CN101289505A

CN101289505A - 骨髓再生调控蛋白brrg-2、其编码基因及其应用

Info

Publication number: CN101289505A
Application number: CNA2007101013884A
Authority: CN
Inventors: 毛文伟; 韩伟; 梁迁
Original assignee: General Regeneratives Ltd
Current assignee: General Regeneratives Ltd
Priority date: 2007-04-20
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2008-10-22

Abstract

本发明公开了一种分离的蛋白BRRG－2，该蛋白具有促进促进骨髓再生的功能。本发明还公开了编码所述蛋白的多核苷酸，生产所述蛋白的方法以及所述蛋白的用途。

Description

骨髓再生调控蛋白BRRG-2、其编码基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域；具体地说，本发明涉及一种新的具有促进骨髓再生功能的蛋白，以及编码该蛋白的基因，本发明还涉及该蛋白的用途和制备方法。

背景技术

骨髓是造血的主要器官，富含多能干细胞。目前，骨髓移植已成为许多疾病的唯一治疗方法，骨髓移植除了可以根治白血病以外，还能治疗其它种类的一些血液病，如再生障碍性贫血、地中海贫血、异常骨髓细胞增生症、遗传性红细胞异常症、血浆细胞异常症等以及淋病系统恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、重症放射病等。近年来世界上接受骨髓移植的病患逐年增加，显示骨髓移植已经成为目前治疗的趋势。

骨髓再生和分化一直是临床上骨髓移植，肿瘤放化疗，以及将来利用骨髓移植进行一些遗传病治疗都要面临的问题。然而，本领域目前对于骨髓再生、分化和迁移的分子机制的了解还不够深入，对于调节骨髓再生、分化和迁移的基因的研究也鲜有报导。

因此，本领域需要进一步了解骨髓再生过程所涉及的基因，从而可以为临床治疗疾病提供新的解决方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有促进骨髓再生功能的蛋白及其编码基因和应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进骨髓再生功能的由(a)衍生的多肽。

在本发明的另一优选例中，该多肽是具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(i)编码所述多肽的多核苷酸；

(ii)与多核苷酸(i)互补的多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在本发明的另一优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞

含有所述的载体；或

基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供一种制备所述的多肽的方法，该方法包含：

(1)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；和

(2)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的第六方面，提供一种所述多肽的用途，用于：

筛选促进骨髓再生的药物；或

制备促进骨髓再生的药物。

在本发明的第一方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物包含：有效量的所述的多肽，以及药学上可接受的载体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了电转正常小鼠后，brrg-2基因对正常小鼠外周血白细胞数(A)、外周血小板数(B)、骨髓细胞数(C)的作用的统计数据曲线图。

图2显示了电转5-氟尿嘧啶抑制小鼠后，brrg-2基因对5-氟尿嘧啶抑制小鼠外周血白细胞数(A)、外周血小板数(B)、骨髓细胞数(C)的作用的统计数据曲线图。

图3显示了brrg-2基因电转后，正常小鼠(A)、5-氟尿嘧啶抑制小鼠(B)集落形成试验结果。

具体实施方式

在本发明中，术语“BRRG-2蛋白”、“BRRG-2多肽”或“骨髓再生调控蛋白BRRG-2”可互换使用，都指具有骨髓再生调控蛋白BRRG-2氨基酸序列(SEQ IDNO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的骨髓再生调控蛋白BRRG-2。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的BRRG-2蛋白或多肽”是指BRRG-2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化BRRG-2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。BRRG-2多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸(Met)残基。

本发明还包括BRRG-2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然BRRG-2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“BRRG-2多肽”指具有BRRG-2蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与BRRG-2蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括BRRG-2蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与BRRG-2的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗BRRG-2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它种类的多肽，如包含BRRG-2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了BRRG-2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有BRRG-2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供BRRG-2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然BRRG-2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如可通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“BRRG-2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Ash	Arg	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Ash	Arg	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码BRRG-2蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的编码BRRG-2蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或BRRG-2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的BRRG-2多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码BRRG-2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，brrg-2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：pcDNA载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含BRRG-2编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的BRRG-2蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于促进骨髓再生或促进骨髓抑制后恢复；用于筛选促进或抑制(优选促进)BRRG-2蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组BRRG-2蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激(优选促进)BRRG-2蛋白功能的多肽分子。

一般在肿瘤放化疗之后会发生骨髓抑制现象，鉴于本发明的BRRG-2蛋白具有促进骨髓抑制后恢复的功能，因此可在受试者放化疗之后给予BRRG-2蛋白，从而有利于尽可能的保护已受损的骨髓细胞，提高其对抗毒副作用的能力。

另一方面，本发明还包括对brrg-2DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于brrg-2基因产物或片段。较佳地，指那些能与brrg-2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制BRRG-2蛋白的分子，也包括那些并不影响BRRG-2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的brrg-2基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的brrg-2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达BRRG-2蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断BRRG-2蛋白功能的抗体以及不影响BRRG-2蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用brrg-2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与brrg-2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗BRRG-2蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的BRRG-2蛋白。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与BRRG-2蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断BRRG-2蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如BRRG-2蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭BRRG-2蛋白阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用BRRG-2蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与BRRG-2蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.00001-20wt％)的本发明BRRG-2蛋白或其激动剂、拮抗剂(优选激动剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的BRRG-2蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

BRRG-2蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。例如，重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的BRRG-2蛋白，以抑制内源性的BRRG-2蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将BRRG-2基因转移至细胞内。构建携带BRRG-2基因或其变异体的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组brrg-2基因或其变异体可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与BRRG-2蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对BRRG-2蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测BRRG-2蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的BRRG-2蛋白水平，可以用作解释BRRG-2蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断BRRG-2蛋白起作用的疾病。

一种检测样品中是否存在BRRG-2蛋白的方法是利用BRRG-2蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与BRRG-2蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在BRRG-2蛋白。

BRRG-2蛋白的多聚核苷酸可用于BRRG-2蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，BRRG-2蛋白的多聚核苷酸可用于检测BRRG-2蛋白的表达与否或在疾病状态下BRRG-2蛋白的异常表达。如BRRG-2DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断BRRG-2蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法、Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用BRRG-2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测BRRG-2蛋白的转录产物。

检测BRRG-2基因的突变也可用于诊断BRRG-2蛋白相关的疾病。BRRG-2蛋白突变的形式包括与正常野生型BRRG-2DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从小鼠骨髓抑制与再生模型获取总RNA，将总RNA反转录获得的cDNA中分离出的。其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为558个碱基(不含终止密码子)，编码全长为186个氨基酸的BRRG-2蛋白。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1基因的获得及制备

本发明人运用基因芯片分析方法，对5-氟尿嘧啶注射引发的小鼠骨髓抑制与再生模型进行了动态基因表达谱检测，成功获得了一张能够反映小鼠骨髓再生过程基因表达的“全景图”。通过这张“全景图”，结合Affymetrix网站免费提供的专用分析软件(http://www.affymetrix.com/support/developer/tools/affytools.affx)，总共找到了31条表达分泌型蛋白的新基因，这些基因的功能都不清楚，但在骨髓抑制和再生的整个过程中，它们的表达水平发生变化。

接着，在前述找到的新基因中，本发明对其中的2号基因进行了重点研究，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，本发明人将之称为brrg-2基因。

本发明人用250mg/kg量的5-氟尿嘧啶注射小鼠，从小鼠骨髓抑制最低点的第7天抽取骨髓细胞总RNA，常规方法反转录为cDNA。接着，利用引物：

5’-ccggaattcaccatgttgcagcagctgtg-3’(SEQ ID NO：3)，

5’-cgcggatcccaagtcttctcgtttccgaag-3’(SEQ ID NO：4)。

进行PCR，获得5’-端携带EcoR I，3’-端携带BamH I酶切位点的brrg-2基因。

用EcoR I/BamHI酶切前述获得的brrg-2基因，克隆入经过同样酶切的pcDNA3.1myc/his tag(-)A质粒(购自Invitrogen)中，获得重组质粒pCDNA3.1/brrg-2；将该重组质粒转化入大肠杆菌DH5α宿主细胞，扩增后大量制备纯化的pcDNA3.1/brrg-2质粒，用于以下的基因活体功能验证。

实施例2brrg-2基因具有促进骨髓再生功能

利用前面制备获得的重组质粒pCDNA3.1/brrg-2注射Balb/c小鼠(周龄介于8-12周，雌雄混合)，每只小鼠胫前肌的质粒注射量为50μg。用微量注射器缓慢注射，然后插入针间距5mm的双针电极电转(美国BTX公司ECM63BTX细胞电穿孔仪)，电转参数为：100V、8次脉冲，每次间隔20ms，脉冲间隔200ms。

并且，设置阳性对照组、空质粒对照组、生理盐水对照组作为比较。其中，阳性对照为电转kit-ligand-pcDNA3.1myc/his tag(-)A质粒(质粒购自Invitrogen；kit-ligand的序列参见GenBank登录号：GI：7305266或者NM_013598，用EcoRI/BamHI酶切后克隆入pcDNA3.1myc/his tag(-)A中)；空质粒对照为电转pcDNA3.1myc/his质粒；电转质粒总量为50μg；生理盐水对照为电转50μL生理盐水。5-氟尿嘧啶抑制小鼠组的5-氟尿嘧啶注射量为250mg/kg，电转时间定在5-氟尿嘧啶注射后第1天。

小鼠外周血采自眼底静脉丛，在MEK6300型全自动血细胞计数仪(日本光电公司)上计数外周血白细胞和血小板数，在血球计数板上计数骨髓细胞，骨髓细胞计数前用0.8％氯化铵破碎红细胞。每只计数细胞的小鼠都预留了股骨和血清，以备在筛查到阳性结果情况下，继续深入检测。如果导入brrg-1基因后，小鼠外周血白细胞数、外周血小板数，骨髓细胞数发生增加，说明brrg-1基因促进骨髓细胞的增殖，分化和/或迁移，反之则抑制骨髓细胞的增殖，分化和/或迁移。

表2和表3列出了brrg-2基因、阳性对照、空质粒对照、生理盐水对照在功能筛查中的细胞计数比较情况。其中，表2为正常小鼠组质粒电转后细胞计数，外周血白细胞数(A)、外周血小板数(B)、骨髓细胞数(C)在各个时间节点的变化。表3为5-氟尿嘧啶抑制小鼠组质粒电转后细胞计数，外周血白细胞数(I)、外周血小板数(II)、骨髓细胞数(III)在各个时间节点的变化。

图1和图2分别是brrg-2基因对正常小鼠和5-氟尿嘧啶抑制小鼠作用的统计数据曲线图，以便于直观比较。统计方法为单尾等方差T检验。

表2

A

B

C

表3

I

II

III

根据统计结果来看，在正常小鼠组，阳性对照第5天外周血白细胞数(8250±1880)显著高于空质粒(5283±584，p＜0.01)和生理盐水(6016±1413，p＜0.05)阴性对照，外周血小板数未见显著差异；骨髓细胞数在第17天(28400000±6096667)和第27天(24700000±3013736)均高于两阴性对照组(空质粒对照、生理盐水对照)，且在第27天和空质粒对照(13800000±3488756，p＜0.01)有显著性差异。在5-氟尿嘧啶抑制小鼠组，阳性对照的骨髓细胞数在第14天外周血白细胞数(6966±4149)和血小板数(317±82)恢复程度都好于空质粒对照(4016±1010，p＝0.06；240±126，p＝0.11)和生理盐水对照(5400±2313，p＝0.12；208±48，p＜0.01)。

brrg-2基因电转正常小鼠后未见到外周血白细胞，血小板和骨髓细胞数目发生显著变化，但第27天的外周血白细胞数(7985±1533)和骨髓细胞数(24000000±3406930)与空质粒对照(5916±2240，p＜0.05；13800000±3488756，p＜0.01)和生理盐水对照(7033±2537，p＝0.21；20400000±7140361，p＝0.13)相比有增高的趋势(图1)；这种趋势在基因电转5-氟尿嘧啶抑制小鼠后第11天和第14天表现得较为充分：第11天和第14天外周血白细胞数(3916±733；6857±1877)与空质粒对照(1550±1306，p＜0.01；4016±1010，p＜0.01)和生理盐水对照(2083±2394，p＝0.05；5400±2313，p＝0.07)相比，具有明显恢复较快趋势；而外周血小板数在第11天(150±64)与空质粒对照(62±60，p＜0.05)和生理盐水对照(63±36，p＜0.01)相比，明显恢复得好，统计有显著性差异；同样，第11天和第14天的骨髓细胞数水平(11000000±4497499，20900000±9137158)与空质粒对照(5360000±5263475，p＜0.05；14500000±6257968，p＝0.08)和生理盐水对照(4970000±7044265，p＝0.05；16400000±7876790，p＝0.11)相比，亦具有恢复较好趋势。

上述结果提示，brrg-2基因具有促进骨髓抑制后恢复的作用，也即可促进骨髓的再生。

实施例3集落形成试验

为了印证以上体内实验的初步结果，本发明人随即对第10天和第17天的正常小鼠，以及第7天和第14天的5-氟尿嘧啶抑制小鼠做了集落形成试验。实验分组和基因电转方法仍然同前，在相应天数处死小鼠，70％酒精浸泡小鼠5分钟以上，无菌条件下冲出股骨骨髓细胞，0.8氯化铵破碎红细胞，计数骨髓有核细胞总数，按10000个细胞/3.5cm平皿铺板，甲基纤维素浓度1.05％，在37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养7天后计数集落。所用细胞因子组合为rhG-CSF10ng+rhEP03U+rmIL-310ng+rmFLt-310ng/平皿。

集落形成试验结果见表4。其中，表4A为正常小鼠组的结果，表4B为5-氟尿嘧啶抑制小鼠组的结果。

结果显示：阳性对照(Kit-Ligand)电转正常小鼠第10天和第17天的骨髓细胞集落形成能力与空质粒对照和生理盐水对照相比均无显著性差异(p＞0.05，表4A)，但第17天集落数均数(53±15)高于空质粒对照和生理盐水对照(42±14；37±14)，反映的趋势与前面骨髓细胞计数一致；这种一致的趋势同样在5-氟尿嘧啶抑制小鼠第7天和第14天的集落形成个数上得到更为清楚的体现(表4B)：阳性对照第7天(46±14)和第14天(204±82)集落均数都高出空质粒对照(34±21，p＝0.12；134±16，p＝0.07)和生理盐水对照(36±11，p＝0.20；118±34，p＝0.08)，这种高的趋势与前面骨髓计数的情况一致。

brrg-2基因电转正常小鼠第10天和第17天的骨髓细胞集落形成能力与对照组相比没有明显不同，与在正常小鼠相同天数骨髓细胞计数结果一致(图3A)；但brrg-2基因电转5-氟尿嘧啶抑制小鼠第7天(57±13)的集落形成能力与空质粒对照(34±21，p＝0.05)和生理盐水对照(36±11，p＜0.05)相比，具有明显增高的趋势，这种趋势到了第14天(230±76vs 134±16，p＜0.05；230±76vs118±34，p＜0.05)表现为统计有显著性增高(图3B)，与在5-氟尿嘧啶抑制小鼠外周血细胞和骨髓细胞变化趋势完全相符。

上述结果进一步提示，brrg-2基因具有明显促进骨髓抑制后恢复的功能，也即可促进骨髓的再生。

表4

A

B

得到这样的结果后，本发明人根据实验记录收集到的brrg-2基因电转5-氟尿嘧啶抑制小鼠第14天死亡率为8.3％(1/12)，阳性对照为12.5％(1/8)，空质粒和生理盐水对照均为14.3％(1/7)，也即brrg-2基因电转后可显著降低5-氟尿嘧啶抑制小鼠的死亡率。该结果进一步反映出brrg-2基因具有促进骨髓抑制后恢复的功能，也即可促进骨髓的再生。

实施例5BRRG-2蛋白变异体

采用常规的定点突变技术，本发明人将SEQ ID NO：2所示的BRRG-2氨基酸序列的第80位的Val残基变异为Ala，构成BRRG-2蛋白变异体(BRRG-2-M)。如前所述类似的方法，在BRRG-2-M蛋白的编码基因的两端加上EcoRI/Bam HI酶切位点，将该基因克隆入经过同样酶切的pcDNA3.1myc/his中，获得重组质粒pCDNA3.1/brrg-2-m。

接着，通过如实施例3所述的集落形成试验验证BRRG-2-M是否也有促进骨髓的再生的功能。

结果显示，brrg-2-m基因电转正常小鼠和5-氟尿嘧啶抑制小鼠后的集落形成能力也显著增高，说明BRRG-2-M保留了BRRG-2的功能，也具有促进骨髓抑制后恢复的功能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>再生医药有限公司

<120>骨髓再生调控蛋白BRRG-2、其编码基因及其应用

<130>071848

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>558

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(558)

<400>1

atg gtt gca gct gtg gcg acg gcg tgg ctg ctc ctg tgg gcc gcg gcc 48

Met Val Ala Ala Val Ala Thr Ala Trp Leu Leu Leu Trp Ala Ala Ala

1 5 10 15

tgc gcg caa tcc gag cag gac ttc tac gac ttc aag gcg gtc aac atc 96

Cys Ala Gln Ser Glu Gln Asp Phe Tyr Asp Phe Lys Ala Val Asn Ile

20 25 30

cgg ggc aag ctg gtg tcg ctg gag aag tac cgt ggc tcg gtt tcc ctg 144

Arg Gly Lys Leu Val Ser Leu Glu Lys Tyr Arg Gly Ser Val Ser Leu

35 40 45

gtg gtg aac gta gct agc gaa tgt ggc ttc aca gac cag aac tac cga 192

Val Val Asn Val Ala Ser Glu Cys Gly Phe Thr Asp Gln Asn Tyr Arg

50 55 60

gcc ttg cag cag ctg cag cgg gac ctg ggc ccc cat cat ttt aat gtg 240

Ala Leu Gln Gln Leu Gln Arg Asp Leu Gly Pro His His Phe Asn Val

65 70 75 80

ctt gcc ttc cct tgc aac cag ttt ggc caa cag gaa cca gac acc aac 288

Leu Ala Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly Gln Gln Glu Pro Asp Thr Asn

85 90 95

agg gag att gag aac ttt gcc cgc cgc acc tac agt gtc tct ttt ccc 336

Arg Glu Ile Glu Asn Phc Ala Arg Arg Thr Tyr Ser Val Ser Phe Pro

100 105 110

atg ttt agc aag atc gca gtc act ggc act ggt gcc cac cct gcc ttc 384

Met Phe Ser Lys Ile Ala Val Thr Gly Thr Gly Ala His Pro Ala Phe

115 120 125

aag tac cta acc cag act tct ggg aag gag ccc acc tgg aac ttc tgg 432

Lys Tyr Leu Thr Gln Thr Ser Gly Lys Glu Pro Thr Trp Asn Phe Trp

130 135 140

aag tac cta gtg gac cca gac gga aag gtg gtg gga gca tgg gac ccc 480

Lys Tyr Leu Val Asp Pro Asp Gly Lys Val Val Gly Ala Trp Asp Pro

145 150 155 160

act gtg cca gtg gcg gag atc aag ccc cgt att aca gag cag gtg atg 528

Thr Val Pro Val Ala Glu Ile Lys Pro Arg Ile Thr Glu Gln Val Met

165 170 175

aaa ctc atc ctt cgg aaa cga gaa gac ttg 558

Lys Leu Ile Leu Arg Lys Arg Glu Asp Leu

180 185

<210>2

<211>186

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2

Met Val Ala Ala Val Ala Thr Ala Trp Leu Leu Leu Trp Ala Ala Ala

1 5 10 15

Cys Ala Gln Ser Glu Gln Asp Phe Tyr Asp Phe Lys Ala Val Asn Ile

20 25 30

Arg Gly Lys Leu Val Ser Leu Glu Lys Tyr Arg Gly Ser Val Ser Leu

35 40 45

Val Val Asn Val Ala Ser Glu Cys Gly Phe Thr Asp Gln Asn Tyr Arg

50 55 60

Ala Leu Gln Gln Leu Gln Arg Asp Leu Gly Pro His His Phe Asn Val

65 70 75 80

Leu Ala Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly Gln Gln Glu Pro Asp Thr Asn

85 90 95

Arg Glu Ile Glu Asn Phe Ala Arg Arg Thr Tyr Ser Val Ser Phe Pro

100 105 110

Met Phe Ser Lys Ile Ala Val Thr Gly Thr Gly Ala His Pro Ala Phe

115 120 125

Lys Tyr Leu Thr Gln Thr Ser Gly Lys Glu Pro Thr Trp Asn Phe Trp

130 135 140

Lys Tyr Leu Val Asp Pro Asp Gly Lys Val Val Gly Ala Trp Asp Pro

145 150 155 160

Thr Val Pro Val Ala Glu Ile Lys Pro Arg Ile Thr Glu Gln Val Met

165 170 175

Lys Leu Ile Leu Arg Lys Arg Glu Asp Leu

180 185

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

ccggaattca ccatgttgca gcagctgtg 29

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

cgcggatccc aagtcttctc gtttccgaag 30

Claims

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽；

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(i)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(ii)与多核苷酸(i)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞

含有权利要求6所述的载体；或

基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

8.一种制备权利要求1所述的多肽的方法，其特征在于，该方法包含：

(1)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；和

(2)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

9.一种权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于：

筛选促进骨髓再生的药物；或

制备促进骨髓再生的药物。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含：有效量的权利要求1所述的多肽，以及药学上可接受的载体。