CN1313316A - 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类新的具有抑癌功能的人蛋白,编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病如癌症等的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这类新的具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸的用途。
Description
本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明涉及新的编码具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸,以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
人基因组学研究目前是国际上的热点,除人染色体DNA大规模测序,表达序列测序(EST)的方法外,还缺少从功能开始的筛选具有功能基因的高通量的方法。
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤,目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此,本领域迫切需要开发研究具有抑癌功能的人蛋白及其激动剂/抑制剂。
本发明的目的是提供一类新的具有抑癌功能的人蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面,提供新颖的分离出的具有抑癌功能的蛋白多肽,它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQID NO:26;或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地,该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:26。
在本发明的第二方面,提供了一种分离的多核苷酸,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85%相同性:(a)编码上述的具有抑癌功能的蛋白多肽的多核苷酸;(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地,该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQID NO:26。更佳地,该多核苷酸的序列选自下组:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQID NO:27的编码区序列或全长序列。
在本发明的第三方面,提供了含有上述多核苷酸的载体,以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面,提供了制备具有具有抑癌功能的蛋白活性的多肽的制备方法,该方法包含:(a)在适合表达具有抑癌功能的蛋白的条件下,培养上述被转化或转导的宿主细胞;(b)从培养物中分离出具有具有抑癌功能的蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面,提供了与上述的具有抑癌功能的蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子,它含有上述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。
在本发明的第六方面,提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明的具有抑癌功能的蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本发明采用大规模cDNA克隆转染癌细胞,在获得具有抑癌作用的基础上,经测序证明为新的基因,进一步得到全长cDNA克隆。DNA转染试验证明,本发明的具有抑癌功能的蛋白对癌细胞(肝癌细胞)具有抑制克隆形成的作用,其抑制率在50%或50%以上。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的具有抑癌功能的蛋白或多肽”是指具有抑癌功能的蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化具有抑癌功能的蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。具有抑癌功能的蛋白多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成的产物,或使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有抑癌功能的人蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然具有抑癌功能的人蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(ⅰ)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ⅱ)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(ⅲ)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。以PP894蛋白(在本申请中,蛋白质的命名采用其克隆编号)为例,编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质,但与SEQ IDNO:3所示的编码区序列有差别的核酸序列。以PP1030蛋白(在本申请中,蛋白质的命名采用其克隆编号)为例,编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:6所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:5的蛋白质,但与SEQ ID NO:6所示的编码区序列有差别的核酸序列。对于其他具有抑癌功能的蛋白,可依此类推。对于其他具有抑癌功能的蛋白,可依此类推。
编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95%以上,更好是97%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地被纯化至均质。
本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如,用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于:1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列,和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。
编码具有抑癌功能的蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得:1)从基因组DNA分离双链DNA序列;2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。
上述提到的方法中,分离基因组DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时,DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时,DNA序列的直接化学合成是不可能的,选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录,形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术,试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。还可得到商业供应的cDNA文库,如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时,即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于):(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交;(2)标志基因的功能出现或丧失;(3)测定具有抑癌功能的蛋白的转录本的水平;(4)通过免疫学技术或测定生物学活性,来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用,也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中,杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源,其长度至少15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸。此外,探针的长度通常在2kb之内,较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素,荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中,检测具有抑癌功能的蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法,放射免疫沉淀法,酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985;230:1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时,可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法),用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因,或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列,测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列,才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或具有抑癌功能的蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的具有抑癌功能的蛋白多肽(Science,1984:224:1431)。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中,具有抑癌功能的人蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125);在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含具有抑癌功能的人蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,coldSpring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时,如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子,通常大约有10到300个碱基对,作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的具有抑癌功能的人蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于):直接做为药物治疗具有抑癌功能的蛋白功能低下或丧失所致的疾病,和用于筛选促进或对抗具有抑癌功能的蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如,抗体可用于激活或抑制具有抑癌功能的人蛋白的功能。用表达的重组具有抑癌功能的人蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激具有抑癌功能的人蛋白功能的多肽分子。
本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)具有抑癌功能的人蛋白的药剂的方法。激动剂提高具有抑癌功能的人蛋白刺激细胞增殖等生物功能,而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如,能在药物的存在下,将哺乳动物细胞或表达具有抑癌功能的人蛋白的膜制剂与标记的具有抑癌功能的人蛋白一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
具有抑癌功能的人蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。具有抑癌功能的人蛋白的拮抗剂可以与具有抑癌功能的人蛋白结合并消除其功能,或是抑制具有抑癌功能的人蛋白的产生,或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。具有抑癌功能的人蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。
在筛选作为拮抗剂的化合物时,可以将具有抑癌功能的蛋白加入生物分析测定中,通过测定化合物影响具有抑癌功能的蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法,可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗,例如,各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。
本发明的多肽,及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术,三瘤技术,人B-细胞杂交瘤技术,EBV-杂交瘤技术等。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒,容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起,可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示,该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外,本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药,如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。具有抑癌功能的蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的具有抑癌功能的蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素,如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
具有抑癌功能的人蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于具有抑癌功能的蛋白的无表达或异常/无活性的具有抑癌功能的蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的具有抑癌功能的蛋白,以抑制内源性的具有抑癌功能的蛋白活性。例如,一种变异的具有抑癌功能的蛋白可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的具有抑癌功能的蛋白,虽可与下游的底物结合,但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗具有抑癌功能的蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将具有抑癌功能的蛋白基因转移至细胞内。构建携带具有抑癌功能的蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)。另外重组具有抑癌功能的人蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。
抑制具有抑癌功能的人蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子,其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得,如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性,可用多种方法对其进行修饰,如增加两侧的序列长度,核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括:将多聚核苷酸直接注入到体内组织中;或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中,再将细胞移植到体内等。
本发明的多肽还可用作肽谱分析,例如,多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割,并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析。
本发明还提供了针对具有抑癌功能的人蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于):多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
抗具有抑癌功能的人蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检标本中的具有抑癌功能的人蛋白。
与具有抑癌功能的人蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记,注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与具有抑癌功能的人蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断具有抑癌功能的人蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如具有抑癌功能的人蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白,红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP,攻击抗体的氨基,通过二硫键的交换,将毒素结合于抗体上,这种杂交抗体可用于杀灭具有抑癌功能的人蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用具有抑癌功能的人蛋白或多肽免疫动物,如家兔,小鼠,大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。
具有抑癌功能的人蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature,1975,256:495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al,PNAS,1985,81:6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.PatNo.4946778)也可用于生产抗具有抑癌功能的人蛋白的单链抗体。
能与具有抑癌功能的人蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时,必须对具有抑癌功能的人蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测具有抑癌功能的人蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的,且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的具有抑癌功能的人蛋白水平,可以用作解释具有抑癌功能的人蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断具有抑癌功能的蛋白起作用的疾病。
具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸可用于具有抑癌功能的蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面,具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸可用于检测具有抑癌功能的蛋白的表达与否或在疾病状态下具有抑癌功能的蛋白的异常表达。如具有抑癌功能的蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断具有抑癌功能的蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法,Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术,相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上,用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用具有抑癌功能的蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测具有抑癌功能的蛋白的转录产物。
检测具有抑癌功能的蛋白基因的突变也可用于诊断具有抑癌功能的蛋白相关的疾病。具有抑癌功能的蛋白突变的形式包括与正常野生型具有抑癌功能的蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外,突变有可能影响蛋白的表达,因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前,需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在,只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明,为了将这些序列与疾病相关基因相关联,其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之,根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp),可以将序列定位于染色体上。然后,将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法,是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物,通过类似方法,可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选,从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH),可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述,参见Verma等,Human Chromosomes:a Manual of BasicTechniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置,此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如,V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析,确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着,需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变,而该突变在任何正常个体中未观察到,则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体,通常涉及首先寻找染色体中结构的变化,如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力,被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA,可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。
本发明的具有抑癌功能的蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
此外,由于本发明的具有抑癌功能的蛋白具有源自人的天然氨基酸序列,因此,与来源于其他物种的同族蛋白相比,预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:cDNA基因的获得及对癌细胞克隆形成的抑制作用
PP894,PP1030,PP1164,PP1187,PP1498,PP2464,PP3051,PP3105,PP5423是通过用常规方法构建人胎盘cDNA文库获得的。取3、6、10月龄的胎盘组织,用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA,用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXR cDNA文库构建试剂盒(Stratagene公司)构建上述mRNA的cDNA文库。其中反转录酶改用MMLV-RT-SuperscriptⅡ(GIBCO BRL),反转录反应在42℃进行。转化XL 10-Gold感受细胞,获得了1×106cfu/μg cDNA滴度的cDNA文库。第一轮随机挑取cDNA克隆,其后以高丰度cDNA克隆和已证明有抑癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针,杂交筛选cDNA文库,挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒,按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染肝癌细胞系7721。100ng DNA酒精沉淀干燥后,加6μl H2O溶解,待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液,混匀后,室温放置10分钟。每管中加1501μl无血清培液,均分加入3孔生长于96孔板的7721细胞中,37℃放置2小时,每孔再加50μl无血清培液,37℃24小时。每孔换100μl全培液,37℃24小时,换含G418的全培液100μl,37℃24~48小时,边观察,边换G418浓度不等的培液。约2~3次后,直到镜检细胞有克隆形成,计数。发现上述克隆有抑制细胞克隆形成作用,结果如下表所示。
cDNA克隆转染细胞(7721)克隆形成情况
cDNA克隆名称 | CDNA克隆数(三个重复) | 空载体克隆数(三个重复) |
PP894PP1030PP1164PP1187PP1498PP2464PP3051PP3105PP5423 | 70 68 650 0 00 0 00 1 10 0 02 0 08 10 110 2 023 50 30 | 57 54 4054 45 4030 37 4130 37 4126 23 3228 30 2712 18 2012 18 2019 32 21 |
对cDNA克隆采用双脱氧终止法,在ABI377 DNA自动测序仪上测定其一端近500bp的核苷酸序列。分析后,确定为新基因克隆,进行另一端测序,仍未获得全长cDNA序列,设计引物,再次进行测序,直到获得全长序列(SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25)。
实施例2:从胎盘cDNA中PCR获得全长基因:
取3、6、10月龄的胎盘组织,用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA,用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用MMLV-RT-SuperscriptⅡ(GIBCO BRL)反转录酶在42℃进行反转录反应,获得胎盘cDNA。利用各个基因的转异引物(如下表所示),按90℃3分钟1个循环;94℃30秒,60℃30秒,72℃1分钟,共35个循环;72℃10分钟,1个循环进行PCR扩增,获得含有完整开放阅读框序列的各蛋白基因的扩增产物。扩增产物经测序验证,与实施例1测得的序列相符,随后用常规技术将扩增产物转入宿主细胞,以获得重组蛋白。基因特异引物序列
实施例3:cDNA克隆序列分析1.PP894A:核苷酸序列:(SEQ ID NO:1)长度:1492bp1 GGCATCTGAG AGGCTGGTCG TGGACTGTGG TTGGGGGAGG TGGGAGCTGT51 TTTAACCGTG TGCCCCCTCT CCTGTGCCGG CGTGGGCATC CCCCGGGGCA101 GTGGAACGCG GGCGCTCCTC CAGCTTCCGA GTCCAGCCAG CCTGGGCGCG151 GGGCGCCGCC CCCGAGACAC CCGAGGAGTC CGTTCCTCCC TGGTTACGTG201 GACTGTGGAG CTGGTCTCTT GTGGCTCAGC GCCGTGCGGA GGTTGAAGCG251 TACCTGCGGA GGTCGCACCA GGGCGTGAGG AGGAGGAGGA AGGGCATGAG301 CCGAGCTTGA GGAATCCGTG CTCCAAACTC TACACTCAAG GGTGGCCCTT351 GGGTAGGGTG AAGATCCCCT GTCTTTATCC TAGTTCCACA CCTTGGTGTG401 GGTTACTGGG TGCAGGATGA ACTGTCGCTC GGAGGTGCTG GAGGTGTCGG451 TGGAGGGGCG GCAGGTGGAG GAGGCCATGC TGGCTGTGCT GCACACGGTG501 CTTCTGCACC GCAGCACAGG CAAGTTCCAC TACAAGAAGG AGGGCACCTA551 CTCCATTGGC ACCGTGGGCA CCCAGGATGT TGACTGTGAC TTCATCGACT601 TCACTTATGT GCGTGTCTCT TCTGAGGAAC TGGATCGTGC CCTGCGCAAG651 GTTGTTGGGG AGTTCAAGGA TGCACTGCGC AACTCTGGTG GCGATGGGCT701 GGGGCAGATG TCCTTGGAGT TCTACCAGAA GAAGAAGTCT CGCTGCCATT751 CTCAGACGAG TGCATCCCAT GGGAAGTGTG GACGGTCAAG GTGCATGTGG801 TAGCCCTGGC CACGGAGCAG GAGCGGCAGA TCTGCCGGGA GAAGGTGGGT851 GAGAAACTCT GCGAGAAGAT CATCAACATC GTGGAGGTGA TGAATCGGCA901 TGAGTACTTG CCCAAGATGC CCACACAGTC GGAGGTGGAT AACGTGTTTG 951 ACACAGGCTT GCGGGACGTG CAGCCCTACC TGTACAAGAT CTCCTTCCAG1001 ATCACTGATG CCCTGGGCAC CTCAGTCACC ACCACCATGC GCAGGCTCAT1051 CAAAGACACC CTTGCCCTCT GAGCGTCGCT GGATCTCTGG GAGCTCCTTG1101 ATGGCTCCCA GACCTTGGCT TTTGGGAATT GCACTTTTGG GCCTTTGGGC1151 TCTGGAACCT GCTCTGGGTC ATTGGTGAGA CTTGGAAGGG GCAGCCCCCG1201 CTGGCTTCTT GGTTTTGTGG TTGCCAGCCT CAGGTCATCC TTTTAATCTT1251 TGCTGATGGT TCAGTCCTGC CTCTACTGTC TCTCCATAGC CCTGGTGGGG1301 TCCCCCTTCT TTCTCCACTG TACAGAAGAG CCACCACTGG GATGGGGAAT1351 AAAGTTGAGA ACATGAGTTT GGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA1401 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA1451 CCTGGGGGGG GGGCCCGGTC CCAGGTAAGT GTACCCAATT CGB:氨基酸序列:(SEQ ID NO:2)长度:128个氨基酸1 MNCRSEVLEV SVEGRQVEEA MLAVLHTVLL HRSTGKFHYK KEGTYSIGTV51 GTQDVDCDFI DFTYVRVSSE ELDRALRKVV GEFKDALRNS GGDGLGQMSL101 EFYQKKKSRC HSQTSASHGK CGRSRCMWC:核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:3)克隆号和蛋白名称:PP894起始编码子:417 ATG 终止编码子:803 TAG蛋白质分子量:14426.671 GG CAT CTG AGA GGC TGG TCG TGG ACT GTG GTT GGG GGA GGT GGG AGC 4748 TGT TTT AAC CGT GTG CCC CCT CTC CTG TGC CGG CGT GGG CAT CCC CCG 9596 GGG CAG TGG AAC GCG GGC GCT CCT CCA GCT TCC GAG TCC AGC CAG CCT 143144 GGG CGC GGG GCG CCG CCC CCG AGA CAC CCG AGG AGT CCG TTC CTC CCT 191192 GGT TAC GTG GAC TGT GGA GCT GGT CTC TTG TGG CTC AGC GCC GTG CGG 239240 AGG TTG AAG CGT ACC TGC GGA GGT CGC ACC AGG GCG TGA GGA GGA GGA 287288 GGA AGG GCA TGA GCC GAG CTT GAG GAA TCC GTG CTC CAA ACT CTA CAC 335336 TCA AGG GTG GCC CTT GGG TAG GGT GAA GAT CCC CTG TCT TTA TCC TAG 383384 TTC CAC ACC TTG GTG TGG GTT ACT GGG TGC AGG ATG AAC TGT CGC TCG 4311 Met Asn Cys Arg Ser 5432 GAG GTG CTG GAG GTG TCG GTG GAG GGG CGG CAG GTG GAG GAG GCC ATG 4796 Glu Val Leu Glu Val Ser Val Glu Gly Arg Gln Val Glu Glu Ala Met 21480 CTG GCT GTG CTG CAC ACG GTG CTT CTG CAC CGC AGC ACA GGC AAG TTC 52722 Leu Ala Val Leu His Thr Val Leu Leu His Arg Ser Thr Gly Lys Phe 37528 CAC TAC AAG AAG GAG GGC ACC TAC TCC ATT GGC ACC GTG GGC ACC CAG 57538 His Tyr Lys Lys Glu Gly Thr Tyr Ser Ile Gly Thr Val Gly Thr Gln 53576 GAT GTT GAC TGT GAC TTC ATC GAC TTC ACT TAT GTG CGT GTC TCT TCT 62354 Asp Val Asp Cys Asp Phe Ile Asp Phe Thr Tyr Val Arg Val Ser Ser 69624 GAG GAA CTG GAT CGT GCC CTG CGC AAG GTT GTT GGG GAG TTC AAG GAT 67170 Glu Glu Leu Asp Arg Ala Leu Arg Lys Val Val Gly Glu Phe Lys Asp 85672 GCA CTG CGC AAC TCT GGT GGC GAT GGG CTG GGG CAG ATG TCC TTG GAG 71986 Ala Leu Arg Asn Ser Gly Gly Asp Gly Leu Gly Gln Met Ser Leu Glu 101 720 TTC TAC CAG AAG AAG AAG TCT CGC TGC CAT TCT CAG ACG AGT GCA TCC 767102 Phe Tyr Gln Lys Lys Lys Ser Arg Cys His Ser Gln Thr Ser Ala Ser 117768 CAT GGG AAG TGT GGA CGG TCA AGG TGC ATG TGG TAG CCC TGG CCA CGG 815118 His Gly Lys Cys Gly Arg Ser Arg Cys Met Trp *** 129816 AGC AGG AGC GGC AGA TCT GCC GGG AGA AGG TGG GTG AGA AAC TCT GCG 863864 AGA AGA TCA TCA ACA TCG TGG AGG TGA TGA ATC GGC ATG AGT ACT TGC 911912 CCA AGA TGC CCA CAC AGT CGG AGG TGG ATA ACG TGT TTG ACA CAG GCT 959960 TGC GGG ACG TGC AGC CCT ACC TGT ACA AGA TCT CCT TCC AGA TCA CTG 10071008 ATG CCC TGG GCA CCT CAG TCA CCA CCA CCA TGC GCA GGC TCA TCA AAG 10551056 ACA CCC TTG CCC TCT GAG CGT CGC TGG ATC TCT GGG AGC TCC TTG ATG 11031104 GCT CCC AGA CCT TGG CTT TTG GGA ATT GCA CTT TTG GGC CTT TGG GCT 11511152 CTG GAA CCT GCT CTG GGT CAT TGG TGA GAC TTG GAA GGG GCA GCC CCC 11991200 GCT GGC TTC TTG GTT TTG TGG TTG CCA GCC TCA GGT CAT CCT TTT AAT 12471248 CTT TGC TGA TGG TTC AGT CCT GCC TCT ACT GTC TCT CCA TAG CCC TGG 12951296 TGG GGT CCC CCT TCT TTC TCC ACT GTA CAG AAG AGC CAC CAC TGG GAT 13431344 GGG GAA TAA AGT TGA GAA CAT GAG TTT GGA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 13911392 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 14391440 AAA AAA AAA AAC CTG GGG GGG GGG CCC GGT CCC AGG TAA GTG TAC CCA 14871488 ATT CG 1492
克隆名称 | 特异引物1(5′→3′) | 特异引物2(5′→3′) |
PP894PP1030PP1164PP1187PP1498PP2464PP3051PP3105PP5423 | GTCGTGGACTGTGGTTGGGGGAGACAGCACGAGAGCACAGCCCTGATTACAGACGCATTTCAGCCCCGCTCAGCTTCCGGGAGTTCCTGCTCGTCAGGCCTGGTCAACGTGGTGTAGACCTCCTCGAAGGAGCAGCCAGAGCTGGCGTGCAAGCTGGAGGGGGGCGGGAGACAGAAAGAGAGTGGAGCCTGAGTGCATCATGGAG | ACCCAGAGCAGGTTCCAGAGCCCGCCACCACCACAAAAGGCTCCAGTGAGCCACTGTCCCCAGCGTTTTAGGAGACAGAGGTGGGCAGGCATCAAAGGGGCACCAGACAGGGAACGAAGATCTCCCCAGGGGGCTTTGAGGAGACAGAGGTGGGCAGGCATCAATTCGATTTCTCCTGCATACAGTCAGGGGCAAGAGCCAAGCTGT |
D:Blastp结果Query=PP894[基因=PP894] (128个氨基酸)>SP FUN:013978 013978 schizosaccharomyces pombe(fission yeast
hypothetical 20.3 kd protein c25h1.03 in chromosome
6/1998长度=184分值=35.6 bits(80),预计值=0.17相同性=30/103(29%),相似性=44/103(42%),缺口=18/103(1Query: 8 LEVSVEGRQVEEAMLAVLHTVLLHRSTGKFHYKKEGTYSIGTVGTQDVDCDFIDFTYVRV 67
+E+ + + E + AVL +L HR TV + +D +D T +Sbjct: 7 IELKIGYKYAAEVVKAVLGVILFHRQ-------------FSTVPARTIDV--LDITVPTL 51Query: 68 SSEELDRALRKVVGEFKDALRNSGGDGLGQMSLEFYQK--KKS 108
EL+ L EF D +RN G GQM L Y++ KKSSbjct: 52 VGAELNEQLATKAAEFIDTIRNEAGAN-GQMILLLYERSPKKS 93
2.PP1030A:核苷酸序列:(SEQ ID NO:4)长度:2258bp1 CCCAACTGGG GGTGGTCCCT GGGATTGGAC ACTAGTGGAG GAGGGCGATG51 GACGCCTTCA GCCCCAGGCA CCCAGCTGGC CGGCAGCTGA GGAGGGAGAG101 GGGGAGCGTA GCCTTACAGC ACGAGAGCAC AGCCCTGAGG AGGCGCGGGA151 GCTGCGGGCT GCGGTGATCC AGCTTCTGGA CACCTCCTAT CTGCTCACTC201 CTGTGGCCCA GGCCCAGCTC CTGTGGCTGC TGGGCTGGGC CCTGCGGGGT251 CTGCAGGGAC AGCCACCGGC ACTCTTCAAG CCGCAGCTGG TACGGCTGCT301 AGGCACAGCA CAGCTGACAC TGTTGCACGC CATGCTTGCG CTCAAGGCGG351 CCTTTGGTGA GGCCTTGTTC ACAGCCCAGG ATGAAGCGTT GCTGCTCCGC401 CGGCTCACCT TGGCTGCCCA GCACCCTGCT CTGCCTCCGC CCACCCATCT 451 CTTTTACCTG CACTGCGTCC TGAGCTTCCC TGAGAACTGG CCGCTGGGCC501 TGAAGGTGAG GAGGCTGCCC CACTGCTGCT AGGGCCCCAG CTATGCCGTG551 GTCTCCTGCC CAGTCTCCTG CATGACCCAA TGGCCCTCCT GGCCCGCCTG601 CATTTACTGT GCCTGCTCTG TGCCGAGGAG GAAGAAGAGG AGAAAGGCCA651 GCTTCCAAGC CCACGGCACT ACCTGGAAGA GCTGCTGGCT GGCTTGCGGC701 ACGGGGCAGC CCTGGATGGG GGCCCCCGGG CTTGGCCACT CTCTGCTTCC751 AGGCCTCGTA TCTGGTGGCC TGCTGCCTGG CTGGGCAACC TACGGTGCTG801 ACCCCCTTGA TCCACGGACT GGCCCAGCTG TACCAAGCCC GGCCCATGCT851 GGCTCCCCAC TTTGTGGACC TCTTGGATCA GGTGGACTCT GAGCTGAGGG901 AGCCCCTGAA GGTGGTGTTG CGGCAGGTGG TGGTGTCCAG GCCGGGCAGG951 GATGAAGCTC TTTGCTGGCA CCTGCAAATG CTGGCAAAGG TGGCAGATGG1001 AGATGCCCAG AGTGCTACCC TCAACTTTCT ACAGGCCGCG GCTGCCCACT1051 GCACGAACTG GGACCTACAG CAGGGCCTGC TGCGGGTCTG CCGGGCGCTG1101 CTGCGGGCAG GGGTGAGGGG CGGCCTGGTC GACTTGCTGC AGGTGCTGGC1151 CAGGCAGCTG GAGGACCCTG ATGGGCGTGA CCACGCCCGC CTCTACTACA1201 TCCTGCTGGC ACACCTGGCA GCACCCAAGT TGGGGGTGGC CCTGGGCCCC1251 TCGCTTGCCG CACCTGCACT GGCCTCTTCA CTGGTGGCCG AGAACCAGGG1301 CTTTGTGGCA GCACTGATGG TGCAGGAGGC ACCGGCCCTG GTACGGCTGA1351 GCCTGGGGTC CCATCGGGTC AAGGGCCCAC TCCCAGTGTT GAAGCTCCAC1401 CGGAGGCGCT GGAGCCCATC TACTCTCTGG AGTGCGCTTC GTGTGGAAGG1451 ACAGCTGTAT GCACCCCTGG AGGCTGTCCA TGTGCCCTGC CTGTGTCCTG1501 GCCGCCCTGC CCGCCCTCTG CTCCTGCCTC TGCAGCCCCG ATGCCCGGCC1551 CCCGCACGGC TGGATGTCCA TGCCCTTTAC ACCACATCCA CTGGTCTCAC1601 GTGCCATGCC CACTTGCCAC CCCTGTTCTG TGAACTTTGC CGACCTCTTT1651 CTGCCTTTCC CGCAGCCTCC AGAGGGGGCC 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AAC TGG GAC CTA CAG CAG GGC CTG CTG CGG GTC TGC CGG GCG CTG CTG 110371 Asn Trp Asp Leu Gln Gln Gly Leu Leu Arg Val Cys Arg Ala Leu Leu 861104 CGG GCA GGG GTG AGG GGC GGC CTG GTC GAC TTG CTG CAG GTG CTG GCC 115187 Arg Ala Gly Val Arg Gly Gly Leu Val Asp Leu Leu Gln Val Leu Ala 1021152 AGG CAG CTG GAG GAC CCT GAT GGG CGT GAC CAC GCC CGC CTC TAC TAC 1199103 Arg Gln Leu Glu Asp Pro Asp Gly Arg Asp His Ala Arg Leu Tyr Tyr 1181200 ATC CTG CTG GCA CAC CTG GCA GCA CCC AAG TTG GGG GTG GCC CTG GGC 1247119 Ile Leu Leu Ala His Leu Ala Ala Pro Lys Leu Gly Val Ala Leu Gly 1341248 CCC TCG CTT GCC GCA CCT GCA CTG GCC TCT TCA CTG GTG GCC GAG AAC 1295135 Pro Ser Leu Ala Ala Pro Ala Leu Ala Ser Ser Leu Val Ala Glu Asn 1501296 CAG GGC TTT GTG GCA GCA CTG ATG GTG CAG GAG GCA CCG GCC CTG GTA 1343151 Gln Gly Phe Val Ala Ala Leu Met Val Gln Glu Ala Pro Ala Leu Val 1661344 CGG CTG AGC CTG GGG TCC CAT CGG GTC AAG GGC CCA CTC CCA GTG TTG 391167 Arg Leu Ser Leu Gly Ser His Arg Val Lys Gly Pro Leu Pro Val Leu 1821392 AAG CTC CAC CGG AGG CGC TGG AGC CCA TCT ACT CTC TGG AGT GCG CTT 1439183 Lys Leu His Arg Arg Arg Trp Ser Pro Ser Thr Leu Trp Ser Ala Leu 1981440 CGT GTG GAA GGA CAG CTG TAT GCA CCC CTG GAG GCT GTC CAT GTG CCC 1487199 Arg Val Glu Gly Gln Leu Tyr Ala Pro Leu Glu Ala Val His Val Pro 2141488 TGC CTG TGT CCT GGC CGC CCT GCC CGC CCT CTG CTC CTG CCT CTG CAG 1535215 Cys Leu Cys Pro Gly Arg Pro Ala Arg Pro Leu Leu Leu Pro Leu Gln 2301536 CCC CGA TGC CCG GCC CCC GCA CGG CTG GAT GTC CAT GCC CTT TAC ACC 1583231 Pro Arg Cys Pro Ala Pro Ala Arg Leu Asp Val His Ala Leu Tyr Thr 2461584 ACA TCC ACT GGT CTC ACG TGC CAT GCC CAC TTG CCA CCC CTG TTC TGT 1631247 Thr Ser Thr Gly Leu Thr Cys His Ala His Leu Pro Pro Leu Phe Cys 2621632 GAA CTT TGC CGA CCT CTT TCT GCC TTT CCC GCA GCC TCC AGA GGG GGC 1679263 Glu Leu Cys Arg Pro Leu Ser Ala Phe Pro Ala Ala Ser Arg Gly Gly 2781680 CGG GCT GGG CTT CTT TGA GGA GCT CTG GGA TTC CTG CCT GCC AGA GGG 1727279 Arg Ala Gly Leu Leu *** 2841728 TGC TGA GAG TCG TGT GTG 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D:Blastp结果Query=PP1030[基因=PP1030] (283个氨基酸)>SW:DIS3_SCHPO P37202 schizosaccharomyces pombe(fission yeast)
mitotic control protein dis3.12/1998长度=970分值=36.7 bits(83),预计值=0.23相同性=23/75(30%),相似性=42/75(55%),缺口=3/75(4%)Query: 12 QVDSELREPLKVVLRQVVVSRPGRDE-ALCWHLQMLAKVADGDAQSATLNFLQAAAAHCT 70
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CCC ACC CCA 1344208 Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Ser Pro Thr Pro 2231345 GCC CCG CCC CAG AAG GAG CAG CCC CCC GCG GAG ACC CCT ACA GAC GCT 1392224 Ala Pro Pro Gln Lys Glu Gln Pro Pro Ala Glu Thr Pro Thr Asp Ala 2391393 GCT GTC TTG ACC TCA CCC CCA GCC CCT GCT CCC CCG GTG ACC CCT AGC 1440240 Ala Val Leu Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala Pro Pro Val Thr Pro Ser 2551441 AAA CCA ATG GCC GGC ACC ACA GAC CGA GAA GAA GCC ACT CGG CTC TTG 1488256 Lys Pro Met Ala Gly Thr Thr Asp Arg Glu Glu Ala Thr Arg Leu Leu 2711489 GCT GAA AAG CGG CGC CAG GCC CGG GAG CAG CGG GAG CGC GAG GAG CAG 1536272 Ala Glu Lys Arg Arg Gln Ala Arg Glu Gln Arg Glu Arg Glu Glu Gln 2871537 GAG CGG AGG CTG CAG GCA GAA AGG GAC AAG CGA ATG CGA GAG GAG CAG 1584288 Glu Arg Arg Leu Gln Ala Glu Arg Asp Lys Arg Met Arg Glu Glu Gln 3031585 CTG GCA CGG GAG GCC GAG GCC CGG GCG GAG CGG GAG GCG GAG GCC CGG 1632304 Leu Ala Arg Glu Ala Glu Ala Arg Ala Glu Arg Glu Ala Glu Ala Arg 3191633 AGG CGG GAG GAG CAG GAG GCA CGA GAG AAG GCG 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AAG CAG AAG GAG AGG GCC ATG TCC 527126 Ala Val His Pro Arg Glu Ile Phe Lys Gln Lys Glu Arg Ala Met Ser 141528 ACC ACC TCC ATC TCC AGT CCT CAG CCT GGC AAG CTG AGG AGC CCC TTC 575142 Thr Thr Ser Ile Ser Ser Pro Gln Pro Gly Lys Leu Arg Ser Pro Phe 157576 CTG CAG AAG CAG CTC ACC CAA CCA GAG ACC CAC TTT GGC AGA GAG CCA 23158 Leu Gln Lys Gln Leu Thr Gln Pro Glu Thr His Phe Gly Arg Glu Pro 73 624 GCT GCT GCC ATC TCA AGG CCC AGG GCA GAT CTC CCT GCT GAG GAG CCG 671174 Ala Ala Ala Ile Ser Arg Pro Arg Ala Asp Leu Pro Ala Glu Glu Pro 189672 GCG CCC AGC ACT CCT CCA TGT CTG GTG CAG GCA GAA GAG GAG GCT GTG 719190 Ala Pro Ser Thr Pro Pro Cys Leu Val Gln Ala Glu Glu Glu Ala Val 205720 TAT GAG GAA CCT CCA GAG CAG GAG ACC TTC TAC GAG CAG CCC CCA CTG 767206 Tyr Glu Glu Pro Pro Glu Gln Glu Thr Phe Tyr Glu Gln Pro Pro Leu 221768 GTG CAG CAG CAA GGT GCT GGC TCT GAG CAC ATT GAC CAC CAC ATT CAG 815222 Val Gln Gln Gln Gly Ala Gly Ser Glu His Ile Asp His His Ile Gln 237816 GGC CAG GGG CTC AGT GGG CAA GGG CTC TGT 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CCA AGC TGC GGG GAA GGG TCC TGA GCA GGG GCA TCT 13431344 GGG AGG CTC TGG CTG CCT TCT GCA TTT ATT TGC CTT TTT TCT TTT TCT 13911392 CTT GCT TCT AAG GGG TGG TGG CCA CCA CTG TTT AGA ATG ACC CTT GGG 14391440 AAC AGT GAA CGT AGA GAA TTG TTT TTA GCA GAG TTT GTG ACC AAA GTC 14871488 AGA GTG GAT CAT GGT GGT TTG GCA GCA GGG AAT TTG TCT TGT TGG AGC 15351536 CTG CTC TGT GCT CCC CAC TCC ATT TCT CTG TCC CTC TGC CTG GGC TAT 15831584 GGG AAG TGG GGA TGC AGA TGG CCA AGC TCC CAC CCT GGG TAT TCA AAA 16311632 ACG GCA GAC ACA ACA TGT TCC TCC ACG CGG CTC ACT CGA TGC CTG CAG 16791680 GCC CCA GTG TGT GCC TCA ACT GAT TCT GAC TTC AGG AAA AGT AAC ACA 17271728 GAG TGG CCT TGG CCT GTT GTC TTC CCC TAT TTT CTG TCC CAG CTC ATC 17751776 CGT GTC TCT GAA GAA CAA ATA TGC TTT TGG ACC ACG AAA AAA AAA AAA 18231824 AAA AAA AAA 1832
Claims (11)
1.一种分离的具有抑癌功能的人蛋白,其特征在于,它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26;
或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26。
3.一种分离的多核苷酸,其特征在于,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85%相同性:
(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸;
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26。
5.如权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸的序列选自下组:
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27的编码区序列或全长序列。
6.一种载体,其特征在于,它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,它是选自下组的一种宿主细胞:
(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞;
(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8.一种具有具有抑癌功能的人蛋白活性的多肽的制备方法,其特征在于,该方法包含:
(a)在适合表达具有抑癌功能的人蛋白的条件下,培养权利要求7所述的宿主细胞;
(b)从培养物中分离出具有具有抑癌功能的人蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的具有抑癌功能的人蛋白特异性结合的抗体。
10.一种核酸分子,它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。
11.一种药物组合物,其特征在于,它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
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