CN1400977A

CN1400977A - 新的人细胞周期控制相关蛋白及其编码序列

Info

Publication number: CN1400977A
Application number: CN01804917.6A
Authority: CN
Inventors: 顾健人; 杨胜利
Original assignee: Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Shanghai Cancer Institute
Priority date: 2000-02-17
Filing date: 2001-02-12
Publication date: 2003-03-05
Anticipated expiration: 2021-02-12
Also published as: CN1160370C; AU2001233587A1; WO2001060855A1

Abstract

本发明公开了一类新的具有抑癌功能的人蛋白，编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病如癌症等的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这类新的具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸的用途。

Description

新的人细胞周期控制相关蛋白及其编码序列发明领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码具有抑癌功能的人细胞周期控制相关基因（crn- l ike gen '， CLG)蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。

发明背景

细胞分裂和增殖是细胞生命活动的基本特征之一。人体及其他多细胞生物体生长发育时，细胞数目的增加，衰老、死亡细胞的更新，生命的延续，均需通过细胞的增殖来完成。细胞增殖周期是细胞通过一系列细胞内事件，实现细胞生长和增殖的过程，各个事件之间存在严格的顺序性，其调控机制涉及多个层次和多种因子，不仅涉及生长因子、环核苷酸、激素、原癌基因等，更重要的是还受到细胞周期调控系统的控制，如细胞分裂周期基因、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖激酶及其抑制蛋白等的调控。

细胞周期的调控，是细胞生物学研究中的核心问题，它涉及到胚胎细胞的有序发育，机体细胞的正常增生，细胞的再生和分化，以及细胞的衰老、凋亡等问题。正常细胞周期必须进行严格有序的调控，细胞周期调控异常将会使细胞发生突变、畸变或癌变。

近年來对细胞周期调控系统进行了深入研究，该系统主要包括细胞分裂周期（cel l division cycle, cdc)基因，细胞周期蛋白（cycl in)，细胞周期蛋白依赖激酶（cycl in - dependent kinase, CDK)和细胞周期蛋白依赖激酶的抑制蛋白（CKI)等。人们依据酵母 (yeast)、果蝇（drosophi la)和线虫（c. elegans)等模式生物，已经分离到了多种人的细胞周期调控基因。如 Lieberman 等依据同源分析方法，分离到一个与酵母 rad9+同源的人细胞周期检査点（checkpoint)控制基因（Lieberman, H. B.， Hopkins, K. M. , et al. Proc. Natl. Acad. Sci . USA 93 : 13890-13895 ; 1996) ₀

癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤，目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此，本领域迫切需要开发研究具有抑癌功能的人蛋白及其激动剂 /抑制剂，尤其是参与细胞周期调控作用的蛋白。

发明概述

本发明的目的是提供一类新的具有抑癌功能的人蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的具有抑癌功能的蛋白多肽，它包含具有 SEQ ID NO : 2氨基酸序列的多肽；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是包含 SEQ ID NO : 2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少 85%相同性：（a)编码上述的 CLG蛋白多肽的多核苷酸；（b)与多核苷酸（a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有 SEQ ID NO : 2的氨基酸序列。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组： SEQ ID N0: 3的编码区序列 (22- 2586位）或全长序列（1一 2659位）。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有 CLG蛋白活性的多肽的制备方法，该方法包含：（a)在适合表达 CLG 蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；（b)从培养物中分离出具有 CLG蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的 CLG蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的 10-800个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的 CLG 蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。

本发明其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图 1是 CLG的 RNA表达谱。

图 2显示了 CLG全长 cDNA对人肝癌细胞 S画 C 7721 集落形成的抑制作用。其中图

2A为载体对照（pCMV-Scr ipt)，集落数为 56个；图 2B为 CLG (pCMV- Script/CLG)，集落数仅为 3个。

图 3是用 CLG转染的 S删 C-7721细胞接种裸鼠后形成的肿瘤组织的石蜡切片照片。图 3A为坏死灶内，可见较多阳性凋亡细胞；图 3B为未坏死区，可见散在的凋亡细胞。

图 4显示了转染 CLG基因后的"梯形" DNA (DNA ladder)电泳图。其中各泳道为： 1 . 转染空载体； 2. 转染 p53 ; 3. 转染 CLG; 4. 未转染对照点； 5. 分子量标准。

图 5 CLG蛋白表达的 SDS— PAGE电泳图。其中，各泳道是： 1 . 蛋白分子量标准； 2. pET32a-CLG 菌体超声上清； 3. pET32a 菌体超声上清； 4. pET32a-CLG 菌体超声沉淀； 5. pET32a菌体超声沉淀。发明详述

本发明采用大规模 cDNA 克隆转染癌细胞，在获得具有抑癌作用的基础上，经测序证明为新的基因，进一步得到全长 cDNA克隆。 DNA转染试验证明，本发明的具有抑癌功能的蛋白对癌细胞（肝癌细胞）具有抑制克隆形成的作用，其抑制率 50%。

在一个实例中，从人胎盘 cDNA 文库中分离到一个与线虫、果蝇和酵母的细胞周期调控蛋白高度同源的新基因，它与线虫的细胞周期调控蛋白具有 66% (557/837)同源性，与果蝇的细胞周期调控蛋白（crooked neck, crn)有 41% (157/375)同源性，与酵母的细胞周期控制蛋白有 37°/。 (228/599)同源性。从生物信息学可以判定人 CLG (crn- l ike gene ; 原序号为 PP3898 , GenBank登录号 AF258567, 登录日期 2000年 4月 24 日）是一个新的人细胞周期相关基因。经过初步功能研究发现， CLG可在体外抑制人肝癌细胞 SMMC-7721 的生长；肝癌细胞 S删 C- 7721裸鼠移植瘤组织的原位凋亡检测和 DNA电泳分析表明， CLG 基因转染 S删 C-7721细胞后能诱导肿瘤细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞的生长。在本文中， "细胞周期控制相关基因蛋白" 、 " CLG蛋白" 、和 " PP3898蛋白"可互换使用，都指具有人细胞周期控制相关基因蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0 : 2)的多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的细胞周期控制相关基因蛋白。

如本文所用， "分离的" 是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物质，原始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分幵，则为分离纯化的。

如本文所用， "分离的 CLG蛋白或多肽" 是指 CLG蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化 CLG 蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。 CLG 蛋白多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主 (例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人 CLG蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语 "片段" 、 "衍生物"和 "类似物" 是指基本上保持本发明的天然人 CLG 蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或（i i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或（i i i)成熟多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列）。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或 RNA形式。 DNA形式包括 cDNA、基因组 DNA或人工合成的 DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是编码链或非编码链。以 CLG 蛋白为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID N0 : 3 所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用， "简并的变异体"在本发明中是指编码具有 SEQ ID N0 : 2 的蛋白质，但与 SEQ ID N0 : 3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列

+各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列（+任选的附加编码序列） +非编码序列。

术语 "编码多肽的多核苷酸" 可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和 /或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少 50%，较佳地至少 70%' 更佳地至少 80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中， "严格条件" 是指：（1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如 0. 2 X SSC, 0. 1%SDS, 60 "C ; 或（2)杂交时加有变性剂，如 50% (v/v) 甲酰胺， 0. 1%小牛血清 /0. 1% Ficoll , 42 °C等；或（3)仅在两条序列之间的相同性至少在 95%以上，更好是 97%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID NO: 2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用， "核酸片段" 的长度至少含 15个核苷酸，较好是至少 30个核苷酸，更好是至少 50个核苷酸，最好是至少 100 个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术（如 PCR)以确定和 /或分离编码 CLG蛋白的多聚核苷酸。

本发明的 DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离 DNA。这些技术包括但不局限于： 1)用探针与基因组或 cDNA 文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和 2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的 DNA片段。

编码 CLG蛋白的特异 DNA片段序列产生也能用下列方法获得： 1 )从基因组 DNA分离双链 DNA序列； 2)化学合成 DNA序列以获得所需多肽的双链 DNA。

上述提到的方法中，分离基因组 DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时， DNA 序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时， DNA序列的直接化学合成是不可能的，选用的方法是 cDNA序列的分离。分离感兴趣的 cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离 mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体 cDNA文库。提取 mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得（Qiagene)。而构建 cDNA 文库也是通常的方法（Sambrook, et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Col d Spri ng Harbor Laboratory. New York , 1989)。还可得到商业供应的 cDNA文库，如 Clontech公司的不同 cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。

可用常规方法从这些 cDNA 文库中筛选本发明的基因。这些方法包括（但不限于）：

( l ) DNA- DNA或 DNA- RNA杂交；（2)标志基因的功能出现或丧失；（3)测定 CLG蛋白的转录本的水平；（4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。

在第（1 )种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少 15个核苷酸，较好是至少 30个核苷酸，更好是至少 50个核苷酸，最好是至少 100个核苷酸。此外，探针的长度通常在 2kb之内，较佳地为 lkb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因 DNA序列信息的基础上化学合成的 DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。 DNA 探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶（如碱性磷酸酶）等。

在第（4)种方法中，检测 CLG 蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如 Western 印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法（ELISA)等。

应用 PCR技术扩增 DNA/RNA的方法（Saiki , et al . Sci ence 1985 ; 230 : 1350-1354) 被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的 cDNA时，可优选使用 RACE 法（RACE- cDNA 末端快速扩增法），用于 PCR 的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法^成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的 DNA/RNA片段。

如上所述得到的本发明的基因，或者各种 DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法（Sanger t a] . PNAS, 1977， 74： 5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的 cDNA 序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的 cDNA序列，才能拼接成全长的 cDNA序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或 CLG蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组 DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的 CLG蛋白多肽（Science , 1984； 224： 1431)。一般来说有以下步骤：

(1) .用本发明的编码人 CLG蛋白的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3) .从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人 CLG蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语 "重组表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于 T7的表达载体（Rosenberg, et al. Gene, 1987, 56 : 125)；在哺乳动物细胞中表达的 pMSXND表达载体（Lee and Nathans, J Bio Chem. 263 : 3521, 1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人 CLG蛋白编码 DNA序列和合适的转录 /翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组 DNA技术、 DNA合成技术、体内重组技术等（Sambroook, et al)。所述的 DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导 mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的 lac或 trp启动子； λ噬菌体 PL启动子；真核启动子包括 CMV立即早期启动子、 HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期 SV40 启动子、反转录病毒的 LTRs 和其他一些已知可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白（GFP) , 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当 DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇 S2或 Sf9的昆虫细胞； CH0、 COS或 Bowes 黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是 DNA的顺式作用因子，通常大约有 10到 300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的 100到 270个碱基对的 SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收 DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用 MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的 DNA 转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人 CLG蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括（但不限于）：直接做为药物治疗 CLG蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗 CLG蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制人 CLG 蛋白的功能。用表达的重组人 CLG蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人 CLG蛋白功能的多肽分子。

本发明也提供了筛选药物以鉴定提高（激动剂）或阻遏（拮抗剂）人 CLG蛋白的药剂的方法。激动剂提高人 CLG 蛋白刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达人 CLG 蛋白的膜制剂与标记的人 CLG 蛋白一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。

人 CLG蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。人 CLG 蛋白的拮抗剂可以与人 CLG蛋白结合并消除其功能，或是抑制人 CLG蛋白的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。人 CLG 蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。

在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将 CLG蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响 CLG 蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人 B-细胞杂交瘤技术， EBV-杂交瘤技术等。

可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。

本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。 CLG 蛋白以有效地治疗和 /或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的 CLG 蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

人 CLG蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于 CLG 蛋白的无表达或异常 /无活性的 CLG蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体（如病毒载体）可设计成表达变异的 CLG蛋白，以抑制内源性的 CLG蛋白活性。例如，一种变异的 CLG蛋白可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的 CLG蛋白，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗 CLG 蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将 CLG 蛋白基因转移至细胞内。构建携带 CLG蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献（Sambr₀₀k，et al . )。另外重组人 CLG蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。

抑制人 CLG蛋白 mRNA的寡聚核苷酸（包括反义 RNA和 DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定 RNA的酶样 RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶 RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的 RNA和 DNA及核酶可用已有的任何 RNA或 DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义 RNA分子可通过编码该 RNA的 DNA序列在体外或体内转录获得。这种 DNA序列已整合到载体的 RNA 聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体（如病毒、噬菌体或质粒等）先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还提供了针对人 CLG蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括（但不限于）：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、 Fab 片段和 Fab 表达文库产生的片段。抗人 CLG蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人 CLG蛋白。

与人 CLG蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。本发明中的抗体可用于治疗或预防与人 CLG蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以剌激或阻断人 CLG蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人 CLG蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素（如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等）共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如 SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人 CLG蛋白阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用人 CLG蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

人 CLG蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产（Kohler and i lstein. Nature, 1975, 256 : 495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产 (Morrison et al ， PNAS, 1985， 81 : 6851)。而已有的生产单链抗体的技术（U. S. Pat No. 4946778)也可用于生产抗人 CLG蛋白的单链抗体。

能与人 CLG蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人 CLG蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人 CLG蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括 FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人 CLG蛋白水平，可以用作解释人 CLG蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断 CLG蛋白起作用的疾病。

CLG 蛋白的多聚核苷酸可用于 CLG 蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面， CLG 蛋白的多聚核苷酸可用于检测 CLG蛋白的表达与否或在疾病状态下 CLG蛋白的异常表达。如 CLG蛋白 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断 CLG蛋白的表达异常。杂交技术包括 Southern 印迹法， Northern 印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列（Microarray)或 DNA 芯片（又称为 "基因芯片" ）上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用 CLG蛋白特异的引物进行 RNA-聚合酶链反应（RT- PCR)体外扩增也可检测 CLG蛋白的转录产物。

检测 CLG蛋白基因的突变也可用于诊断 CLG蛋白相关的疾病。 CLG蛋白突变的形式包括与正常野生型 CLG蛋白 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如 Southern 印迹法、 DNA序列分析、 PCR和原位杂交检测突变。另夕卜，突变有可能影响蛋白的表达，因此用 Northern印迹法、 Western 印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据（重复多态性）的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些 DNA序列定位于染色体上。

简而言之，根据 cDNA制备 PCR引物（优选 15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于 PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

体细胞杂合细胞的 PCR定位法，是将 DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色'本定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的 cDNA库。

将 cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交（FISH) , 可以在一个步骤中精确地进行染色体定位此技术的综述，参见 Verma等， Human Chromosomes： a Manual of Basic Techniques, Pergaraon Press, New York (1988)。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如， V. Mckusick, Mendel ian Inheri tance in Man (可通过与 Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

接着，需要测定患病和未患病个体间的 cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于 cDNA序列的 PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的 cDNA，可以是 50至 500个潜在致病基因间之一种（假定 1兆碱基作图分辨能力和每 20kb对应于一个基因）。

本发明的 CLG蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于 PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的 cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的 cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次 PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关序列，就可以用重组法来大批量地获得该序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生物）的 DNA 序列。然后可将该 DNA序列引入本领域中的各种 DNA分子（如载体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

此外，由于本发明的 CLG蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和 /或更低的副作用 (例如在人体内的免疫原性更低或没有)。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例 1 : cDNA基因片段的获得及对癌细胞克隆形成的抑制作用

PP3898 (即 CLG)来自于用常规方法构建人胎盘 cDNA文库。取 3、 6、 10月龄的胎盘组织，用 Trizol试剂（GIBC0 BRL公司）按厂方说明书提取总 RNA，用 mRNA提纯试剂盒（Pharmacia公司）提取 mRNA。用 pCMV-script TMXR cDNA文库构建试剂盒（Seratagene 公司）构建上述 I RNA的 cDNA文库。其中反转录酶改用 MMLV-RT- Superscript II(GIBC0 BRL)，反转录反应在 42°C进行。转化 XL 10-Gold感受细胞，获得了 lxlO⁶ cfu/ g cDNA 滴度的 cDNA文库。第一轮随机挑取 cDNA克隆，其后以高丰度 cDNA克隆和已证明有抑癌细胞生长功能的 cDNA克隆为探针，杂交筛选 cDNA文库，挑取弱阳性及阴性克隆。用 Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒，按厂家说明书进行质粒 DNA的提取。质粒 DNA和空载体同时转染肝癌细胞系 7721。 lOOng DNA酒精沉淀干燥后，加 6μ1 Η₂0溶解，待转染。每份 DNA样品中加 0.74μ1脂质体及 9.3μ1无血清培液，混匀后，室温放置 10分钟。每管中加 150μ1无血清培液，均分加入 3孔生长于 96孔板的 7721细胞中， 37°C 放置 2小时，每孔再加 50μ1无血清培液， 37Ό 24小时。每孔换 ΙΟΟμΙ全培液， 37°C 24 小时，换含 G418的全培液 100μ1， 37 °C 24-48小时，边观察，边换 G418浓度不等的培液。约 2- 3次后，直到镜检细胞有克隆形成，计数。发现 PP3898(即 CLG)有抑制细胞克隆形成作用（抑制率在 50%或 50%以上），结果如下表所示。

cDNA克隆转染细胞（7721)克隆形成情况

cDNA克隆名称 CDNA克隆数 (三个重复）空载体克隆数 (三个重复）

PP3898 (即 CLG) 2 0 0 33 34 38 对 cDNA克隆采用双脱氧终止法，在 ABI377 DNA 自动测序仪上测定其一端近 500bp 的核苷酸序列。分析后，确定为新基因克隆，再进行完全测序，发现 CLG 片段为非全长序列，需用 RACE方法获取全长 cDNA克隆。实施例 2: RACE法获得全长 cDNA克隆和 RT- PCR法获得 CLC基因

1. RACE法获得全长 cDNA克隆

对 PP3898 cDNA克隆序列分析后发现基因尚不完整，采用 Clontech公司 SMART RACE cDNA 扩增试剂盒（Cat. No. K1811-1) , 设计基因特异引物（如下表 2 所示），按说明书进行操作，获得全长克隆。

表 2 CLG基因特异引物

具体而言，对 PP3898克隆使用如下引物：

通用引物 mix(UPM) Long 5' CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT3'

巢式通用引物（NUP) 5' AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT 3'

pp3898-NB 5' TCATCCAGCCGGTCACTTGACTTGA 3'

pp3898-B 5' GCCACAGCTGGTAGTTGGACTTGCC 3'

用人胎盘组织 mRNA为起始材料，按 Clontech公司 SMART RACE cDNA扩增试剂盒 (Catftl811- 1)说明书获得 cDNA.然后分别以 UPM 引物和基因特异的 pp3898- B引物进行第一轮 PCR，再以 NUP 引物和基因特异的 pp3898- NB引物进行第二轮 PCR，获得基因片段。

反应条件如下： 94°C 1分钟，一个循环； 94°C 30秒， 72°C 4分钟， 5个循环； 94 °C 30秒， 70 °C 4分钟， 5个循环； 94 °C 20秒， 65 °C 30秒， 68 °C 4分钟， 27 个循环。

SMART RACE反应，获得 CLG基因的 5'延伸片段，经重组连接，获得全长 CLG基因的 cDNA克隆，如 SEQ ID NO : 1所示。

2. RT— PCR法获得 CLG基因

合成引物 CLG- F (5 ' ATGGTGGTGATGGCGCGACTCTCG 3 ' , bp 22-45 位）和 CLG- R (5 ' GGTCAGTCTTCCTTCAGGCTCCC 3 ' , bp 2569-2591位），采用 RT- PCR的方法（其中 RT- PCR 反应条件与上述 SMART RACE反应条件相同），从而获得含有完整编码区的 CLG基因， RT-PCR产物大小为 2570bp。实施例 3 : CLG cDNA克隆的序列分析

A : 核苷酸序列（SEQ ID NO : 1 ) 长度： 2659

GGTACCTGGG CATCCAGAAA AATGGTGGTG ATGGCGCGAC TCTCGCGGCC CGAGCGGCCG 60

GACCTTGTCT TCGAGGAAGA GGACCTCCCC TATGAGGAGG AAATCATGCG GAACCAATTC 120

TCTGTCAAAT GCTGGCTTCG CTACATCGAG TTCAAACAGG GCGCCCCGAA GCCCAGGCTC 180

AATCAGCTAT ACGAGCGGGC ACTCAAGCTG CTGCCCTGCA GCTACAAACT CTGGTACCGA 240

TACCTGAAGG CGCGTCGGGC ACAGGTGAAG CATCGCTGTG TGACCGACCC TGCCTATGAA 300

GATGTCAACA ACTGTCATGA GAGGGCCTTT GTGTTCATGC ACAAGATGCC TCGTCTGTGG 360

CTAGATTACT GCCAGTTCCT CATGGACCAG GGGCGCGTCA CACACACCCG CCGCACCTTC 420

GACCGTGCCC TCCGGGCACT GCCCATCACG CAGCACTCTC GAATTTGGCC CCTGTATCTG 480

CGCTTCCTGC GCTCACACCC ACTGCCTGAG ACAGCTGTGC GAGGCTATCG GCGCTTCCTC 540

AAGCTGAGTC CTGAGAGTGC AGAGGAGTAC ATTGAGTACC TCAAGTCAAG TGACCGGCTG 600

GATGAGGCCG CCCAGCGCCT GGCCACCGTG GTGAACGACG AGCGTTTCGT GTCTAAGGCC 660

GGCAAGTCCA ACTACCAGCT GTGGCACGAG CTGTGCGACC TCATCTCCCA GAATCCGGAC 720

AAGGTACAGT CCCTCAATGT GGACGCCATC ATCCGCGGGG GCCTCACCCG CTTCACCGAC 780

CAGCTGGGCA AGCTCTGGTG TTCTCTCGCC GACTACTACA TCCGCAGCGG CCATTTCGAG 840

AAGGCTCGGG ACGTGTACGA GGAGGCCATC CGGACAGTGA TGACCGTGCG GGACTTCACA 900

CAGGTGTTTG ACAGCTACGC CCAGTTCGAG GAGAGCATGA TCGCTGCAAA GATGGAGACC 960

GCCTCGGAGC TGGGGCGCGA GGAGGAGGAT GATGTGGACC TGGAGCTGCG CCTGGCCCGC 1020

TTCGAGCAGC TCATCAGCCG GCGGCCCCTG CTCCTCAACA GCGTCTTGCT GCGCCAAAAC 1080

CCACACCACG TGCACGAGTG GCACAAGCGT GTCGCCCTGC ACCAGGGCCG CCCCCGGGAG 1140

ATCATCAACA CCTACACAGA GGCTGTGCAG ACGGTGGACC CCTTCAAGGC CACAGGCAAG 1200

CCCCACACTC TGTGGGTGGC GTTTGCCAAG TTTTATGAGG ACAACGGACA GCTGGACGAT 1260

GCCCGTGTCA TCCTGGAGAA GGCCACCAAG GTGAACTTCA AGCAGGTGGA TGACCTGGCA 1320

AGCGTGTGGT GTCAGTGCGG AGAGCTGGAG CTCCGACACG AGAACTACGA TGAGGCCTTG 1380

CGGCTGCTGC GAAAGGCCAC GGCGCTGCCT GCCCGCCGGG CCGAGTACTT TGATGGTTCA 1440

GAGCCCGTGC AGAACCGCGT GTACAAGTCA CTGAAGGTCT GGTCCATGCT CGCCGACCTG 1500

GAGGAGAGCC TCGGCACCTT CCAGTCCACC AAGGCCGTGT ACGACCGCAT CCTGGACCTG 1560

CGTATCGCAA CACCCCAGAT CGTCATCAAC TATGCCATGT TCCTGGAGGA GCACAAGTAC 1620

TTCGAGGAGA CCTTCAAGGC GTACGAGCGC GGCATCTCGC TGTTCAAGTG GCCCAACGTG 1680

TCCGACATCT GGAGCACCTA CCTGACCAAA TTCATTGCCC GCTATGGGGG CCGCAAGCTG 1740

GAGCGGGCAC GGGACCTGTT TGAACAGGCT CTGGACGGCT GCCCCCCAAA ATATGCCAAG 1800

ACCTTGTACC TGCTGTACGC ACAGCTGGAG GAGGAGTGGG GCCTGGCCCG GCATGCCATG 1860

GCCGTGTACG AGCGTGCCAC CAGGGCCGTG GAGCCCGCCC AGCAGTATGA CATGTTCAAC 1920

ATCTACATCA AGCGGGCGGC CGAGATCTAT GGGGTCACCC ACACCCGCGG CATCTACCAG 1980

AAGGCCATTG AGGTGCTGTC GGACGAGCAC GCGCGTGAGA TGTGCCTGCG GTTTGCAGAC 2040

ATGGAGTGCA AGCTCGGGGA GATTGACCGC GCCCGGGCCA TCTACAGCTT CTGCTCCCAG 2100

ATCTGTGACC CCCGGACGAC CGGCGCGTTC TGGCAGACGT GGAAGGACTT TGAGGTCCGG 2160

CATGGCAATG AGGACACCAT CAAGGAAATG CTGCGTATCC GGCGCAGCGT GCAGGCCACG 2220

TACAACACGC AGGTCAACTT CATGGCCTCG CAGATGCTCA AGGTCTCGGG CAGTGCCACG 2280

GGCACCGTGT CTGACCTGGC CCCTGGGCAG AGTGGCATGG ACGACATGAA GCTGCTGGAA 2340

CAGCGGGCAG AGCAGCTGGC GGCTGAGGCG GAGCGTGACC AGCCCTTGCG CGCCCAGAGC 2400

AAGATCCTGT TCGTGAGGAG TGACGCCTCC CGGGAGGAGC TGGCAGAGCT GGCACAGCAG 2460 GTCAACCCCG AGGAGATCCA GCTGGGCGAG GACGAGGACG AGGACGAGAT GGACCTGGAG 2520 CCCAACGAGG TTCGGCTGGA GCAGCAGAGC GTGCCAGCCG CAGTGTTTGG GAGCCTGAAG 2580 GAAGACTGAC CCGTCCCTCC CCCCTCCCCA CCCCCTCCCC AATACAGCTA CGTTTGTAAA 2640 AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 2659

B: 氨基酸序列 (SEQ I[ NO : 2) 长度： 85

1 MVVMARLSRP ERPDLVFEEE DLPYEEEIMR NQFSVKCWLR YIEFKQGAPK

51 PRLNQLYERA LKLLPCSYKL WYRYLKARRA QVKH CVTDP AYEDVNNCHE

101 RAFVF HK P RLWLDYCQFL MDQGRVTHTR RTFDRALRAL PITQHSRIWP

151 LYLRFLRSHP LPETAVRGYR RFLKLSPESA EEYIEYLKSS DRLDEAAQRL

201 ATVVNDERFV SKAGKSNYQL WHELCDLISQ NPDKVQSLNV DAI IRGGLTR

251 FTDQLGKLWC SLADYYIRSG HFEKARDVYE EAIRTVMTVR DFTQVFDSYA

301 QFEESMIAAK METASELGRE EEDDVDLELR LARFEQLISR RPLLLNSVLL

351 RQNPHHVHEW HKRVALHQGR PREI INTYTE AVQTVDPFKA TGKPHTLWVA

401 FAKFYEDNGQ LDDARVILEK ATKVNFKQVD DLASVWCQCG ELELRHENYD

451 EALRLLRKAT ALPARRAEYF DGSEPVQNRV YKSLKVWSML ADLEESLGTF

501 QSTKAVYDRI LDLRIATPQI VINYAMFLEE HKYFEESFKA YERGISLFKW

551 PNVSDIWSTY LTKFIARYGG RKLERARDLF EQALDGCPPK YAKTLYLLYA

601 QLEEEWGLAR HAMAVYERAT RAVEPAQQYD MFNIYIKRAA EIYGVTHTRG

651 IYQKAIEVLS DEHAREMCLR FADMECKLGE IDRARAIYSF CSQICDPRTT

701 GAFWQTWKDF EVRHGNEDTI EMLRIRRSV QATYNTQVNF MASQMLKVSG

751 SATGTVSDLA PGQSGMDDMK LLEQRAEQLA AEAERDQPLR AQSKILFVRS

801 DASREELAEL AQQVNPEEIQ LGEDEDEDEM DLEPNEVRLE QQSVPAAVFG

851 SLKED

C. 核苷酸及氨基酸组合序列：（SEQ ID NO : 3) 克隆号： CLG (即 PP3898) 起始编码子： 22 ATG 终止编码子： 2589 TGA 蛋白质分子量： 100004. 44

1 GGT ACC TGG GCA TCC AGA AAA ATG GTG GTG ATG GCG CGA CTC TCG CGG 48

1 Met Val Val Met Al a Arg Leu Ser Arg 9

49 CCC GAG CGG CCG GAC CTT GTC TTC GAG GAA GAG GAC CTC CCC TAT GAG 96

10 Pro Glu Arg Pro Asp Leu Val Phe Glu Glu Glu Asp Leu Pro Tyr Gl u 25

97 GAG GAA ATC ATG CGG AAC CAA TTC TCT GTC AAA TGC TGG CTT CGC TAC 144

26 Glu Glu l i e Met Arg Asn Gin Phe Ser Val Lys Cys Trp Leu Arg Tyr 41

145 ATC GAG TTC AAA CAG GGC GCC CCG AAG CCC AGG CTC AAT CAG CTA TAC 192

42 l ie Glu Phe Lys Gin Gly Ala Pro Lys Pro Arg Leu Asn Gin Leu Tyr 57

193 GAG CGG GCA CTC AAG CTG CTG CCC TGC AGC TAC AAA CTC TGG TAC CGA 240

58 Glu Arg Ala Leu Lys Leu Leu Pro Cys Ser Tyr Lys Leu Trp Tyr Arg 73

241 TAC CTG AAG GCG CGT CGG GCA CAG GTG AAG CAT CGC TGT GTG ACC GAC 288

74 Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ala Gin Val Lys Hi s Arg Cys Val Thr Asp 89

289 CCT GCC TAT GAA GAT GTC AAC AAC TGT CAT GAG AGG GCC TTT GTG TTC 336

90 Pro Ala Tyr Glu Asp Val Asn Asn Cys Hi s Glu Arg Ala Phe Val Phe 105

337 ATG CAC AAG ATG CCT CGT CTG TGG CTA GAT TAC TGC CAG TTC CTC ATG 384

106 Met Hi s Lys Met Pro Arg Leu Trp Leu Asp Tyr Cys Gin Phe Leu Met 121

385 GAC CAG GGG CGC GTC ACA CAC ACC CGC CGC ACC TTC GAC CGT GCC CTC 432

122 Asp Gin Gl y Arg Val Thr His Thr Arg Arg Thr Phe Asp Arg Al a Leu 137

433 CGG GCA CTG CCC ATC ACG CAG CAC TCT CGA ATT TGG CCC CTG TAT CTG 480

138 Arg Ala Leu Pro l ie Thr Gin Hi s Ser Arg l ie Trp Pro Leu Tyr Leu 153

481 CGC TTC CTG CGC TCA CAC CCA CTG CCT GAG ACA GCT GTG CGA GGC TAT 528

154 Arg Phe Leu Arg Ser Hi s Pro Leu Pro Glu Thr Ala Val Arg Gly Tyr 169

529 CGG CGC TTC CTC AAG CTG AGT CCT GAG AGT GCA GAG GAG TAC ATT GAG 576

170 Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ser Pro Glu Ser Ala Glu Glu Tyr l i e Glu 185

577 TAC CTC AAG TCA AGT GAC CGG CTG GAT GAG GCC GCC CAG CGC CTG GCC 624

186 Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Arg Leu Asp Glu Ala Al a Gin Arg Leu Ala 201 - -

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iriOO/IOMD/IDd SS809/I0 OAV 586 Gly Cys Pro Pro Lys Tyr Ala Lys Thr Leu Tyr Leu Leu Tyr Ala Gin 601

1825 CTG GAG GAG GAG TGG GGC CTG GCC CGG CAT GCC ATG GCC GTG TAC GAG 1872

602 Leu Glu Glu Glu Trp Gly Leu Ala Arg His Ala Met Ala Val Tyr Glu 617

1873 CGT GCC ACC AGG GCC GTG GAG CCC GCC CAG CAG TAT GAC ATG TTC AAC 1920

618 Arg Ala Thr Arg Ala Val Glu Pro Ala Gin Gin Tyr Asp Met Phe Asn 633

1921 ATC TAC ATC AAG CGG GCG GCC GAG ATC TAT GGG GTC ACC CAC ACC CGC 1968

634 l ie Tyr l ie Lys Arg Ala Ala Glu l ie Tyr Gly Val Thr Hi s Thr Arg 649

1969 GGC ATC TAC CAG AAG GCC ATT GAG GTG CTG TCG GAC GAG CAC GCG CGT 2016

650 Gly l ie Tyr Gin Lys Ala l ie Glu Val Leu Ser Asp Glu His Ala Arg 665

2017 GAG ATG TGC CTG CGG TTT GCA GAC ATG GAG TGC AAG CTC GGG GAG ATT 2064

666 Glu Met Cys Leu Arg Phe Ala Asp Met Glu Cys Lys Leu Gly Glu l ie 681

2065 GAC CGC GCC CGG GCC ATC TAC AGC TTC TGC TCC CAG ATC TGT GAC CCC 2112

682 Asp Arg Ala Arg Ala l ie Tyr Ser Phe Cys Ser Gin l ie Cys Asp Pro 697

2113 CGG ACG ACC GGC GCG TTC TGG CAG ACG TGG AAG GAC TTT GAG GTC CGG 2160

698 Arg Thr Thr Gly Ala Phe Trp Gin Thr Trp Lys Asp Phe Glu Val Arg 713

2161 CAT GGC AAT GAG GAC ACC ATC AAG GAA ATG CTG CGT ATC CGG CGC AGC 2208

714 His Gly Asn Glu Asp Thr l ie Lys Glu Met Leu Arg l ie Arg Arg Ser 729

2209 GTG CAG GCC ACG TAC AAC ACG CAG GTC AAC TTC ATG GCC TCG CAG ATG 2256

730 Val Gin Ala Thr Tyr Asn Thr Gin Val Asn Phe Met Ala Ser Gin Met 745

2257 CTC AAG GTC TCG GGC AGT GCC ACG GGC ACC GTG TCT GAC CTG GCC CCT 2304

746 Leu Lys Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly Thr Val Ser Asp Leu Al a Pro 761

2305 GGG CAG AGT GGC ATG GAC GAC ATG AAG CTG CTG GAA CAG CGG GCA GAG 2352

762 Gly Gin Ser Gly Met Asp Asp Met Lys Leu Leu Glu Gin Arg Ala Glu 777

2353 CAG CTG GCG GCT GAG GCG GAG CGT GAC CAG CCC TTG CGC GCC CAG AGC 2400

778 Gin Leu Ala Ala Glu Ala Glu Arg Asp Gin Pro Leu Arg Al a Gin Ser 793

2401 AAG ATC CTG TTC GTG AGG AGT GAC GCC TCC CGG GAG GAG CTG GCA GAG 2448

794 Lys l ie Leu Phe Val Arg Ser Asp Ala Ser Arg Glu Glu Leu Ala Glu 809

2449 CTG GCA CAG CAG GTC AAC CCC GAG GAG ATC CAG CTG GGC GAG GAC GAG 2496

810 Leu Ala Gin Gin Val Asn Pro Glu Glu l ie Gin Leu Gl y Glu Asp Glu 825

2497 GAC GAG GAC GAG ATG GAC CTG GAG CCC AAC GAG GTT CGG CTG GAG CAG 2544

826 Asp Glu Asp Glu Met Asp Leu Glu Pro Asn Glu Val Arg Leu Glu Gin 841

2545 CAG AGC GTG CCA GCC GCA GTG TTT GGG AGC CTG AAG GAA GAC TGA CCC 2592

842 Gin Ser Val Pro Ala Ala Val Phe Gly Ser Leu Lys Glu Asp *** 856

2593 GTC CCT CCC CCC TCC CCA CCC CCT CCC CAA TAC AGC TAC GTT TGT AAA 2640

2641 AAA AAA AAA AAA AAA AAA A 2659 实施例 4 : 同源比较和结构分析

应用 Blast软件，对 CLG的氨基酸序列进行同源性分析，发现与果蝇、线虫和酵母的细胞周期调控蛋白高度同源：与果蝇的细胞周期调控蛋白（crooked neck, crn)有 41% ( 157/375)的同源性，与线虫的细胞周期调控蛋白具有 66% (557/837)的同源性，与酵母的细胞周期控制蛋白有 37% (228/599)的同源性。

Query = CLG Sbjct = crn (果蝇）

> crn基因长度 = 702

分值 = 69. 9 bits (168) , 预计值 = 6e-l l

相同性 = 88/375 (23%) , 相似性 = 157/375 (41%) , 缺口 = 33/375 (8%) 1090333AaVAiWnidSaHAHV5AS5M3AaDd¾— dAADVHQWAnVV¾VH¾HM3W3VAV fff ^ofqS

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GT +S + VYD++++LR+A+PQ+++NYAMFLEE++YFE +F+AYE+GI+LFKWP V DIW Sbjct : 502 GTVESCRKVYDKMIELRVASPQMIMNYAMFLEENEYFELAFQAYEKGIALFKWPGVFDIW 561

Query : 558 STYLTKFIARYGGRKLERARDLFEQALDGCPPKYAKTLYLLYAQLEEEWGLARHAMAVYE 617

+TYL KFI RYGG+KLERARDLFEQ L+ CPP +AK ++LLYA+LEEE GLARHA+++Y Sbjct : 562 NTYLVKFIKRYGGKKLERARDLFEQCLENCPPTHA YIFLLYAKLEEEHGLARHALSIYN 621

Query : 618 RATRAVEPAQQYDMFNIYIKRAAEIYGVTHTRGIYQKAIEVLSDEHAREMCLRFADMECK 677

RA V+ A + M+NIYIK+ E+YG+ R I+++AI L ++ +R M LR+A +E Sbjct : 622 RACSGVDRADMHSMYNIYIKKVQEMYGIAQCRPIFERAISELPEDKSRAMSLRYAQLETT 681

Query : 678 LGEID ARAIYSFCSQICDPRTTGAFWQTWKDFEVRHGNEDTIKEMLRI RSVQATYNTQ 737

+GEIDRARAIY+ ++I DP+ FW TWK+FEV HGNE T+++MLR+RRSV+A+YN Sbjct : 682 VGEIDRARAIYAHAAEISDPKVHVKFWDTWKNFEVAHGNEATVRDMLRVRRSVEASYNVN 741

Query : 738 VNFMASQM-LKVSGSATGTVSDLAPGQSGMDDMKXXXXXXXXXXXXXXXDQPLRAQSK I L 796

V + QM + A T + P S +D + Q + I

Sbjct : 742 VTLTSVQMRVDAERKAQETTTSSNPMDS-LDQQQQQPSDGAGSIT QVSMNKGNIS 795

Query : 797 FVRSDASREELAELAQQVNPEEIQLGXXXXXXXXXXXXXXVRLEQQSVPAAVFGSLK 853

FVR + + NP+EI L + + + VPA +FG+LK

Sbjct : 796 FVRGAG --- KTVQQNTTENPDEIDLDEDDDDEEDDGGDADISV— KVVPAQIFGNL 847

Query = CLG Sbjct =推定的细胞周期调控蛋白 (酵母）

> 推定的细胞周期调控蛋白长度 = 674

分值 = 78. 4 bits (190) , 预计值 = le-13

相同性 = 125/599 (20%) , 相似性 = 228/599 (37%) 缺口 = 115/599 (19%)

Query : 24 YEEEIMRNQFSVKCWLRYIEFKQGAPK-PRLNQLYERALKLLPCSYKLWYRYLKARRAQV 82

+E+ I RN+ ++ W+RY +++ + R ++ERAL + LW +Y++ ++

Sbjct : 59 FEDAIRRNRLAMGHWMRYGQWELDQ EFARARSVFERALDVDSTYIPLWLKYIEC --- EM 115

Query : 83 KHRCVTDPAYEDVNNCHE AFVFMHKMPRLWLDYCQFLMDQGRVTHTRRTFDRALRALPI 142

K+R + N +RA + ++ +LW Y G +T + F+R L+ P

Sbjct : 116 KNRNINH ARNLFDRAVTQLPRVDKLWYK Y V YMEEMLGN I TGCRQ VFERWLKWEP- 169

Query : 143 TQHSRIWPLYLRFLRSHPLPETAVRGYRRFLKLSPESAEEYIEYLKSSDRLDEAAQRLAT 202

W Y+R + E A Y RF+ + PE ++ + + + AA

Sbjct : 170 — DENCWMSYIRMERRYHENERARGIYERFVVVHPE-VTNWLRWARFEEECGNAA 221

Query： 203 VVNDERFVSKAGKSNYQLWHELCDLISQNPDKVQSLNVDAI IRGGLTRFTDQLGKLWCSL 262

N +V +DA+ + L + + +

Sbjct : 222 NVRQVYLAAIDALGQEFLNE RFFIAF 247

Query : 263 ADYYIRSGHFEKARDVYEEAIRTVMTVRDFTQVFDSYAQFEESMIAAKMETASXXXXXXX 322

A + IR +E+AR +++ AI M +++ Y FE+

Sbjct : 248 AKFEIRQKEYERARTIFKYAI-DFMPRSKSMELYKEYTHFEKQF 290

Query : 323 XXXXXXXXXXXFEQLISRRPLLLNSVLLRQNPHHVHEWHKRVALHQ— GRPREI INTYTE 380

E + + L LL+ +P+ W + L + G I TY + Sbjct : 291 GDHLGVESTVLDK LQYEKLLKDSPYDYDTWLDLLKLEES AGD INT I RETYEK 344

Query : 381 AVQTVDPF - - - KATGKPHTLWVAFAKFYE-DNGQLDDARV I LEKATKVNFKQVDDLAS VW 436

A+ V A + +W+ + F E D +D AR + ++A K+ + A +W

Sbjct : 345 AIAKVPEVVEKNAWRRYVYIWLNYCLFEEIDVKDVDRARKVYQEALKLIPHKKFTFAKLW 404

Query : 437 CQCGELELRHENYDEALRLLRKATAL - - _ PARRAEYFDGSEPVQN—— VY 481

ELR D A + L +A + P Y + + ++ R+

Sbjct : 405 LMY AMFELRQRK I DV ARKTLGRALGMCPKPKLFRGY I EFED A I KQFDRCR I L YEKW I L YD 464

Query : 482 -KSLKVWSMLADLEESLGTFQSTKAVYDRILDLRI-ATPQIVIN-YAMFLEEHKYFEESF 538

++ W A LE LG +A+Y+ ++ I TP++V Y F E + ++ Sbjct : 465 PEACAPWLG YAALETKLGDSDRARALYNLAVNQP I LETPELVWKA Y I DFEFEEME YGKAR 524 Query: 539 KAYERGISLFKWPNVSDIWSTYLTKFIARYGGRKLE RARDLFEQAL 584

Y++ L P+V +w IA E RAR++FE AL

Sbjct : 525 SIYQQ—LLRTAPHVK-VWISf ANFEIAHLEDDDEEPPNEEVASPTAVVRARNVFENAL 580 对 CLG蛋白的氨基酸序列&行结构分析，发现含有与果蝇 crn蛋白类似的 crn共有序列（crn consensus) , 这种果蝇中的 crn共有序列类似于酵母有关基因蛋白中的 TPR 基序（tetratrico peptide repeat motif)。现已知酵母中具有 TPR 基序的基因家族是一系列细胞周期控制基因，如 CDC16、 CDC23、 nuc2+和 bimA等。另外，酵母中的 TPR 基因家族成员还有蔗糖诱导基因的负调控因子 SSN6、酵母杀手毒素（yeast ki l ler toxin) 的负调控因子 SKI3 以及蛋白输入有关的线粒体膜蛋白 MAS70等。 CLG基因与这些果蝇和酵母基因一样，这种保守的基序在 _CLG 的蛋白序列中呈串联直线重复排列，反复出现，具有共性。

CLG基因中含有的 era蛋白保守序列

1 - VKCWLRY I EFKQGAPK-PRLNQLYERALKLLPCS (35-67) 13

2- PRLWLDYCQFLMDQGRVTHTRRTFDRALRALPIT (110-143) 10

：1 1： I ：1 ：: ：：1：：：1 1 1： I I

3- SRIWPLYLRFLRSHPLPETAVRGYRRFLKLSPES (146-179) 9

：：1 I I I ：： I ： 1：1 1：： I：

4- GKLWCSLADYYIRSGHFEKARDVYEEAIRTVMTV (256-289) 9

5- TQVFDSYAQFEESMIAAKMETASELGREEEDD— (293-324) 7

6- VDLELRLARFEQLISRRPLLLNSVLLRQNPHHVH (325-358) 7

I I ：: 1 1 1 1：1：：

7- HTLWVAFAKFYEDNGQLDDARVILEKATKVNFKQ (395-428) 11

I I：：1：1 I ：：1 I I I 1 : 1

8- LKVWSMLADLEESLGTFQSTKAVYDRILDLRIAT (484-517) 9

： 1 : 1 I ：1 1 I ：: ：: ：!：1 1：：

9- PQIVINYA FLEEHKYFEESFKAYERGISLFKWP (518-551) 9

10- KTLYLLYAQLEEEWGLARHAMAVYERATRAVEPA (593-626) 10

1：： 1 1：：1 1 ：1 ：1 ! 1 1

11 - YDMFNIYIKRAAEIYGVTHTRGIYQKAIEVLSDE (629-662) 6

：：：1 1 1：：1：1 I

12- REMCLRFADMECKLGEIDRARAIYSFCSQICDPR (665-698) 11

VKLWIKYARFEELLKEIDRAREIYERALEFLPRD crn 共有序列

AEA FGLGHIYEKLGDLEKALDAFQKALELDPNN TP 基序实施例 5: CLG在人组织中的 RNA表达谱

用 CLG为探针，与人多种组织的 mRNA膜片（Clontech)进行杂交。结果如图 1所示，发现 CLG在人心（H)、脑（B)、胎盘（P)、肺（Lu)、肝（Li)、肌肉（SM)、肾（K)和胰腺（Pa) 组织中广泛表达，且表达量较为均一，其中在人脑、胎盘、肺、肝、肾和胰腺组织中的转录本大小约为 2. 6kb，与实施例 2中所获得的 CLG的全长 cDNA大小一致，而在心和肌肉组织中则出现一大小约为 3. Okb的转录本。实施例 6: CLG对人肝癌细胞集落形成 (Colony Formation)的抑制作用

RT-PCR获得的含完整编码区的 CLG基因（实施例 2) , 采用 AdvanTAge™ PCR Cloning 试剂合（Clontech, Cat# : K1901- 1)克隆于 pT- Adv载体（Clontech)，然后 EcoR I酶切，回收含完整编码区的 CLG基因片段，再亚克隆至真核细胞表达载体 pCMV-

Script (Stratagene, Cattt : 212220) ,获得质粒 pCMV-Script/CLG, 用 Qiagen质粒抽提试剂盒进行质粒 DNA的提取，供转染用。

取 5μ_§ CLG质粒 DNA (载体为 pCMV-Script)，加无血清无抗生素的 DMEM到 600μ1，空白对照用消毒 rai l l i-Q水代替质粒 DNA。另取 25μ1脂质体 Lipof ectamine (GIBC0 BRL) , 加无血清抗生素的 DMEM至 600μ1，将上述质粒 DNA和脂质体混合，轻柔摇匀，室温放置 30-45分钟，再加入无血清无抗生素的 DMEM 1800μ1 , 总体积为 3ml。将 3ml 转染复合物加入生长于 6cm培养皿的 SMMC- 7721细胞中（1-2χ 10⁵细胞 I每培养皿）， 37

Ό培养 6小时后，换用全培养液， 24小时后，再换用 G418的全培液，约两周左右出现集落，结晶紫（crystal violet)染色，观察着色的集落数目。

结果显示， CLG全长 cDNA转染 SMMC-7721细胞能显著抑制集落形成。转染 CLG后

S画 C-7721细胞只形成 3个集落，而转染空载体的 S匪 C- 7721细胞则形成 56个集落， CLG 基因对人肝癌细胞 S丽 C-7721在体外有明显的抑制作用（图 2A和 2B)。实施例 7: CLG基因转化细胞的成瘤实验及凋亡检测

通过实施例 6相同的方法，用 CLG基因转染人肝癌细胞 SMMC- 7721，然后将转化细胞及未转染 CLG基因的对照组细胞扩大培养，皮下接种裸鼠，观察 CLG基因对成瘤作用的影响，实验分为 CLG转染组和对照组，每组 6只裸鼠，每只裸鼠接种 2χ 10⁶细胞，观察期为 6周，成瘤实验结果见表 3。

SMMC- 7721细胞成瘤实验结果

组别瘤重 (g) 平均瘤重（g) T检验结果

1 2 3 4 5 6

对照 0. 24 0. 11 0. 15 0. 16 0. 12 0. 18 0. 16 Ρ〈0· 05

CLG 0. 14 0. 07 0. 01 0. 03 0. 10 0. 07 0. 07 在成瘤实验中， 6只实验裸鼠接种 CLG转染的 S薩 C- 7721细胞后，形成的肿瘤平均瘤重为 0. 07克，而 6只接种 S薩 C-7721细胞自身对照组所形成的瘤重为 0. 16克，经平均值的成对两样本分析 Τ检验，二者间有显著性差异， ρ<0. 05，抑瘤率为 50%。

CLG转染的 S匪 C- 7721细胞，接种裸鼠后形成的肿瘤组织，作石蜡切片，用 Tunel 法进行凋亡原位检测（Roche公司），可见蓝紫色的阳性凋亡细胞，其中在坏死灶内可见较多阳性凋亡细胞（图 3A所示），在未坏死区可见散在的凋亡细胞（图 3B所示）。

-80Ό冷冻的成瘤组织碾碎后，用含 RNA酶和蛋白酶 K的 DNA抽提溶液消化， 50°C 消化 2小时，然后酚抽提 2次，酒精沉淀 DNA， 1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析，观察是否有 "梯形" DNA条带。转染 CLG全长基因的 S丽 C-7721细胞形成的肿瘤组织 DNA经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析，可见明显的"梯形" DNA条带，与注射转染 p53的 SMMC-7721细胞形成的肿瘤组织 DNA的电泳行为相似。未经转染的 S匪 C-7721细胞形成的肿瘤组织 DNA和转染 pCMV- Script空载体质粒 DNA的 SMMC- 7721细胞形成的肿瘤组织 DNA, 都只出现单一大片段 DNA条带，无"梯形" DNA条带。表明 CLG基因的全长 cDNA转染 SMMC-7721细胞后，具有诱导 SMMC-7721细胞发生凋亡的作用。实施例 8: CLG基因的蛋白表达

根据 CLG全长 cDNA序列，设计引物 3 ( 5 ' TCGGAATTCGTGGTGATGGCGCGACTT 3 ' ， 5 ' 端含 EcoR I位点）和引物 4 ( 5 ' TCTAAGCTTTCAGTCTTCCTTCAGGCT 3' , 5'端含 Hind III 位点）， PCR扩增 CLG编码区序列。 PCR反应条件为： 94°C，变性 5 min; 然后按 94°C变性 lmin, 55°C退火 lmin, 72°C延伸 2min，进行 40个循环；最后 72°C延伸 10min。反应产物电泳检测后再进行酶切回收。将经 PCR扩增及酶切回收的 CLG编码区片断插入载体 pET32a(Novagen)的 EcoR I-Hind III位点，得到 pET32a-CLG重组质粒。

将构建好的重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3), 挑单菌落接种于 LB培养基 (含氨卞青霉素 50mg/L)， 37°C培养过夜， 2%接种量转接于 5ml LB培养基，培养至 OD600≤0.5 时，再按 1%量转接到 150ml LB (含氨卞青霉素 50mg/L)中，至 OD600=0.5-1.0时， IPTG诱导 (ImM), 继续培养 3小时左右，离心收集菌体，超声破碎菌体，高速离心后，发现在上清及沉淀中均出现较高表达的 CLG蛋白（图 5)。 CLG蛋白的分子量为 100kDa，与预测分子量一致。

Claims

权利要求书

1.一种分离的人 CLG蛋白，其特征在于，它包括：具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求 1所述的多肽，其特征在于，该多肽包含 SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
3.—种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少 85%相同性：

(a)编码如权利要求 1和 2所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸 (a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求 3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码的多肽具有 SEQ ID

NO:2的氨基酸序列。
5.如权利要求 3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组： SEQ ID NO:3中第 22— 2258位的编码区序列，或 1—2659位全长序列。
6.—种载体，其特征在于，它含有权利要求 3所述的多核苷酸。
7.—种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞：

(a)用权利要求 6所述的载体转化或转导的宿主细胞；

(b)用权利要求 3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8. 一种具有人 CLG蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含： (a)在适合表达人 CLG蛋白的条件下，培养权利要求 7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有人 CLG蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求 1所述的人 CLG蛋白特异性结合的抗体。
10. 一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求 1所述的多肽以及药学上可接受的载体。