CN102816214B - 乙型肝炎病毒HBx基因的人工转录因子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了能够特异结合乙型肝炎病毒HBx基因转录调控区的C2H2型三锌指蛋白和六锌指蛋白，以及融合了能够抑制基因转录的效应功能域的人工转录因子，本发明还公开了所述转录调节因子在制备治疗乙型肝炎病毒感染性疾病药物中的应用。所述转录因子对HBx基因转录，以及基因组中整合了目标基因HBx的Hep3B细胞的生长具有明显的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种锌指蛋白及其在转录调控目标基因方面的应用，属于分子生物学领域。
背景技术
原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界最常见的癌症之一，而慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC最重要的危险因子之一，研究表明，HBV携带者的HCC发生率比非携带者高5-15倍。大约85-90％的HBV阳性HCC病例在肝细胞中都发现有HBV的整合片段，而X基因是HCC病人中整合最频繁的HBV片段。X基因(以下简称HBx)是HBV的一个ORF，其蛋白产物称为HbxAg，通常由154个氨基酸组成。目前发现HBx在HBV感染宿主以后会与细胞中的一些因子发生作用，并可能在HBV诱发宿主产生HCC(原发性肝细胞癌)的过程中起到某种调控作用。1991年美日学者将1.5kb的含HBx基因的片段注入小鼠受精卵内，得到的小鼠最后都发展为HCC，表达HbxAg和AFP，而在小鼠生前ALT一直正常。说明肝细胞单纯表达HBx，无需产生细胞损伤即可造成形态和生化改变，最终也会导致HCC。根据基于一项CD1品系的HBx转基因小鼠的研究，80-91％的雄性HBx转基因小鼠发生HCC，并于11-15个月龄时死于HCC；60-67％雌性HBx转基因小鼠发生HCC，并于12-21个月龄时死于HCC；而野生型CD1小鼠未见原发肝部肿瘤。HBx基因对于HBV自身基因组的复制是必需的，并作为转录因子调节多种细胞内蛋白功能，涉及细胞增殖、细胞周期、蛋白质降解和DNA修复等多方面，并在肿瘤晚期还参与细胞转移与血管生成相关的宿主基因的调控，因此，被认为是一种HBV来源的HCC相关的癌基因。靶向并特异地下调HBx被认为是阻断HBV感染相关的HCC的有效方法，目前研究者已经尝试了核酶、反义核酸，以及siRNA等方法人工干预下调HBx表达，但由于这些方法受核酸分子半衰期的限制，且容易产生脱靶效应，因此仍需要开发出特异的调控HBx表达的方法。
人工转录因子是通过识别DNA位点，对基因转录进行调控，因此利用少量的人工转录因子往往就能起到很好的调控效果。有研究表明合理设计的人工转录因子能够针对抑癌基因、原癌基因以及病毒的转录都起到相应的调控作用，一个合适的人工转录因子甚至可以调节某个基因家族或是整条代谢通路中的一系列相关产物，因此人工转录因子在疾病的基因治疗与抗病毒治疗等领域都具有广泛的应用前景。另外，由于人工转录因子可以进行模块化设计，通过改变DNA结合结构域可以灵活选择其作用靶位，改变其功能结构域则可以对于目的基因进行激活、抑制、甲基化等不同的调控，应用十分灵活方便。人们借鉴人工转录因子的构建思路，利用更为多样的功能结构域，构建了许多能够特异地作用于靶序列的新型蛋白，用于对DNA进行某种定点的操作。例如，将限制性内切酶的切割亚基与序列特异的锌指相连，构建人工核酸酶，从而能够任意地切割目的序列，并提高重组的效率。把DNA甲基化酶与锌指相连，构建人工甲基化酶，可以在目的启动子上引入甲基化，使得目的基因表达沉默。此外，Bushman等将HIV-1的整合酶结构域与锌指相连构建了嵌合的整合酶；Beretta等利用相似的方法构建了序列特异的拓扑异构酶。有时候人工甲基化酶等也被统称为人工转录因子，但人们更习惯将它们称为嵌合酶。
人工转录因子含有DNA结合结构域和效应功能域。结合结构域负责特异性识别和结合DNA靶序列，而效应功能域则负责调控基因转录，即上调或下调基因转录。C2H2锌指结构是Miller等在1985最先在非洲爪蟾的转录因子TFIIIA中发现的，是真核细胞中最常见的DNA结合结构域，在人类基因组中，大约有2％的基因编码C2H2锌指结构。每一个C2H2锌指单元由大约30个氨基酸组成，形成反平行的β折叠片与一个α螺旋(α-helix)，通过疏水作用以及其中的2个Cys残基和2个His残基与一个Zn2+离子的作用来稳定其结构，形状类似与人的手指，“锌指”因此而得名。
对锌指Zif268以及与其靶DNA序列相互作用的复合物晶体的X射线衍射分析揭示了C2H2锌指与DNA作用的特点：每一个锌指单元的α螺旋(被称为识别螺旋)伸入DNA的大沟中，通过α螺旋外侧的氨基酸来识别DNA双螺旋大沟中相连的3～4bp序列，并可通过氢键作用与相应的碱基结合。进一步的研究发现，对于锌指单元的序列特异性起作用的主要是其α螺旋的-1，1，2，3，6位氨基酸，不改变锌指的基本骨架，仅仅用其他氨基酸来替换这些位点的氨基酸，就可以得到具有新的序列特异性的锌指单元。多个锌指单元可以串联成簇，识别更长的DNA序列。此外，C2H2锌指结构还能识别修饰过的DNA碱基，如甲基化胞嘧啶。
相对于其他的DNA结合结构域，C2H2锌指有很多的优点。例如，许多DNA结合结构域因为自身是对称或者二聚化的结构而只能识别对称序列，而C2H2锌指则可以识别非回文序列；并且由于可以多个锌指单元串联，C2H2锌指对于其识别序列的长度和结构没有太多的限制。仅仅需要改变几个关键位点的氨基酸，就可以赋予锌指新的识别特性。从理论上讲，对于任意的DNA序列，都能找到能够与之特异地结合的C2H2锌指。C2H2锌指的这些特点使它迅速成为人工转录因子模块化设计中首选的DNA结合结构域。
但是基因表达的调控是一个极为复杂精细的过程，人工转录因子与DNA序列结合的特异性，转录因子各亚单位之间，各结构域之间的相互效应都会影响转录的效果，因此，人工转录因子影响基因的调控存在许多不可控的因素，寻找特异性强、调控效果好的人工转录因子既是一项非常耗时费力的工作，也是一项充满挑战性的工作。针对HBV携带者的HCC高发病率，本发明旨在提供一种能够有效控制HBV的HBx的基因转录和表达的高特异性人工转录因子，更具体地，一种三锌指蛋白或者六锌指蛋白，以有效治疗HBV感染相关性疾病及控制HCC的发生。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先选定乙型肝炎病毒adw亚型第1175-1194核苷酸序列，即SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列(5’-GCCAAGTGT TT GCTGACGCA-3’)，作为锌指蛋白作用的DNA靶序列，其中SEQ ID NO 7的5’上游序列(5’-GCCAAGTGT-3’)命名为U序列，SEQ ID NO 7的3’下游序列(即5’-GCTGACGCA-3’)命名为D序列；并以三锌指蛋白Zif268为骨架，在其中的3个锌指所处的3个α螺旋区域随机化设计出待筛选的锌指氨基酸序列；通过噬菌体展示技术，根据两部分筛选(Bipartite selection)策略构建了噬菌体展示锌指文库，筛选出能够特异结合DNA靶序列的三锌指蛋白。因此，本发明首先提供了一种特异性结合乙型肝炎病毒HBx基因转录调控区的C2H2型三锌指蛋白，所述三锌指蛋白具有3个锌指，每个锌指具有一个α螺旋结构，所述三锌指蛋白的3个锌指的α螺旋的第-1，1，2，3，4，5，6位氨基酸序列依次由下列序列所示(-1位表示第1位氨基酸之前的一个氨基酸)：
(1)SEQ ID NO8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10；或者
(2)SEQ ID NO11、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13；或者
(3)SEQ ID NO14、SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16；或者
(4)SEQ ID NO17、SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 19。
在上述序列中，第(1)组和第(2)组锌指蛋白序列的靶序列为U序列，第(3)组和第(4)组序列的靶序列为D序列。
在一个优选技术方案中，本发明提供了4种三锌指蛋白，所述三锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO1、2、4或者5所示，其中SEQ ID NO1所定义的三锌指蛋白被命名为U37，SEQ ID NO2所定义的三锌指蛋白被命名为U5，SEQ ID NO4所定义的三锌指蛋白被命名为D13，SEQ ID NO5所定义的三锌指蛋白被命名为D46。
为了提高锌指蛋白识别DNA靶序列的特异性，可以把多个锌指单元通过接头串联起来。本发明以三锌指蛋白为基础，构建了六锌指蛋白，所述六锌指蛋白由上述四种三锌指蛋白中的任意两个三锌指蛋白串联而成。
在一个优选技术方案中，所述六锌指蛋白由SEQ ID NO4定义的三锌指蛋白D13和SEQ ID NO2定义的三锌指蛋白U5串联而成，被命名为U5D13。
将两个锌指蛋白串联起来可以有多种方法，例如，可以用在天然的多锌指蛋白中常见的连接肽(linker)或者人工设计的更长的连接区把多个锌指串联起来。也可以将两个三锌指结构分别与二聚化区域融合，令其发生二聚化而形成六指结构。常用的二聚化结构域包括Gal4的二聚化结构域，以及亮氨酸拉链。
在本发明的一个优选技术方案中，所述六锌指蛋白U5D13的两个三锌指蛋白以SEQ ID NO20定义的连接肽相连。
研究发现仅仅是由锌指构成的DNA结合结构域对于基因的表达就会有一定的抑制作用，其原因可能是过量表达的锌指蛋白结合在基因的编码区从而阻止了转录的进行，也有可能是结合在基因的启动子区域占据了其他的转录必需的转录因子的结合位点(如果是占据抑制因子的作用位点，则有可能有一定的上调作用)。不过这些作用的强度是很有限的，而且因研究体系的不同而情况不同。因此，在现在的人工转录因子的设计中通常都要加上不同的功能结构域，以赋予人工转录因子不同的功能。KOX1是一种重要的转录抑制因子，是Kox1基因的产物。研究显示KOX1的第1-75氨基酸就具有全部的转录抑制活性，这75个氨基酸是具有高度同源性的序列，称为KRAB域(Krüppel-associated box)，它几乎存在于所有真核生物中。KRAB域与锌指融合以后能够以一种不依赖距离和方向的方式来调控哺乳动物的启动子。
因此为达到更为多样的生化效应或者调控作用，本发明还提供了一种含有上述三锌指蛋白或六锌指蛋白的融合蛋白，其中，所述锌指蛋白与效应基团相连接。所述效应基团包括转录因子的效应结构域、核酸酶、DNA甲基化酶、整合酶、拓扑异构酶。所述效应基团可以针对靶序列发挥特定的生化效应或者调控作用。
优选地，所述效应基团为转录因子的效应结构域。
在一个优选技术方案中，所述融合蛋白为一种转录调节因子，其中，所述效应基团为能够影响HBx基因转录的功能结构域。
优选地，所述功能结构域为KRAB功能结构域。该功能结构域能够下调目标基因HBx的表达。
本发明还提供了上述转录调节因子在制备治疗乙型肝炎病毒感染性疾病药物中的应用。
本发明通过噬菌体展示技术，采用两部分筛选获得的三锌指蛋白对靶序列都具有极高的亲和性，ELISA结果显示，靶序列的单碱基改变都导致亲和性的降低。
本发明所提供的连接有锌指蛋白和功能结构域的人工转录因子能显著下调调控区域含有相应靶序列的报告基因firefly luciferase(萤火虫荧光素酶)的表达水平，提示检测的所有转录因子都能作用于靶序列抑制报告基因的转录。
本发明所提供的人工转录因子能够特异性抑制基因组中整合了目标基因HBx的Hep3B细胞的生长，而含有六锌指蛋白的U5D13显示出较高的抑制活性，表明本发明所提供的人工转录因子能够应用于制备治疗乙型肝炎病毒感染性疾病药物。
附图说明
图1人工转录因子的组成及作用模式图。
图2U序列经噬菌体展示文库筛选后的ELISA检测结果。
图3U5、U37、D13和D46对于靶序列亲和性的ELISA结果。
图4U5对U序列以及一系列带有单碱基突变的U序列的亲和力测定的ELISA结果。
图5D13对D序列以及一系列带有单碱基突变的D序列的亲和力测定的ELISA结果。
图6a pUDtarget-SV40promoter-Luc lucifease报告质粒示意图。
图6b pHBX-promoter-Luc luciferase报告质粒示意图。
图7人工转录因子对载体pUDtarget-SV40promoter-Luc的作用结果。
图8人工转录因子对载体pHBX promoter-Luc的作用结果。
图9人工转录因子对Hep3B的HBx转录的调控结果。
图10Hep3B与HepG2表达HBx的RT-PCR检测结果对照。
图11人工转录因子ZF(U5D13)-KRAB作用于Hep3B与HepG2稳转细胞株的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权利要求所限定的范围构成进一步的限定。
利用噬菌体展示技术筛选具有新的DNA特异性的锌指的策略最常见的有以下三种：平行筛选(Parallel selection)，顺序筛选(Sequentialselection)以及两部分筛选(Bipartite selection)。
平行筛选操作简便，但是未能考虑到相邻的锌指单元之间的协同作用。顺序筛选虽然充分考虑到了相邻的锌指之间的协同作用，但是在筛选的过程中需要不断地构建新的文库，比较耗时耗力。因此本发明采用的是结合了前边两种筛选方法优点的两部分筛选法。该方法先在Zif268的第二指中引入一个DdeI酶切位点，将Zif268分成两部分，分别随机化前后各一个半锌指构建文库。两个文库分别针对自己的5bp靶序列进行筛选，然后将筛选得到的各一个半锌指连接在一起，构建重组小库，再针对9bp的靶序列筛选，最终得到特异地结合目的靶序列的锌指结构。这是目前用于锌指筛选的最好的噬菌体展示策略，它不仅考虑了锌指的靶序列的重叠以及锌指之间的协同作用，也大大缩短了顺序筛选中的时间，结合96孔或384孔板以及机械手可以实现高通量的筛选。
实施例一，噬菌体展示文库的构建与筛选
1、文库的构建
依照文献[Mark I，Yen C.Rapid，high-throughput engineering ofsequence-specific zinc finger DNA-binding proteins.MethodsEnzymol，2001，340：593-609]，设计普通序列18条，含有随机化位点的序列108条。锌指文库Lib12与Lib23的锌指片段的加磷、退火、连接系常规操作，依照分子克隆实验指南(第二版)进行。
设计引物
Lib-top：5’-TCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGAAGAGA-3’(30nt)
Lib-end：5’-TGTAGCGGCCGCCTTCTGTCTTAAATG-3’(27nt)，
分别对Lib12与Lib23的锌指片段连接产物进行PCR扩增，并在片段两端分别引入SfiI与NotI的酶切位点。
PCR的条件为：使用常规Taq酶，95℃，5分钟；95℃30秒，61℃30秒，72℃30秒(25个循环)；72℃7分钟。
质粒pHB-1HScFv用NotI与SfiI消化，回收大片段(约4.3kb)，制备建库载体片段，连接NotI与SfiI酶切的上述PCR扩增片段。乙醇沉淀浓缩去盐。
制备好的转化载体电转大肠杆菌XL1-Blue感受态，电转孵育后取部分菌液涂布平板以记数。其余的菌液37℃孵育后，加终浓度15％的甘油，菌体冻存于-70℃。
2、文库的筛选
选择HBV adw亚型1175-1194序列，即5’-GCCAAGTGT TTGCTGACGCA-3’，作为锌指靶序列。将此序列拆分为上游9bp靶序列(5’-GCCAAGTGT-3，称为U序列)和下游9bp靶序列(5’-GCTGACGCA-3，称为D序列)，分别筛选上述噬菌体展示锌指文库。具体而言：
针对U序列设计的半库筛选片段分别为：
Lib12：
xUp12-1：5’-GTCTGT GCGGAGTGT TTGCTG-3’
xUp12-2：5’-Biontin-GCG CAGCAA ACACTCCGC ACAGAC-3’
Lib23：
xUp23-1：5’-GTCTGT GCCAAGGCG TTGCTG-3’
xUp23-2：5’-Biotin-GCG CAGCAA CGCCTTGGC ACAGAC-3’
重组之后再筛选的靶序列为：
xall-1：5’-ATCTGT GCCAAGTGT TT GCTGACGCA TTATTA-3’
xall-2：5’-Biotin-GCG TAATAA TGCGTCAGC AA ACACTTGGCACAGAT-3’
针对D序列的半库其筛选片段分别为：
Lib12：
xDown12-1：5’-TATTTA GCGGACGCA ACCATT-3’
xDown12-2：5’-Biotin-GCG AATGGT TGCGTCCGC TAAATA-3’
Lib23：
xDown23-1：5’-GTGTTT GCTGAGGCG ACCATT-3’
xDown23-2：5’-Biotin-GCG AATGGT CGCCTCAGC AAACAC-3’
重组之后再筛选的靶序列为：
xall-1：5’-ATCTGT GCCAAGTGT TT GCTGACGCA TTATTA-3’
xall-2：5’-Biotin-GCG TAATAA TGCGTCAGC AA ACACTTGGCACAGAT-3’
筛选的具体方法为：
i、辅助噬菌体M13K07的培养与效价
A、M13K07效价：
含四环素的LB平板上接种大肠杆菌菌株XL1-Blue，37℃培养14小时。在一个20ml试管中加入5ml 2×YT(或LB)，接入前述平板上的一个菌落。37℃，振荡培养6-8小时。冰浴20分钟，4℃保存(可保存1周左右)。
M13K07噬菌体贮液系列稀释，取适当的稀释度100μl，加入3ml 0.7％顶层LB半固体琼脂(含5mM的MgCl2，47℃保温)中。3ml顶层琼脂中再加入100μl前述4℃保存的菌液，轻轻混匀，倾倒在已铺上一薄层LB固体的培养皿上。待上层凝固，37℃培养。
B、M13K07的培养：
2-3ml 2×YT中接种一个补充基本培养基上长出的大肠杆菌XL1-Blue新鲜菌落，37℃振荡培养至OD600约为0.8。用2×YT系列稀释M13K07，参照前述效价过程铺平板以得到分离良好的噬斑，单斑接入OD600约为0.8的菌液中，并加入终浓度为25μg/ml的卡那霉素。37℃，振荡培养12-16小时。将培养物移入1.5ml离心管中，4℃，12000r/min离心2分钟，取上清于干净管中4℃保存。
ii、文库Lib12与Lib23的拯救(Rescue)
如果没有特别注明是其他浓度，GL(glucose，葡萄糖)终浓度为2％，ZnCl2终浓度为50μM，氯霉素(Cm)终浓度为34μg/ml，四环素(Tet)终浓度为10μg/ml。
-70℃冻存的锌指库Lib12与Lib23每支(1ml)接种于4ml含GL、Tet、Cm、ZnCl2的2YT中，37℃，250r/min振荡培养至OD600约为0.5-1.0。加入4×1010pfu M13K07，37℃，100r/min培养约一个小时。4℃，1000g离心10分钟，弃上清。重悬于2ml含Tet、Cm、ZnCl2的2YT(无GL)中，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素(Ka)，30℃，250r/min培养8小时左右。4℃，1000g离心10分钟，取上清。用0.45μm滤膜过滤，4℃保存。
每轮筛选之前用等体积PBS(加入终浓度20μg/ml超声处理的鲑精DNA，1％BSA(w/v)，1％Tween20(v/v)，终浓度50μM的ZnCl2)封闭。
筛选用PBS-Zn的成分(每升)：NaCl 8g，KCl 2g，Na2HPO4 0.609g，KH2PO4 0.2g。配成10×贮存液，用前稀释至1×并加ZnCl2至终浓度50μM。
iii、链亲和素包被酶连板(使用预包被链亲和素的酶联板时此步骤可以省略)
每孔加入浓度为5μg/ml的链亲和素水溶液100μl，37℃放置两小时或4℃过夜。用PBS(pH7.2，0.01M Na3PO4，0.15M NaCl，0.1％Tween20-v/v)洗孔4次。用200μl PBS(含2％BSA-w/v)封闭。室温放置1小时。再用PBS洗四次，拍干备用。
iv、生物素标记的一条链与未标记的互补链退火
靶序列正反两条链各合成5OD，用80μl pH8.0TE溶解。各取5μl混合，95℃，30秒。关闭水浴锅电源，令其自然降至室温。
v、筛选
步骤iv得到的片段以1∶200用PBS(含50μM ZnCl2)稀释。链亲和素包被板中每孔加入50μl前一步的稀释液。室温放置15分钟之后，加入200μl PBS(含50μM ZnCl2，1％BSA-w/v)封闭，室温放置1小时。倒空各孔，加入50-100μl依照前述步骤拯救的噬菌体液(已用含BSA、Tween20、超声处理的鲑精DNA的PBS封闭1小时)，室温放置1小时。用PBS (含1％BSA-w/v，1％Tween20-v/v，50μM ZnCl2)洗20次。用不加Tween20以及BSA，含有50μM ZnCl2的PBS再洗一次。用50μl 0.1M三乙胺(0.05059g/5ml水)洗脱，10-15分钟后吸出。立即用等体积的1MpH7.4 Tris-Cl中和。取中和液感染400μl OD600约为0.3-0.5的大肠杆菌XL1-Blue，37℃，30-60分钟。取一部分涂Cm+Tet平板以记数，另一部分接入4-5ml含GL、Tet、Cm、ZnCl2的2YT中，37℃摇床培养，准备下一轮的拯救与筛选。
vi、单克隆亲和力的ELISA检测
挑单克隆，依照前述方法拯救得到上清，用等体积PBS(含1％BSA-w/v，1％Tween20-v/v，超声处理的鲑精DNA 20μg/ml，50μMZnCl2)封闭。每孔加入50μl PBS-Zn。室温放置15分钟。加入150μl含2％BSA-w/v、50μM ZnCl2的PBS封闭，室温放置1小时。弃液，加入50μl封闭好的噬菌体液，室温放置1小时。用含50μM ZnCl2、1％Tween20-v/v的PBS洗七次，再用含50μM ZnCl2的PBS洗三次。每孔加入用含1％BSA的PBS以1∶5000稀释比例稀释的HRP-anti-M13IgG 50μl，室温放置1小时。用含50μM ZnCl2、0.05％Tween20-v/v的PBS洗三次，再用含50μMZnCl2的PBS洗三次。加入100μl OPD底物(10ml体系反应缓冲液的配制方法：4mgOPD粉，7187μl H2O，243μl 1M柠檬酸，2570μl 0.2MNa2HPO4，用前加入15μl 30％H2O2)。5-30分钟后，加入100μl 1M(2N)H2SO4终止反应。检测492nm光吸收值或492/624双波长值。
图2为靶序列5-GCCAAGTGT-3(U序列)经噬菌体展示文库Lib12和Lib23筛选四轮之后，ELISA检测各轮筛选的富集效果。其中a-d列为文库Lib12的富集结果，e-h列为文库Lib23的富集结果。1-4行分别表示第1到4轮的富集结果。a、b、e、f行表示阴性对照结果。c、d、g、h行表示每轮筛选获得的洗脱液的拯救上清与靶序列发生了特异性结合的结果。可见随着筛选轮次的增加，特异性逐渐增高。
vii、文库Lib12与Lib23筛选得到的阳性克隆PCR
文库Lib12中筛选得到的阳性克隆的拯救上清各取7.5μl，混合在一起，称为混合模板12。同样，文库Lib23筛选得到的阳性克隆的拯救上清也各取7.5μl，混合在一起，称为混合模板23。以混合模板12为模板，用Taq DNA聚合酶以引物Primer1与Lib12扩增；混合模板23，用引物Primer2与Lib23扩增。PCR反应条件：94℃5分钟；(94℃30秒；61℃30秒；72℃30秒)，25个循环；72℃ 7分钟。扩增得到的PCR产物用试剂盒纯化。
Lib12：5’-GGCAAACTTCCTCCCACAAATGT-3’(23nt)
Lib23：5’-CTCGGATGAGCTTACCCGCCATAT-3’(24nt)
Primer1：5’-TCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGAAGAGA-3’(30nt)
Primer2：5’-TGTAGCGGCCGCCTTCTGTCTTAAATG-3’(27nt)
viii、DdeI消化扩增片段并回收大片段
混合模板12和混合模板23分别经DdeI酶切4小时后，电泳，切胶，用胶回收试剂盒分别回收大片段。
ix、二次筛选小库的建立
viii中回收的两个大片段的连接与PCR扩增为常规操作，步骤略。用引物Primer1和Primer2PCR扩增，条件同前，产物用试剂盒回收，经NotI、SfiI双切后回收。该双切片段连接同样双切的载体pHB-1HScFv大片段，构建二次筛选小库的建库载体，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态。具体而言，取200μl感受态于1.5ml离心管中，放于冰上。加入3μl连接产物，冰上放30分钟。42℃或45℃，30秒，再放于冰上2分钟。加入600μl SOC，37℃孵育1小时。每块Cm+Tet平板涂布400μl，共涂布两块平板。37℃培养至菌落长起。
x、二次筛选小库中挑取单克隆针对靶序列的ELISA筛选
同vi部分。
实施例二，噬菌体展示锌指库的亲和性与特异性鉴定
1、ELISA检测筛得锌指的亲和性
试验步骤同实施例一vi部分。如图3所示，三锌指克隆U5和U37对其筛选靶序列GCCAAGTGT(U序列)具有很好的亲和性，而三锌指克隆D13和D46对其筛选靶序列GCTGACGCA(D序列)具有很好的亲和性。
2、靶序列单碱基突变试验检测锌指克隆的特异性
合成9对生物素标记的新的靶序列，每一对序列中含有一个相对于原9bp靶序列碱基转换(或)的突变。将这九对突变序列与原靶序列分别包链亲和素板，ELISA检测各序列对单克隆的拯救上清的亲和力差异，方法同vi部分。
未引入突变的U序列(示双链序列)：
U：5’-ATATAT GCCAAGTGT ATATAT-3’
U’：5’-Biotin-GCG TATATA ACACTTGGC TATATA-3’
针对U序列的9对突变序列(示双链序列，下划线表示突变位点)：
U-1：5’-ATATAT ACCAAGTGT ATATAT-3’
U’-1：5’-Biotin-GCG TATATAACACTTGGT TATATA-3’
U -2：5’-ATATAT GTCAAGTGT ATATAT-3’
U’-2：5’-Biotin-GCG TATATAACACTTGAC TATATA-3’
U-3：5’-ATATAT GCTAAGTGT ATATAT-3’
U ’-3：5’-Biotin-GCG TATATAACACTTAGC TATATA-3’
U -4：5’-ATATAT GCCGAGTGT ATATAT3’
U’-4：5’-Biotin-GCG TATATA ACACTCGGC TATATA-3’
U -5：5’-ATATAT GCCAGGTGT ATATAT-3’
U’-5：5’-Biotin-GCG TATATAACACCTGGC TATATA-3’
U -6：5’-ATATAT GCCAAATGT ATATAT-3’
U’-6：5’-Biotin-GCG TATATA ACATTTGGCTATATA-3’
U-7：5’-ATATAT GCCAAGCGT ATATAT-3’
U’-7：5’-Biotin-GCG TATATA ACGCTTGGC TATATA-3’
U-8：5’-ATATAT GCCAAGTAT ATATAT-3’
U’-8：5’-Biotin-GCG TATATA AGACTTGGC TATATA-3’
U-9：5’-ATATAT GCCAAGTGC ATATAT-3’
U’-9：5’-Biotin-GCG TATATA GCACTTGGC TATATA-3’
未引入突变的D序列(示双链序列)：
D：5’-ATATAT GCTGACGCA ATATAT-3’
D’：5’-Biotin-GCG TATATA TGCGTCAGC TATATA-3’
针对D序列的9对突变序列(示双链序列，下划线表示突变位点)：
D-1：5’-ATATAT ACTGACGCA ATATAT-3’
D’-1：5’-Biotin-GCG TATATA TGCGTCAGT TATATA-3’
D-2：5’-ATATAT GTTGACGCAATATAT-3’
D’-2：5’-Biotin-GCG TATATA TGCGTCAAC TATATA-3’
D-3：5’-ATATAT GCCGACGCAATATAT-3’
D’-3：5’-Biotin-GCG TATATA TGCGTCGGC TATATA-3’
D-4：5’-ATATAT GCTAACGCA ATATAT-3’
D’-4：5’-Biotin-GCG TATATA TGCGTTAGC TATATA-3’
D-5：5’-ATATAT GCTGGCGCA ATATAT-3’
D’-5：5’-Biotin-GCG TATATA TGCGCCAGC TATATA-3’
D-6：5’-ATATAT GCTGATGCA ATATAT-3’
D’-6：5’-Biotin-GCG TATATA TGCATCAGC TATATA-3’
D-7：5’-ATATAT GCTGACACA ATATAT-3’
D’-7：5’-Biotin-GCG TATATA TGTGTCAGC TATATA-3’
D-8：5’-ATATAT GCTGACGTA ATATAT-3’
D’-8：5’-Biotin-GCG TATATA TACGTCAGC TATATA-3’
D-9：5’-ATATAT GCTGACGCG ATATAT-3’
D’-9：5’-Biotin-GCG TATATA CGCGTCAGC TATATA-3’
图4中，第1-9道分别表示三锌指蛋白U5与发生了单碱基突变的靶序列U序列的亲和力测定的ELISA结果。第10道表示未引入突变的U序列的亲和力检测结果。
图5中，第1-9道分别表示三锌指蛋白D13与发生了单碱基突变的靶序列D序列的亲和力测定的ELISA结果。第10道表示未引入突变的D序列的亲和力检测结果。
如图4和5所示，三锌指U5和D13对于只改变一个碱基的靶序列的亲和力就有很明显的下降，表明它们锌指针对目的序列的特异性很高，能够区分与目的靶序列仅仅相差一个碱基的DNA片段。
实施例三，六锌指蛋白的构建
为了保证特异性，人工转录因子在调控基因表达的时候应当仅针对自己的靶序列起作用。由于人的基因组大约含有3×109bp，因此通常17bp(417种可能的组合方式)或者更长的序列才可能保证其在人类基因组中只有单个拷贝。前面已经提到，每个锌指单元通常识别3bp的序列，所以人工转录因子的DNA结合结构域应该有六个或者更多的锌指单元组成。目前通过文库筛选得到的大多是三锌指结构，于是常常需要把多个锌指单元通过接头串联起来。
针对D序列的三锌指蛋白D13通过SEQ ID NO20所示的接头肽与针对U序列的三锌指蛋白U5融合，构建针对靶序列的六锌指蛋白U5D13。
图1是一个人工转录因子的结果与作用模式图，所述转录因子就含有一个本实施例构建的六锌指蛋白。
实施例四，人工转录因子效应域-KOX1的KRAB域的合成与克隆
1、KOX1的KRAB域分段合成：基于NCBI登录号X52332.1序列，根据人的密码子偏性对个别密码子稍做修改，使其更适合在人的细胞中表达，具体序列如SEQ ID NO21所示。
2、序列的合成以及合成片段的退火连接、PCR扩增和酶切鉴定：上述序列分9段合成，加磷、退火、连接；之后使用Taq DNA聚合酶扩增后连入T载体，转化大肠杆菌JM109；挑克隆提质粒，酶切鉴定。均系常规操作，依照分子克隆实验指南(第二版)进行。
3、序列测定：选酶切片段大小正确的质粒，测序。为了标记方便，本文中称此序列为KRAB。
实施例五，人工转录因子真核表达载体的构建
在人工转录因子的N端加入NLS(核定位信号)，将KRAB结构域序列连接在三锌指或六锌指序列的C端，然后将人工转录因子的全序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)的NheI与XhoI酶切位点之间。
图1是一个人工转录因子的结构和作用模式图，其中，一个六锌指蛋白的C端连接有Kox1的KRAB结构域，KRAB能够抑制靶基因HBx的转录。
实施例六，luciferase报告质粒的构建与人工转录因子活性鉴定
将片段5-GCCAAGTGT TT GCTGACGCA-3(HBV adw亚型，1175-1194)克隆入Promega公司pGL3-Control质粒的MluI和SmaI酶切位点之间，构建luciferase报告质粒pUDtarget-SV40promoter-Luc，图6a为该质粒启动子区的示意图。将HBV adw亚型1155-1355区域(为部分EnhI区域+HBx启动子区)克隆入Promega公司的pGL3-Basic质粒的XhoI和HindIII酶切位点，构建lucifease报告质粒pHBX-promoter-Luc，图6b为该质粒启动子区的示意图。
将识别U序列的三锌指U5、识别D序列的三锌指D13，以及识别序列5-GCCAAGTGT TT GCTGACGCA-3的六锌指U5D13分别与KRAB抑制结构域相连，在N端加入核定位信号，在C端加入FLAG标签，构建人工转录因子。
293T细胞铺24孔板，每孔50000个细胞，分别转染各种人工转录因子表达载体(或空白载体)+Promega公司的pRL-TK质粒+上述两个luciferase报告质粒其中一个。42小时后收获细胞，用Promega公司的GloMax 96 Microplate Luminometer检测仪检测相对荧光值。
图7和图8是基于三锌指蛋白U5、D13，以及六锌指蛋白U5D13所构建的人工转录抑制因子在293T瞬时转染体系中的luciferase测定试验。图7和图8中1-4道均分别表示1.空白载体，2.人工转录因子ZF(U5)-KRAB，3.人工转录因子ZF(D13)-KRAB，4.人工转录因子ZF(U5D13)-KRAB。
如图7和图8所示，针对两个报告质粒，检测的所有人工转录因子都显著下调报告基因luciferase的水平，提示所有检测的转录因子都能作用于靶序列抑制报告基因的转录。
实施例七，人工转录因子在Hep3B与HepG2细胞中的转染与稳转株的筛选
Hep3B或HepG2(一株基因组中不含HBV片段的人肝癌细胞株)细胞铺6孔板，待各孔细胞汇合度达到90％以上时，分别转染空载体以及基于锌指U5D13的人工转录抑制因子ZF(U5D13)-KRAB的表达载体(Hep3B还转染基于U5或D13的人工转录因子表达载体)。具体而言，细胞换无血清MEM；0.3μg质粒与150μl无血清MEM培养基混合，1.5μl脂质体与150μl无血清MEM培养基混合，室温放5分钟，之后将二者混合，室温放置20分钟以后加入6孔板的一孔中。37℃孵育6小时以后换含10％胎牛血清的MEM培养基，37℃继续培养。HepG2细胞用0.7mg/mLG418筛选稳转株，Hep3B细胞用0.5mg/mL G418筛选稳转株，筛得的克隆用0.3mg/mL G418维持培养。
实施例八，Hep3B与HepG2细胞HBx转录水平的定量分析
Hep3B和HepG2细胞，以及两种细胞分别转染空载体或人工转录因子表达质粒筛选得到的稳转细胞株用QIAGEN公司的RNeasy Kit提取每孔总RNA。总RNA各取7μl，加入Promega公司RQ1RNase-free DNase10×Reaction Buffer 1ul，RQ1 RNase-free DNase 2μl，37℃作用25分钟。加RQ1 DNase Stop Solution 1μl，65℃，10分钟灭活酶。上述DNase处理过的两种细胞的总RNA各取10μl，加入Invitrogen公司的Oligo(dT)12-18(500μg/ml)1μl，以及1μl 10mM dNTP mix，热灭活65℃，5分钟。立即在冰上冷却。再加入4μl 5×First-stand Buffer，2μl 0.1M DTT，42℃，2分钟。加入1μl(200units)SuperScriptTM II轻轻吹吸混匀，42℃，50分钟；70℃，15分钟。得到cDNA模板。
常规PCR扩增cDNA模板检测细胞中HBx本底mRNA水平的引物，以及检测内对照β-actin的引物序列如下：
HBx-f：5’-GCTGCTAGGCTGTGCTGC-3’
HBx-r：5’-ATGCCTCAAGGTCGGTCGT-3’
Actin-f：5’-CAACCGCGAGAAGATGAC-3’
Actin-r：5’-AGGGTACATGGTGGTGCC-3’
Real-Time qPCR检测HBx的mRNA的引物，以及检测内对照GAPDH的mRNA的引物序列如下：
Rtx 1：5’-ACCGTGTGCACTTCGCTTC-3’
Rtx2：5’-TTCACGGTGGTCTCCATGC-3’
GAPDH-1：5’-CCATGTTCGTCATGGGTGTGA-3’
GAPDH-2：5’-CATGGACTGTGGTCATGAGT-3’
引物合成5OD，分别用80μl去离子水溶解。反应体系含Hot-Start PCRMasterMix 25μl，cDNA 1μl，左右引物各0.1μl，SYBR Green I 0.5μl，去离子水补足体积至50μl，每个样品重复三孔。统计分析所得数据。
图9中，1-4道分别表示Hep3B转染各种表达质粒后经G418筛选所得到的稳转细胞株：1.空白载体，2.人工转录因子ZF(U5)-KRAB，3.人工转录因子ZF(D13)-KRAB，4.人工转录因子ZF(U5D13)-KRAB。如图9所示，在稳定表达各种人工转录因子的Hep3B细胞中，表达六锌指人工转录因子ZF(U5D13)-KRAB的Hep3B细胞株中HBx的mRNA水平降低最为显著(第4道)。
图10是利用常规方法PCR扩增cDNA模板所得到的Hep3B与HepG2的HBx表达情况。β-actin用做内对照。
实施例九，MTT法测定Hep3B和HepG2细胞的生长曲线
细胞铺96孔板，每孔5000个细胞，每个样品做三孔重复。在24，48和72小时每孔分别加入100μl含终浓度1mg/mL MTT的新鲜培养基，孵育4小时，移除培养基，每孔加入100μl DMSO，室温振荡孵育10分钟，检测570nm吸光值。
图11是分别稳定转染空载体与基于六锌指蛋白ZF(U5D13)-KRAB表达载体所构建的人工转录抑制因子的Hep3B与HepG2稳转细胞株的生长曲线。如图11所示，六锌指人工转录因子ZF(U5D13)-KRAB特异地抑制Hep3B细胞株的生长，而对基因组中不含HBV序列的人肝癌细胞株HepG2的生长没有影响，提示该人工转录转录因子通过识别Hep3B基因组中整合的靶序列5-GCCAAGTGT TT GCTGACGCA-3抑制其下游HBx的转录，从而抑制细胞生长；说明该人工转录因子具有良好的特异性与有效性。
Claims (8)
1.一种特异结合乙型肝炎病毒HBx基因转录调控区的C2H2型三锌指蛋白，所述三锌指蛋白具有3个锌指，每个锌指具有一个α螺旋结构，其特征在于，所述三锌指蛋白的3个锌指的α螺旋的第-1，1，2，3，4，5，6位氨基酸序列依次由下列序列所示：
（1）SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10；或者
（2）SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13；或者
（3）SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16；或者
（4）SEQ ID NO17、SEQ ID NO18和SEQ ID NO19。
2.根据权利要求1所述的三锌指蛋白，其特征在于，所述三锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO1、2、4或者5所示。
3.一种六锌指蛋白，其特征在于，所述六锌指蛋白由权利要求1所述的2个三锌指蛋白串联而成，所述串联的2个三锌指蛋白的氨基酸序列分别由SEQ ID NO4和2所示。
4.根据权利要求3所述的六锌指蛋白，其特征在于，所述串联的2个三锌指蛋白由氨基酸序列如SEQ ID NO20所示的连接肽连接。
5.一种含有权利要求1-4中任一所述锌指蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述锌指蛋白与效应基团相连接。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，所述效应基团选自转录因子的效应功能域、核酸酶、DNA甲基化酶、整合酶、拓扑异构酶。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为一种转录调节因子，其中，所述效应基团为能够影响HBx基因转录的效应功能域。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述效应功能域为KRAB功能域。
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