4, 3, 또는 2개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 264 내의 징크 핑거 배열과 최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10 nM 이하의 K_d로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 K13_B08 키메라 ZFP(서열번호: 264)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다.

상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산도 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 264의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호: 263의 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은, 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 핵산은 유도 프로모터나 세포 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나 염색체 내로 삽입될 수 있다.

10. F104_p65 및 관련된 분자들

CX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXSHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXSHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 65),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이다; 또한 J는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 소수성 아미노산이다. 이 배열은 다음과 같이 약칭한다: RDHT－RSHR－QSHR. 다른 인공 폴리펩타이드의 예는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXRXSHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXSHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 66); 및

CX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXSHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 67).

예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 18의 징크 핑거 배열과 동일하거나 서열번호: 18 내에 존재하는 징크 핑거 도메인에서 8, 6, 4, 3, 또는 2개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 18 내의 징크 핑거 배열과 최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10nM 이하의 K_d로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 F104_p65 키메라 ZFP(서열번호: 18)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다.

상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산도 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 18의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호: 17의 서열을 포함하는 핵산으로부터 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은, 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 핵산은 유도 프로모터 또는 세포－형 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나, 염색체 내로 삽입될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포)을 특징으로 한다. 숙주 세포는 상기 핵산을 포함하고 발현한다.

11. F121_p65 및 관련된 분자들

CX_(2－5)CXXXBXQXSHJXTHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXSHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)H (서열번호: 68),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이다; 또한 J는 임의의 아미노산 또는 선택적으로 소수성 아미노산이다. 이 배열은 다음과 같이 약칭한다: QSHT－RSHR－RDHT. 다른 예의 인공 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:

CX_(2－5)CXXXBXRXSHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)H (서열번호: 69); 및

CX_(2－5)CXXXBXQXSHJXTHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXSHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 70).

예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 20의 징크 핑거 배열과 동일하거나 또는 서열번호: 20 내에 존재하는 징크 핑거 도메인에서 8, 6, 4, 3, 또는 2개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 20 내의 징크 핑거 배열과 최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10 nM 이하의 K_d로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 F121_p65 키메라 ZFP(서열번호: 20)과 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는, 예를 들어, 인슐린－유사 성장인자－2(insulin－like growth factor－2)의발현을 조절하는 데 사용될 수 있다.

상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산도 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 20의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호: 19의 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은, 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 핵산은 유도 프로모터 또는 세포－형 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나, 염색체 내로 삽입될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포)를 특징으로 한다. 숙주 세포는 상기 핵산을 포함하고 발현한다.

12. K44－11－D01 및 K44－11－G12와 관련된 분자들

CX_(2－5)CXXXBXQXSHJXVHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXSNJXIHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXCXSNJXRHX_(3－5)H (서열번호: 265),

CX_(2－5)CXXXBXQXSHJXVHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXVXSTJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDNJXQHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXQXTHJXRHX_(3－5)H (서열번호: 266),

이때 B는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 페닐알라닌 또는 타이로신이다;J는 임의의 아미노산이거나 선택적으로 소수성 아미노산이다. 이 배열은 다음과 같이 약칭한다: QSHV－SQNI－QTHR－CSNR 및 QSHV－VSTR－RDNQ－QTHR.

예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 14 또는 서열번호: 16의 징크 핑거 배열과 동일하거나 서열번호: 20 내에 존재하는 징크 핑거 도메인에서 8, 6, 4, 3, 또는 2개 이하의 치환에 의해 달라진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 서열번호: 14 또는 16 내의 징크 핑거 배열과 최소 80, 85, 90, 95 또는 97％ 동일한 서열을 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 폴리펩타이드는 표적 DNA 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 10 nM 이하의 K_d로 결합하는 부위와 같은 표적 DNA 부위에 대한 결합을 위해 F121_p65 키메라 ZFP(서열번호: 14 또는 16)와 경쟁할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 활성 또는 억제 도메인과 같은 전사 조절 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 하나, 둘 또는 셋, 또는 그 이상의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는, 예를 들어, 단백질 생산을 조절하는 데 사용될 수 있다.

상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산도 특징으로 한다. 예를 들어, 서열번호: 14 또는 16의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호: 13 또는 15의 서열을 포함하는 핵산으로부터 코딩될 수 있다. 특징된 핵산은 프로모터 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 인슐레이터(insulator) 서열, 비번역 조절 서열, 폴리 A 첨가부위 등과 같은 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 것을 포함할 수 있다. 한실시태양에서, 핵산은 유도 프로모터 또는 세포 특이적 프로모터와 같은 조건적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 핵산은 벡터에 포함되거나, 염색체 내로 삽입될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 숙주세포(예: 포유류 숙주 세포)를 특징으로 한다. 숙주 세포는 상기 핵산을 포함하고 발현한다.

본원에서, "해리상수(dissociation constant)"는 하나의 9－염기쌍 표적 부위를 포함하는 28－염기쌍 이중－가닥 DNA와의 결합에 대한 폴리펩타이드의 평형화된 해리상수를 의미한다. 해리상수는, 상온에서 20 mM Tris pH7.7, 120 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 20 M ZnSO₄10％ 글라이세롤, 0.1％ Nonidet P－40, 5 mM DTT 및 0.10 mg/mL BSA(소혈청알부민) 조건 하에 결합되어 있는 정제된 단백질을 사용한 겔 이동 분석(Gel Shift Assay)에 의해 결정한다. 추가 세부 사항은 실시예 10 및 레바와 파보의 방법(Rebar와 Pabo,Science,263, 671－673, 1994)에 제시되어 있다.

본 발명의 "스크리닝"은 소정의 특성을 갖는 하나 이상의 특정 구성원을 검색하기 위해 라이브러리 구성원을 분석하는 과정을 의미한다. 예를 들어, 신경돌기를 확장하는 지의 여부에 대해 각 세포가 분석된다. 스크리닝의 다른 형태인 "선별"에서는 각 구성원이 직접적으로 분석되지는 않는다. 오히려 특정 형질을 가진 구성원만 남게 되는 조건 하에서 구성원을 대상으로 하는 분석이 수행된다. 선별은 생존(예: 약제 저항성) 또는 표면 결합(예: 기질에의 접착) 등에 의해 매개될 수있다. 이같은 선별 과정은 "스크리닝"의 개념에 포함된다.

"염기 접촉 부위", "DNA 접촉 부위" 또는 "핵산 접촉 부위"는 ZIF268의 아르기닌 73, 아스파트산 75, 글루타민산 76 및 아르기닌 79의 아미노산 부위에 구조적으로 상응하는 징크 핑거 도메인의 4개의 아미노산 위치를 의미한다.

(서열번호: 71)

이러한 위치는 각각 －1, 2, 3 및 6의 위치를 의미한다. 염기접촉 위치(base contacting position)에 상응하는 의문 서열에서의 부위를 동정하기 위해, 의문 서열은, 의문서열의 시스테인 및 히스티딘 잔기가 Zif268의 핑거3의 시스테인 및 히스티딘 잔기와 정렬하도록 관심 징크핑거 도메인에 정렬된다. 유럽 바이오인포메틱스 연합(Thompson 등 (1994)Nucleic Acids Res. 22:4673－4680)의 ClustalW WWW 서비스는 이러한 서열 정렬을 위한 편리한 방법을 제공한다.

보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄(side chain)을 갖는 잔기의 상호 교환을 의미한다. 예를 들어, 지방족(Aliphatic) 측쇄를 가지는 아미노산기는 글라이신, 알라닌, 류신 및 아이소류신이고; 지방족－하이드록실(aliphatic－hydorxyl) 측쇄를 가지는 아미노산기는 세린 및 트레오닌이고; 아마이드－함유 측쇄로 가지는아미노산기는 아스파라진 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 가지는 아미노산기는 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 가지는 아미노산기는 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이다; 산성 측쇄를 가지는 아미노산기는 아스파트산 및 글루타민산이고; 및 황－함유 측쇄를 가지는 아미노산기는 시스테인 및 메티오닌이다. 상황에 따라서, 동일한 군에 속하는 아미노산은 상호 교환될 수 있다. 추가적인 보존적 아미노산 치환 군은 발린－류신－아이소류신; 페닐알라닌－타이로신; 라이신－아르기닌; 알라닌－발린; 아스파트산－글루타민산; 및 아스파라진－글루타민이다.

"이종 폴리펩타이드"는 천연형 서열을 갖는 폴리펩타이드(예: 잡종(hybrid) 폴리펩타이드) 또는 천연형 폴리펩타이드와 동일한 서열을 가졌으나 천연형은 아닌 중간체로 존재하는 폴리펩타이드를 의미한다.

"하이브리드"및 "키메라"는 다음 중에서 유래된 아미노산 서열을 포함하는 비－천연형 폴리펩타이드를 의미한다. (i) 두 개 이상의 천연형 서열, 또는 동일한 천연형 서열의 인접하지 않은 영역으로서, 하이브리드 내에서; (ii) 하나 이상의 인공 서열(예: 천연형이 아닌 서열) 및 하나 이상의 천연형 서열; 또는 (iii) 두 개 이상의 인공 서열(같거나 또는 다름). 인공 서열의 예는 천연형 서열의 돌연변이체 또는 신규하게 디자인된 서열을 포함한다. "인공 서열"은 천연형 서열 중에 존재하지 않는다. 여기서 기술된 임의의 인공 서열(단백질, 핵산)과 관련하여, 본 발명은 동일한 요소를 지닌 서열을 의미하지만, 다음과 같이 전체 게놈 서열이 밝혀진 유기체 내에는 존재하지 않는다: 인류(Homo sapiens), 쥐류(Mus musculus),애기장대류(Arabidopsis thaliana), 초파리류(Drosophila melanogaster), 대장균류(Escherichia coli), 효모류(Saccharomyces cerevisiae), 및 벼류(Oryza sativa). 상기 서열을 가진 분자는 상기 유기체 중 하나의 세포 내 이종 분자로 발현될 수 있다.

본 발명은 또한 본원에서 기술된 방법에 의해 제조된 서열(필연적으로 "인공"의 개념은 아님)을 포함한다. 그 방법은, 예를 들어, 서로 다른 징크 핑거 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 연결하는 방법 또는 표현형 스크리닝의 방법이다. 본 발명은 그러한 서열을 포함하는 세포를 특징으로 한다.

본 발명의 "엄격한 조건하의 혼성화"는 6×염화나트륨/구연산나트륨(SCC), 45℃ 조건에서 혼성화한 다음 0.2×SSC, 0.1％ SDS, 65℃에서 두 번 세척하는 조건을 의미한다.

"결합 우위(binding preference)"는 다른 부위에 비해 하나의 핵산 결합 부위를 선택하는 폴리펩타이드의 특성을 구별하는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 두 개의 서로 다른 핵산 결합 부위에 결합할 수 있는 양적 제한이 있을 때, 폴리펩타이드가 생체 내 또는 시험관 내에서 다른 부위에 우선하여 더 많이 결합하는 부위를 의미한다.

"대조 세포"는 모든 종류의 표준 세포를 의미한다. 한 예에서 대조 세포는 징크 핑거 단백질을 발현하는 세포의 모세포이다. 즉, 징크 핑거 단백질을 발현하는 세포와 실질적으로 동일하지만 징크 핑거 도메인을 생성하지 못하는 세포를 의미한다.

많은 장점 중에서, 대다수의 방법 및 조성은 새롭고 유용한 키메라 단백질, 즉 키메라 전사인자의 동정 및 이용에 관련되어 있다. 일부 실시 태양은 하나 이상의 다음과 같은 장점을 포함한다: i) 세포 내 유전자의 발현은 증대 또는 감소하도록 조절될 수 있다. 어떤 주어진 인공 키메라 전사인자도 적절한 전사 활성화 도메인과의 융합 또는 억제 도메인과의 융합으로 인해 전사 활성체 또는 저해체로 변환될 수 있다. 또한, 전사 조절 도메인이 없이도, 예를 들면 TATA 상자 및 개시부위(initiator element) 근처에 결합함으로써, 키메라 전사 인자가 강력한 저해체가 될 수 있다. 또한, 서로 다른 DNA 결합 특이성을 갖는 활성체 및 저해체 둘 다를 포함하는 라이브러리의 스크리닝도 가능하다. ii) 유전자 발현은 세밀하게 조절될 수 있다. DNA－결합 친화력에 따라, 키메라 전사 인자는, 예를 들면 중간 내지 강한 활성화 및 억제와 같은 범위의 효과를 야기할 수 있다. 이것은 완전한 비활성화 또는 특정 표적 유전자의 높은 수준의 과발현에 의해서만 얻어지는 것은 아닌 다양한 표현형으로 나타난다. 예를 들면, 원하는 표현형을 추진하기 위해 몇몇 유전자의 협동 작용이 요구되는 경우, 광범위한 특이성이 잇점이 될 수 있다. 다른 경우엔, 협소한 특이성이 요구된다. 특이성을 유연하게 조절하는 한 방법은 징크 핑거 도메인을 삽입 또는 결실하는 것이다. 3－핑거 ZFPs는 이론적으로 6－핑거 ZFPs보다 더 많은 유전자를 조절한다. iii) ZFP 라이브러리 접근법은 광범위하게 적용될 수 있다. 전사 조절 기작은 월등히 유지되고 있고 모든 알려진 유기체는 살아있는 동안 DNA 및 전사를 사용하므로, DNA에 결합한 키메라 단백질은 어떤 원하는 세포에 대해서도 사용될 수 있다. 또한, 여기에서 기술된 많은 방법들은 유용한 키메라 단백질을 동정하기 위해 세포에 대한 선험적 정보(예: 게놈 서열)를 요구하지 않는다. v) ZFP－TF는 주 전사 조절 인자와 같은 주 조절 단백질의 기능을 모방할 수 있다. 예를 들면, ZFP－TF는 주 조절 단백질과 같은 부위에 결합하거나, 중복된 부위에 결합할 수 있다. vi) 유전자 발현 변화의 수준 및 이에 따른 ZFP－TF에 의해 생성된 표현형의 범위는 세포 내 ZFP－TF의 발현 정도를 변화시킴으로써 세밀하게 조절될 수 있다.

본원에 기술된 모든 특허, 특허 출원 및 참고문헌은 참조에 의해 온전히 본원에 합체된다. 다음의 특허 출원들: WO 01/60970 (김 등); 미국 출원 제 60/338,441호; 미국 출원 제 60/313,402호; 미국 출원 제 60/374,355호; 미국 출원제 60/376,053호; 미국 출원 제 60/400,904호; 미국 출원 제 60/401,089호; 및 미국 출원 제 10/223,765호는 모든 목적으로 참조에 의해 온전히 명백하게 합체된다. 본 발명의 하나 이상의 태양에 대한 세부사항은 첨부 도면 및 하기 명세서에 나타나 있다. 본원에 기술된 어떤 특징도 본원에 설명된 다른 양립될 수 있는(compatible) 특징과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점들은 명세서 및 도면, 및 청구항으로 분명해 질 것이다.

도 1은 효모 플라스미드 pYTC－Lib의 유전자 지도이다.

도 2는 예시적인 표적－유도 접근 방법의 모식도이다.

도 3a는 예시적인 징크 핑거 단백질 라이브러리의 제조 방법에 대한 모식도이다.

도 3b는 예시적인 표현형－유도 접근 방법의 모식도이다.

도 4는 일시적으로 형질감염된 ZFP의 발현 프로필을 묘사한 것이다. 왼쪽 도에서, p65 활성화 도메인만을 발현하는 세포를 대조 세포와 비교하였다. 오른쪽 도에서, F121p65 징크 핑거 단백질을 발현하는 세포를 대조 세포와 비교하였다. 대각선에서 이탈한 각 점은 그 발현이 실질상 변화된 유전자를 의미한다.

도 5는 안정적으로 형질감염된 ZFP의 발현 프로필을 묘사한 것이다.

도 6의 A는 K5 ZFP에 대한 DNA－결합 도메인 돌연변이 및 작용 도메인의 변화가 약제 저항성에 미치는 영향을 묘사한 것이고,도 6의 B는 K5와 YLL053C 과다발현의 효과를 묘사한다.

도 7은 3－핑거 라이브러리의 제작 방법을 묘사한다.

도 8은 대조 세포 및 신경돌기 형성이 유도된 ZFP－발현 세포의 사진이다.도 8의 A는 레티놀산(RA)을 처리하지 않은 pcDNA3(공 벡터)－형질감염된 Neuro2A 세포이고,도8의 B는 RA를 처리하지 않은 Neuro1－p65(또한 08_D01－65라고 부름)이고,도 8의 C는 10 uM RA를 처리한 pcDNA3(공 벡터)－형질감염된 세포이고,도 8의 D는 10 uM RA를 처리한 Neuro1－p65의 발현이다.

도 9는 인슐린 유전자가 과발현된 세포에 대한 비교 미세배열 데이타를 묘사한것이다. 키메라 ZFP는 08_D04－p65이다. 이의 서열은 도 16에 나타나 있다.

도 10a는 ZFP DNA 결합 특이성을 나열한 표이다.

도 10b는 징크 핑거 도메인 및 인식 부위 서열의 상호 연관성을 나타낸 모식도이다.

도 11은 인공 ZFP의 표적을 동정하는 방법에 대한 순서도이다.

도 12는 분화를 유도하는 ZFP를 동정하는 방법에 대한 모식도이다.

도 13은 F104－p65 ZFP가 존재하는 세포에서 다양한 시간대별 비교 미세배열 자료를 묘사한 것이다.

도 14는 신경돌기를 유도할 수 있는 단백질인 Neuro1－p65에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 1) 및 아미노산 서열(서열번호: 2)을 나타낸 것이다. Neuro1－p65는 징크 핑거 도메인 QSNR1－QSNK－CSNR1 및 p65 전사 활성화 도메인을 포함한다. QSNR1－QSNK－CSNR1－p65의 도메인과 동일한 양식의 DNA 접촉 잔기를 가지는 최소 두 개 또는 세 개의 연속적인 징크 핑거 도메인을 지닌 다른 인공 단백질이 신경돌기를 또한 유도할 수도 있다.

도 15는 골세포를 유도할 수 있는 단백질인 Osteo1－p65에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 3) 및 아미노산 서열(서열번호: 4)을 나타낸 것이다. Osteo1－p65는 징크 핑거 도메인인 RDKR－QTHR1－VSTR－RDKR 및 p65 활성화 도메인을 포함한다. RDKR－QTHR1－VSTR－RDKR－p65의 도메인과 동일한 양식의 DNA 접촉 잔기를 가지는 최소 두 개 또는 세 개의 연속적인 징크 핑거 도메인을 가진 다른 인공 단백질도 골세포를 유도할 수 있다.

도 16은 인슐린 생산(도 9)을 증가시키는 단백질인 08_D04_p65에 대한 코딩 핵산 서열 (서열번호: 5)과 아미노산 서열(서열번호: 6)을 나타낸 것이다. 08_D04_p65는 징크 핑거 도메인인 RSHR－RDHT－VSSR 및 p65 활성화 도메인을 포함한다. RSHR－RDHT－VSSR의 도메인과 동일한 양식의 DNA 접촉 잔기를 가지는 최소 두 개 또는 세 개의 연속적인 징크 핑거 도메인을 가진 다른 인공 단백질도 인슐린 생산을 증가시킬 수 있다.

도 17은 SV40－SEAP의 생산을 증가시키는 단백질인 P_B08에 대한 코딩 핵산 서열 (서열번호: 7) 및 아미노산 서열(서열번호: 8)을 나타낸 것이다. P_B08은 징크 핑거 도메인인 QSNR1－DSNR－DSNR과 p65 활성화 도메인을 포함한다. QSNR1－DSNR－DSNR의 도메인과 동일한 양식의 DNA 접촉 잔기를 가지는 최소 두 개 또는 세 개의 연속적인 징크 핑거 도메인을 가진 다른 인공 단백질도 SV40－SEAP 생산을 증가시킬 수 있다.

도 18은 세포 증식을 감소시키는 단백질인 K_D10에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 9) 및 아미노산 서열(서열번호: 10)을 나타낸 것이다. K_D10은 징크 핑거 도메인인 QSHV－WSNR－WSNR－RDNQ 및 kid 억제 도메인을 포함한다. QSHV－WSNR－WSNR－RDNQ의 도메인과 동일한 양식의 DNA 접촉 잔기를 가지는 최소 두 개 또는 세 개의 연속적인 징크 핑거 도메인을 가진 다른 인공 단백질도 세포 증식을 억제할 수 있다.

도 19는 세포 증식을 증가시키는 단백질, K_F02에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 11)과 아미노산 서열(서열번호: 12)을 나타낸 것이다. K_F02는 징크 핑거 도메인인 DSAR2－RDKR－RDER1－QTHR1 및 kid 억제 도메인을 포함한다. DSAR2－RDKR－RDER1－QTHR1의 도메인과 동일한 양식의 DNA 접촉 잔기를 가지는 최소 두 개 또는 세 개의 연속적인 징크 핑거 도메인을 갖는 다른 인공 단백질도 세포 증식을 증가시킬 수 있다.

도 20은 단백질 발현을 증가시키는 단백질인 K44_11_D01에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 13) 및 아미노산 서열(서열번호: 14)을 나타낸 것이다. K44_11_D01은 징크 핑거 도메인 QSHV－QSNI－QTHR1－CSNR1과 kid 억제 도메인을 포함한다. QSHV－QSNI－QTHR1－CSNR1의 도메인과 동일한 DNA 접촉 잔기를 가지는 최소 두 개 또는 세 개의 연속적인 징크 핑거 도메인을 갖는 다른 인공 단백질도 단백질 발현을 증가시킬 수 있다.

도 21은 단백질 발현을 증가시키는 단백질인 K44_11_G12에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 15) 및 아미노산 서열(서열번호: 16)을 나타낸 것이다. K44_11_G12는 징크 핑거 도메인인 QSHV－VSTR－RDNQ－QTHR1 및 kid 억제 도메인을 포함한다. QSHV－VSTR－RDNQ－QTHR1의 도메인과 동일한 DNA 접촉 잔기를 가지는 최소 두 개 또는 세 개의 연속적인 징크 핑거 도메인을 갖는 다른 인공 단백질도 단백질 발현을 증가시킬 수 있다.

도 22는 F104_p65에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 17) 및 아미노산 서열(서열번호: 18)을 나타낸 것이다. F104_p65는 징크 핑거 도메인인 RDHT－RSHR－QSHR2－p65를 포함한다.

도 23은 F121_p65에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 19) 및 아미노산 서열(서열번호: 20)을 기술한다. F121_p65는 징크 핑거 도메인인 QSHT－RSHR－RDHT－p65를 포함한다. QSHT－RSHR－RDHT의 도메인과 동일한 양식의 DNA 접촉 잔기를 가지는 최소 두 개 또는 세 개의 연속적인 징크 핑거 도메인을 갖는 다른 인공 단백질도인슐린－유사 성장인자 2의 전사를 증가시킬 수 있다.

도 24는 징크 핑거 도메인인 RDHT－QSNV2－QTHR1－kid를 포함하는 K12_A11에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 259) 및 아미노산 서열(서열번호: 260)을 나타낸 것이다.

도 25는 징크 핑거 도메인인 QSHV－QSSR1－QTHR1－kid를 포함하는 K44－16－E12에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 61) 및 아미노산 서열(서열번호: 262)을 나타낸 것이다.

도 26은 징크 핑거 도메인인 QSNR1－QSSR1－QTHR1－RDKR－KID를 포함하는 K13_B08에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호: 263) 및 아미노산 서열(서열번호: 264)을 나타낸 것이다.

도 14 내지 26의 DNA 서열은 HA 택(tag)(회색 밑줄)을 코딩하는 서열 및 핵 위치 신호(nuclear localization signal, 상자로 표기)를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 시작 및 종료 코돈은 밑줄로 표시되어 있다. 소문자는 연결 서열을 나타낸다. 아미노산 서열에서, 이탤릭체 및 음영 문자는 징크 핑거 도메인을 나타내며 음영문자이면서 이탤릭체가 아닌 것은 kid 또는 p65 도메인과 같은 조절 도메인을 나타낸다.

도 14 내지 24의 DNA 서열은 HA 택(tag)(회색 밑줄)을 코딩하는 서열 및 핵 위치 신호(상자로 표기)를 코딩하는 서열을 포함한다. 개시 및 종료 코돈은 밑줄로 표시되어 있다. 음영 문자는 p65 또는 kid 도메인과 같은 조절 도메인을 코딩하는 서열을 나타낸다. 소문자는 연결서열을 나타낸다. 아미노산 서열과 관련해서, 이탤릭체와 음영 문자는 징크 핑거 도메인을 나타내며 음영문자이면서 이탤릭체가 아닌 것은 Kid나 p65와 같은 조절 도메인을 나타낸다.

본 발명의 한 태양에서, 세포 또는 개체의 표현 형질을 변화시키는 키메라 단백질을 동정하기 위해, 서로 다른 인공 키메라 단백질을 코딩하는 핵산의 라이브러리가 스크리닝 된다. 키메라 단백질은 특정 표적 유전자 또는 경로에 대한 선지식이 없이도 동정될 수 있다.

한 예에서, 라이브러리의 각 핵산은 복수의 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공 폴리펩타이드를 코딩한다. 예를 들어, 상기와 같이 다른 키메라 단백질을 코딩하는 핵산 라이브러리가 제작될 수 있다. 라이브러리 구성원은 개체의 세포 또는 배양중인 세포에 도입될 수 있다. 코딩된 폴리펩타이드의 발현을 위한 시간이 지난 후, 변형된 표현 형질을 갖는 세포 또는 개체를 동정한다. 형질이 변형된 세포 중 최소 하나에서 라이브러리 핵산이 회수되어 표현형에 영향을 주는 키메라 폴리펩타이드를 동정하게 된다.

이러한 방법이 하기에서는 일반적으로 키메라 징크 핑거 도메인의 측면에서 기술되었으나, 다른 DNA 결합 도메인 또는 세포 신호(signal) 도메인을 포함하는 다른 구조 도메인에 쉽게 적용 가능하다.

라이브러리 제작: 1. 구조 도메인의 예

핵산 라이브러리는 하나 이상의 구조 도메인의 키메라 인공 단백질을 코딩하고 발현할 수 있는 핵산을 포함하도록 제작된다. 어떤 측면에서는, 구조 도메인이, 다양한 결합 특이성을 가지는 단백질들을 코딩하는 라이브러리처럼, 특이성이 다양한 핵산 결합 도메인이다.

다양한 구조 도메인은 우수한 친화도 및 우수한 특이성을 지닌 핵산에 결합하는 것으로 알려져 있다. 이중 가닥 DNA를 인식하는 구조적 모티프에 대한 개설로 문헌[Pabo와 Sauer (1992)Annu. Rev. Biochem. 61:1053－95; Patikoglou와 Burley (1997)Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:289－325; Nelson (1995)Curr Opin Genet Dev.5:180－189]이 있다. 핵산 결합 도메인의 몇몇 예는 다음을 포함한다:

징크 핑거.징크 핑거는 대략 30 개의 아미노산 잔기로 된 작은 폴리펩타이드 도메인으로서, 그 중 시스테인 또는 히스티딘인 4 개의 아미노산 잔기가 적절히 배치되어 아연 이온과 배위 결합을 할 수 있다(도 1 참조; 검토를 위해, 예를 들어 문헌 (Klug and Rhodes (1987)Trends Biochem. Sci.12: 464－469 (1987); Evans and Hollenberg, (1988)Cell52: 1－3; Payre and Vincent (1988)FEBS Lett.234: 245－250; Miller 등, (1985)EMBO J.4:1609－1614; Berg (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85:99－102; 및 Rosenfeld and Margalit, (1993)J. Biomol. Struct. Dyn.11: 557－570) 참조). 따라서, 징크 핑거 도메인은 아연 이온과 배위결합을 하는 잔기의 종류에 따라, 예를 들어 Cys₂－His₂류, Cys₂－Cys₂류, Cys₂－CysHis 류 등으로 분류할 수 있다. Cys₂－His₂징크 핑거에서 아연과 배위결합하는 잔기는 전형적으로 다음과 같이 배치되어 있다:

Xa－X－C－X_2－5－C－X₃－Xa－X₅－ψ－X₂－H－X_3－5－H

여기에서 ψ(프사이)는 소수성 잔기이고(Wolfe 등, (1999)Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 3:183－212)(서열번호: 76), "X"는 임의의 아미노산을 나타내고, X_a는 페닐알라닌 또는 티로신이며, 아래 첨자는 아미노산의 개수를 가리키고, 하이픈으로 연결된 두 개의 아래 첨자는 개입하는 아미노산의 전형적인 범위를 가리킨다. 비록 역평행(anti－parallel) β－주름은 짧고 비이상적이고 존재하지 않을 수 있지만, 전형적으로, 개입하는 아미노산은 폴딩되어 α－나선에 대하여 충전되는 역평행 β－주름을 형성한다. 폴딩으로 인해, 아연과 배위 결합하는 측쇄가 아연 이온과 배위결합하기에 적합한 사면체 구조를 갖도록 배치된다. 염기 접촉 잔기는 핑거의 N－말단에 위치하고 선행하는 루프 영역 내에 있다(도 2).

편의를 위해, 징크 핑거 도메인의 주요 DNA 접촉 잔기는 다음 예에 의거하여, －1, 2, 3 및 6으로 번호를 매겼다.

－1 1 2 3 4 5 6

X_a－X－C－X_2－5－C－X₃－X_a－X－C－X－S－N－X_b－X－R－H－X_3－5－H (서열번호: 68),

상기 예에 명기한대로, DNA 접촉 잔기는 시스테인(C), 세린(S), 아스파라긴 (N) 및 아르기닌(R)이다. 상기 모티프는 CSNR로 줄여서 표기할 수 있다. 본 명세서에 사용된대로, 그러한 생략 표기는 첫번째 시스테인의 두 개 앞의 잔기(위의 X_a, 서열번호: 68의 시작 잔기)로부터 금속을 잡고있는 마지막 히스티딘(서열번호: 68의 마지막 잔기)까지의 특정 폴리펩타이드 서열의 압축형이다. 두 개의 상이한 서열이 같은 모티프를 가질 때에는 각 서열을 구별하기 위해 숫자를 사용할 수 있다(예: CSNR1, CSNR2). 문맥에서 분명하게 알 수 있는 경우에 네 글자 압축형은 일반적인 모티프를 지칭한다.

징크 핑거 DNA－결합 단백질은 통상적으로 직렬로 배치된 세 개 이상의 징크 핑거 도메인으로 구성될 수 있다.

징크 핑거 도메인("ZFD")는 가장 흔한 진핵생물 DNA－결합 모티프 중 하나로서, 효모로부터 고등 식물 및 인간에 이르는 다양한 종에서 발견된다. 인간 게놈에만도 수 천가지 이상, 아마도 4,500가지 이상의, 징크 핑거 도메인이 존재할 것으로 추측된다. 징크 핑거 도메인은 징크 핑거 단백질에서 동정되거나 그로부터 단리될 수 있다. 징크 핑거 단백질의 비제한적인 예로는 CF2－II; 크룹펠(Kruppel); WT1; 바소누클린(basonuclin); BCL－6/LAZ－3, 적혈구 크룹펠－유사 전사 인자; 전사 인자 Sp1, Sp2, Sp3 및 Sp4; 전사 억제제 YY1; EGR1/Krox24; EGR2/Krox20; EGR3/Pilot; EGR4/AT133; Evi－1; GLI1; GLI2; GLI3; HIV－EP1/ZNF40; HIV－EP2; KR1; ZfX; ZfY; 및 ZNF7 등이 있다.

하기 전산화 방법을 사용하여 서열이 밝혀진 게놈 중에 또는 핵산 데이터베이스 중에 코딩된 모든 징크 핑거 도메인을 동정할 수 있다. 임의의 그러한 징크핑거 도메인을 이용할 수 있다. 또한, 인위적인 징크 핑거 도메인이 예를 들어 전산화 방법에 의해 디자인되었다(예: Dahiyat and Mayo, (1997)Science278:82－7).

많은 징크 핑거 도메인이 DNA 부위에 결합하지만, 몇몇 징크 핑거 도메인은 RNA 사이트 및 다른 단백질과 같은 다른 리간드에 결합할 수 있다. 어떤 실시태양에서는, 키메라 징크 핑거 단백질이 표적 단백질 또는 표적 RNA 부위와 같은 비－DNA 리간드에 결합하도록 만들어진다. 표적 RNA 부위는 천연의 ncRNA와 같은 ncRNA상의 부위일 수 있다.

호메오도메인.호메오도메인은 DNA의 부된(minor) 그루브(groove)와 접촉하는 N－말단 가지 및 뒤이어 오는 주된(major) 그루브와 접촉하는 3 개의 α－나선으로 구성된 단순한 진핵생물 도메인이다(예를 들어, Laughon, (1991)Biochemistry30: 11357－67 참고). 세 번째 α－나선은 주된 그루브에 위치하며 결정적인 DNA－접촉 측쇄를 함유한다. 호메오도메인은 세 번째 α－나선에 이르는 전환점(turn)에 존재하는 고도로 보존된 특징적인 모티프를 가진다. 이 모티프는 도메인의 소수성 코어 내로 충전되는 불변 트립토판을 포함한다. 이 모티프는 프로사이트(Prosite) 데이터베이스 (Falquet 등 (2002)Nucleic Acids Res.30:235－238 참조)에 PDOC00027([L/I/V/M/F/Y/G]－[A/S/L/V/R]－X(2)－[L/I/V/M/S/T/A/C/N]－X－[L/I/V/M]－X(4)－[L/I/V]－[R/K/N/Q/E/S/T/A/I/Y]－[L/I/V/F/S/T/N/K/H]－W－[F/Y/V/C]－X－[N/D/Q/T/A/H]－X(5)－[R/K/N/A/I/M/W]; 서열번호: 77)로서 공지되어 있다. 호메오도메인은 세포 동일성을 결정하고 유기체의 발생 과정에서 위치적인 정보를 제공하는 전사 인자에서 흔히 발견된다. 그러한 고전적인 호메오도메인은, 게놈 상에 무리(cluster)지어 존재하는데, 무리 중의 호메오도메인의 순서는 바디축(body axis)을 따라 그들의 발현 패턴에 근사적으로 상응한다. 호메오도메인은 예를 들어 Hox－1과 같은 호메오도메인과의 정렬에 의해, 또는 호메오도메인 프로필 또는 호메오도메인 히든 마르코프 모델(hidden Markov Model; HMM; 하기 참조), 예를 들어 Pfam 데이터베이스의 PF00046 또는 SMART 데이터베이스의 "HOX"와의 정렬에 의해, 또는 상기한 프로사이트 모티프 PDOC00027에 의해 동정될 수 있다.

헬릭스－턴－헬릭스 단백질.이 DNA 결합 모티프는 많은 원핵 생물 전사 인자 중에서 흔히 발견된다. 예를 들어 LacI 족, AraC 족 등 많은 아족이 있다. 명칭에서 두 개의 헬릭스는 DNA의 주된 그루브에 대해 충전되고 두 번째 α－나선을 DNA의 주된 그루브 내로 배치하는 첫 번째 α－나선 및 상기 두 번째 알파 헬릭스를 말한다. 이들 도메인은 HMM, 예를 들어 SMART 데이터베이스에서 얻을 수 있는 HTH_ARAC, HTH_ARSR, HTH_ASNC, HTH_CRP, HTH_DEOR, HTH_DTXR, HTH_GNTR, HTH_ICLR, HTH_LACI, HTH_LUXR, HTH_MARR, HTH_MERR 및 HTH_XRE 프로필과의 정렬에 의해 동정될 수 있다.

라이브러리 제작: 구조 도메인의 동정

다양한 방법을 사용하여 구조 도메인을 동정할 수 있다. 동정된 도메인을 코딩하는 핵산은 핵산 라이브러리 제작에 사용된다. 또한, 이러한 도메인을 코딩하는핵산은 라이브러리에 의해 코딩되는 추가 도메인을 제공하기위해 다양화(예: 돌연변이)할 수 있다.

전산화 방법(Computational Method).본 명세서에 기술된 방법에 의해 단리된 DNA 결합 도메인의 아미노산 서열을 공지 서열의 데이터베이스, 예를 들어 단백질 서열의 주석을 단 데이터베이스 또는 핵산 결합 도메인에 대한 기입을 포함하는 주석을 단 데이터베이스와 비교할 수 있다. 또 다른 실시태양에서는, 비특성화된 서열, 예를 들어 주석을 달지 않은 게놈 서열, EST 또는 전장 cDNA 서열의 데이터베이스; 특성화된 서열의 데이터베이스, 예를 들어 SwissProt 또는 PDB; 및 도메인의 데이터베이스, 예를 들어 Pfam, ProDom (Corpet 등 (2000)Nucleic Acids Res.28:267－269), 및 SMART (Simple Modular Architecture Research Tool, Letunic 등 (2002)Nucleic Acids Res30, 242－244)가 핵산 결합 도메인 서열의 공급원(source)을 제공할 수 있다. 의문 아미노산 서열과 비교하기 위해, 핵산 서열 데이터베이스를 모든 6개의 해독 프레임(reading frame)으로 번역할 수 있다. 후보 핵산 결합 도메인을 코딩하는 것으로 표식된 핵산 서열을 적합한 핵산 공급원, 예를 들어 게놈 DNA 또는 세포 RNA로부터 증폭할 수 있다. 그러한 핵산 서열을 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 컴퓨터에 기초한 도메인 동정의 상기 과정을 올리고뉴클레오티드 합성기 및 로보트 시스템과 연계시켜 높은 작업처리량으로 도메인을 코딩하는 핵산을 생산할 수 있다. 후보 도메인을 코딩하는 클로닝된 핵산을 숙주 발현 벡터에 저장하고 제한 효소－매개 서브클로닝 또는 부위－특이적 재조합효소－매개 서브클로닝(미국 특허 제5,888,732호 참조)에 의해 Zif268 핑거 1 및 2와함께 발현 벡터, 예를 들어 번역 융합 벡터에 쉽게 도입시킬 수 있다. 높은 작업 처리량으로, 상이한 후보 핵산 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 함유하는 다수의 마이크로타이터 플레이트를 생성할 수 있다.

출발 서열 또는 프로필로부터 도메인을 동정하는 상세한 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어 프로사이트((Hofmann 등, (1999)Nucleic Acids Res.27:215－219) 참조), FASTA, BLAST((Altschul 등, (1990)J. Mol. Biol.215:403－10) 참조) 등 참조. 간단한 스트링 검색을 수행하여 의문 서열 또는 의문 프로필에 대한 동일성을 가지는 아미노산 서열을 찾을 수 있으며, 예를 들어 Perl을 사용하여 텍스트 파일을 스캐닝할 수 있다. 이렇게 동정된 서열은 초기 입력 서열에 대해 약 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 그 이상의 동일성을 나타낼 수 있다.

의문 도메인과 유사한 도메인을 공용 데이터베이스, 예를 들어 문헌 (Altschul 등, (1990)J. Mol. Biol.215:403－10)의 XBLAST 프로그램(버젼 2.0)을 사용하여 동정할 수 있다. 예를 들어, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3의 XBLAST 변수를 사용하여 BLAST 단백질 검색을 수행할 수 있다. 문헌(Altschul 등, (1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389－3402)에 기술된 바와 같이 의문 서열 또는 검색된 서열에 간격을 도입할 수 있다. XBLAST 및 Gapped BLAST 프로그램에 대한 디폴트 변수는 미국 메릴랜드주 베데스다에 있는 국립보건원내의 국립생물공학정보센타(NCBI)에서 구할 수 있다.

프로사이트 프로필 PS00028 및 PS50157을 사용하여 징크 핑거 도메인을 동정할 수 있다. 80,000개 단백질 서열의 SWISSPROT 방출 중, 이들 프로필은 각각 3189 및 2316 개의 징크 핑거 도메인을 검색하였다. 다양한 상이한 기법을 사용하여 관련 단백질의 다중 서열 정렬로부터 프로필을 구축할 수 있다. 그리브스코프(Gribskov) 및 그의 동료들(Gribskov 등, (1990)Meth. Enzymol.183:146－159)은 심벌 비교 표를 이용하여 잔기 빈도 분포가 제공된 다중 서열 정렬을 각 부위에 대한 가중치로 전환하였다. 예를 들어 PROSITE 데이터베이스 및 문헌(Luethy 등, (1994)Protein Sci.3:139－1465)의 작업 참조.

관심있는 DNA 결합 도메인을 대표하는 히든 마르코프 모델(Hidden Markov Models; HMM's)은 예를 들어 Pfam 데이터베이스, 릴리스 2.1과 같은 그러한 모델의 데이터베이스로부터 생성하거나 얻을 수 있다. 추가적인 도메인을 찾기 위해 예를 들어 상기 디폴트 변수를 사용하여 HMM으로 데이터베이스를 검색할 수 있다(예: Bateman 등 (2002)Nucleic Acids Research30:276－280 참조). 또는, 사용자는 상기 변수들을 최적화시킬 수 있다. 경계 스코어(threshold score)를 선택하여 서열 데이터베이스를 여과함으로써 경계 이상의 스코어를 가지는 서열이 후보 도메인으로서 표시되도록 할 수 있다. Pfam 데이터베이스의 설명은 문헌(Sonhammer 등, (1997)Proteins28(3):405－420)에서 찾을 수 있으며, HMM에 관한 상세한 설명은 예를 들어 문헌(Gribskov 등, (1990)Meth. Enzymol.183:146－159; Gribskov et al,. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:4355－4358; Krogh 등, (1994)J. Mol. Biol.235:1501－1531; 및 Stultz 등, (1993)Protein Sci.2:305－314)에서 찾을 수 있다.

HMM의 SMART 데이터베이스(Simple Modular Architecture Research Tool, Schultz 등, (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA95:5857; 및 Schultz 등, (2000)Nucl. Acids Res28:231)는, HMMer2 검색 프로그램(Durbin 등, (1998)Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press.)의 히든 마르코프 모델로 프로필함으로써 동정된 징크 핑거 도메인의 카탈로그(ZnF_C2H2; ZnF_C2C2; ZnF_C2HC; ZnF_C3H1; ZnF_C4; ZnF_CHCC; ZnF_GATA; 및 ZnF_NFX)를 제공한다.

혼성화에 기초한 방법.다양한 형태의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 핵산의 집합을 분석하여 아미노 말단 및 카르복시 말단의 보존된 경계부 서열을 코딩하는 서열 프로필을 얻을 수 있다. 그러한 보존된 경계부 서열을 코딩하는 서열에 혼성화할 수 있는 축중 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. 또한, 그러한 축중 올리고뉴클레오티드의 유효성은 그들의 조성과 공지된 게놈 서열 상의 가능한 어닐링 부위의 빈도를 비교함으로써 평가될 수 있다. 다수 반복된 디자인에 의해 축중 올리고뉴클레오티드를 최적화할 수 있다. 예를 들어, 공지의 Cys₂－His₂징크 핑거들을 비교함으로써 천연형 서열 중의 인접 핑거들 사이의 링커 영역의 공통 서열을 밝혀내었다(문헌 Agata 등, (1998)Gene213:55－64 참조). 그러한 축중 올리고뉴클레오티드는 다수의 DNA 결합 도메인을 증폭시키는데 사용된다. 증폭된 도메인을 시험 징크 핑거 도메인으로서 하이브리드 핵산 중에 삽입하고, 후속적으로 본 명세서에 기술된 방법에 따라 표적 부위에 대한 결합을 분석한다.

라이브러리 제작: 3. 구조 도메인을 코딩하는 핵산

라이브러리를 구성하는데 이용되는 핵산은 다양한 방법에 의해 얻을 수 있다. 라이브러리 핵산 성분의 일부 구성원은 천연형 도메인을 코딩할 수 있다. 덧붙여, 일부 핵산 구성원은 다른 무작위적 방법 또는 돌연변이에 의해 얻어진 변이체들이다. 일반적으로 단일 도메인만을 코딩하는 구성 핵산은, 다른 도메인과의 융합체를 코딩하는 핵산을 만들어 내기 위해 서로 조합할 수 있다.

천연형 도메인의 분리.도메인의 라이브러리를 인간과 같은 진핵 생물의 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 구축할 수 있다. 이를 위해 다수의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기한 바와 같이, 이용가능한 아미노산 서열의 전산 검색으로 도메인을 동정할 수 있다. 각 도메인을 코딩하는 핵산을 단리하고, 예를 들어 프로모터, 활성화 도메인 및 선별 마커를 함유하는 벡터와 같은, 세포 내 발현에 적합한 벡터 내로 삽입할 수 있다. 또 다른 예에서, 보존된 모티프에 혼성화하는 축중 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 예를 들어 PCR에 의해 이 모티프를 함유하는 다수의 연관 도메인을 증폭시킨다. 예를 들어, 크룹펠－유사 Cys₂His₂징크 핑거를 문헌(Agata 등, (1998)Gene213:55－64)의 방법에 의해 증폭시킬 수 있다. 이 방법은 또한, 예를 들어 Thr－Gly－(Glu/Gln)－(Lys/Arg)－Pro－(Tyr/Phe)(서열번호: 78)의 패턴을 갖는 서열인, 천연형 징크 핑거 도메인 링커 펩타이드 서열을 보유한다. 또한, 비선별적 게놈 라이브러리 또는 cDNA 서열의 라이브러리를 스크리닝하는것과 달리, 관심있는 도메인에 국한된 집합을 스크리닝하는 것은, 라이브러리 복잡성이 매우 감소하고, 대규모 라이브러리를 완전히 스크리닝하는 것이 갖는 내생적인 어려움으로 인해 목적하는 서열을 놓칠 가능성을 감소시킨다.

인간 게놈은 다수의 징크 핑거 도메인을 함유하며, 이 중 다수는 특성화되지 않고 동정되지 않았다. 징크 핑거 도메인을 갖는 단백질을 코딩하는 수천 개의 유전자가 있을 것으로 추정된다(Pellegrino and Berg, (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:671－675). 이들 인간 징크 핑거 도메인은, 신규한 DNA－결합 단백질이 구축될 수 있는 다양한 도메인의 광범위한 집합이다. 인간 징크 핑거 도메인의 많은 예는 2002년 8월 19일에 출원된 WO 01/60970, 미국 연결번호. 60/374,355, filed April 22, 2002, and U.S. Serial No. 10/223,765 에 잘 나타나 있다. 하기 표 1을 참고할 수 있다.

각 징크 핑거 도메인이 독특한 3－ 내지 4－bp 서열을 인식하는 경우, 모든 가능한 3－ 내지 4－bp 서열에 결합하는 데 필요한 도메인의 총 수는 단지 64 내지 256 (4³내지 4⁴)개이다. 인간 게놈의 천연형 목록이 모든 가능한 인식 부위를 특이적으로 인식할 수 있는 충분한 수의 독특한 징크 핑거 도메인을 함유할 수 있다. 이들 징크 핑거 도메인은 인공 키메라 DNA－결합 단백질을 구축하기 위한 귀중한 공급원이다. 핵산 라이브러리는 천연형 징크 핑거 단백질, 상기 도메인의 인공 돌연변이 및 이들의 조합을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.

돌연변이 도메인. 한 실시 태양에서, 라이브러리는 천연형 서열의 인공 변이인 최소 하나의 구조 도메인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 한 실시태양에서, 이같은 변이 도메인은 축중 형태의(degenerated patterned) 라이브러리로부터 구성된다. 핵산 결합 도메인의 경우, 핵산 결합면에 가깝거나 인접한 위치는 돌연변이의 표적부위가 된다. 예컨대, 돌연변이된 시험용 징크 핑거 도메인은 축중 형태의 라이브러리를 이용함으로써 임의의 돌연변이 부위에서 가능한 아미노산의 서브세트(subset)로 만들 수 있다. 축중 코돈 세트는 각 위치에 프로필을 코딩하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 코돈 세트는 단지 소수성 잔기, 지방성(aliphatic) 잔기, 또는 친수성 잔기를 코딩하고 있어 유용하다. 라이브러리는 폴딩된 폴리펩타이드를 코딩하는 전체－길이의 클론으로 선별될 수 있다. Cho 등 ((2000)J. Mol. Biol.297(2):309－19)은 축중 올리고뉴클레오티드를 이용한 이 같은 축중 라이브러리를 제공하고, 더불어 전체－길이의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산라이브러리를 선별하는 방법을 제시하였다. 이러한 핵산은 편리한 제한효소 절단부위를 이용하여 발현 벡터에 손쉽게 삽입될 수 있다.

적합한 코돈의 선별 및 주어진 위치에서 각 뉴클레오티드의 상대적 비율은 유전자 코딩을 나타내는 표의 단순한 검사 또는 전산 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 조(상기 논문) 등은 단백질 서열을 받아들이고, 그 서열을 코딩하는 선호 올리고뉴클레오티드 디자인을 산출하는 전산 프로그램을 제시하였다.

몇몇 유용한 징크 핑거 도메인에 대해 Zhang 등,(2000)J. Biol. Chem.275:33850－33860; Rebar와 Pabo (1994)Science263:671－673; Segal (1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA96:2758; Gogus 등, (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA.93:2159－2164; Drier 등, (2001)J. Biol. Chem.276: 29466－29478; Liu 등, (2001)J. Biol. Chem.276(14):11323－11334; 및 Hsu 등, (1992)Science257:1946－50를 참고한다.

라이브러리 제작: 4. 키메라징크 핑거 단백질 라이브러리

다양한 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산의 라이브러리는 실시예 1에 기술된 것처럼 연속적인 연결에 의해 형성될 수 있다. 각 핵산이 셋, 넷 또는 다섯 개 이상의 징크 핑거 도메인을 가지는 단백질을 코딩하도록 라이브러리가 제조될 수 있다. 몇몇 실시태양에서는, 특별히 큰 규모의 라이브러리를 만들기 위해 각 징크 핑거 단백질이 징크 핑거 도메인의 세트 중 어느 하나를 무작위로 포함하도록 고안될 수 있다. 징크 핑거 도메인의 세트는 예를 들어 64개의 가능한 3－염기쌍 하위 부위 중 30, 40, 50 또는 그 이상을 커버하는 범위의 특이성을 갖는 도메인들을 나타내도록 선택될 수 있다. 이 세트는 약, 12, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50개 이상의 상이한 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다. 이들 도메인의 몇몇 또는 모두는 천연형 단백질로부터 분리된 도메인일 수 있다.

하나의 예시적인 라이브러리는 각 핑거마다 3개의 징크 핑거 및 30개의 가능한 도메인을 갖는 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 완전하게 표시된 형태일 때 이 라이브러리는 30³의 결과인 27,000개의 서열을 포함한다. 이 라이브러리는 30개의 가능한 모든 도메인을 코딩하는 핵산의 풀(pool)이 각 단계에서 부가되는 연속적인 연결에 의해 제조할 수 있다. 최종 라이브러리는 풀로서 저장할 수 있다.

한 실시태양에서는, 라이브러리는 무작위의 집합으로 저장될 수 있다. 다른 실시태양에서는, 각 구성원이 분리되고, 주소화가 가능한 위치에 저장되며(예를 들어, 배열되고), 서열분석 된다. 40,000－50,000 개의 제조된 라이브러리 구성원의 고효율 서열분석(high throughput sequencing) 후에, 완전한 범위를 얻기 위해 누락된 키메라 조합을 개별적으로 조립할 수 있다. 예를 들어 마이크로타이터 플레이트 등에 일단 배열되면, 각 구성체는 추가 분석 또는 특정 응용을 위해 나중에 다시 회수할 수 있다. 원하는 표현형을 지닌 세포는 선별되고 특징화된다. 다른 예에서, 각 라이브러리 구성원은 세포에 형질전환되고, 각 세포는 특징화 된다. 즉, 핵산 미세배열분석을 이용하여 내생 유전자의 전사가 변하였는지를 결정한다(아래의 "키메라 징크 핑거 단백질의 조절 능력 프로필화" 참조).

핵산 라이브러리의 세포 내 도입

핵산 라이브러리는 다양한 방법으로 세포 내에 도입할 수 있다. 한 예로, 라이브러리는 각 핵산 라이브러리의 다중 복제를 포함하는 무작위적 풀로 저장한다. 그 풀의 일부는 세포로 형질전환 된다. 다른 실시태양에서, 개개의 라이브러리 구성원은 개별적으로 저장되고(예: 마이크로타이터 플레이트의 분리된 웰(well) 또는 배열의 분리된 주소에 저장) 개별적으로 세포에 도입된다.

다른 실시태양에서, 라이브러리 구성원은 전체 라이브러리에 비해 덜 복잡한 풀에 저장된다. 예를 들어, 각 풀은 10⁵또는 10⁶의 상이한 구성원을 가지는 라이브러리로부터 10³의 상이한 라이브러리 구성원을 포함할 수 있다. 어떤 풀이 특정 효과를 일으키는 구성원을 가지는 것으로서 동정되는 경우, 그 풀은 표현형 효과를 매개하는 개별 라이브러리 구성원을 동정하기 위해 분석될 수 있다. 이러한 접근법은, 세포사멸을 유도하는 키메라 단백질에 대한 스크리닝에서처럼, 변형된 세포의 회수가 어려울 때 유용하다.

핵산 라이브러리는 다양한 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다. 대표적인 방법은 전기천공법(미국특허 제 5,384,253 호), 입자총(유전자총) 기술(참고: 미국특허 제 5,550,318; 5,538,880; 및 5,610,042 호; 및 WO 94/09699); 리포좀－매개된 형질감염(예: LIPOFECTAMINE^TM(Invitrogen) 또는 SUPERFECT^TM(QIAGEN GmbH)을 사용; Nicolau 등,Methods Enzymol.,149:157－176, 1987.); 및 아그로박테리아－매개 형질 전환(참고: 미국특허 제 5,563,055 및 5,591,616 호). 여기서 사용된 "형질 전환"이라는 용어는, 외생 핵산을 세포로 도입하는 어떤 방법도 포함된다.

시험관 내 또는 생체 내에서 세포에 핵산 라이브러리를 도입하기 위해 바이러스 입자를 사용할 수도 있다. 한 실시태양에서, 바이러스 포장(packaging)은 라이브러리 핵산을 개체 내 세포로 도입하는 데 이용된다. 다른 실시태양에서, 라이브러리 핵산이 시험관 내에서 세포로 도입된 후 세포가 개체로 전달된다.

라이브러리 핵산의 도입 후, 라이브러리 핵산이 발현되어 라이브러리에 의해 코딩되는 키메라 단백질이 세포에 의해 생성된다. 라이브러리 핵산의 불변 영역은 발현을 가능케 하는 필수 조절 및 지지 서열을 제공할 수 있다. 그러한 서열은 전사 프로모터, 전사 종결부위, 스플라이스 부위 공여체 및 수여체(splice site donors and acceptors), 비번역 조절 부위(poly A 추가 부위), 세균 복제시작 부위(origin of replication) 및 라이브러리 핵산의 존재를 가리키거나 라이브러리 핵산의 선별에 사용되는 표지(markers)를 포함한다.

키메라 단백질을 코딩하는 핵산 라이브러리의 스크리닝

스크리닝에서, 세포 또는 개체는 변형된 표현형을 나타내는 것들을 동정하기 위해 분석된다. 이러한 과정은 관심 표현형에 따라 다르다. 가능한 표현형의 수가 막대해짐에 따라, 스크리닝의 가능한 방법도 막대해진다. 수많은 유전자 스크리닝 및 선별이, 돌연변이체 또는 특정 표현형을 나타내는 천연형 유전자의 과발현을 동정하기 위해 이루어졌다. 각 방법은 키메라 단백질을 코딩하는 유용한 핵산 라이브러리 구성원을 동정하는데 적용될 수 있다. 스크리닝은, 라이브러리 핵산을 포함하는 각 세포 또는 개체의 분석 및 선별, 즉, 생존 또는 특정 처리를 견디는 다른 특징을 나타내는 세포 또는 개체의 분석을 포함할 수 있다.

세포를 분석하는 대표적인 방법은 현미경(예: 광학, 다중 초점, 형광, 전자주사 및 투과전자), 형광 근거 세포 분류(sorting), 감별 원심분리, 감별결합, 면역분석, 효소 분석, 성장 분석, 및 생체내 분석 등을 포함한다.

일부 스크리닝은 특정 환경 조건을 포함한다. 이 조건에 대해 민감하거나 저항성이 있는 세포가 동정된다.

일부 스크리닝은 세포의 특정 양태(예: 주화성(chemotaxis), 형태 변화 또는세포사멸), 또는 개체의 특정 양태(예: 식물에 의한 주광성(phototaxis), 초파리속의 교배행동 등)를 요구한다. 한 태양에서, 세포 또는 개체는, 현미경 및 선택적으로 변형 세포를 자동적으로 검색하는 전산 프로그램을 이용하여 시각적 검사에 의해 직접적으로 분석될 수 있다. 다른 태양에서는, 세포 또는 개체는, 원하는 표현형과 관계된 분석 또는 다른 표지체(indicator)를 사용하여 분석될 수 있다.

일부 스크리닝은 세포 증식에 연관된다. 대조세포(예: 정상세포)와 다른 속도로 증식하는 세포가 동정된다. 또한, 증식 신호(예: 성장인자 또는 다른 미토겐 (mitogen))에 다르게 반응하는 세포가 동정될 수 있다. 세포는 신호에 더 또는 덜 민감할 수 있다.

세포 분화에 관련된 스크리닝이 이용될 수 있다. 스크리닝 및 키메라 징크 핑거 단백질의 사용은, 분화 및 다양한 세포의 증식 능력을 조절하기 위해 사용될 수 있는데, 세포는 사람 또는 사람이외의 ES 세포 및 체강(somatic) 줄기세포와 같은 줄기세포를 포함한다. 징크 핑거 단백질은, ES 세포를 신경모세포(neuronal progenitor cells) 또는 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells)와 같이 제한된 계열(lineage)로 직접 분화시킬 때 발견될 수 있다. 또한, 줄기세포를 한정된 세포분열－후(post－mitotic) 세포 아형으로, 예를 들면 ES 세포의 및/또는 신경 줄기 세포의 도파민성 또는 콜린성 신경으로의 직접적 분화로, 직접 분화시키는 징크 핑거 단백질에 대한 스크리닝이 가능할 것이다.

분화를 분석하는 다른 표현형 중, 표지 유전자 및 표지 단백질의 발현을 관찰하는 것이 가능하다. 상기 표지는 다음을 포함한다:

■상피세포용 FLK1(조 등, (2001)Blood98:3635－42; Nishikawa 등,Development125: 1747－1757),

■혈관 평활근 세포－특이적 평활근용 미오신 중쇄(Drab 등, (1997)FASEBJ 11:905－15)

■ 골－특이적 알칼린 포스파타제(BAP) 및 골세포용 오스티오칼시(osteocalci)(Demers 등, (2000)Cancer88:2919－26)

■백혈구용 CD4, CD8 및 CD45(Ody 등, (2000)Blood96:3988－90, Martin 등, (2000)Blood96:2511－9)

■조혈 줄기세포용 Flk－2 및 CD34(Julie 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001,Vol. 98, Issue 25, 14541－14546, Woodward & Jenkinson.Eur J Immunol2001 Nov;31(11):3329－38, George AA 등,Blood2001 Jun 15;97(12):3925－30)

■조혈 줄기세포 및 MSC 전구세포용 CFU(Frimberger 등,Exp Hematol2001 May;29(5):643－52)

■골수섬유세포용 Muc－18(CD146)(Filshie 등, (1998)Leukemia12:414－21)

■연골세포용 콜라겐 II형, 콜라겐 IV형 및 연골세포 발현 단백질－68(Carlberg 등, (2001)Differentiation67:128－38, Steck 등, (2001)Biochem J353:169－74)

■지방세포용 지방세포 지방－결합 단백질(ALBP) 및 지방산 이동물질(transporter)(Amri, 등, (1995)J. Biol. Chem. 270:2367－2371, Bastie 등, (1999)J Biol Chem274:21920－5, Frohnert 등, (1999)J. Biol. Chem.274,3970-3977, Teboul 등, (2001)Biochem. J. 360:305-312)

■신경 줄기세포용 CD133(Uchida N 등, (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA97:14720－5)

■성상세포용 GFAP(Dai 등, (2001)Genes Dev15:1913－25)

■신경용 마이크로튜블－관련 단백질－2(Roy 등, (2000)Nat Med6:2717)

항암효과, 세포사멸의 변화 및 바이러스 저항성 등의 다른 특성으로 포유류 유래 세포를 스크리닝하는 것이 가능하다. 예를 들어, 바이러스 감염 또는 바이러스 생성에 대한 저항 세포를 선별함으로써, 항－바이러스 제제에 이용될 수 있는 인공 키메라 단백질을 동정하는 것이 가능하다.

유사하게 세포 신호 경로에서의 변화도 경로의 활성 또는 불활성과 관련된 탐침(probe)를 사용하거나 경로의 활성 또는 불활성과 관련된 인식할만한 표지를 사용하여 검색할 수 있다.

어떤 스크리닝은 대사산물, 분비단백질 및 번역－후 개조 단백질 같은 관심 합성물의 생성과 관계가 있다. 예를 들면, 세포는 합성물의 증대된 생산량으로 동정될 수 있다. 다른 예에서, 세포는 바람직하지 않은 부산물 같은 합성물의 감소된 생산량으로 동정될 수 있다. 관심 세포는 반응 세포, 미세배열분석, 화학 검색 분석 및 면역분석의 사용을 포함하는 다양한 방법에 의해 동정될 수 있다.

특정 실시 태양의 더 많은 예는 다음을 포함한다:

1)단백질 수용성: 대장균에서, 많은 이종 단백질은 내포체(inclusion body)로 발현된다. 본 발명에서는 대장균에서 발현되는 인간 단백질의 용해성 분획을 증가시키는 키메라 징크 핑거 단백질을 동정하였다(실시예 12 참고). 이에 따르면, 본 발명은 발현된(예: 세포 내 과발현된) 이종 단백질의 용해도를 변화시키는(예: 증가시키는) 인공 전사 인자 또는 키메라 징크 핑거 단백질을 특징으로 한다.

2)당쇄화(Glycosylation): 항체를 포함하는 치료용 단백질은 주로 CHO 세포에서 생산된다. 그러나, 이러한 단백질은 적절한 당쇄화 양식(Glycosylation pattern)을 갖추고 있지 않다. 한 실시태양에서, B 세포에서 생산되는 항체의 특징인 당쇄화를 하나 이상(예: 모두) 포함하는 항체 같은 분비 단백질로 변형된 CHO 세포를 동정하기 위해, 키메라 단백질을 코딩하는 라이브러리가 스크리닝된다. 이에 따르면, 본 발명은 CHO 세포에 의해 분비되는 항체와 같이, CHO 세포에 의해 분비되는 단백질 같은 분비단백질의 당쇄화를 변화시키는, 인공전사인자 또는 키메라 징크 핑거 단백질을 특징으로 한다.

3)바이러스 역가(titer): 한 실시 태양에서, 세포 배양에서 바이러스 역가를 증가시키거나 감소시키는 키메라 단백질을 규명하기 위해, 키메라 단백질을 코딩하는 라이브러리가 스크리닝된다. 바이러스는 유전자 전달체 같은 전달체로 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료용 바이러스는 특정 형태의 암을 치료하기 위해 개발 중에 있다(예: 아데노바이러스). 바이러스 역가의 증대는 치료용 바이러스 제작에 유용하다. 반면, 세포 배양 및 생체 내에서의 바이러스 생산 저해는 바이러스성 질병을 치료하는데 유용하다. 이에 따르면, 본 발명은 진핵생물 또는 포유류 세포 같은 세포에서의 바이러스 생산을 변화(예: 증가 또는 감소)시키는 인공 전사 인자 또는 키메라 징크 핑거 단백질을 특징으로 한다.

4)형질전환 효율: 많은 진핵 세포주 또는 원핵 개체에서의 유전자 공학은 낮은 형질감염 또는 형질전환 효율에 의해 한계가 있다. 인공전사인자는 형질 감염 또는 전환 효율이 증대되도록 개조된 세포로 선별될 수 있다. 그 같은 인자의 선별은, 한정된 농도의 표지 또는 표지로 형질전환 후, 표지 획득한 세포의 선별로 선별가능하다. 이에 따라, 본 발명은 세포의 DNA 획득 효율 또는 DNA 획득 과정의 내성을 변화시키는 인공전사인자 또는 키메라 징크 핑거 단백질을 특징으로 한다.

5)영양 세포(Feeder Cells). 영양 세포의 생산으로 인한 것처럼, 줄기세포의 증식 또는 분화를 보조할 수 있도록 배양세포의 특징을 변화시키는 인공전사인자 또는 다른 키메라 단백질을 동정할 수 있다. 배양세포는 인간 또는 포유류 세포일 수 있다. 이러한 세포는, 동일한 환경에서 배양된 줄기세포를 줄기세포가 증식 또는 분화하도록 하는 세포를 동정하기 위해 스크리닝(예: 라이브러리 구성원 풀링) 될 수 있다. 인공전사인자는 배지로 분비되는 주요 사이토카인 및 성장인자를 활성화시킬 수 있다. 상기 배지는 줄기세포의 분화 또는 증식을 유도(예: 자가 복제 보조를 통해)하는데 이용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 배지를 조절하거나, 줄기세포의 분화 또는 증식 조절과 같은 줄기세포의 행동양식을 변화시키는 포유류 세포의 능력을 변화(예: 증가)시키는 인공전사인자 또는 키메라 징크 핑거 단백질을 특징으로 한다.

한 종류의 세포를 이용하여 인공전사인자를 스크리닝하고 다른 종류의 세포에서 인공전사인자를 발현하는 것 또한 가능하다. 이러한 과정은 일반적으로 전사인자에 의해 유도된 제1 세포에서 제2 세포로의 표현형 전이에 사용된다. 예를 들어, 본 발명자들은 광범위하게 서로 다른 두 개의 세포주에서 부분적 징크 핑거 단백질의 발현 프로필을 결정하였다; 세포주는 암세포가 아닌 인간 배아 신장 293 세포 및 인간 경부암 세포인 HeLa이다. 본 발명자들은 그 프로필이 매우 유사함을 확인하였다. 유사하게, 효모에서도 본 발명자들은 하나의 균주 내 어떤 ZEP에 의해 유도된 표현형이 서로 다른 균주로 전이될 수 있음을 확인하였다.

줄기세포

여기서 기술하는 방법은 일반적인 어떤 세포에든지 적용될 수 있으며, 또한 어떤 후생동물 개체 유래의 줄기세포에든지 그 양식의 조절에 특별히 유용하다. 줄기세포는 자가－복제(self－renewal) 능력 및 분화 가능성을 지닌 세포이다. 자가－복제는 무한대로 연장될 수 있다. 줄기세포는 고도로 분화된 자녀세포(descendants)를 생산할 수 있다(Watt 및 Hogan (2000)Science287:1427－1430). 인간 배아 줄기세포 배양에 관한 최근의 성공으로 세포에 근거한 치료를 위한 세포 근원을 제시하게 되었다. 그러나, 줄기세포의 유지, 복제 및 분화는 때에 따라 어려울 수 있다. 예를 들어, ES 세포는 시험관 내에서 무작위적으로 분화하는 경향을 나타낸다.

키메라 전사인자 라이브러리는 세포분화를 조절할 수 있는 단백질을 동정하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 제한된 유사분열－후 세포아형(defined post－mitotic cell subtype)(예를 들어, 도파민성 또는 콜린성 신경)으로 줄기 세포의 분화를 직접 유도하는 키메라전사인자를 동정할 수 있다.

자가－복제 능력을 증가시켜 분화를 저해하거나 분화의 범위 및 성격에 직접 영향을 주는 단백질이 동정 될 수 있다. 이러한 단백질은, 일반적으로 인공 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 줄기세포 또는 줄기 모세포(progenitor)에 도입하고, 그 세포의 표현형을 분석함으로써 동정될 수 있다.

줄기세포의 분화나 증식을 조절하는 방법은, 미분화 세포의 대량 공급을 제공하고, 특정 세포 형태로의 분화를 조절하는 것이 가능하게 한다. 이러한 조절은 치료 목적 또는 다른 적용(예: 형질전환동물의 발달, 시험관내 세포 배양 등)에 이용되도록 개발될 수 있다.

다른 예에서, 어떤 경우에는 배아 줄기(ES) 세포를 한정된 계열로 직접 분화시키는 키메라 전사인자를 동정할 수 있다. 따라서, ES 세포로부터 신경 모세포(neuronal progenitor) 또는 조혈 줄기세포를 생산할 수 있다. 또한, 1) 분화된 세포를 다른 분화 상태로 적응시키거나 2) 분화된 세포를 줄기세포 또는 전구 세포(pluripotent progenitor cell)를 만들어 내는 미분화 상태로 적응시키도록 유도하는 키메라 ZFP같은 키메라 단백질을 동정할 수 있다.

동정방법은 특정 표적 유전자에 대한 정보를 필요로 하지 않는다. 표적 유전자는, 예를 들면, 동정된 키메라전사인자에 의해 활성이나 발현이 변화된 유전자를 전사체 또는 단백질의 프로필로 동정하는 스크리닝 후에 동정될 수 있다. ZFP－TF에 의해 조절된 유전자 동정은 세포 분화를 이해하는데 도움이 될 것이다.

세포 산물의 생산

본 발명은, 단백질 또는 대사산물과 같은 세포 산물을 생산하는 세포의 능력을 변화시키는 인공전사인자(예: 키메라 징크 핑거 단백질)를 특징으로 한다. 세포 산물은 내생 또는 이종 단백질일 수 있다. 예를 들어, 특정 단백질(예: 특정 내생 단백질), 과발현 단백질, 이종 단백질 또는 미스－폴드(mis－folded) 단백질과 같은, 단백질을 생산하는 세포의 능력을 증가시키는 인공전사인자를 동정하는 것이 가능하다.

한 실시 태양에서, 세포는, 예를 들면, 효소적 또는 형광적으로 추적 가능한 리포터 단백질을 생산하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 한 예에서, 리포터 단백질은 대조세포에서 과발현될 때 불용성이다. 예를 들어, 세균 세포는 내포체를 감소시키는 인공전사인자에 대해 스크리닝될 수 있다. 다른 예에서, 리포터 단백질은 원핵 또는 진핵 세포에 의해 분비된다. 세포는, 더 높은 분비 산물 증가, 증대된 당쇄화, 인산화 또는 단백질 분해과정 같은 번역－후 변형에 대해 동정될 수 있다.

한 실시 태양에서, 세포는 상이한 두 개의 리포터 단백질의 활성을 변화(예: 증가 또는 감소)시키는 능력으로 동정된다. 리포터 단백질들은, 활성, 위치(예: 분비/세포질/핵내), 크기, 용해성, 등전점(isoelectric point), 중합상태, 번역－후 조절, 번역 조절 및 전사 조절(예: 상이한 서열에 의해 조절되는 리포터 단백질들을 코딩하는 유전자)로 구분될 수 있다. 본 발명은, 이러한 특징으로 구분되는 상이한 최소 두 개의 리포터 유전자를 변형시키는 인공전사인자(예: 징크 핑거 단백질)나 리포터 유전자를 선택적으로 조절하는 징크 핑거 단백질을 포함한다.

표현형 스크리닝 방법은 인공전사인자를 분리하는데 이용될 수 있으므로, 징크 핑거 단백질이 어떻게 단백질 생산의 증가를 매개하는 가를 우선적으로 알 필요는 없다. 확인될 수 있는 가능한 기작은 다음 중 하나 이상의 변형을 포함한다; 번역 기작, 전사 과정, 전사, 분비, 단백질 분해, 스트레스 저항성, 대사산물 생산과 같은 촉매 활성. 한 예에서, 인공전사인자는 대사경로에서 하나 이상의 효소 발현을 조절할 수 있으며, 이로 인해 대사산물 또는 단백질과 같은 세포 산물 생산을 증가시킬 수 있다.

반복(iterative) 고안

키메라 DNA 결합 단백질이 동정되면, 세포의 표현형을 변화시키는 능력은 여러 가지 방법에 의해 개선될 수 있다. 예를 들면 약 6 내지 200개 또는 50 내지 2000개의 구성원을 갖는 소형 라이브러리 또는 대형 라이브러리는 특별히 동정된 키메라 단백질의 최적화에 이용될 수 있다.

반복 고안의 첫 번째 대표적인 실시태양에서는, 원조 키메라 DNA 결합 단백질을 변화시키는데 돌연변이 기술이 사용될 수 있다. 이 기술은 원조 단백질의, 예를 들면 제1 라이브러리로부터 동정된 단백질의, 변이체인 구성원을 포함하는 제2 라이브러리를 제작하는데 적용된다. 이러한 기술의 예는 다음을 포함한다: 오류－유발(error－prone) PCR (Leung 등 (1989)Technique1:11－15), 재조합, 무작위 절단을 이용한 DNA 셔플링(shuffling)(Stemmer (1994)Nature389－391), Coco 등 (2001)Nature Biotech.19:354, 위치 특이적 돌연변이(Zollner 등 (1987)NuclAcids Res10:6487－6504), 카세트 돌연변이화(cassette mutagenesis)(Reidhaar－Olson (1991)Methods Enzymol.208:564－586); 축중 올리고뉴클레오티드의 삽입(Griffiths 등 (1994)EMBO J13:3245); 연속적 연결, 사전에 제조되고 배열된 라이브러리로부터 특이적 구성원의 풀(pool)화, 재조합(예: 성적 PCR 및 "DNA 셔플링^TM"(Maxygen, Inc., CA)), 또는 이러한 방법들의 조합.

한 실시 태양에서, 라이브러리는 아미노산 위치를 돌연변이 시키도록 제작된다. 예를 들어, 키메라 징크 핑거 단백질의 경우, 아미노산의 위치는 DNA 접촉 잔기에 근접할 수는 있으나, DNA 접촉 잔기 그 자체는 아니다. 다른 실시 태양에서, 라이브러리는 키메라 단백질 내 각각 코딩된 도메인들이 다양하지만, 키메라 DNA 결합 단백질이 동정되는 초기 라이브러리보다는 한층 제한된다. 키메라 징크 핑거 도메인에서는, 특정 도메인을 코딩하는 핵산은 원조 키메라 단백질에 존재하는 도메인의 특이성과 유사한 특이성을 가진다고 알려진 다른 징크 핑거 단백질들간에 다양하게 변할 수 있다.

일부 기술은, 일부 기능적 특성을 나타내는 최소 두 개의 키메라 DNA 결합 단백질 도메인을 코딩하는 핵산으로부터, 새로운 키메라 DNA 결합 단백질을 만들어 내는 것을 포함한다. 이러한 DNA 셔플링 및 기본 도메인 교환(swapping) 등의 기술은 새로운 도메인 조합을 만들어 낸다. 미국특허번호 제 6,291,242 호 참고. DNA 셔플링은 도메인 교환뿐 아니라 점 돌연변이(point mutation)를 도입할 수 있다. 셔플링 반응은 원하는 표현형을 유도하는 키메라 단백질 코딩 핵산 서열로부터 시작될 수 있다. 핵산은 셔플링된다. 제2 라이브러리는 셔플링 산물로부터 만들어지고, 유사하거나 또는 강화된 조건하에서 원하는 형질을 유도하는 구성원에 대해 스크리닝된다. 만약 초기 라이브러리가 모든 가능한 도메인 조합이 스크리닝되는 것처럼 광범위하다면, 동일한 초기 라이브러리에서 분리된 도메인의 DNA 셔플링은 쓸모없을 수 있다. DNA 셔플링은 범위(coverage)가 광범위한 경우 또는 광범위한 스크리닝이 합리적이지 않은 경우에 유용할 수 있다.

반복 고안의 제2 실시태양에서는, 원하는 표현형을 생성하는 키메라 DNA 결합단백질이 각 도메인의 다양화로 변화될 수 있다. 도메인은, 한번에 하나씩 또는 한번에 하나 이상으로, 순차적으로 변화될 수 있다.

다음의 예는 세 개의 징크 핑거 도메인: 핑거 I,Ⅱ 및 Ⅲ을 포함하고 원하는 표현형을 생산하는 원조 키메라 단백질을 의미한다. 제2 라이브러리는 그의 각 핵산 구성원이 초기에 동정된 단백질과 동일한 핑거 II 및 핑거 III을 코딩하도록 제작된다. 그러나, 라이브러리는 원조 단백질의 핑거 I과 다른, 핑거 I의 핵산 구성원을 포함한다. 다른 점은 코딩된 키메라 단백질의 아미노산 서열을 변화시키는 단일 뉴클레오티드이거나 더 근본적일 수 있다. 제2 라이브러리는 핑거 I의 염기－접촉 잔기가 다양한 형태로 제작되거나, 핑거 I의 염기－접촉 잔기는 변함없으나 인접잔기가 다양화될 수 있다. 제2 라이브러리는 또한 최소 20, 30, 40 또는 60개의 상이한 트리뉴클레오티드 위치를 인식하는, 충분한 수의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다.

제2 라이브러리는 세포 또는 개체의 표현형을 변화시키는 성분을 동정하도록스크리닝된다. 변화의 범위는 원조 단백질에 의한 것과 유사하거나 또는 더 넓을 수 있다.

동시에 또는 연속적으로, 제3 라이브러리는 핑거 II가 다양하게 제작될 수 있고, 제 4 라이브러리는 핑거 III가 다양하도록 제작될 수 있다. 만약 키메라 단백질 또는 이미 동정된 변이체가 충분하다면, 키메라 단백질을 더 향상시키기 위해 모든 도메인을 다양화할 필요는 없다. 다른 경우에는, 각 도메인을 재－최적화하는 것이 필요하다.

만약 동시에 다른 도메인들이 다양화된다면, 특정 라이브러리에서 향상된 변이체는 다른 라이브러리를 제작하기 위해 서로 재조합될 수 있다. 이러한 라이브러리도 유사하게 스크리닝된다.

반복 고안의 세번째 실시태양에서는, 이 방법이 징크 핑거 도메인 또는 조절도메인 같은 도메인을 삽입, 치환 또는 결실하는 것을 포함한다. 삽입된 징크 핑거 도메인은 키메라 단백질의 특이성을 증가시키거나 그 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 특정 경우에는, 결합 친화도의 증가가 키메라 단백질을 만들어내는 표현형을 강화하기도 한다. 제2 활성화 도메인 또는 보조인자를 유도하는 도메인과 같은, 삽입 조절 도메인은 키메라 단백질이 만들어내는 표현형을 강화하기도 한다. 결실은 키메라 단백질의 활성의 특이성을 강화하거나 넓히며, 이는 삭제된 도메인의 기여도 등에 따른다.

반복 고안의 네번째 실시 태양에서, 이 방법은 원조 키메라 단백질과 제2 키메라 DNA 결합 단백질을 세포에서 코－발현하는 것을 포함한다. 제2 키메라 단백질은 상이한 키메라를 코딩하는 핵산 라이브러리를 스크리닝하여 동정될 수 있다. 한 실시태양에서, 제2 키메라 단백질은 원조 키메라 단백질을 발현하는 세포에서 라이브러리를 스크리닝하여 동정된다. 다른 실시 태양에서, 제2 키메라 단백질은 독립적으로 동정된다.

키메라 징크 핑거 단백질의 조절 특성의 프로파일링(profiling)

키메라 징크 핑거 단백질의 특성을 확인하여 이 단백질이 포유류 세포와 같은 세포의 내재 유전자를 조절할 수 있는지를 결정할 수 있다. 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 우선 억제 또는 활성화 도메인에 연결한 후, 대상 세포 내로 도입할 수 있다. 적당한 배양 및 코딩 핵산의 발현 유도 후, 세포로부터 mRNA를 추출하고 핵산 미세배열분석을 통해 분석한다.

핵산 미세배열분석은 예를 들어 포토리토그래픽 방법(예: 미국 특허 제5,510,270호 참조), 기계적 방법(예: 미국 특허 제5,384,261호에 기재된 직접 흐름 (directed flow) 방법) 또는 핀 기반(pin based) 방법(미국 특허 제5,288,514호에 기재됨) 등의 다양한 방법에 의해 제작될 수 있다. 이 분석은 발현된 특정 유전자에 대한 핵산을 검출하기에 적합한 특별한 캡쳐 프로브(capture probe)를 각 주소에 갖도록 제작된다.

mRNA는 예를 들어 문헌(Current Protocols in Molecular BiologyJohn Wiley & Sons, N.Y)에 기술된대로 DNase를 처리하며 게놈 DNA를 제거하고, 올리고－dT를 붙인 고체 기질에 혼성화하는 것을 포함하는 일반적인 방법으로 분리할 수 있다.기질을 세척한 다음, mRNA를 용출시킨다. 분리된 mRNA를 미국 특허 제4,683,202호에 기재된대로 rtPCR 등에 의해 역전사시키고 임의로 증식시킨다. 증식 또는 역전사과정 동안 표지된 뉴클레오타이드의 삽입에 의해 핵산을 표지시킬 수 있다. 바람직한 표지의 예는 적색 형광염료 Cy5(Amersham) 또는 녹색 형광염료 Cy3(Amersham)과 같은 형광 표지를 포함한다. 한편, 핵산을 바이오틴으로 표지하고, 스트렙타비딘－파이코에리트린(Molecular Probes) 등의 표지된 스트렙타비딘과의 혼성화로 검출할 수 있다.

이어서 표지된 핵산을 배열에 접촉시킬 수 있다. 추가로, 대조 핵산 또는 참고 핵산을 동일한 배열에 접촉시킬 수 있다. 대조 핵산 또는 참고 핵산을 표본 핵산의 표지와는 다른 표지, 예를 들어 상이한 최대 방출(emission) 파장을 가진 표지로 표지할 수 있다. 표지된 핵산을 혼성화 조건에서 배열과 접촉시킨다. 배열을 세척한 후, 배열의 각 주소에서 형광을 검출하기 위해 영상화한다.

프로필을 만들고 평가하는 일반적 방법은 배열의 각 주소에서 혼성화를 검출하는 것을 포함한다. 각 주소의 혼성화 정도는 숫자로 표시하여 벡터, 일차원 매트릭스, 또는 일차원 배열에 저장한다. 벡터 x는 배열의 각 주소에 대한 값을 갖는다. 예를 들면, 특정 주소에서 혼성화 정도에 대한 수치는 x_a라는 변수로 저장된다. 이 수치는 각 지역의 배경 수준, 표본량 및 다른 변이조건에 맞춰 조정될 수 있다. 대조 표본으로부터 핵산을 역시 준비하고, 동일하거나 상이한 배열에 혼성화시킬 수 있다. 벡터 y는 벡터 x와 동일하도록 만든다. 예를 들어, 두 벡터의함수인 수학식을 사용하여 표본 발현 프로필을 대조 프로필과 비교할 수 있다. 이 비교는 두 프로필의 유사성을 나타내는 점수등의 스칼라(scalar) 값으로 평가할 수 있다. 배열에 의해 검출되는 상이한 유전자들에 가중치를 부가하기 위해 상기 벡터들 중 어느 하나 또는 모두는 매트릭스에 의해 변환될 수 있다.

발현 데이터는 데이터베이스, 예를 들어 SQL 데이터베이스(예: 오라클(Oracle) 또는 사이베이스(Sybase) 데이터베이스 환경)와 같은 연관 데이터베이스에 저장될 수 있다. 데이터베이스는 여러 개의 표를 가질 수 있다. 예를 들어, 처리되지 않은(raw) 발현 데이터를, 각 세로줄은 분석되는 유전자(예: 주소 또는 배열)에 해당하고, 각 가로줄은 표본에 해당하는 하나의 표에 저장할 수 있다. 별도의 표는 식별자, 및 사용한 배열의 뱃치(batch) 숫자, 날짜 및 다른 품질 관리 정보 등의 표본 정보를 저장할 수 있다.

유사하게 조절되는 유전자들은 함께 조절되는 유전자들을 동정하기 위해 발현 데이터를 클러스터화(clustering) 함으로써 동정할 수 있다. 이러한 클러스터는 키메라 징크 핑거 단백질에 의해 동등으로 조절되는 유전자 세트를 표시한다. 유전자는 위계적 클러스터화(hierarchical clustering) (예: Sokal and Michener (1958)Univ. Kans. Sci. Bull.38:1409 참조), 베이시언 클러스터화(Bayesian clustering), 카파 평균 클러스터화(k－means clustering), 및 자체조직 지도(self－organizing maps) (Tamayoet al.(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA96:2907 참조)를 사용하여 클러스터화될 수 있다.

표본 발현 프로필의 대조 발현 프로필(예: 대조 세포)과의 유사성은 예를 들어 표본 발현 수준의 로그를 프리딕터(predictor) 또는 대조 발현 값의 로그와 비교하고, 이 비교 결과를 프로필 내의 예시값의 모든 유전자에 대한 중요도에 의해 조정함으로써 결정될 수 있다.

또한, 활성화된 키메라 단백질을 가지고 있는 세포 내에서 분석될 수 있다. 대표적인 단백질 프로파일링 방법의 하나로 개별 단백질의 종류를 특정화시키는 2－D 겔 전기영동(gel electrophoresis) 및 질량 분광법(mass spectroscopy)이 포함된다. 2－D 겔 상의 개별 "점"들은 가수분해된 후 질량 분광기에서 분석된다. 이 방법은 단백질 구성요소 및, 많은 경우의, 번역 단계의 변형을 모두 알아낼 수 있다.

단백질 및 핵산의 프로파일링 방법은 키메라 단백질의 특성에 관한 정보뿐 아니라 세포 내 작동되는 자연 기작에 관한 정보도 제공할 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질의 발현에 의해 증가된 단백질 또는 핵산은, 키메라 단백질의 발현에 의해 일어나는 표현형 변화에 대해 자연적 작용체(effector)일 수 있다.

추가적으로, 다른 방법을 사용하여 인공 키메라 단백질에 의해 직접 또는 간접적으로 조절되는 표적 유전자 및 단백질을 동정할 수 있다. 한 가지 예로서, 인공 키메라 단백질이 표현형질에 미치는 효과를 상쇄(예: 억제)시키는 변화들을 들 수 있다. 이러한 변화들은 염색체 유전자 내 돌연변이 및 특정 유전자의 과발현과 같은 유전적 변화뿐 아니라 RNA 간섭(예: 이중－가닥 RNA에 의한)과 같은 다른 변화도 포함한다.

하나의 특정 사례로, 병원성 세균 또는 곰팡이 같은 세포 내에서 조건적으로발현될 때 성장 결함 또는 치사를 일으키는 키메라 ZFP를 분리한다. 이러한 ZFP는, ZFP를 코딩하는 핵산을 포함하는 ZFP 라이브러리를 가진 세포의 형질전환에 의해 동정될 수 있으며, 핵산의 발현은 유도성 프로모터에 의해 조절된다. 형질전환체는 유도성 및 비－유도성 배지에서 배양된 후, 유도성 및 비－유도성 플레이트 위에 복제되었다. 비－유도성 플레이트에서 정상적으로 성장하지만 유도성 플레이트 위에서는 증식결함을 나타내는 콜로니들이 관찰되었고, 이들은 "조건적 치사" 또는 "조건적 증식결함" 콜로니들로 동정되었다.

(a) cDNA 라이브러리를 이용한 표적유전자 동정

cDNA 발현 라이브러리는 위에 설명한 "조건적 치사" 또는 "조건적 증식결함" 균주로 형질전환된다. 형질전환체들은 유도성 플레이트에 도포되었다. 결함을 일으키는 ZFP의 존재 및 발현에도 불구하고 생존하는 콜로니들을 분리하였다. 결함형질을 보완하는 cDNA들의 서열을 분석하였다. 이 cDNA들은, 결함형질에 매개하는 키메라 ZFP에 의해 조절되는 표적 유전자의 직접적 또는 간접적 전사체일 수 있다.

(b) 제2 ZFP 라이브러리를 이용한 표적 유전자 확인

제1 키메라 단백질의 효과를 억제하는 제2 키메라 단백질이 동정된다. 제2 키메라 단백질의 표적 유전자는(제1 키메라 단백질의 존재 또는 부재 시) 동정된다.

예로서, ZFP 라이브러리는 (결함을 일으키는 제1 키메라 ZFP를 포함하는) "조건적 치사"또는 "조건적 성장결함"로 형질전환된다. 형질전환체들은 유도성 플레이트에 도포되었다. 도입된 ZFP의 발현에 의해 생존할 수 있는 콜로니들은 "억제된 균주"로 동정된다. 제2 ZFP의 표적 유전자들은 DNA 미세배열분석에 의하여 분석되었다. 비교분석은 다음 4개의 균주사이에서 수행될 수 있다: 1) ZFP 없는 균주; 2) 제1 ZFP만 가지는 균주; 3) 제2 ZFP만 가지는 균주; 4) 제1 및 제2 ZFP를 모두 가지는 균주. 예로서, 제1 및 제2 키메라 ZFP에 의해 반대 방향으로 조절되는 유전자들이 성장－결함 표현형에 매개하는 표적 유전자의 후보가 된다. 이 방법은 단지 증식결함 뿐 아니라 어떠한 표현형질에도 적용될 수 있다.

(c) 발현 프로필 분석에 의하여 동정된 코－조절(co－regulated) 유전자

키메라 ZFP의 표적 후보는 발현 프로파일링(expression profiling)에 의해 동정될 수 있다. 단계적으로, 키메라 ZFP의 표현형에 매개하는 표적 후보를 결정하기 위해, 표적 후보를 개별적으로 과발현 또는 억제(예: 유전자 결실 또는 RNA 간섭) 시킬 수 있다. 추가적으로, 이 분석법을 다중 표적 후보들에 대하여 적용할 수 있다. 이는 적어도 몇몇 경우에, 하나 이상의 후보가 표현형을 나타내는 것을 방해할 필요가 있기 때문이다. 이러한 접근법의 한 예가 실시예 3(케토코나졸 저항성)에 나타나 있다.

(d) 시간－추이 분석 (Time－Course Analysis)

키메라 ZFP의 표적은 세포를 키메라 ZFP에 노출시킨 후 경과 시간에 따른 유전자 발현의 특징적인 변화를 분석하여 동정할 수 있다. 예를 들어, 키메라 ZFP를 코딩하는 유전자는 유도 프로모터에 연결될 수 있다. 대표적인 유도 프로모터는 독시사이클린 (doxycycline) 같은 작은 분자(small molecule)에 의하여 조절된다. 키메라 ZFP를 코딩하는 유전자는 세포에 도입된다. mRNA 시료들은 유도 프로모터의 의한 유도 후 다양한 시간에 세포로부터 얻어진다. 예를 들어, 도 13에서는 ZFP F104－p65의 유도 과정에서 활성화 되거나 억제된 유전자들을 나타낸다.

(e) 단백질 도입과 cDNA 미세배열 기술을 사용한, 포유류 세포들에서의 ZFP－TF의 일차 표적유전자의 동정

키메라 단백질을 전이(transduction)에 의해 세포내로 전달하는 것 또한 가능하다. 단백질은 세포 외부 조건으로 공급되고, 세포는 그 단백질을 자신에게 전이시킨다. 이 접근은 외생 핵산의 융합(integration), 전파(propagation) 등에 대한 염려를 제거할 것이다. 단백질의 양은 정확하게 조절될 수 있다. 하나의 태양에서, 키메라 ZFP는 Tat 또는 VP22의 단백질 전이 도메인에 융합(fusion)된다.

배양세포에 전이된 키메라 단백질의 효능을 분석하기 위해, 키메라 단백질은, 예를 들면 단백질 전이 도메인과의 융합과 같이, 배양 배지에 첨가된다. 조절된 표적유전자들의 검색은 사이클로헥사마이드(cycloheximide)와 같은 단백질 합성 저해제의 첨가로 향상될 수 있다. 따라서, 일차 표적 유전자들의 번역이 차단되고, 그 일차 표적 유전자들에 의해 코딩된 단백질들에 의해 조절되는 유전자들이 검색된다. 일차 표적 유전자들의 동정은 DNA 미세배열분석에 의해 발견될 수 있다.

일차 표적 유전자를 동정하기 위한 사이클로헥사마이드의 사용은 키메라 단백질이 세포 내 이종 핵산에 의해 코딩된 경우에도 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 이종 핵산의 발현은 30, 20, 15, 10 또는 5분 이내에 유도될 수 있으며, 이때 사이클로헥시미드가 첨가될 수 있다.

(f) 활성 분석

잠재 표적유전자의 기능은, 예를 들어 이중가닥 RNA(double－stranded RNAs (dsRNA)에 의한 RNA 간섭(RNAi), 안티센스(anti－sense) 기술, 라이보자임 (Ribozyme), 또는 표적유전자의 돌연변이에 의해, 표적유전자의 활성을 억제함으로써 분석할 수 있다. 표적유전자의 활성이 감소된 세포 또는 개체는 RNAi를 처리하지 않은 대조군 세포 또는 개체와 비교하고 분석될 수 있다. 또 다른 예로서, 표적유전자를 조절할 것으로 여겨지는 인공 징크 핑거 단백질을 발현하는 세포 또는 개체에 RNAi가 처리된다. 한 표현형질을 유도하는 인공 징크 핑거 단백질의 효능은 RNAi 존재 또는 부재 조건에서 분석될 수 있다. 어떤 경우에는, 만일 잠재적 표적 유전자가 실제로 결정적 표적이라면, RNAi 처리가 잠재 표적을 불활성화 시키는 것은 인공 징크 핑거 단백질에 의한 표현형질을 약화시킬 수 있다.

dsRNA는, 예를 들어, 카세트(cassette)의 양방향에 T7 프로모터를 포함시켜 하나의 카셋트를 양쪽 방향으로부터 전사하여 제조할 수 있다. 카셋트 내 삽입체(insert)는 잠재적 표적 유전자의 상보적인 서열을 포함하도록 선택된다[HiScribe™ RNAi 전사 키트(New England Biolabs, MA) 및 Fire, A.(1999)Trends Genet.15, 358-363 를 또한 참고]. dsRNA는 더 작은 절편으로 분해될 수 있다. [예를 들면, 미국특허 출원번호 제2002－0086356 호를 예시로 참고]. dsRNA는 포유류 세포에서 유전자 발현을 불활성화시키는 데 사용될 수 있다[Clemens, 등 (2000)Proc. Natl. Sci. USA97, 6499-6503; Billy, E. 등 (2001)Proc. Natl. Sci. USA98, 14428-14433; Elbashir 등 (2001)Nature. 411(6836):494－8; Yang, D. 등 (2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA99, 9942-9947 참고].

표적 DNA 부위의 확인

키메라 DNA 결합 단백질들과 관련하여, 관심 표현형을 만들어내는 키메라 DNA 결합 단백질의 표적 부위를 결정하기 위해 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 표적 부위를 찾기 위해, 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다.

하나의 태양에서, 발현 프로필로 인한 정보는 키메라 징크 핑거 단백질에 의해 인식되는 표적부위를 동정하는데 사용된다. 키메라 징크 핑거 단백질에 의해 공동－조절되는(co－regulated) 유전자들의 조절영역(regulatory region)들은, 모든 또는 대부분의 조절 영역들 내에 공통적으로 존재하는 모티프를 동정하기 위해 비교된다.

다른 태양에서, 생화학적 방법이 키메라 징크 핑거 단백질에 의해 결합되는 DNA 부위를 결정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 크로마틴 면역－침강(Chromatin immuno－precipitation) 실험들은 키메라 징크 핑거 단백질이 결합된 핵산을 분리하는데 사용될 수 있다. 분리된 핵산은 PCR 방법으로 증폭되고 서열이 분석된다. Gogus 등 (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:2159－2164 의 예를 볼 수 있다. 다른 예로써, SELEX 방법을 사용할 수 있다. 나아가, 개별 키메라 징크 핑거 단백질 의 결합 특이성에 대한 정보는 표적 부위를 예측하는데 이용될 수 있다. 그 예측은 증명되거나 다른 결과들(예: 크로마틴 면역 침전, 모의(in－silico) 코－조절된 유전자 분석 및 SELEX로 부터의 결과)을 해석하는 지표로 사용될 수 있다.

또 다른 태양에서, 잠재적 표적 부위는 각각의 징크 핑거 구성요소의 결합 특이성에 관한 정보에 의거하여 추론된다. 예로써, 도 10A 및 10B에서 보여주듯, N－말단 내지 C－말단에서 징크 핑거 도메인들을 포함하는 키메라: CSNR, RSNR 및 QSNR은 표적 부위 5'－GAAGAGGACC－3'(서열번호: 130)을 인식할 것으로 예상된다. CSNR, RSNR 및 QSNR 도메인은 각각 GAC, GAG 및 GAA에 DNA 결합 특이성을 갖는다. 예상 표적 부위는, C－말단에서 N－말단으로의 순서로 도메인들을 고려하고, 그들의 인식 특이성을 연결하여 5'에서 3' 방향으로 한가닥의 표적부위를 얻음으로써 형성한다.

비록 대부분의 경우에 키메라 징크 핑거 단백질들이 전사조절자의 기능을 할 것이나, 어떤 경우에는 키메라 징크 핑거 단백질이 RNA 또는 단백질 표적에 결합하여 그들의 표현형 효과를 매개한다. 어떤 천연형 징크 핑거 단백질은 실제로 이러한 고분자에 결합한다.

키메라 전사인자의 추가적 특징

키메라 핵산 결합 도메인을 코딩하는 라이브러리와 관련하여, 코딩된 폴리펩타이드들은 다음의 하나 이상의 특징을 포함할 수 있다. 이러한 특징들은 그 라이브러리의 모든 구성원 중 불변하거나 다양할 수 있다. 하나의 예로, 어떤 핵산들은 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드들을 코딩하고, 다른 것들은 저해도메인을 포함하거나 전사 조절 도메인을 갖지 않을 수 있다.

활성화 도메인. 본 발명에서 사용될 수 있는 전사 활성화 도메인들은 효모에서 유래된 Gal4 활성화 도메인 및 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)에서 유래된 VP16 도메인을 포함하나 여기에 제한되지는 아니한다. 전사를 활성화 시키는 도메인의 능력은, 이미 알려진 DNA 결합 도메인에 융합시키고, 그 알려진 DNA 결합 도메인이 인식하는 부위에 연결된 표지 유전자의 발현이 키메라 단백질에 의하여 활성화 되는지 결정하여 확인된다.

활성화 도메인의 예로 다음의 p65 유래의 도메인이 있다:

YLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQ(서열번호: 131)

대표적인 Gal4 활성화 도메인의 서열은 다음과 같다:

NFNQSGNIADSSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSPGWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKEISMAYPYDVPDYAS (서열번호: 132)

박테리아에서, 활성화 도메인의 기능은 야생형 RNA 중합효소 알파 서브유닛C－말단 도메인 또는 단백질 결합 도메인과 융합된 C－말단 도메인과 같은 돌연변이 알파 서브유닛 C－말단 도메인에 의해 모방될 수 있다.

억제 도메인.필요에 따라, 활성화 도메인 대신 억제 도메인이 DNA 결합 도메인에 융합될 수 있다. 진핵생물의 억제 도메인의 예로는 Kid, UME6, ORANGE, 그로코(groucho) 및 WRPW(참고문헌, Dawson 등, (1995)Mol. Cell Biol.15:6923－31) 등에서 유래된 억제 도메인들이 포함된다. 억제 도메인의 능력은 그 도메인을 알려진 DNA 결합 도메인과 융합시키고, 그 알려진 DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 서열이 연결된 표지 유전자가 융합단백질에 의해 저해 되는지를 결정함으로써 확인될 수 있다.

대표적인 억제 도메인은 다음의 UME6 단백질로부터 유래한 도메인이다:

NSASSSTKLDDDLGTAAAVLSNMRSSPYRTHDKPISNVNDMNNTNALGVPASRPHSSSFPSKGVLRPILLRIHNSEQQPIFESNNSTACI (서열번호: 133)

다른 대표적인 억제 도메인은 Kid 단백질에서 유래한 도메인이다.

VSVTFEDVAVLFTRDEWKKLDLSQRSLYREVMLENYSNLASMAGFLFTKPKVISLLQQGEDPW(서열번호: 134)

또 다른 키메라 전사인자들은 활성화 도메인 또는 억제 도메인 모두를 포함하지 않는다. 오히려, 이러한 전사인자들은 결합된 내생 전사인자(예: 활성인자 또는 억제인자)를 치환하거나 이들과 경쟁하여 전사를 변화시킨다.

펩타이드 링커.DNA 결합 도메인들은 다양한 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커의 유용성과 디자인은 이 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 특히 유용한 링커는핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 링커이다. 따라서, 제1 DNA 결합 도메인, 펩타이드 링커, 및 제2 DNA 결합 도메인을 코딩하는 합성 유전자를 제조할 수 있다. 이러한 디자인은 대규모의 합성 다수－도메인 DNA 결합 단백질을 제조하기 위해 반복될 수 있다. PCT WO 99/45132 및 김 및 파보(Kim and Pabo, 1998,Proc. Natl. Acad. Sci. USA95:2812－7)는 징크 핑거 도메인들을 연결하는 데 적합한 펩타이드 링커의 디자인을 기술하고 있다.

무작위 코일, α－나선 또는 β－주름의 3차 구조를 형성하는 추가적인 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 적합한 유연성 있는 링커를 형성하는 폴리펩타이드는 이 기술 분야에서 잘 알려져 있다(Robinson and Sauer (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA.95:5929－34 참조). 유연성 있는 링커는 전형적으로 글리신을 포함하는데, 이는 글리신이 측쇄가 결여되어 있어서 회전 자유도가 있는 유일한 아미노산이기 때문이다. 친수성을 증가시키기 위해 세린 또는 트레오닌을 링커에 삽입할 수 있다. 아울러, 결합 친화도를 증가시키기 위해 DNA의 인산 골격과 상호작용할 수 있는 아미노산이 사용될 수 있다. 이러한 아미노산들의 현명한 사용으로 친화도의 증가와 서열 특이성의 감소 사이의 균형을 잡을 수 있다. 만약, 링커가 엄격한 신장성을 요구한다면 문헌[Pantoliano et al. (1991)Biochem.30:10117－10125]에 기술된 나선형 링커와 같은 α－나선 링커를 사용할 수 있다. 또한 링커는 컴퓨터 모델링에 의해 디자인될 수 있다(미국 특허 제4,946,778호 참조). 분자 모델링을 위한 소프트웨어는 상업적으로 입수할 수 있다(예를 들어 Molecular Simulation, Inc., San Diego, CA). 이러한 링커는, 단백질 공학 분야에서 실시되는 표준적인돌연변이 유도 기술 및 적절한 생물리학적 테스트, 및 본 명세서에 기술된 기능적 분석법을 사용하여, 예를 들어, 항원성을 감소시키고/시키거나 안정성을 증가시키기 위해 임의로 최적화 한다.

징크 핑거 도메인을 활용한 실시를 위해, 천연적으로 징크 핑거 사이에 나타나는 펩타이드를 징크 핑거들을 함께 연결하기 위한 링커로서 사용할 수 있다. 그러한 천연형 링커로 전형적인 것은 Thr－Gly－(Glu－Gln)－(Lys－Arg)－Pro－(Tyr－Phe)(서열번호: 78)이다(아가타 등, 상기 참조). 일반적으로, 천연형 징크 핑거와 합쳐지는 서열에 의거하여 링커들을 선별할 수 있다.

이량체화 도메인. DNA 결합 도메인들을 연결하는 또 다른 방법은 이량체화 도메인, 특히 이종이량체화 도메인(Pomerantz et al. (1998)Biochemistry37:965－970 참조)을 사용하는 것이다. 이 실시태양에서는 DNA 결합 도메인이 별개의 폴리펩타이드 사슬로 존재한다. 예를 들어, 첫 번째 폴리펩타이드는 DNA 결합 도메인 A, 링커 및 도메인 B를 코딩하는 반면, 두 번째 폴리펩타이드는 도메인 C, 링커 및 도메인 D를 코딩한다. 당업자는 특성이 밝혀진 많은 이량체화 도메인들로부터 하나의 이량체화 도메인을 선별할 수 있다. 동종이량체가 바람직하지 않다면 이종이량체화를 선호하는 도메인이 사용될 수 있다. 특히 적용가능한 이량체화 도메인은 코일화된 코일 모티프, 예를 들어 이량체 평행 또는 역평행 코일화된 코일이다. 우선적으로 이종이량체를 형성하는 코일화된 코일 서열을 또한 이용할 수 있다(Lumb and Kim, (1995) Biochemistry 34:8642－8648). 이량체화 도메인의 또 다른 종류로 이량체화가 소분자에 의해 또는 신호전달 경로를 통해 유발되는 것이 있다. 예를들어, FK506의 이량체 형태는 두 개의 FK506 결합 단백질(FKBP) 도메인들을 이량체화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 이량체화 도메인은 추가적인 조절 단계를 제공하기 위해 이용될 수 있다.

비－DNA 적용 키메라 단백질

본 원의 실시예를 비－DNA 결합 도메인의 서로 다른 조합을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 핵산의 라이브러리를 제작하기 위해 변형시킬 수 있으며, 비－DNA 결합 도메인에는 세포 내 신호전달 도메인들(SH2, SH3, PDZ, Che 도메인 또는 인산화 도메인)이 있다. 라이브러리에 의해 코딩된 키메라 단백질들은 세포내에서 발현될 수 있으며, 변형된 표현형을 가진 세포들은 동정된다. 예를 들어, 신호전달 도메인들의 상이한 조합들로 이루어진 키메라 단백질들이 세포증식 속도의 감소 또는 증가로 동정될 수 있다.

징크 핑거 단백질의 발현

본원에 기술된 방법은 분자생물학, 생화학, 고전적 유전학 및 재조합 유전학 분야의 전형적 기술의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명의 일반적 이용 방법을 제시한 기초 문헌들의 예로는 Sambrook 등,Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd ed. 1989); Kriegler,Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(1990); 및Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 등, eds., 1994)을 포함한다.

본원에 기술된 다른 방법 외에, 징크 단백질을 코딩하는 핵산들은, 합성 유전자를 제조하기 위해, 링커로서 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제작될 수 있다. 다른 예로, 합성 올리고뉴클레오티드는, 인공 또는 합성의 RNA 또는 DNA 주형으로부터 한 개 이상의 징크 핑거 도메인을 코딩하는 서열을 증폭시키기 위해, 프라이머로 사용된다[미국 특허 제 4,683,195호 와 제 4,683,202호;PCR 프로토콜(protocol): 방법과 응용에 대한 안내 (A Guide to Methods and Applications)(Innis 등, eds, 1990)) 참고]. 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 방법이 mRNA, cDNA, 게놈 또는 징크 핑거 단백질 라이브러리로부터 직접 핵산 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 변질 올리고뉴클레오티드를 본서에 제공된 서열들을 이용하여 유사체(homologs)들을 증폭시키도록 고안할 수 있다. 제한효소부위들이 프라이머로 삽입될 수 있다.

징크 핑거 단백질의 유전자 발현은 당 업계에 알려진 방법, 예를 들어 mRNA의 역전사 및 증폭, 전체 RNA 또는 poly A^＋RNA의 분리, 노던 블러팅(Northern blotting), 돗 블러팅(dot blotting), 원위치 잡종화(in situhybridization), RNase 보호(protection) 분석, 핵산 배열 기술 및 이와 유사한 분석법 등을 이용하여 분석될 수 있다.

인공 징크 핑거 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 복제 및/또는 발현은 위해 원핵 또는 진핵 세포를 형질전환시키기 전에 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이 벡터들은 플라스미드, 페이지(phage) 또는 셔틀(shuttle) 벡터 같은 원핵생물 유래벡터이거나 진핵생물 유래 벡터이다.

단백질 발현.인공 징크 핑거 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 재조합 발현(예: 높은 수준)을 얻기 위해, 적합한 코딩 핵산을 발현벡터로 서브클로닝(subcloning)할 수 있으며, 이 발현벡터는 직접 전사를 위한 강력한 프로모터, 전사/번역 종결부위 및 번역 개시부위에 대한 리보좀 결합 부위를 포함하고 있다. 알맞은 박테리아 프로모터는 당 업계에 잘 알려져 있으며, 다음의 예에 구체적으로 제시되어 있다(예: Sambrook 등, 및 Ausubel 등, 상기문헌).박테리아 발현 시스템은 발현을 위해 유용한데, 예를 들어 대장균(E. coli), 바실러스(Bacillus sp.) 및 살모넬라(Salmonella)(Palva 등, (1983)Gene22:229－235; Mosbach 등, (1983)Nature302:543－545)가 있다. 이 같은 발현 시스템을 위한 키트는 통상적으로 이용할 수 있다. 포유류 세포, 효모(예:S. cerevisiae, S. pombe, Pichia,및Hanseula) 및 곤충 세포에서의 진핵생물 발현 시스템은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 또한 통상적으로 이용할 수 있다.

이종 핵산의 직접 발현에 사용되는 프로모터의 선별은 적용 범위에 따라 달라진다. 프로모터는, 천연형일 때 전사 개시 부위로부터의 거리와 동일한 전사 개시 부위로부터의 거리에 위치되는 것이 바람직하다. 그러나, 당 업계에 알려진 바와 같이, 이러한 거리에 대한 약간의 변화는 프로모터 기능의 손실 없이도 적응할 수 있다.

프로모터에 덧붙여, 발현벡터는 일반적으로 숙주세포에서의 발현에 요구되는 모든 추가적 요소들이 포함된 전사 단위 또는 발현 카세트(cassette)를 포함한다.따라서, 전형적 발현 카세트는 코딩 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 전사의 효율적인 폴리아데닐화, 리보좀 결합부위 및 번역 종결 부위에 요구되는 신호들을 포함한다. 카세트의 추가적 구성요소로는 인핸서(enhancer) 및, 게놈 DNA가 구조 유전자로 사용된 경우 기능적 스플라이스 증여 및 수용 부위(splice donor and acceptor sites)를 가진 인트론이 포함될 수 있다.

프로모터 서열에 덧붙여, 발현카세트는 효율적 종결을 위해 구조 유전자의 전사 종결 영역을 하류(downstream)에 포함해야 한다. 종결 부위는 프로모터 서열이 유래한 동일한 유전자로부터 얻어지거나, 또는 상이한 유전자들로부터 얻어질 수 있다.

세포 내로 유전적 정보를 전달하는 데 사용되는 특정 발현벡터는 특별히 중요한 것은 아니다. 기존의 원핵 또는 진핵 세포에서 발현을 위해 사용된 벡터는 어떤 것이라도 사용될 수 있다. 표준 박테리아 발현벡터는 pBR322에 근거한 플라스미드, pSKF 및 pET23D와 같은 플라스미드, 및 MBP, GST 및 LacZ와 같은 융합 발현 시스템 을 포함한다. 분리를 편리하게 하기위해, 에피토프 택(tag) 또한 재조합 단백질에 추가될 수 있는데, 예를 들면 c－믹(myc)－ 또는 헥사－히스티딘 택이 있다.

발현 벡터들은, SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터 및 엠스테인－바 바이러스 유래 벡터와 같은 진핵 바이러스 유래의 조절 요소들을 포함할 수 있다. 다른 대표적인 진핵 벡터들에는 pMSG, pAV009/A^＋, pMTO10/A^＋, pMAMneo－5, 버큘로바이러스 pDSVE, 및 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오닌(metallothionein) 프로모터, 생쥐 유방암 바이러스 프로모터 (murine mammary tumor virus promoter), 라우스 사코마 바이러스 프로모터 (Rous sarcoma virus promoter), 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터 또는 진핵 세포 발현에 효과적으로 나타난 프로모터의 지시 하에 단백질 발현이 허용되는 다른 벡터들이 포함된다.

진핵 벡터로부터의 단백질 발현은 유도 프로모터를 사용하여 조절될 수도 있다. 유도 프로모터의 이용으로, 발현수준은 테트라사이클린(tetracycline) 또는 엑다이존(ecdysone) 같은 유도 제제의 농도에 따라 결정될 수 있으며, 이는 이러한 제제에 대한 감응 요소를 프로모터에 병합시킴으로써 이루어진다. 일반적으로, 높은 수준의 발현은 단지 유도 물질이 있을 때만 유도 프로모터로부터 얻어지며; 기본 수준은 최소한이다. 진핵 단백질의 발현이 진핵 세포에 해로운 경우, 유도 발현 벡터가 종종 사용된다.

어떤 발현시스템은 티미딘 인산화효소(thymidine kinase) 및 디하이드로폴레이트(dihydrofolate) 환원효소와 같이 유전자를 증폭할 수 있는 마커(marker)를 갖는 것도 있다. 변형적으로, 유전자 증폭을 포함하지 않는 고 효율의 발현 시스템(high yield expression systems)은, 곤충세포에 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터를 사용하는 것과 같이, 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터 또는 다른 강력한 바큘로바이러스 프로모터의 지시 하에 미토콘드리아 호흡 쇄(mitochondrial respiratory chain)의 코딩 서열 및 당분해 단백질 코딩 서열을 가지는 것 또한 적합하다.

일반적으로 발현 벡터에 포합되는 요소들은 또한 대장균, 재조합 플라스미드를 가진 박테리아의 선별을 위한 행생제 저항성 코딩 유전자 및 진핵 서열의 삽입이 허용되는 플라스미드의 비 필수 영역 내 동일한 제한 부위에 작용하는 리플리콘(replicon)을 포함한다. 원핵 서열은 진핵 세포 내 DNA 복제를 방해하지 않는 것으로 선택될 수 있다.

표준 형질감염 방법은 많은 양의 징크핑거 단백질을 발현하는 박테리아, 포유류, 효모 또는 곤충의 세포주들을 만들기 위해 사용되며, 이렇게 발현된 단백질들은 표준 기술을 사용하여 분리된다(참고, 예, Colley 등,J. Biol. Chem.264:17619－17622 (1989);Guide to Protein Purification, inMethods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). 진핵 및 원핵 세포들의 형질전환은 표준 기술에 따라 수행된다(참고, 예, Morrison,J. Bact.132:349－351 (1977); Clark－Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology101:347－362 (Wu 등, eds, 1983)).

외래 뉴클레오티드 서열을 숙주세포 내로 도입하기 위해 기존의 어떤 방법도 사용될 수 있다. 이러한 방법들에는 칼슘 포스페이트 형질감염, 원형질체(protoplast) 융합, 전기천공법(electroporation), 리포좀(liposomes), 미세주입(microinjection), 플라즈마 벡터(plasma vectors), 바이러스 벡터(viral vectors) 및 그 밖의 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전 물질을 숙주세포로 도입시키는 기존의 방법들이 포함된다(참고, 예, Sambrook 등, supra). 단지 사용된 특별한 유전공학 과정이 최소 하나의 유전자를 숙주세포에 성공적으로 도입시킬 능력이 있는가만 필수적이다.

발현 벡터가 세포 내로 도입된 후, 형질감염된 세포는 발현하기 좋은 또는 발현을 활성화하는 조건 하에 배양된다. 단백질은 세포추출물, 세포막 구성요소 또는 소낭(vesicle)으로부터 분리될 수 있으며, 또는 배양액으로부터 분리될 수 있다.

적합한 조절 서열들을 가진 발현벡터는 또한 초파리류, 선충류, 소형어류(zebrafish), 개구리류(Xenopus) 또는 쥐류와 같은 모델 개체 내에서 인공 징크 핑거를 코딩하는 이종 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다(참고, 예, Riddle 등, eds.,C. elegans II. Plainview (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1997).

단백질 정제.징크 핑거 단백질은 상기에서와 같이 어떤 적절한 발현시스템에 의해 제조된 물질로부터든지 정제될 수 있다.

징크 핑거 단백질은 표준 방법에 의해 높은 순도로 정제될 수 있으며, 이러한 방법들에는 암모늄설페이트, 컬럼 크로마토그래피, 친화도(affinity)에 의한 분리, 면역분리(immunopurification) 및 그 밖의 물질들을 사용한 선별 침강을 포함한다(Scopes,Protein Purification: Principles and Practice(1982); 미국특허 제 4,673,641 호; Ausubel 등, 상기문헌;and Sambrook 등, 상기문헌). 예를 들어, 징크 핑거 단백질은 다른 단계와의 조합과 같이 분리단계에서 사용될 수 있는 친화도 택(affinity tag)을 포함할 수 있다.

재조합 단백질은 일반적으로 프로모터 유도 후 다량의 형질전환된 박테리아에 의해 발현되지만; 발현은 구조적일 수 있다. IPTG에 의한 프로모터 유도는 유도프로모터 시스템의 한 예이다. 박테리아는 당 업계의 표준 방법에 따라 배양된다. 세포 단백질 분리를 위해 신규한 또는 냉동된 박테리아 세포가 사용된다. 박테리아에 발현된 단백질은 불용성 응집체("내포체"("inclusion bodies"))를 형성할 수 있다. 내포체로부터 단백질을 정제하는데 적합한 다양한 방법들이 있다(참고, 예, Sambrook 등, 상기문헌; Ausubel 등, 상기 문헌). 만일 단백질이 용해성이거나 주변원형질(periplasm)로 전달된 형태라면, 세포 용해물(lysates) 또는 주변원형질 분리액(periplasmic preparations)으로부터 얻어질 수 있다.

선별적 침전. 염첨가－용해 또는 석출(Salting－in or out)법은 징크 핑거 단백질 또는 오염 단백질을 선별적으로 침전시키는데 사용될 수 있다. 대표적인 염은 황산암모늄이다. 황산암모늄은 단백질의 용해도에 기초하여 단백질들을 침전시킨다. 더 강한 소수성의 단백질일수록 더 낮은 농도의 황산암모늄에서 침전되는 경향이 있다. 일반적 방법에는 황산암모늄의 농도가 20－30％가 되도록 포화 황산암모늄을 첨가시키는 단계를 포함한다. 이 농도는 많은 소수성이 강한 단백질들을 침전시킨다. 침전물은 관심 단백질이 침전되었는지 상등액에 녹아있는지를 결정하기 위해 분석된다. 관심 단백질을 침전시키는 것으로 알려진 농도가 되도록 상등액에 황산암모늄을 첨가한다. 침전물은 이후 완충액에 용해되고, 과량의 염은 필요에 따라 투석 또는 정용여과(diafiltration)로 제거된다.

컬럼 크로마토그래피. 징크 핑거 단백질은 단백질의 크기, 표면 전위, 소수성 및 리간드에 대한 친화력에 기초하여 다른 단백질들로부터 분리될 수 있다. 덧붙여, 단백질에 반응하는 항체는 컬럼 매트릭스 및 면역분리된 단백질에 접합될 수있다. 이러한 모든 방법들은 당 업계에 잘 알려져 있다. 크로마토그래피 기술은 어떤 규모로도 수행될 수 있으며, 이용한 방법들은 어떤 규모로도 수행할 수 있으며, 여러 다른 제조업체(예: Pharmacia Biotech)의 장치를 사용하여 수행할 수도 있다(참고, 일반적으로, Scopes,Protein Purification: Principles and Practice(1982)).

유사하게, 일반적 단백질 정제 과정은, 생산 세포 내 인공 징크 핑거 단백질의 발현에 그 생산이 변화된(예: 증대된) 단백질을 회수하는 데 사용될 수 있다.

유전자 및 세포－이용 치료법

상기 본 발명의 한 측면은, 인공 징크 핑거 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 분자를 제공한다. 이러한 단리된 DNA 분자들은 유전자 치료를 목적으로 다양한 DNA 구조와 벡터들에 삽입될 수 있다. 본원에서 사용된 "벡터"는 다른 핵산 분자를 공유적으로 연결시켜 운반할 수 있는 핵산 분자 구성요소이다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 인공염색체(artificial chromosomes) 및 바이러스 요소를 포함한다. 벡터는 숙주세포 내에서 복제하거나 숙주 DNA로 합쳐지는 구성요소일 수 있다. 바이러스 벡터들은 예를 들면 복제 손상 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노－관련 바이러스를 포함한다. 유전자 치료 벡터는 포유류와 같은 대상에 투여하기 위해 고안되는데, 대상의 세포는 벡터 내에 포함된 치료용 유전자를 발현할 수 있다.

유전자 치료 벡터는, 5'조절요소, 인핸서, 프로모터, 5'비번역영역, 신호 서열(signal sequence), 3'비번역영역, 폴리아데닐화 부위 및 3'조절영역과 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 5'조절요소, 인핸서 또는 프로모터는 치료용 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA의 전사를 조절할 수 있다. 그 조절은 조직 특이적일 수 있다. 예를 들어, 조절은 원하는 유전자의 전사를 피질 신경 또는 신경교세포와 같은 뇌세포; 조혈세포 또는 상피세포(endothelial)에만 제한할 수 있다. 다른 방도로, 조절 요소는 스테로이드, 테트라사이클린 또는 이와 유사한 외부 약제에 대한 반응을 포함할 수 있다. 따라서, 치료용 징크 핑거 폴리펩티드(예: VEGF를 조절하는 폴리펩티드)의 발현의 수준 및 시기는 조절 될 수 있다.

유전자 치료용 벡터는 핵산만으로, 바이러스의 또는 비활성화된 바이러스의 구성요소로, 또는 리포좀 또는 다른 운반 매개체로서 전달되기 위해 제작될 수 있다. 다른 방도로, 바이러스 벡터와 같은 운반 제제는 유전자 전달시스템을 생성하는 재조합 세포로부터 만들어질 수 있다. 적합한 바이러스 벡터들에는 몰로니 레트로바이러스(Moloney retrovirus)와 같은 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노－관련 바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 같은 렌티바이러스 등이 포함된다. HSV는 신경조직 세포들을 감염시키는데 잠재적으로 유용하다.

유전자 치료용 벡터는, 예를 들어, 정맥 내 주사, 국부 투여(미국 특허 제5,328,470 호 참고) 또는 정위(stereotactic) 주사(Chen 등 (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:3054－3057 참조)에 의해 대상생물에 투여될 수 있다. 유전자치료 제제는, 예를 들어, 저속 방출 매트릭스(slow release matrix)로 제제의 방출을 늦추거나 지속시키는 등 추가적 조제가 가능하다. 치료용 재조합 트리－도메인 폴리펩티드를 제공하는 한 방법은, 대상생물로부터 추출된 골수세포에 유전자치료 벡터를 삽입하는 것이다. 예를 들면, 세포는 레트로바이러스 유전자 치료 벡터를 이용하여 감염되고, 배지에서 자란다. 한편, 치료대상에 방사능을 조사하여 골수세포들을 제거시킨다. 이후, 치료 대상의 골수는 유전자치료 벡터에 감염된 배양 세포로 다시 채워진다. 치료 대상의 회복 및 치료용 폴리펩티드의 생산은 세심히 관찰된다.

세포－기반 치료 방법들은 배양세포에 프로모터와 작동 가능하게 연결된 인공 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 인공 징크 핑거 단백질은 배양 세포 내 내생 유전자를 조절하거나 배양 세포에 원하는 표현형을 만들어내도록 선별될 수 있다. 또한, 전환유전자 삽입과 같은 핵산 재조합을 사용하여 줄기세포와 같은 세포를 개조하는 것이 가능하며, 전환유전자는 내생 유전자를 조절하는 인공 징크 핑거 단백질을 코딩한다. 개조된 줄기세포는 대상생물에게 투여될 수 있다. 시험관 내 줄기세포의 배양방법은 미국 특허출원 제2002－0081724 호에 기술되어 있다. 특정 예에서, 줄기세포는 대상생물 체내에서 분화되도록 유도될 수 있고, 전환유전자를 발현한다. 예를 들어, 줄기세포는 간, 지방 또는 골 근육 세포로 분화될 수 있다. 줄기세포는 간, 지방, 골 근육 세포와 같은 원하는 조직 형태의 세포를 만드는 계열로부터 유래될 수 있다.

다른 태양에서, 본원에서 기술한 바와 같이, 인공징크 핑거 단백질을 발현하는 또는 발현 가능한 재조합 세포들은 대체요법으로 치료대상에게 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로모터(예: 유도 프로모터, 예, 스테로이드 호르몬 수용체－조절 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 인공 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산은 인간또는 돼지 재조합 세포와 같은 포유류 등의 비인간 세포에 도입될 수 있다. 세포는 배양되고, 폴리－라이신 알기네이트와 같은 생물학적 친화성 물질에 캡슐화 되어, 치료 대상에 이식될 수 있다(Lanza (1996) Nat. Biotechnol. 14:1107; Joki 등 (2001) Nat. Biotechnol. 19:35; 및 미국특허번호 제 5,876,742 호 참조). 인공 징크 핑거 단백질이 분비 단백질을 코딩하는 내생 유전자를 조절하는 실시태양에서, 분비 폴리펩티드의 생산은 치료 대상에 약물(예: 스테로이드 호르몬)을 투여함으로써 조절할 수 있다.

또 다른 태양에서, 인공 징크 핑거 단백질을 발현하거나 발현할 수 있는 재조합 세포들은 시험관 내에서 배양된다. 재조합 세포들에 의해 생산되는 단백질은 세포 또는 세포 주위의 배양액으로부터 회수(예: 분리)될 수 있다.

단백질 생산 변화의 표적

하나의 태양에서, 핵산 라이브러리는, 하나 이상의 특정 표적 단백질의 생산, 합성 또는 활성을 변화시키는 인공 징크 핑거 단백질을 동정하기 위해 스크리닝 된다. 변화는 표적 단백질의 활성 또는 양을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 스크리닝의 대상인 표현형은 하나 이상의 표적 단백질의 변화된 생산 또는 활성과 관계가 있거나, 그 자체의 생산 또는 활성 수준일 수 있다. 예를 들어, 내생 표적 유전자의 조절 서열(예: 프로모터)의 통제 하에, 리포터 유전자(루시퍼라제, LacZ, 또는 GFP 코딩 유전자 등의 유전자)를 활성화 또는 억제하는 인공전사인자에 대한 핵산 라이브러리 스크리닝이 가능하다. 어떤 대표적 표적 단백질은 다음을 포함한다:세포 표면 단백질(예: 당쇄화된 표면 단백질), 암－관련 단백질, 사이토카인, 케모카인, 펩타이드 호르몬, 신경전달체(neurotransmitter), 세포 표면 수용체(예: 세포 표면 수용체 인산화효소, 7개의 막투과성 수용체, 바이러스 수용체 및 코－수용체(co－receptor)), 세포 외 구조체 결합단백질, 세포－결합 단백질 및 병원성 항원(예: 박테리아 항원, 말라리아 항원 등). 추가적 단백질 표적들에는 이놀라제(enolases), 사이토크롬 P450, 아실트랜스퍼라제(acyltransferases), 메틸라제(methylases), TIM 장벽 효소(TIM barrel enzymes) 및 이성체화 효소(isomerases) 등이 포함된다.

더욱 세분화된 예로는 다음을 포함한다: 인테그린, 세포 접합 분자 또는 "CAM"(예: 카데린, 셀렉틴, N－CAM, E－CAM, U－CAM 및 I－CAM 등); 단백질분해효소 (예: 서브틸리신, 트립신, 키모트립신; 유로키나아제 또는 인간 조직－형 프라스미노젠 활성화 효소와 같은 플라스미노젠); 봄베신(bombesin); 인자 IX, 트롬빈; CD－4; 혈소판－유도 성장인자; 인슐린－유사 성장인자－I 및 －II; 신경 성장인자; 섬유아세포 성장인자(예: aFGF 및 bFGF); 내피 성장인자(EGF); VEGFa; 형질전환 성장인자(TGF, 예, TGF－α 및 TGF－β; 인슐린－유사 성장인자 결합 단백질; 적혈구생성촉진인자; 혈소판생성촉진인자; 뮤신; 인간 혈청 알부민 ; 성장 호르몬(예: 인간 성장 호르몬); 프로인슐린, 인슐린 A－쇄 및 인슐린 B－쇄; 부갑상선 호르몬; 갑상선 촉진 호르몬; 티록신; 여포 촉진 호르몬; 칼시토닌; 심방성 나트륨 배설 증가 단백 A, B 또는 C; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 인자 VIII; 조혈모 성장인자; 조직괴사인자(예: TNF－αand TNF－β; 엔케팔리나제; 뮬레니안－억제 물질;성선자극호르몬－관련 펩타이드; 조직 인자 단백질; 인히빈; 액티빈; 혈관내피 성장인자; 호르몬 또는 성장인자 수용체; 류마티즘 인자; 골유도인자; 인터페론, 예, 인터페론－α,β,γ; 콜로니 촉진 인자(CSFs), 예, M－CSF, GM－CSF 및 G－CSF; 인터루킨(ILs), 예, IL－1, IL－2, IL－3, IL－4 등; 붕괴 촉진 인자; 및 면역글로불린. 몇몇 실시태양에서는, 표적은 암과 같은 질병과 연관되어 있다.

본 발명은 하기 실시예를 통하여 더 구체적으로 기술된다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하지 않음을 유의해야 한다.

실시예 1: 징크 핑거 라이브러리의 구축

한 예로써, 사카로마이세즈 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 다양한 표현형은 징크 핑거 단백질(ZEP) 발현 라이브러리를 사용하여 유전자 발현을 조절함으로써 변화된다. 이러한 대표적인 라이브러리의 징크 핑거 단백질은 3 또는 4 개의 징크 핑거 도메인(ZFDs)으로 이루어져 있으며, 각각 9－ 내지 12－염기쌍 DNA 서열을 인식한다. 키메라 징크 핑거 단백질은 표적 유전자의 선험적 지식 없이도 동정된다. 서로 다른 세 개의 전사인자 종류는 라이브러리 내의 ZFP로부터 만들어진다: ZFP가 프로모터 영역 근처 부위에 결합할 경우 단리된 ZFP 자체가 효과적인 전사 저해자로 기능하며; ZFP는, 또한 전사 활성화 또는 저해를 위해, 전사 활성화 도메인 또는 억제 도메인에 융합된 단백질로서 발현된다.

본 발명에서는 3－핑거 또는 4－핑거 징크 핑거 단백질을 제작하기 위해 모듈 빌딩 블록으로서 40개의 상이한 징크 핑거 도메인들을 사용하였다. 이들의 최대 한계치로, 3－핑거 ZFP 라이브러리는 64,000(= 40³) 서열을, 4－핑거 ZFP 라이브러리는 2,560,000(= 40⁴) 서열을 가진다.

이들 ZFP 발현 플라스미드의 라이브러리들은 효모세포에 형질전환 되었다. 각각의 형질전환 세포에서, 상이한 ZFP 전사인자가 발현되며 게놈상의 임의의 표적유전자들을 조절하였다. 이러한 유전자 발현 패턴의 변화는 표현형질의 변화를 일으킨다. 많은 수의 형질전환 세포들을 스크리닝하여 원하는 표현형을 가진 단일 클론을 분리할 수 있다. 추가적으로, 조절된 표적 유전자는, 유전자 발현 프로필(예: DNA 미세배열분석을 통하여)의 게놈－범위 분석에 의해 동정될 수 있거나, 형질전환체로 도입된 징크 핑거 단백질을 동정 후 표적 DNA 서열에 대한 전산(in silico) 예측으로 동정될 수 있다.

(1) 효모 균주

사용된 S. 세리비지에 균주는 YPH499a(MATa, ade2－101, ura352, lys2－801, trp1－△ 63, his3－△ 200, leu2－△ 1, GAL＋)이다. 효모세포의 형질전환은 리튬아세테이트 형질전환 방법(Gietz 등, (1992)Nucl. Acids Res20:1245)을 사용하여 수행하였다.

(2) p3 플라스미드의 제작

징크 핑거 단백질의 라이브러리를 제작하는데 사용된 모벡터(parental vector)는 p3 플라스미드이다. P3는 다음과 같은 방법으로 pcDNA3 벡터(인비트로젠, San Diego CA)를 조작하여 제작되었다. pcDNA3 벡터를 HindⅢ 및 XhoI으로 절단하였다. 상응하는 오버행(overhangs)을 갖는 합성 중복부위 올리고뉴클레오티드는 절단된 pcDNA3에 연결되었다. 중복부위는 헤마글루티닌(HA) 표지 및 핵 위치 신호 (nuclear localization signal)를 코딩하는 핵산을 포함한다. 중복부위는 또한 BamHI, EcoRI, NotI 및 BglⅡ에 대한 제한효소 절단부위들과 종결 코돈을 포함한다. 벡터 내 SV40 유래의 XmaI 부위는, XmaI 절단, 절단된 오버행의 끝부분을 채움, 및양 말단을 다시 연결함으로써 파괴하였다.

(3) pYCT－Lib 플라스미드의 제작

본 발명에서는 효모에서의 징크 핑거 단백질의 조건적 발현을 위한 모벡터로 pYCT－Lib을 사용하였다. pYCT－Lib은 유도 GAL1 프로모터(도 1)를 포함하는 효모 셔틀 벡터이다. 다른 특징으로는, (i) 핵 위치 신호(NLS) 및 헤마글루티닌(HA) 표지, 및 (ii) 트립토판이 없는 합성 최소 배지에서 플라스미드 함유 세포의 선별을 위한 TRP1 유전자 포함하는 서열을 들 수 있다.

T7 프라이머 부위로부터 SphI 부위에 폴리링커 영역은 다음의 서열을 포함할 수 있다:

TAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTAAGCTCACCATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACACAAGCTATGGGTGCTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGCTGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCGCTCGAGGCATGCATCTA (서열번호: 135)

p－YCT－Lib은 다음과 같이 제작되었다. 효모 발현 플라스미드 pYESTrp2 (Invitrogen, San Diego CA)는 NgoM4에 의해 절단된 후, 벡터로부터 2μori 단편을 제거하기 위해 PstI으로 부분절단 되었다. 절단된 NgoM4－PstI으로 부터의 5.0 kb DNA 단편은 젤 전기영동 후 분리되었고, pRS313(전방향 프라이머: 5'CGATCTGCAGGG TCCTTTTCATCACGTGCT－3' (서열번호: 136), 역방향 프라이머: 5'CGATCGATGCCG GCGGACGGATCGCTTGCCT (서열번호: 137))으로부터 증폭된 CEN－ARS 단편과 결합되었다.

B42 활성화 도메인을 코딩하는 DNA 조각은 NcoI 및 BamHI으로 절단하여 제거하였고, 여기에 V5 에피토프 표지 및 핵 위치 신호를 대체하였다. 마지막에 명시된 DNA 단편은 pYESTrp2(전방향 프라이머: 5'AATTCCATGGGTAAGCCTATCCCTAACC－3' (서열번호: 138), 역방향 프라이머: 5'AATTGGATCCAGCTACCTTTCTCTTCTT－3'(서열번호: 139))로부터 PCR 증폭하였으며, 이를 NcoI 및 BamHI 제한부위에 결합시켰다. 결과 플라스미드는 pYTC－Lib(도 1)로 명명하였다.

(4) pYCT－Lib－Gal4 플라스미드 제작

pYCT－Lib－Gal4를 만들기 위해, Gal4 활성화 도메인은 효모 게놈 DNA(전방향 프라이머: 5'－AAGGAAGGAAGGAAGCGGCCGCAGCCAATTTTAATCAAAGTGG－3'(서열번호:140), 역방향 프라이머: 5'－ACATACATGCATGCGCCGTTACTAGTGGATCC－3'서열(서열번호: 141))로부터 PCR－증폭하였으며, pYCT－Lib의 NotI 및 SphI 인식부위에 삽입하여 pYTCLibGal4를 제작하였다. Gal4 활성화 도메인을 코딩하는 대표적 서열 및 연결 서열은 다음을 포함한다:

(서열 번호:142)

(5) pYCT－Lib－Ume6 플라스미드의 제작

pYCT－Lib－Ume6를 제작하기 위해, S. 세레비지에 Ume6의 508 내지 594의 아미노산을 코딩하는 DNA 단편을 효모 게놈 DNA(전방향 프라이머: 5'AAGGAAGGAAGGAAGCGGCCGCAAATTCTGCATCTTCATCTACC－3' (서열번호: 143), 역방향 프라이머: 5'－ACATACATGCATGCTGTAGAATTGTTGCTTTCG－3' (서열번호: 144))로부터 증폭하였으며, pYCT－Lib의 NotI 및 SphI 인식 부위 사이에 삽입되었다. 이 87－아미노산 영역은 전사 억제 도메인으로서 기능한다(Kadosh 및 Struhl (1997)Cell89:365－371). Ume6 억제 도메인을 코딩하는 대표적 서열 및 연결서열은 다음의 서열을포함한다:

(서열번호: 145)

(6) 라이브러리 제작

3개의 ZFD의 배열을 갖는 징크 핑거 단백질을 코딩하는, 3－핑거 단백질 라이브러리 ("3－F 라이브러리")는 40개의 상이한 ZFD 또는 "핑거"를 코딩하는 핵산으로부터 제작되었다. 4－핑거 단백질 라이브러리("4－F 라이브러리")는 27개의 상이한 ZFD를 코딩하는 핵산으로부터 제작되었다(하기 표 2).

상기 표 2의 2열의 위첨자는 1) Zhang 등,(2000)J. Biol. Chem.275:33850－33860; 2) Rebar 및 Pabo (1994)Science263:671－673; 3) Segal (1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA96:2758 ; 4) Gogus 등, (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA.93:2159－2164; 5) Drier 등, (2001)J. Biol. Chem.276: 29466－29478; 6) Liu 등 (2001)J. Biol. Chem.276(14):11323－11334; 7) Hsu 등, (1992)Science257:1946－50을 표시한다.

도 7은 다양한 3－핑거 단백질 라이브러리를 구축하는 방법을 묘사하고 있다. 각 ZFD을 코딩하는 핵산 단편들은 "단일 핑거" 벡터를 형성하기 위해 개별적으로 p3 벡터 내에 클로닝되었다. 동일 양의 각 "단일 핑거" 벡터들을 조합하여 풀을 형성하였다. 풀의 일부는 AgeI 과 XhoI으로 절단하여 절단된 벡터 절편들을 얻었다. 이 벡터 절편들을 30분 동안 탈인산화 효소로 처리하였다. 풀의 다른 일부는 XmaI과 XhoI으로 절단하여 단일 핑거들을 코딩하는 단편들을 얻었다. AgeI 및 XhoI으로 절단된 풀로부터 전단된 벡터 핵산을 XmaI 및 XhoI 절단에 의해 벡터로부터 방출된 핵산 절편들과 결합시켰다. 이러한 결합은 각각 2 개의 징크 핑거 도메인을 코딩하는 벡터들을 생성하였다. 대장균에 형질전환시킨 후, 약 1.4 × 10⁴개의 개별 형질전환체를 수득하였으며, 2－핑거 라이브러리를 형성하였다. 2－핑거 라이브러리의 삽입 영역의 크기는 40개 콜로니의 PCR 분석에 의해 확인하였다. 라이브러리 구성원의 95％는 알맞은 크기의 삽입을 나타냈다.

3－핑거 라이브러리를 제작하기 위해, 단일 핑거를 코딩하는 DNA 조각을 2 핑거를 코딩하는 플라스미드로 삽입하였다. 2－핑거 라이브러리는 AgeI 및 XhoI으로 절단되었다. 2 개의 징크 핑거 도메인을 지니고 있는 절단된 플라스미드들은 단일 핑거(상기와 동일한 방법으로 XmaI 및 XhoI으로 절단된)를 코딩하는 핵산에 결합되었다. 이 결합의 생성물을 대장균에 형질전환시켜 2.4 × 10⁵개의 개별 형질전환체를 얻었다. 삽입 영역의 확인으로 라이브러리 구성원들이 3개의 징크 핑거 도메인을 코딩하는 서열을 우세하게 지니고 있음을 확인하였다.

4－핑거 라이브러리를 제작하기 위해, 2－핑거 도메인을 코딩하는 DNA 절편들을 2－핑거를 코딩하는 플라스미드에 삽입하였다. 2－핑거 라이브러리는 XmaI 및 XhoI으로 절단하였고, 2－핑거 도메인을 코딩하는 핵산 절편들을 얻었다. 2－핑거 라이브러리는 또한 AgeI 및 XhoI으로 절단하였고, 절단된 플라스미드 풀을 얻었다. 2개의 징크 핑거 도메인을 코딩하는 핵산서열을 함유하는 절단된 플라스미드는 2개의 징크 핑거 도메인을 코딩하는 핵산 절편과 결합되어 상이한 조합의 4－핑거 단백질을 생성하였다. 이 연결의 생성물은 대장균에 형질전환시켜 약 7 × 10⁶의 개별 형질전환체를 생성하였다.

(7) 효모 내 발현을 위한 라이브러리 제작

3－핑거(3－F) 및 4－핑거(4－F) 라이브러리들은 pYTC－Lib, pYTC－Gal4 및 pYTC－Ume6의 EcoRI 및 NotI 부위에 서브클로닝 되었다. 이 서브클로닝의 단계는 전사 조절 도메인을 갖거나 갖지 않는 3 및 4 핑거 ZFP를 코딩하는 6개의 상이한 라이브러리들이 생성되었다. 대장균 내 증폭 후, 각 라이브러리는 리튬 아세테이트를 사용하여 효모 균주인 YPH499a로 형질전환 시켰다. 형질전환은 약 1.5 x 10⁷콜로니를 생성하였다. 라이브러리의 삽입영역의 크기는 50 콜로니의 PCR 분석으로 확인되었다. 95％의 라이브러리 구성원들은 정확한 삽입 크기를 포함하였다. 형질전환체들은 TE 완충용액에 분산되고, －80 ℃ 글리세롤에 보관하였다.

실시예 2: 갈락토스 배지 상의 성장－결함 형질전환체

효모세포의 성장을 손상시키는 키메라 징크 핑거 단백질들을 동정하기 위해 3－F 라이브러리를 스크리닝 하였다. 이 스크리닝은 키메라 징크 핑거 단백질을 조건적으로 발현시키기 위해 GAL 프로모터를 사용한다. 기존 연구들은, 과발현시 치상을 나타내는 유전자를 동정하기 위해, 효모 cDNA 및 게놈 DNA 서열에 GAL 프로모터를 사용하였다(Liu 등, (1992)Genetics132:665－673; Ramer 등 (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:11589－11593; Espinet 등, (1995)Yeast11:25－32; Akada 등, (1997)Mol. Gen. Genet254:267－274; Stevenson 등, (2001)Proc. Natl. Acad. Sci. USA.98:3946－3951).

효모 균주 YPH499a는 3－F 라이브러리로부터 핵산을 가지고 형질전환 시켰다. 형질전환체를 트립토판이 결핍되고 글루코스를 함유하는 합성 최소 배지가 들어있는 플레이트에서 30℃, 2 일간 성장시켰다. 이러한 각 글루코스 플레이트는 갈락토스 플레이트 및 제2 글루코스 플레이트 상에 복제－배양 되었다. 복제 플레이트들은 30℃에서 밤새 배양되었다. 그 후, 각 갈락토스 플레이트를 그에 상응하는 글루코스 플레이트와 비교하였다. 갈락토스에서 자라지 못하면서, 글루코스에서 성장하는 콜로니들을 동정하였다. 이 콜로니들은 글루코스 플레이트로부터 회수되었고 다시 갈락토스 배지 위에 스트리킹(streaking)하여 재시험을 하였다. 재시험된 각 콜로니로부터 라이브러리 플라스미드를 얻어냈다. 플라스미드는 성장 결함이 징크 핑거 단백질의 발현에 의한 것인지 확증하기 위해 YPH499a로 재형질전환 시켰다. 어떠한 징크 핑거 단백질도 코딩하지 않는 두 벡터 플라스미드 pYTC와pYTC－Gal4을 대조군으로 동일하게 수행하였다.

표 3에서 알 수 있듯이, 3－F와 4－F 라이브러리로부터 형질전환체의 0.7％ 내지 2.8％는 갈락토스 배지에서 성장할 수 없었다. 이러한 백분율은 대조군 pYTC－Lib 벡터 대조군(0.1％) 및 pYTC－Lib－Gal4 벡터 대조군(0.2％)에서 얻어진 값과 유사하거나 훨씬 높았다.

글루코스 상에서 생장－결함을 나타내는 10 개의 콜로니로부터 플라스미드를 회수하였다. 플라스미드(L1 에서 L10)는 효모세포에 재형질전환 되었다. 10 개의 플라스미드는 모두 재시험되었다. 회수된 플라스미드로 형질전환된 세포들은 글루코스 배지에서는 성장하지만, 갈락토스 배지에서는 성장할 수 없었다. 이러한 10개의 플라스미드들에 의해 코딩된 징크 핑거 단백질들은 DNA 서열분석(표 4)에 의해 분석되었다. 이들 단백질들에 대한 잠재적 표적 DNA 결합 부위는 구성요소 징크 핑거 도메인의 결합특이성에 대한 정보로부터 유추하였다.

실시예 3: 항균약물에 대한 저항성

케토코나졸(Ketoconazol)은 경구 흡수되는 항균성(antimycotic) 이미다졸 (imidazole) 약제이다. 이것은 특정 점막들의 치료를 위해 투여될 수 있다. 케토코나졸은 효모 및 다른 진균류에서 에르고스테롤(ergosterol)의 생합성을 차단하며 (Burden 등, (1989)Phytochemistry28:1791－1804), 세포의 대사에 추가적 효과를 나타낸다(Kelly 등, (1992) In Fernandes, P.B. (Ed.)New Approaches for Antifungal Drug,Birkhㅴuser, Boston, pp.155－187).

케토코나졸에 대한 시험균주 YPH499a의 진균저항(fungistatic) 반응을 확인하기 위해, YPH499a 균주 10⁷세포는 상이한 농도의 약제를 함유하는 합성 배지 상에 도포되었다. 본 발명자들은 35 μM의 케토코나졸이 YPH499a 세포의 증식을 저해하는 것을 확인하였고, 케토코나졸－저항 효모 콜로니를 스크리닝하기 위해 이러한 농도를 사용하였다.

3－핑거 및 4－핑거 라이브러리로부터 플라스미드를 함유하는 1 × 10⁷효모세포들을, 징크 핑거 단백질의 발현을 유도하기 위해, 2％ 갈락토스 함유 합성 배양액에서 30℃, 3시간 동안 배양하였고, 그 후 35 μM 케토코나졸(ICN Biomedicals)을 함유하는 합성 갈락토스 아가 플레이트에 도포하였다. 30℃에서 4일 동안 배양한 후, 35 μM 케토코나졸을 함유하는 갈락토스 배지 위에 약 120개의 클론들이 콜로니를 형성하였다. 이들 케토코나졸 저항성 효모 콜로니들을 채집허여 35 μM 케토코나졸을 함유하는 신선한 합성 갈락토스 아가 플레이트에 스트리킹 하였다. 120개의 저항성 클론 중 23 클론이 무작위로 선별되었다. 각각의 23 클론들에 대해, 저항 표현형은 플라스미드 회수로 확인하였다. 플라스미드들을 분리하여 증폭을 위해 대장균에 형질전환 시켰으며, 효모 균주인 YPH499a로 재형질전환 시켰다(Ausubel, 등 (Eds) (1995)Current Protocols in Molecular BiologyJohn Wiley 및 Sons Ltd, New York). 동일한 수의 형질전환체들은 35 μM 케토코나졸을 함유하거나 함유하지 않는 합성 갈락토스 아가 플레이트들에 스팟(spot)되었다. 재형질전환체들은, 약제 저항성이 징크 핑거 단백질의 칼락토스－유도 발현에 의해 유도된 것인지를 확인하기 위해, 케토코나졸을 함유하거나 함유하지 않는 합성 글루코스아가 플레이트에 역시 스팟되었다.

한 실험에서, 각 형질전환체들로부터 5×10⁴세포를 순차적으로 희석하였으며(10^－1, 10²및 10^－3배), 35 μM의 케토코나졸을 함유하거나 함유하지 않는 갈락토스 또는 글루코스 공급된 배지에 스팟되었다. 세포 성장은 30℃에서 4일 후 관찰되었으며, 동일한 플레이트상의 대조군과 비교되었다. 대조군은, 케토코나졸 저항성을 유도하지 않는 징크 핑거 단백질을 코딩하는 플라스미드 및 징크 핑거 단백질을 코딩하는 삽입체를 갖지 않는 pYTC－Lib 플라스미드를 포함하였다. 23개의 모든 경우에서, 회수된 플라스미드는 재시험 되었다. 추가적으로, 케토코나졸 저항성은 단지 갈락토스 배지에 도포된 세포에서만 관찰되었고, 이로써 징크 핑거 단백질의 발현이 케토코나졸 저항성을 유도한다는 사실을 알 수 있다.

케토코나졸 저항 형질전환체들로부터 분리된 플라스미드는 염기서열이 분석되었고 효모 게놈 내 그 예상 표적 서열이 예측되었다(표 5). 11개의 독특한 클론들이 동정되었다(표 5).

이러한 단백질들의 아미노산 서열은 하기에 나타내었다(징크 핑거 도메인들은 밑줄표시 되었고 전사 조절도메인들은 굵은선 처리 되었다). K1:QSHV－QFNR－RSHR－Ume6은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekpYECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTHTGEKP YKCHQCGKAFIQSFNLRRHERTH TGEKP YKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIH AAAANSASSSTKLDDDLGTAAAVLSNMRSSPYRTHDKPISNVNDMNNTNALGVPASRPHSSSFPSKGVLRPILLRIHNSEQQPIFESNNSTACI (서열번호: 221)

K2: RSNR－RSNR－QSSR1－QSHT－Ume6 는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekp YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH TGEKPYICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTHTGEKP YKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTH TGEKP YKCEECGKAFRQSSHLTTHKIIH AAAANSASSSTKLDDDLGTAAAVLSNMRSSPYRTHDKPISNVNDMNNTNALGVPASRPHSSSFPSKGVLRPILLRIHNSEQQPIFESNNSTACI (서열번호: 222)

K3: RSNR－RSNR－QGTR－QSHR5－Ume6 는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekp YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH TGEKP YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH TGEKP FQCRICMRNFSQRGTLTRHIRTH TGEKP YVCRECGRGFRQHSHLVRHKRTH AAAANSASSSTKLDDDLGTAAAVLSNMRSSPYRTHDKPISNVNDMNNTNALGVPASRPHSSSFPSKGVLRPILLRIHNSEQQPIFESNNSTACI (서열번호: 223)

K4: RSNR－RSNR－QGTR－QTHQ－Ume6 는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekp YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH TGEKP YICRKCGRGFSRKSNLIRHQRTH TGEKP FQCRICMRNFSQRGTLTRHIRTH TGEKP YECHDCGKSFRQSTHLTQHRRIH AAAANSASSSTKLDDDLGTAAAVLSNMRSSPYRTHDKPISNVNDMNNTNALGVPASRPHSSSFPSKGVLRPILLRIHNSEQQPIFESNNSTACI (서열번호: 224)

K5: VSSR－DGNV－VSSR－VDYK－Gal4 는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekp YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTH TGEKP FQCRICMRNFSDSGNLRVHIRTH TGEKP YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTH TGEKP FHCGYCEKSFSVKDYLTKIRTH AAAANFNQSGNIADSSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSPGWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKEISMAYPYDVPDYAS (서열번호: 225)

K6: MHHE－QSNR1－VSSR－QGDR－Gal4 는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekp YACPVESCDRRFSMSHHLKEHIRTH TGEKP FECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTH TGEKP YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTH TGEKP FQCRICMRNFSQSGDLRRHIRTH AAAANFNQSGNIADSSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSPGWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKEISMAYPYDVPDYA S (서열번호: 226)

K7: DGNV－QSHT－QSSR1－DGHR－Gal4 는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekp FQCRICMRNFSDSGNLRVHIRTH TGEKP YKCEECGKAFRQSSHLTTHKIIH TGEKP YKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTH TGEKP FQCRICMRNFSDPGHLVRHIRTH AAAANFNQSGNIADSSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSPGWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKEISMAYPYDVPDYA S (서열번호: 227)

K8: DGAR－RDTN－QTHQ－RDTN 는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekpFQCRICMRNFSDPGALVRHIRTHTGEKPFQCRICMRNFSRSDTLSNHIRTHTGEKPYECHDCGKSFRQSTHLTQHRRIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDTLSNHIRTHAAAARGMHLEGRIM (서열번호: 228)

K9: RDHT－QTHQ－QSHT－DGNV 는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekpFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGEKPYECHDCGKSFRQSTHLTQHRRIHTGEKPYKCEECGKAFRQSSHLTTHKIIHTGEKPFQCRICMRNFSDSGNLRVHIRTHAAAARGMHLEGRIM (서열번호: 229)

K10: RDHT－QTHQ－QSHT 는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekp FQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTH TGEKP YECHDCGKSFRQSTHLTQHRRIH TGEKP YKCEECGKAFRQSSHLTTHKIIH AAAARGMHLEGRIM (서열번호: 230)

K11: RDHT－QSHV－QSHV 는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

MGKPIPNPLLGLNSTQAMGAppkkkrkvgiripgekp FQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTH TGEKP YECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTH TGEKP YECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTH AAAARGMHLEGRIM (서열번호: 231)

동일한 일반 모티프(예: 4개의 DNA 접촉 잔기의 세트)를 가진 징크 핑거 도메인을 2개, 3개 또는 그 이상 포함하고, 상기 어떤 단백질과도 동일한 일련의 순서로 정렬된 나머지 징크 핑거 단백질들도 진균 세포에 약제 저항성을 또한 부여할수 있다.

어떤 클론들은 징크 핑거 도메인과 유사한 구조를 포함한다. K2, K3 및 K4의 제1 및 제2 핑거는 서로 동일하다. 이러한 클론에서는, 4개의 핑거 중 3개가 다른 단백질의 상응되는 위치에 있는 핑거와 동일하였다. 이들 ZFP들의 관계가 단지 우연은 아닐 것이다(P ＜ 1.6×10^－5). 따라서, K2, K3 및 K4 ZFP는 생체 내 동일한 표적부위에 결합하며 동일한 표적 유전자를 조절할 것이다.

추가적으로, K10 클론에 의해 코딩되는 징크 핑거 단백질은 K9 및 K11 클론에 코딩된 것과 밀접한 관련이 있다. K9, K10 및 K11에서 발견된 QTHQ, QSHT 및 QSHV 핑거는 동일한 3－bp DNA 부위를 인식할 수 있다: 5'－HGA－3'. 그들의 구조적으로 유사하다고 가정할 때, K9, K10, K11 ZFPs는 생체내에서 동일한 표적에 결합하고 동일한 유전자들을 조절할 것이다. 관계된 클론(예: K2, K3, K4; 그리고 K9, K10, K11)들에서 각 두군을 가진 모든 ZFP는 조절 특성의 동일한 유형을 포함한다. K2, K3, K4 클론은 각각 Ume6 억제 도메인을 포함한다. K9, K10 및 K11클론은 전용 전사 조절 도메인이 없이도 각각 기능한다.

두 개 이상의 ZFP가 세포로 공동형질전환될 때는 상가적 또는 추가적 효과가 나타날 수 있다. 예를 들어, K4 및 K5 ZFP가 공동－발현될 때, 효모세포는 케토코나졸에 대한 완전한 저항성이 되었다. 조합은 대략 1,000배의 표현형질 증대를 만들어 냈다.

ZFP 돌연변이들은 DNA 접촉 잔기를 변화시키거나 조절도메인을 치환하여 제작되었다. 하나의 돌연변이(VSSR－DGAV－VSSR－VDYK－GAL4AD)에서, K5의 제2 징크 핑거의 아스파라진 DNA와 접촉 잔기는 알라닌으로 돌연변이 되었다. 겔 이동 분석은, 이러한 돌연변이된 ZFP의 예상 DNA 부위에 대한 결합력이 10－배 이상 감소함을 나타내었다. 이러한 돌연변이 K5 단백질은 효모세포에 약제 저항성을 부여하지 않는다. 다른 돌연변이에서는, K5 징크 핑거 단백질의 Gal4 활성화 도메인을, 이를 코딩하는 DNA 서열 앞에 종결 코돈을 삽입하여 삭제하였다. 이러한 단백질 역시 케토코나졸 저항성을 부여하지 않는다. 유사한 결과들이 다른 케토코나졸 저항성 ZFP에서도 얻어졌다.

K5 ZFP에 융합된 활성화 도메인이 Ume6 억제 도메인으로 치환되면, Ume6－형 단백질은 케토코나졸 저항성 표현형을 역행했다. Ume6－형 단백질을 발현하는 세포는 대조 세포에 비해 케토코나졸에 더욱 민감하였다. 이러한 결과는, 원하는 표현형 효과를 갖는 전사인자를 만들어 내기 위해, 표현형을 악화시키는 전사인자를 선별하고 접합 조절 도메인(예: 기능적 방향성의 전환(switching))을 변형시킴으로써, 전사인자를 선별할 수 있다는 것을 나타낸다. 원하는 형질과 반대되는 반대 형질에 대한 스크리닝은 원하는 표현형 자체를 스크리닝하는 것보다 더 용이할 수 있다. 기능적 방향성을 전환하는 치환의 예로는 하나의 조절 도메인형을 다른 형 또는 다른 조절도메인으로 치환하는 것 및 조절도메인을 제거하는 것이 포함된다. K5 ZFP의 경우, 약제 민감성을 증대시키는 단백질은 약제 저항성을 증가시키는 단백질을 스크리닝하고, 그 전사 활성화 도메인을 전사 억제 도메인으로 치환하여 수득되었다.

약제저항 표현형에 연관된 유전자를 동정하기 위해 DNA 미세배열분석이 사용되었다. 본 발명자들은 동일한 표현형을 부여하는 상이한 ZFP들이 직접적 또는 간접적으로 표현형과 관계된 상이한 발현을 갖는 동정 유전자 세트를 조절할 것이라 추론하였다. 3개의 ZFP－－K5, K6 및 K7－－는 발현 프로필 분석을 위해 선택되었다. 이 세 전사인자들은 Gal4 활성화 도메인을 포함한다. 효모의 6400개 오픈 리딩 프레임 중, 10개가 최소한 2개의 상이한 ZFP 전사인자들에 의하여 2배 이상 활성화 되었으며, 4개의 활성화된 오픈 리딩 프레임은 시험된 3개의 모든 ZFP 전사 인자에 의해 활성화되었다. 4개의 오픈 리딩 프레임들은 YLL053C, YJR147W, YLL052C 및 YPL091W.

표 7은 최소 하나 이상의 키메라 ZFP에 의해 조절된 유전자의 수를 나타낸다.

케토코나졸을 세포 외로 배출한다고 알려진 PDR5는 2개의 ZFP인 K6 및 K7에 의해 활성화되었으며, K5에 의해서는 활성화되지 않았다. 이러한 결과는 K5가 PDR5－무관한 기작으로 케토코나졸 저항성을 부여하며, 효모에서 케토코나졸 저항성을 유발하는데 최소 2개의 경로가 관여함을 나타낸다. 하나의 경로는 PDR 활성에 좌우되지만, 다른 하나는 PDR5와 무관하다.

약제저항 표현형과 관련된 새로운 유전자를 동정하기 위해, 본 발명자들은 세 개의 시험된 ZFP 전사 인자 모두에 의해 활성화된 4개의 유전자중 하나를 과발현하는 세포의 약제저항 표현형을 분석하였다. 본 발명자들은 유전자 중 하나－－YLL053C－－가 그 유전자의 과발현 시 케토코나졸 저항성을 유발하는 것을 발현하였다. 상기 표 6에 나타난 YLL053C는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 세포막 및 수분 통로(water channel) 단백질과 상동이다. YLL053C의 아미노산 서열은 다음과 같다:

MWFPQIIAGMAAGGAASAMTPGKVLFTNALGLGCSRSRGLFLEMFGTAVLCLTVLMTAVE

KRETNFMAALPIGISLFMAHMALTGYTGTGVNPARSLGAAVAARYFPHYHWIYWISPLLG

AFLAWSVWQLLQILDYTTYVNAEKAAGQKKED (서열번호: 232)

칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 수분 통로 1 단백질(AQY1)의 아미노산 서열은 다음과 같다:

MVAESSSIDNTPNDVEAQRPVYEPKYDDSVNVSPLKNHMIAFLGEFFGTFIFLWVAFVIA

QIANQDPTIPDKGSDPMQLIMISFGFGFGVMMGVFMFFRVSGGNLNPAVTLTLVLAQAVP

PIRGLFMMVAQMIAGMAAAGAASAMTPGPIAFTNGLGGGASKARGVFLEAFGTCILCLTV

LMMAVEKSRATFMAPFVIGISLFLGHLICVYYTGAGLNPARSFGPCVAARSFPVYHWIYW

VGPILGSVIAFAIWKIFKILKYETCNPGQDSDA (서열번호: 233)

YLL053C 유전자 생성물은 PDR5 유전자 생성물과 마찬가지로 케토코나졸을 세포외로 배출하는 작용을 통하여 저항성을 부여한다. 이러한 결과는, 표현형의 변화와 연관된 유전자들이 세포의 유전자 발현 프로필 분석에 의해 동정될 수 있다는 것을 나타낸다. 유전자 동정은 또한 동일한 표현형(본 실시예에서, 케토코나졸 저항성)을 유발하는 서로 다른 키메라 ZFP의 사용에 의해서도 도움을 받는다.

실시예 4: 열저항성 형질전환체 스크리닝

본 발명에서는 효모 세포에 열저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 핵산을동정하기 위해, 키메라 징크 핑거를 코딩하는 라이브러리를 스크리닝하였다.

3－핑거 라이브러리의 핵산을 함유하는 1×10⁷효모 세포들을 2％ 갈락토스를 함유하는 SD 합성 배양액에서 30℃, 3시간 동안 배양한 후 52℃에서 2시간 동안 천천히 회전배양 하였다. 열처리 후, 배양액을 갈락토스 배지에 깔았고, 이를 30℃에서 5일 동안 배양하였다. 성장 효모 콜로니는 열저항 표현형을 확인하기 위해 갈락토스 배양액에 희석시켜 52℃에서 2시간 동안 배양시켰다. 이 세포들의 플라스미드를 분리하여 상기의 방법대로 효모에 재형질전환시켰다. 재형질전환체들은 30℃ 갈락토스 배양액에서 3시간 동안 배양된 후, 52℃에서 2시간 동안 배양되었다. 배양된 재형질전환체들은 SD 갈락토스 아가 플레이트에 4단계로 희석되어 스팟되었다. 열 저항성이 돌연변이체의 징크 핑거 단백질 발현에 의해 유도되었음을 확인하기 위해, 재형질전환체들을 상기와 동일한 조건의 SD 글루코스 배양액에서 배양시킨 후 SD 글루코스 아가 플레이트에 스팟시켰다. pYTC 벡터의 형질전환체 및 무작위－선택된 3－핑거 단백질을 코딩하는 플라스미드를 대조군으로 사용되었다.

열저항 효모 세포들은 징크 핑거 단백질 발현 플라스미드로 형질전환된 세포들로부터 동정되었다. pYTC－Lib 플라스미드 또는 무작위－선정된 징크 핑거 단백질을 코딩하는 플라스미드를 함유하는 야생형 세포들은 음성 대조군으로 사용되었다. 총10⁷세포가 갈락토스 배양액에서 증식되었다. 갈락토스는 징크 핑거 단백질의 발현을 유도하였다. 세포들은 52℃에서 2시간 동안 열처리 된 후 최소 갈락토스 아가 플레이트로 옮겼다. 30℃에서 5일간 배양한 후, 26개의 콜로니가 플레이트에서성장했다. 본 발명자들은 이 콜로니들로부터 플라스미드를 회수하고 YPH499a로 재형질전환 시켰다. 이로부터 다양한 정도의 열저항성을 나타내는 9개의 클론을 분리하였다. 전형적으로, 이러한 클론들의 징크 핑거 단백질 발현은 열처리 후 갈락토스 배지에서는 세포의 10％이상이 생존하도록 유도되었으나 글루코스에서는 유도되지 않았다. 대조 플라스미드로 형질전환된 세포에서는 단지 0.3％만이 동일 조건에서 생존하였다. 신규－성장 형질전환 세포들은 동결 보관된 세포들보다 실험조건에서 잘 생존하였다. 이러한 결과들은 특정 징크 핑거 단백질의 발현이 효모세포에서 열저항성을 유도할 수 있음을 나타낸다. ZFP들은 회수된 라이브러리 플라스미드의 DNA 염기서열 분석으로 확인되었다(표 8).

실시예 5: 신경돌기 생성

본 발명자들은 신경세포 타입으로 분화될 수 있는 생쥐 뉴로블라스토마 (neuroblastoma) 세포주 Neuro2A에서 신경돌기형성을 유도하는 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 찾기 위해 핵산 라이브러리를 스크리닝 하였다. 본 발명자들은 세포의 형태의 변화 및 신경 표지 유전자의 발현에 의해 증명함으로써 신경분화를 유도하는 신규한 키메라 ZFP를 발견하였다.

재료 및 방법

라이브러리 제작

상기 실시예 1에 명시된 바와 같이, 3－핑거 및 4－핑거 ZFP－Tf 라이브러리들을 각각 40개 및 25개의 징크 핑거 도메인들을 사용하여 제작하였다. 3－핑거와 4－핑거 라이브러리는 각각 대략 9－ 및 12－bp DNA 결합자리를 인식한다. ZFP들은 p65 전사 활성화 도메인 및 KRAB 억제 도메인과의 융합단백질로 발현되었다.

Neuro2A 세포배양과 신경분화

생쥐 뉴로블라스토마 neuro2A 세포는 10％ FBS와 항생제를 포함하는 MEM－α 배제에서 37℃, 95％ 대기와 5％ CO₂의 습한 대기상태로 배양되었다. 세포는 96－웰 플레이트의 웰 당 8.0×10³세포가 되도록 분주하였고, 리포펙타민 플러스 시약(LIPOFECTAMINE PLUS™ reagent)(Invitrogen, CA)을 사용하여 ZFP 50 ng 및 LacZ 표지 플라스미드 20 ng을 함께 제조사의 방법에 따라 형질감염시켰다. 시험관내 분화는 레티놀산(RA)(10 uM)을 첨가 또는 첨가하지 않은 조건에서 수행되었고, 형질감염되지 않은 세포들의 수를 감소시키기 위해 G418(1 ㎎/㎖)을 형질전환 24시간 후에 처리하였다. 세포들은 96시간 동안 배양된 후 고정되었고, β－갈락시토다제(β－galactosidase) 활성을 보기 위해 염색 후 사진 촬영되었다. β－갈락시토다제－양성 세포들 중, 신경돌기의 길이가 세포체의 직경보다 최소 2배 이상 확장된 경우 분화된 세포로 간주되었다.

결과 및 고찰

신경돌기 생성을 유도하는 ZFP－TF의 스크리닝

신경분화를 유도하는 ZFP－TF를 스크리닝하기 위해, Neuro2A 세포들을 라이브러리 플라스미드 및 LacZ 유전자를 포함하는 표지 플라스미드로 임시 형질감염시켰다. LacZ 발현은 형질감염된 세포들의 형태를 시각화하는데 이용되었다. 분화하는 세포들은 분화하지 않는 세포들보다 천천히 성장하며 분화하지 않는 세포가 세포집단에서 우세해지므로, 형질감염되지 않은 세포를 제거하기 위해 형질 감염 후 24시간에 배양세포에 G418을 처리하였다. 5일 후, 세포들을 고정시켜 LacZ－염색 하였다. 그 후, 세포 형태적 특징에 따라 세포들을 분류하였다. 특히, 본 발명자들은 신경돌기의 길이 및 굵기가 증가한 세포들을 동정했다.

본 발명자들은 신경돌기생성을 변화시키는 몇몇 ZFP－TF을 동정하였다. 이 ZFP－TF들은 다양한 정도로 신경돌기생성에 영향을 주었다. Neuro1－p65로 명명된 ZFP－TF는 유도되는 신경돌기의 길이와 두께의 측정값으로 볼 때 분화에 가장 탁월한 효과를 보였다. 또한, Neuro1－p65－형질감염된 Neuro2A 세포의 신경돌기생성 증대를 나타내는 표지는 10 uM RA(레티놀산)로 세포를 처리했을 때도 관찰되었다.

Neuro1－p65를 코딩하는 핵산 서열 및 아미노산 서열은 도 14에서 볼 수 있다. Neuro1－p65 핵산은 QSNR1－QSNK－CSNR1 징크 핑거 도메인들을 유도하는 키메라 ZFP를 코딩한다. 같은 모티프를 갖는 다른 ZFP 및/또는 Neuro1－p65의 결합 부위에 최소한 부분적으로 겹치는 부위에 결합하는 ZFP 또한 분화를 조절할 것으로 예측되었다. 징크 핑거－DNA 결합 부위 목록(표 6을 참조)에 의거하면, Neuro1의 예상되는 결합 부위는 5'－GACGAAGAA－3' 이다.

신경돌기 생성을 유도하기 위하여 Neuro1－p65는 p65 활성화 도메인을 필요로 한다. KRAB 전사 억제 도메인과 융합되었거나, 어떤 조절도메인을 갖지 않는 동일한 징크 핑거 도메인은 신경돌기생성을 유도하지 않는다. 도 8 및 표 9를 참조. 또한 신경돌기생성을 유도하는 능력을 잃어버린 Neuro1－p65(Neuro1－p65mut)의, 징크 핑거 도메인이 갖는 DNA 결합 능력을 상실했을 것으로 예상되는 돌연변이들로 인해, Neuro1－p65의 DNA 결합 능력은 중요하다.

세포에서 Neuro1－p65가 발현되는 동안 신경 표지 유전자들의 발현수준을 나타내기 위해 실시간(Real－time) PCR을 사용되었다. 유사하게, RA－처리된 세포와 ZFP－TF로 처리된 세포들 간의 분화과정의 다양한 시간 포인트 별 유전자 발현 패턴을 비교하기 위해 핵산 미세배열분석을 사용하였다. Neuro1－p65는 최소한 시험관 내에서, 뉴로블라스토마 세포가 분화하는데 필수적인 경로를 활성화시킬 것이다.

실시예 6: 골세포생성

C2C12세포는 근육모세포(myoblast) 계열로부터 유래되었으나, 골형성단백－2 (BMP－2)(Katagiri, T. 등, (1994)J. Cell. Biol.127, 1755)의 첨가 하에 조골세포(osteoblast)로 분화될 수 있다. 몇몇 천연형 전사 인자들이 이러한 과정을 통제하는 후보자로 동정되었다 (Lee, K.－S. 등, (2000)Mol. Cell. Biol.20:8783; Nakashima, K. 등, (2002)Cell108:17).

본 발명자들은 BMP－2가 존재하지 않을 때 C2C12 근육모세포로부터 조골세포로 전환분화(transdifferentiation) 하도록 유도하는 키메라 징크 핑거 단백질을 스크리닝 하였다. 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 라이브러리 핵산을 C2C12 세포에 임시로 형질전환시키고, BMP－2가 없는 조건에서 전환분화하는 세포를 스크리닝 하였다. 형질감염 후 7일에 형질전환된 세포들은 조골세포의 표지인 알칼린 포스파타제(ALP)(Katagiri, T. 등, (1994)J. Cell. Biol.127:1755)로 염색하였다.

약 2000개의 ZFP－TF들의 스크리닝으로부터, 약 30％의 세포에서 강한 ALP 염색을 유도하는 1개의 활성화 단백질 Osteo1－p65를 동정하였다. ALP로 염색된 세포들의 백분율은 LacZ 염색에 의해 검출되는 형질감염된 세포의 백분율과 유사하였다. 이러한 결과들로부터, 본 발명자들은 Osteo1－p65 전사인자가 BMP－2 없이 C2C12 근육모세포로부터 조골세포로 전환분화를 촉진시킬 수 있음을 결론지었다.

양성 대조군으로는, 세포에 1 ㎍/㎖의 BMP－2를 처리하였다. 거의 100％의 양성 대조군 세포들은 BMP－2 처리에 따라 강한 ALP 염색을 보였다. BMP－2를 처리하지 않고, 대조 벡터로 형질전환시킨 음성 대조군 세포들은 단지 배경 염색만 되었다. Osteo1－p65은 RDKR－QTHR1－VSTR－RDKR 징크 핑거 도메인(N－말단에서 C－말단으로)으로 이루어진 4－핑거 단백질이다. 도 15를 참조. 이 단백질은 DNA 구성요소 5'－GGGGCWRGAGGG－3'(서열번호: 234)을 인식하는 것으로 예측된다.

이러한 실험들에서, 마우스 근육모세포 세포주인 C2C12는 4.5 g/L 글루코스, 10％ FBS 및 항생제를 포함하는 둘베코의 변형 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM)에서 37℃, 95％ 공기 및 5％ CO₂를 포함하는 습한 대기조건으로 유지되었다. 세포들은 96－웰 플레이트 당 1.0×10⁴세포로 분주되었다. 세포는 리포펙타민 플러스(LIPOFECTAMINE PLUS™, Invitrogen)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 라이브러리 핵산 50 ng을 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간에, 성장 배지는 2％ FBS를 함유하는 DMEM으로 대체되었고, 세포들은 추가로 6일 동안 배양되었다.

C2C12세포가 조골세포로 분화되는지를 알아보기 위해, Katagiri, T. 등, (1994)J. Cell. Biol.127:1755 에 나타난 대로 ALP 염색이 수행하였다.

요약하면(실시예 5 및 6에 따라), 두가지 상이한 세포 분화 과정을 유도할 수 있는 단백질을 찾기 위해 인공 전사 인자 라이브러리를 스크리닝하였다. 다시 말하면, 이 방법은 특정 줄기세포의 생물학적 지식을 필요로 하지 않는다.

실시예 7: 인슐린 조절

본 발명자들은 키메라 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산을 인간 293 세포주에 안정하게 형질감염시켰고, 형질전환된 세포들에 대한 DNA 미세배열분석을 사용하여 각각의 키메라 징크 핑거에 의해 조절된 유전자들을 분석하였다(도 4, 5 및 9를 참조). 본 발명자들은 인간 인슐린 유전자의 발현을 60배 이상 증가시키는 키메라 징크 핑거 단백질(08_D04－p65)을 동정하였다.

08_D04－p65가 상이한 인간 세포주에서 인슐린 유전자의 발현을 유도하는지 여부를 확인하기 위해, 08_D04－p65를 코딩하는 핵산을 Hela 세포에 임시 형질전환시켰으며, HeLa 세포의 핵산 발현이 인슐린 유전자 발현을 80배로 증가시킴을 확인하였다.

따라서, 08_D04－p65, 그의 유도체 및 기능적으로 유사한 징크 핑거 단백질들은 당뇨병의 치료제로 사용될 수 있다. 08_D04－p65 또는 기능적으로 유사한 징크 핑거 단백질들을 코딩하는 DNA를 당뇨병 환자에게 바이러스성 운반 또는 캡슐화된 형태(예: 리포좀)로 전달시킬 수 있다. 일단 DNA가 세포에 전달되면, 징크 핑거 단백질은 발현되어 인슐린의 생산을 유도할 수 있다. 어떤 실시태양에서는, 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산이 Tet－유도성 프로모터와 같은 유도 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수도 있다. 유도물질로서 독시사이클린을 사용하여, 소량의 화학물질로 인슐린 생산 수준을 조절하는 것이 가능하다. 08_D04－p65 같은 인슐린－유도성 징크 핑거 단백질은 상이한 인간 세포주에서 작용할 수 있기 때문에, 췌장세포(예: 베타세포와 비－베타세포) 및 비－췌장세포 모두에서 작용할 수도 있다.

인슐린의 효소의 발현 공정 효소를 유도하는 인공전사인자를 동정하는 것도 역시 가능하다. 세포들은 이런 전사인자 및 인슐린 유전자를 유도하는 전사인자, 예: 08_D04－p65를 유도하는 전사인자를 발현하도록 조작될 수 있다. 추가적으로, 인슐린－유도 징크 핑거 단백질들은 생체 외 세포 치료에 사용될 수 있다. 하나의 예로, 환자의 세포를 인슐린－유도 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산의 도입으로 인해 시험관 내에서 변형시킬 수 있다. 변형 세포들은 이후 환자 또는 다른 대상동물에게 이식 될 수 있다.

재료 및 방법

ZFP－TF를 발현하는 세포주의 DNA 마이크로배열 분석

징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산은 FlpTRex－293 세포주(Invitrogen)에 제조사의 방법대로 안정하게 도입되었다. 간략히, pLFD－p65 또는 pLFD－Kid 벡터로부터 절단된 HindIII－XhoI 절편을 pCDNA5/FRT/TO (Invitrogen CA)에 서브클로닝시켰다. 이 절편은 징크 핑거 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 결과물로 얻어진 플라스미드는 FlpTRex－293 세포로 pOG44와 함께 형질감염시켰다. 독시사이클린의 유도 하에 ZFP－TF를 발현하는 안정적 삽입 세포가 얻어졌다.

7458 인간 EST 클론을 포함하는 DNA 미세배열분석 지노믹트리(Genomictree, 대한민국)에서 구입되었다. ZFP－TF를 안정하게 발현하는 FlpTRex－293 세포들은 1 ㎍/㎖ 독시시이클린 존재하(＋Dox) 또는 비존재하(－Dox)에 48시간 동안 배양되었다. 총 RNA는 각각의 시료로부터 준비되었다. -Dox 시료로부터 얻어진 RNA는 표준(Cy3)으로, ＋Dox는 실험 시료(Cy5)로 사용되었다. 미세배열분석은 제조사의 방법에 따라 수행되었다. 중간 값의 합이 500 이하인 점은 적색으로 표기되고 분석되지 않았다.

특정 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산은 HeLa 세포에서도 발현되었다. 08_D04 ZFP을 함유하는 pLFD－p65는 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)™2000(Invitrogen)을 사용하여 Hela 세포에 임시 형질감염시켰다. 징크 핑거 단백질을 코딩하지 않는 pLFD－p65 벡터는 대조군으로 동등하게 세포들에 형질감염시켰다.

실시예 8

포유류 세포에서 표지 유전자의 발현을 변화시키는 단백질의 코딩 핵산을 동정하기 위해 키메라 징크 핑거를 코딩하는 라이브러리를 스크리닝 하였다.

라이브러리의 제작

4개 및 3개의 핑거 단백질로 변형 pcDNA3 벡터인 P3에 두 종류의 ZFP 라이브러리가 제조되었다. 이러한 라이브러리의 제작은 상기의 방법에 따랐다.

ZFP 플라스미드에 의한 형질전환

인간 배아 신장 293 세포는 95％ 공기 및 5％ 이산화탄소를 함유하는 습한 대기 조건에서 10％ FBS의 100 ㎕ DMEM으로 배양되었으며, 96웰 플레이트의 웰에 분주하여 형질감염 전 하루까지 키웠다. 플라스미드는 각 라이브러리의 개별적 콜로니들로부터 각각 분리하여 리포펙타민 플러스(인비트로젠)로 제조자의 방법에 따라 293 세포로 형질전환시켰다. MTT 분석을 위해, 기능 도메인이 융합된 징크 핑거 단백질 유전자를 포함하는 50 ng의 플라스미드를 웰 당 5×10³세포로 배양된 세포에 형질감염시켰다. SEAP 분석을 위해, 10 ng의 pSEAP2－대조(클론텍) 플라스미드를 웰 당 1×10⁴세포로 배양된 세포에 기능 도메인이 융합된 징크 핑거 단백질 유전자를 포함하는 50 ng의 플라스미드와 같이 형질감염시켰다. 형질전환한 세포는 분석 전 3일 동안 37℃에서 배양되었다.

SEAP 분석

형질감염 후 3일에, 배지를 새 튜브로 옮기고, 65℃에서 30분 동안 열처리하여 내생 알칼린 포스파타제를 불활성화 시켰다. 25 ㎕의 배지를 2×SEAP 분석 완충액(2 M 다이에타놀아민(pH 9.8) 10 ㎖, 1 M MgCl₂10 ㎖, 1 M 호모아르기닌 200 ㎖,파라－니트로 페닐 인산 44.52 ㎎)과 동량으로 혼합시켰다. 37℃에서 지시된 시간 동안 배양한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

루시퍼라제 분석

루시퍼라제 분석을 위해서, 각각 5 ng의 CMV－루시퍼라제 및 pRL－SV40 플라스미드를 50ng의 ZFP 코딩 플라스미드와 함께 96 웰 플레이트에 키운 293 세포로 공동－형질감염시켰다. 3일간 배양 후, 세포를 모았으며 듀얼 루시퍼라제 리포터 분석 시스템(프로메가)을 사용하여 제조사의 방법대로 루시퍼라제 분석을 수행하였다.

MTT 분석

MTT 분석은 세포 성장을 측정하는데 사용된다. 대사활성이 있는 세포에 의해 환원된 테트라졸륨 MTT(tetrazolium MTT)는 노란색으로 변한다. 노란색에 의한 흡광도 측정치는 살아있는 세포의 개수를 나타낸다. MTT 분석은 MTT 분석 키트(트라비젠)를 이용하여 수행하였다. MTT 분석은 형질감염 후 3일에 수행하였다. 간단히 설명하면, 10 ㎕의 MTT 용액을 직접 세포 배양액에 첨가하고 이산화탄소 배양기에서 두시간 동안 배양시켰다. 그 후, MTT 분석 키트로부터 100 ㎕의 결정용액(detergent)을 첨가하여 두시간 동안 암실에서 배양시킨 후 파워－웨이브 340x(바이오－텍 기계)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포수를 확인하기 위해, 293 세포를 24웰 플레이트에 1.5×10⁴세포/웰로 형질감염 하루 전에 분주하였다. ZFP－코딩 핵산 또는 대조 벡터 플라스미드 200 ng을 형질감염시킨 후 3일 뒤, 세포를 PBS로 한번 세척하고, TE(10 mM 트리스 1 mM EDTA, pH 8.0) 완충액 30 ㎕에 희석시킨 다음 헤마사이토미터(hemacytometer)로 측정하였다.

결과

단백질 생산성의 변화

핵산 라이브러리가 이종 핵산의 발현을 변화시킬 수 있는지를 알아보았다. ZFP가 세포 내에서 생산되는 외부 단백질의 양에 영향을 줄 수 있는지를 알아보기 위해 SEAP(분비성 알칼린 포스파타제)을 표지 단백질로 사용했다. 표 10은 81개 웰로부터 얻어진 대표적인 결과를 보여주는데, 각 웰은 라이브러리로부터 무작위로 선택된 키메라 ZFP를 코딩하는 핵산으로 형질감염시킨 세포를 포함하며, 세 개의 웰은 대조군 벡터로 형질감염된 표준 세포를 포함한다. 몇몇 웰은 무작위 ZFP를 코딩하는 핵산으로 형질감염시킨 세포를 포함하는 웰 및 대조 벡터로 형질감염시킨 세포를 포함한 웰에 비해 증가된 흡광도를 보였다.

p65 도메인에 융합된 한 징크 핑거 단백질인 P_B08이 가장 높은 SEAP 활성을나타낸다. 이러한 ZFP는 세 개의 구분되는 형질감염에서 SEAP 플라스미드로 형질감염시켜 재확인되었다. 표 11은 그 같은 재확인 중 하나의 결과를 나타낸다. 이 분석에서의 P_B08에 대한 P 값은 0.008이다. P_B08은 모 플라스미드에 비해 약 16배로 증가된 SEAP 활성을 나타낸다.

SEAP 분석은 외부 단백질의 생산을 분석하는 데 사용하였으므로, 관찰된 SEAP 활성의 증가에 대한 원인은 다양할 수 있는데, 예를 들면, pSEAP2－대조 플라스미드의 SEAP 유전자 발현에 이용된 SV40 프로모터의 직접적 또는 간접적 활성화일 수 있다. 다른 이유는 다음을 포함한다: 분비 경로에 관계하는 단백질의 작용의 증대된 활성 또는 단백질 생산에 관련된 일반적인 기작의 활성화. SEAP의 증가된 활성의 기작은 다른 리포터 단백질(예: 비분비 리포터) 및 다른 프로모터에 연결된 리포터와 같은 다른 단백질의 생산에 대한 p_B08의 효과를 결정함으로써 밝혀낼 수 있다.

이것을 조사하기 위해, 293F 세포에서 CMV 프로모터의 조절 하에 있는 SEAP리포터(CMV－SEAP)를 사용하여 광범위한 스크리닝을 수행하였다. SEAP 단백질의 활성을 증가시키는 두 개의 ZFP인 K44_11_D01 및 K44_11_G12를 분리시켰다. 이러한 두 ZFP는 두 개의 다른 표지 플라스미드인 SV40－SEAP 및 CMV 프로모터 조절 하에 있는 루시퍼라제(CMV－Luc)를 이용하여 또한 확인하였다. 표 12가 그 결과의 일부를 나타낸다. K44_11_D01 및 K44_11_G12는 모 플라스미드(벡터)와 비교하여 약 3배로 증가된 SEAP 활성을 나타내었다. K44_11_D01은 SV40－SEAP의 활성을 나타냈으나, CMV－루시퍼라제는 나타내지 않았으며, 이는 상기 활성화가 분비 같은 SEAP에 특이적인 기작과 연관되어 있음을 시사한다. 대조적으로, K44_11_G12는 SV40－SEAP 및 CMV－루시퍼라제 둘 다에 대해약 2 내지 3배의 증가된 활성을 나타냈는데, 이는 그 기작이 프로모터 또는 리포터에 특이적이지 않음을 암시한다. 그러므로, K44_11_G12는 진핵세포와 같은 세포에 단백질 생산을 일반적으로 증가시키는 데 사용될 수 있다.

징크 핑거 단백질인 K44－16－E12(도 25) 및 K12_A11(도 24)는 CMV－SEAP 및 SMV－Luc 발현에 의해 표시된 대로 단백질 생산을 변화시킬 것이다.

비슷한 예로, 사이클린 D1의 과발현이 어떤 단백질의 생산을 증가시키는 것으로 보고되었다(미국 특허 제 6,210,924 B1호). 징크 핑거 단백질의 효과가 다양한 범위로 달라지거나 더 강력할 지도 모르지만, 사이클린 D1의 발현을 직접적 또는 간접적으로 활성화시키는 징크 핑거 단백질은 단백질 생산을 상향－조절할지 모른다. 사이클린 D1의 과발현과 비슷한 생리적 효과를 초래하는 다른 징크 핑거 단백질이 이러한 분석에 의해 분리될 수도 있다. 그러한 징크 핑거 단백질은 표적 단백질의 생산 증가에 이용될 수 있다.

세포 성장 속도 변화

kid 도메인에 결합된 두 ZFP인 K_D10 및 K_F02는, MTT 분석 결과를 근거로 대조군과 비교 시 최대 변이를 나타내기 때문에, 세포 성장을 조절하는 대표적 ZFP로 선별되었다. MTT 분석 결과를 확인하기 위해, 293 세포에 K_D10 및 K_F02를 형질감염시킨 후 세포 수를 확인하였다. 이러한 결과는 모 벡터로 형질감염시킨 웰의 세포수와 비교하여 상대적인 백분율로 전환시켰으며 표 13a에 나타냈다. 모 벡터와 비교하여, 대조군과 비교된 세포 성장 활성에서 K_D10은 약 3－배의 저해를 나타냈으며, K_F02는 약 2.7배의 활성화를 나타냈다. K_D10 및 K_F02에 대한 P 값은 각각 0.001 및 0.01이었다. 서열 정보를 위해, 도 18 및 19를 참조.

세포 성장 속도 변화

본 발명자들은 세포 성장 및 증식 속도를 변화시킬 수 있는 징크 핑거 단백질을 동정하였다. 이러한 중요 표현형은 암 및 바이러스 감염과 같은 질병 및 발달 과정과 연관되어 있다. 세포 성장 및 증식을 조절하는 징크 핑거 단백질의 능력은, 세포자가사멸(apoptosis) 조절, 세포 분화, 숙주세포 방어(예: 바이러스 감염에 대한) 및 p53－매개 신호 전달을 포함한다.

이러한 형질 중 하나 이상을 만들어 내는 징크 핑거 단백질은 직접 또는 간접적으로 세포 성장 또는 신호전달을 조절하는 유전자를 조절한다. 상기 특정 징크 핑거 단백질은 MTT 분석에 의해 검색된 것과 같이 세포성장에서 검색될 만한 효과를 만들어낸다. 예를 들면, 두 징크 핑거 단백질은 대조군과 비교하여 최소한 두 배의 세포 성장 차이를 나타냈다. 이 분석이 임시 형질감염 후 3일된 세포에서 관찰된 점을 고려하면, 이 두 배 차이는 의미 있다. 덧붙여, 세포수의 변화는 MTT 분석을 사용하여 검색된 차이점이 분석에 특이한 것이 아니라는 것을 확인시킨다.

세포 성장이 이렇게 세포 생리의 중요한 변수이므로, 이 실험은, 세포 성장을 조절하는 충분히 많은 수의 징크 핑거 단백질을 분리하기 위해, 대규모 스크리닝으로 확대될 수 있다. 이러한 각 징크 핑거 단백질을 발현하는 세포의 유전자 발현 패턴 프로파일링을 위해 cDNA 미세배열이 이용될 수 있다. 이 프로필은 세포 증식 또는 사멸에 관계하는 신규한 유전자 및 경로를 동정할 수 있다.

이러한 실험은 징크 핑거 단백질이, 세포증식을 바꾸는 경우에서처럼, 포유류 세포에서 다양한 표현형을 유도할 수 있음을 나타낸다.

실시예 9: 용매 저항성 박테리아 세포

인공 키메라 징크 핑거 단백질의 결과로 유기용매에 저항성을 나타내는 세포에서, 인공 키메라 징크 핑거 단백질을 발현하는 박테리아 세포를 스크리닝하였다. 서로 다른 세 개의 징크 핑거 단백질이 대장균 세포에 헥산(hexane) 저항성을 부여하는 능력으로 동정되었다(표 13b). 핵산 저항성은, 징크 핑거 단백질 중 하나－－HT－1, HT－2 및 HT－3－－를 발현하는 형질전환체의 생존률을 대조 세포의 생존률과 비교하여 분석하였다. 대조군 세포는 공벡터(empty vector)나 ZFP－1을 포함하였다. ZFP－1 구조체(construct)는 헥산(hexane) 저항성을 부여하지 않으며 RDER－QSSR－DSKR의 핑거를 포함하는 징크 핑거 단백질을 코딩한다. 헥산 저항성－부여 징크 핑거 단백질을 발현하는 박테리아 세포는 200배 증가한 헥산(hexane) 저항성을 나타냈다.

이러한 징크 핑거 단백질에 대한 발현 플라스미드는 IPTG－유도 프로모터를 포함한다. 각 헥산 저항성 유도 ZFP를 발현하는 형질전환체는 IPTG 유무에 의해 구별되었다. HT－2를 발현하는 형질전환체는 IPTG 존재 하에 더 높은 헥산 저항성을 보이는 데 반해, HT－1 또는 HT－3 발현 세포는 IPTG가 없어도 헥산에 저항성을 나타냈다.

대장균 발현을 위한 ZFP를 코딩하는 핵산 라이브러리의 제작.대장균에서만 징크 핑거 단백질을 발현하기 위해, 본 발명자들은 pYTC－Lib 효모 벡터에 클로닝된 징크 핑거 단백질을 pZL1에 서브클로닝 시켰다. pZL1은 pBT－LGF2(클론텍, 팔로 알토, CA)의 조작으로 제작되었다. Plac－UV5는 pBT－LGF2로부터 PCR(전방향 프라이머: 5'－GACA ACC GGT CAT CGA TAA GCT AAT TCT CAC－3' (서열번호: 236); 역방향 프라이머: 5'－TTG TCC ATG GAC GCT GTT TCC TG GTG AAA－3' (서열번호: 237))에 의해 증폭되었다. PCR 산물은 pYTC－Lib 벡터의 AgeI 및 NotI 사이 부위에 클로닝 되었다. 이 벡터를 pYTC－lac으로 명명하였다. pYTC－lac은 ClaI 및 NotI으로 절단하여 다음 요소를 포함하는 DNA 절편을 서브클로닝 하였다: Plac 프로모터－V5 에피토프－MCS. 전단된 DNA 절편은 젤－전기영동 후 분리하여 pBT－LGF2의 ClaI 및 NotI 사이 부위로 서브클로닝 시켰다. 결과 벡터를 pZL1으로 명명하였다. pYTC－Lib에 제작된 3F－ 또는 4F－ZFP 라이브러리는 EcoRI 및 NotI으로 절단시켰다. 절단된 DNA 절편은 겔－분리하여 pZL1의 EcoRI 및 NotI 사이 부위에 서브클로닝 시켰으며, 이로써 대장균 발현 라이브러리를 제공하였다.

용매 저항성 스크리닝.대장균 균주인 DH5α는 원핵 발현을 위해 맞춰진 3－핑거 또는 4－핑거 ZFP 핵산 라이브러리로 형질전환 되었다. 형질전환체는 클로람페니콜(34 ㎍/㎖) 함유된 LB에서 밤새 키웠다. 밤새－배양한 배지는 1 mM IPTG 및 클로람페니콜을 함유하는 1 ㎖ LB에 1:500으로 희석하여 ZFP 발현을 유도하였다. 30℃에서 3시간 동안 배양 후, 헥산을 1.5％로 첨가하고 급격히 볼텍싱(vortexing) 하여 헥산 및 대장균 배양액 에멀젼을 제조하였다. 혼합액을 37℃에서 3시간 동안 회전시켜(250 rpm) 배양하였으며, 클로람페니콜(34 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 플레이트에 분주하였다. 플라스미드는 성장한 콜로니 풀로부터 분리하였으며 DH5α로 형질전환시켰다. 그 후, 형질전환체에 상기의 방법대로 헥산처리 하였다. 헥산 저항성에 대한 선별은 두 번 더 반복되었다. 선별의 세 번째 단계 후 클로람페니콜(34 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 플레이트에서 자란 20개의 개별적 콜로니로부터 플라스미들를 회수하였다. 이 플라스미드를 DH5α로 재형질전환시켰다. 각 형질전환체는 상기의 방법대로 헥산－저항성에 대해 재확인되었다. 헥산 저항성을 유도하는 플라스미드들은 코딩하는 징크 핑거 단백질을 알아내기 위해 서열조사 하였다.

실시예 10: 열－저항 박테리아 세포

본 발명자들은 세포에 열 저항성을 부여하는 징크 핑거 단백질을 스크리닝하였다. 서로 다른 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산 라이브러리를 대장균 세포로 형질전환 시켰다. 이 세포들을 열에 노출시킨 뒤 열－저항성 세포를 회수하였다. 표현형 스크리닝의 세번째 단계 후 선택된 23개의 콜로니로부터 개별적으로 플라스미드를 분리하였다. 열 개의 상이한 징크 핑거 단백질이 동정되었으며(표 15), 열－저항성의 증대는 열처리 조건에서 ZFP 형질전환체 및 대조 세포인 C1 또는 ZFP－2의 생존률에 비교하여 분석하였다. C1 또는 ZFP－2는 각각 공벡터(empty vector) 또는 관계없는 ZFP(QTHT－RSHR－QTHR1)의 형질전환체를 의미한다. 50℃에서 두시간 동안 열처리 조건에서 99.99％ 이상의 야생형 세포가 죽었다. 대조적으로, 이러한 극한조건에서 어떤 ZFP－TF 형질전환체는 6％ 정도 생존하였는데, 이는 열저항성 표현형이 700배 증가한 것을 나타낸다－－즉, 스트레스 조건에서 생존한 ZFP－TF 발현세포의 백분율 (6.3％)을 같은 조건에서 생존한 C1의 백분율(0.0085％)로 나눈 값이다. ZFP 발현은 IPTG에 의해 유도되므로 열－저항성을 유도하는 ZFP의 형질전환체를 IPTG 유무하에서 그 표현형을 분석하였다. T－1 또는 T－10 형질전환체는 IPTG 존재하에서 더 높은 열－저항성을 보였다.

열저항성 스크리닝.원핵세포 발현용 라이브러리는 상기 실시예 9의 방법대로 제작하였다. 대장균 균주 DH5α를 3－핑거 또는 4－핑거 ZFP 라이브러리로 형질전환 시켰으며, 클로람페니콜(34 ㎍/㎖)이 함유된 LB에서 밤새 배양시켰다. 밤새 키운 배양액을 1 mM IPTG 및 클로람페니콜(34 ㎍/㎖)을 함유하는 1 ㎖의 신선한 LB에 1:500으로 희석하여 ZFP 발현을 유도하였다. 이를 30℃에서 3시간 동안 배양한 후, 100 ㎕을 마이크로－원심분리 튜브로 옮긴 후, 50℃ 수조에서 두시간 동안 배양시켰다. 배양액을 클로람페니콜(34 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 플레이트에 깔았다. 자라난 콜로니 풀로부터 플라스미드를 분리하여 DH5α로 형질전환시켰다. 열저항성 선별은 재형질전환으로 반복하였다. 세 번째 선별 후 클로람페니콜(34 ㎍/㎖)을 함유한 LB에서 자란 30개의 콜로니에서 개별적으로 플라스미드들을 분리하여 DH5α를 재형질전환하였다. 각 형질전환체는 상기의 방법대로 열－저항성을 분석하였다. 열－저항성을 유도하는 플라스미드는 ZFP를 동정하기 위해 서열분석 되었다.

실시예 11: ZFP F121－P65에 의한 유전자

F121－p65 징크 핑거 단백질을 인간 배아 신장 293 세포에서 발현하였다. 세포의 전사체(transcripts)를 프로파일링 하였으며, 프로파일링된 전사체들을 F121－p65를 발현하지 않는 대조세포와 비교하였다. F121－p65에 의해 상향－조정된 전사체의 예가 표 16에 나타나 있다. F121－p65는 다른 유전자 중 인슐린－유사 성장 인자 2(insulin－like growth factor 2)의 전사를 증가시킨다.

실시예 12: 대장군에서의 외생단백질 용해도 변화

본 발명자들은 대장균에서 발현된 재조합 단백질인 Akt1의 용해도를 증가시키는 징크 핑거 단백질을 스크리닝하였다. 포유류의 Akt1 유전자를 pET12b벡터에클로닝하였으며, Akt1 ORF의 C－말단에 GFP를 연결하였다. 서로 다른 징크 핑거 단백질을 코딩하는 핵산 라이브러리로 대장균을 형질전환시켰다. 용해성 Akt1을 발현하는 세포는 더 많은 형광 GFP를 생성하므로 Akt1의 증가된 용해도는 FACS 분리에 의해 분석되었다. 8번째 표현형 스크리닝 후 개별 콜로니들을 선별하였으며, 웨스턴 블럿(western blot) 분석에 의해 ZFP가 발현된 세포와 C1이 발현된 세포 사이의 용해성 분획(fraction)의 Akt1 양을 비교함으로써 용해도 증가를 분석하였다. 웨스턴 블럿 결과는 영상 분석 소프트웨어인 퀀티티 완(QUANTITY ONE, 바이로래드, 허큘레스, CA)에 의해 정량화 되었다. C1은 공벡터인 pZL1 형질전환체를 의미한다. 두 개의 서로 다른 징크 핑거 단백질이 대장균에서 발현된 재조합 Akt1 단백질의 용해도를 증가시키는 것으로 동정되었다.

C1에서의 용해 및 비용해 분획간의 Akt1 단백질 양의 비는 32.5:67.5였다. 대조적으로, 어떤 징크 핑거 단백질로 형질전환된 세포는 용해 분획에서의 Akt1의 비가 2배 증가한 것으로 나타났다－－즉, ZFP－TF 발현세포의 용해 분획 Akt1 단백질 양의 백분율(66,1％)을 C1에서의 양(32.5％)으로 나눈 값이다.

재조합 단백질의 용해도 증가를 위한 스크리닝

원핵세포 발현용 라이브러리는 상기 실시예 9의 방법대로 제작하였다. 대장균 균주 DH5α에 ZFP 라이브러리 및 Akt1 발현 벡터를 같이 공동－형질전환시켰으며, 클로람페니콜(34 ㎍/㎖) 및 암피실린(50 ㎍/㎖)을 함유하는 LB에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양한 배양액을 1 mM IPTG, 클로람페니콜 (34 ㎍/㎖) 및 암피실린(50 ㎍/㎖)이 함유된 신선한 LB 배지 1 ㎖에 1:500으로 희석하여 ZFP 발현을 유도하였다. 30℃에서 3시간 배양한 후, 10⁶세포를 FACS 밴티 플로우 사이토미터(Vantage flow cytometer)에서 FACS 분석하여 높은 형광을 나타내는 5 내지 10％의 세포를 분리하였다. GFP 발현 또는 pET21b 공백터로 형질전환된 세포를 각각 양성 또는 음성 대조군으로 사용하여 배경(background ) 형광수준을 정했다.

분리된 세포를 클로람페니콜(34 ㎍/㎖)과 암피실린(50 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 배지에서 밤새 배양하였다. 배양액에서 플라스미드를 분리하여 DH5α를 형질전환시켰다. 재조합 단백질의 용해도 증가 스크리닝은 재형질전환체를 사용하여 반복하였다. 8번째 선별 후 LB＋클로람페니콜(34 ㎍/㎖)＋암피실린(50 ㎍/㎖) 플레이트에서 성장한 개별 콜로니들로부터 플라스미드를 분리하여 DH5α로 형질전환시켰다. 각 형질전환체는 웨스턴 블럿 분석에 의한 Akt1 용해도 증가로 분석하였다. Akt1의 용해도를 증가시키는 플라스미드는 ZFP를 동정하기 위해 서열분석 되었다.

본 발명에 관한 많은 실시 태양을 기술하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 의도 및 범위를 벗어나지 않는 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시 태양들도 하기 청구항의 범위에 포함된다.

Claims

인공 전사 인자를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 변형 세포로서, 상기 인공 전사 인자가 상기 변형 세포와 실질적으로 동일하고 이종 핵산 및 인공 전사 인자가 결여된 대조 세포에 비해 변형 세포에 스트레스 저항성을 부여하는, 변형 세포.
제1 항 있어서,

인공 전사 인자가 두 개의 징크 핑거 도메인을 포함하는 변형 세포.
제1 항에 있어서,

세포가 세균 세포인 변형 세포.
제1 항에 있어서,

세포가 진핵생물 세포인 변형 세포.
제2 항에 있어서,

스트레스 저항성이 열 저항성, 용매 저항성, 중금속 저항성, 삼투압 저항성, 극한 pH 저항성, 화학물질 저항성, 추위 저항성, 유전자 독성 제제 저항성 및 방사능 저항성의 형질 중 하나 이상을 포함하는 변형 세포.
제1 항에 있어서,

인공 전사 인자를 발현하고, 인공 전사 인자가 결여된 실질적으로 동일한 배양 세포에 비해 증대된 스트레스 저항성을 나타내는 것을 특징으로 하는 변형 세포.
제1 항의 변형 세포를 제공하는 단계;

변형 세포를 인공 전사 인자가 생산되는 조건 하에 유지시키는 단계; 및

인공 전사 인자 이외에 배양된 세포에 의해 생산된 생성물을 회수하는 것을 포함하는, 세포 생성물의 생산 방법.
제 7 항에 있어서,

변형 세포가 인공 전사 인자 외의 이종 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하고, 생성물이 이종 단백질인 생산 방법.
제 7 항에 있어서,

생성물이 대사산물 또는 내생(endogenous) 단백질인 생산 방법.
제 8 항에 있어서,

변형 세포가 이종 단백질을 코딩하는 제2 핵산을 추가로 포함하고, 상기 이종 단백질이 대사산물의 생산에 관여하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
제 7 항에 있어서,

변형세포를 20℃ 내지 40℃에서 유지하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
제 7 항에 있어서,

변형 세포를 인공 전사 인자가 결여된 실질적으로 동일한 세포의 성장을 억제하는 조건 하에 유지시키는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
제 7 항에 있어서,

인공 전사 인자가 징크 핑거 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
제13 항에 있어서,

징크 핑거 도메인이 표 15에 기재된 징크 핑거 도메인의 DNA 접촉 잔기에 상응하는 DNA 접촉 잔기의 집합을 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
제14 항에 있어서,

인공 전사 인자가 세 개 이상의 징크 핑거 도메인의 배열을 포함하고, 상기 배열의 각 징크 핑거 도메인의 DNA 접촉 잔기가 표 15의 열에 기재된 임의의 세 개의 연속된 징크 핑거 도메인의 DNA 접촉 잔기에 각각 상응하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
제 7 항에 있어서,

스트레스 저항성이 열 저항성, 용매 저항성, 중금속 저항성, 삼투압 저항성, 극한 pH 저항성, 화학물질 저항성, 추위 저항성 및 방사능 저항성의 형질 중 하나 이상을 포함하는 생산 방법.
표적 단백질을 코딩하는 유전자, 및 인공 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하고, 상기 인공 키메라 단백질이 (1) 이종 핵산을 포함하지 않는 세포에 비해 세포의 단백질 생산량을 증가시키고, (2) 표적 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 직접적으로 조절하는 전사 조절 영역에 결합하지 않는 세포.
제17 항에 있어서,

인공 키메라 단백질이 두 개의 징크 핑거 도메인을 포함하고 DNA에 결합하는 것을 특징으로 하는 세포.
제17 항에 있어서,

세포가 진핵생물 세포이고, 인공 키메라 단백질이 게놈(genomic) DNA 부위에 결합하기 위해 PB08, K_F02 또는 K_D10과 경쟁하는 것을 특징으로 하는 세포.
제17 항에 있어서,

인공 키메라 단백질이 세포의 세포 주기 진행 속도를 변화시키는 세포.
제17 항에 있어서,

유전자가 내생 유전자인 세포.
(1) 인공 전사 인자를 포함하지 않는 세포에 비해 진핵 세포에 의한 표적 단백질의 생산량을 증가시키고, (2) 표적 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 직접적으로 조절하는 전사 조절 영역에 결합하지 않는 인공 전사 인자.
다수의 징크 핑거 도메인을 포함하고, 진핵 세포에서 세포 주기 진행 속도를 변화시키는 인공 전사 인자.
제17 항의 세포를 제공하는 단계; 및

인공 키메라 단백질이 세포의 이종 핵산을 포함하지 않는 세포에 비해 표적 단백질 생산량을 증가시키는 조건 하에서 세포를 유지시키는 단계를 포함하는 단백질 생산 방법.
제24 항에 있어서,

단백질이 분비 단백질인 방법.
분비 단백질을 코딩하는 내생 유전자 및 인공 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 세포로서, 상기 인공 전사 인자가 이종 핵산을 포함하지 않는 세포에 비해 세포의 분비 단백질 생산량을 증가시키는 세포.
제26 항에 있어서,

세포가 진핵 세포이고, 분비 단백질이 인슐린인 세포.
제26 항에 있어서,

인공 전사 인자가, 08_D04_p65가 특이적으로 결합하는 내생 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 세포.
제26 항에 있어서,

인공 전사 인자가 내생 DNA 부위에 특이적으로 결합하고 내생 DNA 부위에 결합하기 위해 08_D04_p65와 경쟁하는 세포.
제26 항에 있어서,

인공 전사 인자가 하기와 같은 아미노산 서열을 포함하는 세포:

CX_(2－5)CXXXBXRXSHJXRHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)H(서열번호: 45); 또는

CX_(2－5)CXXXBXRXDHJXTHX_(3－5)HX_(1－6)BXCX_(2－5)CXXXBXVXSSJXRHX_(3－5)H(서열번호: 46)

여기에서, B는 페닐알라닌 또는 티로신이고, J는 소수성 아미노산이다.
제24 항의 세포를 제공하는 단계; 및

이종 핵산을 포함하지 않는 세포에 비해 인공 전사 인자가 세포의 인슐린 생산량을 증가시키는 조건 하에서 세포를 유지하는 단계를 포함하는 인슐린 생산 방법.
두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공 전사 인자로서, 상기 인공 전사 인자 부재 시에는 내생 인슐린 유전자를 발현하지 않는 포유류 세포에서 내생 인슐린 유전자의 발현을 유도하는 인공 전사 인자.
인공 전사 인자를 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 동일한 세포에 비해 독성 물질에 대한 세포의 감수성을 변화시키는 인공 전사 인자.
인공 전사 인자를 코딩하는 핵산을 포함하고 발현하는 세포로서, 상기 인공 전사 인자가 상기 핵산을 포함하지 않는 동일한 세포에 비해 독성 물질에 대한 세포의 감수성을 변화시키는 세포.
제 34 항에 있어서,

독성 물질이 약제(drug)인 세포
제 34 항에 있어서,

감수성이 증가하는 세포.
제 34 항에 있어서,

감수성이 감소하는 세포.
제 34 항에 있어서,

진균 세포인 세포.
제 38 항에 있어서,

독성 물질이 케토코나졸인 세포.
제 34 항에 있어서,

인공 전사 인자가 세 개의 징크 핑거 도메인을 포함하는 세포.
제 39 항에 있어서,

인공 전사 인자가 내생 DNA 부위에 결합하고 상기 내생 DNA 부위에 결합하기 위해 표 5에 기재된 징크 핑거 단백질과 경쟁하는 것을 특징으로 하는 세포.
세포에서 AQY1, YJR147W, YLL052C, YLL053C 또는 YPL091W와 70 ％ 이상 동일한 단백질의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함하는, 진균 세포의 약제 저항성을 변화시키는 방법.
다수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리로서, 다수의 핵산 중 각 핵산이 천연형 단백질에서는 서로 인접하여 나타나지 않는 두 개 이상의 인접한 징크 핑거 도메인을 포함하여 세 개 이상의 징크 핑거 도메인의 배열을 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계;

라이브러리 구성원(member)을 시험 세포의 복제물에 도입하여 형질전환 세포를 얻는 단계;

형질전환된 세포를 독성물질의 존재 하에 배양하는 단계; 및

독성 물질에 대한 감수성이 시험세포에 비해 변화된 세포를 형질전환된 세포로부터 동정하는 단계를 포함하는,

독성 물질에 대한 세포의 감수성을 변화시키는 인공 키메라 단백질의 동정 방법.
재 43 항에 있어서,

시험 세포가 진균 세포이고, 독성 물질이 항－진균 제제인 방법.
제 43 항에 있어서,

시험 세포가 암세포이고, 독성물질이 항－분열 제제(anti－mitotic agent)인 방법.
제 43 항에 있어서,

다수의 핵산 중 각 핵산에 의해 코딩되는 키메라 단백질이 전사 조절 도메인을 포함하는 방법.
제 46 항에 있어서,

선택된 세포 내의 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질의 징크 핑거 도메인 배열을 포함하지만, 동정된 세포 내의 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질의 전사 조절 도메인은 포함하지 않는 제2 키메라 단백질을 코딩하는 핵산을 제작하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 47 항에 있어서,

(i) 선택된 세포 내의 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질의 징크 핑거 도메인 배열, 및 (ii) 동정된 세포 내의 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질의 전사 조절 도메인이 아닌 전사 조절 도메인을 포함하는, 제2 키메라 단백질을 코딩하는 핵산을 제작하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
세 개의 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하고, 상기 인공 전사 인자의 발현이 하나 이상의 척추동물 세포에서 신경세포의 표현형을 유도하는 핵산.
제 49 항에 있어서,

징크 핑거 도메인 중 하나 이상이 하기 서열을 갖는 핵산:

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His (서열번호: 250)

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His (서열번호: 251); 또는

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Cys－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His (서열번호: 252)

상기에서, X_a는 페닐알라닌 또는 티로신이고; X_b는 소수성 아미노산이다.
제 50 항에 있어서,

인공 전사 인자가 하기 서열을 포함하는 핵산:

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His－X_1－6－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His－X_1－6－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Cys－X_b－X－Ser－Asn－His－X_3－5－His(서열번호: 253)

상기에서, X_a는 페닐알라닌 또는 티로신이고; X_b는 소수성 아미노산이다.
제 44 항의 핵산을 포함하는 척추동물 세포를 제공하는 단계; 및

상기 척추동물 세포를 인공 전사 인자가 생산되고 신경돌기 형성이 유도되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 척추동물 세포에서 신경돌기 형성을 유도하는방법.
제 52 항에 있어서,

척추동물 세포가 포유류 세포인 방법.
제 52 항에 있어서,

포유류 세포가 인간 세포인 방법.
제 52 항에 있어서,

척추동물 세포가 인공 전사 인자를 생산하기 전의 줄기 세포인 방법.
세 개의 징크 핑거 도메인으로 이루어진 인공 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하고, 상기 인공 전사 인자의 발현이 하나 이상의 척추동물 세포에서 골세포형성(osteogenesis)을 유도하는 핵산.
제 56 항에 있어서,

하나 이상의 징크 핑거 도메인이 하기 서열을 갖는 핵산:

Cys－X_2－5－Cys－X₃－Xa－X－Arg－X_b－X－Asp－Lys－His－X_3－5－His (서열번호: 254);

Cys－X_2－5－Cys－X₃－Xa－X－Gln－X_b－X－Thr－His－His－X_3－5－His (서열번호: 255);

Cys－X_2－5－Cys－X₃－Xa－X－Val－X_b－X－Ser－Thr－His－X_3－5－His (서열번호: 256); 또는

Cys－X_2－5－Cys－X₃－Xa－X－Arg－X_b－X－Asp－Lys－His－X_3－5－His(서열번호: 257)

상기에서, X_a는 페닐알라닌 또는 티로신이고; X_b는 소수성 아미노산이다.
제 57 항에 있어서,

인공 전사 인자가 하기 아미노산 서열을 포함하는 핵산:

Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Arg－X_b－X－Asp－Lys－His－X_3－5－His－X_1－6－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Gln－X_b－X－Thr－His－His－X_3－5－His－X_1－6－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Val－X_b－X－Ser－Thr－His－X₃₅－His－X_1－6－Cys－X_2－5－Cys－X₃－X_a－X－Arg－X_b－X－Asp－Lys－His－X_3－5－His (서열번호: 258)

상기에서, X_a는 페닐알라닌 또는 티로신이고; X_b는 소수성 아미노산이다.
제 44 항의 핵산을 포함하는 척추동물 세포를 제공하는 단계; 및

상기 척추동물 세포를 인공 전사 인자가 생산되고 골세포형성이 유도되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 척추동물 세포에서 골세포형성을 유도하는 방법.
다수의 징크 핑거 도메인을 포함하고 줄기세포의 분화 능력을 변화시키는 인공 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산, 및 줄기 세포를 제공하는 단계;

상기 핵산을 줄기세포에 도입하는 단계; 및

인공 전사 인자가 생산되어 줄기세포의 분화 능력을 변화시키는 조건 하에서 줄기세포를 유지시키는 단계를 포함하는,

줄기세포의 분화 능력을 변화시키는 방법.
제 60 항에 있어서,

인공 전사 인자가 줄기세포의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 60 항에 있어서,

인공 전사 인자가 줄기세포의 자가－복제(self－renewal) 능력을 증대시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 60 항에 있어서,

줄기세포가 배아 줄기세포인 방법.
제 60 항에 있어서,

줄기세포가 척추동물 줄기세포 또는 식물 줄기세포인 방법.
제 62 항에 있어서,

줄기세포가 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 신경모세포(neuronal progenitor cell) 또는 근육모세포(muscular progenitor cell)인 방법.
각각 2개 이상의 징크 핑거 도메인 및 전사를 활성화 또는 억제하는 조절 도메인의 배열을 포함하는 상이한 인공 전사 인자를 코딩하는 다수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계;

소정의 형질을 가진 세포를 제공하는 단계;

핵산 라이브러리의 구성원을 세포 내로 도입하는 단계;

상기 소정의 형질을 변화시키는 라이브러리의 구성원을 동정하는 단계; 및

동정된 구성원의 징크 핑거 도메인 배열은 포함하나 동정된 구성원의 조절 도메인과 동일한 조절 도메인은 포함하지 않는 DNA 결합 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 코딩 핵산을 제조하는 단계를 포함하는, 인공 전사 인자의 동정 방법.
제 66 항에 있어서,

DNA 결합 폴리펩타이드가 동정된 구성원의 조절 도메인을 갖지 않는 방법.
제 66 항에 있어서,

DNA 결합 폴리펩타이드가 동정된 구성원의 조절 도메인에 비해 돌연변이된 조절 도메인을 포함하는 방법.
제 67 항에 있어서,

DNA 결합 폴리펩타이드가 동정된 구성원의 조절 도메인에 반대되는 기능의 조절 도메인을 포함하는 방법.
제 66 항에 있어서,

세포에 상기 코딩 핵산을 도입하고 세포의 소정 형질을 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 66 항에 있어서,

동정 단계가 소정의 환경 조건에 대한 저항성; 분화; 역분화; 증식; 세포사멸(apoptosis); 혈청－독립성(serum－independence); 병원체 저항성; 및 병원체 감수성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특성을 가진 세포를 동정하는 것을 포함하는 방법.
다수의 제1 핵산 및 다수의 제2 핵산을 포함하고, 여기에서

(a) 다수의 제1 핵산 각각이 두 개 이상의 징크 핑거 도메인 및 전사를 활성화하는 제1 기능 도메인을 포함하는 인공 키메라 단백질을 코딩하며,

(b) 다수의 제2 핵산 각각이 두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하고 제1 기능 도메인은 포함하지 않는 인공 키메라 단백질을 코딩하는, 핵산 라이브러리.
제 72 항에 있어서,

다수의 제2 핵산 각각에 의해 코딩되는 인공 키메라 단백질이 제1 기능 도메인과는 다른 제2 기능 도메인을 포함하는 핵산 라이브러리.
제 72 항에 있어서,

제1 기능 도메인이 활성화 도메인이고, 제2 기능 도메인이 억제 도메인인 핵산 라이브러리.
제 73 항에 있어서,

제1 기능 도메인이 활성화 도메인이고, 제2 기능 도메인이 제1 활성화 도메인과 상이한 효율의 활성화 도메인인 핵산 라이브러리.
제 72 항에 있어서,

제1 기능 도메인이 히스톤 탈아세틸화효소(deacetylase) 도메인인 핵산 라이브러리.
제 72 항의 핵산 라이브러리를 제공하는 단계;

소정의 형질을 가진 세포에 핵산 라이브러리의 구성원을 도입하는 단계; 및

상기 소정의 형질을 변화시키는 라이브러리 구성원을 동정하는 단계를 포함하는, 다수의 키메라 단백질의 동정 방법.
발현되면 시험 세포의 소정의 형질을 변화시키는 제1 인공 키메라 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 시험 세포의 복제 세포를 제공하는 단계;

두 개의 징크 핑거 도메인을 포함하는 상이한 인공 키메라 단백질을 각각 코딩하는, 다수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리의 구성원을 각 복제 세포에 도입하는 단계; 및

각 복제 세포가 라이브러리의 제1 구성원에 의해 코딩되는 키메라 단백질 및 도입된 핵산 라이브러리 구성원에 의해 코딩되는 제2 키메라 단백질을 발현하는 복제 세포들을 스크리닝하여 소정의 형질이 추가로 변화된 세포를 동정하는 단계를 포함하는, 다수의 키메라 단백질의 동정 방법:
두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 각각의 상이한 인공 키메라 단백질을 각각 코딩하는, 다수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계;

세포의 소정 형질을 변화시키는 라이브러리의 제1 및 제2 구성원을 동정하는 단계; 및

동정된 제1 및 제2 라이브러리 구성원에 의해 각각 코딩되는 제1 및 제2 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 제조하는 단계를 포함하는,

변형 세포의 제조 방법.
제 79 항에 있어서,

동정 단계가, 세포 복제물에 핵산 라이브러리의 구성원을 도입하여 형질전환 세포를 제공하고, 소정 형질이 변화된 제1 및 제2 세포를 동정하는 것을 포함하는 방법.
제 79 항에 있어서,

제조된 세포에 대하여 상기 소정 형질을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 79 항에 있어서,

세포의 제조 단계가 제1 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 유전자 및 제2 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 유전자를 세포에 도입함을 포함하는 방법.
제 82 항에 있어서,

제1 및 제2 유전자가 동일한 핵산의 성분들(components)인 방법.
제 79 항에 있어서,

세포의 제조 단계가 제1 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 유전자를 포함하는 제1 세포를 제2 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 유전자를 포함하는 제2 세포와 융합시키는 것을 포함하는 방법.
두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 상이한 인공 키메라 단백질을 각각 코딩하는 다수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계;

소정의 형질을 가진 세포에 상기 핵산 라이브러리의 구성원을 도입하는 단계;

상기 소정의 형질을 변화시키는 라이브러리의 구성원을 동정하는 단계; 및

하기 변이체 또는 키메라 단백질을 각각 코딩하는 다수의 핵산을 포함하는 제2 라이브러리를 제작하는 단계를 포함하는, 키메라 단백질의 동정 방법:

(1) 1 내지 6개 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해, 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질과 구별되는 변이체,

(2) 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질의 징크 핑거 도메인 및 추가의 징크 핑거 도메인을 포함하고, 상기 추가의 징크 핑거 도메인이 제2 라이브러리의 구성원들 간에 다양하게 변하는 키메라 단백질,

(3) 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질의 변이체로서, 다른 징크 핑거 도메인으로 치환된 징크 핑거 도메인 위치들의 하위집합(subset) 및 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질의 상응하는 위치에 있는 징크 핑거 도메인과 동일한 하나 이상의 불변 징크 핑거 도메인을 갖는 변이체, 또는

(4) 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질의 변이체로서, 제2 라이브러리의 구성원 중 하나 이상의 징크 핑거 도메인 위치가, 동정된 구성원에 상응하는 인공 키메라 단백질 내의 그 위치에서의 특정 도메인이 그 위치에서의 다른 징크 핑거 도메인보다 높은 빈도로 나타나도록 변화된 변이체.
두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 각각 포함하는 상이한 인공 전사 인자를 각각 코딩하는 다수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계;

라이브러리의 구성원을 시험 세포의 복제물에 도입하여 다수의 형질전환된 세포를 제공하는 단계;

형질전환된 세포를 인공 전사 인자가 발현되는 조건 하에서 유지시키는 단계;

다수의 형질전환된 세포로부터, 시험 세포에 비해 변화된 표현형을 갖는 다수의 표현형 변환 세포(phenotypically altered cell)를 동정하는 단계;

다수의 각 표현형 변환 세포 내 전사체(transcripts) 또는 단백질 양을 프로파일링(profiling)하여 각 표현형 변환 세포의 프로필을 제공하는 단계; 및

프로필을 서로 비교하여, 다수 중 두 개 이상의 표현형 변환 세포에서 그 양이 시험 세포에 비해 유사하게 변한 하나 이상의 전사체 또는 단백질을 동정하는 단계를 포함하는,

인공 전사 인자의 표적(target)을 동정하는 방법.
두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공 전사 인자로서 상기 인공 전사 인자가 발현되지 않는 대조 세포에 비해 세포의 표현형질을 변화시키는 인공 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 변형 세포를 제공하는 단계;

변형 세포에서의 발현이 대조 세포에 비해 변화된 표적 유전자를 동정하는 단계;및

이종 핵산을 포함하고 인공 전사 인자를 발현하며, 표적 유전자의 활성이 변화한 시험 세포의 표현 형질을 평가하는 단계를 포함하는,

세포의 평가 방법.
제 87 항에 있어서,

표적 유전자의 활성이 유전자 돌연변이에 의해 변화되는 방법.
제 87 항에 있어서,

표적 유전자의 활성이 이중 가닥 RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 리보자임에 의해 변화되는 방법.
제 87 항에 있어서,

표적 유전자의 활성이 표적 유전자의 과발현에 의해 변화되는 방법.
두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 인공 전사 인자로서 상기 인공 전사 인자가 발현되지 않는 대조 세포에 비해 세포의 표현 형질을 변화시키는 인공 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 변형 세포를 제공하는 단계;

라이브러리 핵산을 변형 세포의 복제물에 도입하는 단계; 및

인공 전사 인자에 의한 표현 형질의 변화를 감소시키는 라이브러리 핵산을 동정하는 단계를 포함하는,

인공 전사 인자를 평가하는 방법.
제 91 항에 있어서,

라이브러리 핵산이 cDNA 라이브러리 핵산을 포함하는 방법.
제 91 항에 있어서,

라이브러리 핵산이 상이한 인공 키메라 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 방법.
제 93 항에 있어서,

상이한 인공 키메라 단백질이 상이한 징크 핑거 도메인을 포함하는 방법.
두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하되 하나 이상의 징크 핑거 도메인이 천연형 단백질에서 유래한 것을 특징으로 하는, 상이한 인공 키메라 단백질을 각각 코딩하는 다수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계;

소정의 형질을 가진 세포에 핵산 라이브러리 구성원을 도입하는 단계; 및

상기 소정의 형질을 변화시키는 라이브러리 구성원이 있는 세포를 동정하는 단계를 포함하는,

키메라 단백질의 동정 방법.
두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 상이한 인공 키메라 단백질을 각각 코딩하는 다수의 핵산을 포함하되 상기 다수 중 하나 이상의 구성원의 하나 이상의 징크 핑거 도메인이 표 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계;

핵산 라이브러리 구성원을 소정의 형질을 지닌 세포에 삽입하는 단계; 및

라이브러리 구성원이 상기 소정의 형질을 변화시킨 세포를 동정하는 단계를 포함하는,

키메라 단백질의 동정 방법.
(1) 각 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 제1 및 제2 징크 핑거 도메인이 각각 천연형 단백질 유래의 징크 핑거 도메인과 동일하되, (i) 동일한 천연형 단백질에는 나타나지 않거나, (ii) 동일한 천연 단백질에서는 상기 폴리펩타이드에서와 다른 배열로 나타나고, (2) 제1 징크 핑거 도메인이 다수의 핵산들 간에 다양하게 변화하고, (3) 제2 징크 핑거 도메인이 다수의 핵산들 간에 다양하게 변화하는, 제1 및 제2 징크 핑거 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포 다수를 포함하는 세포 라이브러리를 제공하는 단계;

대조 세포와 표현형이 다른 라이브러리 세포를 동정하는 단계; 및

동정된 라이브러리 세포로부터 핵산을 회수하는 단계를 포함하는,

키메라 단백질의 동정 방법.
인공 전사 인자를 생산하는 세포에서 이종의 과발현된 단백질의 용해도를 개선하는 인공 전사 인자를 코딩하는 단리된 핵산.
제 98 항에 있어서,

인공 전사 인자가 다수의 징크 핑거 도메인을 포함하는 핵산.
제 98 항에 있어서,

세포가 세균 세포인 핵산.
제 98 항에 있어서,

단백질이 포유동물 단백질인 핵산.
제101 항에 있어서,

단백질이 AKT 단백질을 포함하는 핵산.
제 99 항에 있어서,

다수의 징크 핑거 도메인이 QSTR－DSAR－RDHT－WSNR 또는 VSTR－DGNV－QSNR－QSNK도메인을 포함하는 핵산.
제 98 항 내지 제103항 중 어느 한 항의 이종 핵산을 포함하는 변형 세포.
이종 표적 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제104항의 변형 세포를 제공하는 단계; 및

변형 세포를 인공 전사 인자 및 이종 표적 단백질이 생산되는 조건 하에서 유지하는 단계를 포함하는,

이종 표적 단백질의 생산 방법.
제105 항에 있어서,

변형 세포가 배양 세포인 방법.
제105 항에 있어서,

변형 세포가 대상(subject) 내에 존재하는 방법.
제1 항의 변형 세포를 제공하는 단계;

변형 세포를 인공 전사 인자가 생산되는 조건에서 유지하는 단계; 및

인공 전사 인자가 아닌, 배양 세포에서 생산된 산물을 회수하는 단계를 포함하는,

세포 산물의 생산 방법.
두 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 상이한 인공 키메라 단백질을 각각 코딩하는 다수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 제공하는 단계;

소정의 형질을 지닌 제1 세포에 핵산 라이브러리 구성원을 도입하여 형질전환된 세포를 제공하는 단계;

형질전환된 세포로부터, 라이브러리 구성원이 소정의 형질을 변화시킨 변화된 세포를 동정하는 단계;

동정된 변화된 세포로부터 핵산 라이브러리 구성원을 회수하는 단계;

소정의 형질 외의 표현 형질이 제1 세포와 다른 제2 세포에 상기 핵산 라이브러리 구성원을 삽입하는 단계; 및

상기 핵산 라이브러리 구성원을 포함하며, 핵산 라이브러리 구성원이 코딩하는 인공 키메라 단백질을 발현하는 제2 세포를 평가하는 단계를 포함하는,

제1 세포로부터 제2 세포로 변화된 형질을 전이하는 방법.
제109 항에 있어서,

제1 및 제2 세포가 진핵생물 세포인 방법.
제110 항에 있어서,

제1 및 제2 세포가 효모 세포인 방법.
제110 항에 있어서,

제1 및 제2 세포가 포유류 세포인 방법.
제112 항에 있어서,

제1 및 제2 세포의 증식 특성이 상이한 방법.
제113 항에 있어서,

제1 세포가 암세포이고, 제2 세포가 비－암세포(non－cancerous)인 방법.
제109 항에 있어서,

평가된 제2 세포가 소정의 형질의 변화 여부로 평가되는 방법.
서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 260, 262 및 264로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드.
제116 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
세 개의 징크 핑거 도메인으로 구성되고 그의 발현이 하나 이상의 진핵 세포의 바이러스 복제, 바이러스 생산 및 바이러스 감염성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 특성을 변화시키는 인공 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
세 개의 징크 핑거 도메인을 포함하며 그의 발현이 진핵 세포와 공동배양되거나 진핵 세포에 의해 조절된(conditioned) 배지에서 배양된 줄기세포를 조절하는 진핵 세포의 능력을 변화시키는 인공 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
세 개의 징크 핑거 도메인을 포함하며 그의 발현이 분비된 단백질을 당쇄화시키는 포유동물 세포의 능력을 변화시키는 인공 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
제120 항에 있어서,

분비된 단백질이 하나 이상의 면역글로불린(immunoglobulin) 가변 도메인을 포함하는 이종 단백질인 핵산.
제120 항에 있어서,

세포가 CHO 세포인 핵산.
세 개의 징크 핑거 도메인을 포함하며 그의 발현이 외생(exogenous) 핵산을 받아들이는 세포의 능력을 변화시키는 인공 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산.