JPS63502637A - 誘導性熱ショック及び増幅系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 浄書（５畜に度更なし） 明　細　書 本発明は、遺伝子工学の分野にあり、形質転換宿主細胞における高割合ポリペプ チド或いはタンパク質産生方法に向けられたものである。

遺伝子工学を用いて形質転換宿主細胞内に異種（外来）ポリペプチド類或いはタ ンパク質類を発現或いは産生ずることができる。これらの方法によると、目的ポ リペプチド或いはタンパク質をコードする異種遺伝子が発現ベクター中に挿入さ れ、それを次いで宿主細胞中に導入する。形質転換された宿主細胞の複製系が次 いで挿入遺伝子を再現する。適当な条件下において、複製遺伝子が発現され、宿 主細胞タンパク質及び異種ポリペプチド或いはタンパク質の両者を産生ずる。異 種ポリペプチド或いはタンパク質収率は、異種遺伝子の複写数、宿主細胞の複製 系の効率及び目的ポリペプチド及びタンパク質をコードする異種遺伝子に操作可 能に結合されたプロモーターの種類などを含む多くの因子に応じて異なる。

遺伝子増幅を用いて、宿主細胞が含有するプラスミド或いは遺伝子の複写数を増 大することができる。遺伝子増幅系の利用の結果、目的異種遺伝子の高複写数が 得られるが、異種タンパク質を産生ずる異種遺伝子の発現は常に成功するものと は限らない。

一つの研究において〔ラウ等（Ｌａｕ　ｅｔ　ａｌ、）　、モレキュラー・アン ド中セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、４　：１４６９〜１４７５（１９８４年）〕、ジヒドロ葉 酸レダクターゼ遺伝子増幅系を用いてチャイニーズハムスター卵巣細胞における 異種ヒト遺伝子の複写数を増大した。この研究において、哺乳動物誘導性プロモ ーター、メタロチオナイン、を用いてヒトグロビン遺伝子の発現を制御した。カ ドミウムによるメタロチオナインプロモーターの誘導後遺伝の転写が起こったが 、しかし、産生されたメツセンジャーＲＮＡの量はグロビンタンパク質への翻訳 を支持するのには不十分であった。

もう一つの研究において誘導性発現が生じたが比較的低収率であった。ページ、 　Ｍ、（Ｐａｇｅ、Ｍ、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、３７　：１Ｂ９〜１４４　 （１９８５年）は、チャイニーズハムスター卵巣細胞内においてジヒドロ葉酸レ ダクターゼ系により増幅されたヒトベーターインターフェロン遺伝子の発現を記 載している。このベーターインターフェロン遺伝子は硫酸カドミウムにより誘発 された誘導性プロモーター、メタロチオナインに操作可能に結合されていた。結 果は、誘発なしに産生されたものよりもベーターインターフェロンの産生におい て僅かに１．２〜１０．７倍の増大を示したに過ぎなかった（表Ｉ）。

多くの有用なタンパク質は生物学系により少量で合成されており、それはそれら の機能の理解及び医学的応用に対する進歩を制限している。より多量のタンパク 質はこれらのタンパク質の治療用途における精製及び利用を可能にするであろう 。遺伝子工学クローニング技術は、これらのタンパク質をコードする遺伝子を単 離することができる。更に、遺伝子工学技術は形質転換宿主系においてこれらの タンパク質を多量に合成することができるであろう。グリコジル化パターン及び これらのタンパク質の幾つかの二次構造を含む多くの理由により、哺乳動物宿主 細胞発現系における合成が好ましい。

誘導性プロモーターを用いた遺伝子増幅系において、遺伝子増幅後に宿主細胞に おける異種遺伝子の複写数が重要であり、及び誘導時に誘導性プロモーターが高 割合の誘導性を保持し、その結果、目的ポリペプチド或いはタンパク質の高割合 の産生が得られるような、異種ポリペプチド類或いはタンパク質を含む高割合の ポリペプチド或いはタンパク質産生方法を確保することは望ましい本発明は、誘 導性熱シヨツクプロモーターを有する遺伝子増幅系を用いる形質転換宿主細胞に おいて、異種ポリペプチド類及びタンパク質類の産生を含む高割合のポリペプチ ド或いはタンパク質の産生方法を提供するものである。

本発明は下記工程を含んでなる方法において達成された： （ａ）宿主細胞を、熱シヨツクプロモーターの制御下においてポリペプチド或い はタンパク質をコードする異種遺伝子で形質転換する工程、 （ｂ）該異種遺伝子の該形質転換宿主細胞内の複写数を誘導性熱シヨツクプロモ ーター以外のプロモーターの制御下で増幅系を用いて増幅させる工程、（ｃ）該 誘導性プロモーターを、該異種遺伝子を転写するのに十分な温度及び時間で該形 質転換宿主細胞を熱ショックさせることにより誘導する工程、及び（ｄ）該熱シ ョックを受けた細胞を、該熱シヨツク温度より低い温度において及び該転写異種 遺伝子を翻訳するのに十分な時間回復させて、該異種ポリペプチド或いはタンパ ク質を産生ずる工程。

本発明は又、異種遺伝子の複写数を実質的に増大させるためにジヒドロ葉酸レダ クターゼ遺伝子増幅系を用いて、形質転換哺乳動物宿主細胞内において、誘導性 熱シヨツクプロモーターの制御下に異種ポリペプチド或いはタンパク質を高割合 で産生ずる方法も提供する。

図面の説明 第１ａ図はｐＣＶＳＶＥ　１ｌ−ＤＨＦＲプラスミドの遺伝子地図の概略図であ る。第１ｂ図はｐＨ８−ＣＭＹＣプラスミドの遺伝子地図の概略図である。

第２図は組換え細胞系統におけるｃ−ｍｙｃ造成体の複写数を示す。

第３Ａ図及び第３Ｂ図は、組換えＣＨＯ細胞におけるｃ−ｍｙｃ　ｍＲＮＡの存 在、誘導性及び安定性を示す。

第３Ｃ図は、Ｂａ１ｂ　ｃ／３Ｔ３、ＣＨＯ−ＤＵＫＸＢ１細胞及び組換えＣＨ Ｏ細胞系統からの細胞におけるｃ−ｍｙｃ　ｍＲＮＡ配列の比較を示す。

ｍ４Ａ図及び第４Ｂ図はｃ−ｍｙｃタンパク質の時間経過誘導及び誘導細胞内の タンパク質割合の分析を示す。

第４Ｃ図は熱シヨツク後の細胞の放射線標識及びｍｙｃタンパク質の免疫沈降を 示す。

定　義 以下の説明において、組換えＤＮＡ技術において用いられる多くの用語が、広範 に利用される。その様な用語に与えられる範囲を含めて明細書及び請求の範囲の より明確且つ首尾一貫した理解を与えるために、次の定義が与えられる。

プロモーター　開始コドンの近辺に位置した一般的に遺伝子の５′領域として説 明されるＤＮＡ配列。プロモーター領域において、隣接遺伝子の転写或いは発現 が開始される。

一ト残基よりなる骨格により一緒に結合された線状ヌクレオチド類の配列であり 、姓に用いられるようにＤＮＡ及びＲＮＡ重合体を包含し得る。

遺伝子　ポリペプチド或いはタンパク質の造成のための情報を含有するＤＮＡ配 列であり、及び萩に用いられるように５′及び３′未満を含む。

構造遺伝子　メツセンジャーＲＮＡに転写され、次いで特定のポリペプチドに特 徴的なアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列。典型的には、第１の翻訳コドンの 第１番目のヌクレオチドは＋１の番号を付され、及びヌクレオチド類は構造遺伝 子の翻訳領域を通して３′未翻訳領域まで逐次正の整数の番号が付される。翻訳 領域までのプロモーター及び制御領域５′におけるヌクレオチドの付番は第１の 翻訳ヌクレオチドの次の５′ヌクレオチドが−１の番号を付され、逐次負の整数 で進行する。

異種遺伝子　外来性、即ち宿主と異なったドナーから起源する構造遺伝子或いは 化学的に合成された遺伝子であって、宿主とは異なった種のドナーを包含しうる 。この遺伝子は、発現ビヒクルにより形質転換されやすい生物体によっては通常 産生されないポリペプチドをコードする。

−ターが、構造遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現の開始を制御する ということである。

発　現　発現は構造遺伝子がペプチドを産生ずる過程である。それは遺伝子のメ ツセンジャーＲＮＡ（ｍ　ＲＮ　Ａ　）への転写及びその様なｍＲＮＡのポリペ プチドへの翻訳を含む。

クローニングビヒクル　宿主細胞において複製することのできるプラスミド或い はファージＤＮＡ或いはその他のＤＮＡ配列であり、その様なりＮＡ配列がその ＤＮＡの本質的な生物学的機能を失うことなく決定可能な様式で切断される１個 或いは限られた数のエンドヌクレアーゼ認識部位により特徴付けられ、及び形質 転換細胞の同定において使用するのに適した表現型選択マーカーを含有する。マ ーカーは、例えば、テトラサイクリン耐性或いはアンピシリン耐性である。「ベ クター」という用語は時々クローニングビヒクルの代りに用いられる。

発現ビヒクル　通常ある種の調節配列の制御下にある、クローニングビヒクルに 類似した、しかし宿主内において所定の構造遺伝子を発現することのできるビヒ クル。

合のタンパク質の産生。

複写数　細胞が含有するプラスミド或いは遺伝子のゲノム当りの分子数。

構成的　ある生物体は、酵素その他のタンパク質の産生に対して、もしそのタン パク質が全ての生理学的条件下において細胞により常に産生されるならば、構成 的であると言われる。

誘導性　遺伝子或いは遺伝子〜生成物は、もしその転写或いは合成が細胞のエフ ェクターへの曝露により増大されるならば、誘導性であると言われる。例えば、 誘導性熱シヨツクプロモーターは高温の存在により誘導される。

形質転換或いは形質転換された　宿主細胞によるＤＮＡの摂取を含む遺伝子転移 の機構。細胞内に入った後、形質転換ＤＮＡは宿主のそれと組換わるか或いはプ ラスミドとして独立に複製する。

翻　訳　メツセンジャーＲＮＡに含まれている情報を解読するリポソームにより 行なわれるタンパク質合成りＮＡ鋳型上におけるＲＮＡ合成の過程。

発明の詳細な説明 本発明は、形質転換宿主細胞における異種ポリペプチド或いはタンパク質の高割 合（ｈｉｇｈ　１ｅｖｅｌ）産生方法を提供する。本発明は、異種遺伝子に操作 可能に結合した誘導性熱シヨツクプロモーターが相当な複写数に増幅された際に 依然高割合の誘導性を保持するという発見に基づくものである。この方法を用い て、異種ポリペプチド或いはタンパク質の増大した産生が達成される。更に、本 発明の方法はその過剰表現が宿主細胞の生育を害する異種ポリペプチド類或いは タンパク負数の発現に対しても特に有用である。

本発明の方法において、目的ポリペプチド或いはタンパク質をコードする異種遺 伝子は誘導性熱シヨツクプロモーターの制御下にある。この誘導性熱シヨツクプ ロモーターは転写の基底レベルの全くない或いは低いものよりなるものである。

即ち、誘導に先立ち、このタイプのプロモーターはその制御下にポリペプチド或 いはタンパク質を発現しないか或いは僅かに極めて少量発現するにすぎない。低 基底レベルの転写を有する誘導性熱シヨツクプロモーターの具体例としては、ホ ルムグレン等（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）、セル（Ｃｅｌｌ）　、１８ 　：１３５９−１３７０　（１９７９年）により記載され及びアミル等（Ａ＋ｎ ｌｒ　ｅｔ　ａｌ、）モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（河ｏ１ ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、５　：１９７ 〜２０３　（１９８５年）、及びコルセス等（Ｃｏｒ−ｃｅｓ　ｅｔ　ａｔ、） 　、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌｏｇｌｃ ａｌ　Ｃｈｅｃｌｓｔｒｙ）　２５９　：１４８１２−１４８１７　（１９８４ 年）において特性決定されたドロソフィラ・メラノガスタ−（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ 　Ｉａｌｌｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）　７０．　０００ダルトン熱ショックタン バり質遺伝子プロモーター（ｈｓｐ７０）が挙げられる。

各種真核生物からの熱シヨツクプロモーターは同様なメカニズムにより誘導され るように思われる。事実、誘導を荷う配列要素はショウジヨウバエからヒトまで 保存されている〔ベルハム（Ｐｅｌｈａｍ）、セル（Ｃｅｌｌ）　、３０　：５ １７−５２８　（１９８２年）〕。この様に、真核生物源から単離された任意の 熱シヨツクプロモーター、例えばショウジヨウバエｈｓｐ２２及びｈｓｐ２６プ ロモーター〔ニイム等（Ａｙｍｅ　ｅｔ　ａｔ、）、ジャーナル・オブ−［−レ キュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１８２ ：４６９−４７５　（１９８５年）〕は、この系において使用することのできる プロモーターの具体例である。

誘導性熱シヨツクプロモーターは熱ショック遺伝子をドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏ ｐｈ　ｉ　Ｉ　ａ）から単離し、次いでプロモーター領域を酵素的に、化学的に 、或いは両者により得ることができる。いずれの特性決定された真核生物種にも 同様のプロモーターが存在し、及びこれらの種の任意のものを熱シヨツクプロモ ーター源として用いることができる。更に、熱シヨツクプロモーターは、新たに 例えば天然起源のものの代りに実験室における操作により合成してもよい。

本発明の一つの実施態様において、熱シヨツクプロモーターは構成遺伝子に操作 可能に結合しており、及び得られた遺伝子造成物が発現ビヒクル中に導入される か或いは一部を形成する。この発現ビヒクルを次いで利用して適当な宿主細胞を 形質転換する。

本発明のもう一つの実施態様においては、熱シヨツクプロモーターは第１のポリ ペプチドをコードする遺伝子配列に操作可能に結合されており、及びこの遺伝子 配列はもう一つのポリペプチドをコードする第２の遺伝子配列に操作可能に結合 されている。この発現は、第２のポリペプチドのアミノ酸配列及び所望の第１の ポリペプチドのそれの両者を含んでなり、且つそれらの間に所望アミノ酸配列に 隣接して選択切断部位を含有する融合或いは前駆体タンパク質をもたらす。

切断部位は好ましくはメチオニンであるが、この部位は公知の任意の好ましい部 位であってよい。目的ポリペプチドは、好ましくは実際の選ばれた切断部位に対 応する内部切断部位が欠けているのがよい。その他の公知の切断部位としては、 ａｓｎ−ｇｌｙ、ａｓｐ−ｐｒｏｓｌ　ｙＳ、ａ　ｒｇｓ及びｌｙｓ−ａｒｇが 挙げられる。

融合或いは前駆体タンパク質の選択的切断は、発現ビヒクル内の複製環境の外側 で典型的に行なわれる。この後−翻訳工程において、融合或いは前駆体タンパク 質は選択処理により切取られる。例えば、メチオニンが切断部位である場合には 、融合或いは前駆体タンパク質をシアノーゲンブロマイドで処理して目的ポリペ プチドを切取る。その他の公知の切断部位に対しては、切取り処理としてはヒド ロキシルアミン、酸、トリプシン、及びｌｙｓ−ａｒｇ切断酵素などが挙げられ る。

融合された、操作可能に結合された遺伝子の製造方法及びその発現方法は公知で あり、例えば米国特許４．３６６．２４６号明細書に示されている。

典型的には、所望の構造遺伝子配列は宿主細胞に異種であり、即ちそれはその宿 主細胞により天然には産生されない。或いは又、所望の構造遺伝子配列は宿主細 胞により産生されるが、しかし少量産生されるに過ぎない。

従って、本発明を用いることにより、所望タンパク質の収量を増大させることが できる。

宿主細胞の形質転換後、異種遺伝子の複写類を遺伝子増幅系を介して増大する。

本発明の方法において用いることのできる遺伝子増幅系は周知であり、アクセル 等（Ａｘｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）への米国特許４，３９９．２１６号明細書（２６ 〜３０欄）に記載されているようなジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ　ＨＦ　Ｒ） 増幅系が挙げられる。細胞内における遺伝子の高複写数を生成するためのその他 の公知方法としては、アデノシンデアミナーゼ増幅系或いは哺乳動物細胞内にお いて自動複製を可能にするベクター類、例えばＳＶ４０或いはウシバピロマウィ ルス〔マリガン、Ｒ１等（Ｍｕｌｌｉｇ、ａｎ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャ ー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２７７　：１０８−１１４　（１９７９年）；ローウィ 、Ｄ、Ｐ、等（Ｌｏｖｙ、Ｄ、Ｐ、ｅｔ　ａｔ、）、ネイチャー、２８７　：　 ７２−７４　（１９８０年）〕の使用などが挙げられる。

本発明の好ましい方法において、遺伝子増幅系はジヒドロ葉酸レダクターゼ系（ Ｄ　ＨＦ　Ｒ）である。この方法は、ＤＨＦＲ−欠乏宿主細胞をＤＨＦＲＤＮＡ を含有する発現ベクターで形質転換することを含む。変更された表現型ＤＨＦＲ ＋で形質転換された宿主細胞を次いで選択し、及びＤＨＦＲの阻害剤である次第 に増大する濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下において生育することが できる。次第に増大する濃度のＭＴＸ内で生育された細胞は、宿主細胞ゲノム内 のＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、ＤＨＦＲ酵素を過剰産生ずることにより 薬品に対する耐性を発達させる。対象異種遺伝子を含有するクローニングビヒク ルが、ＤＨＦＲ遺伝子を含有するクローニングビヒクルと共形質転換された場合 には、選択圧力下に両方の遺伝子が共に増幅することが知られている。

この様に、本発明に従えば、遺伝子増幅系を用いて熱シヨツク誘導性プロモータ ーに操作可能に結合した異種遺伝子の複写数をかなり増大させる。当業者により 理解されるように、複写数は細胞毎に異なり、用いられる遺伝子増幅系により異 なる。本発明においては、異種遺伝子の複写類は重要であり、即ち、細胞当り約 １００コピ−より多く、より好ましくは細胞当り約１０００コピーより大である 。

遺伝子増幅後、増大した複写数でもって、熱シヨツクプロモーターが、異種遺伝 子を転写するのに十分な温度及び時間において形質転換宿主細胞への熱ショック により誘導される。公知の如く、プロモーターの機能は全て細胞の種類により規 定され、例えばショウジヨウバエｈｓｐ７０プロモーターは異なった細胞の書類 においては異なった条件により誘導される。従って、熱シヨツク温度は用いられ る細胞の種類に応じて異なるが、しかし典型的には４０℃〜約４５℃である。熱 ショックの時間も又用いられる宿主細胞に応じて異なるが、典型的には約１００ 〜約１８０分である。熱ショックに際して、異種遺伝子は目的異種ペプチド或い はタンパク質の鋳型であるメツセンジャーＲＮＡに転写される。

熱ショックを受けた細胞は次いで熱ショックの高温から回復される。典型的には 細胞は転写された異種遺伝子を翻訳するのに十分な低温において及び時間で培養 される。熱ショックを受けた宿主細胞を熱ショックから回復させることにより誘 導された転写異種遺伝子（メツセンジャーＲＮＡ）が高割合の目的異種ポリペプ チド或いはタンパク質に翻訳される。回復温度及び時間は用いられる宿主細胞に おいて異なるが、しかし典型的には約３５℃〜約３９℃の回復温度及び約１００ 〜約６００分の回復時間である。

本発明の方法は、任意のポリペプチド或いはタンパク質を発現するために、好ま しく用いることができる。その様なポリペプチド類或いはタンパク質としては、 酵素類、ホルモン類、抗体類、構造タンパク質類、インターフェロン類、インタ ーロイキン類、インリュリンなどが挙げられるが、これらに限定されるものでは ない。本発明の方法は、それらが過剰発現された場合に宿主細胞の生育を害する 構造遺伝子生成物を発現するために、好ましく用いることができる。その様なポ リペプチド類或いはタンパク質類の具体例としては、ｃ−ｍｙｃなどの腫瘍ケン 類などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の好ましい実施態様においては、異種遺伝子はドロソフィラ熱ショックタ ンパク質７０　（ｈｓｐ７０）プロモーターに操作可能に結合されている。この 遺伝子造成物を含有する発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子を含有する発現ベクタ ーと構成的プロモーターの制御下・に、ＤＨＦＲ−欠乏宿主細胞を共形質転換す る。ＤＨＦＲ遺伝子に操作可能に結合される構成的プロモーターとしては、アデ ノウィルス後期、Ｅ■、ＳＶ４０初期などが挙げられる。

在に含まれる遺伝子造成物及び方法は、哺乳動物宿主細胞におけるポリペプチド 類或いはタンパク質の発現に利用することができる。目的発現構造遺伝子が哺乳 動物タンパク質である場合には、哺乳動物宿主細胞の使用が好ましい。前孔動物 宿主細胞は哺乳動物タンパク質合成に含まれるグリコジル化、ホスホリル化、そ の他の二次的修飾に関して好ましい。前孔動物宿主細胞の具体例としては、チャ イニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ナマルバ（Ｎａｏ＋ａｌｖａ）細胞〔 ウルム等（Ｗｕｒｉ　ｅｔ　ａｔ、）、ディベロップメント・オブ・バイオロジ カル・スタンダード（Ｄｅｖｅｌ、Ｂｉｏｌ　５ｔａｎｄａｒｄ）、６０：３９ ３−４０４（１９８５年））　、ＢＨＫ２１細胞〔ラッドレット等（Ｒａｄｌｅ ｔｔ　ｅｔ　ａｌ、）　、アプライド・マイクロバイオロジー　（Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ、）　、２２　：　５３４−５３７（１９８７１））　 、？ウスＬ細胞〔ハウザー等（Ｈａｕｓｅｒｅｔ　ａｌ、）　、ネイチ＋　−（ Ｎａｔｕｒｅ）　、２９７　：　６５０〜６５４　（１９８２年）〕、及びべＯ （Ｖｅｒｏ）細胞〔ホワイタツカー及びヘイワード（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　ａｎ ｄ　Ｈａｙｖａｒｄ）、ディベロップメント・オブ・バイオロジカル・スタンダ ー　ド　（Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄａｒｄ）、　６０　：１２５ 〜１３１（１９８５年）〕などが挙げられるが、これらに限定されるものではな い。

一般的に、宿主細胞と適合性のある種から得られるレプリコン及び制御配列を含 有するプラスミド或いはウィルス（バクテリオファージ）ベクターが、これらの 宿主に関して用いられる。これらのベクターは通常複製部位、及び１個以上の独 特の制限部位を保有する。

共形質転換された宿主は、公知の手段に従って発酵及び培養され、最適細胞成長 を達成することができる。

ＤＨＦＲ系を用いて、宿主細胞はメトトレキセートの存在下において生育される 。メトトレキセートの濃度は、段階的に増大されて宿主細胞のメトトレキセート への耐性を増大させ、遺伝子の増大した増幅を与える。例えば、初期培養は、０ ０５μＭメトトレキセート中で行なわれる。濃度はほぼ４倍の段階で増大され、 最終濃度は１ｍＭ程度に高いものであり得る。

好ましい発酵操作は次の通りである。即ち、共形質転換された宿主、好ましくは 哺乳動物細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が宿 主細胞の生育要件に合致する栄養物質を含有する培養培地中に導入される。増幅 された異種遺伝子を有する宿主細胞は、最大生育速度を達成するように選ばれた 培養条件下において生育される。温度条件は宿主に応じて異なるが、典型的な最 適範囲は約３５℃〜約３９℃であり、３７℃が形質転換されたＣＨＯ細胞に対し て最も好ましい。異種遺伝子の複写数は典型的には約１００〜約３．　０００で ある。

細胞が最適密度に達した後、熱シヨツクプロモーターを誘導する。この工程に際 し、温度条件は約り０℃〜約４５℃に上げられるが、４３℃が最も好ましい温度 条件である。この温度は異種遺伝子をメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写 するために、このレベルに典型的には約１５分間〜約１８０分間保たれる。

熱ショックの後、細胞及びｍＲＮＡを、異種ポリペプチドをメツセンジャーＲＮ Ａ鋳型から産生即ち翻訳するのに十分な、より低温において及び時間熱から回復 される。好ましい温度は約り５℃〜約３９℃、より好ましくは約３７℃である。

回復及び産生時間は典型的には約６０〜約６００分である。

産生された異種ペプチドは公知の方法に従って回収される。本発明のこの方法を 用いると、産生されるポリペプチド或いはタンパク質の割合は、構成的プロモー ターにより産生されるそれよりも２０〜１００倍高い。本発明の好ましい実施態 様は、異種ポリペプチド或いはタンパク質が形質転換された宿主細胞の生育を害 する場合に、特に有用である。この方法は、プロモーターの異種遺伝子の発現へ の誘導を約５時間以内に達成することができる。

以下の具体例は、本発明を実施する際に用いた物質及び方法を更に説明するもの である。これらの例は本発明を全く限定する趣旨のものではない。

例 以下の具体例において、これらの操作を用いた。

細胞 ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠乏ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＤＵＫＸ　Ｂ１）をり、チ ャシン（Ｌ、Ｃｈａｓｉｎ）、（コロンビア大学、ニューヨーク）から得た。ウ ルラーブ、Ｇ。

等（Ｕｒｌａｕｂ、Ｇ、ｅｔ　ａｔ、）プロシーディング・オブ・ナショナル− アカデミ−・アンド・サイエンス・Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　７７　：　４２１６−４２２０（１９ ８０年）。トランスフェクションに先立ち、細胞を、アデノシン、デオキシアデ ノシン及びチミジンを各々１０μｇ／ｍｌの最終濃度に添加した１０％透析ＦＣ ５でアルファー変性したＭＥＭ内で生育させた。

ＤＨＦＲ−プラスミドを含有する細胞を１０％透析ＦＣ６を補給し、指示された 量の薬品メトトレキセートを含有するアルファー変性ＭＥ　Ｍ内に維持した。

ＤＮＡトランスフェクション及び増幅 ＣＨＯ−ＤＵＫＸ　Ｂｌ細胞を、グラハム及びヴアンデル　ニブ（Ｇｒａｈａｍ 　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）のリン酸カルシウム共沈澱技術〔グラハム、 Ｆ、Ｌｏ等（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ。

ｅｉ　ａｌ、）　、ピロロジー（Ｖｊｒｏｌｏｇｙ）　、５２　：　４５６〜４ ６７　（１９７３年）及びキックストン、Ｒ，Ｅ、等（Ｋｌｎｇｓｔｏｎ、Ｒ， Ｅ、ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１ １．Ｂｉｏｌ、）　４　：　１９７０−１９７７（１９８４年）に記載〕の修正 方法によりトランスフェクションさせた。クローンをクローニング円筒を用いて 選び出し、６個の独立の細胞系統を確立し、それらから４つの細胞系統（４−Ｂ ３−ＭＹＣ，５Ａ−Ｂ９−ＭＹＣ，５Ｂ−Ｂ３−ＭＹＣ，６Ａ−Ｂ３−ＭＹＣ） を０．００５μＭの濃度から始まる段階的４倍増大濃度のメトトレキセート内で 生育させた。細胞は、再びメトトレキセートの濃度を増大する前に各増大した選 択のレベルに２〜４週間順化させた。全ての細胞系統は最終的に３２０μＭメト トレキセート中で確立させた。

プラスミド類 プラスミドｐＣＶＳＶＥＩＩはキックストン、Ｒ，Ｅ。

等（Ｘｌｎｇｓｔｏｎ、Ｒ，Ｅ、ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・セルラー・バ イオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｊｏｌ、）　４　：　１９７０−１９７７　 （１９８４年）に記載されている。プラスミドｐＨ３ｍｙｃは次の様に造成され た。即ち、ｐＳｖ２ｍｙｃ　（ランド、Ｈｌ等（Ｌａｎｄ、Ｈ，ｅｔ　ａｔ、） 、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３０４　：　５９６−６０１　（１９８３年） 〕をＸｂａｌで切断し、フレノウポリメラーゼを用いてプラント（ｂｌｕｎｔ） 化し、次いでＣ−ｍｙｃゲノム断片を単離するためにＢａｍＨＩで切断した。こ の断片をＨｉｎｃ■及びＢａｍＨＩ切断ｐＳＰ６−Ｂ５−９にクローニングして ｐＨ５ｍｙｃを得た。ｐＳＰ６−ＨＳ−９は、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ 　ｌａ）熱シヨツクタンパク質を含有するｐ２３２．３　［ホルムグレン、Ｒ９ 等（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ、Ｒ。

ｅｔ　ａｌ、）　、セル（Ｃｅｌｌ）　、１８：１３５９−１３７０（１９７９ 年）〕からプロモーター含有Ｈｉｎｄｍ／ＰｓｔＩ断片を単離し、次いでこの断 片をＰｓ　ｔ　Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＳＰ６５にクローニングすることによ り造成した。

ＲＮＡ及びＤＮＡの分析 細胞質ＲＮＡの単離及び分析は、ＳＰ６ポリメラーゼを用いて造成された放射線 標識ＲＮＡプローブを用いてファバロロ、Ｊ１等（Ｆａｖａｌｏｒｏ、Ｊ、ｅｔ 　ａｌ、）、メソッド・オブ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、ＥｎｚｙＩＩｌｏ ｌｏｇｙ）　６５　ニア１ｇ−７４２（１９８０年）及びメルトン、　Ｄ、　Ａ 。

等（Ｍｅｌｔｏｎ、Ｄ、Ａ、ｅｔ　ａｔ、）、ヌクレイツク・アシツズ・リサー チ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　１２　：　７０３５−７０５６（１９ ８４年）に記載されている方法に従って行なった。

細胞系統からのゲノムＤＮＡの分析は、制限ＤＮＡ分離のためのミニゲル及びＳ Ｐ６ポリメラーゼにより合成された放射線標識ＲＮＡプローブを用いてサザーン （Ｓｏυ−ｔｈｅｒｎ）法に従って行なった。

組換え細胞系統の誘導 組換え細胞は、誘導の前日１０ｃｍペトリ皿中に６０〜８０％の集合密度を有す るように分割された。それらは４３℃に予備加温された培地を供給することによ り熱ショックを与えられ、その温度においてインキュベーター中で１〜４時間、 好ましくは２時間保たれた。培地を、細胞を３７℃で１〜９時間、好ましくは２ 〜４時間回復させるために、その時間後再び変えた。

Ｃ−ｍｙｃタンパク質の分析及び同定 細胞の溶解のために２ｍｌ　ＲＩＰＡ緩衝液〔クレメンス、Ｒ，（Ｋｌｅｍｅｎ ｓ、Ｒ，）　、エンボ・ジャーナル（ＥＩＩｌｂ。

Ｊ、）４：　２０５３−２０６０　（１９８５））を１０ｃｍ皿内の５０〜ｂ ゴム棒の助けを借りて擦り落し、高度に粘稠な液を氷上で各５秒間３回超音波処 理した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンプロット分析を１２％ゲルを用いて行 なった〔ハン、Ｓ、Ｒ，及びアイゼンマン、Ｒ，Ｎ、（Ｈａｎｎ、Ｓ。

Ｒ９及びＥｉｓｅｎｍａｎ、Ｒ，Ｎ、）、（１９８４年）モレキュラー・セルラ ー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　４　：２４８６−２４９ ７　（１９８４年）〕。Ｃ−ｍｙｃタンパク質の免疫検出のために、ヒトｃ−ｍ ｙｃタンパク質に対して産生じたポリクローナル及びモノクローナル抗体を用い た。これらの抗体はＲ，シップナイト（Ｒ，Ｃｈｉ−ｚｚｏｎｉｔｅ）　（ホフ マンラロシュ（Ｉｌｏｆ’ｍａｎｎ−ＬａＲｏｅｈｅ）、ナラトリ−（Ｎｕｔｌ ｅｙ）　）からの贈与品である。３２−リン酸標識化細胞タンパク質を免疫沈降 させるために、１００μｍの超音波処理したＲＩＰＡ−緩衝液溶解物を２５μｌ タンパク質Ａセフアロース〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍ−ａｃｉａ）　）と４℃ において一部揺すりながらインキュベートした。この懸濁液を次いで１３５００ Ｘｇにて１５分間遠心分離した。上澄液に１μｍのモノクローナル抗−ｃ−ｍｙ ｃ抗体を添加し、混合物を室温で１．５時間インキュベートした。次いで５μｌ のウサギ抗−マウスＩｇＧ（アフィニティ精製、２５ＣＤ１ｇ／ｍｌ、カッペル （Ｃａｐｐｅｌ）　、クーパー・バイオメディカル（ＣｏｏｐｅｒＢｉｏｍｅｄ ｉｃａｌ）　）を２０μｍタンパク質Ａセファ０−スと共に添加した。懸濁液を ４℃で揺動ホイール上でインキュベートし、次いで１３５００ｘｇにおいて１０ 分間遠心分離した。沈澱物を３同各１ｍｌの０．５ｍＮａＣ１を含有するＲＩＰ Ａ緩衝液で洗浄してから５０μｌ　２Ｘレンムリ（Ｌａｅｍｉｌｉ）試料緩衝液 中に再懸濁させた。この試料を１００℃で３分間加熱し、１５μｌのアリコート を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に負荷するために用いた。放射標識化５３ ５−メチオニン及び酸不含ホスフェートをＮＥＮから得た。細胞タンパク質の標 識化は、熱ショックの際に各成分から細胞を取出し、標識化成分を回復時間の際 に添加することにより行なった。

例　１ ｃ　−ｙｍｃ遺伝子のＣＨＯ細胞内における増幅最初の試みとして、構成的プロ モーター上の遺伝子（ｐＳＶ２−　ｃｍｙｃ）をＤＨＦＲ発現を選択として用い てＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ−ＤＵＫＸ　Ｂｌ細胞系統中に導入することにより、ｃ− ｍｙｃタンパク質を過剰発現することが行なわれた。このトランスフェクション 後形成されたコロニーは異常な発現型を有した。即ち、選ばれたコロニーのほと んどが安定な系統に生育せず、３個の得られた安定な系統のうち僅かに１つがＣ −ｍｙｃＲＮＡを発現したに過ぎなかった（データ示さず）。この系統の細胞は 極めて屈折的であるように見え、生育が悪く、ｃ−ｍｙｃの構成的過剰発現は細 胞毒性であることを示唆した。従って、プラスミドｐＭＳ−ｍＹＣを造成した（ 第１ａ図）。このプラスミドは極めて低い基底発現レベルを有するドロソフィラ （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　ｈ　ｓ　ｐ７０プロモーター領域及びブラスマ細胞 腫から単離されたマウスＣ−ｍｙｃ遺伝子の第２及び第３エクソンを結合する〔 ジエン−オン、Ｇ、１．等（Ｓｈｅｎ−Ｏｎｇ　、　Ｇ　、　ｌ　、　ｅｔａｌ 、）セル（Ｃｅｌｌ）３１　：４４３−４５０　（１９８２年）〕ｐＨＡ−ｍｙ ｃにおいて、ｈｓｐ７０転写開始部位の最初のＡＵＧ３’　はｍｙｃタンパク質 のそれである。

第１ａ図は発現ベクターｐＨ３−ｒｒｌ’　Ｃの造成を示す。

このプラスミドはエクソン２における翻訳開始コドンの上流４８ｂｐの独特のＸ ｂａ１部位からエクソン３の下流約２．５ｋｂの独特のＢａｍＨ１部位までのゲ ノムマウスｃ−ｍｙｃ断片を含有する。塗り潰された囲みはｍｙｃコード化領化 合域し、斜線を付した囲みはマウスｃ−ｍｙｃゲノム配列の残部を示す。白抜き 囲みは、ショウジヨウバエｈｓｐ７０プロモーター領域を示し、及び矢印は転写 の開始部位を示す。プロモーター領域とＣ−ｍｙｃ遺伝子の間の融合はｈｓｐ７ ０プロモーターの５′未翻訳領域の＋８８にある。

第１ｂ図はＤＨＦＲ選択ベクターｐＣＶＳＶＥＩＩ　−ＤＨＦＲを示す。ＤＨＦ Ｒコード化領域はべた囲みにより示され、スプライス及びポリアデニル化信号は 斜線を付した囲みにより示され、及びアデノウィルスＥＩＩプロモーター及びＳ Ｖ４０エンハンサ−領域は白抜き囲みにより示され領域中に含まれている。この プラスミドの詳細はキックストン、　Ｒ，Ｅ、等（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｒ，Ｅ、 ｅｔ　ａｔ、）、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ、）４　：１９７０−１９７７　（１９８４年）に見られる。

プラスミドｐＭＳ−ｍｙｃ　（５μｇ）及びｐｃＶｓＶＥＩＩ−ＤＨＦＲ（Ｉμ ｇ）をＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯＤＵＫＸ　Ｂｌ細胞中に導入した。細胞を選択におい た後、１０日後に個々のコロニーをクローニングし、引続いて細胞系統に拡大し た。６個の細胞系統をｐＨＳ−ｍｙｃの存在について試験したところ、全てうに プラスミドを含有した。これらの系統の４つを、ＤＨＦＲ機能の拮抗剤である薬 品メトトレキセートを段階的に増大する濃度で含有する選択培地内で培養した。

この選択圧力の結果、細胞生存能力を許容するためにトランスフェクションされ たＤＨＦＲ遺伝子及び付随ＤＮＡ（７）増幅が生ずル〔アルド、Ｆ、　Ｗ、等（ ／＋ｔ、Ｆ、Ｗ。

ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、２５３　：　１３５７−１３７０（１９７８年）及び 米国特許４，３９９，２１６号明細書〕。これらの系統を３２０μＭメトトレキ セート中で確立後、各細胞系統に導入されたｃ−ｍｙｃ造伝遺伝複写数をめ、異 なった割合のメトトレキセートにおいて生育する細胞系統における導入ｃ−ｍｙ ｃ遺伝子の複写数と対比した。

第２図は組換えＣＨＯ細胞系統におけるｃ　−ｍｙｃ造成物の複写数を示す。ゲ ノムＤＮＡをＨｉｎｄｕで切断し、アガロースゲル電気泳動及びニトロセルロー スＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ膜（ＮＥＮ）へのサザーン転移にかけた。こ れらの膜を次いでＲＮＡプローブ、ｃ−ｍｙｃエクソン２、イントロン２及びエ クソン３のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列を含有するＳＰ６ポリポリーゼ ｊｎ　ｖｊｔｒｏ合成３２Ｐ−ＲＮＡにハイブリダイズした。右側の最後のレー ンは放射標識１ｋｂ−はしごＤＮＡ（ＢＲＬ）を含有する。レーン６〜９は３２ ０　ｕ　Ｍメトトレキセートにおいて生育する４つの異なった組換え細胞系統か ら単離されたゲノムＤＮＡ　（２μｇ）を示す。

レーン１３〜１６は異なった濃度のメトトレキセートにおいて生育する細胞系統 ５Ａ−Ｉｓ−ＭＹｃから単離されたゲノムＤＮＡ　（０，５μｇ）を示す。レー ン１〜４及び１０〜１２はプラスミドｐＨＳ−ｍｙｃから単離されたゲノムＤＮ Ａを示す。

プラスミドｐＭＳ−ｍｙｃを用いて作られた再造成物に対比して、これらの組換 え細胞系統はほぼ９００（細胞系統４）　、２７００　（細胞系統５Ａ）、９０ （細胞系統５Ｂ）及び１５００　（細胞系統６Ａ）の導入されたＣ−ｍ　ｙ　ｃ 遺伝子のコピーを含有した。４つの細胞系統のうちの１つ（６Ａ）は第２図の余 分のバンド、レーン９により証明されるように追加の再配列ｃ−ｍｙｃ遺伝子も 含有した。これらの割合のＤＮＡは第２図の細胞系統５Ａ、レーン１３〜１６に ついて示されるように選択に際しての複写数の増幅の結果であった。

組換え細胞系統内の増幅ｃ−ｍｙｃ造伝子の遺伝が誘導されるかどうかをめるた めに、ＲＮＡを３７℃或いは４３℃において２時間インキュベートされた生育細 胞系統から単離した。第３図、Ａ及びＢは単離され、全ドロソフィラ（Ｄｒｏｓ ｏｐｈｌｌａ）　ｈ　ｓ　ｐ　７０プロモーターの配列を含有するＳＦ３　ＲＮ Ａポリメラーゼを用いて作られた３２Ｐ−標識化ＲＮＡプローブにハイブリダイ ズした未誘導（−）及び熱シヨツク誘導（＋）（４３℃で２時間）Ｍｉ換え細胞 からの細胞質ＲＮＡを示す。これらのハイブリッド分子は一本鎖領域を切断する ためにＲＮａ　ｓ　ｅ　Ｉで処理した。得られた分子を６％非−変性ポリアクリ ルアミドゲル上で分離した。

第３Ａ図において、レーン１〜１０は０メトトレキセート中において元々単離し た異なった組換え細胞系統からのＲＮＡ試料（１０Ｐｇ）の分析結果を示す。使 用した細胞系統は図中に示す。レーン１１〜１６は異なった濃度のメトトレキセ ートで生育する系統５Ａ　−ＨＳ　−ＭＹＣからのＲＮＡ試料（５μｇ）の分析 結果を示す。

細胞系統の元の単離物（レーン１〜１０）及び増幅細胞系統（レーン１１〜１６ ）の両者において、熱シヨツク後のｈｓｐ７０−ｃ−ｍｙｃ融合遺伝子からの適 当に開始されたメツセージの量は実質的に増大した。誘導後のＲＮＡの割合はＤ ＮＡ複写数が増大すると共に増大した（レーン１１〜１６）。組換え遺伝子は増 幅細胞系統においてさえも、高度に誘導性に留どまる（レーン５及び６をレーン １５及び１６と対比せよ）。正確な誘導の量を定量することは発現の基底レベル を検出することが困難なために困難である。

第３Ｂ図はＡにおいて分析された細胞系統４−ＨＳ−ＭＹＣ（レーン１〜４）　 、５Ａ−ＨＳ−ＭＹＣ（レーン５〜８）及びＣＨＯ−ＤＵＫＸ　（レーン９及び １０）からのＲＮＡ試料（３μｇ）を示す。ＲＮＡは３７℃において生育する細 胞（レーン１．５及び９）、或いは４３℃において２時間インキュベートされ、 ３７℃において１時間（レーン２及び６）、２時間（レーン３．７及び１０）或 いは３時間（レーン４及び８）回復された細胞から単離された。

メツセージの完全性をめるために、ｃ−ｍｙｃの第２及び第３エクソンを包含す るＲＮＡプローブを用いた。

このプローブはＢａ　１　ｂ　−ｃ３Ｔ３細胞における内在Ｃ−ｍｙｃ遺伝子に 対すると同様に組換え系統において同一の一次ＲＮＡ構造を現わした。組換えレ ーンにおける誘導ＲＮＡ割合はＢａ１ｂ／ｃ　３Ｔ３細胞の内在遺伝子に対して 観察されたよりも少なくとも１００倍高かった。第３Ｃ図はＢａ１ｂ　ｃ／３− Ｔ３、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ　Ｂｌ細胞及び組換えＣＨＯ細胞系統からの細胞におけ るｃ−ｍｙｃ　ｍＲＮＡ配列の比較を示す。

３７℃に保たれた細胞（−）からの及び４３℃において２時間誘導された細胞（ ＋）からの細胞質ＲＮＡ　（５μｇ）を単離し、マウスｃ−ｍｙｃ遺伝子のＰｓ ｔｌ−ＨｔｎｄＩＩ［断片の配列（エクソン２、イントロン２及びエクソン３） を含有する放射標識化ＳＰ６ポリメラーゼ作成ＲＮＡにパイプリダイズＬ１及び ＲＮａｓｅｌで消化した。得られた分子を６％非−変性ポリアクリルアミドゲル 上で分析した。レーン１及び２（Ｂａｌｂ／ｅ３Ｔ３細胞からのＲＮＡ）　、及 び３及び４　（ＣＨＯＤＵＫＸ細胞）を７２時間曝露として示されたのに対し、 レーン５〜１２（示されたＨＳ−ＭＭＣ系統からのＲＮＡ）は同一ゲルの８時間 曝露である。

時間経過はｃ−ｍｙｃ　ＲＮＡ割合が３時間を通しての熱ショックの時間の増加 と共に増加し続けたことを示した（データ示さず）。Ｃ−ｍｙｃタンパク質合成 はこれらの系統において４３℃においては起こらないので（例３において説明） 、熱誘導された細胞系統を３７℃に戻した場合に高ＲＮＡ割合が持続するか否か をめることは興味深いことであった。ＲＮＡ割合は温度シフト後３時間比較的一 定に留どまった（第３Ｂ図）。

４３℃における２時間の熱ショックの直後組換え細胞系統内にｃ−ｍｙｃタンパ ク質を検出する最初の試みがなされた。その時点において３５ｓ−メチオニンに よるパルス標識化或いは免疫プロッティングによって判断して何等の検出可能な Ｃ−ｍｙｃタンパク質が作られていなかった。しかしながら、これに対して細胞 を２時間の熱シヨツク後３７℃で回復させたところ、Ｃ−ｍｙＣタンパク質は免 疫プロッティングにより検出可能であり、及びタンパク質の割合は回復時間の増 大と共に増大した。

第４図、Ａ及びＢはｃ−ｍｙｃタンパク質の誘導の時間経過及び誘導細胞内のタ ンパク質割合の分析を示す。

ＲＩＰＡ−緩衝液溶解物（２ｍｌ）はそれらを３７℃において生育後（第４Ａ図 、レーン１．５．９．１１；第４Ｂ図：レーン１．３．７）及び４３℃において ２時間の熱シヨツク誘導後及び３７℃における各種回復時間後（第４Ａ図：レー ン２及び６．１時間回復；レーン３．７及び１０．２時間回復；レーン４及び８ ．３時間回復；第４Ｂ図：レーン４．１時間回復；レーン２及び５．２時間回復 ；レーン６．３時間回復）、１０ｃｍ皿内において７０〜８０２６集合細胞から 調製した。溶解物を１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（試料当り２０μｌ）にかけ、タ ンパク質を電気泳動的にニトロセルロース濾紙（Ｓ＋Ｓ。

ＢＡ８５）に転移させた。ｃ−ｍｙｃタンパク質は抗Ｃ−ｍｙｃモノクローナル 抗体［Ｒ，シゾナイト（Ｒ，Ｃｈｉ−ｚｚｏｎｉｔｃ）、ホフマンーラロシュ（ Ｈｏｒｆ＋ｎａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｃ）　；１　：　２０００稀釈〕及び１２５ ヨウ素標識化タンパク質Ａ（Ｎ　Ｅ　Ｎ）とインキュベーションして検出した。

第４Ｂ図において、レーン８及び９は組換え昆虫細胞ＣＧ、　シュ（Ｇ、Ｊｕ） 　、ホフマンーラロシュ（Ｈｏｌ’ｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）から得られた 精製ｃ−ｍｙｃを含有する（レーン８；１０μｇ１　レーン９；５０μｇ）。

マウスｃ−ｍｙｃに保存されているヒトｃ−ｍｙｃタンパク質〔ミャモト、Ｃ１ 等（Ｍｉｙａｍｏｔｏ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・セルラー・バイオ ロジー（Ｈｏｔ　、Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ　、）５　：　２８６０−２８６５　 （１９８５年）〕の一部に対して産生されたモ、ツクローナル或いはポリクロー ナルのいずれかにより認識された相対易動度６４，０００．６６．０００及び７ ５，０００を有する３つのバンドが観察された。これらのうち、小さい方の２つ は従来の研究において見られている〔シュツブ１Ｍ１等（５ｃｈｖａｂ　、　Ｍ 。

ｅｔ　ａｔ、）　、ネイチ−？　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１５　：　３４５− ３４７　（１９８５年）；ハン、Ｓ、　Ｒ，等（Ｈａｎｎ、Ｓ、Ｒ。

ｅｔ　ａｔ、）　、セル（Ｃｅｌｌ）　３４　：　７８９−７９８（１９８３年 ）；ラムゼイ、Ｇ、（Ｒａｒｎｓａｙ、Ｇ、）プロシーディングズ・オブ・ナシ ョナルアカデミツク・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）　ＵＳＡ、　８１　：　７７４２−７７４６　（１９８４年）；及びハン、Ｓ 、　Ｒ，（Ｉ（ａｎｎ、Ｓ。

Ｒ，）及びアイゼンマン、　ＲｏＮ、（Ｅｉｓｅｎｍａｎ、Ｒ，Ｎ、）、モレキ ュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ　、Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、）４　： 　２４８６−２４９７　（１９８４年）〕。

〕５Ａ−Ｈ３−ＭＹＣ系により産生されたｃ−ｍｙｃタンパク質の量は、より低 いｃ−ｍｙｃ造成物の複写数を有する４−Ｈ５−ＭＹＣ系統から得られる量の少 なくとも２倍高い。タンパク質の割合を昆虫発現ベクター〔ミャモト等（Ｍｉｙ ａｍｏｔｏ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍ ｏｌ、Ｃｃｌｌ、Ｂｉｏｌ、）　、５　：２８６０−２８６５　（１９８５年） 〕において産生された精製タンパク質と比較することにより、１０９個ＣＨＯ細 胞がほぼ１ｍｇのｃ−ｍｙｃタンパク質を産生ずると推定された（第４Ｂ図、レ ーン６及び９を対比）。

これらの系統は、はぼ２０コピーの内在ｃ−ｍｙｃ遺伝子を含有するヒト腫瘍系 統Ｃ０ＬＯ３２０Ｈ５Ｒ〔シュワブ等（Ｓｃｈｗａｂｂ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、）　 、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１５：３４５−３４７　（１９８５年）〕よ りも実質的に多量のｃ−ｍｙｃタンパク質を産生ずる（第４Ａ図におけるレーン ８及び１１、及び第４Ｂ図におけるレーン６及び７を比較）。

回復期間に際しての高割合のｃ−ｍｙｃタンパク質の存在は、ｃ−ｍｙｃはこの 期間において組換え系統において作られるより豊富なタンパク質の一つであるこ とを暗に示す。これは第４Ｃ図に示されるように実証された。

第４Ｃ図はｃ−ｍｙｃタンパク質が回復時に組換え系統内に合成された主たるタ ンパク質の一つであり、それがホスホタンパク質として作られたことを示してい る。

３５Ｓ−メチオニン（レーン１〜１４）及び３５ホスフエート標識化タンパク質 （レーン５〜１０、免疫沈降：レーン１１〜１７）のＲＩＰＡ緩衝液溶解物は１ ２％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離された。免疫沈降は上記の如く行なわれた。タン パク質単離物は３７℃（−）において生育するか或いは４３℃において２時間誘 導され（十）、及び３７℃において２時間（レーン２．４．６．９．１２及び１ ５）或いは４時間（レーン７．１０．１３．１６及び１７）回復させられた、指 示された細胞系統からのものであった。レーン１７はレーン１６の光曝露である 。

得られた細胞溶解物の分析は、ｃ−ｍｙｃが熱ショック後１〜３時間のこの期間 に細胞系統５Ａ内において最も活性に合成されたタンパク質の一つであることを 示す（第４Ｃ図、レーン４）。

踊乳動物Ｃ−ｒｒｌ／Ｃタンパク質はホスホリル化されることが示されている〔 ハン等（Ｈａｎｎ、Ｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、）、セル（Ｃｅｌｌ）　３４　：　７ ８９−７９８　（１９８３年）、ラムゼイ（ＲａｒＱｓａｙ、Ｇ、）、プロシー ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミツク・サイエンス・Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ“ＩＡｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、８１　：　７７４２−７７ ４６　（１９８４）及びハン及びアイゼンマン（）Ｉａｎｎ、Ｓ、Ｒ，ｅｔ　ａ ｌ、、ａｎｄ　Ｅｉｓ−ｅｎｍａｎ、　ＲＮ、）モレキュラー・セルラー・バイ オロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　４　：　２４８６−２４９７　（ １９８４年）〕。組換え細胞系統４及び５Ａにおいて産生されたＣ−ｍ”／Ｃタ ンパク質は又ホスホリル化され、回復期間内に標識化される主たるホスホタンパ ク質である（第４Ｃ図、レーン６．７及び９．１０）。免疫沈降はＣ−ｍｙｃタ ンパク質の全３種がホスホリル化されているようであることを示す（第４Ｃ図、 レーン１２．１３及び１５〜１７）。５Ａ−Ｈ３−ＭＭＣ細胞系統の培養物は制 限なしにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　（１２３０１Ｐａｒｋｌ ａｗｎ　Ｄｒ、、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２）に１９ ８６年２月４日ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ９０１０の下に寄託された。この寄託は寄 託物の永久性及び公衆によるそれへの容易な入手可能性を保障するものである。

例　４ 最初の経験はｃ−ｍｙｃの過剰産生は細胞毒性であるという可能性を指摘した。

この仮説を試験するために、ｃ−ｍｙｃの誘導後の組換え系統の生存可能性を検 討した。組換え系統を約１０６／１０ｃＩＴ１皿の密度でプレート培養し、３７ ℃で５時間放置し、次いで４３℃で２時間熱シヨツクを行ない、及び次いで３７ ℃に戻すか、或いは３７℃に放置した。３７℃において２日後に、熱ショックを 受けた組換え細胞の皿の上には生きた細胞が残らなかったのに対し、組換え系統 の対照皿並びに平行系統の熱ショック及び対照皿は共に集密であった。他の３つ の組換え系統についても同様な結果が得られた。この回復期間内の細胞の顕微鏡 検査はｃ−ｍｙｃの誘導後更に細胞分裂することなくゆっくり死滅したことを示 した。

前記発明を明確性及び理解を目的として図解及び具体例により幾らか詳細に説明 した。ある種の変更及び修正が請求の範囲に掲げられた範囲によってのみ制御さ れる本発明の範囲内において行なわれることは自明であろう。

（抄　訳） 原英文明細書第２６頁第２４行に記載の微生物寄託機関：アメリカン・タイブー カルチャー・コレクション 住　所：１２’３０Ｌバークローン・ドライヴ、口・ソクヴイル、メリーランド 、２０８５２、アメリカ合衆国 寄託臼：１９８６年２月４日 受託番号：ＣＲＬ　９０１０ 微生物の表示：チャイニーズ・１１ムスター・卵巣細胞ＤＵＫＫ　Ｂｌ 浄書（内容に変更なし） 浄ひ（内容に変更なし） Ｆ′４１書（内容（こ変更なし） 浄ａ（内容に変更なし） ７口 浄書（内容に変更なし） 浄古（内容に変更なし） ンンＩさく内容１こ変更なし） 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１（資）昭和　６２年　１０月 　６　日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８７１００２２４ ２、発明の名称 誘導性熱ショック及び増幅糸 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国マサチューセッツ州、ボストン、フルーツ、ストリート （番地なし） 名　称　ザ、ゼネラル、ホスピタル、コーポレーション４、代理人 （郵便番号１００） 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 ５、　補正書の提出年月日 １９８７年６　月　１５日 ６、　添付書類の目録 （１）　？ｔｆｉ正書の翻訳文　１２ｉ！１、　形質転換された宿主細胞におけ るポリペプチド或いはタンパク質の高割合産生方法であって、（ａ）　宿主細胞 を、誘導性熱シヨツクプロモーターの制御下においてポリペプチド或いはタンパ ク質をコー　ドする構造遺伝子で形質転換し、 （ｂ）　該構造遺伝子の該形質転換宿主細胞内の複写数を誘導性熱シヨツクプロ モーター以外のプロモーターの制御下で増幅系を用いて増幅させ、 （ｃ）　該誘導性プロモーターを、該構造遺伝子を転写するのに十分な温度及び 時間での該形質転換宿主細胞への熱ショックにより誘導し、 （ｄ）　該熱ショックを受けた細胞を該熱シヨツク温度より低い温度において及 び該転写構造遺伝子を翻訳するのに十分な時間回復させて該ポリペプチド或いは タンパク質を正常の発現より少な（とも２０倍高いレベルで産生ずる、 ことを特徴とする方法。

１０４　下記工程を含んでなることを特徴とする形質転換された哺乳動物細胞に おいて構造ポリペプチド或いはタンパク質の産生を増大させる方法：（ａ）（ｉ ）　構成プロモーターの制御下のＤＨＦＲ遺伝子、及び 手続ネ甫正書（方式） （■）誘導性熱シヨツクプロモーターの制御下のポリペプチド或いはタンパク質 をコードする構造遺伝子、で形質転換されたジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ　Ｈ Ｆ　Ｒ）欠乏哺乳動物細胞をメトトレキセートを含有する培養培地中において、 該形質転換咽乳動物細胞の生育を行なわせるのに十分な時間培養し、 （ｂ）　該熱シヨツクプロモーターを該構造遺伝子を転写するのに十分な温度及 び時間で誘導し、及び（Ｃ）　該熱ショックを受けた細胞を該転写された構造遺 伝子を翻訳するのに十分低（−１温度にて及び時間で、該熱ショックから回復さ せて、該ポリペプチド或いはタンパク質を正常の発現より少なくとも２０倍高い レベルで産生ずることを特徴とする方法。

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Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．形質転換された宿主細胞におけるポリペプチド或いはタンパク質の高割合産 生方法であって、（ａ）宿主細胞を、誘導性熱ショックプロモーターの制御下に おいてポリペプチド或いはタンパク質をコードする構造遺伝子で形質転換し、 （ｂ）該構造遺伝子の該形質転換宿主細胞内の複写数を誘導性熱ショックプロモ ーター以外のプロモーターの制御下で増幅系を用いて増幅させ、 （ｃ）該誘導性プロモーターを、該構造遺伝子を転写するのに十分な温度及び時 間での該形質転換宿主細胞への熱ショックにより誘導し、 （ｄ）該熱ショックを受けた細胞を該熱ショック温度より低い温度において及び 該転写構造遺伝子を翻訳するのに十分な時間回復させて該ポリペプチド或いはタ ンパク質を産生する、 ことを特徴とする方法。
2. ２．工程（ｂ）の該増幅系が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ増幅系、アデノシンデ アミナーゼ増幅系、ＳＶ４０ベクター及びウシパピロマウィルスベクターよりな る群から選ばれる、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該熱ショックプロモーターが真核生物熱誘導性プロモーターである、請求の 範囲第１項記載の方法。
4. ４．該熱ショックプロモーターが、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）熱シ ョックタンパク質７０プロモーター、ドロソフィラ熱ショックタンパク質２２プ ロモーター、ドロソフィラ熱ショックタンパク質２６プロモーター、及びヒト熱 ショックタンパク質７０プロモーターより選ばれる、請求の範囲第３項記載の方 法。
5. ５．増幅後に該構造遺伝子の該複写数が宿主細胞ゲノム当り少なくとも約１００ コピーである、請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．該構造遺伝子が該宿主細胞に対し異種である、請求の範囲第１項記載の方法 。
7. ７．該構造遺伝子が該宿主細胞に対して同種である、請求の範囲第１項記載の方 法。
8. ８．該宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．該哺乳動物宿主細胞が、チャイニーズ（Ｃｈｉｎｅ−ｓｅ）ハムスター卵巣 細胞、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞、ナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ）細胞、ＢＨＫ２１細 胞及びマウスＬ細胞よりなる群から選ばれた培養哺乳動物細胞である、請求の範 囲第８項記載の方法。
10. １０．下記工程を含んでなることを特徴とする形質転換された哺乳動物細胞にお いて構造ポリペプチド或いはタンパク質の産生を増大させる方法：（ａ）（ｉ） 構成プロモーターの制御下のＤＨＦＲ遺伝子、及び （ｉｉ）誘導性熱ショックプロモーターの制御下のポリペプチド或いはタンパク 質をコードする構造遺伝子、で形質転換されたジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨ ＦＲ）欠乏哺乳動物細胞をメトトレキセートを含有する培養培地中において、該 形質転換哺乳動物細胞の生育を行なわせるのに十分な時間培養し、 （ｂ）該熱ショックプロモーターを該構造遺伝子を転写するのに十分な温度及び 時間で誘導し、及び（ｃ）該熱ショックを受けた細胞を該転写された構造遺伝子 を翻訳するのに十分低い温度にて及び時間で、該熱ショックから回復させて、該 ポリペプチド或いはタンパク質を産生することを特徴とする方法。
11. １１．該形質転換哺乳動物細胞が、次第に増大する濃度のメトトレキセート中で 培養される、請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．該熱ショックプロモーターが約４０℃〜約４５℃の温度において、及び約 １５分〜約１８０分の時間誘導される、請求の範囲第１０項記載の方法。
13. １３．工程（ｃ）の該回復温度が約３５℃〜約３９℃で、約６０分〜約６００分 の時間である、請求の範囲第１０項記載の方法。
14. １４．該哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞、ベロ細胞、ナマルバ 細胞、ＢＨＫ２１細胞、及びマウスＬ細胞よりなる群から選ばれる、請求の範囲 第１０項記載の方法。
15. １５．該熱ショックプロモーターがドロソフィラ熱ショックタンパク質７０プロ モーターである、請求の範囲第１０項記載の方法。
16. １６．該ポリペプチド或いはタンパク質が酵素類、ホルモン類、抗体類、構造タ ンパク質類、インターフェロン類、インターロイキン類、インシュリン及び腫瘍 ゲン類よりなる群から選ばれる、請求の範囲第１項又は第１０項記載の方法。
17. １７．（ａ）構成プロモーターの制御下の遺伝子増幅系、及び （ｂ）誘導性熱ショックプロモーターの制御下のポリペプチド或いはタンパク質 をコードする構造遺伝子、 で共形質転換された宿主細胞。
18. １８．該遺伝子増幅系がジヒドロ葉酸レダクターゼ増幅系、アデノシンジアミナ ーゼ増幅系、ＳＶ４０ベクター、及びウシパピロマウィルスベクターよりなる群 から選ばれる、請求の範囲第１７項記載の宿主細胞。
19. １９．該誘導性熱ショックプロモーターが、ドロソフィラ熱ショックタンパク質 ７０プロモーター、ドロソフィラ熱ショックタンパク質２６プロモーター、ドロ ソフィラ熱ショックタンパク質２２プロモーター、及びヒト熱ショックタンパク 質７０プロモーターより選ばれる、請求の範囲第１７項又は第１８項記載の細胞 。
20. ２０．該ポリペプチド或いはタンパク質が該宿主細胞に対して異種である、請求 の範囲第１７項又は第１８項記載の細胞。