JPH06502176A - 新しいオンコフェータル遺伝子、そのための遺伝子生成物およびその利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２　新しいオンコツニータル遺伝子、そのための遺伝子生成物およびその利用法 １里豊立互 本発明はＴ−リンパ腫ライブラリーから得た新しいｃＤＮＡクローンに関するも のである。Ｐｅｍとして知られているこの新しいｃＤＮＡクローンは胎盤および 妊娠初期の胎児で段階固有の形態で表現されるトランスクリプトと交雑する。こ のＰｅｍｃＤＮＡ配列は他のＤＮＡや蛋白質配列と配列上の基本的な類似性を持 たない細胞内親水性蛋白質の形成を予言する。本発明によるＤＮＡ配列および遺 伝子組替えＤＮＡ分子は、それぞれが以下の特徴を有する新しい蛋白質をコード 表現することを特徴とする＋（＋）Ｔ−リンパ腫細胞によって表現される、（２ ）通常の胸腺、活性化膵臓細胞、消化管関連リンパ組織、あるいは骨髄において は表現されず、成人の脳、肝臓、大腸、あるいは卵巣では検出できない、（３） 不死化された、あるいはガン細胞株では表現され、（４）胎児の発達段階で表現 される。以下の開示からも理解されるように、胎児の発達段階で表現されるこの 新しい蛋白質および新しいＰｅｎ蛋白質を基本的に清潔な形態で生産するための ＤＮＡ配列、遺伝子組替えＤＮＡ分子、およびプロセスは胎児発達の規制操作、 腫瘍形成性表現型の変更において有益であり、また、Ｐｅｍ腫瘍遺伝子を含んで いる腫瘍の転移病巣の位置を特定する上でも役に立つ可能性がある。

五１月り肪 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、　Ｃａｅｎｏｒｂａｂｄｉ ｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓおよび５ａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖＪｓ ｉａｓなどの無を椎生物において、発達に関与する多数の遺伝子が確認されてい る。哺乳動物においては、発達中に不可分の役割を演じる遺伝子がごく少数確認 されている（Ｂｌａｕ　（１９８８）　Ｃｅ１ｌ　５３　：　６７３）　、例え ば、筋肉特有の遺伝子であるＭｙｏＤｌおよびミオジェニンはねずみの分化の遺 伝子コントロールの重要なモデルとして役立ってきた。体面および四肢芽は最初 に妊娠８日目とｌＯ０日目ミオジェニンとＭｙｏＤｌをそれぞれ表現しく５ａｓ ｓｏｎら（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ３４１　：　３０３−３０８）　、イン・ ビトロでミオブラスト系統（ｍｙｏｂｌａｓｔｌｉｎｅａｇｅ）への切替えをコ ントロールすることで知られている（Ｄａｖｉｓら（１９８７）皿５１　：　９ ８７−１０００）。Ｈｏｘ−５遺伝子複合体は妊娠９日目以後にねずみの四肢芽 で興味深い表現パターンを示す（Ｄｏｌｌｅら（＋９８９）　Ｎａｔ、ｕｒｅ　 ３４２　：　１６１−Ｉｌｌ）が、コード化された遺伝子の機能については、今 後の研究が必要である。ねずみの発達の初期および中間段階の細胞をタグする遺 伝子マーカーが他にもいくつか知られている。例えば、マウスにおいて妊娠８日 目に起きる非削（ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の最初のプロセスと特に関連づけ られた遺伝子はこれまでなかった（例えば、Ｒｏｓｓａｎｔ　ａｎｄ　Ｊｏｙｎ ｅｒ　（１９８９）　Ｔｒｅｎｄｓ　１ｎＧｅｎｅｔｉｃｓ　５　：　２７７− ２８３参照）。

不死化された、そして十分に形質変換された細胞は正常な哺乳類の発達において 表現され（そして恐らくそれに影響を及ぼす）遺伝子を往々にして転写する（Ｒ ｕｄｄｏｎ　（１９８７）　ＧｅｎｅＤｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ、　ｉｎ　Ｃａｒ＋ｃｅｒ　Ｂｉｏｌｏ　、　０ｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、４３１−４３ ６）　、いくつかの例で、これらの「オンコツニータルｊ　（ｏｎｃｏｆｅｔａ ｌ）遺伝子は腫瘍形成（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）表現型には関与していないよう に見える。例えば、ａ−胎児蛋白質はトロフォブラスト（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓ ｔ）細胞および多くの腫瘍細胞によって表現される。他の例で、発展的に規制さ れる遺伝子は細胞の変換された表現型への転化において主要な役割を果たす。例 えば、プロト−オンコシンであるｃ−ｍｙｃ、　ｃ−ｓｒｃ、　ｃ−ｆｏｓおよ びｃ−ｆｍｓは胎児の発達中に表現され、イン・ビトロで発達段階を規制するこ とが示されている（Ａｄａｍｓｏｎ　（１９８７）　Ｐｌａｃｅｎｔａ　８　： 　４４９−４６６参照）。

免疫システムの発展においては、Ｔ−リンパ球が胸腺に入って分化および成熟の 段階を経過する前駆体幹細胞から得られる。Ｔ−細胞が胸腺内部で異なった発展 段階を経過すると、多くの遺伝子が活性化されるか、あるいは抑制される０例え ば、細胞はこの時期にそれらの表面でＩＬ−受容体、ＣＤ４および／またはＣＤ ８を獲得する。これらの分化標識はＴ−細胞発展および／または機能にとって重 要な役割を果たす。多くの遺伝子生成物は発達中のＴ−リンパ球内でその表現レ ベルが増大される。これらには抗原に関するＴ−細胞受容体、および標識ＣＤ４ およびＣＤ８などが含まれる。他の多くの抗原もリンパ球内でのその正確な機能 が分かる前からＴ−細胞標識として役立ってきた。ごく最近になって、Ｔ−細胞 抗原Ｐｇｐｌが胸腺リンパ球が胸腺に戻るのを助け、一方、Ｔ２Ｏ０（ＣＤ４５ ）は細胞内シグナリングのひとつの成分として機能する。別のＴ−細胞標識であ るｒｈｙ　１はそれに結びつけられる特定の機能は分かっていない。

５Ｌ１２．４細胞はＣＤ　４　／ＣＤ　８二重ネガティブ表現型を示し、したが って、発達の比較的初期の段階においては胸腺リンパ球に似ている。さらに、そ れらはＴ−細胞受容体アルファ・サブユニットは表現しない。しかしながら、５ Ｌ１２．４細胞は胸腺上皮単層上での共生培養後、その表面にＣＤ４およびＣＤ ８を安定して表現させることが可能である。このように、５Ｌ１２．４細胞は分 化を成熟の段階を通過する能力を持っている。この特殊イン・ビトロ生物システ ムは、一定程度、胸腺の微細環境を模倣する。

発達中の胸腺リンパ球で最初に表現される多数の遺伝子が確認されている。これ らの遺伝子の多くはＴ−細胞前駆体が免疫システム内で一定の機能を果たすよう になるために表現されねばならない、例えば以下のような蛋白質をコード表現す る＝（１）抗原の識別似必要な抗原に関するＴＣＲ；　（２）細胞がサイトカイ ンＩＬ２に応答するために表現されねばならないＣＤ２５　（ＩＬ２受容体）　 ；　（３）　ＣＤ３　、　ＣＤ４　、　ＣＤＳ、　ＣＤ４５など、抗Ｋｍ別中の シグナル・トランスダクションに重要な役割を果たす遺伝子生成物；（４）胸腺 リンパ球を標的器官に向かわせる機能に関与している遺伝子生成物のいくつか、 および（５）Ｔ−細胞活性化に関与する遺伝子生成物（Ｆｏｗｌｋｅｓ　ａｎｄ 　Ｐａｒｄｏｌｌ。

−Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　４４：２０７−２６４　（１９ ８９）　ＨＨｏｏｄら（＋９８５）　Ｃｅ１ｌ　４０　：　２２５−２２９　； 　ＲｏｔｈｅｎｂｅｒｇおよびＬｕｇｏ。

Ｄｅｖｅｌｏ　Ｂｉｏｌ　１＋２　：　１−１７　（１９８５）　；　Ａｄｋｉ ｎｓら旦ｎ　ＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ、５　：　３２５−３６５　（１９８７）　 ；　Ｃｒａｂｔｒｅｅ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　：３４３−３５５　（１９８ ９）　；　ＫｗｏｎおよびＷｅｉｓｓｍａｎ、　Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃａｄ　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６　：　１９６３−１９６７　（１９８９）　）　、表現 された遺伝子の異なった組み合わせを表現する胸腺リンパ球サブセットには著し い不均質性がある。遺伝子表現は多数ある胸腺リンパ球のすべてではないとして も、多くの種類で詳細に分析されており、Ｔ〜細胞の発達およびホーミング（ｈ ｏＩＩｌｉｎｇ）において一定の役割を果たす生成物、特に数値的には少ない、 一過性のプロジェニター胸腺リンパ球において表現されるものをコード表現する 遺伝子を特定する課運も残っているようである。

胸腺リンパ球の不均質性が大きいので、発展過程に発生する遺伝子表現のカスケ ードの十分な特徴付けを行えるに足るだけの分画されたプロジエニター胸腺リン パ球を獲得するのは数の点でも純度の点でも実際的には不可能である。こうした 理由から、リンパ球の発達における遺伝子表現の研究においてはリンパ腫および 白血病細胞株が広く用いられている（Ｇｒｅａｖｅｓ　（１９８６）　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２３４　：　６９７−７０４　；　Ｈａｎｄｌｅｙ−ＨｙｄｅおよびＬ ｙｎｃｈ　（１９８６）　Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　４　：６２１−６ ４９）。

かなり多くの文献が数値的に少ない、一過性のプロジエニタ形質変換された標的 細胞の特徴のいくつかが腫瘍細胞にも保持されていることを示唆している。腫瘍 細胞における予想外の遺伝子表現は従来形質変換のおける異常として切り捨てら れることが多かった。しかしながら、不均質は腫瘍細胞におけるｒ異常な」遺伝 子表現を注意深く分析してみると、そうした遺伝子を表現する不正常なプロジェ ニター細胞の珍しいサブセットが明らかになった（Ｇｒｅａｖｅｓ　（１９８６ ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４　：６９７−７０４　；　Ｈａｎｌｅｙ−４（ｙｄ ｅおよびＬｙｎｃｈ　（１９８６）　Ａｎｎ　Ｒｅｖ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ　４　：　６２１−６４９　；　Ｐｉｅｒｅｓおよび５ｐｅｅｒ ｓ　（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　４８　：　１９９６−２００４）　。

ひとつの個体から取り出されたマウスおよびヒト・リンパ腫細胞株の不均質性は 個々の細胞が到達した成熟度の差からもたらされる可能性がある。特定の数の特 徴だけが異なっている緊密に関連した細胞クローンを獲得するために、確立され たＴ−リンパ腫細胞株の不均質性がこれまで利用されてきた。Ｈｅｄｒｉｃｋら （Ｈｅｄｒｉｃｋ　ら（＋９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０８　：　１４９−１５ ３）はサブストラクション・クローニング法を用いて、Ｔ−細胞とＢ−細胞は１ ００個程度の遺伝子の表現が異なっていると推測している。緊密に関連している Ｔ−リンパ腫細胞がもっと少ない遺伝子の表現でだけ異なっているという可能性 もある。

こうした細胞クローンは特定の数の特徴だけが異なったよく定義された、そして 安定した表現型を持った純粋な細胞群で研究する機会を提供してくれる。本願に おいては、こうした密接に関連した細胞群をつくりだすために、５Ｌ４２　Ｔ− リンパ−腫モデル・システムが開発され、用いられた。（Ｈａｙｓ　ら（１９８ ６）　Ｔｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　３０　：　５９７−６０１　；　ＭａｃＬｅ ｏｄら（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　４４　：　１７８４−１７９０　； 　ＭａｃＬｅｏｄら（１９８５）　Ｊ　ＮａｔＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ　７４　 ：　８７５−８８２　；　ＭａｃＬｅｏｄら（１９８６）　ＰｒｏｃＮａｔｌ　 Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：６９８９−６９９３；Ｓｉｅｇａｌら（１ ９８７）Ｌ、ム且、叉０工１６６　：　１７０２−１７１５）。

５ＬＩ２，４細胞は成熟の中間段階で胸腺リンパ腫と類似している（Ｆｏｗｋｌ ｅｓおよびＰａｒｄｏｌｌ　（１９８９）　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕ ｎｏ１４４　：　２０７−２６４）　、これら２つの細胞クローンはその生物学 的特性が異なっている。ＳＬ＋２．４細胞は節外主要を発生させ、グリコフルチ コイド誘発細胞溶解にかかりやすいのに対して、５Ｌ１２．３細胞はグリココル チコイドによる細胞溶解に対して抵抗力を持つ拡散播種状腫瘍（ｄｉｆｆｕｓｅ 　ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ　ｔｕｍｏｒｓ）をひきおこす。

の　な 本発明は新しいｃＤＮＡ配列、遺伝子生成物（Ｐｅｗ）蛋白質、およびこの新し いｃＤＮＡ配列およびＰｅｎ遺伝子生成物の使用法およびＰｅｍ遺伝子生成物を 提供するものである。本発明においては、Ｔ−リンパ腫から得られたｃＤＮＡク ローン（Ｐｅｍ）により代表される新しい遺伝子の配列および表現上の特徴につ いて説明する。いくつかの系統から得られた不死化され、形質変換された細胞株 がＰｅｍトランスクリプトを表現する。本発明によるＤＮＡ配列および遺伝子組 み替えＤＮＡ分子はそれぞれ以下の特徴を有する新しい蛋白質をコード表現する ことによす特徴づけられる：（１）Ｔ−リンパ腫細胞により表現される、（２） 正常な胸腺、活性化膵臓細胞、腸関連リンパ球組織、あるいは骨髄においては表 現されず、成人の脳、肝臓、大腸、あるいは卵巣においては検出されない、（３ ）不死化された、あるいはガン細胞株において表現され、そして（４）胎児の発 展過程で表現される。以下の開示から理解されるように、胎児発達過程で表現さ れる新しい蛋白質およびその新しいＰｅｍ蛋白質をかなり純粋な形で生産するた めのＤＮＡ配列、遺伝子組み替えＤＮＡ分子およびプロセスは、胎児発達の調節 機能を操作し、腫瘍源性表現型を変えるのに役立つ可能性があり、また、Ｐｅｍ 腫瘍遺伝子を含む腫瘍の転移巣の場所をつきとめるのにも有益である可能性があ る。

Ｐｅｍ遺伝子は成熟した個体の組織では検出可能なレベルでは表現されないが、 マウス胎児の発達過程では、まず胚で。

そしてその後で胚性組織で、かなり表現される。胎児発達過程でのＰｅｎの表現 と不死化された腫瘍形成性細胞株におけるその存在とは「オンコツニータルｊ　 （ｏｎｃｏｆｅｔａｌ）遺伝子に予想される特性と一貫している。このＰｅｍ　 ｃＤＮＡ配列は腫瘍形成性細胞の標識、および初期の胎児発達に関与する細胞の 標識として有益である。

本発明のさらに別の目的、特徴および利点は、以下の図面の簡単な説明と、その 後の図面を参照した好ましい実施例についての詳しい説明を参照すれば明らかに なるであろう。

図面の簡単な説明 図１はＤＮＡおよびＰｅｍ　ｃＤＮＡの予想される蛋白質配列を示し図３は胎児 の発達過程におけるＰｅｍ　ｍＲＮＡ表硯を足している。

ｌし主群」口り睨ｊ− ここに説明されている発明をさらによく理解できるように、以下に詳細な説明を 行う。

以下の説明において、以下の用語が用いられる。

「宿主Ｊという用語は、ここでは、原核生物だけでなく、イーストおよび線状、 さらに植物性および動物性細胞などの真核生物も含めて意味するように使われて いる。

「原核生物」という用語は、本発明によるＰｅｎあるいは遺伝子組み替え蛋白質 （ｒＰ６ｍＰ）を表現させるためにそのＤＮＡを用いて形質変換させることがで きるすべてのバグテリアを含んで意味するように使われている。

「真核生物Ｊという用語は、本発明によるＰｅｎあるいは遺伝子組み替えＰｅｍ 蛋白質を表現させるために、そのＤＮＡを用いて形質変換させることができるす べてのイースト、真菌、動物および植物細胞を含んで意味するように使われてい る。

本発明によるＰｅｍ蛋白質を生産するためのＤＮＡはどんな哺乳動物種からでも 得ることができる。必要なのはＰｅｎ蛋白質（ＰｅｍＰ）のための遺伝子配列が 原核生物あるいは真核生物において表現されるということだけである。好ましい のはマイスからＰｅｍ蛋白質を表現するＰｅｗ　ＤＮＡである。特に好ましいの は複数の動物種（例えば、マウス、ウサギ、アザラシ、またはヒトなど）の間で 免疫学的に交差反応性のＰｅｎ　ＤＮＡの配列である。

本発明によるＰｅｎ蛋白質をコード表現する遺伝子組み替えＤＮＡ分子は当業者 には公知の技術のいずれかを用いて宿主を形質変換するために用いることができ る。特に好ましいのは原核生物を形質変換するために、本発明によるＰｅｎ蛋白 質に関するコーディング配列を含むベクターの使用である。

本発明によるＴ−細胞遺伝子組み替え蛋白質（ｒＰｅａ＋）は自然のＰｅｍ蛋白 質のアミノ酸配列と比較して、そのフランキング端末（ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｅｎ ｄｓ）でのアミノ酸がより多いが、あるいはより少なくなっている。

「本質的に純粋」という用語は、本発明によるＰｅｎ蛋白質に対して用いた場合 、そのポリペプチドがその自然の状態ではＰｅｍ蛋白質と結びついていて、一定 の、そして再現可能な電気泳動的あるいはグロマトグラヒー的反応、溶出特性、 そして抗原活性を示す他の蛋白質を基本的には含んでいないということを意味す る。Ｔ本質的に純粋Ｊという用語はＰｅｍ蛋白質と他の化合物の人為的、あるい は合成混合物を排除することは意味していない。

融合された、操作可能に連結された遺伝子を作成し、それらをバクテリア内で表 現する方法は、例えば、本資料に引例として組み込まれている米国特許４４．３ ６６、２４６に示されており、公知である。そこに述べられている遺伝子構造お よび方法は原核生物または真核生物宿主においてＰｅｍ蛋白質を表現させるため に用いることができる。

原核生物宿主は大腸菌、サルモネラ・チフィムリウム、セ）　ラチア・マルセッ センス、およびバシラス・サチリスなどのゲノム陰性菌とゲノム陽性菌の両方を 含んでいる場合がある。

真核生物宿主はビチア・バストリスなどのイースト菌、あるいは哺乳動物細胞を 含む場合がある。

一般的に、挿入されたＤＮＡ片の効率的な転写を行いやすくするプロモーター配 列を含んだ表現ベクターはその宿主との組み合わせで用いられる。表現ベクター は通常、複製系、プロモーター、ターミネータ−１そして、形質変換される細胞 における表現型選択を行うことができる特殊な遺伝子を含んでいる。形質変換さ れた宿主はこの技術領域で公知の手段によって栄養を与え、培養して、最善の細 胞成長を行わせることができる。

本発明で用いることができるプロモーターの例は、例えばｒｅｃ　Ａ、　ｔｒｐ 、　ｌａｃ、　ｔａｃ、バクテリオファージ・ラムダｐＲあるいはｐＬ、　ＭＭ ＴＶ、　ＳＶ４０などがある。本発明で用いることが可能なプラスミドあるいは バクテリオファージのいくつかの例はＭａｎｉａｔｉｓ　らＭｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ、　１９８２に記載されており、他のものも当業者には知られており、容易 に確かめることができる。

本発明は上記の方法で修正された、あるいは他のいずれかの方法で修正された、 この技術領域で通常の技術を有する人々に一般的に知られている方法、例えば、 漆原性ファージを用いた遺伝子物質の伝達などによって修正された、そして、Ｐ ｅｎ蛋白質に関する遺伝子を表現する原核生物あるいは真核生物をつくりだすど んな宿主に対してでも適用できる。

遺伝子はテンプレートあるいはメツセンジャーＲＮＡを通じて特定のペプチドを 特性を有するアミノ酸の配列をコード表現するＤＮＡ配列である。　ｃＤＮＡと いう用語は介在配列が取り除かれた遺伝子を含んでいる。ｒＤＮＡという用語は イン・ビトロでｃＤＮＡあるいはゲノム性ＤＮＡ配列をスプライシングすること によって遺伝子が組み替えられた分子を意味する。

クローニング伝播体はプラスミドかファージＤＮＡ、あるいは、その場所でＤＮ Ａの生物学的な機能を損傷せずに判定できるような方法でそうしたＤＮＡ配列を 切断することができ、そして形質転換細胞の識別のために使用するのに適してい る、ひとつあるいは少数のエンドヌクレオチド識別部位で特徴づけられる宿主細 胞において自己増殖できる他のＤＮＡ配列である。標識は、例えば、テトラサイ クリン抵抗、ネオマイシン抵抗、あるいはアムビシリン抵抗である。ｒベクター Ｊという用語は、時々はクローニング伝播体に関しても用いられる。

表現伝播体はクローニング伝播体に類似しているが、しかし通常、ある種のコン トロール配列のコントロール下で宿主内で任意の構造遺伝子を表現できる伝播体 である。

Ｐｅｎ蛋白質を表現するためにＰｅｍゲノムを用いて形質変換された宿主はＰｅ ｎポリペプチドおよび蛋白質の生産のためには特に有益である。

Ｐｅｎ蛋白質はＰｅｎ蛋白質のアミノ酸配列全体で構成されている場合もあるし 、特定の決定基だけで構成されている場合もある。Ｐｅｎ遺伝子組み替え蛋白質 によって免疫化された動物は遺伝子組み替え、あるいは自然発生ポリペプチド上 に存在するエピトープに結合する抗体をつくりだす。したがって、Ｐｅｎ含有遺 伝子組み替え蛋白質の商業的な生産を行うことができる。

デ個体ｊという用語は、いずれかの動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ま しくはけっ歯頚、ネコ、イヌ、あるいはヒトを含んで意味するように用いられて いる。

検出可能なラベルは検出できる分子ならどれでもよい。

広く用いられている検出可能なラベルは”＃Ｐ、”ｃ、＋”工。

Ｈおよび°°Ｓなどの放射性ラベルを含んでいる。ニック・トランスレーション 、＃素あるいは化学的な手段によってビオチンでラベルしたヌクレオチドをＤＮ ＡあるいはＲＮＡに組み込むことができる６ビオチン化プローブはアビジン／ス トレプトアビジン、蛍光、酵素的、あるいはコロイド性金接合体などを用いて複 合化した後に検出される。核酸はまた、他の蛍光性化合物、免役検出可能蛍光性 誘導体、あるいはビオチン類似物を用いてラベルすることもできる。核酸は蛋白 質を取りつけることによってもラベルすることができる。放射性、、−ゼおよび ペロキシダーゼ）、あるいは−重鎖結合（ｓｓＢ）蛋白質とクロス−リンクした を用いることも可能である。

新しい違って表現された遺伝子を遺伝子表現において知られている相違および同 系宿主動物において腫瘍を発生させる能力の違いに基づいて分離するために、５ ＬＩ２　Ｔ−リンパ腫細胞株から得られる二つのクローンが用いられた。（Ｈａ ｙｓら（１９８６）　Ｉｎ５　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　３８　：　５９７−６０１　 ；　ＭａｃＬｅｏｄら（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　４４　：　１７８４ −１７９０　：　ＭａｃＬｅｏｄら（１９８５）　Ｊ　Ｎａｔ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ　７４　：　８７５−８８２　；　ＭａｃＬｅｏｄら（ １９８６）Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３　：　６ ９８９−６９９３　ＨＳｉｅｇａｌら（１９８７）　Ｊ一旦１−Ｍｅｄ　１６６ 　：　１７０２−１７１５　；　Ｗｅｉｎｒｏｔｈら（＋９８５）　Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ。

４５　：　４８０４−４８０９　；　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら（＋９８８）　ＥＭ ＢＯＪ　７　：　１０１−１０９　および表現型の要約に間しては表１．）対照 的に、５Ｌ１２，４＠胞はＴＣＲ−アルファを除いてＴＣＲ／ＣＤ　３複合体の すべての構成成分に関するｍＲＮＡを表現する；そしていくつかの点で、これら の細胞は胸腺リンパ球の発達における中間段階における胸腺リンパ球と類似して いる。５Ｌ１２．４細胞は腫瘍形成性は低いが、顕著な節外腫瘍を形成する。

５ＬＩ２．４細胞でだけ表現され、５Ｌ１２．３Ｍ胞では表現されない遺伝子だ けを示すｃＤＮＡを分離するためには、サブストラクション・ハイブリダイゼー ション強化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ　）プローブと従来の分画スクリーニングの組み 合わせが用いられた（別の資料：　ＭａｃＬｅｏｄら（１９９０）　Ｃｅ１ｌ　 ＧｒｏＷｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ、１　：　２７１−２７９にも述べられているよう にＦｉｌｍｕｓら（１９８９）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

影二Ｌ　８　：４２４３−４２４９と類似）。

ＤＮＡ配列および遺伝子組み替えＤＮＡを提供することによって、本発明はまた これらの配列を含んでいる、または欠いている細胞を識別するためのプローブお よび方法と、こうした配列を欠いている細胞にこれらの配列を提供する手段も提 供する。

加えて、本発明は正常のＰｅｍ　ＤＮＡ配列を含んでいる細胞にアンチセンスＲ ＮＡ配列、あるいは本発明による新しい蛋白質をコード表現するＲＮＡに結合す ることができ、その合成を阻止する該アンチセンスＲＮＡをコード表現するＤＮ Ａを提供することで新しいＰｅｎ配列の表現を抑制する手段を提供する。また、 この開示から、リガンドのそれらの蛋白質に対する結合を阻止し、そして薬品あ るいは他の試薬（ラベルなど）をこれらの蛋白質を表現する細胞に向かわせるた めに、本発明による蛋白質のいずれかに対する抗体を用いることができることも 当業者には明らかであろう。

本発明は新しいｃＤＮＡ配列、遺伝子生成物（Ｐｅ＋＋＋）蛋白質、およびこの 新しいｃＤＮＡ配列とそれに関連したＰｅｌ１１遺伝子蛋白質生成物の使月法を 提供する。ｃＤＮＡ配列は長さが８３８ｂｌ）で、ｂｐ９１から７２０に延びた 単一の、長い、オープン解読わくを含んでおり、そして、２１０アミノ酸を含む 蛋白質の形成を予言する（図１およびＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｃｔ　１　）。図１ の右側の数字はヌクレオチド配列を示している。左側の数字は予言されたアミノ 酸の位置を示している。配列内に存在する第一のメチオニンに下線を付しである 。ポリアデニル化シグナル・コンセンサス配列：　ＡＡＴＡＡＡにも下線を付し である。ＤＮＡ配列の３′端末の（Ｘ）はポリ（Ａ）テイルの１４アデニレート 残基のストリングを示している。ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存キナーゼ（ＡＧ）　、 蛋白質キナーゼＣ（Ｃ）、およびカゼイン・キナーゼＩＩ　（ＣＫ）に関する燐 酸化可能箇所は、キナーゼのそれぞれのＳｅｒあるいはＴｈｒを取り囲んでいる 適切なコンセンサス配列を識別するインテリジエネテイックス・プログラムを用 いて確認された。このコンセンサス・ポリアデニル化配列：　ＡＡＴＡＡＡはポ リ（Ａ）トラクトの５０ｂｐ　５’に位置している。最初のメチオニン・コード ン（５′端末から９１ｂｐ）は効率的な翻訳スタート箇所を提供するコザッグ・ コンセンサス配列（Ｇ／　ＸＸＡＴＧＧ）によって取り囲まれている（Ｋｏｚａ ｋ　１９８６）。Ｔ７ボリメラーゼを用いて作成され、網状赤血球内溶解物内で 翻訳されたＰｅｍセンス・トランスクリプトは予言された分子量（２３Ｋｄａ　 ：データは示されず）の蛋白質分子をつくジノだす。したがって、第一のメチオ ニンはイン・ビトロ転写−翻訳実験で翻訳開始箇所としての役割を果す。Ｐｅｍ 　ｃＤＮＡクローン（８３８ｂｐ、ポ１バＡ）テイルを除く）の長さは除去され たポリ（Ａ）テイルを持っていたＰｅｍ　トランスクリプト（０，９Ｋｂ）のサ イズと類似している（データなし）。したがって、Ｐｅｎ　ｃＤＮＡクローンは ほとんど全長である可能性がある。

Ｐｅｍ蛋白質は親水性で、リーダー配列、Ｎ−結合グリコシレーション部位、あ るいは蓑を越えて広がっている可能性のある領域を含んでいない５したがって、 Ｐｅｍが分泌されたり細胞膜内に挿入されたりする可能性はないが、細胞内蛋白 質としての属性を有している。予言されたＰｅｍ蛋白質は図１に付記されている ように蛋白質キナーゼＣ、カゼイン・キナーゼおよびｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存キ ナーゼによってＳｅｒおよびＴｈｒのリン酸化のためのコンセンサス配列を含ん でいる。ＤＮＡと予言されるアミノ酸配列を遺伝子バンク（ＧｅｎＢａｎｋ）お よびスイスの蛋白質データベースで調べたところ、他の公知の遺伝子あるいは遺 伝子生成物との重大な類似性が見いだされなかったので、Ｐｅｎは新しい遺伝子 を表わしている。

上に本発明について全体的に述べたので、以下の具体的な事例を参照することの よって、より完全な理解が得られるであろう。これらの事例は説明のためのみに 提供されるのであって、特に具体的な指示がない限り、本発明を限定するための ものではない。

ス」Ｕ引上 細　の　キャラクタリゼーション　よび培Ａ、　リンパ腫　株 Ｔ−リンパ腫細胞株５Ｌ１２，１．　ＳＬ＋２．３．５Ｌ１２．４およびそれら の間で形成される体細胞ハイブリッドの分離、キャラクタリゼーションおよび培 養条件はＨａｙｓら（１９８６）　Ｔｎｔ、　ＪＣａｎｃｅｒ　３８　：　５９ ７−６０１　；　ＭａｃＬｅｏｄら（１９８４）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５４４　 ：　１７８４−１７９０　；　ＭａｃＬｅｏｄら（＋９８５）Ｊ　Ｎａｔ、　Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ。

７４　：　８７５−８８２　；　ＭａｃＬｅｏｄら（１９８６）Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｒｅｓ、　４５　：　４８０４−４８０９に詳細に述べられており、これらはす べて本文書中に引用文献として組み込まれている。

ＳＬ］２．３および５Ｌ１２．４細胞クローンの表現型を要約して表１に示す。

トランスクリプト表現、表面蛋白質表現、腫瘍形成性および腫瘍タイプはそれぞ れノーザン分析、フロー・サイトメトリー、およびクローンされた細胞の同系動 物へのイン・ビボ注射によって調べられた。ＴＣＲ−β　１，０および１．３ｋ ｂ　トランスクリプトはそれぞれ、（Ｄ）−Ｊ−ＣおよびＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃ配列を コード表現する。グリコフルチコイド反応は１ｍＭデキサメタシン内での細胞の 成長を手掛かりに調べられた。

以下余白 Ｌ ＳＬ１２．４゛よびＳＬ＋２．３　クローンの５ＬＩ２．４　５Ｌ１２．３ ＣＤ８　−　− 表面　ＴｈＢ　＋　− Ｒ＝溶解に抵抗性のある細胞 Ｓ＝溶解に感受性が高い ＳＡＫ　８細胞（Ｇａｓｓｏｎ　ａｎｄ　Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ　Ｊ、　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ、９６：４０９−４１５　（１９８３）　）はＧａ５５ｏｎ博士か ら入手したものである。

リンパ腫細胞はＩＯパーセント牛脂仔血清、グルタミン、およびストレプトマイ シンで補ったダルベツコの修正イーグルス・メディア内で培養された。二つのヒ ト卵巣悪性腫瘍株２００８　（Ｄｉｓａｅａ　らＡｍ、　Ｊ　０ｂｓｔｅｔ、　 Ｇ　ｎｅｃｏｌ、　１＋４　：９７９−９８９　（１９７２）　）およびＣ０Ｌ Ｏ３１６（Ｗｏｏｄｓ　らＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３９　：４４４９−４４５ ９　（１９７９）は５パーセント仔ウシ血清、グルタミン、および１パーセント フアンギーバクト（Ｆｕｎｇｉ−ｂａｃｔ）（カリフォルニア州すンタ・アナ、 アーヴイン・サイエンティフィック社）で補完したＲＰＭＩメディア１６４０内 で培養された。ＲＮＡを作成するためにこれらの細胞を用いた場合、１ｉ１あた り５−８ＸＩＯ°個の細胞程度の密度での指数関数的成長の最中に収穫された（ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　ＭａｃＬｅｏｄ　ＥＭＢＯＪＬ７：ｌ○ｌ−１０ ９（＋９８８）　）　、　ＢＡＬＢ／Ｃマウスから取り出された膵臓リンパ腫は ３×１０“細胞／１１１の密度でシードされ、ＲＮＡを収穫する前の２日間、ｌ ｏｕｇ／ｚｉ　ＣｏｎＡで刺激が与えられた。

Ｂ、ＳＬ＋２．４細、と　１上皮里　の共著養５Ｌ１２．４と胸腺上皮単１の共 培養の条件。簡単に説明すると、５Ｌ１２．４細胞が、３日間の共培養期間後の 最終的な濃度がｌＸ１Ｏ’細胞／ｍｌとなるような密５度でシードされた。置あ るいはＴ　Ｅ　Ｐ　Ｉは３８百までには融合状態にあった。これらの細胞は１０ パーセント拍仔性ウシ血清を含み、グルタミン〜　とペニシリン／ストレプトマ イシンで補完したダルベツコの修正イーグルス・メディアム内で３７℃の温度下 で培養された。

Ｃ，２０２表　のための　株 ２０．２表現研究では、以下の供給源からの細胞株が用いられた。胎仔性悪性腫 瘍Ｆ９およびＰＣＣ４（Ｂｅｒｎｓｔｉｎｅら（１９７３）シ！ムゴ蝕月、」二 足、玉配工里努よ７０　：　３８９９−３９０３）、粘液分泌性腫瘍（ｐｉｔｕ ｉｔａｒｙ　Ｔｕｍｏｒ）　ＡＴｔ２０　（Ｂｕｏｎａｓｓｉｓｉら（１９６２ ）均■旦、」呈り４−酎」亘、Ｊ立ムー里μ工４８　：　１１８４−１１９２） 　、胸腺上皮ＴＥＰＩ　（Ｂｅａｒｄｓｌｅｙら（１９８３）　Ｐｒｏｃ　Ｎａ ｔＬ　Ａｃａｄ、旦ｃｉ工びＭＥＦはＦｒｅｓｈｎｅｙ　（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（ １９８３）　Ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｏｆ　ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ、　Ａｌａｎ 　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、　ｐ９９−１１０）によって調製された。Ｂ−細胞 ハイブリド−？ＰＳ、Ｇ８、Ｂ／Ｔ−リンパ腫ＷＥＨＩ−２１、マクロファージ Ｐ３８ＳＤＩ、ｙ４腺上皮置、バッフイルＲＢＬ−１、Ｔ−細胞ハイフリトーマ ２Ｈ１Ｏｖ、神経芽Ｎ４ＴＧＩ、ｔｍｍＳ！９４１５、Ｔ−リンパ腫：　５Ｌ１ ２，３．　Ｒ５４，２，５ＡＫ８　、　ＢＷ５１４７゜ＡＫＲｌ　、　ＥＬ−４ 、体細胞ハイブリッド５Ｌ１２．３　ｘ　５Ｌ１２，４、およびＴ−細胞ハイブ リドーマＢＯ−４Ｈ，Ｈ９，１，これらの細胞は１０パーセント胎仔性ウシ血清 、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンで補完したダルベツコの修 正イーグルス・メディアム内で培養された。ＲＮＡを作成するために用いられた 細胞は１ｍｌあたり５−８Ｘ１０’細胞を含む培養−基から指数関数的増殖中に 収穫された。ＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた膵臓りンパ腫は上と同様に補強さ れたＲＰＭＪ内で３×！０°細胞／ｍｌの密度でシードされ、ＲＮＡを収穫する 前に６゜２４、４８あるいは７２時間、ｌｏｕｇ／ｍｌ　ＣｏｎＡを用いて刺激 が与えられた。

１１■１ クローニングおよびスクリーニングの　法二本領（ｄｓ）　ｃＤＮＡ　（Ｇｕｂ ｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ　（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２５　：２６３− ２６９）を作成するために５Ｌ１２．４細胞からのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡが鋳型 として用いられた。ＥｃｏＲＩリンカ−が予めメチル化されたｄｓ　ＤＮＡに加 えられた。脱リン酸化されたラムダｇｔｌ。

アーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）がｃＤＮＡに結合され、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ社の指示に従い、同社のパッケージング抽出液を用いてラムダ・ファージにパ ッケージ化した（Ｈｕｙｎｈらｉｎ　Ｄ、　Ｇｌｏｖｅｒ　（ｅｄ、）（１９８ ４）　ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃ ａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ。

ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｕ、に、）。

サブストラクション・ハイブリダイゼーションは基本的にはＨｅｄｒｉｃｋらが 　１９８４　Ｎａｔｕｒｅ　３０８　：　１４９−１５３でおよびＴｉｍｂｅｒ ｌａｋｅが（１９８０）　Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、　７８　：４９７−５０３で述べ たような方法で行われた。一本領ｃＤＮＡはｌｏＯｕｇ／ｍｌのアクチノマイシ ンＤの存在下で２５０ｍＣの°’　Ｐ　ｄＣＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用 いてｌ０ｍｇのポリ（Ａ）＋　５ＬＩ２４　ＲＮＡから作成され、６８℃の温度 下、８ｍｌ容量の５Ｌ１２．３細胞から得た２５ｍｇポリ（Ａ）”　ＲＮＡを用 いて１２６０（１リツトルあたり１ｍｏｌあたりのヌグレオチドｘ秒）の割合で １８時間をかけてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ヒドロキシ アパタイト・カラムを通じてグロマトグラフィーにより、ｓｓ　ｃＤＮＡが回収 された。スタート時の５Ｌ１２．４ｃＤＮＡ　１　ｕｇから１２０ｎｇ　（３Ｘ ＩＯ’ｃｐｍを含んでいる投入ｃＤＮＡの１２パーセント）程度が得られ、フィ ルター１個あたり２０．０００ラムダｇｔｌｏプラークを含んでいる２つの１５ ０鵬ニトロセルロース・フィルターをプローブするために用いられた。ＳＬ＋２ ，４ラムダｇｔｌｏライブラリーから入手した２つの同じフィルター・リフトの うちの最初のものは５ＬＩ２．３　ｍＲＮＡからの総ｃＤＮＡを用いてプローブ され、第二のフィルター・リフトは上に述べたように作成された５Ｌ１２．４サ ブストラクション強化ｃＤＮＡを用いてプローブされた。用いられた基本方針は Ｆｉｌｍｕｓらが用いたものと類似していた。２回のスクリーニング（別個に作 成されたサブトラクト・プローブを使用）によって、プラーク精製ラムダ・ファ ージ・クローンが５Ｌ１２．４固有のものと確認された。その後、そのクローン が５Ｌ１２．４細胞からのｍＲＮＡだけにハイブリダイズし、５Ｌ１２．３細胞 からのｍＲＮＡにはハイブリダイズしなかったことを確認するために、ノーザン 分析が行われた。ｃＤＮＡインサートが制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩ ｒによる消化によってラムダＤＮＡから取り除かれ、低融点アガロース（Ｓｅａ 　Ｋｅｍ社）内で分離され、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩによって消化され たプラスミド・ベクターｐＴ７／Ｔ３　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にサブクローンされた。分離株のすべてにおいてＥｃｏ Ｒｒが破壊されたので、ＥｃｏＲＩを有するファージからインサートを回収する ことはできなかった（Ｋｕｚｉｅｌ　ら（１９８７）樽旦且」旦届、ユ蛭よ１５ 　＋　３１８１）。

１里■ユ ノーザン・プロット グアジニン・イソチアネート法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら（１９３３）Ｉｎ　Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、 　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：ただし、Ｗ ｉｌｋｉｎｓｏｎら（１９８８）　ＥＭＢＯＪ、７　：　１０１−１０９に記載 のように修正）によって、細胞株および組織から総細胞性ＲＮＡが分離された。

アクリジン・オレンジ染色法（Ｍａｎｉａｔｉｓら（＋９８３）　Ｉｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　ＭａｎｕａｌＣｏ ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ、　ＮｅｗＹｏｒｋ）およびアクチン、 ＣＨＯ−Ａおよび／またはサイクロフィリンｃＤＮＡによるハイブリダイゼーシ ョンにより、ル−ンあたりＲＮＡが等しく負荷、伝達されていることが確認され た。

組織から得た細胞に関しては、塩化セシウム内での遠心分離後に得られたＲＮＡ ベレットがｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８）　、　０．５パーセントＳＤＳ、Ｓ ｍＭＥＤＴＡ内に再懸濁され、次いで、フェノール：クロロフォルム：イソ−ア ミル・アルコール（２４：２４：１）による２回の抽出と、クロロフォルム：２ −ブタノール：イソ−アミルアルコール（２０：５：１）による２回の抽出が行 われた。　ＲＮＡプロットに関しては、ＬｏｎｇのＲＮＡが１パーセント・アガ ロース−ホルムアルデヒド・ゲル内で電気泳動され、ニドラン・メンプレイン（ Ｍａｎｉａｔｉｓら１９８２）に伝達された。

−二のノーザン・プロットは１０パーセント・デキストラン・サルフェートおよ び５０パーセント・ホルムアミドの存在下、４２℃の温度下で１２−１８時間、 ランダム・オリゴマー・プライムした″′Ｐ−ラベルｃＤＮＡインサートを用い てハイブリダイズされた（ＭｅｉｎＫｏｔｈおよびＷａｈｌ　＋９８４）　、ラ ベルされたプローブを取り除くために、ＲＮＡプロットが９０℃の温度下で０． Ｉ　Ｘ　５ＳＰＥおよび０．１パーセントＳＤＳを用いて洗浄され（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ　ら（１９８２）　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮｅｌｇＹｏｒｋ）　、室温まで 冷却されるまで放置され、再びハイブリダイズされるまで真空下で放置された。

ＲＮＡのサイズはＢＲＬ　ＲＮＡ高および低分子量階梯による比較によって調べ られた。

１１■土 サザーン・プロット 総細胞性ＤＮＡが細胞、Ｔ−リンパ腫およびマウス−ハムスタ一体細胞ハイブリ ッドから分離され、他の種からの組織は制限酵素Ｅｃｏ　Ｒ，１，によって消化 された。消化ＤＮＡの２０マイクロ・ダラムが０．７バーセント・アガロース・ ゲルの各レーンに与えられ、基本的には（ＭｅｉｎｋｏｕｈおよびＷａｈｌ　（ １９８４）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３　：　２６７−２８４）に述べら れている方法でニドラン・サポート上にプロットされ、ノーザン・プロット分析 を行うために上記資料に述べられているようにハイブリダイズされ、洗浄された 。

−８２０２サザーン・プロット ２０．２のサザーン・プロット分析は、以下に述べる点を除いては、上に述べた ように行われた。

ＳＬ＋２．４細胞、マウスおよびハムスター肝臓と、体細胞ハイブリッドから分 離された。ヒヨコおよびヒト肝臓からのＤＮＡはＣｌｏｎｅｔｅｃ社（カリフォ ルニア州パロ・アルド）から購入した。このＤＮＡは供給会社の設定した条件に 従って、例に記載されている制限酵素により消化された。消化されたＤＮＡＩＯ ｕｇを０．８パーセント・アガロース・ゲルの各レーンに投入し、酢酸Ｔｒｉｓ 緩衝液内で最低４８時間電気泳動され、ニドラン・サポート上にプロットされ、 プレイン・プロット分析に関して記載されている方法でハイブリダイズされ、洗 浄された。他の種からのＤＮＡを含んだプロットは程度の厳格さで洗浄され、最 終的な洗浄は室温で２ｘＳＳＰＥを用いて実施された。

総細胞性ＤＮＡは記載（ＭＢｌｉａｔｉｓら１９８２）の通りに分離され、制＠ 酵素Ｅｃｏ　Ｒ，Ｉ、によって消化された。消化されたＤＮＡの２０マイクログ ラムが０．７パーセント・アガロース・ゲルの各レーンに投入され、酢酸Ｔｒｉ ｓ緩衝液内で電気泳動され、基本的には記載（Ｍａｎｉａｔｉｓら１９８２）通 りの方法でニドラン・メンプレイン上にプロットされ、プレイン・プロットに間 して記載の通りに洗浄された。

遺ｍ 以恍μノリと拡 制限エンドヌクレアーゼ・マツプがＰｅｍ　ｃＤＮＡクローンから判定され、断 片がｐＴ７Ｔ３にサブクローンされた：このプラスミドは塩化セシウム勾配上で 精製され、シーケナーゼ（Ｓｅｑｕ６ｎａｓｅ）試薬（Ｕ、　Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａ１社、オハイオ州クリープランド）を用いての二本鎖ジデオキシ・シー ケンシングによって直接配列決定された。この配列の一部はホスト・プラスミド に対するプライマーを用いて判定され、ｃＤＮＡに対しては他の特殊なオリゴヌ クレオチド・プライマー（１７マー）がＵＣＳＤガン・センター・コア分子生物 学施設（ＵＣ５Ｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ　ＣｏｒｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ）内で作成された。両方のＤＮＡ鎖はその 全体性において配列決定され、すべての配列は同じ条件で実施された少なくとも ２回の反応で判定された。重複配列情報を集め、ＤＮＡ配列の最初の分析を行う ためにミクロジエニア（Ｍｉｃｒｏｇｅｎｉａ）およびインテリジェネティック ス（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ）社のコンピュータ・プログラムが用いら れた。予言された蛋白質の属性はインテリジェネティックス社からのプロサイト ・プログラムを用いて評価が行われた。

１呈五ｌ ＰｅｍのｃＤＮＡ゛よび　−白 Ｐｅｗ遺伝子によりコード表現される蛋白質のｃＤＮＡおよび蛋白質配列を決定 するために、分化および／または組織異常増殖に関与する遺伝子に対応する新し いｃＤＮＡがめられた。そ、の目的のために、成熟度および腫瘍形成属性が異な っている２つの密接に関連したＴ−リンパ腫細胞クローンである５Ｌ１２．４お よび５Ｌ１２．３　（ＭａｃＬｅｏｄ　ら（１９８４）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ 、　４４　：１７８４−１７９０）が選ばれた。１０の細胞表面抗原および１２ の特殊なｍＲＮＡを分析する前提で、これらの細胞クローンはＴ−細胞発達の異 なった段階、あるいは直線配列を示している（ＭａｃＬｅｏｄら（１９８４）　 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４４　：　１７８４−１７９０　；　ＭａｃＬｅｏｄ ら（１９８５）Ｊ　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　７４　：８７５− ８８２　；ＭａｃＬｅｏｄら（１９８６）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　Ｓ ｃｉ　ＵＳＡ　８３：６９８９−６９９３；Ｈａｙｓら（１９８６）　Ｉｎｔ　 Ｊ二Ｃａｎｃｅｒ　３８　：　５９７−６０１　；　ＭａｃＬｅｏｄら（１９９ ０）Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔ、ｈ　Ｄｉｆｆｅｒ、１　：　２７＋−２７９）　。

ひとつのｃＤＮＡクローン、２０．２は胎盤および胚内で表現されるトランスク リプトを識別し、Ｐｅｎと命名されている。

このｃＤＮＡ配列は長さが８３８ｂｐで、ｂｐ９１から７２０まで延びているひ とつの長いオープン解読フレームを含んでおり、２１０のアミノ酸を含んでいる 蛋白質を予言する（図１）。図の右側の数字はヌクレオチド配列を示している。

左側の数字は予言されたアミノ酸位置を示している。配列内に存在する最初のメ チオニンに下線を付しである。ポリアデニル化信号配列ＡＡＴＡＡＡにも下線が 付しである。ＤＮＡ配列の３′端末の（Ｘ）はポリ（Ａ）テイルの１４アデニレ ート残基のストリングを示している。ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ−依存キナーゼ（ＡＧ ）、蛋白質キナーゼＣ（ｃ）、およびカゼイン・キナーゼＩＩ　（ＣＫ）に関し てリン酸化可能部位は、それらキナーゼ類のそれぞれに関するＳｅｒあるいはＴ ｈｒを、取り巻く適切なコンセンサス配列を識別するインテリジェネテイックス 社のプログラムを用いて識別された。コンセンサス・ポリアデニル化配列Ａ、Ａ ＴＡＡＡはボｌバＡ）トラクトの５０ｂｐ５′の位置にあることが確認された。

第一のメチオニン・コードン（５′端末から９１ｂｐ）は効率的な翻訳スタート 部位を提供するＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｇ／ＡｘＸＡＴＧＧ）によって取 り囲まれている（Ｋｏｚａｋ　（＋９８６）皿４４　＋　２８３−２９２）　。

Ｔ　７ポリメラーゼを用いて作成され、網状赤血球溶解物内で翻訳されたＰｅｎ センス・トランスクリプトは予言された分子量の蛋白質分子をつくりだす（２３ Ｋｄａ、データなし）。したがって、第一のメチオニンはイン・ビトロ転写−翻 訳実験における翻訳開始部位としての役割を果す。Ｐｅｍ　ｃＤＮＡクローンの 長さく８３８ｂｐ、ポリ（Ａ）テイルを除く）はそのポリ（Ａ）テイルが取り除 ぞかれたＰｅｍ　トランスグリブト（０，９ｋｂ）のサイズと類似している（デ ータなし）、シたがって、このＰｅｍ　ｃＤＮＡがほとんど全長である可能性が ある。

このＰｅｍ蛋白質は親水性で、リーダー配列を含んでおらず、また、Ｎ−結合グ リコシル化部位および膜を越えて広がっている可能性のある領域も含んでいない 。したがって、Ｐｅｍは細胞膜内に分泌されたり挿入されたりする可能性はない が、細胞内蛋白質としての属性は有している。予言されたＰｅｍ蛋白質は図１に 示されているように、蛋白質キナーゼＣ、カゼイン・キナーゼおよびＣＡＭＰ／ ＣＧＭＰ−依存キナーゼによるＳｅｒおよびＴｈｒのリン酸化のコンセンサス配 列を含んでいる。遺伝−子バンクおよびスイス蛋白質データベースでのＤＮＡお よび予言アミノ酸配列に間する調査では他の知られている遺伝子や遺伝子生成物 に対する類似性は認められなかったので、Ｐｅｍは新しい遺伝子を示している。

スｌ五工 Ｐｅｍトランスクリプトの 不死化され形質変換された細胞株におけるＰＣＩＩ！トランスクリプトの表現を 確かめるために、Ｐｅｍトランスクリプトを表現する組織および細胞タイプを確 認する目的で、ノーザン分析が行われた。Ｐｅｆｆ１トランスクリプトはＴ−リ ンパ腫細胞株においては豊富であるが、それらは成熟した個体の胸腺、休止ある いは活性化膵臓リンパ腫、腸関連リンパ球組織、あるいは骨髄などでは検出でき ず、成熟した個体の脳、肝臓、大腸、そして卵巣でも検出されない。さらに、Ｐ ｅｍ　トランスクリプトは膵臓、心臓、肺、胃、腎臓あるいは胎盤では見いださ れなかった。

Ｐｅｗ　ｃＤＮＡクローンは形質変換された細胞株（ＳＬ１２．４）からは分離 されたので、Ｐｅｍ遺伝子表現は他の不死化され、形質変換された株で評価が行 われたＣ図２）、、すべての株でＰｅｎｍＲＮＡ表現を得る目的で、以下のマウ ス細胞株でＰｅｍ　ｍＲＮＡの表現を評価するために′ＰでラベルしたＰｅｍイ ンサートを用いてノーザン・プロットがプローブされた：Ｆ９．ＰＣＣ４（胎仔 性悪性腫瘍）　；　ＡＴｔ２０　（胎盤）　；ＴＥＰＩ　（胸腺上皮）；悶Ｅ（ 乳房上皮）；３Ｔ３（不死化線維芽細胞）；ＭＥＦ（正常なマウス胎仔線維芽細 胞）　；５Ｌ１２．４　（Ｔ−リンパ腫）　；ＰＳ、Ｇ８　（Ｂ細胞ハイブリド ーマ）　；ＷＥＨＴ−２１（Ｂ／Ｔ−リンパ腫）　、Ｐ３８８Ｄｌ（マクロファ ージ）、置（胸腺上皮）　、ＲＢＬ−１（好塩基球）　、２ＨＩＯ（Ｔ−細胞ハ イブリドーマ）　；　Ｎ４ＴＧ１　（神経芽）；５１９４１５　（骨髄種）；　 ５Ｌ１２．３．　Ｒ５４，２，５ＡＫ８　、　ＢＷ５１４．　、　ＡＫＲｌ、Ｅ Ｌ−４（Ｔ−リンパ腫）　；５Ｌ１２．３ｘＳＬＩ２，４　（体細胞ハイブリッ ド）；およびＢＯ−４）１．Ｈ，９，１（Ｔ−細胞ハイブリドーマ）。

すべてのレーンでのＲＮＡの同様の負荷および伝達に関しては、＋８ｓおよび２ ８　Ｓ　ｒＲＮＡのアクリジン・オレンジ染色法と、そのプロットのほとんどの マウス細胞系で類似のレベルで存在しているトランスクリプトを認識する１１Ｐ ラベル・サイクロフィリン（Ｃｙ）プローブ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ら（１９８ ９）　Ｎａｔｕｒｅ　３３７　：４７３−４７５　）によるハイブリダイゼーシ ョンによって評価が行われた。

複数の能力を有する（ｐｌｕｒｉｐｏ℃ｅｎｔ）幹細胞の特性を有する２つの悪 性腫瘍細胞株（Ｆ９およびＰＣＯ２）はＰｅｍ遺伝子を表現するが、その量は明 確に異なっている。不死化された３Ｔ３線維芽はＰｅａを豊富に表現するが、正 常の胎仔性線維芽は少なくとも３０分の１以下のＰｅｍ　ｍＲＮＡを表現する。

　Ｐｅｍは神経、胎盤、マクロファージ、および乳房上皮などからのすべての細 胞株で表現される。対照的に、Ｐｅｍトランスクリプトは胸腺上皮細胞株とテス ト対象となったほとんどのＢ−およびＴ−細胞腫瘍およびハイブリドーマ細胞株 では基本的に検出不可能であるが、ひとつの８細胞ハイブリドーマ（ＰＳ、Ｇ８ ）と２つの細胞株（ＥＬ　４および５Ｌ１２．４）はＰｅｍトランスクリプトを 表現する（図２）、［Ｊ２はＩ、　Ｉ−ｋｂ　トランスクリプトが最も顕著なト ランスクリプトであることを示しているが、いくつかの細胞は追加３−ｋｂ　ｍ ＲＮＡを表現する。１．１および３−ｋｂ　トランスクリプトはポリ（Ａ）指定 ＲＮＡで強化され、５Ｌ１２．４細胞の細胞質対応部位内に存在している。

Ｐｅｍ遺伝子表現の直線配列上の特殊性については明確なパターンが認められず 、細胞株内でのｍＲＮＡの量に大きな偏差があるので、これらの遺伝子がランダ ムにイン・ビボでか、あるいはイン・ビトロ培養後のいずれかにランダムに失わ れたり、不活性化されたり、位置が変えられたりした可能性もある。これまでに 行われたサザーン分析では、Ｐｅｎ遺伝子が５Ｌ１２．３　（Ｐｅｎ−）および ５Ｌ１２．４　（Ｐｅｍ”）細胞の間で帯域強度あるいはサイズにおいて検出可 能なレベルの差を示さないこと、そして他の（Ｐｅｍ−）　Ｔ−リンパ腫細胞株 であるＳＡＫ　８においても同様であることが示されている（ＭａｃＬｅｏｄら （＋９９０）　ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ、１　：２７１−２７９） 　、大量のＰｅｎ　ｍＲＮＡを表現する細胞株のいくつかについて、ＤＮＡに関 するテストがかなりテストされてきているが（ＳＬ１２，４．　Ａ丁し２０．　 Ｆ　９　、　ＭＭＥ。

Ｎ４ＴＧＩ、および）”Ｌ４）、帯域強度（コピー数）やサイズにおける差は認 められなかった。したがって、これらの細胞株におけるＰＥＭ　ｍＲＮＡ蓄積に おける差に遺伝子消去、大幅な遺伝子配列変更、あるいは遺伝子増幅が関与して いる可能性はなさそうである。

ス」ｌ引ｌ ゛にお（るＰｅｍ　ｉ伝 Ｐｅｍ　トランスクリプトは形質変換され不死化された細胞株および胎仔性悪性 腫瘍幹細胞には存在しているが、成熟した個体の組織には存在していないので（ Ｒｕｄｄｏｎ　（１９８７）　ＧｅｎｅＤｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌｏ　０ｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ４３１−４３６）　、　Ｐｅｍ遺伝子表 視のパターンはオンコツニータル遺伝子と類似している。Ｐｅ１Ｑがこのクラス の遺伝子に属していることをさらに確かめるために、マウスの発達のい（つかの 段階で、胎仔および胎仔外組織の両方でトランスクリプト・レベルが評価された 。ＲＮＡは図３に示されている妊娠時期に、胎仔、胎盤、および卵黄嚢から取り 出された。図３はＰｅｍトランスクリプトが胎仔発達の６日目の段階で早くも検 出可能であることを示している。妊娠６日目の胎仔は胎仔外組織を含んでいる。

Ｐ６ｍ　ｍＲＮＡは７日目あるいは８日目から豊富になるが、９日日以後、かす かな信号は認められるものの、表現は急激に減少する（図３）。対照的に、Ｐｅ ｍトランスクリプトは妊Ｆｉ７日日あるいは８日目の胎盤および卵黄嚢ではほと んど検出できないが、９日目にはかなりのレベルに増大し、その後のすべての段 階でも増大する。妊娠ＩＯ０日目よび１８８日目胎仔、胎盤および卵黄嚢（図示 されず）は妊娠１２日日日１６日目の時点のＰｅｍ　ｍＲＮＡ表現と類似のパタ ーンを保有していた。これらのプロットは図２に示されるようにプローブされた 。胎仔および胎仔外組織内−のＰｅｍ遺伝子表現パターンはふたつの重要な結論 を導く。（１）ＰｅｍｍＲＮＡは胎仔において短い期間（７あるいは８日間）だ け高いレベルで蓄積されるが、後の段階でも特定の胎仔性直線配列に残る場合も ある；（２）胎仔のＰｅｗ　ｍＲＮＡの表現は胎仔外組織において観察されるも のと相補的である。

叉ｌ琺工 Ｐｅｗ　ｌオンコツニータル伝　・　るＰｅｎは胎仔形成の過程で発達段階固有 の形態で表現され、また多様な不死化され、形質変換された細胞株において表現 される６テスト対象となったいずれの成熟個体においても検出できるレベルには 表現されなかった。これらの異常な表現特性はオンコツニータル遺伝子に予想さ れるものであるから（Ｒｕｄｄｏｎ　（１９８７）　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｐｒｅｓｓ ｉｏｎ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ、　Ｃａｎｃｅｒ％０ｘｆｏｒｄ　Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ４３１−４３６） 　、　Ｐｅｎは不死化細胞および／または初期のマウス発達に関与している細胞 の有益な標識である可能性がある。それらが胎盤および卵黄嚢の中で豊富になる のと同じ時期である妊娠９日目の胎仔で急激に減少するという観察結果は、Ｐｅ ｍ十細胞が胎仔から胎仔外の対応部分に移動する可能性を示唆している。（細胞 内物質から得た）胎仔外中胚葉からの細胞は胎盤および卵黄嚢細胞を発生させる ので、したがって、そうした移行細胞に期待される特性を有しているのである。

Ｐｅｎ遺伝子は胎仔発達過程で具体的に表現されるが、それが成熟した個体でも 一定の役割を果している可能性も完全には排除できない。

ｌ　Ｐｅｍ遺伝子は成熟した個体の組織に存在している数値的には稀で、一過性 のプロジェニター細胞によって表現される可能性もある。成熟した個体と胎仔の 両方のプロジェニター細胞は形質変換／不死化プロセスの対象であると考えられ るから（Ｐｉｅｒｃｅ　ａｎｄ　５ｐｅｅｒｓ　（１９８８）　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ　４８　：　１９９６−２００４）　、　ＰｅｍｍＲＮＡが多数の不死化 され、形質変換された細胞株により表現されるという観察結果はこうした考え方 と一致している。不死化細胞でのＰｅｍの過剰表現あるいは構成的表現は、それ によって、細胞の継続的増殖に貢献している可能性もある。

Ｐｅｗの過剰表現あるいは構成的表現によって誘発される異常な増殖を防止、あ るいはコントロールするために、その遺伝子の機能、あるいは機能的遺伝子生成 物の機能を抑制するために均質遺伝子組み替え遺伝子療法あるいは標的とされる 遺伝子の不活性化技術を用いることが可能であるかもしれない。こうした目的の ために、Ｐｅｎ遺伝子のゲノム性クローンが用いられる。Ｐｅｍ遺伝子はその遺 伝子内の、該遺伝子が機能的標識あるいは機能的標識の表現に関する能力をコー ド表現する力を不活性化する部位に選択的標識を挿入することで不活性化される 。突然変異した遺伝子は、次にエレクトロポレーション　ｅｌｅｃｔｒｏ　ｏｒ ａｔｉｏｎ　あるいはマイクロインジェクションによって胎仔の幹細胞あるいは その確立された細胞株に移される。その選択的標識が適切に組み込まれている細 胞は選択され、個体の線維芽に移される。そのように伝達されたＰｅｍ遺伝子の 対立遺伝子の片方あるいは両方で構成される個体を選択することも可能である。

本発明が上に述べたようなその目的を実施し、課題および利点、さらにはそれに 本質的に付随する課題や利点を達成できることは当業者には明らかであろう。こ こに述べられている構成成分、方法、手順および手法は現在の段階で好ましい実 施例を代表するものであり、具体例として示されているのであって、本発明の範 囲を限定するためのものではない。本発明の精神および以下の特許請求の範囲内 で、一定の変更や他の使用法が可能であることは、当業者には明らかであろう。

以下余白 −（１）　一般的情報 （ｉ）　出願者：　Ｃａｒｏｌ　ＭａｃＬｅｏｄ（ｕ）　発明の名称：　新しい オンコツニータル遺伝子、遺伝子生成物、およびその利用法 （ｉｉｉ）　配列数：１ （１■）　通信用住所： （Ａ）　あて先：　Ｊａｍｅｓ　Ｆ、　Ｗｅｉｌｅｒ（Ｂ）　街路：　Ｏｎｅ　 Ｒｉｖｒｗａｙ、　５ｕｉｔｅ　１５６０（Ｃ）　都市：　）Ｉｏｕｓｔｏｎ （Ｄ）　州：　Ｔｅｘａｓ （Ｅ）　国：米国 （Ｆ）　郵便番号：　７７０５６ （Ｖ）　コンピュータ読み出し可能形式％式％ （Ｂ）　コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣ／Ａ丁（Ｃ）　オペレーティング・シス テム：　ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）　ソフトウェア；　ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ（Ｖｌ ）　本出願日 （Ａ）　出願番号 （Ｂ）　出願日 （Ｃ）　分類 （〜１１）　先行出願日 （、Ａ）　出願番号：　０７１５９０，８９４（Ｂ）　出願日・１９９０年１０ 月１日（ｖｉ）　弁理ｉ−／代理（Ｉ：間″ｆる情報：（Ａゝ　氏名：　、’３ ）＋ｅＳ　Ｆ、　ｆｅｅｌ　’ＬｅｒＬ　Ｂ　′　登録番号　：ミ９Ｓ４０ 、Ｃ）　参照　事・＝整理番号：　Ｄ−５２３７（、Ｘ）　通信、こ　￥′ｔ　 シ　情報、Ａゝ　電話：　、Ｔ：３”５２１−６４０９Ｖ３１　−ヤ・・・“ス ：　（７１３）６２２−１９８１ｆｃ）　テ、ヅクス： （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋　１　：に関する情報（ｉ）　配列特性・ （Ａ）　長さ＝８３８ （Ｂ）　タイプ：核酸 （Ｃ）ｇ特性二二重 （Ｄ）　トポロジー二線状 （Ｌｉ）　分子タイプ：　ｃＤＮＡ−ｚＲＮＡ（■）　オリジナル・ソールニ （Ａ）　生物：マウス （Ｂ）　系統：　ＡＫＲＩ　Ｊａｃｋｏｓｏｎ（Ｃ）　個別分離株：５ＬＩ２細 胞株 （Ｄ）　発達段階：骨髄−成熟した個体（Ｅ）　ハブロタイブ： （Ｆ）　組織タイプ：リンパ腫 （Ｇ）　細胞タイプ二Ｔ−細胞 （Ｈ）　細胞株：　ＳＬ；２，４クコーン（１）　小器官： （Ａ）　図書館：　ｇｇｔｌ。

（Ｂ）　クローン、２Ｑ、： （ｘ）　出版情報 （Ａ）　著者：Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ。

（Ｂ）　タイトル （Ｃ）　雑誌：　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｄ）　ボリュ ーム：１４１ （Ｅ）　版：：２ （Ｆ）　ベージ：４５１−４５５ （Ｇ）　日付： （Ｈ）　資料番号： （Ｉ）　出願臼： （Ｊ）　出版日：　１９９０年１０月１日（Ｋ）　関連情報： （ｘｉ）　配列説明：ＳＥＱ　ｒＤＮｏ：　１　：−ＴＧＡＴＴＴＧＡＴＣＡＣ ＡＴＡＴＧＣＣＧ　ＧＣＴＡＴＧＡＣＡＧ　ＣＣＣＴＴＡＣＴＴＴ　７６０ＴＣ ＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＧ　ＡＧＧＴＧＧＡＴＴＣＣＣＡＧＴＡＴ ＧＴＴ　８００ＴＧＴＴＣＣＡＴＴＡ　ＣＣＴＣＴＡＴＧＡＴ　ＴＡＴＴＡＡＡ ＡＴＡ　ＴＴＧＡＴＡＣＡ　Ｘ　８３８以下余白 ２０．２　（ＰＥＭ）　ｃＤＮＡ ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＡＡＣＡＧＣＣＡＴ　ＣＴＣＣＣＴ　ＧＣＡ　ＣＡＧ 　ＴＣＣＴＴＣＡＡＧ　ＣＴＣ４２１Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ 　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｔｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ ＧＡＴ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＴＴＣＴＴＣＣＡＧ　ＧＣ Ｔ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＡＧＡ　２１０５７　ＡＳＤ　Ｖａｌ　ＬＹＳ　 Ａｌａ　ＧＩＵ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　ＧＩＹ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｙ　Ａｒ（ＩＧＡＴ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＧＧＣ ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　２５２７１　Ａｓ ｐ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ＶａｌＡＡＧ　ＧＡＴ　ＡＧＴ　ＧＧＣＡＣＣＡ ＧＧ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　にＡＡ　ＣＡＡ　３ ７８１１３　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒ９　Ａｌａ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ＧｉｎＡＡＴ　ＧＡＧ　ＣＣＡ 　Ｇｎ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＧＣＡＣＴ　ＧＡＧ　ＡＧＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＡＡ Ｔ　ＧＧＡ　４２０１２７　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＧｌｙＡＡＴ　 ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＣＣＴＣＣＡＧＧ　ＧＣ Ｔ　ＣＴＡ　ＧＧＴ　ＴＣＧ　４６２１４１　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇａｙ　Ｇｌｙ 　Ａｒｑ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｑ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇａｙ 　５ｅｒＣｎ　ＴＴＣＡＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＡＧ Ｇ　ＴＧＧ　Ａｎ　ＣＣＣＡＧＴ　ＡＴＧ　７９８ＴＴＴ　ＧＴＴ　ＣＣＡ　Ｔ ｒＡ　ＣＣＴ　ＣＴ７１’　Ｔｌ　’口′Ａ汀Ａ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＴＧＡ　Ｔ ＡＣＡ（ｘ）　８句０ＦＩＧ、　ＩＢ ＩＧ　２ 国際ｖ４斎報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｐｅｍ遺伝子によりコード表現されるＰｅｍ蛋白質のアミノ酸配列で構成さ れる遺伝子組み替えポリペプチド。
2. ２．実質的に純粋な形態の、特許請求の範囲第１項のポリペプチド。
3. ３．該Ｐｅｍ蛋白質がＴ−リンパ腫細胞のＤＮＡによりコード表現される、特許 請求の範囲第１または２項のポリペプチド。
4. ４．該アミノ酸配列が図１に示される核酸配列によりコード表現される、特許請 求の範囲第１項のポリペプチド。
5. ５．図１に示されるヌクレオチド配列で構成されるｃＤＮＡプローブ。
6. ６．ハイブリダイジング条件下で、標的細胞群による特許請求の範囲第５項のプ ローブの培養ステップで構成される腫瘍性細胞を検出するための方法。
7. ７．不活性化変異体Ｐｅｍ遺伝子を腫瘍性細胞内に挿入するステップで構成され る、腫瘍性細胞を処理するための方法。
8. ８．特許請求の範囲第５項のｃＤＮＡ配列のアミノ酸配列により構成されるポリ ペプチド。
9. ９．実質的に純粋な形態の特許請求の範囲第８項のポリペプチド。
10. １０．Ｐｅｍ蛋白質に関するコード表現を行うＤＮＡ配列で構成される表現伝播 体。
11. １１．該表現伝播体が、操作可能な直線配列で、ａ）複製のオリジン ｂ）プロモーター ｃ）Ｐｅｍ蛋白質をコード表現するＤＮＡ配列で構成される宿主内で複製を行う ことができるプラスミドである、特許請求の範囲第１０項の表現伝播体。
12. １２．該表現伝播体が、操作可能な直線配列で、ａ）複製の原核生物オリジン ｂ）原核生物プロモーター 。）Ｐｅｍ蛋白質をコード表現するＤＭ配列で構成される原核生物宿主において 複製を行うことができるファージあるいはプラスミド。
13. １３．該伝播体がｐＭＳｎｅｏ，ｐＮＥＯ／Ｔｆｒ−ＮＣおよびｐＭＡＭ／ｎｅ ｏ／Ｔｆｒ−ＮＣで構成されるグループから選択される特許請求の範囲第１１項 の表現伝播体。
14. １４．Ｐｅｍ蛋白質をコード表現するＤＮＡ配列で構成されるベクター。
15. １５．該ベクターがプラスミド、ファージおよびコスミドで構成されるグループ から分離される、特許請求の範囲第１４項のベクター。
16. １６．該ベクターがＡＴＣＣアクセス番号Ｎｏ．６８３０４を有する特許請求の 範囲第１５項のベクター。
17. １７．遺伝子組み替えＤＮＡ分子で形質変換され、該遺伝子組み替えＤＮＡ分子 がＰｅｍ蛋白質をコード表現するＤＭ配列で構成される宿主。
18. １８．大開菌である特許請求の範囲第１７項の宿主。
19. １９．ａ）Ｔ−細胞蛋白質をコード表現するＤＮＡ配列で宿主を形質変換し、 ｂ）該ＤＮＡ配列を表現し、そして ｃ）該Ｐｅｍ蛋白質を回収する 諸ステップで構成されるＰｅｍ蛋白質を生産するための方法。
20. ２０．免疫学的に有効な量のＰｅｍ蛋白質で構成される、個体中でＰｅｍ蛋白質 に対する抗体の生産を誘発するのに有益な医薬用組成物。
21. ２１．該Ｐｅｍ蛋白質が特許請求の範囲第１９項の方法により生産される、特許 請求の範囲第２０項の医薬用組成物。