CN1948335B

CN1948335B - 白念珠菌菌丝调控因子基因及其用途

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Publication number: CN1948335B
Application number: CN200510030527A
Authority: CN
Inventors: 陈江野; 毛旭明
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2005-10-14
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2025-10-14
Also published as: CN1948335A

Abstract

本发明提供了一种新的菌丝调控因子-CaSnf2蛋白，编码CaSnf2蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种CaSnf2蛋白的方法。本发明还公开了编码这种CaSnf2蛋白的多核苷酸的用途。CaSnf2是白念珠菌菌丝生长所必需。免疫共沉淀实验证明CaSnf2因子和CaSwi1因子能够在白念珠菌体内相互作用，这种相互作用不管在菌体还是菌丝条件下都能发生，说明在白念珠菌中存在着CaSwi/Snf复合物调控白念珠菌的形态发生。小鼠系统感染实验表明，casnf2/casnf2缺失株没有毒性，这表明CaSnf2是白念珠菌中一个重要的毒性因子。

Description

白念珠菌菌丝调控因子基因及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码白念珠菌菌丝调控因子CaSnf2的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。更具体地，本发明涉及从白念珠菌的基因组中克隆到白念珠菌菌丝生长和毒性相关因子基因CaSNF2及其用途。

背景技术

白念珠菌也称为白色念珠菌(Candida albicans)，它是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌，在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等疾病，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡(Odds，F.C.1994.J Am Acad Dermatol.31：S2-S5.)。

白念珠菌在不同的生长条件下，呈现不同的生长形态，包括菌体(yeast form)，假菌丝(pseudohyphae)和菌丝(hyphae)。各种形态之间的相互转化能力直接影响白念珠菌的致病能力(Odds，F.C.1985.Crit Rev Microbiol.12：45-93；Brown，A.J.P.et al.1999.TrendsMicrobiol.7：334-338.)，菌丝生长缺陷的菌株其系统感染能力下降或消失(Lo，H.J.et a1，1997.Cell.90：939-949；Braun，B.R.et al.2001.EMBO J.20：4753-61；Hwang，C.S.et al.2003.Mol Microbiol.47：1029-43.)。

许多培养条件可以引起白念珠菌的形态转换，包括血清，温度，pH值，氮源利用以及氧压等等。细胞内调节白念珠菌形态转换的分子机制主要有MAPK途径(mitogen-activaied protein kinase pathway)和cAMP/PKA途径(cAMP-dependent protein kinase Apathway)。同时还发现Cph2介导的，Efg1介导的以及pH应答的信号途径也都和白念珠菌的形态发生相关(Lane，S.et al.2001.Mol Cell Biol.21：6418-28；Stoldt，V.R.，et al.1997.EMBO J.16：1982-1991；El Barkani，A.et al.2000.Mol Cell Biol.20：4635-4647.)。在白念珠菌中还存在抑制效应的信号途径，主要是Tup1介导的信号途径，依靠特异性DNA结合抑制因子Rfg1，Nrg1等来发挥作用(Kadosh，D.et al.2001.Mol Cell Biol.21：2496-2505；Braun，B.R.et al.2001.EMBO J.20：4753-4761.)。

由于白念珠菌会严重威胁人们的身体健康，因此，本领域迫切需要开发与白念珠菌的生长或毒性有关的各种蛋白或因子，以便更好地防治白念珠菌的引起的感染。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的与白念珠菌生长有关的菌丝调控因子CaSnf2蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的CaSnf2多肽，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个((如1-100个，较佳地1-50个，更佳地1-20个，最佳地1-10个))氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，并且具有调控白念珠菌菌丝形成的功能的由(a)衍生的多肽。

更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述白念珠菌CaSnf2多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中1-5070位的序列；(b)具有SEQ IDNO：1中1-5073位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有白念珠菌CaSnf2蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达白念珠菌CaSnf2蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有白念珠菌CaSnf2蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的白念珠菌CaSnf2多肽特异性结合的抗体。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗白念珠菌CaSnf2多肽活性的化合物，以及抑制白念珠菌CaSnf2多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是白念珠菌CaSnf2多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在CaSnf2蛋白的方法，它包括：将样品与CaSnf2蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaSnf2蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与白念珠菌CaSnf2多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。本发明多肽可被用于筛选促进白念珠菌CaSnf2多肽活性的激动剂，或者筛选抑制白念珠菌CaSnf2多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的白念珠菌CaSnf2蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。在一个优选例中，白念珠菌CaSnf2多肽或基因被用于制备检测白念珠菌的试剂，或者筛选抑制CaSnf2表达或活性的抑制剂或拮抗剂，或作为筛选抑制CaSnf2表达或活性的靶点。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.001-99.99wt％)的本发明的白念珠菌CaSnf2多肽的拮抗剂或抑制剂或抗体以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗白念珠菌感染等病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1A显示了白念珠菌CaSNF2基因开放阅读框的脱氧核糖核苷酸序列。

图1B显示了白念珠菌CaSnf2蛋白质的氨基酸序列。

图1C显示了白念珠菌CaSnf2蛋白因子和酿酒酵母ScSnf2蛋白因子结构域比较。两者都还有相似的DEXDc，HELICc和BROMO结构域。

图2A显示了在白念珠菌中敲除CaSNF2基因的策略及其染色体上的酶切图谱。

图2B显示了在白念珠菌CaSNF2基因的敲除过程中各个菌株的Southern杂交图谱。所用探针为CaSNF2编码框5’端的1kb片段。

图3显示了白念珠菌casnf2/casnf2缺失株在菌丝生长条件下形成假菌丝。培养条件为液体YPD加10％血清和Lee’s培养基在37℃诱导以及包埋在YPS中室温培养。

图4显示了白念珠菌casnf2/casnf2缺失株在菌体生长条件下都形成假菌丝。培养条件为液体和固体YPD培养基，以及固体SLAD培养基，温度30℃。液体YPD中生长的各个菌株细胞用染料Calcofluor White染色显示几丁质的分布。

图5显示了CaSnf2因子和CaSwi1因子能够在白念珠菌体内相互作用。培养条件为液体YPD，25℃，液体YPD加10％血清和Lee’s培养基在37℃诱导。

图6显示了在小鼠系统感染实验中，CaSNF2基因的敲除导致白念珠菌毒性消失。注射液浓度为5×10⁷细胞/毫升，每只小鼠尾静脉注射100μl菌液，共注射8只小鼠。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次在白念珠菌中克隆了一种调控白念珠菌菌丝生长的基因CaSnf2。具体地，本发明人利用同源重组原理，在白念珠菌中敲除CaSNF2，构建了casnf2/casnf2缺失株，该缺失株不能形成菌丝，这说明CaSnf2是白念珠菌菌丝生长所必需。此外，不管在菌体还是菌丝培养条件下，白念珠菌casnf2/casnf2缺失株都以假菌丝形态生长。免疫共沉淀实验证明CaSnf2因子和CaSwi1因子能够在白念珠菌体内相互作用，这种相互作用不管在菌体还是菌丝条件下都能发生，说明在白念珠菌中存在着CaSwi/Snf复合物调控白念珠菌的形态发生。小鼠系统感染实验表明casnf2/casnf2缺失突变株没有毒性，这说明CaSnf2是白念珠菌中一个重要的毒性因子。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“CaSnf2蛋白”、“CaSnf2多肽”或“菌丝调控因子CaSnf2”可互换使用，都指具有白念珠菌菌丝调控因子CaSnf2氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的菌丝调控因子CaSnf2。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的CaSnf2蛋白或多肽”是指CaSnf2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质.本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CaSnf2蛋白.基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带.

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括白念珠菌CaSnf2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然白念珠菌CaSnf2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“白念珠菌CaSnf2多肽”指具有白念珠菌CaSnf2蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与白念珠菌CaSnf2蛋白相同功能的、SEQID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括白念珠菌CaSnf2蛋白的活性片段和活性衍生物。该术语还包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％序列相同性，并且具有调控白念珠菌菌丝形成的功能的多肽。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与白念珠菌CaSnf2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗白念珠菌CaSnf2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含白念珠菌CaSnf2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了白念珠菌CaSnf2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有白念珠菌CaSnf2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供白念珠菌CaSnf2蛋白或多肽的类似物.这些类似物与天然白念珠菌CaSnf2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之.这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体.诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术.类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物.应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽.

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“白念珠菌CaSnf2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CaSnf2蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的白念珠菌CaSnf2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的CaSnf2蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的CaSnf2蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CaSnf2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CaSnf2多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码白念珠菌CaSnf2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，白念珠菌CaSnf2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含白念珠菌CaSnf2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，coldSpring Harbor Laboratory.New York，1989).所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成.这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子.表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子.

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的白念珠菌CaSnf2蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于筛选促进或对抗CaSnf2蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组白念珠菌CaSnf2蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制白念珠菌CaSnf2蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对白念珠菌CaSnf2DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体.“特异性”是指抗体能结合于白念珠菌CaSnf2基因产物或片段.较佳地，指那些能与白念珠菌CaSnf2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体.本发明中抗体包括那些能够结合并抑制白念珠菌CaSnf2蛋白的分子，也包括那些并不影响白念珠菌CaSnf2蛋白功能的抗体.本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的白念珠菌CaSnf2基因产物结合的抗体.

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的白念珠菌CaSnf2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达白念珠菌CaSnf2蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断白念珠菌CaSnf2蛋白功能的抗体以及不影响白念珠菌CaSnf2蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用白念珠菌CaSnf2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与白念珠菌CaSnf2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗白念珠菌CaSnf2蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的白念珠菌CaSnf2蛋白。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与白念珠菌CaSnf2蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断白念珠菌CaSnf2蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如白念珠菌CaSnf2蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭表达CaSnf2蛋白的白念珠菌。

多克隆抗体的生产可用白念珠菌CaSnf2蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明的CaSnf2蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CaSnf2蛋白发生相互作用的物质，如抗体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明的CaSnf2蛋白的抗体、抑制剂、或拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口腔内、阴道内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

例如，本发明的CaSnf2蛋白的抗体、抑制剂、或拮抗剂可直接用于疾病治疗，例如，用于抑制白念珠菌的正常生长，进而减轻白念珠菌造成的感染。在使用本发明CaSnf2蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如其他抗真菌剂氟康唑等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的抗CaSnf2多肽的抗体或其拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂.这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合.药物制剂应与给药方式相匹配.本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备.诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备.药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造.活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重.此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用.

使用药物组合物时，是将安全有效量的CaSnf2蛋白的拮抗剂或抗体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

能与白念珠菌CaSnf2蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，宜对白念珠菌CaSnf2蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测白念珠菌CaSnf2蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的白念珠菌CaSnf2蛋白水平，可以用作判断白念珠菌是否会造成严重的感染。

一种检测检测样品中是否存在CaSnf2蛋白的方法是利用CaSnf2蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与CaSnf2蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaSnf2蛋白。

CaSnf2蛋白的多聚核苷酸可用于CaSnf2蛋白相关疾病的诊断。在诊断方面，CaSnf2蛋白的多聚核苷酸可用于检测CaSnf2蛋白的表达与否。如CaSnf2DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CaSnf2蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用CaSnf2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CaSnf2蛋白的转录产物。

检测CaSnf2基因的突变也可用于诊断CaSnf2蛋白相关的疾病。CaSnf2蛋白突变的形式包括与正常野生型CaSnf2DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从白念珠菌cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为5073个碱基，其开放读框位于1-5070位，编码全长为1690个氨基酸的白念珠菌CaSnf2蛋白(SEQ ID NO：2)。CaSnf2蛋白为治疗白念珠菌感染提供新的治疗途径，具有潜在的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明.应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料

限制性内切酶、T4DNA连接酶、探针标记试剂盒均购自美国Invitrogen公司；消解酶(Zymolyase 100T)购自日本Seikagaku公司；酸洗玻璃珠(425～600μm)，Calcoflour White荧光染料，FLAG M2抗体，蛋白酶抑制剂均购自Sigma公司，proteinG-bead悬液购自Roche公司，GFP抗体购自Santa Cruz公司，ECL试剂购自Pierce公司，用于PCR扩增的KOD plus购自日本的Toyobo公司。

通用方法：

(1)白念珠菌基因组DNA抽提

白念珠菌培养过夜用ddH₂O洗1次，悬浮在500μl溶液A中(1M山梨醇，100mMEDTA pH8.0)，加入5μl 20mg/ml的消解酶(Zymolase)，37℃放置1小时后，高速离心去上清，细胞用500μlTE缓冲液(20mM Tris·HCl pH7.5，1mM EDTA)洗一次，悬浮在350μlTE缓冲液中，并加入90μl溶液B(250mM EDTA pH8.0，400mM Tris·HCl pH8.0，2％SDS)，65℃放置30分钟，加入80μl5M KAc，冰上放置1小时，高速离心5分钟，吸取上清并加入1ml的无水乙醇，-20℃放置20分钟，高速离心5分钟，沉淀用70％乙醇洗一次，离心后烘干。

(2)Southern分析

白念珠菌基因组DNA抽提后，基因组DNA用HindIII完全酶切，电泳完成后的琼脂糖胶分别用变性液和中和液浸泡45min，尼龙膜用双蒸水或10xSSC浸透，搭好转膜平台，胶与膜间用Parafilm封闭，加一个500g砝码。以10xSSC为转膜液转移过夜，第二天漂洗晾干交联。交联后的膜装入杂交管，加入10ml预杂交液(6xSSC，5xdenhardt’sReagent，0.5％SDS，100μg/ml鱼精DNA于42℃预杂交12h，探针在100℃变性5min，加入150μl(约1/3所标记的探例)42℃杂交10-16h。0.1xSSC，0.1％SDS洗两到三次，每次40min，取出膜，晾干，室温或-70℃压片。探针标记用Invitrogene公司的随机引物标记试剂盒，照其说明操作。将含25ng DNA的溶液于100℃加热变性5-10min，置于冰浴中，再依次加入随机引物缓冲液混合物(Random Primers Buffer Mixture)，2μldCTP，2μl dGTP，2μl dTTP，3μl[α-32P]-dATP(10μCi/μl)，混匀后加入1μl Klenow酶，于25℃保温1h，以Sephadex G-25柱以3000rpm离心4min，收集离心液，即为纯化后的探针溶液。探针于100℃变性5min冰上冷却后加入杂交体系中。

(3)白念珠菌的转化

准备PEG/LiAc溶液(pH 7.5)10ml；在1.5ml Eppendof管中依次加入质粒5μg，10μl 10mg/ml鱼精DNA，混匀；加入0.1ml感受态细胞和0.6ml PEG/LiAc，votex混匀；30℃200rpm培养30min；加入70μl DMSO，轻轻混匀；42℃热冲击15min，期间不时轻轻摇匀；冰浴2min：高速离心15s，吸掉上清，用0.2ml TE重悬细胞；涂布于营养筛选SD平板上。

(4)白念珠菌Calcoflour White荧光染料的染色

白念珠菌各个菌株在YPD里培养过夜，转接到新鲜的YPD培养基中培养5小时，收集细胞，用ddH₂O洗3次，悬浮在70％的乙醇中，室温振摇1小时，再用ddH₂O洗3次，悬浮在1μg/ml的Calcoflour White荧光染料(购自Sigma公司)的溶液中，室温振摇15分钟，用ddH₂O洗3次，在荧光显微镜下观察。

(5)白念珠菌总蛋白抽提，免疫沉淀和Western Blot检测

白念珠菌菌株在YPD中培养至OD＝1，收集细胞，用400μl酵母细胞裂解液(20mMTris-HCl pH 7.5，1mM EDTA，150mM NaCl，0.5％NP-40)洗涤3次后重悬于400μl酵母细胞裂解液，加入0.5mm珠(bead)0.5g和蛋白酶抑制剂(protease inhibitor cocktail，购自Sigma公司)于0℃，在Fastprep120上以5m/s振荡三次，每次30秒。12000rpm离心15min，吸取上清，再离心15min，收集上清为细胞裂解物。取500μl细胞裂解物，加anti-FLAG M2单克隆抗体(购自Sigma公司)(1μg/反应)，在4℃振荡1h。12000rpm离心2min，在上清中加入30μl用酵母细胞裂解液平衡过的50％protein G-agarose(购自Roche公司)悬液，4℃振荡2h。免疫沉淀物用IP缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，2mM EGTA，150mM NaCl，1％NP-40，1mM DTT)洗三次。然后重悬在1×蛋白质电泳上样缓冲液中，进行10％的SDS-PAGE电泳。

用湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的TBS-T(10mMTris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl，0.1％Tween-20)溶液封闭膜2-3小时，anti-FLAG和anti-GFP(Santa Cruz)(抗体稀释度为1∶1000)4℃结合过夜，用TBS-T室温洗膜四次，每次15分钟。用二抗于室温结合2小时，再用TBS-T洗膜四次，每次15分钟。用吸水纸吸尽多余的液体，用ECL试剂显色。

将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个cDNA克隆的DNA序列为新的全长cDNA。

CaSnf2 cDNA为5073bp(图1A和SEQ ID NO：1)，含有完整的开放性读框5073bp，编码含1690氨基酸残基的多肽(图1B和SEQ ID NO：2)。

实施例1

白念珠菌CaSNF2基因的获得和结构分析

利用同源序列搜索的方法从白念珠菌(Candida albicans)基因组序列中(http://genolist.pasteur.fr/CandidaDB/)。

根据搜索结果，合成以下引物：

上游引物：ATGAATCGTCAACCTACAAGAGAG(SEQ ID NO：3)

下游引物：TCAATCAAAATTTGCTGGTGTAGACTC(SEQ ID NO：4)

以野生型白念珠菌基因组DNA为模板，通过常规的PCR反应获得长度约5.1Kb的扩增产物。

通过合成一系列引物对扩增产物所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，该扩增产物所含的全长DNA是一个新的DNA序列(如SEQ ID NO：1和图1A所示)，编码一个新的1690个氨基酸的蛋白质(如SEQ ID NO：2和图1B所示)。此蛋白质被命名为CaSnf2蛋白，其编码基因命名为CaSNF2基因。

利用BLAST结构域搜索和同源性比较分析，发现该基因产物和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ScSNF2基因产物有一定的同源性，一致性(identity)达49％，因此把这个基因命名为CaSNF2，其对应的编码产物为CaSnf2。

通过结构域分析，发现CaSnf2和ScSnf2都有几个相似的结构域(图1C).CaSnf2和ScSnf2都含有DEXDc和HELICc结构域，这两个结构域及其中间的片段是结合ATP并且水解ATP所必需的，而且这个区域对整个Swi/Snf复合物进行染色体重塑也是必需的(Mohrmann，L.et al.2005.Biochim Biophys Acta 168-1：59-73.)。同时CaSnf2和ScSnf2都含有BROMO结构域，这个结构域能够与赖氨酸残基乙酰化后的蛋白相互作用(Ladurner，A.G.2003.Mol Cell.11：365-76.)。因此序列比较分析表明白念珠菌CaSNF2基因是酿酒酵母ScSNF2基因的同源基因，白念珠菌CaSnf2因子是酿酒酵母ScSnf2因子的同源蛋白。

白念珠菌CaSNF2基因的核苷酸序列已送GenBank登录，在本申请之前尚未公开。

实施例2

白念珠菌中CaSNF2基因的敲除

为了研究白念珠菌CaSNF2基因在白念珠菌形态发生和毒性表现中的功能，本实施例首先在白念珠菌中敲除CaSNF2基因。具体方法如下：

敲除采用图2A所示的策略。

利用5’引物：CGGGATCCATGAATCGTCAACCTACAAGAGAG(SEQ ID NO：5)

和3’引物：GAAGATCTGTTGTTGAAGGGCATATTGTTG(SEQ ID NO：6)

从野生型白念珠菌株基因组DNA中用PCR的方法扩增大约0.9kb的片段，连接到质粒pCUB6(Praveen Singh等人，Infect Immun.2001 December；69(12)：7898-7903)的BglII位点，

利用5’引物：CAGGATCCGAACAGAAGAGTCTACACCAG(SEQ ID NO：7)

和3’引物：ACATGCATGCGTTCCACAAGTGTTCTATACC(SEQ ID NO：8)

从野生型白念珠菌株基因组DNA中用PCR的方法扩增大约1.0kb的片段，继续连接到质粒pCUB6的BamH-SphI位点，从而体外构建了CaSNF2基因敲除质粒pCaSNF2-KO，在此质粒中CaSNF2开放阅读框(open reading frame，ORF)中约4.0kb DNA片段被HisG-URA3-HisG替代.质粒pCaSNF2-KO用PstI酶切并转化常规的白念珠菌ura-营养缺陷型菌株，在缺少尿嘧啶的合成培养基上可以筛选到转入质粒的转化子。通过0.9kb和1.0kb两个同源片段和基因组上的CaSNF2同源片段重组，可以把染色体上的CaSNF2基因中的4.0kb DNA同源片段用HisG-URA3-HisG给替换掉，从而破坏染色体上的CaSNF2基因，正确插入的转化子通过Southern杂交分析确定。筛选标志URA3和一个拷贝HisG序列可以在含5-氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid，5-FOA)平板上通过两个同向HisG同源序列在同一条染色体上的重组而环出，丢失了URA3筛选标志的重组子可以在5-FOA平板上生长，通过负向筛选得到(Boeke et al.1984.Mol Gen Genet.197：345-346.)，从而可以进行下一轮的转化进而敲除另一条染色体上的CaSNF2基因。

所得重组子的基因型用Southern杂交技术检测确定(图2B)。HindIII酶切各个菌株基因组DNA，用1.0kb片段作探针杂交。根据白念珠菌基因组序列(http://genolist.pasteur.fr/CandidaDB/)，发现野生型菌株显示一条杂交条带，单拷贝缺失株显示两条杂交条带，在5-FOA平板上将一份拷贝的HisG和URA3环出后，又出现了一条较小的杂交条带，通过第二轮的转化和环出，可以将染色体上的第二拷贝的CaSNF2基因敲除。图2B显示了CaSNF2基因敲除中各个菌株的Southern杂交分析图谱。

实施例3

CaSNF2基因的敲除对白念珠菌菌丝形成的影响

通过同源重组的方法在白念珠菌中敲除了CaSNF2基因，Southern杂交分析确证这个敲除是成功的.CaSNF2基因的敲除，引起了白念珠菌一系列细胞和菌落形态的变化.

白念珠菌菌丝形成能力对其侵入和感染是必需的。CaSNF2基因的敲除大大降低了白念珠菌菌丝形成能力。在含YPD加10％胎牛血清培养基上，经过37℃，3.5小时培养后，可以看到野生型菌株形成典型的菌丝(hyphae)，延长的管状细胞和平行生长的细胞壁，细胞之间没有明显的缢缩，而casnf2/casnf2缺失株则形成假菌丝，没有形成这种典型的菌丝，细胞之间是链状相连。一部分细胞要伸长一些(图3)，个别细胞伸长程度为原来的2-3倍，极少量细胞呈单个生长细胞，而且也形成较长的菌丝，不同细胞间形态差异比较大。在Lee’s液体培养中，细胞形态和在YPD加10％血清培养中基本一致，说明CaSNF2基因的缺失确实在很大程度上阻断了白念珠菌菌丝的形成。

在微氧的菌丝诱导条件下，当野生型菌株被包埋在固体YPS培养基中，经过3天后可形成明显的丝状生长。而casnf2/casnf2缺失株没有形成菌丝，菌落仍然平滑呈球形，说明CaSNF2的缺失阻断了在微氧条件下的菌丝生长。

实施例4

白念珠菌casnf2/casnf2缺失株在菌体生长条件下的表型

CaSNF2基因的敲除导致白念珠菌在菌体生长条件下形态发生变化(图4)。casnf2/casnf2缺失株在YPD或者SD培养基，30℃培养条件下，几个到几十个细胞会形成有分枝的链状细胞，细胞基本呈椭圆型或者略微延长，呈单极分裂模式，细胞和细胞之间相互粘连，而且通过Calcofluor White染料染色，在细胞之间可以看到明显的缢缩。这种细胞形态和白念珠菌中假菌丝形态很相似，而且这种细胞形态也不是细胞分裂不完全所致，因为DAPI染色表明每个细胞中都含有一个完整的细胞核。

野生型菌株在同样培养条件下，呈现典型的分散的球形细胞生长，也有2-4个细胞连在一起，那是正在分裂的细胞。在固体培养基上，菌落形态由野生型菌株光滑的表面，规则的边缘转变为casnf2/casnf2缺失株皱褶的表面和不规则的边缘，而且菌落和培养基间以及菌和菌之间的粘附明显下降。而在酿酒酵母ScSNF2的缺失并没有引起细胞和菌落形态的变化，也说明了CaSNF2和ScSNF2在体内可能发挥不同的作用。

同样在固体SLAD培养基上，野生型菌落基本呈均向生长的球形，而两个缺失株都呈现典型的假菌丝生长形态。在白念珠菌CBK1，FKH2缺失株和酿酒酵母FKH1，FKH2双缺失株中也可形成类似的细胞和菌落形态(McNemar，M.D.et al.2002.JBacteriology.184：2058-206；Hollenhorst，P.C.et al.2000.Genetics.154：1533-1548；Bensen，E.S.et al.2002.Eukaryotic Cell.1：787-798.)。

实施例5

白念珠菌蛋白因子CaSnf2和CaSwi1能在体内相互作用

在酿酒酵母里，ScSwi1和ScSnf2都是SeSwi/Snf复合物的组分，两者在体内非常紧密的结合在一起。而且任何一个因子的缺失都引起相同的突变表型(Peterson，C.L.etal.1992.Cell.68：573-583；Peterson，C.L.et al.1994.Proc Natl Acad Sci USA.91：2905-8.)。为了检测在白念珠菌中CaSwi1和CaSnf2能否也相互作用，本发明人构建了GFP-CaSwi1和FLAG-CaSnf2融合表达菌株。方法如下：

利用5’引物：GGGGATCCGGACACCTACACCAAAACA(SEQ ID NO：9)

和3’引物：CCGCTCGAGCCATTCACACCCTGCCATA(SEQ ID NO：10)

从野生型白念珠菌株基因组DNA中用PCR的方法扩增大约0.9kb的片段，连接到质粒p584(参见美国专利6,911,468、5,520,253、或5,477,351)的KpnI-XhoI位点，

利用5’引物：TCCCCGCGGTACCTTGAGATTTGGCTGTAACA(SEQ ID NO：11)

和3’引物：TCCCCGCGGCCATGTCTGATTGGTTGAATG(SEQ ID NO：12)

从野生型白念珠菌株基因组DNA中用PCR的方法扩增大约0.9kb的片段，继续连接到质粒p584的SacII位点，从而得到质粒pCaSWI1-GFP，用KpnI酶切质粒pCaSWI1-GFP并转化白念珠菌，通过同源重组的原理，使得CaACT1p-GFP-URA3-GFP插入到染色体上CaSWI1基因的起始密码子前面。通过在5-FOA平板上的负向选择，环出一个拷贝的GFP和URA3，从而得到菌株能在CaACT1启动子调控下表达融合蛋白GFP-CaSwi1，GFP融合在CaSwi1的N端.

利用5’引物：GAGGATCCTCTGACGACGATGATGACAATG(SEQ ID NO：13)和

3’引物：ACATGCATGCCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCATCAAAATTTGCTGGTGTAGACTC(SEQ ID NO：14)

从野生型白念珠菌株基因组DNA中用PCR的方法扩增大约0.9kb的片段，连接到常规的质粒pFLAG-Act1(Umeyama，T.，Nagai，Y.，Niimi，M.，和Uehara，Y.(2002).Construction of FLAG tagging vectors for Candida albicans.Yeast 19，611-618.)的BamHI-SphI位点，得到质粒p4FLAG-CaSNF2。用PstI酶切p4FLAG-CaSNF2并转化融合表达GFP-CaSwi1的菌株，通过位点特异性的同源重组，质粒p4FLAG-CaSNF2被重组到染色体的CaSNF2位点，从而得到另一菌株，该菌株中4个FLAG融合在CaSnf2的C端，并在CaSNF2自身启动子下表达，同时也表达GFP-CaSwi1融合蛋白。质粒pFLAG-Act1用StuI酶切并转化融合表达GFP-CaSwi1d菌株，得到菌株仅仅表达GFP-CaSwi1融合蛋白。

通过免疫共沉淀实验发现，在两个融合蛋白共表达的菌株中，GFP-CaSwi1能够被抗FLAG的抗体共沉淀并且通过Western blot能够检测到。作为对照，在仅仅表达FLAG空载体的菌株中，GFP-CaSwi1不能被免疫共沉淀下来(图5)。由此可见，在白念珠菌中，CaSwi1和CaSnf2也能相互作用，而且它们的相互作用不管在YPD培养的菌体条件下，还是血清诱导和Lee’s培养基中都能发生(图5)，说明了CaSwi1和CaSnf2也是紧密的结合在一起，而非瞬时作用，同时也说明在白念珠菌中也存在着保守的CaSwi/Snf复合物。

实施例6：

CaSNF2基因的敲除导致白念珠菌毒性的下降

本实施例通过小鼠系统感染实验检测CaSNF2基因的敲除对白念珠菌毒性的影响。方法如下：以体重在16-18gICR雄性小鼠为实验对象，通过尾静脉注射100μl白念珠菌各菌株，并培养观测25天。各个菌株注射浓度为5×10⁷细胞/毫升。

以上结果表明，CaSNF2基因的敲除导致白念珠菌菌丝生长的缺陷，也就是使得白念珠菌即使在强烈的菌丝诱导条件下也无法形成菌丝。通过小鼠尾静脉注射野生型菌株和缺失株进行小鼠系统感染实验来检测CaSNF2基因的被坏是否导致了菌株毒性下降。发现野生型菌株有较强的毒性，小鼠在注射了5×10⁶野生型细胞后于14天后全部死亡；同样条件下，小鼠注射了5×10⁶casnf2/casnf2缺失株细胞后存活25天以上，证明casnf2/casnf2缺失株没有毒性(图6)，说明了CaSnf2在白念珠菌中是一个必需的毒性因子。

实施例7

CaSnf2蛋白重组表达和纯化

在该实施例中，以实施例1中的PCR扩增产物为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得白念珠菌CaSnf2 DNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-CGGGATCCATGAATCGTCAACCTACAAGAGAG-3’(SEQ ID NO：15)

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的部分编码序列；

3’端引物序列为：

5’-CGGGATCCTCAATCAAAATTTGCTGGTGTAGACTC-3’(SEQ ID NO：16)

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和白念珠菌CaSnf2的部分编码序列。

白念珠菌CaSnf2蛋白cDNA PCR产物纯化后经BamHI酶切再与质粒pGEX-2T(购于美国Invitrogen公司)按常规方法重组形成载体pGEX-2T-CaSnf2并转化至感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆用EcoRI酶切鉴定插入方向，酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。经测序证实，已插入了完整的CaSnf2编码序列。

挑表达CaSnf2的阳性DH5α克隆接种于100ml 2×YTA培养基中，37℃300rpm振荡培养12-15hr，1∶10稀释于预热的2×YTA培养基继续振荡培养1.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后30℃诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)重悬，超声(B.BraunLabsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱，1×PBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到白念珠菌CaSnf2蛋白。

实施例8

抗CaSnf2蛋白抗体的产生

将实施例7中获得的重组白念珠菌CaSnf2蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀白念珠菌CaSnf2蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明的CaSnf2蛋白发生结合。

讨论

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SNF2基因(ScSNF2)最先在调控单倍体细胞HO基因的正常表达克隆得到的(Stern，M.et al.1984.J Mol Biol.178：853-868.)。ScSNF2编码的蛋白ScSnf2定位在细胞核中，具有DEXDc，HELICc和BROMO结构域。DEXDc，HELICc结构域以及两结构域中间的部分对ScSnf2的ATPase活性是必需的(Mohrmann，L.et al.2005.Biochim Biophys Acta.1681：59-73.)，而BROMO结构域能够和赖氨酸残基被乙酰化的蛋白相互作用(Ladumer，A.G.2003.Mol Cell.11：365-76；Aileen，K.et al.1987.Genet.116：523-530.)。ScSNF2基因的缺失，在单倍体细胞中可阻断a型和α型细胞生殖型之间的转换，在双倍体细胞间引起减数分裂缺陷，导致生长缺陷，对非发酵糖类(如半乳糖，蔗糖，棉于糖，甘油等)利用的缺陷以及a，α型细胞特异性基因(如STE6，MCM1，MATα1等)以及其它和代谢相关基因(如SUC2，INO1，ADH2，PHO85等)表达的下调(Aileen，K.et al.1987.Genet.116：523-530；Peterson，C.L.et al.1992.Cell.68：573-583；Sudarsanam，P.et al.2000.PANS.97：3364-3369.)。遗传学和生物化学证据表明在酿酒酵母细胞中，ScSnf2是由11个成分组成的Swi/Snf复合物中的成员之一，在ATP存在的条件下，该复合物可以和RNA聚合酶II全酶(RNA polymerase holoenzyme)，转录激活因子(transcriptional activator)，染色质上的组蛋白，非组蛋白成分以及其它抑制因子相互作用，改变染色质的结构，去除抑制效应，把RNA聚合酶II全酶募集到靶基因的启动子上，从而激活转录(Burns，L.G.et al.1997.Mol Cell Biol.17：4811-4819；Kruger，et al.1995.Genes Dev.9：2770-2779；Igor，M.et al.1997.EMBO J.16：6263-627l；Christopher，J.et al.1996.Cell.84：235-244；Neely，K.E.et al.2002.Mol Cell Biol.22：1615-1625；Yudkovsky，N.et al.1999.Genes Dev.13：2369-2374.)。同时该复合物也有可能使染色质结构更加紧密而抑制靶基因的转录(Joseph，A.et al.2002.Genes Dev.16：2231-2236.)。

白念珠菌(Candida albicans)是一种人体机会性致病真菌，能引起广泛的深部和浅部感染，但是其真正的致病因子和致病机理没有完全研究清楚。利用生物信息学比较分析，本发明人在白念珠菌的基因组序列中发现一个新基因，该基因编码的产物和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的SNF2基因编码的蛋白有一定的同源性，一致性达49％，以及结构域的相似性，因此命名为CaSNF2。利用同源重组原理，在白念珠菌中敲除CaSNF2，构建了casnf2/casnf2缺失株，该缺失株不能形成菌丝，说明CaSnf2是白念珠菌菌丝生长所必需。不管在菌体还是菌丝培养条件下，白念珠菌casnf2/casnf2突变株都以假菌丝形态生长。免疫共沉淀实验证明CaSnf2因子和CaSwi1因子能够在白念珠菌体内相互作用，这种相互作用不管在菌体还是菌丝条件下都能发生，说明在白念珠菌中存在着CaSwi/Snf复合物调控白念珠菌的形态发生。小鼠系统感染实验表明casnf2/casnf2缺失株没有毒性，说明CaSnf2是白念珠菌中一个重要的毒性因子。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>白念珠菌菌丝调控因子基因及其用途

<130>057914

<160>16

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>5073

<212>DNA

<213>白念珠菌(Candida albicans)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(5070)

<400>1

atgaatcgtc aacctacaag agaggatatt caaagagcga ttcaacgctg gcatcaaatg 60

aaacaacaat atggagacca agttcaactt aatcctgaat ttgttaaatt aaccaagttc 120

ttgaatactt tgaaaatgca acaacaacg ttttcagcaac aataccaaca acaacaacaa 180

caacaacaac agcagcagca gcagcagcag cagcaacaac aacaacaaca gcagcaacaa 240

caaagtctaa accattcaca acaatcgcca ttgctacaaa atgcacaggg ccaaactcca 300

caacaacctc caactcctca acagttttct aatttcaatc agaacggtta taatggtcaa 360

cagttttctt ctcaagtaca ctcacctgct attggtgggt ctttatcgac ttcaggacat 420

ggaaccccat tagttacaaa tgccaatttg atgacaggaa agaaaaatac aaggacacca 480

aatgcccaat ttggtaacca gacggctgct ggaacaccat tacaacaaca acaacaacaa 540

caacaacaac aacaacagcc tttccctcat ggaaacaatt cgaatcctat gctaaaccag 600

acggctcagc aaccaccaca atctcaacaa cgtcaacaaa accaaccacc aagtccccaa 660

tcagcattca ctaatcaaca attccaatta ttgaaatctc agcttcaagc attcaagtat 720

tttgtgagag ctcctagtca gggtcaaggt caaataccac aaaacttgat agcatatgtt 780

tcgaatccat catctgctat ggccaatgat atgtacttac cagcagtgaa ccggcctcaa 840

actaatggta tggatcgtac aatgcaaatg ccacaatcaa taccttcaca accacaacaa 900

tatgcccttc aacaacaaaa cgatttgctg aacctgaatc caaagtcaac tggaggcacc 960

cctgaaatcc cagaaaagaa aaaaggaaag cgtggaccta aaccaaagaa tccgaaaaaa 1020

cctacaaaga aacagttgag agaagaagaa cagagacttg cattggaaaa acaaagacaa 1080

gaacttgaac aaaatagact caagagtagt gctcctcaag cattcccgcc tcaagcaggt 1140

ttacaaggac aagctccttt cccaccacaa ccaccacagc agtcacaaca acatgtacct 1200

caaccacctc cagcatcaac ttcatctagt ccacccggtg ggttgccaca gctgcaaccg 1260

caacagcaac agcaacagcc atctcgtcca attactaaac ctgccacacc tcaaccttta 1320

ttccctgatc catctcctcc agtgaatata aagagtgtag tacccgacaa agcaaacaac 1380

aagaaggtaa taataccggt aactaaacca aatattgaag tagacacctt cgagttattt 1440

gacattatca gtgatgaggt gaaagatata ccgtttaata ctttatatgc tccacagagt 1500

agatttcaga tcccttcgtt tttgcctgat ggtataaata tggaagatat ttatgtgaac 1560

agagaaggat atatgcaaat tacaatagaa caagagaagg agagattaag aaaacaaatt 1620

gacagtttga atgaaaaaga cactgaaaag aaattggaac ttgaaacaca attaagtcaa 1680

ttggaattga ttccttatca gaaagattta cgtggtaaag ttcttataca atcttggttt 1740

gggaaatcat tacttcctaa ttcacatcca aactttttag caagattcag ttcattatct 1800

atggacagtg ttcatatgac aacagattta taccgactcc aattggaatc catgatgaga 1860

gaacaaaata agaaacatgg caaaactatt gaagaaatca taaatttcag tgatcgaagt 1920

agcatcaaag ccgtcaagaa atcagaccgg ttgtcaaggt ttatgactaa aattaataat 1980

ttccataatc aaactgccaa ggaagaacag aaaaagttgg aaaaaatggc taaacaacgt 2040

ttgcaagcat tgaaactgaa tgatgaagaa gcttatttga aattgttgga tcatacaaag 2100

gatacaagaa ttacccattt attagaacaa acaaatcaat ttttggactc tttggctctt 2160

gcagtgcaaa gtcaacaaaa agaggctcag gacaatttag catattcagg tcgtgccata 2220

gaaccagcat cagttgaacc ccttgatgat gagaagagag aaaaaattga ttattataat 2280

gttgctcata gaattaaaga agaagtcacc aagcaacctt caatattggt tgggggtact 2340

ttgaaggagt atcaattgaa aggtttacaa tggatggttt cattgtttaa taatcatttg 2400

aacggtatct tggcagatga gatgggtttg ggtaaaacaa ttcaaactat ttcattactc 2460

acatatcttg tggaagtgaa aaaaattcct ggtccatttt tagtaattgt tcccttatca 2520

acagtaacca attggaattt agaatttgaa aaatgggctc cctcaattaa aaaaattacc 2580

tataaaggta ctccaaatca acgtaaagtg atgcaacacg atatcagaac cgggaatttc 2640

caattagtat tgacgacatt tgaatatgtt attaaagata aaggattatt gggtagaatc 2700

aaatgggtcc atatgattat tgatgaaggt catcgtatga agaatgctaa ttcgaaatta 2760

tctgagacat tgacacaaaa ttaccatagt gattatcgtt tgattttgac tggtactcca 2820

ttgcaaaata acttaccaga attatgggcc ttgttaaatt ttgttttacc caaaattttc 2880

aactctgtga aatcatttga tgaatggttc aatacaccat ttgccaatac tggtggtcaa 2940

gataagatag aattgacaga agaagaaaca ttgttggtga ttagaagatt gcataaagtt 3000

ttaagaccgt tccttttaag aagattaaag aaagatgttg aaaaagattt accaaacaag 3060

gtggaaaaag ttgtcaaatg taaatcatcg gcattgcaat ctaaattata tcaacaaatg 3120

ttgaggtata atatgttgta tgctggagat cctgccaatg gatcagtgcc cgttactata 3180

aaaaacgcca acaatcaaat aatgcaattg aaaaaaattt gtaatcaccc ttttgtttat 3240

gaagaagttg agaatttgat taatcctaat attgaaacca acgatcagat ttggagagta 3300

gctggtaaat ttgaattatt agacaaagtc ttacctaaat tcaaagctac tggtcataaa 3360

gttttgattt tcttccaaat gactcaaatt atgaatatca tggaagactt tttacgattc 3420

agaggtatga aatatatgag attggatggt ggaaccaaag ctgatgatag aactgattta 3480

ttgaaaagtt ttaatgcccc agattctgat tatttttgtt ttcttttatc cactcgtgct 3540

ggtgggttag gtcttaattt acaaactgcc gatacagtca ttatttttga tactgattgg 3600

aatcctcatc aagatttaca agctcaagat agagcccatc gtattggtca aaagaatgaa 3660

gttagaatat taagattgat tacggaaaac tcggtggaag aaatgatttt ggaaagagct 3720

cataaaaagt tggagattga tggtaaagtg attcaagccg gtaaattcga taacaaatcc 3780

actgctgaag aacaagaagc tatgttaaga gcattaatag aaaaagaaga tgaacgtaga 3840

cagaaaggtg gtaccgacga agaagaagaa gatttggatg atgatgaatt gaatcaaatt 3900

attgccagaa atgaaaacga gttggtggtg tttaggaaaa tggatgaaga aagatacctt 3960

gctaccaaga atgctccata cccatccaga ttgtataccg aggaagagtt gcctgaaatt 4020

tataagatag atccagaaga acttttcaag aaagaagacg ttgcactgga agagtatggt 4080

cgtggtgcta gagaaaggaa aatattacaa tacgatgata atttaactga agagcaatgg 4140

ttgaagaaaa ttgaaggtat ggtatctgac gacgatgatg acaatgacga tgacgatggc 4200

aatgttgata tgagtgattc tgaaatggaa gccaagccga agaaaccgaa aggaagaaga 4260

ggtcggaaac ccaaggttgc acgtgttgaa gatgaagaaa gtcaaactga atcggatgtt 4320

atttctgtta agcgtcaatt tcctgaagat gcagatgact ttataccacc aaagagacag 4380

aaatctgcta caccaggtgg cactactact tcgggtagag gcagaggtag gggccgtggt 4440

agaggtcgtg gacgtggaag aggcagaggc agaggatctt tgttgtctcg ttatacacct 4500

tctgtagacc ccttaactgc agacgagaga tctactttac aaaatcaaat tgaaaacata 4560

ttggggttga tcattaatta taagaatgaa catgatagag tattgagtga attgtttttg 4620

gtgaagccac ccaagagatt ttaccctgat tactatgttt tgataaagca tccaattgca 4680

cttgacgtga ttaaaaagag aacagcgtca aaatcttaca gcaagattag ggaatttttg 4740

gaggatattc atttgatgtt caccaacgcc aagatatata atgaagaagg ttcaattgtt 4800

tatcaagatg cagcattctt ggaaagatta tcaatggaca aattcaaaga attatcagcc 4860

aatctttcag aagacgaaat caataagatt ttggatttcg ctgagtttga cgaaatgttt 4920

agtttaaaac cattagttcc ttcaactgct atcaaacatc caattgaagc taaattagag 4980

aaaatagata aaggtgaagc aattgacagt ccattactca atgcttctac cactgctgga 5040

acagaagagt ctacaccagc aaattttgat tga 5073

<210>2

<211>1690

<212>PRT

<213>白念珠菌(Candida albicans)

<400>2

Met Asn Arg Gln Pro Thr Arg Glu Asp Ile Gln Arg Ala Ile Gln Arg

1 5 10 15

Trp His Gln Met Lys Gln Gln Tyr Gly Asp Gln Val Gln Leu Asn Pro

20 25 30

Glu Phe Val Lys Leu Thr Lys Phe Leu Asn Thr Leu Lys Met Gln Gln

35 40 45

Gln Arg Phe Gln Gln Gln Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

50 55 60

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

65 70 75 80

Gln Ser Leu Asn His Ser Gln Gln Ser Pro Leu Leu Gln Asn Ala Gln

85 90 95

Gly Gln Thr Pro Gln Gln Pro Pro Thr Pro Gln Gln Phe Ser Asn Phe

100 105 110

Asn Gln Asn Gly Tyr Asn Gly Gln Gln Phe Ser Ser Gln Val His Ser

115 120 125

Pro Ala Ile Gly Gly Ser Leu Ser Thr Ser Gly His Gly Thr Pro Leu

130 135 140

Val Thr Asn Ala Asn Leu Met Thr Gly Lys Lys Asn Thr Arg Thr Pro

145 150 155 160

Asn Ala Gln Phe Gly Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr Pro Leu Gln Gln

165 170 175

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Phe Pro His Gly Asn

180 185 190

Asn Ser Asn Pro Met Leu Asn Gln Thr Ala Gln Gln Pro Pro Gln Ser

195 200 205

Gln Gln Arg Gln Gln Asn Gln Pro Pro Ser Pro Gln Ser Ala Phe Thr

210 215 220

Asn Gln Gln Phe Gln Leu Leu Lys Ser Gln Leu Gln Ala Phe Lys Tyr

225 230 235 240

Phe Val Arg Ala Pro Ser Gln Gly Gln Gly Gln Ile Pro Gln Asn Leu

245 250 255

Ile Ala Tyr Val Ser Asn Pro Ser Ser Ala Met Ala Asn Asp Met Tyr

260 265 270

Leu Pro Ala Val Asn Arg Pro Gln Thr Asn Gly Met Asp Arg Thr Met

275 280 285

Gln Met Pro Gln Ser Ile Pro Ser Gln Pro Gln Gln Tyr Ala Leu Gln

290 295 300

Gln Gln Asn Asp Leu Leu Asn Leu Asn Pro Lys Ser Thr Gly Gly Thr

305 310 315 320

Pro Glu Ile Pro Glu Lys Lys Lys Gly Lys Arg Gly Pro Lys Pro Lys

325 330 335

Asn Pro Lys Lys Pro Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Glu Glu Gln Arg

340 345 350

Leu Ala Leu Glu Lys Gln Arg Gln Glu Leu Glu Gln Asn Arg Leu Lys

355 360 365

Ser Ser Ala Pro Gln Ala Phe Pro Pro Gln Ala Gly Leu Gln Gly Gln

370 375 380

Ala Pro Phe Pro Pro Gln Pro Pro Gln Gln Ser Gln Gln His Val Pro

385 390 395 400

Gln Pro Pro Pro Ala Ser Thr Ser Ser Ser Pro Pro Gly Gly Leu Pro

405 410 415

Gln Leu Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Ser Arg Pro Ile Thr

420 425 430

Lys Pro Ala Thr Pro Gln Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Pro Pro Val

435 440 445

Asn Ile Lys Ser Val Val Pro Asp Lys Ala Asn Asn Lys Lys Val Ile

450 455 460

Ile Pro Val Thr Lys Pro Asn Ile Glu Val Asp Thr Phe Glu Leu Phe

465 470 475 480

Asp Ile Ile Ser Asp Glu Val Lys Asp Ile Pro Phe Asn Thr Leu Tyr

485 490 495

Ala Pro Gln Ser Arg Phe Gln Ile Pro Ser Phe Leu Pro Asp Gly Ile

500 505 510

Asn Met Glu Asp Ile Tyr Val Asn Arg Glu Gly Tyr Met Gln Ile Thr

515 520 525

Ile Glu Gln Glu Lys Glu Arg Leu Arg Lys Gln Ile Asp Ser Leu Asn

530 535 540

Glu Lys Asp Thr Glu Lys Lys Leu Glu Leu Glu Thr Gln Leu Ser Gln

545 550 555 560

Leu Glu Leu Ile Pro Tyr Gln Lys Asp Leu Arg Gly Lys Val Leu Ile

565 570 575

Gln Ser Trp Phe Gly Lys Ser Leu Leu Pro Asn Ser His Pro Asn Phe

580 585 590

Leu AlaArg Phe Ser Ser Leu Ser Met Asp Ser Val His Met Thr Thr

595 600 605

Asp Leu Tyr Arg Leu Gln Leu Glu Ser Met Met Arg Glu Gln Asn Lys

610 615 620

Lys His Gly Lys Thr Ile Glu Glu Ile Ile Asn Phe Ser Asp Arg Ser

625 630 635 640

Ser Ile Lys Ala Val Lys Lys Ser Asp Arg Leu Ser Arg Phe Met Thr

645 650 655

Lys Ile Asn Asn Phe His Asn Gln Thr Ala Lys Glu Glu Gln Lys Lys

660 665 670

Leu Glu Lys Met Ala Lys Gln Arg Leu Gln Ala Leu Lys Leu Asn Asp

675 680 685

Glu Glu Ala Tyr Leu Lys Leu Leu Asp His Thr Lys Asp Thr Arg Ile

690 695 700

Thr His Leu Leu Glu Gln Thr Asn Gln Phe Leu Asp Ser Leu Ala Leu

705 710 715 720

Ala Val Gln Ser Gln Gln Lys Glu Ala Gln Asp Asn Leu Ala Tyr Ser

725 730 735

Gly Arg Ala Ile Glu Pro Ala Ser Val Glu Pro Leu Asp Asp Glu Lys

740 745 750

Arg Glu Lys Ile Asp Tyr Tyr Asn Val Ala His Arg Ile Lys Glu Glu

755 760 765

Val Thr Lys Gln Pro Ser Ile Leu Val Gly Gly Thr Leu Lys Glu Tyr

770 775 780

Gln Leu Lys Gly Leu Gln Trp Met Val Ser Leu Phe Asn Asn His Leu

785 790 795 800

Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Thr

805 810 815

Ile Ser Leu Leu Thr Tyr Leu Val Glu Val Lys Lys Ile Pro Gly Pro

820 825 830

Phe Leu Val Ile Val Pro Leu Ser Thr Val Thr Asn Trp Asn Leu Glu

835 840 845

Phe Glu Lys Trp Ala Pro Ser Ile Lys Lys Ile Thr Tyr Lys Gly Thr

850 855 860

Pro Asn Gln Arg Lys Val Met Gln His Asp Ile Arg Thr Gly Asn Phe

865 870 875 880

Gln Leu Val Leu Thr Thr Phe Glu Tyr Val Ile Lys Asp Lys Gly Leu

885 890 895

Leu Gly Arg Ile Lys Trp Val His Met Ile Ile Asp Glu Gly His Arg

900 905 910

Met Lys Asn Ala Asn Ser Lys Leu Ser Glu Thr Leu Thr Gln Asn Tyr

915 920 925

His Ser Asp Tyr Arg Leu Ile Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Asn

930 935 940

Leu Pro Glu Leu Trp Ala Leu Leu Asn Phe Val Leu Pro Lys Ile Phe

945 950 955 960

Asn Ser Val Lys Ser Phe Asp Glu Trp Phe Asn Thr Pro Phe Ala Asn

965 970 975

Thr Gly Gly Gln Asp Lys Ile Glu Leu Thr Glu Glu Glu Thr Leu Leu

980 985 990

Val Ile Arg Arg Leu His Lys Val Leu Arg Pro Phe Leu Leu Arg Arg

995 1000 1005

Leu Lys Lys Asp Val Glu Lys Asp Leu Pro Asn Lys Val Glu Lys

1010 1015 1020

Val Val Lys Cys Lys Ser Ser Ala Leu Gln Ser Lys Leu Tyr Gln

1025 1030 1035

Gln Met Leu Arg Tyr Asn Met Leu Tyr Ala Gly Asp Pro Ala Asn

1040 1045 1050

Gly Ser Val Pro Val Thr Ile Lys Asn Ala Asn Asn Gln Ile Met

1055 1060 1065

Gln Leu Lys Lys Ile Cys Asn His Pro Phe Val Tyr Glu Glu Val

1070 1075 1080

Glu Asn Leu Ile Asn Pro Asn Ile Glu Thr Asn Asp Gln Ile Trp

1085 1090 1095

Arg Val Ala Gly Lys Phe Glu Leu Leu Asp Lys Val Leu Pro Lys

1100 1105 1110

Phe Lys Ala Thr Gly His Lys Val Leu Ile Phe Phe Gln Met Thr

1115 1120 1125

Gln Ile Met Asn Ile Met Glu Asp Phe Leu Arg Phe Arg Gly Met

1130 1135 1140

Lys Tyr Met Arg Leu Asp Gly Gly Thr Lys Ala Asp Asp Arg Thr

1145 1150 1155

Asp Leu Leu Lys Ser Phe Asn Ala Pro Asp Ser Asp Tyr Phe Cys

1160 1165 1170

Phe Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln

1175 1180 1185

Thr Ala Asp Thr Val Ile Ile Phe Asp Thr Asp Trp Asn Pro His

1190 1195 1200

Gln Asp Leu Gln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Lys

1205 1210 1215

Asn Glu Val Arg Ile Leu Arg Leu Ile Thr Glu Asn Ser Val Glu

1220 1225 1230

Glu Mer Ile Leu Glu Arg Ala His Lys Lys Leu Glu Ile Asp Gly

1235 1240 1245

Lys Val Ile Gln Ala Gly Lys Phe Asp Asn Lys Ser Thr Ala Glu

1250 1255 1260

Glu Gln Glu Ala Met Leu Arg Ala Leu Ile Glu Lys Glu Asp Glu

1265 1270 1275

Arg Arg Gln Lys Gly Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Asp Leu Asp

1280 1285 1290

Asp Asp Glu Leu Asn Gln Ile Ile Ala Arg Asn Glu Asn Glu Leu

1295 1300 1305

Val Val Phe Arg Lys Met Asp Glu Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Lys

1310 1315 1320

Asn Ala Pro Tyr Pro Ser Arg Leu Tyr Thr Glu Glu Glu Leu Pro

1325 1330 1335

Glu Ile Tyr Lys Ile Asp Pro Glu Glu Leu Phe Lys Lys Glu Asp

1340 1345 1350

Val Ala Leu Glu Glu Tyr Gly Arg Gly Ala Arg Glu Arg Lys Ile

1355 1360 1365

Leu Gln Tyr Asp Asp Asn Leu Thr Glu Glu Gln Trp Leu Lys Lys

1370 1375 1380

Ile Glu Gly Met Val Ser Asp Asp Asp Asp Asp Asn Asp Asp Asp

1385 1390 1395

Asp Gly Asn Val Asp Met Ser Asp Ser Glu Met Glu Ala Lys Pro

1400 1405 1410

Lys Lys Pro Lys Gly Arg Arg Gly Arg Lys Pro Lys Val Ala Arg

1415 1420 1425

Val Glu Asp Glu Glu Ser Gln Thr Glu Ser Asp Val Ile Ser Val

1430 1435 1440

Lys Arg Gln Phe Pro Glu Asp Ala Asp Asp Phe Ile Pro Pro Lys

1445 1450 1455

Arg Gln Lys Ser Ala Thr Pro Gly Gly Thr Thr Thr Ser Gly Arg

1460 1465 1470

Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly

1475 1480 1485

Arg Gly Arg Gly Ser Leu Leu Ser Arg Tyr Thr Pro Ser Val Asp

1490 1495 1500

Pro Leu Thr Ala Asp Glu Arg Ser Thr Leu Gln Asn Gln Ile Glu

1505 1510 1515

Asn Ile Leu Gly Leu Ile Ile Asn Tyr Lys Asn Glu His Asp Arg

1520 1525 1530

Val Leu Ser Glu Leu Phe Leu Val Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr

1535 1540 1545

Pro Asp Tyr Tyr Val Leu Ile Lys His Pro Ile Ala Leu Asp Val

1550 1555 1560

Ile Lys Lys Arg Thr Ala Ser Lys Ser Tyr Ser Lys Ile Arg Glu

1565 1570 1575

Phe Leu Glu Asp Ile His Leu Met Phe Thr Asn Ala Lys Ile Tyr

1580 1585 1590

Asn Glu Glu Gly Ser Ile Val Tyr Gln Asp Ala Ala Phe Leu Glu

1595 1600 1605

Arg Leu Ser Met Asp Lys Phe Lys Glu Leu Ser Ala Asn Leu Ser

1610 1615 1620

Glu Asp Glu Ile Asn Lys Ile Leu Asp Phe Ala Glu Phe Asp Glu

1625 1630 1635

Met Phe Ser Leu Lys Pro Leu Val Pro Ser Thr Ala Ile Lys His

1640 1645 1650

Pro Ile Glu Ala Lys Leu Glu Lys Ile Asp Lys Gly Glu Ala Ile

1655 1660 1665

Asp Ser Pro Leu Leu Asn Ala Ser Thr Thr Ala Gly Thr Glu Glu

1670 1675 1680

Ser Thr Pro Ala Asn Phe Asp

1685 1690

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>3

atgaatcgtc aacctacaag agag 24

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>4

tcaatcaaaa tttgctggtg tagactc 27

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>5

cgggatccat gaatcgtcaa cctacaagag ag 32

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>6

gaagatctgt tgttgaaggg catattgttg 30

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>7

caggatccga acagaagagt ctacaccag 29

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>8

acatgcatgc gttccacaag tgttctatac c 31

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>9

ggggatccgg acacctacac caaaaca 27

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>10

ccgctcgagc cattcacacc ctgccata 28

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>11

tccccgcggt accttgagat ttggctgtaa ca 32

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>12

tccccgcggc catgtctgat tggttgaatg 30

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>13

gaggatcctc tgacgacgat gatgacaatg 30

<210>14

<211>100

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>14

acatgcatgc cttgtcatcg tcatccttgt aatcgatgtc atgatcttta taatcaccgt 60

catggtcttt gtagtcatca aaatttgctg gtgtagactc 100

<210>15

<211>32

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>15

cgggatccat gaatcgtcaa cctacaagag ag 32

<210>16

<211>35

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>16

cgggatcctc aatcaaaatt tgctggtgta gactc 35

Claims

1.一种白念珠菌CaSNF2基因的用途，用于构建白念珠菌casnf2/casnf2缺失株，所述的缺失株没有毒性；所述的白念珠菌CaSNF2基因的核苷酸序列是：

(a)编码SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列；或

(b)与(a)互补的多核苷酸序列。