JPH05504955A

JPH05504955A - 白血病抑制因子

Info

Publication number: JPH05504955A
Application number: JP3505302A
Authority: JP
Inventors: ヒース，ジヨン・ケイ; スミス，オースチン・ジエラード; ラスジエン，ピーター・デイビツド
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-03-05
Filing date: 1991-03-05
Publication date: 1993-07-29
Also published as: EP0518933A1; WO1991013985A1; GB9004890D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】８、請求の範囲１〜４いずれか１項記載のＬＩＦのＮ末端に対して特異性を示すか、或は請求の範囲７記載宿主細胞によって製造したポリクローナルもしくはモノクローナル抗体。

９、薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と共に、請求の範囲１〜４いずれか１項記載のＬ４Ｆか或は請求の範囲８記載抗体のいずれかを含む薬学組成物。

１０、そのＮ末端に、配列ＮＨ２−Ｕ−ａ　ｒ　ｇ−Ｘ−ａ　ｒ　ｇ　−［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸から成るペプチドの残基か、或は共有結合であり、そしてＸは、いずれかのアミノ酸である］を含む組換え型蛋白質もしくはペプチド。

１１、該Ｎ末端配列がＮＨ，−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇ−ｉ　１ｅ−ｖａｌ−ｐｒｏ−１ｅｕ−ｅｕ− 〔ここで、ＵおよびＸは、請求の範囲８で定義したのと同じであるコ、並びにそれらと本質的に同じ変異体、から成る請求の範囲９または１０いずれか記載の組換え型蛋白質もしくはペプチド。

１２、ホルモン、成長因子またはシトキンである請求の範囲１０または１１記載の組換え型蛋白質もしくはペプチド。

１３、請求の範囲９〜１２いずれか１項記載の蛋白質もしくはペプチドをコードする組換え型ＤＮＡ。

１４　請求の範囲１３のＤＮＡを含む組換え型複製可能発現ベクター。

１５、請求の範囲１４のベクターで形質転換もしくはトランスフェクションした宿主細胞。

１６、請求の範囲９〜１４いずれか１項記載の蛋白質もしくはペプチドのＮ末端に対して特異性を示すか、或は請求の範囲１５記載宿主細胞によって製造したポリクローナルもしくはモノクローナル抗体。

１７、式：％式％［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸から成るペプチドの残基か、或は共有結合であり、そしてＸは、いずれかのアミノ酸であるコ　、並びにそれと本質的に同じ変異体、を有するペプチド。

１８　配列ＮＨ２−Ｕ−ａ　ｒ　ｇ−Ｘ−ａ　ｒ　ｇ　−［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸から成るペプチドの残基か、或は共有結合であり、そしてＸは、いずれかのアミノ酸であるコのＮ末端を有する蛋白質もしくはペプチドにＥＣＭを接触させることがら成る、哺乳動物細胞のＥＣＭに蛋白質もしくはペプチドを付着させる方法。

１９、該蛋白質もしくはペプチドのＮ末端が、ＮＨ，−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇ −ｉ　１ｅ−ｖａ　１−ｐｒｏ−１ｅｕ　−ｅｕ− ［ここで、ＵおよびＸは、請求の範囲１８で定義したのと同じである〕、並びにそれらと本質的に同じ変異体、から成る請求の範囲１８記載の方法。

２０　治療もしくは診断によりヒトもしくは動物体を治療する方法における、請求の範囲１〜４いずれか１項記載のＬＩＦが或は請求の範囲８記載抗体の使用。

２１、上記治療が必要な受容個体に、請求の範囲１記載のＬＩＦが或は請求の範囲８記載の抗体の有効量を投与することから成る、ＬＩＦの天然に存在しているレベルを変化させることから利点が得られるところの、ヒトを含む唾乳動物中でのＬＩＦの異常および／または異所発現に関連した状態を治療する方法。

明　細　書白血病抑制因子本発明は、白血病抑制因子、その製造および使用に関する。

白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、特定的に分化を抑制し、そしてマウス胎芽由来の多分化能性胎芽幹細胞の多分化能性を維持する特徴を有する、分泌される可溶ポリペプチド？Ｊ！節因子である。

初期のマウス胎芽の内部細胞塊から直接確認されたところの、ＥＳ細胞系を用いた実験（ＥｖａｎｓおよびＫａｕｆｍａｎ、　１９８１；　Ｍａｒｔｉｎ、　１９８１）により、ＬＩＦは正常な胎芽調節因子であることが示された。ＤＩＡ（分化阻害活性）としても知られているＬＩＦの存在下、多分化能性の損失を生じさせることなくインビトロで、ＥＳ細胞を培養そして維持することができる。インビトロでの数多（の世代の後でも再び、これらの細胞をマウスの胚盤胞の中に導入することができ、ここでこれらは、胚芽系を含む全ての組織へ分化した子孫に寄与する（Ｂｒａｄｌｅｙ他、１９８４）。

ＥＰ−＾−２８５４４８には、マウスのＬＩＦが有する１つの形態の完全なアミノ酸配列が開示されていると共に、この因子のヒト形態が有する、Ｎ末端が不完全な配列も開示されている。ＥＰ−Ａ−２８５４４８に開示されているマウスのＬＩＦは、Ｎ末端に配列ＮＨ，−ｍｅｔ−１ｙｓ−ｖａｌ−１ｅｕ−ａ　ｌ　ａ −ａ　ｌ　ａ−ｇ’ｌ　Ｙ　（ＫＶＬ−Ｌ　Ｉ　Ｆ）を有している。

５ｔａｈｌ他（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ６．２６５（１５）、８８３３　（Ｍａｙ　１９９０）　）は、ヒトＬｌのゲノム配列を開示している。

我々はここに、驚Ｘべきことに、ＤＩＡ−ＬＩＦ活性を示す特定細胞系が、Ｎ末端に配列ＮＨ，−ｍｅｔ−ａｒｇ−ｃｙｓ−ａｒｇ　（ＲＣＲ−Ｌ　Ｉ　Ｆ）を有するＬＩＦの新規形態を通してそれを行う、ことを見い出した。このようなＬＩＦの形態は、前に記述したＬＩＦ形態の第２および第３エクソンに新規な５′ エクソンを連結させるスプライシングの結果として生じる。従って、このような代替スプライシングにより、ＫＶＬ−ＬＩＦが有する最初の７個のアミノ酸残基が、ＲＣＲ−ＬＩＦが有する最初の４個のアミノ酸で置き換えられる。このＬＩＦ蛋白質のアミノ末端におけるこのような変化の結果として、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へのＲＣＲ−ＬＩＦの組み込みが生じる。従ッテ、ＲＣＲ−Ｌｌは、分化に関して、散乱した測定とは逆に局在化した測定を与える。

我々の発見の結果として、正常なＥＣＭの一部を形成している２つの蛋白質であるラミニン−β２およびｅ−カドヘリンを同定し、これらは、それらのＮ末端もしくはその近くに、配列−ａｒｇ−Ｊ−ａｒｇ− ［ここで、Ｊは、ラミニン−β２におけるグリシンであり、そしてｅ−カドヘリンにおけるシスティンであるコを有している。しかしながら、これらの蛋白質は他の多くの配列類似性を共有しているため、これらの蛋白質のどの部分がＥＣＭ中でのそれらの存在の原因であるか−もしそうだとしてどれがそうであるか−については以前は明らかでなかった。

我々は、ＥＣＭと会合したときのＬＩＦのこの形態は微孔性膜を通して拡散することができない、ことによってＲＣＲ−ＬＩＦの場所を示すことができる、ことを見い出した。以下の実施例で示すように、ＬＩＦの作用に応答し得る細胞系、例えば多分化能性細胞系（例えば、上述したＥＳ細胞系）は、上記ＥＣＭＩ：直接接触させた時のＬＩＦのこの形態を含んでいるＥＣＭにのみ応答する。ＲＣＲ −ＬＩ　Ｆ含有ＥＣＭとＬｒＦ応答性細胞の間に微孔性膜が存在していると、これらの細胞上でのＲＣＲ−ＬＩ　Ｆの作用を遮断するが、拡散性を示すＫＶＬ− Ｌ　Ｉ　Ｆ　（これはＥＣＭによって保持されない）の作用は遮断しない。従って、このＲＣＲ−ＬＩＦは該ＥＣＭと会合したままで存在する。微孔性膜の如き物理的バリヤーが存在していない場合、ＬＩＦが有する両方の形態共、ＬＩＦ応答性細胞に作用する。

ＲＣＲ−ＬＩＦは、従ッテ、下記の基準によってＫＶＬ−ＬＩＦから区別される：１、ＬＩＦ活性は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対して物理的に拘束され、従って、ＲＣＲ−ＬＩ　Ｆ含有ＥＣＭに対して物理的に直接隣接している細胞にのみ作用する。

２、ＥＣＭ会合ＲＣＲ−ＬＩＦ源は、ＫＶＬ−、ＬＩＦよりも優れた安定性を示す。

３、ＲＣＲ−ＬＩＦ活性は、物理的に該ＲＣ，Ｒ−ＬＩＦ会合ＥＣＭ調合物に会合し得る細胞に拘束され、従って、インビボおよびインビトロでそれが示す生物学的活性の範囲は、ＫＶＬ−ＬＩＦよりも特異的に標的にされ得る。

４、ＲＣＲ−ＬＩＦは、非ＥＣＭ会合源から誘導されるＫＶＬ−ＬＩＦに比較して改良された生物学的有効性を有するところの、より濃縮された形態（自由には拡散しない形態として）で表示され得る。

更に、上記パラメーターで定義した如きＲＣＲ−Ｌ　Ｉ　Ｆは、下記の特性を有する１、交感ニューロンおよびＣＮＳ由来ニューロンの生存をインビボおよびインビトロで増強する。

２、ニューロン調合物中で、神経伝達物質、例えばコリンアセチルトランスフェラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼの発現を調節する。

３、骨芽細胞子孫の細胞増殖をインビボおよびインビトロで誘発する。

４、骨形成組織中の破骨細胞の発生を誘発する。

５、脂肪細胞表現型の細胞におけるリポ蛋白質リパーゼの発現をインビボおよびインビトロで抑制する。

６、肝細胞もしくは肝細胞由来細胞型における急性相応答蛋白質の発現を誘発する。

７、ケラチン細胞の生存力および増殖をインビトロで増強する。

８、造血細胞の増殖を維持する。

９、白血病細胞の分化を誘発する。

１０　胚芽細胞の生存力および増殖を増強する。

本発明のＬＩＦが有する新規なＮ末端配列は、蛋白質もしくはペプチドの如き分子を、哺乳動物のＥＣＭに特異的に向かわせそしてそれらにつなぎ止めるためのシグナル配列を与える。従って、テトラペプチドである配列ＮＨ２−ｍｅｔ−ａｒｇ−ｃｙｓ−ａｒｇを、化学的もしくは組換え手段で、蛋白質もしくはペプチドにつなぎ、これらの分子を該ＥＣＭに取り付けるか或は会合させる。より一層のＬＩＦ配列に相当している該テトラペプチド配列のＣ末端誘導体、例えばＮＨ２−ｍｅｔ−ａｒｇ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ｉｌｅ−ｖａｌも使用できる。該ＥＣＭとの直接的な会合に対してこの配列が有する能力を本質的に変化させないところの、テトラペプチド配列ＮＨ２−Ｍｅ　ｔ　−Ａ　ｒ　ｇ−Ｃｙ　ｓ　−Ａ　ｒ　ｇにおける変化も、本発明の範囲内である、と理解すべきである。

本発明のＬＩＦは、胎芽幹（ＥＳ）Ｊｉｆｆ胞の伝播、並びにＥＳ細胞の多分化能性（キメラ中に機能的配偶子を生じさせる能力によって定義される）を維持するために使用できる。更に、本発明のＬＩＦおよびそれのＮ末端フラグメント、並びにＬＩＦに対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはそれらのフラグメント、そしてそのＮ末端フラグメントは、下記の用途で潜在的な有効性を示す：１、造血細胞分化のインビボおよびインビトロ誘発および抑制。

２、骨および歯の堆積および再吸収のインビボ誘発。

３、肝細胞における急性相応答蛋白質遺伝子発現の調節。

４　悪液質の調節。

５、ニューロン生存力および分化の調節。

６、創傷治癒の促進／抑制。

７、上皮細胞増殖および分化の誘発および抑制。

従って、本発明は、哺乳動物の細胞外マトリックスと会合し得る新規なＬＩＦを提供するものである。本発明の１つの面において、この新規なＬＩＦは、Ｎ末端配列ＮＨ２−ｍｅｔ−ａｒｇ−ａｙｓ−ａｒｇによって特徴づけられる。

本発明はまた、ＬＩＦをＥＣＭに会合させ得る配列ｍｅｔ−ａｒｇ−ｃｙｓ−ａｒｇと本質的に同じ配列を含んでいるＬＩＦの新規な形態も提供する。特に、このＮ末端から最初の５個から成るアミノ酸残基の中の２つが置換されているＬＩＦ配列の類似物も、本発明の範囲内である。

本発明の更に一層の具体例において、上述したＬＩＦに関するこれらの新規な形態、Ｎ末端のシグナル配列、または組換え型蛋白質もしくはペプチドいずれかの遺伝情報を指定するＤＮＡも提供する。このＤＮＡは、放射能または非放射能標識を用いた通常の手段で標識したプローブを製造するために用いてもよいか、或はこのＤＮＡをベクターにクローン化してもよい。

本発明の更に一層の具体例において、上記ＤＮＡの複製および発現用ベクターを提供する。これらのベクターは、例えば、複製の起点、任意に上記ＤＮＡを発現させるためのプロモーター、および任意に該プロモーターの調節因子が備わっているところの、プラスミド、ウィルスまたは７フーンベクターであってもよい。

このベクターは、１種以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌のプラスミドの場合アンピリジン耐性遺伝子、或は哺乳動物ベクターのためのネオマイシン耐性遺伝子、を含んでいてもよい。このベクターは、例えば、このＤＮＡに相当するＲＮＡ産生のためか、或は宿主細胞をトランスフェクションもしくは形質転換するためにインビトロで用いられてもよい。

本発明の更に一層の具体例において、上記ＬＩＦのＤＮＡを複製および発現させるためのベクターで形質転換されたか或はトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。これらの細胞は、上記ベクターに対して適合性を示すように選択され、そして例えば、細菌、酵母または哺乳動物の細胞であってもよい。

本発明はまた、本発明の新規な蛋白質もしくはペプチドか、或はそのＮ末端フラグメントに対する、Ｎ末端に特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、それらのフラグメント、も提供する。

本発明はまた、本発明の新規な蛋白質もしくはペプチドに対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の製造方法も提供する。この新規な蛋白質もしくはペプチドか或はそれらのフラグメントを免疫原として用いる通常のハイブリドーマ技術によって、モノクローナル抗体を製造してもよい。ポリクローナル抗体もまた、宿主動物、例えばラットもしくはラビットに、本発明の蛋白質もしくはペプチドを接種した後、免疫血清を回収する、ことから成る通常の手段で製造され得る。

本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物中のＬＩＦの異常な（例えば通常でない高もしくは低レベルの）および／または真贋の（例えば、遺伝子配列中の変異による）発現に関連した増殖に関する病気を含む状態を治療および／または調節するためか、或はヒトを含む哺乳動物の状態もしくは病気を治療するため［これらの利点は、天然に存在しているＬＩＦのレベルを変化させることによる〕、本発明のＬｒＦ蛋白質もしくはペプチドか、或はそれらのフラグメント、並びにこれらの蛋白質、ペプチドおよびそれらのフラグメントに対する抗体もしくはそれらのフラグメント、を含有している薬学的組成物も提供する。

本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物中のＬＩＦに関する異常および／または真贋の発現に関連した、増殖に関する病気を含む状態を治療または診断するための、上記蛋白質、ペプチド類および抗体、並びにそれらのフラグメント、そして上記蛋白質およびペプチド（或はそれらのフラグメント）の遺伝情報を指定するＤＮＡも提供する。

更に、本発明は、上記配列が不足しているところの、天然に存在している分子か、或はいずれかの形態の組換え型分子用の、Ｎ末端シグナル配列として使用するための、配列ＮＨ２−ｍｅｔ−ａｒｇ−ｃｙｓ−ａ「ｇを有するペプチド類、それらのＣ末端誘導体、例えばＮＨ２−ｍｅｊ　ｔ−ａｒｇ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ｉ　１ｅ−ｖａｌ、並びに上で定義したのと本質的に同じ配列、を有するペプチドも提供する。上記配列は、上記！　分子、例えば蛋白質もしくはペプチドを、該ＥＣＭに会合させる。

従って、本発明はこのように更に、そのＮ末端に、配列ＮＨ２−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ −ａｒｇ　− ［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸を有するペプチドの残基か、或は共有結合であり、そしてＸはいずれかのアミノ酸であるコを含んでいる組換え型蛋白質もしくはペプチドも提供する。

好適には、Ｕは、大きさが２０個もしくはそれ以下、例えば１０個もしくはそれ以下の残基である。好適には、Ｘはグリシンまたはシスティンである。好適には、このＮ末端配列は、ＮＨ２−Ｕ−ａ　ｒ　ｇ−Ｘ−ａ　ｒ　ｇ　−ｉ　１　ｅ −ｖａ　ｌ　−ｐ　ｒｏ　−；またはＮＨ，−Ｕ−ａ　ｒｇ−Ｘ−ａ　ｒｇ−ｉ　１　ｅ−ｖａ　Ｉ　−ｐ　ｒｏ−１ｅｕ　−［ここで、ＵおよびＸは上で定義したのと同じである］、並びにそれらと本質的に同じ変異体を含んでいる。本質的に同じ配列は、これらの配列が付いている蛋白質もしくはペプチドを該ＥＣＭに向かわせる該Ｎ末端配列の能力を本質的に変化させない配列である、と理解される。

本発明のＮ末端配列が付着し得る蛋白質およびペプチドは、例えばホルモン、成長因子またはシトキンであってもよい。上記蛋白質およびペプチド類への本発明に従う配列の付着は、その得られる組換え型蛋白質およびペプチド類が該ＥＣＭに付着する結果の原因となる。これにより、上記蛋白質およびペプチド類の作用が局在化され得る。例えば、このホルモンの全てもしくはその活性フラグメントと共に本発明に従うＮ末端配列を含んでいる組換え型ホルモンは、本発明の目的のためのホルモンであると見なされることも、本分野の技術者に理解されるであろう。同様に、本発明に従って修飾された他の天然に存在している蛋白質もしくはペプチド類も、もしそれらの機能が本質的に変化していない場合、その未変性蛋白質もしくはペプチドと同等であると見なされる。

上記修飾蛋白質もしくはペプチド類も、適宜、ヒトおよび動物体の処置もしくは治療で用いられ得る。

本発明は更に、本発明に従う蛋白質もしくはペプチドをコードする組換え型ＤＮＡも提供する。

本発明はまた、上記ＤＮＡを含んでいる組換え型の複製可能（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ）発現ベクター、上記ベクターを用いて形質転換もしくはトランスフェクションされた宿生細胞、並びに本発明に従う蛋白質もしくはペプチドのＮ末端に対して特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体も提供する。適切なベクター類、宿生細胞、および抗体の産生方法のための、ＬＩＦに関連した上記記述に対する言及も行う。

本発明はまた、式％式％［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸を有するペプチドの残基か、或は共有結合であり、モしてＸはいずれかのアミノ酸である］を有するペプチド、並びにそれらと本質的に同じ変異体も提供する。

更に、本発明は、配列ＮＨ，−Ｕ−ａ　ｒ　ｇ−Ｘ−ａ　ｒ　ｇ　−；またはＮＨ２−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ −ａｒｇ−ｉ　１ｅ−ｖａｌ−ｐｒｏ−１ｅｕ−［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸を有するペプチドの残基か、或は共有結合であり、モしてＸはいずれかのアミノ酸であるコのＮ末端を有する蛋白質もしくはペプチド、並びにそれらと本質的に同じ変異体、にＥＣＭを接触させることから成る、蛋白質またはペプチドを哺乳動物細胞のＥＣＭに付着させる方法を提供する。

好適には、上述した全ての配列の変異体は、モチーフであるｒ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇＪ［ここで、Ｘは上で定義したのと同じである］を保持している。

以下に示す実施例は、マウス由来の、本発明の新規なＥＣＭ会合ＬＩＦの単離および特性を説明するものである。しかしながら、他の給源、例えばヒトまたはブタなどからのＥＣＭ会合ＬＩＦも、本発明の範囲内であり、そしてこれらも同様な方法で単離され得る。

実施例１：材料および方法細胞培養および生物学的アッセイ細胞培養を、抗生物質、１０−４Ｍの２−メルカプトエタノールおよび１０％（Ｖ　／　Ｖ　）のウシ胎児血清（２！！択したバッチ）が入っているＤＭＥＭ　：　Ｈａａ＋’ｓ　Ｆ１２　（５０：　５０）中、湿度を与えた７、５％ＣＯ２雰囲気下で行った。ＥＳ細胞の維持に関しては、ｐｃｌｏ−６ＲヒトＤＩＡ／ＬＩＦ発現プラスミド（Ｓ＋１ｉｔｈ他、１９８８）を用いてトランスフェクションしたＣｏ５−７細胞に暴露することで条件付けした上澄み液の１／１０００希釈液を更に培地に補った。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　０ｘｆｏｒｄのＰａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｃｅ１ｌ　ＢａｎｋのＳｉｒ　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｄｕｎｎ　５ｃｈｏｏｌから、Ｅｈｒｌｉｃｈ腹水細胞およびＭＲＣ−５ヒト胎芽肺線維芽細胞を人手した。ＢＲＬおよびＳＴＯ細胞（Ｓｍｉ　ｔｈおよびＨｏｏｐｅｒ、　１９８７）およびＣ３Ｈｌ０ＴＩ／２７ウス胎芽線維芽細胞（Ｅｄｖａｒｄｓ他、１９８７）は、前に記述したのと同じであった。分化アッセイは、Ｍａｒｔｉｎ　Ｅｖａｎｓ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）から寛大な提供を受けた多分化能性ＥＳ細胞系ｃＰｌを用いて行った。拡散性Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆは、ＥＳ細胞を初期密度が１０４個細胞／ｍＬ／１６ｍｍウェルになるように撒いた後、実験用サンプル存在下で４日間培養する、ことによって評価した。次に、これらのサンプルを固定した後、Ｌｅｉｓｈｍａｎ’　ｓで染色し、そして形態学的分化の抑制を、顕微鏡検査で評価した（Ｓｍｉ　ｔｈおよびＨｏｏｐｅｒ、　１９８７）。

集密培養物をミトマインンＣ（ＬｏＩｉｇ／ｍＬ）で２〜３時間処理した後、トリブノン処理し、そして再び撒くことによって、支持細胞層を調製した（ＭａｒｔｉｎおよびＥｖａｎｓ、　１９７５）、孔サイズが０．４μｍのものを用いて、コラーゲン膜挿入断片（Ｔｒａｎｓｖｅｌｌ”、　Ｃｏ５ｔａｒ）を透明にした。

０．０２ＭのＮＨ，ＯＨを用いた低浸透圧溶解（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、１９８４）によるか、或はＰＢＳ中の０．０２％ＥＤＴＡを用いた細胞分離（ＲｈｅｉｎｗａＬｄおよびＧｒｅｅｎ、１９７５）により、細胞が入っていないＥＣＭ調合物がプラスミド構築の全てで、標準的技術を用いた（Ｍａｎｉａｔｉｓ他）。この報告を通して用いたＬＩＦの番号付はシステムは、Ｇｅａｒｉｎｇ他（１９８７）が記述したところの、部分長を有するマウスｃＤＮＡを参照にする。

Ｅｈｒｌｉｃｈｌｌｉ水細胞由来のＥｈｒｌｉｃｈ腹水ＲＮＡがら得られる第１ストランドｃＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、マウスＬＩＦのコード領域全体（Ｇｅａｒｉｎｇ他、１９８８）を包含しているｃ　ＤＮＡが得られた。２．５μｇのポリＡ′″ＲＮＡの逆転写を開始させるためにオリゴｄＴを用いた（ｃＤＮＡ合成キット、＾ｍｅｒｓｈａｍ）　ｏフェノール／クロロホルム抽出の後、０．２５ＭのＮａＯＨ中４℃で一晩培養することによってＲＮＡを加水分解し、この溶液をＨＣＩ添加で中和し、そしてこのｃＤＮＡを、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０クロマトグラフイーおよびエタノール沈澱によって精製した。ｍＬＩＦに特異的なプライマーＬＩＦＩ５’　、、、ＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＴＧＧ、、。

３゛およびＬＩＦ２５’　、、、ＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＴＧＧＴＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡ、、、３’を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として、上記ｃＤＮＡの２０ｎｇを用いた。これらのプライマー［これらの両方共、ＥＣ０ＲＩ制限部位を含んでいるコは、それぞれ残基１１〜２８および６５７〜６３６で、該ｍＬＩＦのｃＤＮＡにハイブリッド形成する。ＰＣＲ条件は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓが推奨したのと同じであった。増幅は、９４℃における２分間の変性、６０℃における２分間のアニーリング、および７２℃における３分間の重合、から成るサイクルを通して進行した。増幅させたＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（ＢＩＯ１０１、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ＋　（ｐ　Ｄ　Ｒ１）のＥｃｏＲＩ制限部位および発現ベクターｐＸＭＴ２　（ｐＤＲｌｏ）にクローン化した。

Ｓｍａ　Ｉを用いたｐＤＲｌの消化に続く再結合で、ｍＬＩＦのＳｍａＩ制限部位の下流に在るｍＬＩＦ配列が欠如しているｐＤＲ２を生じさせることによって、マウスＬＩＦのオーブン読み枠の５°に末端に特異的なプローブを構築した。

Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆのマトリックス会合形態をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＸＭＴ２中で構築した。ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニング（以下を参照）によって誘導されるＤＮＡを、Ｘｈｏｌ／Ｓｍａｌ消化によってＩ）ＤＲＩＯＩから取り出し、そしてこれを、ＸｈｏＩ／Ｓｍａ■で切断したｐＤＲｌｏにクローン化することで、プラスミドｐＤＲ１１を生じさせた。

ＲＮＡ分析ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　ｌこクローン化したマウスＬＩＦｃＤＮＡフラグメントのインビトロ転写により、高い特異性を示す活性リボプローブを合成した。Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　（ｐＤＲｌ、ｐＤＲ２）またはＸｈｏＩ　（ｐＤＲｌｏｏ、ｐＤＲｌｏｌ）を用いた消化による該鋳型の直線化の後の、Ｔ７ボリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた転写により、アンチセンスプローブを生じさせた。該ｍＬＩＦのｃＤＮＡ中のヌクレオチド３５３で切断するＤｄｅＩを用いた消化による該プラスミドの直線化の後の、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いたｐＤＲｌの転写により、該ｍＬＩＦのオーブン読み枠の３°末端に特異的なりボブローブを製造した。この反応条件は、６．２５μＬのα−３２Ｐ−ＵＴＰ（８００Ｃｉ／ミリモル、４ＱｍＣｉ／ｍＬ、＾ｍｅｒｓｈａｍ）を１５μＬの反応容積中で用いる以外は、ＫｒｉｅｇおよびＭｅｌｔｏｎ　（１９８８）が記述したのと同様であった。

リボヌクレアーゼ保護アッセイを、ＫｒｉｅｇおよびＭｅｌｔｏｎ　（１９８８）が記述したのと本質的に同様にして行った。ｔＲＮＡを添加しないで、１５Ｍｇの細胞質ＲＮＡ　（Ｅｄｖａｒｄｓ他、１．９８５）を６ｘｌＯ’ｃｐｍプローブ（特異的活性３　ｘ　１０８ｃ　ｐｍ／μｇ）にハイブリッド形成させた。

４５℃で１６〜２０時間ハイブリッド形成を行った。ＲＮＡハイブリッドを、４ ℃で３０分間、４０Ｍｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）および２μｇ／ｍＬのＲＮアーゼＴｌ　（ＢＲＬ）で消化した。保護されたフラグメントを、オートラジオグラフィーにかける前に乾燥した５％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素の配列決定用ゲルを用いて分析した。

ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡクローニングＥｈｒｌｉｃｈ腹水細胞由来の細胞質ＲＮＡの１０Ｍｇを、マウスのＬＩＦｃＤＮＡの残基５００〜４８４にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド５’　、、、ＡＣＡＣＧＧＴＡＣＴＴＧＴＴＧＣＡ、、、３’から逆転写した。このＲＮＡを、１６μＬから成る全体容積中の２０Ｍｍｏｌのプライマーおよび２μＬＬｙ）１０ｘアニール緩衝液（５００ｍＭのトリス／ＨＣＩ　ｐＨ８，０，６０ｍＭのＭｇＣ１，，４００ｍＭのＫＣｌ）に加え、８５℃に５分間加熱した後、ゆっくりと室温に冷却した。Ｆｒｏｈｍａｎ他（１９８８）が記述したのと同様にして伸長反応を行った。０．０５ｘＴＥで平衡にした２ｍＬの５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを通したゲル濾過により、過剰のオリゴヌクレオチドを除去した。このｃＤＮＡの放射能ピークに相当している５０μＬ画分をプールし、真空遠心分離により濃縮した後、２３μＬのＨ，Ｏ中に再懸濁した。このｃＤＮＡの３゛末端にｄＧ残基の尾を付ける目的で、３μＬの１０ｍＭｄＧＴＰ、６μＬの５ｘテーリング用緩衝液（ＢＲＬ）および１５単位の末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＢＲＬ）を添加し、そしてこの混合物を３７℃で６０分間培養した後、７０℃で１５分間培養した。エタノール沈澱後、このｃＤＮＡ鋳型を再び５００／ＩＺＬのＨ２０中に懸濁した。

マウスのＬＩＦ特異的オリゴヌクレオチド５°、、、ＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＧＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＣＡ、、、３°　（ｍＬＩＦ残基３８９〜３６５）およヒアンカーノヌクレオチド５’　、、、ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ，、，３’　ｔ−用いてＰＣＲを行った。このアンカーオリゴヌクレオチドには、制限部位ＡｐａＩＳＮｃｏ　Ｌ　Ｘｈｏ　Ｉおよび５ｆｉｒが含まれており、一方該ｍＬＩＦオリゴヌクレオチドには、このｍＬｆＦオーブン読み枠中のヌクレオチド３７９にユニークなＳｍａ　ｒ制限部位が含まれている。該ｃＤＮＡ鋳型７μＬと各々のオリゴヌクレオチド２５ｐｍｏｌとが入っている５０μＬの最終体積の中で、ＰＣＲを行った。反応条件は、３ｍＭのＭｇＣ１□から成る最終濃度を用いる以外は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓが推奨したのと同じであった。Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）に添加するに先立って、この反応混合物を９４℃に５分間加熱することによって、ＤＮＡを変性させた。各々のＰＣＲサイクルは、９４℃ における２分間の変性、５５℃における２分間のアニーリング、および７２℃における３分間の伸長、から成っていた。この反応の生成物を、ｐＤＲｌ、ｐＤＲ２または該ＬＴＦＩオリゴヌクレオチドから誘導されるプローブを用いたサザンプロットハイブリッド形成で分析した。最終的伸長（７２℃で３０分間）後、サンプルをエタノール沈澱し、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてアガロースゲル電気泳動で分析した。Ｇｅｎｅｃｌｅａｎを用いてアガロースゲルからＤＮＡを精製した後、ＸｈｏＩ／Ｓｍａｒ消化ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化した。アルカリ溶解方法により、適切な組換え型プラスミドを精製した。ＤｒＡ／ＬＩＦの拡散形態に相当するクローンをｐＤＲｌｏｏと表示し、そしてＤ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆのマトリックス会合形態に相当するクローンをｐＤＲｌｏｌと表示した。

このＲＡＣＥ　ｃＤＮＡクローンの配列決定を行う目的で、ｐＤＲｌｏｏおよびｐＤＲｌｏｌをＸｈｏＩおよびＳｍ１Ｉで消化した後、このＤＩＡ／ＬＩＦ　ｃＤＮＡフラグメントを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎでアガロースゲルから精製し、そしてＳ　ａ　ｌ　Ｉ／Ｓｍａ　Ｉ消化Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９にクローン化した。製造業者の推奨に従い、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０　（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＳＣｌｅｖｅｌａｎｄ）を用いてプラスミドの配列決定を行った。

実施例１の結果Ｃ３Ｈｌ０ＴＩ／２胎芽線維芽細胞によって生じるマトリックス会合Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆ活性の同定未分化状態にＥＳ細胞を維持することは、ＢＲＬ細胞を用いた予備培養によって条件付けした培地中で細胞を増殖させることによって達成され得る。これは、ＢＲＬ細胞により可溶Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　ｒ　Ｆ蛋白質を培地中に分泌させることによって生じる。逆に、異なる支持細胞系によって条件付けした培地は、ＥＳ細胞の分化を防止することができないか、或は比較的不充分な防止能力を示す。このことは、支持細胞に会合したＤＩＡ／Ｌ　Ｉ　Ｆ活性の少なくとも一部は、拡散性を示さず何らかの方法でこの細胞に局在化する、ことを示唆している。これは、この支持細胞膜もしくは細胞外マトリックスどちらかへの付着を伴う可能性がある。

これを試験するために設計した実験の結果を図１に示す。ｌ０ＴＩ／２胎芽の線維芽細胞に直接接触させて培養したＥＳ細胞は、未分化状態で維持された（図１．１）。このことは、ＳＴ○および３Ｔ３の如き他の胎芽線維芽細胞系で通常のように、ｌ０ＴＩ／２細胞は、未分化ＥＳ細胞を培養するための支持細胞として働き得る、ことを立証している。

１０ＴＩ／２細胞と一緒に前培養することによって条件付けした培地中では、有意なりＩＡ／ＬｒＦ活性は検出されなかった（図１、ｉｌ）。

更に、拡散性を示す巨大分子の通過は可能にするが直接的な細胞と細胞の接触物の通過は防止する該微孔性膜による、このｌ０ＴＩ／２支持細胞とＥＳ細胞との物理的分離の結果、これらのＥＳ細胞の分化がもたらされた（図Ｌｉｊｉ）。ｌ０ＴＩ／２支持細胞およびＥＳ細胞との開の物理的接触、および分泌された拡散性Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆ活性が存在していないことに対する必要条件は、ｌ０ＴＩ／２細胞の上にＤ　Ｉ　Ａ／Ｌ　ＩＦＦ蛋白質局在形態が存在していることを論するものである。

この活性の位置を同定する目的で、浸透圧的溶解をもたらす水酸化アンモニウムか、或は細胞外マトリックスからの無傷細胞の分離をもたらすＥＤＴＡのどちらかを用いて処理することで、ｌ０ＴＩ／２細胞を上記培養物から取り出した。この分泌された細胞外マトリックスの上で細胞がインビトロで増殖するため、上記処理の効果により、はとんど排他的に細胞外マトリックスから成る物質が得られる。この基質の上に植え付けたＥＳ細胞を、それらの明白な形態または５ＳＥＡ −１抗原の存在によって判断して、未分化状態に維持した（図１、ｉｖ、ｖ）。

この結果により、マトリックス会合Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆ活性が１０Ｔ１／２線維芽細胞上に存在していることを確立した。ＤＩＡ／ＬｒＦの可溶形態を該培地の中に分泌するＭＲＣ−５ヒト線維芽細胞の細胞外マトリックス上で、同等の活性を検出するための同様な実験は失敗に終わった。

従って、ｌ０ＴＩ／２細胞が有するマトリックス会合Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆ活性は、これらの細胞によって作り出される特異的な活性であるに違いなく、そしてこの細胞外マトリックスの非特異的効果ではないであろう。

予備的精製および酸安定性に関する特性により、上記活性は、公知のＤＩＡ／ＬＩＦ糖蛋白質と非常に密に関連している、ことが示唆された。

ＤＩＡ／ＬＩＦのマトリックス会合形態をコードする転写物の同定Ｇｅａｒｉｎｇ他（１９８７）が定義したように、マウスのＬＩＦ（ｍＬＩＦ）のオーブン読み枠金体を含んでいるｃＤＮＡフラグメントから、ノーザンプロットで用いたプローブおよび初期のりボヌクレアーゼ保護を誘導した。可溶Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆを分泌することが前に示されているＥｈｒｌｉｃｈ腹水細胞から、ＲＮＡを用いたＰＣＲにより、上記ｃＤＮＡを得た。生物学的活性を試験する目的で、このｍＬＩＦフラグメントを、ｐＸＭＴ２［即ち、ＳＶ４０の複製起点を含んでいる発現ベクター］のユニークなＥｃｏＲＩ制限部位にクローン化した。ｃｏｓ７細胞中へのこの分子ｐＤＲ１，Ｏのトランスフェクション、並びにＥＳ細胞分化を防止するその能力によって条件付けした培地のバイオアッセイにより、このクローンが有する生物学的活性は、Ｍｏｒｅａｕ他、（１９８８）が記述したヒトＬＩＦ遺伝子のそれと同等であることが見いだされた、ことを立証した。

このｍＬ　Ｉ　ＦのｃＤＮＡをまた、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳのユニークなＥｃｏＲＩ制限部位にクローン化することで、ｐＤＲｌが得られた。α −”Ｐ−ＵＴＰの存在下でＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写したこのプラスミドを用いて、ノーザンプロットおよびリボヌクレアーゼ保護の両方で用いるための、高い特異性を示す活性を有する放射能標識アンチセンスＲＮＡプローブを作り出した。

Ｅｈｒｉｃｈ腹水（ＥＡ）およびＢＲＬ細胞由来の全体およびポリ／Ａ十ＲＮＡに関するノーザンプロット分析の結果、大きさが、マウスの細胞における４ｋｂから、Ｂｕｆｆａｌｏラット細胞における４、５ｋｂに変化するところの、各々の細胞型中での単一転写が示された（図２）。我々は、種々の細胞系および胚芽ＲＮＡをスクリーニングしたにも拘らず、ノーザンプロットでは、１．　８　ｋ　ｂ　（Ｍｏｒｅａｕ他、１９８８）または０．　７ｋｂ（Ｇｏｕｇｈ他、１９８８）の代替ＬＩＦ転写物を検出することができなかった。

Ｅｈｒｉｃｈ腹水細胞由来の全ＲＮＡもまた、リボヌクレアーゼ保護によるＤＩＡ／ＬＩＦ発現に関してスクリーニングした。この技術で２つの転写物が検出された（図３Ａ）。この保護された２つの帯の同様な大きさは、それらは、ｍＬＩＦのコード化領域の主要部分全体に渡って同じである、ことを論議するものである、と言うのは、このリボヌクレアーゼ保護技術は、異なる領域における開裂により、プローブと基質との間の差を同定するものであるからである。これらの２つのメツセージの間の不一致が、このｍＬＩＦコード化領域の３°　もしくは５゛末端に在るが否かを決定する目的で、このオープン読み枠の両末端に対して特異的なりボブローブを作り出した。これらの中で、５゛プローブのみが、２つの異なる転写物を保護した（図３Ｂ）。このことは、これらの転写物の間に不一致を有する部位は、該ｍＬＩＦオーブン読み枠の５′末端に現れる、即ち２０　＋／−５ヌクレオチドが該コード化領域の中に現れる、ことを立証している。これは、ゲノムのヒトＬＩＦ配列および部分的なゲノムのｍＬＩＦ配列から推定されるように、第二ｍＬＩＦエクソンの開始点に一致している。

これらの２つの転写物の同一性を、２つの胎芽線維芽細胞支持細胞系、１０ＴＩ／２およびＳＴＯ中、並びにＥＡおよびＰＭＳ−２（壁卵黄のう細胞系）中でのＤＩＡ／ＬＩＦ転写の分析によって立証した（図４Ａ）。

上部の転写物りは、Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆ蛋白質の分泌された拡散性形態に相当している、と言うのは、これは、ＬＩＦコード化領域全体に渡って、該リボプローブと完全な相同性を共有しているがらである。このような同定は、Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆ活性を有するＥｈｒｌｉｃｈ腹水およびＳＴＯ細胞由来のＲＮＡ中には上記転写物が有意なレベルで存在しているが、ＤＩＡ／ＬＩＦ活性を有していないｌ０ＴＩ／２細胞の中には存在していない、ことに一致している。下部の転写物Ｍの同定は、このリボヌクレアーゼ保護パターンと、該細胞系が有する公知の生物学的特性と、を比較することによって引き出すことができる（図４Ｂ）。ＳＴＯおよび１０Ｔ１／２細胞両方の中にこの転写物が現れることは、これが、上記細胞系をＥＳ細胞の支持細胞として働かせることを可能にするＤＩＡ／ＬＩＦ蛋白質のマトリックス会合形態をコードする、ことを示唆している。この相関関係は、下部転写物のみが有意なレベルで存在しておりそしてこの蛋白質のマトリックス会合形態のみを検出することができるところの、１０ＴＩ／２細胞の中で最も明らかである。

上記結果は、該Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆ蛋白質の、マトリックスと会合した拡散形態の産生は、該ｍＬＩＦ遺伝子の、上流のエクソンを公知の第２および第３エクソンに代替スプライシングすることによって制御されている、ことを示唆していた。

Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆのマトリックス会合形態をコードするｃＤＮＡのＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングＤ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆのマトリックス会合形態をコードするｍＲＮＡの未知５ ′配列をクローン化する目的で、ＲＡＣＥ　ＰＣＲ技術を用いた。オープン読み枠内の配列が公知であり、そしてこれを、この公知配列の５°　もしくは３′に配列をクローン化する目的で修飾できる場合でさせも、上記技術が使用できる。

リボヌクレアーゼ保護は、このＤＩＡ／ＬＩＦのマトリックス会合形態はエクソン２および３全体に渡って該蛋白質の可溶形態と同じである、ことを示していた。該ｍＬＩＦ　ｃＤＮＡ（Ｇｅａｒｉｎｇ他、１９８８）の残基５００〜４８４に対して相補性を示すオリゴヌクレオチドを用いて、Ｅｈｒｌｉｃｈ腹水の全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を開始させた。末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、このｃＤＮＡの３′末端にｄＧＴＰ残基の尾を付け、そしてこの得られる１本鎖ＤＮＡを、該ｍＬＩＦ配列の残基３８９〜３６５およびアンカーオリゴヌクレオチド５’　、、、ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣ，、，３’　に対して相補性を示すオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲのための鋳型、として用いた。該ＰＣＲ反応の特異性を上昇させる目的で、そしてこれが、該ｍＬＩＦオーブン読み枠のユニークなＳｍａ　Ｉ制限部位を取り込むため、上記内部オリゴヌクレオチドを選択した。これを後で、完全なオープン読み枠の再構築で用いた。

このＰＣＲは、期待された２つの帯を生じず、むしろ、サザンプロットで確かめられたように、ｍＬＩＦに対して相同性を示す４００〜６００個のヌクレオチドの間に在る材料のなすり付は標本を生じた。全体的ＰＣＲ反応の産生物をＸｈｏＩおよびＳｍａ　Ｉで消化した後、２％アガロースゲル上で分離した。ｍＬＩＦ配列に相当するＤＮＡの領域を上記ゲルから切除した後、これを、ＸｈｏＩ／ＳｍａＩ切断ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＫＳ＋Ｓにクローン化した。挿入されたフラグメントの大きさに関して組換え型コロニーをスクリーニングし、そして異なる大きさを有する２つの組の中で最も大きい挿入断片をＭ１３にサブクローン化した後、配列決定した。残基３７の上流に在るこれらの２つのクローンの配列を、個々の蛋白質の推定アミノ酸配列と一緒に図５に示す。大きい方のｃ　ＤＮＡ（ｐＤＲｌｏｏ）は、該ＤＩＡ／ＬＩＦ蛋白質の拡散形態をコードする。

図５に示す配列は、Ｇｅａｒｉｎｇ他（１９８８）のそれと同じであるが、１２２個のヌクレオチドをＡＴＧ開始コドンの上流に伸ばしている。これは、該Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆ蛋白質の拡散形態をコードするｍＲＮＡの正常な５゜末端を表している可能性がある。

小さい方のクローン（ｐＤＲｌｏｌ）は、該第２エクソンの開始点であると推定される正確なその点で、公知ｍＬＩＦ配列とは異なっており、従って、このＤＩＡ／ＬＩＦ蛋白質のマトリックス会合形態をコードする良好な候補物である。上記ｃＤＮＡによってコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、ＤＩＡ／ＬＩＦの拡散形態のそれとは、このリーダー配列の第１部分ＭＫＶＬＡＡＧが配列ＭＲＣＲに置き換わっている点で異なっている。このＡＴＧ開始コドンの同定は、枠内の停止コドンＵＡＧ。

即ちＡＴＧの上流に在る３０個のヌクレオチド、の存在によって立証された。このマトリックス会合蛋白質は、アミノ酸８と、残基２３の後の開裂部位との間で、該拡散性ｍＬ　Ｉ　Ｆ蛋白質のシグナル配列を保持している。このリーダー配列は、この細胞膜を横切るＬＩＦ蛋白質のトランスロケーションにとって必要な疎水性コア配列を含んでいる。このｐＤＲＩＯＩ　ｃＤＮＡの配列は、３１個のヌクレオチドを該ＡＴＧの上流に伸ばしている。これは、該マトリックス会合Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆ蛋白質をコードするＲＮＡの５゛末端を表している可能性がある。

これらの２つのＲＡＣＥクローンに関する同一性を立証する目的で、ｐＤＲｌｏｏおよびｐＤＲｌｏｌから誘導されるリボプローブを用いて、Ｅｈｒｌｉｃｈ腹水細胞由来の細胞質ＲＮＡを保護した。このｐＤＲｌｏｏおよびｐＤＲｌｏｌ　ｃＤＮＡの５゛末端から、該ｍＬＩＦオープン読み枠内のＳｍａｒ制限部位に伸びているアンチセンスリボプローブを、上記クローンのインビトロ転写によって作り出した。これらのりボブローブに関して得られる保護パターンを、ｐＤＲ２から誘導される５′　リボプローブによって生じる公知のパターンと比較した。

この実験の結果および解釈を図６に示す。各々のりボブローブは、３４５個のヌクレオチド［ｍＬＩＦエクンン２の５゛末端とＳｍａ　Ｉ制限部位との間の距離］から成るフラグメントを保護した。従って、この帯（Ｃ）は、プローブｐＤＲ２およびｐＤＲｌｏｏに関する転写物Ｍ１並びにプローブｐＤＲ１０１に関する転写物Ｄ１に相当している。プローブｐＤＲ１００およびｐＤＲｌｏｌの両方共、プローブｐＤＲ２が保護するフラグメントよりも大きなフラグメントを保護した（３４５個と３６９個のヌクレオチド）。このことは、上記ＲＡＣＥクローン中のＡＴＧの上流に在る配列は、それぞれ、細胞のＤおよびＭ転写物の中に存在している、ことを立証しており、そして、Ｄ　Ｉ　Ａ／Ｌ　Ｉ　Ｆの拡散形態をコードするｃＤＮＡとしてのクローンｐＤＲ１００の同一性を立証している。３６９個のヌクレオチドより大きい２つの保護された帯の存在は、この２つのＤＩＡ／ＬＩＦ転写物の発現を命じるプロモーターの各々が２個のＲＮＡ開始部位を有している、ことを示唆している。これらの部位に関する推定位置を図５に示す。

参考文献Ｂｒａｄｌｅｙ、＾、他、（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９：２２５−２５６゜Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｄ他、（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、５：３２８０−３２８８゜Ｅｄｖａｒｄｓ、　Ｄ、他、（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、　６：１８９９−１９０４゜Ｅｖａｎｓ、　Ｍ、Ｊ、およびＫａｕｆｍａｎ、　Ｍ、　（１９８３）　Ｃａｎｃｅｒ　５ｕｒｖｅｙｓ　２：１８５−２０６゜Ｆｒｏｈｍａｎ他、　（１９８８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、ＡｃａｄＳｃｉ、ロＳ＾　８５　（２３）　１９１１１１１１　８９９ｇ−９００２゜Ｇｅａｒｉｎｇ、　Ｄ、Ｆ、他ＥＭＢＯ（１９８７）　Ｊ、　６：３９９５−４００２゜Ｇｅａｒｉｎｇ、　Ｄ、Ｆ、他ＥＭＢＯ（１９８ｇ）　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１６：９８５７゜Ｇｏｓｐｏｄａｒａｗｉｃｚ他Ｊ、　（１９８４）　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　９９：９４７−９６１゜Ｇｏｕｇｈ、　Ｎ、Ｍ、他（１９８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５：２６２３−７゜Ｋｒｉｅｇ、　Ｐ、およびＭｅｌｔｏｎ、　Ｄ、＾、　（１９８７）輩ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５５：３９７−４１５゜Ｍａｎｉａｔｉｓ、丁、他　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃ。

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補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）１．特許出願の表示ＰＣＴ／ＧＥ　９１１０　Ｏ３３４２、発明の名称白血病抑制因子３、特許出願人氏　名　ヒース、　ジョン・ケイ　（ほか２名）４、代理人　〒１０７ｔ　話　３５８５−２２５６５、補正音の提出年月日１９９２年２月２０日６、添付書類の目録（１）　補正音の写しく翻訳文）　１通３、肝細胞における急性相応答蛋白質遺伝子発現の調節。

４、悪液質の調節。

５　ニューロン生存力および分化の調節。

６　創傷治癒の促進／抑制。

７　上皮細胞増殖および分化の誘発および抑制。

従って、本発明は、哺乳動物の細胞外マトリックスと会合し得る新規なＬＩＦを提供するものである。本発明の１つの面において、この新規なＬＩＦは、Ｎ末端配列ＮＨ２−ｍｅｔ−ａｒｇ−’ｃｙｓ−ａｒｇ、並びにそれらの誘導体、例えばＮＨ２−Ｕ−ａ　ｒ　ｇ−Ｘ−ａ　ｒ　ｇ　［こコテ・ＵおよびＸは以下に定義する］、によって特徴づけられる。

本発明の更に一層の具体例において、上述したＬＩＦに関するこれらの新規な形態、Ｎ末端のシグナル配列、また１ジ組換え型蛋白質もしくはペプチドいずれかの遺伝情報を指定するＤＮＡも提供する。このＤＮＡは、放射能または非放射能標識を用いた通常の手段で標識したプローブを製造するために用いてもよいか、或はこのＤＮＡをベクターにクローン化してもよい。

１２、ホルモン、成長因子またはントキンである請求の範囲１０または１１記戴の組換え型蛋白質もしくはペプチド。

１３、請求の範囲１０〜１２いずれか１項記載の組換え型蛋白質もしくはペプチドをコードする組換え型ＤＮＡ。

１４、請求の範囲１３のＤＮＡを含む組換え型複製可能発現ベクター。

１６、請求の範囲１０〜１４いずれか１項記載の蛋白質もしくはペプチドのＮ末端に対して特異性を示すか、或は請求の範囲１５記載宿主細胞によって製造したポリクローナルもしくはモノクローナル抗体。

１７、式：％式％［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸から成るペプチドの残基か、或は共有結合であり、モしてＸは、いずれかのアミノ酸であるコ　、並びにそれと本質的に同じ変異体、を有するペプチド。

１８、配列ＮＨ２−Ｕ−ａ　ｒ　ｇ−Ｘ−ａ　ｒ　ｇ　−［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸から成るペプチドの残基か、或は共有結合であり、モしてＸは、いずれかのアミノ酸である］のＮ末端を有する蛋白質もしくはペプチドにＥＣＭを接触させることから成る、哺乳動物細胞のＥＣＭに組換え型蛋白質もしくはペプチドを付着させる方法。

１９、該蛋白質もしくはペプチドのＮ末端が、ＮＨ２−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇ −ｉ　Ｉｅ−ｖａ　１−ｐｒｃ−１ｅｕ−ｅｕ− 〔ここで、ＵおよびＸは、請求の範囲１８で定義したのと同じであるコ、並びにそれらと本質的に同じ変異体、から成る請求の範囲１８記載の方法。

２０、治療もしくは診断によりヒトもしくは動物体を治療する方法で使用するための、請求の範囲１〜４いずれか１項記載のＬＩＦか或は請求の範囲８記載抗体。

２１、上記治療が必要な受容個体に、請求の範囲１記載のＬＩＦか或は請求の範囲８記載の抗体の有効量を投与することから成る、ＬＩＦの天然に存在しているレベルを変化させることから利点が得られるところの、ヒトを含む哺乳動物中でのＬＴＦの異常および／または真新発現に関連した状態を治療する方法。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳動物の細胞外マトリックスと会合し得る本質的に純粋な白血病抑制因子（ＬＩＦ）。
２．Ｎ末端配列がＮＨ２−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇ− ［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸から成るペプチドの残基か、或は共有結合であり、そしてＸは、いずれかのアミノ酸である］から成る請求の範囲１記載のＬＩＦ。
３．Ｕがメチオネイン（ｍｅｔｈｉｏｎｅｉｎｅ）の残基を表し、そしてＸがｃｙｓまたはｇｌｙである請求の範囲２記載のＬＩＦ。
４．該Ｎ末端配列がＮＨ２−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇ−ｉｌｅ−ｖａｌ−ｐｒｏ−ｌｅｕ−ｌｅｕ− ［ここで、ＵおよびＸは、請求の範囲２で定義したのと同じである］、並びにそれらと本質的に同じ変異体、から成る請求の範囲２または３いずれか記載のＬＩＦ。
５．請求の範囲１〜４いずれか１項のＬＩＦをコードする組換え型ＤＮＡ。
６．請求の範囲５のＤＮＡを含む組換え型の複製可能発現ベクター。
７．請求の範囲６のベクターで形質転換もしくはトランスフェクションした宿主細胞。
８．請求の範囲１〜４いずれか１項記載のＬＩＦのＮ末端に対して特異性を示すか、或は請求の範囲７記載宿主細胞によって製造したポリクローナルもしくはモノクローナル抗体。
９．薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と共に、請求の範囲１〜４いずれか１項記載のＬＩＦか或は請求の範囲８記載抗体のいずれかを含む薬学組成物。
１０．そのＮ末端に、配列ＮＨ２−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇ− ［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸から成るペプチドの残基か、或は共有結合であり、そしてＸは、いずれかのアミノ酸である］を含む組換え型蛋白質もしくはペプチド。
１１．該Ｎ末端配列がＮＨ２−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇ−ｉｌｅ−ｖａｌ−ｐｒｏ−ｌｅｕ−ｌｅｕ− ［ここで、ＵおよびＸは、請求の範囲８で定義したのと同じである］、並びにそれらと本質的に同じ変異体、から成る請求の範囲９または１０いずれか記載の組換え型蛋白質もしくはペプチド。
１２．ホルモン、成長因子またはシトキンである請求の範囲１０または１１記載の組換え型蛋白質もしくはペプチド。
１３．請求の範囲９〜１２いずれか１項記載の蛋白質もしくはペプチドをコードする組換え型ＤＮＡ。
１４．請求の範囲１３のＤＮＡを含む組換え型複製可能発現ベクター。
１５．請求の範囲１４のベクターで形質転換もしくはトランスフェクションした宿主細胞。
１６．請求の範囲９〜１４いずれか１項記載の蛋白質もしくはペプチドのＮ末端に対して特異性を示すか、或は請求の範囲１５記載宿主細胞によって製造したポリクローナルもしくはモノクローナル抗体。
１７．式：ＮＨ２−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇ−ｉｌｅ−ｖａｌ−ｐｒｏ−ｌｅｕ−ｌｅｕ− ＣＯＯＨ［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸から成るペプチドの残基か、或は共有結合であり、そしてＸは、いずれかのアミノ酸である］、並びにそれと本質的に同じ変異体、を有するペプチド。
１８．配列ＮＨ２−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇ− ［ここで、Ｕは、２０個もしくはそれ以下のアミノ酸から成るペプチドの残基か、或は共有結合であり、そしてＸは、いずれかのアミノ酸である］のＮ末端を有する蛋白質もしくはペプチドにＥＣＭを接触させることから成る、哺乳動物細胞のＥＣＭに蛋白質もしくはペプチドを付着させる方法。
１９．該蛋白質もしくはペプチドのＮ末端が、ＮＨ２−Ｕ−ａｒｇ−Ｘ−ａｒｇ −ｉｌｅ−ｖａｌ−ｐｒｏ−ｌｅｕ−ｌｅｕ− ［ここで、ＵおよびＸは、請求の範囲１８で定義したのと同じである］、並びにそれらと本質的に同じ変異体、から成る請求の範囲１８記載の方法。
２０．治療もしくは診断によりヒトもしくは動物体を治療する方法における、請求の範囲１〜４いずれか１項記載のＬＩＦか或は請求の範囲８記載抗体の使用。
２１．上記治療が必要な受容個体に、請求の範囲１記載のＬＩＦか或は請求の範囲８記載の抗体の有効量を投与することから成る、ＬＩＦの天然に存在しているレベルを変化させることから利点が得られるところの、ヒトを含む哺乳動物中でのＬＩＦの異常および／または異所発現に関連した状態を治療する方法。