CN100355782C - 新的肝癌高表达基因、其编码的蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的人HCCA1蛋白，编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了此多肽的药物组合物用于治疗肝癌等多种疾病的方法。本发明还公开了HCCA1蛋白特异性抗体的制备方法以及该抗体用于疾病诊断和治疗等多种用途。本发明还公开了编码这种新的人HCCA1蛋白的多核苷酸的用途。

Description

新的肝癌高表达基因、其编码的蛋白及其应用

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码人HCCAl蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽及其特异性抗体的用途和制备。具体地说，本发明的HCCA1蛋白是一种新的在肝癌中高表达的蛋白。

肝癌是一种严重危害人类的疾病。西方发达国家肝癌的发病率较低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。

到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。

因此，为治疗和诊断目的研究和开发在肝癌中高表达的基因和/或蛋白具有重要意义。本领域迫切需要新的在肝癌中高表达的基因和/或蛋白。

本发明的目的是提供一种新的、在肝癌中高表达的人HCCA1蛋白(protein ofhepatocellular carcinoma susceptible gene 1，简称为“HCCA1蛋白”)多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

本发明人应用差异显示法从肝癌组织中获得一基因片段，进而通过基因克隆技术获得该基因的全长序列。令人感兴趣的是该基因在肝癌中的表达高达90.8％，而癌旁肝组织不表达或表达极低。该基因编码一719个氨基酸的蛋白质，位于胞内，而且含有多个蛋白质-蛋白质相互作用结构域以及磷酸化修饰位点，表明该基因参与细胞内信号传导，这一发现使人们在探讨肝癌的发病机制中又前进了一大步，同时为肝癌的诊断以及通过干预细胞内信号传导的“信息治疗”提供巨大的潜在应用价值。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的HCCA1蛋白多肽，该多肽是人源的，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性：(a)编码上述人HCCA1蛋白多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中320-2479位的序列；和(b)具有SEQ ID NO：1中1-2702位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人HCCA1蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达人HCCA1蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人HCCA1蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人HCCA1多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-2702个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人HCCA1多肽活性的化合物，以及抑制人HCCA1多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人HCCA1多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在HCCA1蛋白的方法，它包括：将样品与HCCA1蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在HCCA1蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人HCCA1多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人HCCA1多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人HCCA1多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人HCCA1蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人HCCA1多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗肿瘤等病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了本发明人HCCA1蛋白的氨基酸序列及其编码序列。其中氨基酸效率采用标准的氨基酸单字母缩写。全长蛋白是719个氨基酸(不包括终止密码子)。

图2显示了Northern杂交分析HCCA1 mRNA在肝癌中的表达情况。其中，在各L泳道为癌旁肝组织；各K泳道为肝癌组织。

图3显示了用免疫组织化学分析HCCA1蛋白在肝癌中的表达情况。其中，阳性信号为做左下方的棕黄色区域(彩色照片)或灰色区域(黑白照片)。

在本发明中，术语“HCCA1蛋白”、“HCCA1多肽”或“肝癌高表达蛋白HCCA1”等可互换使用，都指具有人肝癌高表达蛋白HCCA1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。该术语包括含有或不含起始甲硫氨酸的肝癌高表达蛋白HCCA1。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的HCCA1蛋白或多肽”是指HCCA1多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化HCCA1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。HCCA1多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人HCCA1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人HCCA1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人HCCA1多肽”指具有人HCCA1蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人HCCA1蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人HCCA1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人HCCA1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人HCCA1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人HCCA1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人HCCA1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人HCCA1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人HCCA1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人HCCA1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人HCCA1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID N0：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                        表  1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile

Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或菲编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸所编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码HCCA1蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人HCCA1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或HCCA1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的HCCA1多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人HCCA1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人HCCA1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒.如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人HCCA1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人HCCA1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗HCCA1蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗HCCA1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人HCCA1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人HCCA1蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人HCCA1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人HCCA1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人HCCA1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人HCCA1蛋白的分子，也包括那些并不影响人HCCA1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人HCCA1基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人HCCA1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人HCCA1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人HCCA1蛋白功能的抗体以及不影响人HCCA1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人HCCA1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人HCCA1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人HCCA1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人HCCA1蛋白。此外，与人HCCA1蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人HCCA1蛋白相关的疾病。由于HCCA1为胞内蛋白，富含脯氨酸，含有蛋白质-蛋白质相互作用结构域和磷酸化修饰位点，HCCA1很可能是细胞信号传导链中的重要一环，给予适当剂量的抗体可以阻断人HCCA1蛋白的活性及其信号传导而达到治疗目的，这就是新型的癌症治疗方法——“信息治疗”。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人HCCA1蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人HCCA1蛋白阳性的细胞(例如肝癌细胞等)。由于本发明的HCCA1蛋白在肝癌细胞中是特异性高表达的，这种杂交抗体可用于定向地杀灭肝癌细胞。本发明的研究表明，HCCA1是一胞内蛋白，由于它在正常脑、肺和肌肉等组织表达，表明它是一个正常细胞基因，但HCCA1蛋白在这些组织中表达的意义仍有待探讨。这些组织中HCCA1的表达低下可能导致某些疾病，应用本发明分离到的HCCA1的多核苷酸和蛋白可以治疗在这些组织中因HCCA1不表达或低下而导致的疾病。此外，HCCA1在正常肝脏中不表达，但在胚胎肝中表达，肝癌发生后HCCA1有很高的表达，这表明它在出生后处于关闭状态，而肝癌发生时重新开放，该基因在肝癌发生时极有可能已发生了突变。已发现HCCA1在肝癌中高表达，但又发现它弱表达于其他的肿瘤细胞系如乳腺癌、胃癌和大肠癌等，所以HCCA1在肝癌中的表达可能并不特异，HCCA1有可能是许多癌症发病中的一个共同的环节。因此，可用杂交抗体进行局部介入治疗的方式治疗癌症。

多克隆抗体的生产可用人HCCA1蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白及其抗体，通过各种常规筛选方法，可筛选出与HCCA1蛋白发生相互作用的物质，如与其功能密切相关的相互作用蛋白、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或其作用蛋白等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，如那些在脑和肺等组织中表达低下而导致某些疾病状态的治疗，而该多肽的拮抗剂可用于肿瘤尤其是肝癌方面的治疗。在使用本发明HCCA1蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明HCCA1多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的HCCA1蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人HCCA1蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于HCCA1蛋白的无表达或异常/无活性的HCCA1蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的HCCA1蛋白(尤其是改变其蛋白质-蛋白质相互作用结构域和磷酸化修饰位点)，以抑制(或竞争性抑制)内源性的HCCA1蛋白活性而阻止HCCA1的细胞内信号传导。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将HCCA1基因转移至细胞内。构建携带HCCA1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.“分子克隆”)。另外重组人HCCA1基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人HCCA1 mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人HCCA1蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人HCCA1蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人HCCA1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人HCCA1蛋白水平，可以用作解释人HCCA1蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断HCCA1蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在HCCA1蛋白的方法是利用HCCA1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与HCCA1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在HCCA1蛋白。

HCCA1蛋白的多聚核苷酸可用于HCCA1基因相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，HCCA1蛋白的多聚核苷酸可用于检测HCCA1基因的表达与否或在疾病状态下HCCA1基因的异常表达。如HCCA1 DNA序列可制备成特异性探针用于对活检标本的杂交以判断HCCA1基因的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用HCCA1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测HCCA1蛋白的转录产物。

检测HCCA1基因的突变也可用于诊断HCCA1蛋白相关的疾病。HCCA1蛋白突变的形式包括与正常野生型HCCA1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR(SSCP)和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明HCCA1蛋白的cDNA(位于3′-UTR序列)设计并合成PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人源胎盘cDNA文库(该文库可从有关公司购得)中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为2702个碱基，其开放读框位于320-2479位，编码全长为719个氨基酸的人HCCA1蛋白(SEQID NO：2)。该HCCA1蛋白是一种肝癌高表达蛋白，HCCA1在肝癌中的表达率高达90.8％，而在癌旁肝组织的表达率和表达水平极低。由于HCCA1在肝癌中的很高表达率，明显高于目前用于肝癌诊断的AFP(其检出率约50-60％)，因此HCCA1多核苷酸、HCCA1蛋白及其抗体，以及HCCA1蛋白相关的拮抗剂、激动剂等可为治疗包括肝癌等多种疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.人肝癌组织中高表达基因片段的获得和克隆

新鲜肝癌组织、癌旁肝组织以及正常肝组织标本采用异硫氰酸胍(Sigma公司)法提取总RNA，经RNA变性琼脂糖凝胶电泳鉴定证实所获得的总RNA未被降解而且具有较高的纯度，以此RNA作为模板合成cDNA第一链和第二链(采用Clontech公司cDNA合成试剂盒)，3’-端锚定引物为Oligo dT₁₁MC，5′-端随机引物为5′-AATCGGGCTG-3′(AP2)。

逆转录(RT)反应管组成(总20μl)含1μg总RNA和2.5μM Oligo dT₁₁ MC引物，70℃反应10min；冰浴2min后，加入1μM DTT，0.2mM dNTP混合物，1×逆转录反应缓冲液，5U逆转录酶，20U RNA酶抑制剂，在37℃反应1h，最后在70℃加热15min终止反应分装后保存于-80℃。

PCR扩增反应管组成(总20μl)含取1μl逆转录反应产物，2.5μM Oligo dT MC和AP2，0.2mM dNTP混合物，10μCi α-³²P-dATP，1.25mM MgCl₂和2.5U Taq酶。PCR扩增的循环参数和程序为：94℃，5min→94℃，1min，40℃，2min，72℃，1min 20s，40循环→72℃，8min。PCR产物经6％测序胶电泳分离，放射自显影显示差异表达的基因片段，与测序胶严格对位后扣出含目的基因片段的凝胶，加100μl ddH₂O煮沸15min，离心，上清用等体积酚/氯仿各抽提一次，加2.5倍体积无水乙醇和1/10体积3 M NaAc，混合后置-20℃ 1h，13000×g离心15min，用预冷70％乙醇洗2次，沉淀物重悬于10μl ddH₂O，-80℃保存备用。

为了进一步进行基因克隆的需要，将首轮PCR产物进行二次PCR扩增，扩增反应除了模板为首轮PCR扩增并经分离纯化的产物以及反应体系中未加α-³²P-ATP外，其他条件同首轮PCR反应相同。二次PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，其大小被确定与测序胶显示的目标片段大小相同，即成功进行了二次PCR扩增。

将此片段用QIAEX II kit(GIAGEN公司)进行纯化，纯化产物克隆到pGEM-T easyvector(Promega公司)。

连接反应管的组成：

	μl/反应管
		T4 DNA Ligase 10×缓冲液	1.0
PGEM-T Vector(3kb，50ng)	1.0
		PCR产物(～500bp，20～30ng)	7.0
T4 DNA Ligase(3Weiss units)	1.0
		总体积	10.0

混合，4℃反应过夜。

连接产物转化大肠杆菌JM-109，氨苄青霉素和X-Gal筛选，白色菌落可能为成功转化了重组质粒的菌株，选取多个白色菌落(设立蓝色菌落为对照)直接或抽提质粒后进行PCR扩增和鉴定，引物为根据载体两侧SP6和T7序列合成。

用于鉴定的PCR反应管的组成如下：

	μl/反应管
		ddH2O	8.5
质粒DNA(～25ng)	1.0
		2mM dNTP	2.0
10×缓冲液	2.0
		25mM MgCl2	2.0
T7(10μg/ml)	2.0
		SP6(10μg/ml)	2.0
Taq(5U/μl，Promega)	0.5
		总体积	20.0

PCR扩增的循环参数和程序为：94℃，5min→94℃，40s，56℃，50s，72℃，1min，共40循环→72℃，8min。

获得的重组阳性克隆经Pst I和Xho I酶切重新获得该基因片段，纯化后用随机引物(Prime-a-Gene kit，Promega公司)法制备成特异性探针，用Northern杂交进一步确证其在肝癌及癌旁组织中的差异表达。

实施例2.从人源胎盘cDNA文库钓取全长基因、测序和序列分析

筛选表达文库：人胎盘cDNA文库(λZAP噬粒)按每盘3×10⁴铺盘20盘(宿主菌为SOLR细胞)，噬菌斑转于NC膜，经碱变性后用上述制备的特异性探针进行杂交、洗膜、放射自显影，对阳性噬斑进行第二轮和第三轮筛选，然后用辅助噬菌体M13进行删切释放pBluescript质粒，宿主菌更换成JM-109再转化一次。具体如下：

(1)宿主菌(XL-1 blue)复苏

挑取XL-1 blue单菌落

         ↓

50ml LB+500μl麦芽糖(20％)+500μl MaSO₄(1M)

         ↓

37℃，250rpm，培养过夜

         ↓

4℃，4000rpm，10min

         ↓

       弃上清

         ↓

10ml MgSO4(10mM)+100μl Maltose(20％)重悬

         ↓

测定OD₆₀₀，分装，4℃保存(1OD₆₀₀＝8×10⁸)

(2)噬菌体滴度测定

[1]用PSB稀释噬菌体：1∶10，1∶100，1∶1000置4℃备用

1M Tris-HCl pH7.5 10ml  10mM

NaCl                 5.8g  0.1M

MgCl₂                2.0g  10mM

Gelatin              0.5g  1.67mM

PSB                 1000ml(终体积)

[2]铺LB琼脂盘(1.5％，90mm，30ml/盘×4个)

[3]滴度测定

200μl XL-blue菌液(0.5OD₆₀₀)+10μl各稀释度的噬菌体

               ↓

37℃水浴摇床孵育15-30min

            ↓

加3ml顶层琼脂(0.6％，50℃保温)

            ↓

    铺于底层LB琼脂上

            ↓

    37℃温箱孵育5小时

            ↓

计算培养皿中单个噬菌斑的数量

(3)铺盘扩增文库

[1]准备LB琼脂(1.5％，150mm，80ml/盘×20个)

[2]扩增(×20管)

800μl XL-blue(0.7OD₆₀₀)+10μl噬菌体(3×10⁴pfu/盘)

                 ↓

        37℃温浴15-30min

                 ↓

    9ml Top-agar(0.6％，～50℃)

                 ↓

铺于底层琼脂上，培RT5-20min，37℃培养过夜

                        ↓

            次日置4℃平衡2h

(4)转膜

                NC膜编号

                  ↓

NC膜置顶层琼脂1min，带墨水针头三点定位

                  ↓

[1]变性：1.5M NaCl+0.5M NaOH，250ml，1-5min

[2]中和：1.5M NaCl+0.5M Tris-HCl(PH7.5)，250ml，5min

[3]漂洗：2×SSC，250ml，10-30min→DNA面朝上凉干

[4]烤膜：覆以滤纸，80℃，2小时

(5)探针标记(随机引物法)、预杂交、杂交(36h)同Northern印迹

(6)压片与曝光：将洗好的膜晾干后用盖革氏记数器检测，记数应在5-10cpm之间。将膜固定于滤纸上，用保鲜膜包裹再固定于增感屏上并贴上荧光尺，压X光片于-70℃曝光48小时。

(7)扣取含阳性噬菌斑的琼脂(设阴性对照)

                     ↓

1ml PSB+20μl氯仿，振荡30min，置4℃12h

                ↓

              滴度测定

                ↓

(8)第二轮(1000噬菌体/盘)、第三轮筛选(50-100噬菌体/盘)

                ↓

(9)质粒删切

800μl XL-blue(0.7OD)+100μl噬菌体(5×10⁵pfu)+1μl辅助噬菌体(＞10⁶)

                ↓

        37℃温浴15-30min

                ↓

    70℃加热20min以灭菌

                ↓

离心4000g×15min，上清转入新管，4℃保存备用

                ↓

噬菌体10μl(1×10⁵)+新鲜SOLR细胞(OD 1.0)200μl，37℃，15min

                ↓

铺LB-氨苄青霉素平板，37℃培养过夜

                ↓

    氨苄青霉素筛选获得阳性质粒

经过三轮筛选后，获得8个阳性克隆，纯化质粒用EcoR I和Xho I酶切，1％琼脂糖凝胶电泳分离、Southern转膜、杂交进行确证。

测序、同源性比较和蛋白质序列分析：用T3、T7以及合成的内侧引物，采用3700型全自动测序仪(PE Biosystems公司)进行测序。分析cDNA序列以确定其是否为全长基因，用PcGene软件分析开放读框，核酸和蛋白质序列进入EMBL/Genbank/DDBJ数据库检索进行同源性比较，用DNATools 5.1、Tmpred、ScanProsite、NetPhos 2.0、Smart、Prodom和eMotif等软件分析蛋白质的结构域。

8个阳性克隆(经Southern杂交确证)均进行测序，测序结果表明其中最长的克隆其大小与Northern分析获得的转录子大小相同，该质粒为HCCA1/pBluescript SK，基因序列如SEQ ID NO：1所示，其长度为2702 bp，3′-UTR含226bp，有一个含22bp poly(A)尾，其上游18bp处有一加尾信号(AATAAA核心序列)，5′-UTR含319bp，从320bp至2476bp为一开放读框，编码719氨基酸，起始子上游-1，-3，-6和-9nt为嘧啶碱基，上游有3个终止子，符合典型的Kozak标准，这证明所获得的基因为一全长cDNA，该基因命名为HCCA1。核酸和氨基酸序列进入EMBL/Genbank/DDBJ基因数据库检索，检索结果未发现已知同源基因。综上所述，证明本研究所获得的基因为一全长序列的新基因，该基因送入EMBL/Genbank/DDBJ基因数据库，登录号为AF203474，因申请保密，基因序列在本申请之前未公开。

该基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(图1)，分子量为79.5kDa，pI值为8.22，含45.5％疏水性氨基酸，31.0％亲水氨基酸，13.4％碱性氨基酸和10.2％酸性氨基酸。该基因富含脯氨酸，脯氨酸总含量达11.0％，显著高于一般基因4.6％的脯氨酸含量，尤其重要的是在C-端含有2个典型的SH3结合结构域，其核心序列为PXPXXP，如下所示为P1(PHPIQP)和P2(PIPST^*P)，后者的T^*(苏氨酸)又可能是CK-II的磷酸化修饰位点。另外，该基因含有多个修饰位点包括糖基化、豆蔻酰化和磷酸化。HCCA1氨基酸序列和结构分析(ScanProsite和NetPhos 2.0)报告如下：

            修饰位点        核心序列

糖基化      N₃₂₃            AMTG

豆蔻酰化    G₃₂₂            GNMTGT

            G₄₃₉            GVSGGE

            G₅₃₇            GGGCNM

            G₅₈₉            GNSVNL

PKC磷酸化   S₆₀             KKPSAKQ

            T₁₇₉            PHKTVKK

            T₂₀₀            ILATSKKV

            T₂₄₅            ARQLTVRIK

            S₅₀₀            RRPSKRR

            T₅₃₀            VPATTVKIV

PKA磷酸化   T₂₄₅            RQLTVRI

            S₃₇₉            KRSSVLK

            S₄₆₂            RTSFPL

            S₅₀₀            RRPSKRR

            T₆₇₀            RWTVVK

PKG磷酸化   S₆₀             KKPSAKQ

            S₃₇₉            KRSSVLK

            S₅₀₀            RRRPSKRR

CKI磷酸化   T₁₇₉            SPHKTVKK

            S₃₀₆            SLPSIQE

            S₃₄₅            SELGSETR

            S₄₀₅            TPAQSTHS

            S₄₄₅            SGGESFES

            S₄₆₆            SFPLSESQ

            S₄₈₈            SPASSMFR

            S₆₃₇            SPLSATV

            S₆₆₅            SENSAYR

                T₆₇₄                TVVKTEEG

                S₆₉₅                SLNNSSPG

                S₇₁₆                TEEISGFL

CK II磷酸化     S₃₀₆                ASLPSTQEE

                T₄₀₆                PAQSTHSEA

                S₄₄₁                PLGVSGGES

                S₆₉₆                NNSSPGD

GSK3磷酸化      T₁₃₁                ELGTFAQS

                S₁₆₇                EDFSTHVS

                S₁₇₁                THVSIDCS

                T₃₂₈                TGTTEINS

                S₃₄₁                KDNSELGS

                S₃₉₁                PSPSLQPS

                T₄₀₁                PGKTPAQS

                S₄₄₁                LGVSGGES

                S₄₅₂                ARTSFPLS

                T₄₇₀                ESQTLLSS

                S₄₈₄                MMPSPASS

                S₆₉₁                IQESLNNS

                T₇₁₂                EDATEEIS

p34cdc2磷酸化   S₁₇₅                IDCSPHK

CaMII磷酸化     T₂₄₅                RQLTVRI

                S₅₀₀                RRPSKRR

酪氨酸磷酸化    Y₂₃₄                KAEDNKYLLTC

                Y₃₄₉                SETRYPLLL

实施例3.可经RT-PCR从肝癌组织中获得HCCA1编码序列的多核苷酸

1.引物

引物1：5′-GCGAATTCATGGGATTCTCCAACATGG-3′(SEQ ID NO：7)

引物2：5′-CGCTCGAGCAGACTCTTATTCTCCTAG-3′(SEQ ID NO：6)

在两头分别加入EcoR I和Xho I接头。

2.RT

逆转录(RT)反应管组成(总20μl)含1μg总RNA和2.5μM引物2，70℃反应10min；冰浴2min后，加入1μM DTT，0.2mM dNTP混合物，1×逆转录反应缓冲液，5U逆转录酶，20U RNA酶抑制剂，在37℃反应1h，最后在70℃加热15min终止反应分装后保存于-80℃。

3.PCR扩增、克隆及测序

扩增反应管组成(总100μl)含取5μl逆转录反应产物，2.5μM引物1和引物2，0.2mM dNTP混合物，1.25mM MgCl2和2.5U Taq酶。PCR扩增的循环参数和程序为：94℃，5min→94℃，1min，56℃，1min，72℃，1min 20s，35循环→72℃，8min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，用QIAEX II kit(GIAGEN公司)进行纯化，纯化产物构建于克隆载体pBluescript SK，或表达载体pGEX-5X-1或pcDNA3等，重组体进行测序确证。

实施例4.Northern杂交分析研究HCCA1在人正常组织中的分布以及在肝癌和一系列肝肿瘤细胞系及一胚胎肝细胞系中表达的变化

Northern杂交分析：用随机引物法(Prime-a-gene，Promega公司产品，标记反应按说明书进行)制备全长HCCA1 cDNA探针。组织和细胞RNA样品(40μg/泳道)进行甲醛变性胶电泳、转膜、杂交，严谨洗膜后进行放射自显影。用PhospherImager分析系统对杂交结果进行分析，杂交信号强度用RNA上样18s的相对灰度值进行校正。

结果表明，HCCA1 mRNA正常分布于脑、肺和肌肉，胃肠道仅微弱表达于小肠，正常肝和胰不表达。65例原发性肝癌细胞癌(HCC)患者，91.5％HCCA1在肝癌组织中高表达，12.3％癌旁组织弱表达(如图2所示，各L泳道为癌旁肝组织；各K泳道为肝癌组织)。与病理指标关系的研究表明，肝癌组织及癌旁组织均有表达的患者，癌组织HCCA1的表达水平明显高于癌旁组织不表达的患者，该基因与癌栓形成有关，表明可能与肝癌的浸润有关。另外，HCCA1 mRNA在多种肝癌肿瘤细胞系(Hep G2，Huh-7和SK-Hep1等)均呈高表达。

实施例5.原核表达载体的构建和融合蛋白的制备

1.表达载体pGEX-5X-1

pGEX-5X-1为一种可市售的GST融合载体(Pharmacia公司)，其结构特点为：在紧挨多克隆位点前的一段短的DNA编码GST融合蛋白，其前端含有tac启动子可被IPTG诱导，表达产物含有凝血因子Xa的识别序列，经Xa因子酶切可获得所表达的目的蛋白。

2.HCCA1蛋白编码区多核苷酸的获得与亚克隆

HCCA1 N-端174氨基酸的基因片段用PCR扩增，5′-端和3′-端引物分别为

P1：5-′GCGAATTCATGGGATTCTCCAACATG-3′(SEQ ID NO：3)

P2：5-′CGCTCGAGGCAGTCAATGCTGACATG-3′(SEQ ID NO：4)

HCCA1 C-端199氨基酸的基因片段用PCR扩增，5′-端和3′-端引物分别为

P3：5-′GCGAATTCGTTATCTTCACTGTTCCTG-3′(SEQ ID NO：5)

P4：5′-CGCTCGAGCAGACTCTTATTCTCCTAG-3′(SEQ ID NO：6)

HCCAI蛋白氨基酸全部编码区多核苷酸用PCR扩增，5′-端和3′-端引物分别为

P5：5′-GCGAATTCATGGGATTCTCCAACATGG-3′(SEQ ID NO：7)

P6：5′-CGCTCGAGCAGACTCTTATTCTCCTAG-3′(SEQ ID NO：6)

在两头分别加入EcoR I和Xho I接头。

PCR反应管的组成如下：

	μl/反应管
		ddH2O	73.5
质粒HCCA1/pBluescript SK(25ng)(模板)	1.0
		2.5mM dNTPs	8.0
10×PCR缓冲液	10.0
		25Mm MgCl2	5.0
50μM(P1和P2)或(P3和P4)或(P5和P6)	1.0
		5U/μl Taq	0.5
总计	100.0

PCR扩增的循环参数和程序为：94℃，5min→94℃，50s，56℃，1min，72℃，1min20s，共30个循环→72℃，8min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，用QIAEX II kit(GIAGEN公司)进行纯化，纯化产物亚克隆于pGEX-5X-1，重组体进行测序确证。

3.融合蛋白的表达、鉴定与纯化

上述重组质粒转化大肠杆菌BL-21，阳性克隆在含氨苄青霉素的LB培养基培养，1mM IPTG于30℃诱导4h。表达产物经8％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色鉴定。高表达菌株进行大量培养，用同样的条件进行诱导，收集细胞，冰上裂解30min(裂解液：50mM Tri-HCl，pH8.0；150mM NaCl；1mg/ml溶菌酶；5mM EDTA；0.5mM PMSF；0.2μg抑蛋白酶肽(aprotinin))，超声处理5min(80％强度，0.8频率)，加1％Triton X-100，冰浴15min，15,000rpm离心1h，取上清加2ml GST-bead，冰浴并间断振摇混匀2h，上亲和层折柱洗脱(洗脱液：50mM Tris-HCl，pH8.0；1mM DTT；10mM谷胱苷肽)。得到纯化的HCCA1-GST融合蛋白。

实施例6.特异性抗体的制备

抗体制备、纯化和鉴定：将实施例4中获得的经GST亲和层析纯化的蛋白质，皮下注射免疫成年雄性新西兰兔，按1mg，0.5mg，0.25mg和0.1mg递减的剂量，每2周加强1次，8周后取血，免疫前取血1次作为对照。首次免疫1周后可见局部反应明显，有硬结和溃疡，8周后取股动脉血，分离血清，1％琼脂糖双向凝胶扩散试验可见反应后的沉淀线，抗血清滴度为1∶16，Western杂交证明其有较好的特异性。

实施例7.真核表达载体的构建、细胞转染、表达与鉴定

(1)人源胚胎肾纤维细胞系K293细胞瞬时转染和过表达：

全长HCCA1 cDNA克隆(HCCA1/pBluesript)用EcoR I和Xho I，纯化后构建于pcDNA3表达载体，转化大肠杆菌XL1-blue或JM109，常规抽提质粒(用Promega公司提供的试剂盒)。K293细胞培养于10％小牛血清DMEM培养基(37℃，5％CO₂培养箱)，细胞生长至70％进行转染，加纯化质粒2μg用FuGENE^TM 6(Boehringer Mannheim公司)转染试剂转染，空载体作为对照。转染后继续培养30h以获得蛋白过表达，弃培养液用PBS洗1次，于冰上进行细胞裂解(裂解液：50mM HEPES，pH7.5；150mM NaCl；1mMEDTA；10mM NaF；10mM焦磷酸钠；40μM过钒酸钠；1μg/ml aprotinin；0.5mM PMSF；10％甘油；1％Triton-X 100)，裂解物分装后储于-80℃以备进一步检测。

(3)Western杂交：

细胞裂解物用8％SDS-PAGE电泳，转印于NC膜(转移缓冲液：39mM甘氨酸，48mM Tris，0.037％SDS，20％甲醇)，丽春红染色1min标记蛋白Marker的位置，用封阻剂(50mM Tris，pH7.5；150mM NaCl；5mM EDTA；0.05％Triton-X100；0.25％gelatin)预杂交30min，制备的一抗按1∶1000加入，室温杂交1h，封阻剂漂洗两次(15min/次)，辣根过氧化酶抗兔二抗按1∶10000室温杂交1h，封阻剂再漂洗两次(15min/次)后，用ECL反应1min，Kodak X曝光15s至2min进行放射自显影。

结果是构建的真核表达载体HCCA1/pcDNA3转染了K293细胞后，成功获得了蛋白表达，其分子大小与理论上推测的分子量相符。

实施例8.HCCA1 Ab的应用研究

免疫组化：肝癌标本石蜡切片(厚5mm)或培养于盖玻片上的多种肝癌细胞系以及一来源于正常胚胎肝细胞系WRL68，用实施例5中制备的抗HCCA1的特异性抗体，按ABC法(华美公司ABC试剂盒，操作按说明进行)检测蛋白水平的表达和细胞定位。

免疫组化证实HCCA1表达于肝癌组织，癌旁肝组织不表达(图3)。在多种肝癌细胞系以及一来源于正常胚胎肝细胞系WRL68也可见HCCA1蛋白表达，HCCA1蛋白定位于胞浆。

实施例9.原位杂交

对多种肝癌细胞系以及一来源于正常胚胎肝细胞系WRL68进行了原位杂交检测HCCA1 mRNA的表达。应用HCCA1 cDNA 3 ′-端500bp经SP6 RNA聚合酶逆转录合成的反义cRNA探针，经T7 RNA聚合酶逆转录合成的正义cRNA探针作为对照。研究方案如下：

1.用于体外转录cRNA的线性化DNA模板的制备

HCCA1/pGEM T

        ↓

    Apa I酶切

        ↓

       纯化

        ↓

溶于DEPC处理水(0.5μg/μl)

2.地高辛cRNA探针的制备

        转录缓冲液                    1×

        DTT                           10mM

        RNasin                        20U

        NTP

          ATP                        1mM

          CTP                        1mM

          GTP                        1mM

          UTP                        0.65mM

          DIG-16-UTP                 0.35mM

        BSA  成分V                   3μg

        线性化HCCA1 cDNA模板         0.5μg

        SP6或T7 RNA聚合酶            20U

        总体积                       20μl

                        ↓

                    40℃水浴2h

                        ↓

                    DNase消化10min(37℃)

                        ↓

                    探针纯化

                        ↓

        溶于10μl重蒸水(DEPC处理)+20U RNasin

                        ↓

        取1μl 1％琼脂糖凝胶鉴定，其余-20℃保存备用

3.原位杂交

        细胞爬片经0.1M PBS(pH7.2，DEPC处理)洗3次

                        ↓

            4％PFA/PBS固定20min

                        ↓

        PBS(pH7.2，DEPC处理)，5min×3次

                        ↓

            0.1M甘氨酸/PBS×5min

                        ↓

        0.4％Triton X-100/PBS×15min

                        ↓

        1μg/ml蛋白酶K，37℃，30min

                        ↓

                4％PFA/PBS固定5min

                        ↓

        PBS(pH 7.2，DEPC处理)，5min×2次

                        ↓

                0.25％乙酸酐处理10min

                        ↓

                    2×SSC冲洗10min

4.杂交及显色            ↓

            加入杂交液(含探针0.5μg/ml)

            去离子甲酰胺            50％

            硫酸葡聚糖              10％

            Denhardt                1x

            Tris-HCl(pH8.0)         10mM

            NaCl    0.3M

            EDTA(pH8.0)             1mM

            ssDNA                   10mM

                    ↓

            43℃，12-16h(湿盒)

                    ↓

            4×SSC，37℃洗15min

                    ↓

    2×SSC，20μg/ml RNaseA，37℃，30min

                    ↓

            1×SSC，37℃洗15min

                    ↓

        0.5×SSC，37℃洗15min×2次

                    ↓

            0.05M PBS，5min×3次

                    ↓

            地高辛抗体(1∶1000)

                1％BSA

                0.4％Triton X-100

                0.05M PBS

                    ↓

                室温，4h

                    ↓

            0.05M PBS，5min×2次

                ↓

            TSM1，5min×2次

            Tris-HCl(pH8.0)0.1M

                NaCl                 0.1M

                MgCl2                10mM

                ↓

          TSM2，5min×2次

            Tris-HCl(pH9.5)0.1M

                NaCl                 0.1M

                MgCl2                50mM

                ↓

            显色反应(用TSM2配)

            NBT                      0.4mg/ml

            BCIP                     0.2mg/ml

                ↓

            室温显色3h

                ↓

        0.05M PBS，5min×2次

                ↓

        100％乙醇，15min×2次

                ↓

        二甲苯，15min×3次

                ↓

            中性树胶封片

结果：HCCA1 mRNA在多种肝癌细胞系以及一来源于正常胚胎肝细胞系表达，可见蓝色阳性信号位于细胞胞浆。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

(1)一般信息：

(ii)发明名称：新的肝癌高表达基因、其编码的蛋白及其应用

(iii)序列数目：7

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：2702bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

GGCACGAGAA CGATCCCAGT GTCGGTTGCG GGATCCGCCT CCTCTCAGTT TGCCCCTTTA  60

GCCCTCCACC TTTCCCTTCT CCTCTCTCGC ATTTCCGCCA GTCGGCTTAC CCGCTGGCCG  120

CCTCCTGACA AGCGGGAGGG ATCCGCGGTG GACCCAGGGA AGCGGAGGAG CCTGGCGGCC  180

ACCCCCTCTT CCTCACTTCC CTGTACTCTC ATCGCTCTCG GCCTCCGACA CGAAAAGGAA  240

GCAAATGAGC TGATGGAAGA TCTGTTTGAA ACTGTGAGTA ATGATCCTCA AGTGAGAACA  300

TGGGATTTTC CAAGATGAGA TGGGATTCTC CAACATGGAA GATGATGGCC CAGAAGAGGA  360

GGAGCGTGTG GCTGAGCCTC AAGCTAACTT TAACACCCCT CAAGCTCTAC GGTTTGAGGA  420

ACTACTGGCC AACCTACTAA ATGAACAACA TCAGATAGCG AAGGAACTAT TTGAACAGCT  480

GAAGATGAAG AAACCTTCAG CCAAACAGCA GAAGGAGGTA GAGAAGGTTA AACCCCAGTG  540

TAAGGAAGTT CATCAGACCC TGATTCTGGA CCCAGCACAA AGGAAGAGAC TCCAGCAGCA  600

GATGCAGCAG CATGTTCAGC TCTTGACACA AATCCACCTT CTTGCCACCT GCAACCCCAA  660

TCTCAATCCG GAGGCCAGTA GCACCAGGAT ATGTCTTAAA GAGCTGGGAA CCTTTGCTCA  720

AAGCTCCATC GCCCTTCACC ATCAGTACAA CCCCAAGTTT CAGACCCTGT TCCAACCCTG  780

TAACTTGATG GGAGCTATGC AGCTGATTGA AGACTTCAGC ACACATGTCA GCATTGACTG  840

CAGCCCTCAT AAAACTGTCA AGAAGACTGC CAATGAATTT CCCTGTTTGC CAAAGCAAGT  900

GGCTTGGATC CTGGCCACAA GCAAGGTTTT CATGTATCCA GAGTTACTTC CAGTGTGTTC  960

CCTGAAGGCA AAGAATCCCC AGGATAAGAT CCTCTTCACC AAGGCTGAGG ACAACAAGTA  1020

CCTTCTAACC TGCAAGACTG CCCGCCAACT GACAGTGAGA ATCAAGAACC TCAACATGAA  1080

CAGAGCTCCT GACAACATCA TTAAATTTTA TAAGAAGACC AAACAGCTGC CAGTCCTAGG  1140

AAAATGCTGT GAAGAGATCC AGCCACATCA GTGGAAGCCA CCTATAGAGA GAGAAGAACA  1200

CCGGCTCCCA TTCTGGTTAA AGGCCAGTCT GCCATCCATC CAGGAAGAAC TGCGGCACAT  1260

GGCTGATGGT GCTAGAGAGG TAGGAAATAT GACTGGAACC ACTGAGATCA ACTCAGATCA  1320

AGGCCTAGAA AAAGACAACT CAGAGTTGGG GAGTGAAACT CGGTACCCAC TGCTATTGCC  1380

TAAGGGTGTA GTCCTGAAAC TGAAGCCAGT TGCCGACCGT TTCCCCAAGA AGGCTTGGAG  1440

ACAGAAGCGT TCATCAGTCC TGAAACCCCT CCTTATCCAA CCCAGCCCCT CTCTCCAGCC  1500

CAGCTTCAAC CCTGGGAAAA CACCAGCCCA ATCAACTCAT TCAGAAGCCC CTCCGAGCAA  1560

AATGGTGCTC CGGATTCCTC ACCCAATACA GCCAGCCACT GTTTTACAGA CAGTTCCAGG  1620

TGTCCCTCCA CTGGGGGTCA GTGGAGGTGA GAGTTTTGAG TCTCCTGCAG CACTGCCTGC  1680

TATGCCCCCT GAGGCCAGGA CAAGCTTCCC TCTGTCTGAG TCCCAGACTT TGCTCTCTTC  1740

TGCCCCTGTG CCCAAGGTAA TGATGCCCTC CCCTGCCTCT TCCATGTTTC GAAAGCCATA  1800

TGTGAGACGG AGACCCTCAA AAAGAAGGGG AGCCAGGGCC TTTCGCTGTA TCAAACCTGC  1860

CCCTGTTATC CACCCTGCAT CTGTTATCTT CACTGTTCCT GCTACCACTG TGAAGATTGT  1920

GAGCCTTGGC GGTGGCTGTA ACATGATCCA GCCTGTCAAT GCGGCTGTGG CCCAGAGTCC  1980

CCAGACTATT CCCATCGCCA CCCTCTTGGT TAACCCTACT TCCTTCCCCT GTCCATTGAA  2040

CCAGCCCCTT GTGGCCTCCT CTGTCTCACC CTTAATTGTT TCTGGCAATT CTGTGAATCT  2100

TCCTATACCA TCCACCCCTG AAGATAAGGC CCACATGAAT GTGGACATTG CTTGTGCTGT  2160

GGCTGATGGG GAAAATGCCT TTCAGGGCCT AGAACCCAAA TTAGAGCCCC AGGAACTATC  2220

TCCTCTCTCT GCTACTGTTT TCCCCAAAGT GGAACATAGC CCAGGGCCTC CACCAGTCGA  2280

TAAACAGTGC CAAGAAGGAT TGTCAGAGAA CAGTGCCTAT CGCTGGACCG TTGTGAAAAC  2340

AGAGGAGGGA AGGCAAGCTC TGGAGCCGCT CCCTCAGGGC ATCCAGGAGT CTCTAAACAA  2400

CTCTTCCCCT GGGGATTTAG AGGAAGTTGT CAAGATGGAA CCTGAAGATG CTACAGAGGA  2460

AATCAGTGGA TTTCTTTGAG CTAGGAGAAT AAGAGTCTGG AGACTGGGAG CCTTCACTTC  2520

GGCCTCCGAT TGGTGGCGCA TAGGGTGTAA CCAATAGGAA ACCCCTAAAG GGTACTTAAA  2580

CCCCAGATTT TGCAACTGGG GCTCTTGAGC AGCTTGCTTT AGCCTGCTCC CACTCTGTGG  2640

AATATACTTT TGCTTCAATA AATCTGTGCT TTTATTGCTT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA  2700

AA                                                                 2702

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：719个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

MGFSNMEDDG PEEEERVAEP QANFNTPQAL RFEELLANLL NEQHQIAKEL  50

FEQLKMKKPS AKQQKEVEKV KPQCKEVHQT LILDPAQRKR LQQQMQQHVQ  100

LLTQIHLLAT CNPNLNPEAS STRICLKELG TFAQSSIALH HQYNPKFQTL  150

FQPCNLMGAM QLIEDFSTHV SIDCSPHKTV KKTANEFPCL PKQVAWILAT  200

SKVFMYPELL PVCSLKAKNP QDKILFTKAE DNKYLLTCKT ARQLTVRIKN  250

LNMNRAPDNI IKFYKKTKQL PVLGKCCEEI QPHQWKPPIE REEHRLPFWL  300

KASLPSIQEE LRHMADGARE VGNMTGTTEI NSDQGLEKDN SELGSETRYP  350

LLLPKGVVLK LKPVADRFPK KAWRQKRSSV LKPLLIQPSP SLQPSFNPGK  400

TPAQSTHSEA PPSKMVLRIP HPIQPATVLQ TVPGVPPLGV SGGESFESPA  450

ALPAMPPEAR TSFPLSESQT LLSSAPVPKV MMPSPASSMF RKPYVRRRPS  500

KRRGARAFRC IKPAPVIHPA SVIFTVPATT VKIVSLGGGC NMIQPVNAAV  550

AQSPQTIPIA TLLVNPTSFP CPLNQPLVAS SVSPLIVSGN SVNLPIPSTP  600

EDKAHMNVDI ACAVADGENA FQGLEPKLEP QELSPLSATV FPKVEHSPGP  650

PPVDKQCQEG LSENSAYRWT VVKTEEGRQA LEPLPQGIQE SLNNSSPGDL  700

EEVVKMEPED ATEEISGFL                                    719

(2)SEQ ID NO：3的信息

(i)序列特征

(A)长度：26碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

GCGAATTCAT GGGATTCTCC AACATG                                    26

(2)SEQ ID NO：4的信息

(i)序列特征

(A)长度：26碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

CGCTCGAGGC AGTCAATGCT GACATG                                     26

(2)SEQ ID NO：5的信息

(i)序列特征

(A)长度：27碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

GCGAATTCGT TATCTTCACT  GTTCCTG                                     27

(2)SEQ ID NO：6的信息

(i)序列特征

(A)长度：27碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

CGCTCGAGCA  GACTCTTATT  CTCCTAG                                   27

(2)SEQ ID NO：7的信息

(i)序列特征

(A)长度：27碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID  NO：7：

GCGAATTCAT  GGGATTCTCC AACATGG                                    27

Claims (10)

1.一种分离的人HCCA1蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：

(a)编码如权利要求1所述蛋白的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码序列如SEQ IDNO：2所示的蛋白。

4.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a) SEQ ID NO：1中320-2479位的序列；

(b) SEQ ID NO：1中1-2702位的序列。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞：

(a)用权利要求5所述的载体转化或转导的宿主细胞；

(b)用权利要求2所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

7.一种人HCCA1蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在表达条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出人HCCA1蛋白。

8.一种能与权利要求1所述的人HCCA1蛋白特异性结合的抗体。

9.一种体外检测样品中是否存在HCCA1蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

将样品与权利要求8所述的HCCA1蛋白特异性结合的抗体接触；

观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在HCCA1蛋白。

10.一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，含有权利要求8所述的抗体。

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