CN1952129A - Angptl4缺失突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

基因ANGPTL4缺失突变体及其应用涉及肿瘤相关新基因，尤其涉及ANGPTL4基因的功能应用。基因ANGPTL4缺失突变体ANGPTL4－Δ1缺失了C端纤连蛋白功能域；缺失突变体ANGPTL4－Δ2缺失了N端信号肽；缺失突变体ANGPTL4－Δ3缺失了N端信号肽和卷曲功能域。基因ANGPTL4缺失突变体具有抑制肝癌细胞体外生长的作用，可用于制备抑癌的药物。

Description

ANGPTL4缺失突变体及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤相关新基因，尤其涉及ANGPTL4缺失突变体及其应用。

背景技术

随着人类基因组计划的完成和科学技术的不断进步，以对基因(尤其是致病基因)功能研究为主要内容的“后基因组时代”已经来临。

尽管国内外相继克隆了与各种功能相关的基因、并对其初步生物学功能和作用机制进行了研究，本实验室进行的以细胞生长为基础的大规模功能筛选就发现并克隆了372个新基因[Wan等，PNAS(2004)101(44)：15724-15729]。

ANGPTL4基因(最初该基因被李锦军的实验室命名为pp1158)[朱洪新等，中华肿瘤杂志(2002)24(2)：123-125]就是利用此功能筛选技术平台从人胎盘cDNA文库中克隆到的新基因，该基因cDNA全长为1943bp，开放阅读框含1218bp，编码406个氨基酸，预计分子量为45.2kDa。N端有一疏水信号肽和卷曲(Coiled-Coil)结构域，C端有一纤维蛋白原样(Fibrinogen-like)结构域。并于2000年首先将该基因(原基因名为pp1158)的cDNA序列在GenBank上登录(登录号为AF202636)。现已同Yoon等克隆的PGAR[Mol.Cell.Biol.，Jul 2000；20：5343-5349]和Kim等克隆的HFARP[Biochem.J，2000，346：603-610]由HUGO统一正式命名为ANGPTL4(angiopoietin-like 4)。

Kim等对该基因的研究结果表明ANGPTL4能够抑制内皮细胞HUVEC的凋亡，但对内皮细胞HUVEC的出芽(sprouting)没有影响。Yoon等的研究结果表明ANGPTL4能够调节脂代谢。

目前，对全长的基因序列及其功能的研究比较普遍，然而人们并不知道或了解其缺失体或片断。ANGPTL4就是这样的基因。

基于许多生理反应和疾病与基因缺失体有关，因此，本领域迫切需要确定各种基因缺失体的结构域。

发明内容

本发明的目的就是提供了一种确定结构域的ANGPTL4缺失突变体。本发明的另一目的是基于上述缺失突变体，提供其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种ANGPTL4的缺失突变体，它具有体外抑制癌细胞生长的功能，并且所述的缺失突变体选自下组：

(a)缺失了SEQ ID NO：2中第192-406位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突变体；

(b)缺失了SEQ ID NO：2中第1-65位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突变体；

(c)缺失了SEQ ID NO：2中第1-182位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突变体。

在一优选例中所述的突变体氨基酸序列选自：SEQ ID NO：3、4或5。

在另一优选例中所述的突变体完全缺失了C端纤连蛋白Fibronectin功能域或卷曲功能域。

在本发明的另一方面，提供了ANGPTL4的缺失突变体在制备抑制肝癌细胞生长的药物中的应用。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码下组缺失体的多核苷酸：

(i)缺失了SEQ ID NO：2中第192-406位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突变体；

(ii)缺失了SEQ ID NO：2中第1-65位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突变体；

(iii)缺失了SEQ ID NO：2中第1-182位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突变体。

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

其中所述的多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3、4或5所示氨基酸序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有权上述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有上述的载体。

在本发明的另一方面，提供了一种多肽的制备方法，它包含：

(a)在适合表达的条件下，培养上述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出ANGPTL4的缺失突变体。

在本发明的另一方面，提供了所述的ANGPTL4的缺失突变体的用途，它包括用于(a)制备促进肿瘤血管新生的组合物；或(b)制备调节肿瘤细胞迁移能力的组合物。

本发明确定了ANGPTL4的缺失突变体的结构域，并将其用于制备抑癌组合物、促进肿瘤血管新生的组合物或制备调节肿瘤细胞迁移能力的组合物，显示其广阔的使用价值。

附图说明

图1A显示了基因ANGPTL4染色体定位及功能域。

图1B显示了构建基因ANGPTL4的缺失突变体。

图2显示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突变体在转染的SMMC7721细胞中的定位。

图3显示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突变体Western blot检测结果。其中，各泳道如下：1：空载体；2：ANGPTL4-全长；3：ANGPTL4-Δ1；4：ANGPTL4-Δ2；5：ANGPTL4-Δ3。

图4显示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突变体生长曲线的测定结果。

图5显示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突变体转染SMMC7721细胞迁移24小时测定结果。

图6显示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突变体转染SMMC7721细胞侵袭24小时测定结果。

图7显示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突变体转染SMMC7721细胞管状形成24小时测定结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，构建了基因ANGPTL4的多个特异性缺失突变体，发现它们能抑制肝癌细胞体外生长，有的能使肝癌细胞的迁移、侵润和管状结构形成能力降低，有的能促进肿瘤血管新生(包括细胞的迁移、侵润和管状结构形成能力升高)，从而可以将它们用于制备抑制肝癌的药物。

在本发明中，术语“ANGPTL4蛋白”、“ANGPTL4多肽”或“血管生成素样蛋白ANGPTL4”可互换使用，都指具有人血管生成素样蛋白ANGPTL4氨基酸序列AAG22490(gi：10732648)(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的血管生成素样蛋白ANGPTL4。

在本发明中，术语“ANGPTL4基因”、“ANGPTL4多核苷酸”或“血管生成素样蛋白基因ANGPTL4”可互换使用，都指具有人ANGPTL4核苷酸序列(AF202636或SEQID NO：1)的核酸序列。

在本发明中，术语“本发明的多肽”指ANGPTL4蛋白的缺失体。

在优选例中，构建了ANGPTL4的缺失突变体ANGPTL4-Δ1(ANGPTL4-deltal或pp1158-deltal)，该缺失体是缺失了第192-406位氨基酸序列，属于编码C端纤连蛋白Fibronectin功能域的缺失突变体。

在优选例中，构建了ANGPTL4的缺失突变体ANGPTL4-Δ2(ANGPTL4-delta2或pp1158-delta2)。该缺失体是缺失了1-65氨基酸序列，属于缺失N端一疏水信号肽的缺失突变体。

在优选例中，构建了ANGPTL4的缺失突变体，ANGPTL4-Δ3(ANGPTL4-delta3或pp1158-delta3)，该缺失体是缺失了编码1-182氨基酸序列，属于缺失N端信号肽和卷曲(Coiled-Coil)功能域的缺失突变体。

本发明提供的ANGPTL4缺失突变体对肝癌细胞的体外生长具有抑制作用。

本发明提供的ANGPTL4缺失突变体ANGPTL4-Δ1和ANGPTL4-Δ2的过表达产物主要定位于胞核，且呈点状分布。

本发明提供的ANGPTL4缺失突变体ANGPTL4-Δ3的过表达产物主要定位于核，呈均匀分布。

本发明提供的ANGPTL4缺失突变体ANGPTL4-Δ1能使肝癌细胞迁移能力下降。

本发明提供的ANGPTL4缺失突变体ANGPTL4-Δ2能促使肿瘤血管新生。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明还包括人ANGPTL4蛋白缺失体的的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人ANGPTL4蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，还包括具有与人ANGPTL4蛋白缺失体相同功能的、SEQ ID NO：3、4或5序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人ANGPTL4蛋白的活性片段和活性衍生物。

发明还提供人ANGPTL4蛋白缺失体的类似物。这些类似物人ANGPTL4缺失体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，还包括与SEQ ID NO：3、4或5的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的人ANGPTL4核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就司以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ANGPTL4蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的ANGPTL4缺失体多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人ANGPTL4缺失体多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人ANGPTL4缺失体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee andNathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人ANGPTL4缺失体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的缺失体多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人ANGPTL4缺失体或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：

用表达的重组人ANGPTL4缺失体筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人ANGPTL4缺失体功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人ANGPTL4 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里， “特异性”是指抗体能结合于人ANGPTL4基因产物或片段。较佳地，指那些能与人ANGPTL4基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人ANGPTL4缺失体的分子，也包括那些并不影响人ANGPTL4缺失体功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人ANGPTL4基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链FV分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人ANGPTL4基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人ANGPTL4缺失体或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人ANGPTL4缺失体功能的抗体以及不影响人ANGPTL4缺失体功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人ANGPTL4基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人ANGPTL4基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人ANGPTL4缺失体的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人ANGPTL4缺失体。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人ANGPTL4缺失体相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人ANGPTL4缺失体的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人ANGPTL4缺失体高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人ANGPTL4缺失体阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用人ANGPTL4缺失体或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与ANGPTL4缺失体发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明ANGPTL4缺失体，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供所需的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于抑制肿瘤细胞生长方面的治疗。在使用本发明ANGPTL4缺失体时，还可同时使用其他治疗剂，如顺铂、5-FU等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明ANGPTL4缺失体多肽或其激动剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的ANGPTL4缺失体、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于确定了ANGPTL4的缺失突变体的结构域，并可将其用于制备抑癌组合物、促进肿瘤血管新生的组合物或制备调节肿瘤细胞迁移能力的组合物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

ANGPTL4缺失突变体的构建

对ANGPTL4的生物信息学分析结果显示，ANGPTL4基因定位于染色体19p13.3，含有7个外显子和6个内含子；该基因cDNA全长为1943bp，开放阅读框含1218bp，编码406个氨基酸，预计分子量为45.2kDa。N端有一疏水信号肽和卷曲(Coiled-Coil)结构域，C端有一纤维蛋白原样(Fibrinogen-like)结构域(图lA)。

本实施例中，用哺乳动物细胞表达载体EGFP-N1(购自Clontech公司)构建ANGPTL4基因全长和3个缺失突变体亚克隆(图1B)，具体操作为：利用含有酶切位点的特异性引物，用PCR的方法扩增ANGPTL4基因的编码区(1-406位氨基酸)及其3个ANGPTL4缺失子Δ1(1-191位氨基酸)，Δ2(67-406位氨基酸)，Δ3(183-406位氨基酸)，均以XhoI/KpnI酶切位点分别装入EGFP-N1载体，构建成能够表达C端带有GFP标签的融合蛋白ANGPTL4-GFP，ANGPTL4-Δ1-GFP，ANGPTL4-Δ2-GFP和ANGPTL4-Δ3-GFP，ANGPTL4基因融合表达载体均经过酶切鉴定及测序验证无误。

实施例2

ANGPTL4蛋白缺失突变体融合蛋白在人肝癌细胞SMMC-7721的细胞定位

从图2可以看出EGFP蛋白均匀分布于细胞核、胞质和胞膜；ANGPTL4全长基因定位于细胞质，而缺失C端Fibronectin功能域的缺失突变体(pp1158-delta1)和只缺失N端信号肽的缺失突变体(pp1158-delta2)其过表达产物主要定位于胞核，且呈点状分布。缺失N端信号肽和Coiled-coil功能域的缺失突变体(pp1158-delta 3)其过表达产物定位主要定位于核，但呈均匀分布。

实施例3

ANGPTL4基因及缺失突变体稳定细胞系的建立及Western blot检测

用LipofectAMINE脂质体转染EGFP-N1空载体、ANGPTL4-GFP-N1(全长)、ANGPTL4-delta1-GFP-N1、ANGPTL4-delta2-GFP-N1、ANGPTL4-delta3-GFP-N1融合表达载体、经G418筛选的肝癌细胞系SMMC7721细胞的Western blot检测，见图3。

结果显示目的基因均表达，表明稳定细胞系成功建立。

实施例4

ANGPTL4基因及缺失突变体转染肝癌细胞的体外增殖试验

a)分别将生长状态良好的转染EGFP-N1空载体、ANGPTL4-GFP-N1(全长)、ANGPTL4-delta1-GFP-N1、ANGPTL4-delta2-GFP-N1、ANGPTL4-delta3-GFP-N1融合表达载体、经G418筛选的肝癌细胞系SMMC7721细胞消化后制成单细胞悬液；

b)按每孔1.5×10³细胞的密度接种于96孔细胞培养板中，接种并开始贴壁生长当天为0天，每隔24h为一个检测点，用MTT试验法连续测定7天的细胞增埴状况；

c)测定时每孔加入10μl的MTT(5mg/ml)(Sigma)，4h后弃培养液，加入150μl的DMSO溶解蓝紫色结晶，待其经振荡充分溶解后每孔各取100μl移至新的酶标板，于540nm波长处测定吸收值，取3个孔的均值(Mean±SD)，绘制生长曲线。(图4)

结果表明与转染EGFP-N1空载体的SMMC7721细胞相比，转染ANGPTL4-GFP-N1(全长)、ANGPTL4-delta1-GFP-N1、ANGPTL4-delta2-GFP-N1、ANGPTL4-delta3-GFP-N1质粒的SMMC7721细胞生长明显受到抑制(P＜0.05)，提示ANGPTL4基因对肝癌细胞的体外生长具有抑制作用。

实施例5

ANGPTL4基因及缺失突变体转染肝癌细胞的迁移试验

a)在60mm细胞培养皿接种1×10⁶分别转染EGFP-N1，ANGPTL4-full-GFP-N1(全长)，  ANGPTL4-delta1-GFP-N1，ANGPTL4-delta2-GFP-N1和ANGPTL4-delta3-GFP-N1融合表达载体的SMMC7721肝癌稳定细胞系培养至融合度为90％以上；

b)用灭菌双面剃须刀片刮制三条宽2-5mm的无细胞区，用无血清培养基轻洗除去脱壁细胞；

c)添加新鲜培养液3ml，加Thymidine至终浓度为1mmol/L；

d)G418 200ug/ml继续培养24h，弃培养液，PBS轻洗细胞5minx3，10％缓冲福尔马林固定，Giemsa染色，每条刮痕上随机选取3个视野，共9个重复拍照并进行计数，比较不同处理组之间迁移细胞数，未转染细胞作阴性对照。图5

结果显示与EGFP-N1(空载体组)相比，ANGPTL4-delta1-GFP-Nl转染组迁移细胞稍少，ANGPTL4-delta3-GFP-N1转染组转染组侵润细胞较多但差异不显著，而ANGPTL4-full-GFP-N1(全长)和ANGPTL4-delta2-GFP-N1转染组侵润细胞显著增多(P＜0.001，P＜0.001)差异极显著。

实施例6

ANGPTL4基因及缺失突变体转染肝癌细胞的侵袭试验

a)取24-well细胞培养板用孔径为8μm的培养碟，外底侧均匀涂布10μlCollagen type I，内底侧均匀涂布10μl matrigel的PBS稀释液，净化工作台内风干后置于24-well培养板孔内；

b)培养杯内分别添加100μl 5×105/ml的分别转染EGFP-N1，ANGPTL4-full-GFP-N1(全长)，ANGPTL4-delta1-GFP-N1，ANGPTL4-delta2-GFP-N1和ANGPTL4-delta3-GFP-N1融合表达载体的SMMC7721肝癌稳定细胞系细胞悬液；

c)培养板每孔内各加入600μl完全培养基，另外分别加终浓度为100ug/ml的高纯度BSA，PBS空白对照；

d)继续培养12h，PBS轻洗细胞5minx3，甲醇固定，Giemsa染色，用湿润的医用棉签拭去培养碟内未穿膜的细胞，切下培养碟底膜并用中性树脂封固在载玻片和盖玻片中，显微镜下进行细胞计数并拍照，比较不同处理间的侵润细胞数。图6

结果显示与EGFP-N1(空载体组)相比，ANGPTL4-delta1-GFP-N1转染组侵润细胞稍少，ANGPTL4-delta3-GFP-N1转染组转染组侵润细胞较多但差异不显著，而ANGPTL4-full-GFP-N1(全长)和ANGPTL4-delta2-GFP-N1转染组侵润细胞显著增多，差异极显著。

实施例7

ANGPTL4基因及缺失突变体转染肝癌细胞的管状形成试验

a)取24孔培养板每孔加入300μl matrigel原液，37℃培养箱内孵育30min待凝固后再在每孔内添加1ml浓度为1.0×105的分别转染EGFP-N1，ANGPTL4-full-GFP-N1(全长)，ANGPTL4-delta1-GFP-N1，ANGPTL4-delta2-GFP-N1和ANGPTL4-delta3-GFP-N1融合表达载体的SMMC7721肝癌稳定细胞系细胞悬液；

b)同时设未转染细胞的空白对照；

c)37℃，5％CO₂条件下继续培养，在2h，4h，6h，12h，24h时间点观察不同处理组之间内皮细胞管状排列情况，单位面积内管状结构数量，完整程度的差异。图7

结果显示未转染组、EGFP-N1、ANGPTL4-delta1-GFP-N1和ANGPTL4-delta3-GFP-N1转染组在各时间点上均未形成完整的管状结构；而ANGPTL4-full-GFP-N1(全长)和ANGPTL4-delta2-GFP-N1转染组所形成的管状结构排列整齐，较完整，单位面积内管状结构较多。

本发明所述的基因ANGPTL4的缺失突变体的结构和功能：

	蛋白质	序列	功能
				Δ1	1-191	SEQ ID NO：3	其过表达产物主要定位于细胞核，且呈点状分布；对肝癌细胞的体外生长具有抑制作用；与空载相比转染SMMC7721组迁移肝癌细胞较少；与空载相比转染SMMC7721组侵润肝癌细胞稍少；转染SMMC7721组在各时间点上均未形成完整的管状结构。
Δ2	66-406	SEQ ID NO：4	其过表达产物主要定位于细胞核，且呈点状分布；对肝癌细胞的体外生长具有抑制作用；与空载相比转染SMMC7721组浸润肝癌细胞显著增多；与空载相比转染SMMC7721组侵润肝癌细胞显著增多；转染SMMC7721组所形成的管状结构排列整齐，较完整，单位面积内管状结构较多。
				Δ3	183-406	SEQID NO：5	其过表达产物主要定位于细胞核，但呈均匀分布；对肝癌细胞的体外生长具有抑制作用；与空载相比转染SMMC7721组浸润肝癌细胞较多但不显著；与空载相比转染SMMC7721组浸润肝癌细胞较多但不显著；转染SMMC7721组在各时间点上均未形成完整的管状结构。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市肿瘤研究所

<120>ANGPTL4缺失突变体及其应用

<130>058128

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1943

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(173)..(1393)

<223>

<400>1

ggagaagaag ccgagctgag cggatcctca cacgactgtg atccgattct ttccagcggc     60

ttctgcaacc aagcgggtct tacccccggt cctccgcgtc tccagtcctc gcacctggaa    120

ccccaacgtc cccgagagtc cccgaatccc cgctcccagg ctacctaaga gg atg agc    178

                                                          Met Ser

                                                          1

ggt gct ccg acg gcc ggg gca gcc ctg atg ctc tgc gcc gcc acc gcc      226

Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala Thr Ala

        5                   10                  15

gtg cta ctg agc gct cag ggc gga ccc gtg cag tcc aag tcg ccg cgc      274

Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser Pro Arg

    20                  25                  30

ttt gcg tcc tgg gac gag atg aat gtc ctg gcg cac gga ctc ctg cag      322

Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu Leu Gln

35                  40                 45                   50

ctc ggc cag ggg ctg cgc gaa cac gcg gag cgc acc cgc agt cag ctg      370

Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser Gln Leu

                55                  60                  65

agc gcg ctg gag cgg cgc ctg agc gcg tgc ggg tcc gcc tgt cag gga      418

Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys Gln Gly

            70                  75                  80

acc gag ggg tcc acc gac ctc ccg tta gcc cct gag agc cgg gtg gac      466

Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg Val Asp

        85                  90                  95

cct gag gtc ctt cac agc ctg cag aca caa otc aag gct cag aac agc      514

Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Ash Ser

    100                 105                 110

agg atc cag caa ctc ttc cac aag gtg gcc cag cag cag cgg cae ctg      562

Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg His Leu

115                 120                 125                 130

gag aag cag cac ctg cga att cag cat ctg caa agc cag ttt ggc ctc      610

Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe Gly Leu

                135                 140                 145

ctg gac cac aag cac cta gac cat gag gtg gcc aag cct gcc cga aga      658

Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala Arg Arg

            150                 155                 160

aag agg ctg ccc gag atg gcc cag cca gtt gac ccg gct cac aat gtc      706

Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His Asn Val

        165                 170                 175

agc cgc ctg cac cgg ctg ccc agg gat tgc cag gag ctg ttc cag gtt      754

Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln Val

    180                 185                 190

ggg gag agg cag agt gga cta ttt gaa atc cag cct cag ggg tct ccg      802

Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly Ser Pro

195                  200                205                 210

cca ttt ttg gtg aac tgc aag atg acc tca gat gga ggc tgg aca gta      850

Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp Thr Val

                215                 220                 225

att cag agg cgc cac gat ggc tca gtg gac ttc aac cgg ccc tgg gaa      898

Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp Glu

            230                 235                 240

gcc tac aag gcg ggg ttt ggg gat ccc cac ggc gag ttc tgg ctg ggt      946

Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His G1y Glu Phe Trp Leu Gly

        245                 250                 255

ctg gag aag gtg cat agc atc acg ggg gac cgc aac agc cgc ctg gcc      994

Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu Ala

    260                 265                 270

gtg cag ctg cgg gac tgg gat ggc aac gcc gag ttg ctg cag ttc tcc     1042

Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser

275                  280                285                 290

gtg cac ctg ggt ggc gag gac acg gcc tat agc ctg cag ctc act gca     1090

Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala

                295                 300                 305

ccc gtg gcc ggc cag ctg ggc gcc acc acc gtc cca ccc agc ggc ctc     1138

Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu

            310                 315                 320

tcc gta ccc ttc tcc act tgg gac cag gat cac gac ctc cgc agg gac     1186

Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp

        325                 330                 335

aag aac tgc gcc aag agc ctc tct gga ggc tgg tgg ttt ggc acc tgc     1234

Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys

    340                 345                 350

agc cat tcc aac ctc aac ggc cag tac ttc cgc tcc atc cca cag cag     1282

Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln

355                 360                 365                 370

cgg cag aag ctt aag aag gga atc ttc tgg aag acc tgg cgg ggc cgc     1330

Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg

                375                 380                 385

tac tac ccg ctg cag gcc acc acc atg ttg atc cag ccc atg gca gca     1378

Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala

            390                 395                 400

gag gca gcc tcc tag cgtcctggct gggcctggtc ccaggcccac gaaagacggt     1433

Glu Ala Ala Ser

        405

gactcttggc tctgcccgag gatgtggccg ttccctgcct gggcaggggc tccaaggagg   1493

ggccatctgg aaacttgtgg acagagaaga agaccacgac tggagaagcc ccctttctga   1553

gtgcaggggg gctgcatgcg ttgcctcctg agatcgaggc tgcaggatat gctcagactc   1613

tagaggcgtg gaccaagggg catggagctt cactccttgc tggccaggga gttggggact   1673

cagagggacc acttggggcc agccagactg gcctcaatgg cggactcagt cacattgact   1733

gacggggacc agggcttgtg tgggtcgaga gcgccctcat ggtgctggtg ctgttgtgtg   1793

taggtcccct ggggacacaa gcaggcgcca atggtatctg ggcggcgtca cagagttctt   1853

ggaataaaag caacctcaga acacttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   1913

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                    1943

<210>2

<211>406

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala

1               5                   10                  15

Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser

            20                  25                   30

Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu

        35                  40                  45

Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser

    50                  55                  60

Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys

65                  70                  75                  80

Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg

                85                  90                  95

Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln

            100                 105                 110

Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg

        115             120                     125

His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe

    130                 135                 140

Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala

145                 150                 155                 160

Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His

                165                 170                 175

Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe

            180                 185                 190

Gln Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly

        195                 200                 205

Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp

    210                 215                 220

Thr Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro

225                 230                 235                 240

Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp

                245                 250                 255

Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg

            260                 265                 270

Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln

        275                 280                 285

Phe Ser Val His Leu Gly Gln Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu

    290             295                     300

Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser

305                 310                 315                 320

Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg

                325                 330                 335

Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly

            340                 345                 350

Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro

        355                 360                 365

Gln Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg

    370                375                  380

Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met

385                 390                 395                 400

Ala Ala Glu Ala Ala Ser

                405

<210>3

<211> 191

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>ANGPTL4缺失突变体Δ1

<400>3

Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala

1               5                   10                  15

Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser

            20                  25                  30

Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu

        35                  40                  45

Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser

    50                  55                  60

Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys

65                  70                  75                  80

Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg

                85                  90                  95

Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln

            100                 105                 110

Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg

        115                 120                 125

His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe

    130                 135                 140

Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala

145                 150                 155                 160

Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His

                165                 170                 175

Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu

            180                 185                 190

<210>4

<211> 341

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>ANGPTL4缺失突变体Δ2

<400>4

Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys Gln

1               5                   10                  15

Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg Val

            20                  25                  30

Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn

        35                  40                  45

Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg His

    50                  55                  60

Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe Gly

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala Arg

                85                  90                  95

Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His Asn

            100                 105                 110

Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln

        115                 120                 125

Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly Ser

    130                 135                 140

Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp Thr

145                 150                 155                 160

Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp

                165                 170                 175

Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp Leu

            180                 185                 190

Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu

        195                 200                 205

Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe

    210                 215                 220

Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr

225                 230                 235                 240

Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly

                245                 250                 255

Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg

            260                 265                 270

Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr

        275                 280                 285

Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln

    290                 295                 300

Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly

305                 310                 315                 320

Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala

                325                 330                 335

Ala Glu Ala Ala Ser

            340

<210>5

<211>224

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>ANGPTL4缺失突变体Δ3

<400>5

Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln Val Gly Glu Arg Gln

1               5                   10                  15

Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly Ser Pro Pro Phe Leu Val

            20                  25                  30

Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg

        35                  40                  45

His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp Glu Ala Tyr Lys Ala

    50                  55                  60

Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Val

65                  70                  75                   80

His Ser lle Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu Ala Val Gln Leu Arg

                85                  90                  95

Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser Val His Leu Gly

            100                 105                 110

Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala Pro Val Ala Gly

        115                 120                 125

Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu Ser Val Pro Phe

    130                 135                 140

Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp Lys Asn Cys Ala

145                 150                 155                 160

Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn

                165                 170                 175

Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln Arg Gln Lys Leu

            180                 185                 190

Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu

        195                 200                 205

Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala Glu Ala Ala Ser

    210                 215                 220

Claims (10)

1.一种ANGPTL4的缺失突变体，其特征在于，所述的缺失突变体具有体外抑制癌细胞生长的功能，并且所述的缺失突变体选自下组：

(a)缺失了SEQ ID NO：2中第192-406位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突变体；

(b)缺失了SEQ ID NO：2中第1-65位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突变体；

(c)缺失了SEQ ID NO：2中第1-182位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突变体。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的突变体氨基酸序列选自：SEQ ID NO：3、4或5。

3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的突变体完全缺失了C端纤连蛋白Fibronectin功能域或卷曲功能域。

4.如权利要求1-3任一所述的ANGPTL4的缺失突变体在制备抑制肝癌细胞生长的药物中的应用。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述缺失体的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：3、4或5所示氨基酸序列的多肽。

7.一种载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的多核苷酸。

8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体。

9.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出ANGPTL4的缺失突变体。

10.如权利要求1所述的ANGPTL4的缺失突变体的用途，其特征在于，用于(a)制备促进肿瘤血管新生的组合物；或(b)制备调节肿瘤细胞迁移能力的组合物。

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