PT99122B - Processo para a preparacao de uma proteina a partir de um novo oncogene conhecido por pem - Google Patents

Description

úteis para manipular a regulação do desenvolvimento embriónico, alterando o fenótipo tumorigénico e tamoém podem ser úteis para localizar Tocos metastásicos de tumores que contenham o oncogene Pem .

Antecedentes da Invenção

Foraa. $£ identificados numerosos genes em organismos de invertebrados, tais como Drosophila melanogaster, Caenor-habditis elegsns eSaccharomyc.es. cerevisiae, os quais participam em fenómenos de desenvolvimento, Kos sistemas dos mamííe ros acenas foram identificados alguns &enes que desempenham uma função integral durante o desenvolvimento (filau, Gell. 51) (1933; 673}. x^or exemplo , ,os: g<in§s específicos dos músculos kyoDl e miogenina constituíram modelos importantes para o controlo genético da diferenciação nos merinos. Os somites e os embriões dos membros expressam primeiro a miogenina e kyoDl no ΒδεηοΐΟδ dias da gestação, respectivamente (Sasson et al,, Nature, 1^-1 (1789), 303-303) e sabe-se que controlam a transfe rencia para a linhagem dos mioblastos in vitro (Davis et al,, Cell. 51 (1937), 937-IOOO). 0 complexo génico Hox-5 exibe um interessante diagrama de expressão nos embriões dos membros dos murinos após o 9fi dia de gestação (Dolle et al., Nature, jtó, (1939) 161-111), embora a ou as funções dos genes codificados ainda não tenham sido definidas. São conhecidos alguns outros marcadores genéticos que identificam ss células nas fases primitiva. e intermédia do desenvolvimento do murino. For exemplo, nenhum gene foi associado unicamente a um processo inicial de segmentação, o que ocorre no 82 dia de gestação no murganho (para revisão veja-se Rossant e Joyner, Trends in Genetics. £ (1939), 277-283).

As células imortalizadas e totalmente transformadas transcrevem frequentemente genes que são expressados (e presumivelmente influenciam) no desenvolvimento normal dos mamíferos (veja-se, Ruddon, "tfene Derepression em Câncer Cells". em Câncer Biology. New York, Oxford University Press, 193?, PP.^31-^36). Sm alguns clsos esses genes "oncofetais" não parecem contribuir para o fenétipo neoplásico. Por exemplo, a fetoproteína-a é ex pressada pelas células dos trofoblastos e por muitas células tu morais. Noutros casos, os genes de desenvolvimento regulado desempenham uma função essencial na conversão das células no fe nótipo transformado. Por exemplo, os proto-oncogenes c-myc,c-src, c-fos e e-fms são expressados durante o desenvolvimento embriónico tendo sido demonstrado que regulam os passos de desenvolvi mento in vitro (para uma revisão veja-se Adamson, Placenta. 8, (1987) ^9-^66).

No desenvolvimento do sistema imunologico os linfdcitos T derivam das células originais precursoras que entram no timo para sofrerem-diferenciação e maturação. Muitos genes sso acti vados ou reprimidos a medida que as células T passam através das diversas fases de desenvolvimento no interior do timo,

Por exemplo, durante esse intervalo de tempo as células adquirem na sua superfície o receptor II-2, ou os marcadores CD** e/ou CD3. 3sses ma roedores de diferenciação são importantes para o desenvolvimento e/ou função das células T . Muitos produtos génicos aumentam os seus níveis de expressão desenvolvendo lin fócitos T . Isses englobam o receptor das células T para o -ntigsne e também os marcadores CD^ e Ct8 , Kuitos outros an tigenes serviram como marcadores das células T antes de se conhecer a sua fur.çao exacta nos linfócitos. Só recentemente se descobriu que o entigene Pgpl das células T auxilia os timócitos a auto-birigirem-se para o timo, ao passo que ·ο T200 (0Β*+5) serve õe componente para a sinalixação intracelular. Ixiste outro marcador das células T , o Thyl para o qual ain da não se conhece nenhuma função que lhe esteja associada.

As células SL 12 Λ exibem um fenótipo negativo duplo GDh/CDá e, por isso, assemelham-se a timócitos numa fase rela-tiva^onte inicial de desenvolvimento. Alem disso, nso expressam ? sub-unidade alfa do receptor das células T . iodavia, as células ÇL· 12.^-:podem-;sèr.· induxidas a expressar estavelmen-te os mercadores GD*+ e GD3 na sua superfície após cultura sobre monocamadas epiteliais tímicas, 0 ABNm de TCR-alfa também e induzido após estes tratamentos. Sendo assim, admite-se que as células SL 12Λ tenham capacidade pa^a sofrerem diferenciação e maturação, dste sistema biológico dnico in vitro imita, de alguma forma, o micrormbiente tímico. foram identificados diversos genes que sso expressados primeiro nos timócitos em desenvolvimento. Kuitos desses genes codificam proteínas que devem ser expressadas para que os precursores das células ΐ se tornem funcionais no sistema imuno lógico, por exemplo: (1) o loR para o antigene qUt ó nte§Ê- sario para o reconhecimento do sntigenej (2) o CDt5 (° receptor 112) que deve ser expressado para que as células respondam à citoquina IL2$ (3) os produtos génicos importantes para a transdução do sinal durante 0 reconhecimento do antigene, tais como CD3j CD*+, CD5» GD*+5j (*+) alguns produtos génicos implicados no processo de auto-dirigir o timécito para os orgaos alvo; (5) os produtos génicos implicados na activaçao das células Ί , (Fowlkes e Pardoll, Advances in Immunology. M+,(1939) 207-26*+; Hood, et al., Gell. 1+0, (1935) 225-229; Bothenberg e Lugo, Deveiop. Biol. , 112, (1985) 1-17j Adkins et al., Ann. Bev. Immunol.. % (1937) 325-365; Crabtree, Science. 2V3, (1989) 3^3-355; Kwon e tíeissman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 36, (Γ939) I963-I967). Sxiste uma notável heterogeneidade nos subconjuntos timocíticos que expressam combinações diferentes de genes expressados. A expressão &énica foi analisada pormeno rizadamente em numerosas, mas não em todas, as classes de timéci-tos; e 4 provável que continuem por identificar em genes que codificam produtos com soluções no desenvolvimento e no proces so de auto-direcção das células Ϊ , particularmente os que são expressados em timécitos progenitores transientes numericamente raros.

Devido ã grande heterogeneidade dos timécitos não é exequível obter timécitos progenitores fraccionados com pureza e em némero suficientes para caracterizar completamente a casca ta da expressão génica que ocorre durante 0 desenvolvimento.

Por esta razão as linhas de células de linfoma e da leucemia foram utilizadas intensamente para estudar a expressão génica no desenvolvimento linféide (tfreaves, Science. 2λ*+. (1936) 697-70*+; Hanley-Hyde e Ljrnch, Ann. Bev. Immunol.. *+ (1936) 6 621-6½¾)). Existe literatura em quantidade considerável que in dica que as células progenitoras transientes numericamente raras, são o alvo da transformação para um estado maligno e que refere que algumas dessas características das células alvo trans formadas sã© conservadas nas células tumorais. A expressão gé-nica inesperada em células tumorais foi frequentemente rejeitada como aberração de transformação. Todavia, uma análise cuida dosa da expressão génica "acerrante'* em células tumorais hemato poiéticas revelou a existência de subconjuntos raros de células progenitoras normais que expressam esses genes (Greaves Science. 2^4, (1986) 097-70½} Hanley-Hyde e Lynch, Ann. Rev, Immunol., ;+, (1936) 621-6^9¾ Pierce e Speers, Câncer Res.. 43, (1938) 1996-200½). A heterogeneidade das linhas de células de linfomas de murinos e de seres humanos obtidos a partir de um tínico indivi duo podem resultar de diferenças na intensidade da maturação atingida pelas células individuais. A heterogeneidade das linhas de células do linfoma T fixado foram utilizadas para ob ter clones celulares estreitamente relacionados, os quais diferem por um. minero limitado de características. Hedrick, et al., (Hedrick et al., fature, 808. (198½) ^9-153) utilizando téc nicas de clonegem subtractiva admitiram que as células I e B diferem na sua expressão em cerca de 100 genes, i? provável que as células do linfoma T estreitamente relacionadas possam diferir na sua expressão por um némero menor de genes. Ssses cio nes celulares proporcionam uma oportunidade para se trabalhar com populações celulares puras com fenotipos definidos e estáveis que difiram por um nilmero limitado de características.

Desenvolveu-se e aplicou-se na presente invenção o sistema de modelo do linfoma T das células SL12 para proporcionar uma dessas populações celulares de estreita afinidade. (Hays et al., Int. J. Câncer. 30, (1936) 597-001; MacLeod et al., Câncer Res.. Mt, (1984·) 1734—1790; kacleod et al., J. Nat. Câncer Instf. 2k> (1935) 375-382; EacLeod et al., Proc. Natl.

Acad. Sei._USA, 3l, (1986) 69á9-69y3; Siegal et al., J. 5xc.

Med., 166, (1937) 1702-1715).

As células SL12.4 são similares aos timo eitos numa fase intermédia de maturação (iowlkes e Pardoll, Advances in Immunol,. 44, (1939) 207-264·). Os dois clones celulares diferem pelas suas propriedades biológicas. As células SL12.4- geram tumores sxtranodais e slo sensíveis ã lise induzida por glucocorticoi-des, ao passo que as células SL12.3 fazem com que os tumores disseminados difusos sejam resistentes è lise indU2ida pelos glu cocorticéides.

Breve descrição da Invenção A presente invenção proporciona uma nova sequência de ADNc, uma proteína de origem génica (Pem) e a utilização préti-ca dessa nova sequência de ADNc e desse produto génico Pem.

Ra presente invenção descreve-se as earacterísticas de sequência e de expressão de um novo gene representado pelo clone ADNC(Pem) obtido a partir de um linfoma T . As linhas de células imortalizadas e transformadas derivadas de vérias linhagens expressam as transcrições Bem . A sequência de ADR e as moléculas de ADN recombinante da presente invenção csracterizam-se pelo facto de codificarem uma nova proteína que exibe as ceracterísticas seguintes: (1) 4 expressada pelas células de linforna T , (2) nao 4 ex pressada no timo normal, nas células do baço activadas, no tecido linfóide associado ao intestino ou na medula óssea e não 4 detectével no cérebro, no fígado, no intestino grosso ou nos ovários dos adultos, (3) 4 expressada em linhas de células imortalizadas ou cancerosas e (q·) 4 expressada no desenvolvi mento embriónico, Conforme se conclui da descrição seguinte, a sequência de ABN , as moléculas de ADK recombinante nos processos para a preparação da nova proteína expressada no desenvolvimento embriónico e a nova proteína tem numa forma praticamente pura podem ser úteis na manipulação da regulação do desenvolvimento embriónico, para alterar o fenótipo tumori génico e também podem ser dteis para localizar focos metastasi cos de tumores que contenham o oncogene Pem . imbora o gene Pem nso se^a detectavelmente expressado nos tecidos dos adultos, 4 sequencialmente expressado duran te o desenvolvimento fetal dos murinos, inicialmente nos primeiras embriões e depois nos tecidos extraembriónicos. A expres são do gene rem durante o desenvolvimento fetal e a sua presença em linhas de células imortalizadas e neoplósicas são consistentes com as propriedades esperadas do gene "oncofetal”. ista sequência de ADK do Pem pode ser útil como marcador de células neoplésicas e de células que participam no desenvolvimento embriónico inicial. Outros objectivos, aspectos e vanta gens da presente invenção tornar-se-ão evidentes através da explicação pormenorizada adiante apresentada envolvendo os aspep- 1 tos preferenciais e tomando em consideração as Figuras anexas. Breve descrição das Figuras, A Figura 1 representa o ADN e a sequência proteica previsível do ADNC do Pem. A Figura 2 demonstra a expressão de ARNm do Pem em linhas de células. A Figura 3 demonstra a expressão do ARNm do Pem durante o desenvolvimento fetal.

Descrição pormenorizada da Invenção

Com o objectivo de permitir uma melhor compreensão da presente invenção, epresenta-se a descrição pormenorizada que se segue.

Na descrição que se segue foram utilizados os termos seguintes: 0 termo "hospedeiro” significa não sé células pro-cariotas mas também eucariotas, tais como células de leveduras e filamentosas e também células de vegetais e de animais. 0 termo "proeariota” refere-se a todas as bactérias que possam ser transformadas com o ADN para a expressão do gene Pem ou das proteínas de Pem recombinantes (P Pem r), de acordo com a presente invenção. 0 termo "eucariota" refere-se a todas as células de leveduras, de fungos, de animais e de vegetais que possam ser transformadas com o ADN para a expressão do gene Pem ou das pro teínas Pem recombinantes, de acordo com a presente invenção. 0 ADN para as proteínas do gene rem da presente invenção podem ser obtidas a partir de quaisquer espécies de mamíferos. Para esse efeito, apenas é necessário que a sequência genética da proteína Pem (PPem) seja expressada no organismo procarioti-co ou eucariético. jS preferívsloADNdoPemqueexpressa a(s) pro teína(s) do Pem proveniente dos murganhos. Hl especialmente preferencial a sequência do ADI? do Pem que ê irr.uno lógica mente reactiva nas reacções cruzadas entre diversas espécies de ani ma is (por exemplo, murganhos, coelhos, leões marinhos ou seres humanos). t possível utilizar utis molécula de ADN recombinante que codifica a proteína do Pem de acordo com a presente inven ção para trsnsformer uni hospedeiro, recorrendo a qualquer das técnicas normalmente conhecidas pelos especialistas na matéria. especialmente preferível utilizar um vector que contenha a se quência de codificação da proteína Pem em conformidade com a presetíte invenção para efeitos de transformação procariota. A proteína recombinante das células X ( Pemr) de acor do com a presente invenção poderia possuir mais ou menos amino-ácidos nas suas extremidades periféricas comparativamente com a sequência de aminoécidos da proteína Pem nativa. A expressão "praticamente puro'1 quando aplicada à proteína Pem de acordo com a presente invenção significa que o polipéptido é essencialmente isento de outras proteínas normal mente associadas à proteína Pem no seu estado natural, exibindo uma resposta electroforética ou cromatográfica constante e reprodutível, o mesmo sucedendo com as curvas de eluiçao e com a actividade antigénica. A expressão "praticamente puro" não pretende excluir as misturas artificiais ou de síntese da proteína Pem com outros compostos.

Os métodos para a preparação de genes unidos e funcio nalmente ligados e para os expressar em bactérias são conheci dos e encontram-se descritos, por exemplo na patente de inven ção norte-americana ífs 1+3662^6 aqui incorporada como referen cia, A arquitetura e os métodos genéticos descritos nessa pa tente de invenção podem ser utilizados para a expressão da proteína Pem em hospedeiros procariéticos ou eucariéticos.

Os hospedeiros procariéticos podem abranger as bactérias de gram negativo e também as bactérias de gram positivo, tais como gj. coli. β, tymDhimurium. Serratia marcescens. e Bacillus subtilis,

Os hospedeiros eucariéticos podem abranger as leveduras, tais como Pichia pastoris ou células de mamíferos.

De um modo geral, são utilizados vectores de expressão que contem sequências promotoras que facilitam a trfmscri ção eficiente do fragmento de AD!I inserido, em associação com o hospedeiro. 0 vector de expressão contém tipicamente uma origem de replicação, promotor(es), terminador(es) s também genes específicos que são capazes de proporcionar a selecção fenotípica nas células transformadas. Os hospedeiros transformados podem ser submetidos a fermentação e processados em culturas de acordo com métodos conhecidos na especialidade, de modo ε congeguir-se o crescimento celular éptimo.

Como exemplos de promotores que podem ser utilizados na presente invenção, referem-se, mas sem que isso constitua uma limitação: rec A, trp, lac, tac, o bacteriéfago lambda PR ou pL, KKTV, SVkO. Como exemplos de alguns plasmídeos ou hacteriéfagos que podem ser utilizados na presente invenção 12 referem-se os que foram enumerados por Kanietis et al,, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982,* e outros são conhecidos pelos especialistas na matéria e podem ser facilmente determinados. A presente invenção abrange quaisquer hospedeiros modificados áe acordo com os métodos descritos ou modificados por quaisquer outros métodos, vulgarmente conhecidos pelos especialistas na matéria, tais como, por exemplo, a transferência de material genético utilizando um fago lisogénico e os quais proporcionem células procariotas ou eucariotas que expressem o gene para a proteína Pem . 0 gene é uma sequência de ADN que codifica através da sua matriz ou do seu ARN mensageiro uma sequência de aminoáci dos característica de um péptidn específico. 0 termo ADNe abrange os genes dos quais foram removidas as sequências intervenientes. Pelo termo ADNr entende-se uma sequência que foi recombineda mediante exeisão-reoa ração das sequências do ADNe ou do ADN gen^mico in vitro. 0 veículo de clonagem é um ADN de um plasmídeo ou de um fago ou qualquer outra sequência de ADN susceptível de se replicar numa célula hospedeira caracteri2ando-se por possuir um ou eventualmente um pequeno mímero de sítios de reconhecimento da endonuclease pelos quais essas sequências de ADN podem ser cortadas de uma forma determinável sem perda das funções biolégicas essenciais do ADN, e que contém um marcador adequado para utilização na identificação das células transformadas. Os marcadores são, por exemplo, a resistência ã te traciclina, a resistência à neomicina ou a resistência à ampi cilina. Ο termo "vector" e utilizado, por vezes, para signi ficar veículo de clnnagem.

Um veículo de expressão e um veículo semelhante a um veículo de clonagem mas que e susceptível de expressar um determinado gene estrutural num hospedeiro normalmente sob o controlo de determinadas sequências de controlo.

Os hospedeiros transformados com o genoma dem para a proteína i'em são particularmente úteis para o produção do po-lipéptido e da proteína rem. A proteína Pem pode ser constituída por toda a sequên cia de aminoa'cidos da proteína .Pem ou pode possuir apenas um determinante específico. Um animal imunizado com a proteína recombinante rem produzirá anticorpos que se ligarão aos epi-topes presentes nos polipéptidos reeombinantes ou que ocorrem naturalmente. Deste modo, 4 possível produzir comercial-mente proteínas recombinantes que contenham o Pem. 0 terno !l indivíduo" significa qualquer animal, de pre ferencia um mamífero e ma is preferencialmente um roedor, um ga to, um cão, uma vaca ou um ser humano. A*? identificações deteet^veis podem ser quaisquer mole cuias que jKSSsam ser detectadas» As identificações detectáveis vulgarmente utilizadas são identificações radioactivas incluiu do, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os isótopos 32p} % e Os nucleótidos marcados com, 'oiotina podem; ser incorporados num ADN ou num ABN por radiomareação com AD'Í polimerase I ("nick translation") ou por meios enzimá ticos ou químicos. As sondas biotiniladas são detectadas após hibridação utilizando os conjugados em avidina/estreptavidlna, fluorescentes, enzimáticos ou de ouro coloidal. Os ácidos nu-cleicos também podem ser marcados com compostos fluorescentes, com derivados fluorescentes imunodetectáveis ou coe análogos da biotine. Os ácidos nucleicos também podem ser marcados ou identificados acoplando-lhes uma proteína. Tamtem podem ser utilizados ácidos nucleicos interligados a histona Hl radioacti va ou fluorescente, a enzimas (fosfatase e peroxidases) ou uma proteína de ligação de cordão simples (ssB) (ou Lcs),

Foram escolhidos dois clones celulares obtidos a partir da linha de células linfoma I das células SL12 para isolar os novos genes diferencialmente expressados, tomando como base as diferenças conhecidas na expressão genica e a sua capacidade diferente de originarem tumores em animais hospedeiros singe-neicos (Hays et al., Int. J. câncer. 3,3 (1956), 597-601; KacLeod et al., oancer Res.. k]± (1931+), 17S*+-1790; facLeod et al., J. "lat. Câncer Inst.. 2í± (1935) > 375-682; MacLeod et al., Proc. j^atl. „Ac.a,d. Sei. USA, 33 (1936), 6939-6993> Siegal et al., j[^_jxp. Red,,, 166 (lyd7), 1702-1715, tfeinroth et al., Câncer Res.,, *+5 (1935); *+809; Bilkinson, et al., BICBO J., 2, (1933) 101-109 e Qíiadroll para um sumário de fenotipos). A linha de células SL12.3 expressa muito poucos dos genes necessários para a função das células T, é altamente maligna em animais singeneicos e forma tumores difusos agressivos. Feio contrário, as células 5Ε12Λ expressam o ARNm para todos os componentes do complexo TCR/CD3 com a excepção de TCR-alfa; e sob vários aspectos, essas células são similares nos timrfcl-tos numa fase intermédia dn desenvolvimento dos timécitos.

As células SL12,l+ são muito menos tumorigénicas e induzem 'turno. u res extranodais proeminentes.

Para se isolar elones de ADftc representando genes expressados exclusivamente nas células 8Ι.12Λ e não nas células SL12.3 utilizou-se ume combinação de sondas enriquecidas por hibridação de subtracção e recorreu-se ao rastreio diferencial cléssico (semelhante ao descrito em Filmus et al., kol. Cell. Biol., 3 (1989), ^2^3-^+2^+9, conforme descrito pormenorizadamen te noutra publicação, FaeLeod et al., Cell Growth Differ., 1 (1 yyd), 271-C.79) ·

Ao proporcionar as sequências de ADN e as moléculas de ADN recombinante a presente invenção proporciona também son das e métodos para identificar células que contenham ou às quais faltam essas sequências e meios para administrar essas sequências às células às quais faltem essas sequências,

Adicionslmente a presente invenção proporciona meios pera inibir a expressão èt nova sequência de Pem proporcionando uma célula que contém a sequência normal do ADN do Pem e a sequência do ΑΒΠ srti-sentido ou o ADN que codifica o referido ABM enti-sentido que se pode ligar e, consequentemente, blo quear a síntese de ARN que codifica ε nova proteína da presen te invenção. A partir da presente descrição também é evidente parp o especialista na matéria que os anticorpos contra qualquer das proteínas da presente invenção podem ser utilizados para bloquear a ligação do ligando às proteínas e aos fér maços slvo ou outros agentes (tais como as suostâncias de marcação) às células que express&n essas proteínas. A presente invenção proporciona uma nova sequência de ADNc, uma proteína génica (Pem) e proporciona também as utili- 16 ?açnes práticas dessa nova sequência de ADNc e dos seus produ tos proteicos de gene Pem associados. A sequência do ADNc tem um comprimento de 339 Pb e possui uma dnica estrutura lon ga de leitura aberta que se prolonga desde o pb 91 ate ao 270 permitindo concluir que se trata de uma proteína que contém 210 sminoácidos (figura 1). Os ndmeros à direita na figura 1 referem-se à sequência nucleotídica. Os ndmeros à esquerda indicam a posição prevista dos aminoáeidos, A primeira metionina presente na sequência está sublinhada. A sequên cia consensual com o sinal da poliadenilação AATAAA também esta' sublinhada. 0 símbolo (λ) na extremidade 3' da sequência de ADN refere-se a um cordão de 1*+ resíduos edenilados da extremidade poli(A). Os sítios de fosforilaçao potenciais pa ra a quina se dependente de c/KP/cGKP (AG), par? a quinase pro teic? G (G) e para a quinase II da caseína (Cf) foram identifi cados utilizando programas da intelliGenetics que identifica r?m as consequências consensuais adequadas em torne de Ser ou Thr para cada uma das quinases. / sequência de poliadenilação consensual /.ATA A A está localizada a 50 pb da extremidade 5' do tracto poli(A) 0 primeiro codão da metionina (a. yl pb da extremidade 5') está envolvido pela sequência consensual de nozak (U/A íwvATuu) que proporciona uai sítio inicial de trmsla ção eficiente (Aozak, 1936). As transcrições no sentido Pem preparadas utilizando a polimerase T7 e traduzidas num lisa-to de reticulocito produzem moléculas proteicas com um peso mo lecular previsto (^3 nda, dados não representados). Deste modo, a primeira metionina actua como sítio de iniciação da trans leçeo em experiências de transcrição/translaçao efectuadas in vitro. 0 comprimento do clone de ADKc do Pem (339 pb, excluindo a extremidade poli(A) é semelhante ao comprimento, dos produtos de transcrição Pen (0,9 kb) aos quais se removeu a sua extremidade poli(A) (dados não representados). Deste mo do, é provável que o clone de ADNc do Pem possua, um eomprimen^ to quase,completo. A proteína Pem e hidrófila e não contém nenhuma sequên cia inicial ("leader"), não possui nenhum sítio de glicosila-ção ligado a N, nem possui nenhuma região potencial que abranja a transmembrana. Sendo assim, é provável que a tem não seja secretada ou inserida na membrana celular mas que possua propriedades de urna proteína intracelular. A proteína fem pre visível contem sequências consensuais para a fosforilação de £er e Thr devida à quinase C proteica, à quinase da caseina e θ quinase dependente de cAkP/cGMF conforme se mostra na Figu ra. 1. Uma ve? que as pesquisas eíectuadas nas bases de dados de uenbank e Swiss Protein sobre a sequência do ADN e sobre a previsível sequência de aminoácidos não revelaram qualquer se i. elhança significativa com outros genes conhecidos ou com outros produtos gónicos conhecidos, conclui-se que Pem representa um gene novo.

Acabada de descrever a presente invenção de uma forma genérica proporcionar-se-á uma melhor compreensão tomando como referência os exemplos específicos seguintes. Esses exemplos têm apenas objectivos ilustrativos e não pretendem ser limi tativos, salvo quando especificado de outro modo. vxem- 13 3xemplo 1

Isolamento, Caracterização e Cultura de Células A. Linhas de Células de Linfoma

Os requisitos relativos ao isolamento, à caracterização e h cultura de linhas de células SL12.1* SL12.3».. Si.12.4 do lin ma T e dos híbridos celulares somáticos entre elas formados, foram descritos pormenorizadamente por Hays et al.,

Int. J. Câncer. l8 (1936), 597—6015 KacLeod et al., Câncer Hes.., M+ (198^), 1734—1790; KacLeod et al., . 3:. Hat, Câncer Inst.. 2lt (1965)) 375-382; KacLeod et al., Proc, Natl. Acad. ·3ΐ (I986), 6939-69935 e Weinroth et al., Câncer Bes.. (1985)j 4-304—48095 considerando-se esses trabalhos aqui incorporados por referência.

Os fenétipos dos clones celulares SL1£3 e SL12.4- encontram-se resumidas no Quadro 1. A expressão do produto de transcrição, a expressão da proteína superficial, a tumorige-nicidade e 9 tipo de tumor foram determinados através de análise segunde Northern, por citometrigrama e por injecção in vivo de células clonadas em animais singeneieos, respeeti vamente. Os produtos de transcrição TLR-J(^ de 1,0 e de l,3kb codificam, respectivamente, as sequências (D)-J-C e V-D-J-C. A resposta glucocorticéide foi determinada pelo crescimento das células em dixametasona 1 mK. 19

Garacterísticas fenotípicas Quadro 1 dos clones célula res SL12.if e SL12.3 • SL12 Λ SL12.3 Thy-1 -i'+ TCR-alfa - + TGR-/3 l,Okb - AR*lm l,3kb - - TCH-gama - - TCR-delta - - CD3-gama. + - CD3-4elta + - GD3-epsilon + + /- CD3-?eta + GD2 4· CD>+ - - CDá - - Ihy-l +*t" ++ Rg2-1 m* + Expressão ThB + - superfi- TL + + ciai Xc:UU + H-2Kk - - IL2r f· ·+· JTld + + CE3-epsilon - - Esl-lh + NT Sensibilidade r» U R Glucocorticáide Tumorigenicidade Baixo Elevado Tipo de Tun:©r Extra- Difuse noidal (ovariano muscular) Β = células resistentes b lise, S = sensíveis à lise

As células SAL3 (uasson e Bourgeois, J. Cell. Biol.. 26 (1>j3), ^09*415, foram fornecidas pelo Ur, «asson. As células de linfoma foram cultivadas em meio de dagle modificado do Dulbecco enriquecido com 10 .1 de soro de vitela fetal, glu tamina, penicilina e estreptomicina. Utilizaram-se duas linhas de células, 2003 de carcinoma do ovério de mulher (Disaea et al., Am. J. Obstet. OinecolM llè- (1972), 979-939 e GOLO 31ó (Weods et al., Câncer Pes,. 32. (1279), *M9-¥f59), com as quais se preparou uma cultura em meio R?kl ló^+O enrique eido com 5 % de soro de vitela fetal, glutamina e 1 / de Fungi-bact (Irvine Scientific, Santa Ana, Califérnia). Quando as células estavam a ser utilizadas para a preparação do ABN procedeu-se > sua colheita durante o crescimento exponencial a um valor de densidade préximo de 5-3 x 10^ células por mili litro (>/ilkinson e KacLeod, SUBO J.. 7 (1933), 101-109).

Semearam-se espleriócitos provenientes de murganho BALB/c na con - 6 centração de 3 x 10 células/ml e estimularam-se com ConA na concentração de 10 jpg/ml durante 2 dias antes de se proceder à colheita do AM. B♦ Oo-cultura de células εΐ12Λ e de monocamadas epiteliais tímicas

As condições d.e co-cultura das células SL12A e das monocamadas epiteliais tímicas foram as que a seguir se descre vem. Be sumidamente, semearam-se as SL12A a um valor de densidade tal que a sua concentração final apés um período de 3 dias de co-cultura. foi de 1 x 10 células/ml. Adicionaram-se Células epiteliais tímicas (fiSL nu TIPI) no 32 dia. 0 desen- 21 volvimento celular efectuou-se em meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo 10 /1 de soro de vitela fetal e enrique eido com glutamina e com penicilina/estreptomicina à temperatura de 37aC. C. Linhas de células para os estudos de expressão 20.2

Os estudos de expressão 20.2 foram efectuados utilizan do as seguintes fontes de linhas de células : carcinoma emfcrio nais Fg e PC(3+ (Bernstine et al., Proc. Katl. .Açad. Sei, USA.,yo (1973) > 3899-39Q3)> tumores de pituita'ria ATt20 (Buonassisi et al., Proc. Katl. Acad........Sei. USA., 1+3 (19Ó2), 118^-1192), epiteliaiâ'. _tímicas (T8PI), (Beardsley et al.,

Broc. Katl. Acad. Sei. USA.. 80 (1933)» 6005-6009), epiteliais da mama (UME) (Evans, Science, 2k0 (1988), 889-891+)12.9), 3T3 (ATCC Ko. 92) e MEF,cuja,preparação foi efectuada em conformida de com Freshney (B'reshney, In Culture . of Animal Ce lis. Alan R. Liss, Inc, (1983), péginas 99-110), hibridoma PS.08 das células B , linfoma WEHI-21 das células Β/Γ , macréfago Ρ338Π, células epiteliais tímic-as (TEU), basófilos RBL-1, hibridoma 2H10V das células T , neuroblastoma N*+TG1, mieloma 519^/5^ linfomas T : SL12.3, RS *+.2 , SAa8, Ba 51^7» AK.R1, 31-*+, produ to híbrido das células somáticas SL12.3 x SL12.1+ e o hibridoma B0-1+H.H9.1 das células T . Sfectua-se a cultura celular em meio de Eagle modificado por Dulbecco enriquecido com 10 de soro de vitela fetal, glutamina, penicilina e estreptomici na. Efectuou-se a colheita das células utilizadas para a pre paração do ARN durante 0 crescimento exponencial a partir de culturas que continham 5-3 x 10** células por ml. Semearam-se esplen^citos provenientes de murganhos BALIí/c a um valor dè concentrarão de 3 x 10^ õéiulas/ml em meio RPtol 161+0 enriquecido conforme descrito antes e estimularam-se com ConA na concentração 10 jigMl ó, 2*+, 1+3 ou 72 horas antes da colheita de ARN.

Exemplo 2

Clonagem e estratégia de rastreio

Utilizou-se o ARNmde poli(A)+ proveniente das células 5112Λ com© matriz para a preparação do ADKc de cordão duplo (cd) (Uluber e Hoffman , Oene, 2£ (1963)» 263-269). Ao ADN de cordão duplo que havia sido previamente metilado adicionaram-se ligadores EcoRI. Ligaram-se ao ADKc ramificações gtlO lambda desfosforiladas (Stratagene) e procedeu-se à sua embalagem em bacteriofsgos lambda utilizando extracto para embala gem da Stratagene, de acordo com as instruções do fabricante (Huj-Kh et al, em D. Glover (ed,), (19$+) DNA Cio nine"'lechni-que.st, A Practlcal Agrooach. . Oxford, 13 L rress, 19Λ).

Sfectuou-se a hibridação por subtração praticamente conforme originalmente descrito por Hedrick, et al., Nature, 308 (I931+), 11+9-153 e P°r Simberlake, £ev. Biol.. (1980), '+97-503. Preparou-se o ADNc de cordão simples a partir de 10 mg de ARK de poli(A)+ de células SI12Λ utilizando 250 mC de 32p dCTP (Amersham) na presença de aetinomicina D na concentração áe 100 jíg/ml e hibridou-se até um valor Rot de 1260 23 23

> (moles de nucleótido por litro x segundo) com 25 mg de ARN de poli(A)+ proveniente de células SL12.3 num volume de 8 ml â temperatura de 68°C durante 18 horas. Após a hibridação procedeu-se ã recolha de ADNc de cordão simples (cd) por cromat£ grafia em coluna de hidroxiapatite. A partir de 1jpg de ADNc das células SL12.4 iniciais recuperou-se aproximadamente 120 ng (12% da carga de ADNc contendo 3 x 10^ cpm) e utilizou-se para sondar dois filtros de nitrocelulose de 150 mm con tendo 20 000 placas de gt 10 lambda por filtro. A primeira de duas camadas filtrantes em duplicado proveniente da biblioteca gt 10 lambda das células SL12.4 foi sondada com ADNc total proveniente de ARNm das células SL12.3 e a segunda camada filtrante foi sondada com ADNc das células SL12.4 enriquecido por subtração e preparado conforme descrito antes. A estratégia utilizada foi similar à utilizada por Filmus et al. Os clones do Bacteriófago lambda purificado em placa foram identificados como sendo específicos das células SL12.4 através de dois rastreios (utilizando sondas de subtração preparadas separadamente). Depois, recorreu--se â análise de Northern para confirmar que o clone hibridou apenas o ARNm proveniente das células SL12.4 e não o das células SL12.3. Os produtos de inserção do ADNc foram removidos do ADN lambda por digestão com as enzimas de restrição Hind III e Bgl II, isolados em agarose de baixo ponto de fusão (Sea Kem) e subclonados no interior do vector plasmídeo pT7/T3 (Bethesda Research Laboratory) digerido com Hind III e BamHI. Não foi possível excisar os produtos de inserção separando-os dp bacteriófago com EcoRI uma vez que os sítios do EcoRI foram danificados em todos os produtos de isolamento, segundo ftuziel et al., !;Iuclt„,Ació. Res.» lfc (1987):3181.

Utilizando o ADNc do Fem foram obtidos mais 15 clones a partir de uma biblioteca de ADNc de células SL12 de ZAPII lambda. Esses clones abragem o comprimento total do produto de transcrição ABWic maduro.

Exemplo 3

Ana'lise da mancha de Northern

Isolou-se o ARN celular total proveniente de tecidos e de linhas de células pelo método do isotiocianato de guanidina (Xaniatis et al., Molecular Cloningj A Labo.rat.ory Manual.

Cold Spring Karbor, Nova Iorque, .Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1983 , modificado conforme descrito por Wilkinson et al., SMBQ J.. 2 (1988), 101-109. Avaliou-se a carga e a trans ferência igual do ARN por pista através da coloração laranja da acridina (Maniatis et al., Molecular Cloning: A.Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1983), e por hibridaçao com o ADNc da actina, CKO-A e/ou ciclofilina. No caso dos*tecidos o método foi modificado de tal modo que o granulo de A5K obtido apés centrifugação em cloreto d.e césio foi utilizado para preparar nova suspen são em Tris 10 ilK (pH 3), 0,5 £ de SDS e EDTA 5 mM, seguindo--se duas extracções com fenol; clorofórmio; álcool isoamflico (2bi2kil) e duas extracções com clorofórmio: 2-butanol: élcool isoemílico (20:5:1). Para a observação das manchas de ARN submeteu-se 10 mg de ARN a electroforese em geles constituídos por 1 ;J de agarase-formaldeído e procedeu-se à transferencia para membranas de Nytran (kaniatis et al., 1982). As manchas de t Northern foram hibridadas com um oligémero aleatório iniciado dos produtes de inserção do ABKc marcado com ^P na presença de 10 % de sulfato de dextre.no e 50 i de formamida, durante um período compreendido entre 12 e 18 horas à temperatura de ½2n C. (Meinkoth e Nahl, 193½). rara a remoção da sonda mar cada procedeu-se b lavagem das manchas de ABN utilizando 0,1 λ x SS2i2 e 0,1 ,0 de SDS b temperatura de 90°C (Kaniatis et al., Kolecular Clonlng; A Laboratqry Kanual, Cold Spring Earbor Nova Iorque, Cold Spring Harbor. Laboratory Press, 1983) e depois deixou-se arrefecer até a temperatura ambiente, secou-se por exposição ao ar e armazenou-se sob vazio até nova híbrida-ção. As dimensões do AM foram determinadas por comparação com as gradações de ..alto-:e baixo peso molecular do ARN de BRL.

Exemplo *f

Anélise da mancha de Southern

Isolou-se o ABM celular total proveniente de célUlas, de linfoma T e de células somáticas de híbridos de murino/ /hamster e efectuou-se a digestão de tecidos de outras espécies com a enzima de restrição Bco B.I. Aplicou-se 20 micro-gramas de ADN digerido a cada pista de um gel de agarose a 0,7 % e submeteu-se a electroforese e espalhamento sobre supor tes de Nytran essencialmente conforme descrito por (meinkoth e Nahl, Anal. Biochem., 13 (193½), 267-23½), hibridou-se e lavou- -se conforme descrito para 0 caso de anélise da mancha de Northern. B. Análise da mancha de Southern da linha 20.2

Procedeu-se à análise da mancha de Southern da linha 20.2 conforme anteriormente descrito com as excepções adiante referidas.

Isolou-se o ADN celular total proveniente de células SL12.4, de fígados de murino e de hamster e de células somáticas de híbridos. O ADN de fígado de seres humanos e de galinhas foi adquirido a Clonetec, Paio Alto, Califórnia. O ADN foi digerido com as enzimas de restrição referidas nos exemplos, de acordo com as instruções do fabricante. Aplicou-se 10 mi-crogramas de ADN digerido a cada pista de um gel de agarose a 8% e submeteu-se a electroforese em tampão de acetato Tris du rante pelo menos 48 horas e efectuou-se o espalhamento sobre suportes de Nytran, hibridou-se e lavou-se conforme descrito para a análise de mancha de Northern. As manchas que continham o ADN proveniente de outras espécies foram lavadas com menor rigor tendo a lavagem final sido efectuada â temperatura ambiente utilizando 2 x SSPE.

Isolou-se o ADN celular total conforme descrito por Maniatis et al., 1982 e digeriu-se com as enzimas de restrição Eco R.I. Aplicou-se 20 microgramas de ADN digerido a cada pista de um gel de agarose a 0,7% e submeteu-se a electrofore se em tampão de acetato Tris, efectuou-se o espalhamento sobre uma membrana de Nytran essencialmente conforme descrito por Maniatis et al., 1982 e lavou-se conforme descrito para a análise das manchas de Northern.

Exeiri' £Ζ

Sxemplo 5

Analise da sequência do AD!\ ·*» iiw ιΐιί um ié —ii iiIiiiiiiíi «*'*»Mt “MiWíμ»·*· ***·**+**‘JMt-μ· r-r llM ^rí< rrt

Determinou-se a cartografia de uma endonuclease:de res trição a partir do clone ADNc do Aem e procedeu-se à subclona-gem de fragmentos em pT7T3j purificou-se o plasmídeo em grsdi ente de cloreto de cesio e determinou-se directamente a sequên cia pelos métodos de sequenciaçSo do didesoxi de cordão duplo utilisando os reagentes de Sequenase (D. S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Determinou-se uma parte da sequência utilizando origens iniciadoras para o plasmfáeo hospedeiro e foram preparadas outras origer.s iniciadoras oligonucleotídicas específicas (17 meros) para o ADTíc nas instalações da LLSB Câncer lenter Gore Molecular Biology Facility. Os dois cordões de ALOI foram sequenciatíos integralmente e as sequências foram todas determinadas pelo menos em 2reacções efeetuadas em duplicado. Recorreu-se aos programas e aplicações informáticos de Xicrogenia and IntelliCreneties para reunir a informação da sequência sobreposta e efectuar a análise inicial da sequência do ABN. · As procfie.dades da proteína previsível foram avaliadas re correndo ao programa Arosite elaborado por IntelliGenetics. A. sequência do ADH e da proteína prevista fni utilisada para pesquisar semelhanças nas bases de dados de Swiss Proteín e uxem-

Exemplo 6

Sequência co ADKc e da proteína prevista co ?em

Com o ofcgeetivo de determinar a sequência do ABKc e da proteína codificada pelo gene ?em proeurou-se obter novos ADKc correspondentes aos genes implicados ns diferenciação e/ou neo plasia. uá práximo do fim foram seleccionados dois clones ce lulares do linfoma T estreitamente afins das linhas $112Λ e SL12.3 (hacLeod et al., Câncer Bes.. kk (19¾), 173^-1790) que diferiam pelo seu nível de maturação e pelas suas propriedades tumorigánicas. Tomando como base a análise de 10 antigenes da superfície celular e 12 ARNm específicos verificou-se que os clones celulares representam fases ou linhagens distintas do desenvolvimento das cálulas T . (XacLeod et al., Câncer Res.« k± (19¾). 1'/3h-1790 j XacLeod et al., J. Natl. Câncer Inst., 7k (1935), 875-382} XacLeod et al., ?roc. Xatl. Acad. Sei. LSA» 33 (1936), 6939-6993; Hays et al., Int. J. Câncer^ 38 (1936), 597-601; XacLeod et al., Cell urowth Liffer., 1 (1990), 271-279).

Lm clone ALIIc da linha 20.2 identifica os produtos de transcrição expressados na placenta e nos embriões e foi desig. nado por bem. A sequência do ADXc possui 339 ?b de comprimento e contêm um único quadro longo aberto de leitura que se prolonga des de o pb 91 atá ao 720 e permite prever uma proteína que contem 210 aminoácidos (Figura 1). Os números à direita da figura re-fereí2-Se ç sequência nucleotídica. Os números ã esquerda indi- cam a posição previsível dos aminoácidos. A primeira metioni na presente na sequência esta' sublinhada. A sequência conseh suai do sinal de polisdenilaçeo, /:/'!//·/., também está sublinha da. 0 símbolo (λ) na extremidade 3' da sequência do ADN re-fere-se a um cordão de Ik resíduos adenilato da sequência de cauda poli(A). Os sítios de fosforilação potencial para quina-se dependente de cAKP/eGKP (AO), para a quinase C proteica (C) e para a quinase II da caseína (CK) foram identificados recorrendo aos programas informáticos da IntelliOenetics que identi ficam as sequências consensuais adequadas em torno de Ser ou Thr para cada uma das quinases. A sequência de poliadenilação consensual, AATAAA está localizada s 50 pb da extremidade 5' do tracto poli(A). 0 primeiro codão da metionina (a 91 pb da extremidade 5') está envolvido pela sequência consensual de Kozak ( /^XXATGG)que proporciona um sítio eficiente para o início da tradução (Kozak, Cell, M+ (1936), 233-292). Os produtos de transcrição no sentido Pem preparados utilizando a polimerase 17 e traduzidos num lisato de reticulácito produzem moléculas proteicas cem o peso molecular previsto (23 Kda, dados não representados). Deste modo, a primeira metionina funciona como um sítio de iniciação da tradução nas experiências de transcrição-tradução in vitro. 0 comprimento do clone ADNc do Pem (339 pb, excluindo a sequência de cauda poli(A)) e similar ao comprimento dos produtos â®do Pem (0,9 kb) cuja se quência de cauda ^oli(A) foi removida (dados não representados). Deste modo, é provável que o clone ADi.c do remi tenha um comprimento quase completo. 30 A proteína Pem e hidrófila e nao contém nenhuma sequên cia inicial, não possui nenhuns sítios de glicosilação ligados a N, nem possui nenhumas regiões potenciais que abranjam a transmemfcrafia. Sendo assim, é provável que a Sem não seja segregada ou inserida na membrana celular mas que possua proprie dades de uma proteína intra-celular. A proteína Pem previsível contém sequências consensuais para a fosforilação de Ser e Thr devida h quinase C proteica, h quinase da caseína e è quinase dependente de cAkP/cGKP conforme se mostra na Figura 1, Uma ) ver que as pesquisas efectuadas nas bases de dados de GenBank e Swiss Protein sobre a sequência do ADN e sobre a previsível sequência de aminoácidos não revelaram qualquer semelhança sig, nificativa com outros genes conhecidos ou comi outros ^rodutos génicos conhecidos, conclui-se que Pem representa um gene novo.

Sxemplo 7

Sxpressão dos produtos de transcrição do Pem > ~

Com o objectivo de avaliar a expressão dos produtos de transcrição do Pem em linhas de células imortalizadas e transformadas, recorreu-se h análise de Northern para identificar os tipos de tecidos e de células que expressam os produtos de trans crição do Pem. Os produtos de transcrição do Pem são abundantes na linha de células do linfoma T mas não são detectáveis no tecido linféide do’timo de adultos, nos esplenocitos quiescentes ou activados, no tecido linféide associado ao intestino ou na medu la ossea, e não são detectáveis no cérebro, no fígado, no intes 31 tino grosso ou nos ovários dos adultos. Além disso, os produ tos de transcrição do Pem não foram encontrados no pâncreas, no corado, nos pulmões, no estômago, nos rins nem na pituitá ria. l’ma vez que o clone ADMc do Pem foi isolado a ^artir de uma linha celular transformada (£Ι12Λ), avaliou-se a expressão do gene Pem noutras linhas de células imortalizadas e transformadas (Figura 2). Para obter a expressão do AKNm do Pem em todas as linhas, efectuou-se a sondagem das manchas de 'Torthern com produtos de inserção Pem marcados com um isótopo 32P para avaliar a expressão de AMm do Pem nas seguintes linhas de células de murinos: F9> PCC1* (carcinomas embrionais); ATt20 (pituitária); TSPI (epitelial tímica); KX3 (epitelial da mama)j 3T3 (fibroblastos imortalizados)5 K3P (fibroblastos embrionários de murinos normais); 5Ι12Λ (linfoma T); PS.03 (hi-bridoma das células B); V/3KI-21 (linfoma E/Γ); P338D1 (macrofa-go); T3L (epitelial tímico); RBL-1 (baséfilo); 2B10V (hibridoma das células T); N^+TGl (neuronlastomaÍjSl^/Ç (mieloma); SL12.3, PS^f.2, SAKS, Bví5W, AKRI, SL-k (linfomas T); SL12.3 x SL12A (células somáticas de híbridos); e BO-^H.H.9.1. (hibridoma das células T). Observaram-se carga e transferencia de ARN similares em todas as pistas pelo método da coloração laranja da acridina do AR-Tr 13S e 288, e por hifcridação da mancha com uma sonda de ciclofilina (Cy) marcada com o isétopo (Xakahashi et al., Nature. 117 (1939), i+73-Lt-75> 3 qual permite reconhecer os produtos de transcrição presentes em níveis similares na maior parte das linhas de células dos murinos. 32

Duas linhas de células de carcinoma embrional (F9 e PC(A-) que possuem caraeterfsticas de hemocitoblastos pluripo-tentes expressam o gene de Pem mas em quantidades notavelmente surpreendentes. Os fibroblastos 3T3 imortalizados expressam o Pem abundantemente ao passo que o fibroblasto embrionário normal expressa cerca de $0 vezes menos o ARKm do Pem. 0Pem expressado nas linhas de células de origem neuroniea, pituité ria, macrofaga e epitelial mamária. Pelo contrário, os produ tos de transcrição do Pem são virtualmente indetectaveis nas linhas de células epiteliais tímicas e na maioria das linhas de células de hibridoma e dos tumores de células B e T , embora o hibridoma de células B (PS.G3) e duas linhas de célu las de linfoma T (SlA e 8112Λ) expressem os produtos de transcrição do Pem (Figura 2). A Figura 2 mostra que o produ to de transcrição de l,lkb é o produto de transcrição mais no tável; contudo, algumas células expressam um ARKm adicional de 3kb. Os dois produtos de transcrição de 1,1 e 3 ^ são en riquecidos en; ARN seleceionado de poli(A) e encontram-se presentes no compartirr.er.to citoplésmico nas células SL12A. A falta de qualquer padrão evidente de especificidade da linhagem cara a expressão do gene Pem e a grande variabili dade m quantidfda de. ARKmnasjlish%§ de-células, 3 S pos sibilidade de os genes serem aleatoriamente perdidos, desacti vados, deslocados ou amplificados in vivo ou apés prolongada cultura in vitro . A análise de Southern demonstrou pre-viamente que os genes Pem nso exibiam quaisquer diferenças de tectáveis na amplitude ou na intensidade da banda, entre célu las SL12.3 (Pem ) e SL12A (Pem ) nem em outras linhas de cé- lulas do linfoma T (Pem"), SAh3 (KacLeod et al., Ge 11 Gro-wth riffer,, 1 (1990), 271-279). Posteriormente o ADK foi testa do a partir de diversas linhas de células expressando grandes quantidades de ABKm do Pem SL12A, ATt20, F9, MK2, Hhíul e 3IA) e não foram detectadas quaisquer diferenças na amplitude nu intensidade da banda (ndmero de copias). Sm consequência, é improvável que as supressões de genes, rearranjos genéticos fundamentais ou ocorrências de amplificação génica sejam res-ponséveis pelas diferenças na acumulação do ARKm do Pem nas linhas de células.

Sxemplo 3

Expressão do gene Pem no desenvolvimento embriénícá. 0 padrão da expressão do gene Pem. é similar ao dos ge nes oncofetais, uma vez que os produtos de transcrição do Pem se encontram presentes nas linhas de células transformadas e imortalizadas, nos hemocitoblastos de carcinoma embrional, mas não nos tecidos de adultos (Buddon "Gene Derepression in Câncer Cells", ín, Câncer Biology, Fova Iorque, Oxford University Press, 1987, PP. ^ara melhor explorar a possifcili dade de o Pem pertencer a esta classe de ^ genes procedeu-se à avaliação de níveis de transcrição tanto nos embriões como nos tecidos extraembriónicos, em diversas fases de desenvolvi mento dos murinos. 0 ABN foi preparado a partir de embriões placenta (P) e membrana da gema de ovo (ϊ), nos momentos de gestação indicados na Figura 3. A Figura 3 mostra que os pro dutos de transcrição do Pem sso detectéveis logo aos 6 dias do desenvolvimento embriónico. Os embriões com 6 dias possuem tecido extraembriónico. 0 ARNm do Pem torna-se abundar: te entre os 7a e o 3s dias,mas a expressão é drasticamente reduzida por volta do 9a dia e nos dias subsequentes, embora se observe tipicamente uni sinal tónue (Figura 3). Feio contrário, os produtos de transcrição do Pem são fracamente ce-tectaveis entre os 7S e dias, na placenta e na membrana de gema de ovo, mas aumentam cara níveis abundantes por volta do 92 dia e em todas as fases subsequentes. Os embriões com 10 e 13 dias, a placenta e a membrana da gema do ovo (não representada) possuem um padrão de expressão do ARNm de Pem similar aos dos dias 12-16. Hifectuou-se a sondagem das manchas conforme descrito na Figura 2. Os diagramas de expressão do gene Pem tecidos embriónicos e extraemoriónicos permitem tirar duas conclusões significativas: (1) 0 ARNm do Pem acu mula-se em níveis elevados apenas brevemente nos embriões in toto (72 q 32 dias) embora possa persistir em linhagens em briónicas específicas em fases mais avançadas; (2) a expressão do ARNm do pem nos embriões ê recíproca da que se observa no tecido extraembriónico.

Nxemolo 9 0 Pem 4 um gene oncofetal 0 gene Pem é expressado ce uma forma específica da fa se durante a embriogónese e ê expressado numa ampla variedade de linhas de células imortalizadas e transformadas. Não 4 ôx pressado de forma detectavel em nenhuns tecidos de adultos tes tados . Una vez que essas características de expressão singu lares são as que se espera dos genes oncofetais (Ruddon, "Gene derepression in Câncer Cells", in Câncer Biology»

Mova Iorque, Oxford University Press, 1937» 1?. 4-31-4-36), o ^em pode constituir um marcador útil de células imortalizadas e/ou de células que participem nas fases iniciais de desenvolvimento dos murinos. A observação do fenómeno que corresponde à diminuição dréstica d^s produtos de transcrição do Pem nos embriões do 92 dia, momento esse correspondente ao ponto de gestação em que passam a ser abundantes na placenta e na membrana da gema do ovo, sugere a possibilidade de as células Pem+ migrarem do compartimento embriónico para o compartimento extraembriónico. As células da mesoderme extraembrió-nica (derivadas da massa celular interior) originam as células da placenta e da membrana da gema do ovo e por essa razão possuem as csracterísticas previsíveis para essas células nigrato rias. Embora 0 gene Pem seja expressado especificamente duran te 0 desenvolvimento fetal, não se pode daí concluir que actue também no adulto. 0 gene Pem pode ser expressado por células progenitoras numericamente raras ou transitórias presentes em tecidos adultos. Cma vez que se admite que tanto as células progenitoras fetais ou de adultos sejam alvos do processo de transformação/imortalização (Pier e Speers, Câncer fíes., 4£ (19bo), 1993-2004-), a observação de que o ARKm do Pem é expres sado por numerosas linhas de células imortalizadas e transformadas é consistente com este conceito. A desregulação resultante da hiperexpressao ou da expressão constitutiva do Pem em células imortalizadas sua capacidade para a -Ode, eventualmente, contribuir para i-^oliferação celular contínua. a 36

Com o objectivo de evitar ou de controlar a proliferação anormal induzida pela hiperexpressio ou pela expressão con£ titutiva do Pem, é possível recorrer â terapia genica recombi-nante homóloga ou â inactivação de genes discriminados para inibir a função dos genes ou a expressão de um produto génico funcional. Para satisfazer este objectivo utilizam-se clones genómicos do gene Pem. 0 gene Pem é desactivado inserindo um marcador selectivo no interior do gene numa posição que desactjL ve a capacidade do gene para codificar o marcador funcional ou a capacidade para a expressão do marcador funcional. 0 gene mu tado é depois transferido por electrodifusão osmótica ou por microinjecção para um hemocitoblasto ou para uma correspondente linha de células fixada. As células em que o marcador selectjL vo é adequadamente incorporado são seleccionadas e transferidas para o blastocisto de um indivíduo. Os indivíduos podem ser seleccionados de modo a possuírem um ou ambos os alelos do gene Pem assim transformado.

Qualquer especialista na matéria concluirá facilmente que a presente invenção está particularmente bem adaptada para satisfazer os objectivos propostos proporcionando as vantagens referidas, satisfazendo também aspectos que lhe são inerentes.

Os componentes, os métodos, os procedimentos e as técnicas agç> ra descritos são caracteristicamente representativos dos aspe£ tos preferenciais e devem ser considerados exemplificativos não constituindo qualquer limitação ao âmbito da presente inven ção. As possíveis modificações e outras utilizações que ocorram aos especialistas na matéria são consideradas englobadas no espírito da presente invenção e são definidas no domínio das reivindicações anexas. 37 NOVAS REIVINDICAÇÕES 6 A 20 6.- Processo para a dececção de sequências nucleotl dicas em células, caracterizado pelo facto de se utilizar a se_ quência de nucleotidos seguinte GAA GAG CCA ΛΑΟ AGC CAC 1 CTC : cct 1 GCA . CAG TCC TTC 1 * /-· .· rw-vvj ******* 42 1 Glu Glu ?rs Ser His La u Pra Ala Glu Sac Píie Lys Lau ACC -cc TGC crc CCG TGG ACA , AGA GGA AGC ACA AAG ^ » rr* ΛΛίι CAT 84 15 TV - Ser I CVS Leu Pra Tsp Tiir Arç Gly Ser 1 Tir Lys Asn His 1 <c) l <c> .126 CCS. GGT AXG GAA GCT GAG GGT TCC AGC CGC AAG GTC ACC AGG 29 Pra Gly HST Glu Ala Glu Gly Ser | Ser | Arç Lys Vai Tíir | Arç 1 (C t CJ {AG) 1168 CTA CCC CGC CTG GCA GTC AAG GAA GAC TCC GAA GAA CAT 43 Leu Leu Arç Leu Gly Vai Lys Glu Asp Ser Glu Glu Gla His ******* GTG »^ i (W\ GCA GAG GCT TTC TTC CAG GCT GGA GAG GGG AGA 210 57 Asn Vai Lys Ala Glu Ala Phe PÍ16 Gin Ala Gly Glu Gly Arç GAT GAG CAA GGT GCA CAG GGC CAG CCT GGA GTG GGA GCG GTG 252 71 Asp Giu Gin Gly Ala Gla Gly Gla Pra Gly Vai Gly Ala Vai GGA ACA GAA GGC GAA GGA GAA GAA TTA AAT GGA GGA AAA GGC 294 85 Gly Thr 1 Glu Gly Glu Gly Glu Glu Leu Asa Gly Gly Lys Gly · CAC (CO TTT * > ******* ccc. GGT gct CCT GGT C^r* ATG GGT GAT ****** V7V£\3 GAC 336 99 His Pia Gly Pro Gly Ala Pra <siy .?Γ3 «eu Gly Asp Gly Asp AAG GAT AGT GGC ACC AGG GCT GGT GGT GTG GAG CAG GAA CAA 378 113 Lys Asp Ser Gly Hir Arç Ala Gly Gly Vai Glu Gin Glu Gla AAT GAG CCA GTT GCT GAG GGC ACT GAG AGC CAG GAG AAT GCA· 420 127 Asn Glu ?rc Vai Al a Glu Gly TlAr Glu Ser Gin Glu Asa Gly AAT ccr GGT AGG CAG ATG CCC TCC \ **0* AWW GCT **m% GGT CCG 462 141 Asa ?co Gly Gly Ar? Gin «SC pra Ser Arç Ala Lau Gly Ser ccc AGC m·» m CGA CCG AGG GAA CTG GAG TCC AT . TTC CAG CGC 504 155 Ser 1 Tyr Arç Lau Ara Glu Lau Giu Ser 113 Lau Gla Arç ·» /·*“·· Λ'τ* · <C) ΛΛ* m s*.·· -· w^· GAT GTC CCA AGG GAG GAT CTT GAT AGA 1 CTG 546 169 *·**> - Asa Ser Pha ^ ^ Vai 2*»*» • «* w Arç Glu Asp Lau Asp Arç Lau i l

Claims (15)

1. 38 38 ATG GAT GCC GTG TCC AGA GTG CAG AAT TGG TTT AAG ATC 588 183 «ec ASÇ Ala cyi Vai Ser AC? Vai Gin Asa Trp Phe L^s (CJ Ele AGG AGG GCG GCC AGA AGA ACC AGG AGG AGG GCA ACA CCA 630 197 Acg Ae<j Ala Ala Ala Ac? Ac? ThC 1 (C) Ac? AC? Are Ala Thr i (AG) PCQ CCT GAA CAT AGA GGA ACA TTC GAG TGT CCT GCT TGT 672 211 Vai Pro Glu HÍS Phe Arp Gly The Phe Glu Cys ?ra Ala Cys CGT GGA GTG AGA TGG GGA GAA AGA TGC CCT TTT GCG ACA CCG 714 225 Ac? Gly Vai AC? Trp Gly^Glu Ar? cys Pra Phe Ala Thr 1 (C) Pca 239 AG A TTT Acq Phe TGA TTT GAT CAC ATA TGC GGG CTA TGA CAG CCC TTA 756 ) CTT TTC AAG AAT TCA GCA ATA AAG AGG TGG ATT CCC AGT ATG 798 TTT GTT CCA. TTA CCT CTÃ TGA TTA TTA AAA TAT TGA TAC A(x)|840 como sonda de ADNc.
2. 7. - Mitodo para a detecção de células neoplásicas, caracterizado pelo facto de se incubar a sonda de acordo com a reivindicação 6 com uma população de células alvo sob condições de hibridação.
3. 8. - Método para o tratamento de células neoplásicas, caracterizado pelo facto de se inserir um gene Pem mutante inactivado nas células neoplásicas.
4. 9.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos da sequência de ADNc de acordo com 39 a reivindicação 6.
5. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, cara£ terizado pelo facto de se obter o polipéptido sob uma forma substancialmente pura.
6. 11. - Processo para a preparação de um hospedeiro pr£ cariõtico ou eucariõtico que exprime o gene para a proteína Pem, caracterizado pelo facto de se introduzir no referido hospedeiro um veículo de expressão que contém uma sequência de ADN que codifica para a proteína Pem.
7. 12.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o veículo de expressão ser um plasmí deo susceptível de replicação num hospedeiro, o qual compreende, numa ligação exequível:

   a) uma origem de replicação; b) um promotor; e c) uma sequência de ADN que codifica a proteína Pem.
8. 13.- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de ser um fago ou plasmídeo susceptível de replicação num hospedeiro procariota, o qual compreende numa ligação exequível: 40 a) uma origem procariota de replicação; b) um promotor procariota; e c) uma sequência de ADN que codifica a proteína Pem.
9. 14.- Processo de acordo com a reivindicação 12, carácter izado pelo facto de se seleccionar o veículo de expressão no grupo constituído por pMAMneo, pNEO/Tfr-NC e pMAM/neo/Tfr-NC.
10. 15.- Processo para a preparação-de um vector capaz de se replicar num hospedeiro, caracterizado pelo facto de se utilizar uma sequência de ADN que codifica a proteína PEM.
11. 16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de se isolar o vector a partir do grupo constitído por um plasmídeo, um fago e um cosmido. )
12. 17. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o vector ser pT7T3-20.2 e ter o nume ro de depósito ATCC 68304.
13. 18,- Processo para transformar um hospedeiro, caxac terizado pelo facto de se introduzir uma molécula de ADN recom binante no referido hospedeiro, compreendendo a molécula de ADN recombinante uma sequência de ADN que codifica a proteí- 41

    na Pem.
14. 19. - Processo de acordo com a reivindicação 18, cara_c terizado pelo facto de o hospedeiro ser E. coli.
15. 20, - Processo para induzir a produção de anticorpos para a proteína Pem num indivíduo, caracterizado pelo facto de se promover a imunização do indivíduo com a proteína Pem codificada pelo gene Pem. Agente Oficial aa Proprieauue iimusiM»1

    Lisboa, 30 de Setembro de 1991 42

    RESUMO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA A PARTIR DE UM NOVO ONCOGENE CONHECIDO POR PEM" Descreve-se um processo para a preparação de uma_-pro-teína Pem que consiste em: a) transformar um hospedeiro com uma sequência de ADN que codifica uma proteína de células T; b) exprimir a referida sequência de ADN; e c) recuperar a referida proteína Pem. A sequência de ADN e as moléculas de ADN recombinante da presente invenção são caracterizadas pelo facto de cada uma codificar uma nova proteína que apresenta as características seguintes: 1) é expressa por células T de linfoma; 2) nao é expressa no timo normal, em células de baço activadas, em teci do linfóide associado ao intestino, ou em medula óssea, e não é detectãvel no cérebro adulto, no fígado, no intestino grosso nem nos ovários; 3) é expressa em linhas de células câncer£ sas ou imortalizadas; e 4) é expressa no desenvolvimento embriónico. „ Agente Oficial aa Preprieaaae mausinwi

    Lisboa, 30 de Setembro de 1991 i