WO2004031388A1 - 転写調節に関与する因子 - Google Patents

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WO2004031388A1
WO2004031388A1 PCT/JP2003/009443 JP0309443W WO2004031388A1 WO 2004031388 A1 WO2004031388 A1 WO 2004031388A1 JP 0309443 W JP0309443 W JP 0309443W WO 2004031388 A1 WO2004031388 A1 WO 2004031388A1
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hdart
dna
transcription
peptide
protein
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PCT/JP2003/009443
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Shuki Mizutani
Takayuki Yamada
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Sony Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • the present invention relates to a transcription regulatory factor and the like, and more particularly, to a factor and a peptide capable of regulating transcription caused by a nuclear hormone receptor.
  • Receptors such as these hormones are transcriptional regulators present in the nucleus, and bind to specific sites in chromatin DNA to regulate gene transcription reactions.
  • a ligand such as a hormone is not bound to a receptor
  • transcription is suppressed
  • a ligand binds to a receptor
  • transcription is activated by a change in chromatin structure or the like. It has been reported that many factors called coactivator and co-repressor form a complex in the pathway from the nuclear receptor to the transcription device to form a complex.
  • a corepressor complex containing histone deacetylase binds to the receptor to which the ligand is not bound, thereby suppressing gene expression.
  • the corepressor complex is Instead, a coactivate complex containing histone acetylase is recruited.
  • An example of such a coactivator is Skip (Ski interacting protein, also known as N-CoA62), and several nuclear receptors (eg, vitamin 3 receptor, puter, retinoic acid receptor, estrogen).
  • an object of the present invention is to provide a transcription regulatory factor, particularly a new factor that can be involved in the transcriptional regulation of nuclear receptors.
  • the present inventors have found through cloning and functional analysis of a human homolog of the Drosophila crn (crooked neck) gene that the human homolog is involved in the regulation of transcription via a nuclear receptor.
  • the Drosophila crn gene itself is a gene that has the highest expression level in the early stage of embryogenesis, and inactivation of this gene causes defects in embryogenesis, mainly leading to the development of the nervous system. Effects have been reported (Zhang, K., Smouse, D., and
  • TPR tandemly oriented tetratricopeptide repeat
  • the human homologue of the crn gene has a large number of TPRs, similar to the Drosophila crn gene, although the copy number differs from 15 in the copy number.
  • the human crn gene that the present inventors have cloned is a gene encoding a protein (XAB2) involved in transcription-related transcription-coupled DNA repair that has been reported previously (Yoshimichi et al., Jounal. Biol. Chem. 275: 34931-34937), but the present inventors have newly found that the present gene product is involved in transcriptional repression.
  • HDART a HDAC associated repressor TPR
  • the present inventors have also found that HDART directly binds to Skip, which functions as a transcription coactivator of the nuclear receptor described above, and suppresses transcription of a nuclear receptor. Furthermore, they also demonstrated that HDART is one of the transcriptional corepressors of nuclear receptors, and that it can bind to HDAC and strongly suppress transcription by histone deacetylation of HDAC.
  • the present invention is based on various newly elucidated functions of HDART, and is specifically as follows.
  • the present invention relates to a DNA encoding a transcription repressor, comprising: (A) DNA encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or (B) DNA encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Is DNA.
  • the present invention relates to a DNA encoding a transcription repressor, wherein (A) an amino acid having one or more amino acids substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 DNA encoding a protein having an acid sequence, or (B) a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention is a transcriptional repressor encoded by the DNA according to the above (1) or (2).
  • the present invention is the transcription repressor according to the above (3), which is capable of suppressing transcription caused by nuclear hormone receptor.
  • the present invention relates to a DNA encoding a peptide capable of activating transcription
  • (A) a peptide consisting of the amino acid sequence of positions 1 to 179 in SEQ ID NO: 2
  • the present invention relates to a DNA encoding a peptide capable of activating transcription
  • SEQ ID NO: 1 Is an MA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence from 1 to 537 bases in.
  • the present invention is a transcriptional activation peptide encoded by the DNA according to the above (5) or (6).
  • the present invention is a DNA having a length of at least 15 nucleotides, among the DNAs described in any of the above (1), (2), (5) and (6).
  • the present invention is a vector into which the DNA according to any of the above (1), (2), (5) or (6) is inserted.
  • the present invention is a host cell that carries the DNA according to any one of the above (1), (2), (5) or (6) or the vector according to the above (9).
  • the present invention is an antibody capable of binding to the factor described in (3) or the peptide described in (7).
  • the present invention is an oligonucleotide probe which hybridizes with the DNA according to any one of (1), (2), (5) and (6) and has a length of at least 10 nucleotides.
  • the present invention is a substrate to which any one of the following (A) to (D) is fixed.
  • HAT histone acetyl transferase or histone acetylase
  • HDAC histone deacetylase or histone deacetylase
  • DAPI 4 ′, 6— Diamidino 2-phenylindole
  • RAR Retinoic acid receptor
  • GR Dalcocorticoid receptor
  • DBD DNA binding domain
  • AD Activity domain
  • ATRA All-trans Retinoic Acid: All transretinoic acid.
  • the present invention relates to factors relating to transcriptional regulation.
  • This transcription factor includes a factor that suppresses transcription and a factor that activates transcription.
  • the transcription repressor will be described.
  • An example of the transcription repressor of the present invention is HDART, and the amino acid sequence of HDART consists of SEQ ID NO: 2.
  • the transcription repressor of the present invention is not limited to HDART described in SEQ ID NO: 2, and one or more amino acids may be substituted, deleted, or inserted in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 as long as it has a transcription repressing activity.
  • the HDART protein is expressed in the nucleus of a human cell, it can be obtained from the nucleus of a human cell.
  • the human cells serving as the raw material are not particularly limited, but, for example, 293 cells that clearly express HDART endogenously can be used.
  • HDART similar protein having an amino acid substitution or the like for example, a phage library screening techniques known in the art (Mol ecul r Cloning 3 rd Ed , Chapter 2, pp. 2. 1-2. 117) and polymerase Ichize chain reaction (PGR:.. Molecular Cloning 3 rd Ed, Chapter 8, pp 8. 1-8 126) be carried out utilizing techniques Wear.
  • DNA SEQ ID NO: 1 encoding HDART or a part thereof as a probe or primer to obtain DNA having homology with SEQ ID NO: 1, and producing a protein based on this DNA Can be obtained by
  • the protein obtained here usually has a high homology in HDART and amino acid sequence. This high homology is at least 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and more preferably at least 97% or more (for example, 98-99%).
  • stringent eight hybridization conditions One example is a hybridization solution containing 25% formamide, more stringent 50% formamide, 4X SS 50mM Hepes pH 7.0, 10X Denhardt's solution, 20g / ml denatured salmon sperm DNA at 42 ° C
  • the labeled probe is added, and the mixture is incubated at 42 ° C. overnight to perform the hybridization.
  • the cleaning solution and temperature conditions in the subsequent cleaning are lxSS 0.13 ⁇ 4 SDS, about 37 ° C. More severe conditions are 0.5xSS 0.1% SDS, about 42 ° C. It can be performed at 2xSSC, 0.1% SDS, about 65 ° C.
  • the sequence described in SEQ ID NO: 2 is artificially modified, it is generally within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, more preferably 1% of all amino acids. Although it is considered to be within the above range, the amino acid sequence may be substituted beyond the above-mentioned modification ratio as long as the transcription repressing activity can be maintained.
  • the technique for artificially modifying the amino acid sequence can be carried out by, for example, a known method for preparing a deletion-mutant, a PCR method, and site-directed mutations. Whether or not the modified protein has transcriptional repressive activity, similarly to HDART, is determined by using various reporter analysis methods and the like described in Examples described later. Can be analyzed and determined.
  • HDART Since the above-mentioned HDART or a protein similar thereto has a transcription repressing activity as described above, the transcription of a desired gene can be suppressed by using this function in combination with a desired transcription apparatus.
  • This transfer device may be either an in transfer system or an in F / 'ra transfer system.
  • the transcription repressor of the present invention can be used alone to suppress transcription.
  • HDART since HDART has no DNA binding ability, it is preferably used as a fusion protein in which a DNA binding region is fused.
  • HDART also has the ability to bind to HDAC, and HDART can recruit HDAC and strongly suppress transcription by histone deacetylation activity. Therefore, the transcription repressor of the present invention can also suppress transcription by using it together with HDAC or by inducing HDAC.
  • HDAC has a type
  • HDAC1, HDAC2, HDAC3 and Type II HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, Is known to exist. Since the HDART of the present invention is considered to bind to HDAC2, HDAC5, HDAC7, HDAC8, etc., in the present invention, HDAC2, HDAC5, HDAC7, and HDAC8 can be preferably used. There is no particular limitation, and any HDAC belonging to Type I or II can be used.
  • a transcription device that can be suppressed by the transcriptional repressor of the present invention preferably includes a transcription device via nuclear receptors.
  • the nuclear receptor include a retinoic acid receptor and a dalcocorticoid receptor, and retinoin X receptor and vitamin D receptor as long as the factor of the present invention can suppress transcription.
  • Nuclear receptors for hormones such as evening, androgen receptor, and estrogen receptor, and thyroid hormone receptor can be included. Therefore, the transcriptional repressor of the present invention may be useful for treating such dysregulation of transcription from nuclear receptors, particularly for diseases caused by excessive transcriptional promotion.
  • HDART suppresses the transcription of retinoic acid receptor and further suppresses the differentiation induced by transcription of this retinoic acid receptor.
  • the present transcriptional repressor may be applied as a therapeutic drug for diseases caused by enhanced differentiation by transcription of retinoic acid receptor.
  • the present invention relates to a DNA encoding the above-described transcription repressor.
  • the DNA include, but are not limited to, a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and a DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 described above.
  • the DNA may be a human cell (for example, as described in Example 1 described below, human islet cells, as described in Example 1 below) using the DNA of SEQ ID NO: 1 or a part thereof as a probe or primer. ) Can be obtained by hybridization or polymerase chain reaction (PCR) from a cDNA library or the like. Other ways, using mRNA of human cells in ⁇ , as primers a part of the DNA of SEQ ID NO: 1 RT- PCR (Molecular Cloning 3 rd Ed, Chapter 8, Protocol 8, pp. 8. 46-8. 53).
  • a human cell is described as an example, but it may be prepared using other mammalian cells, eukaryotic cells, and the like. Hybridization conditions for isolating DNA are as described above.
  • the DNA described in SEQ ID NO: 1 and a complementary strand thereof may be synthesized using a DNA synthesizer and annealed to produce the DNA. Since the above DNA encodes a transcription repressor, it can be used as a tool for producing the transcription repressor or as a tool for introducing it into cells or individuals to express the transcription repressor. When used for such purposes, it is preferable to incorporate the DNA into an expression vector or the like.
  • the expression vector can be appropriately selected depending on the translation system used for protein production or the cell to be introduced.
  • the vector is first introduced into a host cell, and the host cell is cultured.
  • the method of introducing the vector into the cell can be appropriately selected depending on the cell to be used. For example, biological methods using virus vectors or phage, calcium phosphate method, Lipofexi
  • a chemical method such as a three-method method, a physical method such as a gene gun, and an electoral port method can be used.
  • the protein produced in the host cell can be used after purification (for example, affinity purification) if necessary.
  • the expression vector into which the above DNA is incorporated can also be used in cells or individuals. It can be used for the purpose of suppressing transfer. That is, a desired transcription system can be suppressed by introducing this expression vector into a cell or an individual and expressing the transcription repressor.
  • the transcription repressing factor of the present invention can exert a transcription repressing activity even when used alone.
  • the present transcription repressor be expressed as a fusion protein with a DNA binding region capable of binding to DNA in a control region of a desired gene. This makes it possible to suppress the transcription of the target gene.
  • the present transcription repressor has the ability to bind to HDAC, expression of the present transcription repressor can recruit HDAC to more strongly suppress transcription.
  • the transcriptional repressor encoded by the DNA of the present invention can effectively suppress the transcription of nuclear receptors
  • the present DNA is used as a therapeutic composition for diseases caused by enhanced transcription of these nuclear receptors. May be applied.
  • therapeutic vectors include, for example, retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, vaccinia virus vectors, lentivirus vectors, herpes virus vectors, alphavirus vectors, and EB virus vectors. And virus vectors such as Papi's mouth virus vector and Fomy virus vector Yuichi.
  • the present invention also relates to a peptide capable of activating transcription, as opposed to the above, among the transcription regulatory factors.
  • HDART When HDART is full-length, it functions as a transcription repressor, whereas the dominant negative peptide of HDART functions as a transcription activator.
  • N4TPR N-terminal TPRs
  • N4TPR N-terminal TPRs
  • the present invention is not limited thereto, and one or more amino acids may be substituted, deleted, inserted and Z or added amino acids in the amino acid sequence from position 1 to position 179 in SEQ ID NO: 2 as long as it has a transcription activating ability.
  • Peptides having a sequence can be included.
  • the preparation of the above-mentioned dominant negative peptide can be adjusted by synthesizing a peptide based on DNA consisting of the nucleotide sequence from 1 to 537 of SEQ ID NO: 1.
  • a codon was changed by adding a mutation (substitution, deletion, insertion and / or addition) to the nucleotide sequence from 1 to 537 in SEQ ID NO: 1 above. It can be prepared by peptide synthesis based on DNA.
  • the peptide Since the peptide has a transcription activating ability, it can be used to promote transcription of a desired transcription system.
  • N4TPR of HDART activates the transcription of nuclear receptors, and thus can be used to promote the transcription of these nuclear receptors.
  • the nuclear receptor preferably, a nuclear receptor on which Skip acts, for example, retinoic acid receptor, darcocorticoid receptor, vitamin! ) Receipt, estrogen receptor.
  • the peptide of the present invention it may include hormones such as retinoin X receptor, androgen receptor and thyroid hormone receptor, and nuclear receptor for fat-soluble pitamine and the like.
  • N4TPR N4TPR to activate transcription of the retinoic acid receptor
  • ATRA is currently used to induce differentiation of malignant tumors such as leukemia by activating the transcription of receptor retinoic acid.
  • vitamin A and its derivatives including ATRA have been used in hepatocellular carcinoma (Okuno, M. et al., (2002) Front Biosci 7, 204-18) and ovarian cancer (Zhang D. et a ) J Cell Physiol 185 (1), 1-20), thyroid cancer (Schmutzler C. and Kohrle J.
  • the peptide can be used.
  • the present invention relates to a DNA encoding the above-mentioned peptide having the ability to activate transcription.
  • the present invention is not limited to this, and one or more amino acids may be substituted, deleted, inserted, and / or substituted in the amino acid sequence of positions 1 to 179 in SEQ ID NO: 2 as long as it has a transcription activating ability.
  • DNA that encodes a peptide having an added amino acid sequence, or DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of the nucleotide sequence from 1 to 537 bases in SEQ ID NO: 1 can be included. .
  • the DNA encoding the above-mentioned transcriptional activation peptide can be prepared by, for example, deleting the C-terminal side after obtaining the DNA encoding the above-mentioned transcriptional repressor. Alternatively, it may be synthesized and prepared by a DNA synthesizer.
  • the above-mentioned DNA can be used for producing the above-mentioned transcription-activating peptide, or for the purpose of being introduced into a cell or an individual to express the above-mentioned transcription-activating peptide.
  • the expression vector in this case can be appropriately selected depending on the transcription-translation system for producing the peptide.
  • This transcription and translation system may be either in vitro or in r / ra.
  • the transcriptional activation peptide is produced intracellularly by introducing an expression vector into which the DNA is incorporated into a cell and culturing the cell. The method of introduction into cells is the same as described above.
  • the DNA is directly introduced into a cell or the like and temporarily expressed or temporarily inserted into a chromosome to stably Or may be incorporated into an expression vector and introduced into cells or the like.
  • the transcription-activating peptide can be applied to the treatment of differentiation induction of malignant tumors like ATRA. Therefore, instead of using the transcription-activating peptide directly, the present DNA is injected into a patient and the like. May be used for the above treatment method. For this purpose, it is preferable to incorporate the DNA into a vector for transferring the DNA to a desired tissue or cell.
  • a virus vector such as the retrovirus vector described above can be used.
  • the DNA encoding the transcriptional repressor of the present invention can be modified into the DNA encoding the above-mentioned transcription activation peptide by shortening the DNA encoding the N-terminal side.
  • the DNA encoding the transcription repressor or the DNA encoding the transcriptional activation peptide can be used as a shorter partial fragment, as a probe for hybridization, a PCR primer, or a liposome derivative. .
  • the DNA has a length that can maintain the specificity as a probe or the like, for example, 15 nucleotides.
  • the present invention provides an oligonucleotide probe which hybridizes with the DNA of the present invention (for example, the DNA described in SEQ ID NO: 1) and has a length of at least 10 nucleotides.
  • examples of such a polynucleotide include those that specifically hybridize with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a complementary strand thereof.
  • “specifically hybridizes” means that the hybridization does not cause significant cross-hybridization with DNA encoding other proteins.
  • the above probes and primers can be used for cloning of DNA encoding a transcriptional repressor and the like.
  • the present invention also relates to an antibody capable of binding to the above-described transcription repressor or transcriptional activation peptide.
  • the antibody of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can specifically bind to the above-mentioned transcription repressor or transcription activating peptide.
  • the polyclonal antibody is obtained by mixing the protein of the present invention or a partial peptide thereof with Freund's adjuvant, if necessary, and immunizing non-human animals such as rabbits, goats, and guinea pigs by a well-known method, and increasing the antibody titer. It can be prepared by collecting the serum from the peripheral blood of the immunized animal after confirming the above.
  • a monoclonal antibody is also used to immunize an animal such as a mouse by a well-known method using the above-mentioned transcription repressor or transcriptional activating peptide or a partial peptide thereof, and collects the spleen or lymph node of the immunized animal having an increased antibody titer.
  • a hybridoma is prepared by fusing antibody-producing cells and myeloma cells in these tissues. It can be obtained by collecting the antibody produced from the hybridoma from the culture supernatant.
  • These antibodies can be used for affinity purification of the above-mentioned transcription repressor or transcriptional activation peptide, and can be used for immunological analysis of the expression level of the transcription repressor in various cells. Or may be used for the purpose of inhibiting a transcription repressor.
  • the present invention also provides a substrate having the oligonucleotide of the present invention immobilized thereon.
  • the substrate By using the substrate as a biochip, for example, the expression state of the DNA of the present invention in a test organism (cell) can be analyzed.
  • the DNA of the present invention (for example, the DNA of SEQ ID NO: 1 or a partial DNA region thereof) is amplified from a test organism (cell).
  • a substrate on which a nucleotide probe that hybridizes with the DNA is fixed is prepared.
  • the DNA is brought into contact with the substrate.
  • the expression state of the DNA of the present invention can be analyzed by detecting the DNA hybridized to the nucleotide probe immobilized on the substrate.
  • a DNA array method is a DNA array method.
  • Preparation of a DNA sample from a test organism (cell) can be performed by a method well known to those skilled in the art.
  • it can be prepared based on chromosomal DNA extracted from cells.
  • the DNA of the present invention can be prepared by PCR using the primers that hybridize to the DNA of the present invention and the chromosomal DNA as type III. is there. If necessary, the prepared DNA sample can be labeled for detection by a method well known to those skilled in the art.
  • the term “substrate” refers to a plate-like material capable of immobilizing nucleotides. Fees, usually also referred to as chips.
  • nucleotides include oligonucleotides and polynucleotides.
  • the substrate of the present invention is not particularly limited as long as nucleotides can be immobilized, but a substrate generally used in DNA array technology can be suitably used.
  • DNA arrays are composed of thousands of nucleotides printed on a substrate at high density. Normally, these DNAs are printed on the surface of a non-porous substrate.
  • the surface layer of the substrate is generally glass, but a permeable membrane such as a nitrocellulose membrane can be used.
  • examples of the method for immobilizing (arraying) nucleotides include an oligonucleotide-based array developed by Affymetrix.
  • oligonucleotide arrays oligonucleotides are usually synthesized in situ.
  • photolithographic technology Af fymetrix
  • ink jet Rasetta Inpharmatics
  • the nucleotide probe immobilized on the substrate is not particularly limited as long as it can detect the DNA of the present invention. That is, the probe is, for example, a probe that specifically hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide probe need not be completely complementary to the DNA of the present invention, as long as specific hybridization is possible.
  • the length of the nucleotide probe to be bound to the substrate is generally 10 to 100 bases, preferably 10 to 50 bases, and more preferably 15 to 25 bases when the oligonucleotide is immobilized. .
  • the DNA sample is brought into contact with the substrate.
  • the DNA sample is hybridized to the nucleotide probe.
  • the reaction solution and reaction conditions for hybridization are determined by the nucleotide pro- cess immobilized on the substrate. Although it may vary depending on various factors such as the length of the tube, it can be generally carried out by a method known to those skilled in the art.
  • the presence or absence or the intensity of hybridization between the DNA sample and the nucleotide probe immobilized on the substrate is detected.
  • This detection can be performed, for example, by reading the fluorescent signal with a scanner or the like.
  • DNA arrays DNA fixed on a slide glass is generally called a probe, while labeled DNA in a solution is called a target. Therefore, the above nucleotide immobilized on the substrate is referred to herein as a nucleotide probe.
  • the detected hybridization intensity is compared with a control.
  • Examples of the above method include a DNA array method (SNP gene mutation strategy, Kenichi Matsubara and Yoshiyuki Sakaki, Nakayama Shoten, l28-135 Nature Genetics (1999) 22: 164-167), and others skilled in the art. Can be implemented as appropriate with reference to known documents and the like.
  • the present invention also provides a substrate on which the protein of the present invention or a partial fragment of the protein is immobilized.
  • the substrate By using the substrate as a biochip, for example, it is possible to search for a molecule that binds to the protein of the present invention or to screen for an HDAC inhibitory compound.
  • a protein on which a protein is immobilized on a substrate is called a protein chip.
  • the principle is that, like a DNA chip, proteins are immobilized on a slide glass or membrane at high density, and proteins and nucleic acids that interact with them are detected.
  • the HDART protein of the present invention binds to various HDAC proteins, it can be applied to screening for HDAC inhibitory compounds. More specifically, by immobilizing the HDART protein of the present invention on a solid phase surface, various HDACs can be bound to one surface. By binding various compounds to the surface of the solid phase and measuring the HDAC activity, the HDAC inhibitory compound can be screened. As an example of the HDAC inhibitory compound obtained by the above screening, trichostatin A used as a drug in a cancer differentiation induction therapy can be shown.
  • the substrate on which the antibody of the present invention is immobilized can be used as a biochip. High-density is possible by immobilizing the antibody separated and purified with high purity on the chip surface.
  • elution can be performed by spotting a sample on a substrate and then washing the protein and other contaminants that do not show an affinity for the spot surface.
  • those skilled in the art can appropriately detect the presence / absence (strong or weak) of the affinity by a known method in consideration of the type of the substrate and the like.
  • Vector can be measured.
  • the immobilization of any DNA or peptide on the substrate can be appropriately performed by those skilled in the art by a known method.
  • FIG. 1 shows HDART, which is a TPR (Jetra trico peptide repeat) protein, and shows its structure and relationship with related genes.
  • HDART shows the schematic structure of the secondary structure, showing the TPR, acidic region, Skip interaction region, and CRN homology region.
  • FIG. 2 shows a comparison of CRN homology regions between human HMRT and human CRN.
  • FIG. 3 is a diagram showing a phylogenetic tree between HDARTZCRN proteins. This phylogenetic tree was constructed using the GENETYX-MAC program (software development).
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of immunoprecipitation analysis identifying the interaction between exogenous or endogenous HDART and exogenous Skip.
  • Lane 1 shows the result of analyzing the interaction between exogenous HDART and exogenous Skip.
  • Lane 1 is GFP—HDART only
  • Lane 4 is Flag—Skip only
  • lanes 2 and 3 are both Was expressed in 293 cells.
  • Lane 5 is the control cell with no vector introduced.
  • Lanes 1, 2, 4, and 5 are samples immunoprecipitated with anti-Flag antibody
  • lane 3 is a sample immunoprecipitated with control mouse IgG.
  • the upper two panels show the expression of each expressed protein, and the lower two panels show the immunoprecipitates.
  • the upper row shows the results of immunoblotting with the anti-GFP antibody
  • the lower row shows the results of immunoblotting with the anti-Flag antibody.
  • FIG. B shows the results of analyzing the interaction between endogenous HDART and exogenous Skip.
  • FIG. 5 shows the results of identification of interacting regions on both Skip and HDART proteins.
  • FIG. 6 is a graph showing that HDART suppresses transcriptional activation by nuclear hormones (retinoic acid or dalcocorticoid).
  • (A) shows the results of concentration-dependent suppression of transcription activated by retinoic acid by HDART.
  • the corrected CAT activity was shown based on the CAT activity when the empty vector (lOg) was introduced in the absence of ligand.
  • the average of three replicate experiments and the error bar indicate SD.
  • FIG. 7 is a photograph showing the subcellular localization of HDART.
  • the left panel shows the results of immunofluorescence staining using the anti-HDART antibody (upper) or pre-immune serum (lower), and the right panel shows the DAPI staining results in the visual field corresponding to the left panel.
  • FIG. 8 shows the autonomous promoter inhibitory activity of HDART.
  • Figure 9 is a photograph showing the direct interaction between HDART and HDAC.
  • FIG. 10 shows that HDART suppression is due to a single HDAC inhibitor (tricosutin A, sodium butyrate).
  • C, D indicate that L.) inhibited the suppression of HDART, respectively.
  • FIG. 11 is a diagram and a photograph showing the dominant negative effect of four TPRs (N4TPR) at the N-terminus of HDART.
  • FIG. 12 is a diagram and a photograph showing that HDART inhibits retinoic acid-induced differentiation in band-1-19-P cells.
  • Awake 19-P cells into which the HDART expression vector or empty vector was introduced were analyzed for differentiation induction in the presence and absence of ATRA (2 x M).
  • ATRA (2 x M).
  • the GFP vector was cotransfected with the above vector. Photographs (A, B, C, D) of green fluorescent light emission by GFP taken by a standard micrograph and photographs (E, F) taken under a phase contrast microscope are shown.
  • ATRA ATRA (I) and empty vector transfected sample
  • B ATRA (I) and empty vector-transfected sample
  • c ATRA (I) and HDART expression vector
  • D ATRA (+) and HDART expression Vectors
  • phase-contrast photographs of the same field of view (F) and (D) black arrowheads represent undifferentiated GFP positive cells
  • white arrowheads represent differentiated cells.
  • G Graph shows the percentage of morphologically differentiated cells in GFP positive cells. 4 independent experiments The results are presented as mean and SD (error) (P ⁇ 1% between HDART on Mock and ATRA (+), Student's t-test).
  • a human homologue of the Drosophila cm gene was searched using the BLAST database, and it was found that human EST (expressed sequence tag) clone # 52930 derived from islet mRNA in the knee has high homology to the above crn gene. It has been shown. The complete sequence of this clone W52930 was determined according to a standard method. By the 5'-RACE method (5'-rapid amplification of cDNA ends strategy), this gene was identified as having a full-length cDNA of 2660 bases and one long reading frame. did. As described later, the protein identified here binds to HDAC (histone deacetylase) and functions as a reversal device.
  • HDAC histone deacetylase
  • HDART is a highly conserved TPR protein encoding 855 amino acids ( Figure 1).
  • the HDART protein deduced from the DNA sequence has been shown to be clearly similar to the human CRN protein.
  • the region from residues 262 to 779 of the HDART protein is highly conserved between HDART and the human CRN protein ( Figures 1 and 2). Genetic analysis of this protein among several species has shown that they form a gene family ( Figure 3).
  • yeast two-hybrid system was used to isolate proteins that bind to HDART. Specifically, yeast MATCHMAKER two-hybrid analysis kit
  • NonidetP-40 buffer containing 10 l of protease inhibitor cocktail (Sigma #p 8340) 100 1 (5 OmM Tris HC1 (pH 7.6), 1 Cell extracts (lmg) were prepared by lysing cells in 5 OmM NaCK 5 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM PMSF). This extract was preliminarily clarified by incubating with 40 l of Protein A / G Sepharose beads for 30 minutes at 4 ° C.
  • the clarified supernatant extract was incubated with anti-Flag antibody or negative control mouse IgG antibody (2 ag) for 1 hour and then sedimented for 30 minutes using 40 l protein A / G Sepharose. .
  • the immunoprecipitates were washed four times with Nonidet P-40 buffer.
  • a / G bound protein in SDS reading buffer The eluate was eluted from the Sepharose beads, and the eluate was developed by SDS-PAGE. After the development, the membrane was transferred to a membrane, and the membrane was subjected to immunoplot according to a standard method. Antibodies for this immunoplot were anti-FLAG antibody M2 (Sigma) and anti-GFP monoclonal antibody clone 1E4 (MBL).
  • FIG. 4A The results of the above immunoprecipitation analysis are shown in FIG. 4A.
  • the upper two panels show the expression results of each protein, and the lower two panels show the immunoprecipitates.
  • the GFP-HDART protein was immunoprecipitated together with the Flag-Skip fusion protein by the anti-Flag antibody only when both of the complex proteins were expressed (lane 2).
  • the anti-FLAG antibody Lane 1
  • no precipitation was observed when the negative control antibody was used (Lane 1).
  • Lane 3 This result suggests that HDART and Skip interact specifically at in / ra.
  • the upper panel shows the results of immuno-plotting the cell extract with anti-HDART antibody
  • the middle panel shows the results of immuno-precipitation using anti-Flag antibody and immuno-plotting with anti-Flag antibody
  • the lower panel Shows the results of immunoprecipitation using an anti-Flag antibody followed by immunoplotting with an anti-HDART antibody.
  • Skip N-terminal region (codon 1-220), nuclear hormone binding region (NHR bindng, codon 221-388), transactivation region to map the region on Skip involved in the interaction with HDART (TA, codons 438-536)
  • a deletion mutation series in which the various regions above were deleted was prepared, and the mutation was detected by the yeast hybrid analysis using Gal4 DBD-HDART described in Example 2 above.
  • the interaction with Skip was analyzed.
  • the analysis results are shown in FIG. 5A.
  • the “+” symbol shown to the right of FIG. 5A indicates that an interaction was detected by filter-lift analysis of ⁇ -galactosidase activity, and the “+” number indicates the relative strength of the interaction.
  • -25-I did.
  • CAT analysis is used for retinoid response elements.
  • CAT analysis was performed using RAR (ret ino id ac id receptor) report plasmid that incorporates thymidine yellow promoter (pTREpal-tata) and CAT gene downstream of (ret inoid response el ement).
  • RAR ret ino id ac id receptor
  • pcDNA3-HDART which constantly expresses HDART, was transfected into HepG2 cells simultaneously with the RAR reporter plasmid using the Eiiectene kit (QIAGEN).
  • the amount of pcDNA3-HDART expression vector introduced was changed to 0.5, 0.5, and 1.0 g, and the amount of pcDNA3-HDART expression vector became 1 g with an empty pcDNA vector to make the amount of DNA of each transfection the same.
  • the measurement results (FIG. 6) represent the values corrected based on the CAT activity into which the empty vector 1.0 / ig was introduced in the absence of ATRA. Also, the standard deviation is shown by the average and error bars of the results of three experiments.
  • CAT activity was increased 5-fold by ATRA in cells into which an empty vector (pcDNA) was introduced.
  • pcDNA empty vector
  • CAT activity induced by ATRA was suppressed by HDART in a concentration-dependent manner.
  • HDART co-expression suppressed repo overnight-gene activation in response to darcocorticoids, to a similar extent to that observed in transactivation caused by RAR (Retinoic acid receptor) (Fig. 6 B). These results indicate that HDART selectively suppresses transcription activated by nuclear receptors. [Example 5] Localization of HDART in cell nucleus
  • HDART Since HDART has been shown to be directly involved in transcriptional regulation, it is expected that HDART will be localized in the nucleus of cells. Therefore, a polyclonal antibody against the HDART recombinant protein was prepared, and the immunofluorescence experiment was used to analyze the intracellular localization of HDART.
  • a polyclonal antibody To prepare a polyclonal antibody, first, it was produced as a fusion protein of His-HDART (amino acid residues 296-431) in Escherichia coli and purified with Ni-NTA resin (QIAGEN) having affinity for His. Next, the His-HDART protein was immunized to a heron, and the obtained anti-HDART antiserum was further purified by affinity mouth chromatography using ProtOn kit 1 (MPS). The purified egret anti-HDART antibody purified here was incubated with Hela cells endogenously retaining HDART, followed by incubation with PE (Phycoerythrin) -fused anti-Peagle antibody, and immunofluorescence staining was performed. As a control experiment, a similar operation was performed using pre-immune rabbit sera instead of the rabbit anti-HDART antibody. DAPI staining was also performed to determine the location of the nucleus.
  • His-HDART amino acid residues 296-431
  • HMRT localization of HMRT in living cells was analyzed. Hela cells were transfected with GFP or GFP-HDART expression vector, and fluorescence emission by GFP was detected 24 hours later. In addition, GFP-HDART cells were incubated with Hoechest 33342 dye to visualize the nuclei.
  • the Gal4 DBD-HDART plasmid which expresses a fusion protein of the full-length HDART protein and Gal4 DBD, is introduced into NIH3T3 cells into which the Gal4 repo overnight plasmid (pGal4—Lucierase) has been introduced in advance. (0, 0.1, 0.3, 0.5 ag).
  • the amount of expression vector was adjusted to 0.5 using an empty vector of GaM DBD in each transfection. 24 hours after transfection, the expression activity (luciferase activity) of the reporter gene from the promoter was analyzed.
  • the luciferase activity of each sample was expressed as a value corrected using the luciferase activity when only the empty vector was introduced as a reference (100%) (FIG. 8).
  • the analysis results were shown as the average of the results of three experiments, and the standard deviation was shown by error (Fig. 8A).
  • the same analysis was performed on another U-20S cell using Gal4 DBD-HDART (introduction amount 0 or 0.5 lig) (FIG. 8B).
  • HDART significantly suppressed the promoter activity in NIH-3T3 cells in a concentration-dependent manner, and reduced luciferase expression by 80% at the highest concentration (0.5 g) (Fig. 8A). Similar results! It was also observed in J-20S cells (Fig. 8B). From these results, HDART It was shown to have an autonomous transcriptional repressing action by itself.
  • HDART having no GAL4 DNA binding region
  • luciferase expression was not suppressed at all (not shown). This suggests that HDART itself has no binding activity to DNA in the open motor region.
  • Acute transcriptional regulation is reported to be regulated by the state of core histone acetylation through a mechanism involving activation by HAT (histone acetylase) and repression by HDAC (histone deacetylase). Have been.
  • HAT histone acetylase
  • HDAC histone deacetylase
  • a Flag-HDACs expression vector capable of expressing different types of HDACs (1, 3, 4, or 6) and a GFP-HDART expression vector were cotransfected into 293 cells as in Example 2, and transfection was performed. After 24 hours, the cell extract was prepared. Each cell extract was incubated with an anti-Flag antibody and immunoprecipitated. The immunoprecipitated product was separated by SDS-PAGE, and the separated pattern was transferred to a membrane, followed by immunoblotting using an anti-Flag antibody or an anti-GFP antibody. For reference, in order to confirm the expression of the GFP-HDART protein in each cell, each sample before immunoprecipitation was similarly developed by SDS-PAGE, and immunoplotting using an anti-GFP antibody was performed. In FIG.
  • the upper panel shows the results of expression of the GFP-HDART protein before immunoprecipitation
  • the middle panel shows the results of immunoprecipitation of the immunoprecipitated product with an anti-Flag antibody
  • the lower panel shows the results.
  • the result of immunoblotting of the immunoprecipitated product with an anti-GFP antibody is shown.
  • the HDAC types are as follows from the left of the figure: lane 1; HDAC L lane 3; HDAC 3, lane 4; HDAC 4, lane 5, and HDAC 6.
  • Lane 2 is a sample expressing only GFP-HDART. As shown in Fig.
  • GST binding buffer coupling reaction was prepared containing a l ml in GST-HDART fusion protein or pair irradiation GST protein (about 1 / ig) and 3 5 S- radiolabelled ⁇ translation product (10 l). After incubating the reaction solution at 4 ° C for 1 hour with shaking, the Sepharose-GST protein complex was washed 5 times with GST binding buffer. The protein bound to the GST protein was eluted by boiling in a sample buffer containing sodium dodecyl sulfate (SD.S) and separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. It was confirmed by Coomassie brilliant blue staining of GST fusion protein are equally electrophoresis was used to detect 3 5 S- radiation-labeled HDAC by further O over autoradiography.
  • SD.S sodium dodecyl sulfate
  • in vitro translated HDAC3 is simply GST It did not bind to the protein and could not be pulled down, but was shown to be pulled down by using the GST-HDART fusion protein (FIG. 9B). Although not shown in the figure, HMC1 showed similar results. This suggested that this interaction between HDART and HDAC was direct.
  • the CAT reporter was used in the same manner as in Example 4 in the presence of trichostatin A (TSA) which specifically inhibits HDAC Analysis was performed ( Figures 10C and D).
  • TSA trichostatin A
  • a fixed amount of pcDNA3-HDART expression vector (1 jag) was used ("HDART10" in Fig. 10), and ⁇ TSA or 1mA sodium butyrate was added together with the ligand (ATRA or dexamethasone). did.
  • RAR and TR are expressed in the form of / 7 rzo '(Baniahmad, A., Kohne, AC, and Renkawitz, R. (1992) Enibo J 11 (3), 1015-23) and in vitro (Fondel, JD, Roy , AL, and Roeder, RG (1993) Genes Dev 7 (7B), 1400-10.) Suppresses gene activation in the absence of ligand. For this reason, this is called active repression. Skip interacts with NHR in a ligand-independent manner (MacDonald, PN, Baud ino, II. A., Tokumaru, H., Dowd, DR, and Zhang, C. (2001) Steroids 66 (3-5 ), 171-6.).
  • 293 cells were transfected with Flag-Skip and N4TPR flagged with GFP or GFP. Twenty-four hours after transfection, a cell extract was prepared and immunoprecipitated with an anti-Flag antibody. Immunoprecipitates were separated on SDS-PAGE. In addition, in order to confirm the expression of endogenous HDART before immunoprecipitation, cell extracts before immunoprecipitation were similarly separated by SDS-PAGE. The pattern after separation was transferred to a membrane. The expression of Flag-Skip was detected using an anti-FLAG antibody, the expression of GFP and GFP-N4TPR was detected using an anti-GFP antibody, and the expression of endogenous HDART was detected using an anti-HMRT antibody. 1 1 A). In Fig. 11A, the lower three panels show the immunoprecipitated Skip (upper lower), endogenous HDART (lower middle) and N4TPR (lower lower), respectively. Indicates expression of endogenous HDART protein prior to immunoprecipitation.
  • N4TPR expression reduced the amount of HDART co-precipitated with Skip compared to controls without N4TPR (GFP only, lane 1).
  • N4TPR (Lower center panel, lane 2).
  • N4TPR overexpression increased the interaction between N4TPR and Skip and significantly increased the amount of co-precipitated Skip (lane 2, lower bot tom panel).
  • Expression of the control protein (GFP) had no effect on the interaction of HDART with Skip (lane 1). This result shows that N4TPR Instead, it has been shown to act as a dominant negative protein that interacts with Skip.
  • ATRA All-trans retinoic acid
  • the cell line derived from human rhabdomyosarcoma-1-19-P is mainly composed of small polygonal cells, and finally differentiates into giant myotube-like cells with retinoic acid.
  • the number of GFP positive cells was 30-70.
  • the number of GFP-positive cells in the ATRA-treated cells transfected with the empty vector was less than 30% due to the cytotoxic effect of ATRA.
  • the number of GFP-positive cells was the same between the groups.
  • the transcription repressor of the present invention acts on a desired transcription system to suppress the transcription autonomously, and particularly suppresses the transcription of nuclear receptors, and suppresses the transcription of the transcription system. Can be used for purpose. Further, the transcription repressor of the present invention has an ability to bind to HDAC, and can exert a transcription repressing ability through histone deacetylation activity of HDAC. Therefore, HDAC can be recruited using the transcription repressor of the present invention, and transcription can be suppressed by the action of HDAC. Such an action of the transcription repressor of the present invention can be applied, for example, to diseases caused by enhanced transcription of nuclear receptors, and the transcription repressor is useful as a therapeutic agent for such diseases. Become.
  • the dominant negative peptide of the above-mentioned transcription repressor functions as a transcription activator. Therefore, this dominant negative peptide can be used to promote transcription.
  • This dominant negative peptide also acts on the transcription of nuclear receptors and reversely promotes their transcription. Therefore, the present peptide is useful as a transcription promoting substance of a nuclear receptor.
  • the four TPRs at the N-terminal end of HDART have a higher ability to activate the transcription of retinoic acid receptors than ATRA, and therefore are used for the treatment of diseases for which ATRA is currently used (for example, for the differentiation of malignant tumors).
  • the present peptide can be applied as a therapeutic agent instead of or together with ATRA.

Abstract

　HDARTは、HDAC（ヒストン脱アセチル化酵素）に結合しリプレッサーとして機能する。また、HDARTは、核内レセプターの転写コアクチベーターとして機能するSkipと直接結合し、核内レセプターの転写を抑制する。さらに、HDARTは核内レセプターの転写コリプレッサーの１つであり、HDACと結合しHDACのヒストン脱アセチル化により強力に転写を抑制し得る。一方、HDARTのドミナントネガティブペプチドも得られ、このペプチドは完全長のHDARTたんぱく質とは逆に転写を活性化することをも確認した。特にこのペプチドによるレチノイン酸レセプターの転写活性化能はall-trans Retinoic Acid(ATRA)を上回る活性を有していた。

Description

明細書 転写調節に関与する因子 技術分野
本発明は転写調節因子等に関し、 特に、 核内ホルモンレセプ夕一に起因した転 写を調節し得る因子、 ペプチドに関する。 背景技術
ホルモンや脂溶性ビタミンなどは生物の恒常性の維持、 エネルギー代謝、 分化、 成長などに重要な役割を果たしている。 これらホルモン等のレセプ夕一は核内に 存在する転写調節因子であり、 クロマチン DNAの特定部位に結合して、 遺伝子の 転写反応を調節する。 多くの場合、 ホルモン等のリガンドがレセプ夕一に結合し ていない場合には、 転写が抑制され、 レセプターにリガンドが結合するとクロマ チン構造の変化などにより転写が活性化される。 この核内レセプターから転写装 置に至る経路にはコアクチべ一夕一やコリプレッサーと呼ばれる多くの因子が複 合体を形成して働いていることが報告されている。 リガンドが結合していないレ セプターにはヒストン脱ァセチル化酵素を含むコリプレッサー複合体が結合して 遺伝子発現を抑制し、 一方、 リガンドが結合することによりレセプターの構造が 変化すると、 コリプレッサー複合体が離れて代わりにヒストンァセチル化酵素を 含むコアクチべ一夕一複合体がリクルートされる。 このようなコアクチべ一ター の一例としては Skip (Ski相互作用タンパク質、 N- CoA62とも称されている） が あり、 いくつかの核内レセプター (例えば、 ビタミン 3レセ,プター、 レチノイン 酸レセプター、 エストロゲンレセプター、 およびダルコマルチコイドレセプ夕 一） と直接結合して、 これら核内レセプターが媒介する遺伝子発現を増強し得る (Baudino, T. A. , Kraiche ly, D. M. , Jefcoat, S. C. , Jr. , Winches ter, S. K. , Partridge, Ν. C. , and MacDonald, P. N. (1998) J Biol Chem 273 (26) , 16434-41、 MacDonald, P. N.， Baudino, T. A. , Tokumaru, H. , Dowd, D. R. , and Zhang, C. (2001) Steroids 66 (3-5) , 171-6. ) 。 発明の開示
上述したように、 核内レセプ夕一を介した転写の制御メカニズムの概要は明ら かにされつつあるが、 そのメカニズムにどのような因子が関与するかの解明は残 されている。 そこで、 本発明は、 転写調節因子、 特に核内レセプ夕一の転写調節 にも関与し得る新たな因子を提供することを目的とする。
本願発明者らは、 ショウジヨウバエの crn (crooked neck) 遺伝子のヒトホモ ログのクローニングおよびその機能解析の研究を通して、 このヒトホモログが核 内レセプターを介した転写調節に関与することを見出した。 なお、 このショウジ ョゥバエ crn遺伝子自体は、 胚形成の早期段階で最大の発現レベルになる遺伝子 であり、 この遺伝子の不活性化は、 胚形成の欠陥をひき起こし、 主に神経系の発 達に影響を及ぼすことが報告されている （Zhang, K.， Smouse, D.， and
Perrimon, N. (1991) Genes Dev 5 (6) , 1080-91) 。 crnタンパク質の 1つの独 特な特徴は、 縦列に方向付けられたテトラトリコペプチド反復 （TPR) の 1 6の コピーが存在することである。 TPRは、 さまざまなタンパク質で見出され、 進化 中に広まった同義性の 3 4アミノ酸反復モチーフである。 TPRタンパク質が関与 するプロセスとしては、 細胞サイクル制御、 転写抑制、 ストレス応答、 タンパク 質キナーゼ抑制、 およびタンパク質輸送が含まれる （Lamb, J. R. , Tugendreich, S. , and Hieter, P. (1995) Trends Biochem Sci 20 (7) , 257-9) 。
上記 crn遺伝子のヒトホモログには、 コピー数において 1 5と異なるが上記シ ョウジヨウバエ crn遺伝子と同様に多数の TPRが存在する。 本願発明者らがク口 —ニングしたヒト crn遺伝子は既に報告されている転写に関連した転写共役 DNA 修復に関与するタンパク質 （XAB2) をコードした遺伝子 (Yoshimichiら、 Jounal. Biol. Chem. 275 : 34931-34937) と一致するものであるが、 本願発明者 らは、 本遺伝子産物が転写抑制に関与することを新たに見出した。 特に、 本遺伝 子産物は、 HDAC (ヒストン脱ァセチル化酵素） に結合しリブレッサ一として機能 することから、 本明細書では 「HDART (a HDAC associated repressor TPR) 」 夕 ンパク質と称する。 また、 本願発明者らは、 HDARTが、 上述した核内レセプタ一 の転写コアクチべ一夕一として機能する Skipと直接結合し、 核内レセプターの 転写を抑制することも見出した。 さらに、 HDARTが核内レセプターの転写コリプ レッサーの 1つであり、 HDACと結合し HDACのヒストン脱ァセチル化により強力 に転写を抑制し得ることも明らかにした。 一方、 HDARTのドミナントネガティブ ペプチドも得られ、 このペプチドは全長 HDARTとは逆に転写を活性化することを も確認した。 すなわち、 本願発明は、 HDARTの新たに解明した種々の機能に基づ くものであり、 具体的には、 以下の通りである。
( 1 ) 本発明は転写抑制因子をコードした DNAであって、 （A) 配列番号 2に 記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードした DNA、 または、 （B) 配列 番号 1に記載の塩基配列からなる DNAである。
( 2 ) 本発明は転写抑制因子をコードした DNAであって、 （A) 配列番号 2に 記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入およ び/または付加されたァミノ酸配列を有するタンパク質をコードした DNA、 また は （B) 配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下 でハイブリダイズする DNAである。
( 3 ) 本発明は上記 （1 ) または （2 ) に記載の DNAによりコードされた転写 抑制因子である。
( 4 ) 本発明は核内ホルモンレセプ夕一に起因した転写を抑制し得る上記 ( 3 ) 記載の転写抑制因子である。
( 5 ) 本発明は転写を活性化し得るペプチドをコードした DNAであって、
(A) 配列番号 2における 1から 179位のアミノ酸配列からなるペプチドをコー ドした DNA、 または （B) 配列番号 1における 1から 537塩基までの塩基配列か らなる DNAである。
( 6 ) 本発明は転写を活性化し得るぺプチドをコードした DNAであって、
(A) 配列番号 2における 1から 179位のアミノ酸配列において 1若しくは複数 のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有する ペプチドをコードした MA、 または （B) 配列番号 1における 1から 537塩基 までの塩基配列からなる DNAとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする MAである。
(7) 本発明は上記 （5) または （6) 記載の DNAによりコードされた転写活 性化ペプチドである。
(8) 本発明は上記 （1) 、 （2) 、 (5) または （6) のいずれかに記載の DNAのうち、 少なくとも 1 5ヌクレオチド長を有する DNAである。
(9) 本発明は上記 （1) 、 （2) 、 (5) または （6) のいずれかに記載の DNAが挿入されたべクタ一である。
(10) 本発明は上記 （1) 、 （2) 、 (5) または （6) のいずれかに記載 の DNAまたは上記 （9) に記載のベクタ一を保持する宿主細胞である。
(1 1) 本発明は上記 （3) に記載の因子または上記 （7) に記載のペプチド に結合し得る抗体である。
(12) 本発明は上記 （1) 、 （2) 、 (5) または （6) のいずれかに記載 の DNAとハイブリダィズし、 少なくとも 10ヌクレオチド長を有する、 オリゴヌ クレオチドプローブである。
(13) 本発明は以下の （A) 〜 （D) のいずれかが固定された基板である。
(A) 上記 （12) に記載のオリゴヌクレオチドプローブ
(B) 上記 （3) または （4) に記載の転写抑制因子、 もしくは該因子の部分べ プチド
(0 上記 （7) に記載の転写活性化ペプチド、 もしくは該ペプチドの部分ぺプ チド
(D) 上記 （ 1 1 ) に記載の抗体
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。 なお、 本明細書において 予め用いる略語を説明する： HAT (ヒストンァセチルトランスフェラーゼまたは ヒストンァセチル化酵素） 、 HDAC (ヒストンデァセチラーゼまたはヒストン脱ァ セチル化酵素） 、 DAPI ( 4 ' ， 6—ジアミジノ 2—フエニルインドール） 、 RAR (レチノイン酸レセプタ一） 、 GR (ダルココルチコイドレセプ夕一） 、 DBD (DNA 結合ドメイン） 、 AD (活性ィ匕ドメイン） 、 ATRA (al l-trans Ret inoic Acid :全ト ランスレチノイン酸） 。
本発明は、 転写調節に関する因子に関する。 この転写調節因子には、 転写を抑 制する因子と、 活性化する因子が含まれる。 まず、 転写抑制因子について説明す る。 本発明の転写抑制因子を例示すれば HDARTであり、 HDARTのアミノ酸配列は、 配列番号 2からなる。 但し、 本発明の転写抑制因子は配列番号 2に記載の HDART に限定されず、 転写抑制活性を有する範囲で、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列 において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入および Zまたは付加され たアミノ酸配列を有するタンパク質、 さらには、 HDARTをコードした DNA (配列 番号 1 ) とストリンジェントな条件でハイブリダイズする DNAによりコードされ たタンパク質をも包含される。
上記 HDARTタンパク質は、 ヒト細胞の核内で発現していることから、 ヒト細胞 核より得ることができる。 この原料となるヒト細胞は、 特に限定はないが、 一例 を挙げれば HDARTを内在的に発現していることが明らかである 293細胞を用いる ことができる。
また、 アミノ酸置換等を有する HDART類似タンパク質の調製は、 例えば、 公知 の技術であるファージライブラリースクリーニング技術 (Mol ecul r Cloning 3rd Ed, Chapter 2, pp. 2. 1-2. 117) やポリメラ一ゼ連鎖反応 (PGR： Molecular Cloning 3rd Ed, Chapter 8， pp. 8. 1-8. 126) 技術を利用して実施することがで きる。 具体的には、 HDARTをコードした DNA (配列番号 1 ) またはその一部をプ ローブやプライマーとして、 配列番号 1とホモロジ一を備えた DNAを得て、 この DNAを基にタンパク質を生成することにより得ることができる。 ここで得られる タンパク質は、 通常、 HDARTとアミノ酸配列において高いホモロジ一を有する。 この高いホモロジ一は、 少なくとも 40%以上、 好ましくは 60%以上、 さらに好 ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以上、 さらに好ましくは少なくとも 97%以上 （例えば、 98から 99%) の塩基配列の一 致を意味する。
また、 上記 「ストリンジェン卜な八イブリダィゼーシヨン条件」 は、 当業者で あれば適宜選択することができる。 一例としては、 25%ホルムアミド、 より厳し い条件では 50%ホルムアミド、 4 X SS 50mM Hepes pH7. 0、 10 Xデンハルト溶 液、 20 g/ml変性サケ精子 DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、 42°Cで 一晚プレハイブリダィゼーシヨンを行った後、 標識したプローブを添加し、 42°C で一晩保温することによりハイブリダィゼーシヨンを実施することが挙げられる。 その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、 lxSS 0. 1¾ SDS、 37°C程度で、 より厳しい条件としては、 0. 5xSS 0. 1% SDS、 42°C程度で、 さらに厳しい条件 では、 0. 2xSSC、 0. 1% SDS、 65°C程度で実施することができる。 これら SSC、 SDS および温度の条件の組み合わせは例示であり、 当業者であれば、 適宜改変するこ とは可能である。
配列のホモロジ一は、 BLASTn (核酸レベル） や BLASTx (アミノ酸レベル） の プログラム（Al tschul et al. J. Mol. Biol. 215 :403-410, 1990)を利用して決定 することができる。 該プログラムは、 Karl in and Al tschulによるアルゴリズム BLAST (Proc. Nat l. Acad. Sei. USA 87 : 2264-2268, 1990、 Proc. Nat l. Acad. Sei. USA 90 : 5873-5877, 1993)に基づいている。 BLASTNによって塩基配列を解 析する場合には、 パラメ一夕一は例えば score = 100、 wordlength = 12 とする。 また、 BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、 パラメ一夕一は例え W
一 7 一 ば score = 50、 wordlength = 3とする。 また、 Gapped BLASTプログラムを用い て、 アミノ酸配列を解析する場合は、 Al tschul ¾ (Nucleic. Acids.
Res. 25 : 3389-3402, 1997) に記載されているように行うことができる。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログラムのデフォルトパラメ 一ターを用いる。 これらの解析方法の具体的な手法は公知である
(ht tp://www. ncbi. nlm. nih. gov. )。
配列番号 2に記載の配列を人為的に改変する場合には、 一般的には、 全ァミノ 酸の 10%以内であり、 好ましくは全アミノ酸の 5%以内であり、 さらに好ましく は全アミノ酸の 1%以内であると考えられるが、 転写抑制活性を維持し得る範囲 内であれば上記改変割合を超えてアミノ酸配列を置換等してもよい。 この人為的 にアミノ酸配列を改変する手法は、 例えば、 公知の手法である delet ion- mutant 作製方法、 PCR法、 s i te-directed mutagenes isなどにより実行することができ る。 なお、 ここで改変されたタンパク質が、 HDARTと同様に、 転写抑制活性を有 するか否かは、 後述する実施例に記載されているような種々のレポーター解析法 などを用いて転写抑制能を解析し決定することができる。
上記 HDARTまたはこれに類似したタンパク質は、 上述した通り転写抑制活性を 有するため、 この機能を利用して所望の転写装置に組合せて所望の遺伝子の転写 を抑制することができる。 この転写装置は、 in 転写系、 in F/'ra転写系の いずれでもよい。 また、 HDARTの転写抑制能は自律的であることから、 本発明の 転写抑制因子は単独で用いて転写を抑制させ得る。 但し、 この場合、 HDARTは DNA結合能を有しないため、 好ましくは、 DNA結合領域を融合させた融合タンパ ク質として用いることがよい。 また、 HDARTは HDACと結合能を有し、 HDARTは HDACをリクルートしてヒストン脱ァセチル化活性により強力に転写を抑制し得 る。 そのため、 本発明の転写抑制因子は、 HDACと共に用いて、 あるいは HDACを 誘導することにより転写を抑制することもできる。 なお、 HDACにはタイプ
I (HDAC1, HDAC2, HDAC3)とタイプ I I (HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC 8)が存 在することが知られている。 本発明の HDARTは HDAC2、 HDAC5, 薩7、 HDAC8等 と結合するものと考えられることから、 本発明においては、 HDAC2、 HDAC5, HDAC7、 HDAC8を好適に使用することができるが、 これらの HDACに特に限定され るものではなく、 タイプ Iまたは IIに属するいずれの HDACを用いることが可能 である。
また、 HDARTは核内レセプ夕一の転写を抑制し得ることから、 本発明の転写抑 制因子により抑制し得る転写装置としては、 好適には核内レセプ夕一を介した転 写装置を挙げることができる。 この核内レセプ夕一としては、 レチノイン酸レセ プ夕一、 ダルココルチコイドレセプターを好適に挙げることができ、 また、 本発 明の因子が転写抑制し得る範囲でレチノイン Xレセプ夕一、 ビタミン Dレセプ夕 一、 アンドロゲンレセプ夕一、 エストロゲンレセプ夕一、 チロイドホルモンレセ プターなどのホルモンゃ脂溶性ビ夕ミンなどに対する核内レセプターなどを含め ることができる。 そのため、 本発明の転写抑制因子は、 このような核内レセプ夕 一からの転写の不調節、 特に過剰に転写が促進されることが起因した疾患の治療 に役立ち得る。 特に、 後述する実施例で示すように、 HDARTはレチノイン酸レセ プ夕一の転写を抑制し、 さらには、 このレチノン酸レセプターの転写により誘導 する分化をも抑制することが明らかになつているため、 レチノン酸レセプターの 転写による分化亢進が起因した疾患の治療薬として本転写抑制因子を応用しても よい。
本発明は上記転写抑制因子をコードした DNAに関する。 この DNAとしては、 例 えば配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAを挙げることができるが、 これに 限定されるものではなく、 上述した配列番号 2に記載のァミノ酸配列をコードし た DNA、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を コードした DNA、 および配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジ ェントな条件下でハイプリダイズする DNAなどが包含される。 上記 DNAは、 配列番号 1に記載の DNAまたはその一部をプローブまたはプライ マーとして用い、 例えば、 ヒト細胞 （一例を挙げれば、 後述する実施例 1に示し たように、 ヒト塍臓の小島細胞） の cDNAライブラリーなどからハイブリダィゼ —シヨンまたはポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) により得ることができる。 他の方 法としては、 ヒト細胞の mRNAを铸型に用い、 配列番号 1に記載の DNAの一部を プライマーとして RT- PCR (Molecular Cloning 3rd Ed, Chapter 8, Protocol 8， pp. 8. 46-8. 53) により得ることもできる。 なお、 ここでは、 ヒト細胞を例に挙 げたが、 それ以外の哺乳動物細胞、 真核細胞などを用いて調製してもよい。 また、 DNAを単離するためのハイブリダィゼーション条件は、 上述した通りである。 上記 DNAをクローニングする方法以外にも、 DNA合成機により配列番号 1に記 載の DNAとその相補鎖とをそれぞれ合成し、 アニーリングさせて生成してもよい。 上記 DNAは転写抑制因子をコードしていることから、 この転写抑制因子を生産 するツールとして、 または細胞や個体内に導入して転写抑制因子を発現させるッ —ルとして用いることができる。 このような目的で用いる場合には、 上記 DNAを 発現ベクターなどに組み込むことが好ましい。 発現ベクターは、 タンパク質生産 に用いる翻訳系により、 あるいは導入する細胞により適宜選択することができる。 上記腿 Aが組込まれたベクタ一を用いて転写抑制因子を生産するためには、 先 ず、 上記べクタ一を宿主細胞に導入し、 この宿主細胞を培養する。 これにより、 宿主細胞内では上記転写抑制因子が生産される。 ここでベクターを細胞に導入す る手法は、 用いる細胞に応じて適宜選択することができる。 例えば、 ウィルスべ クタ一やファージを介した生物学的な手法、 リン酸カルシウム法、 リポフエクシ
3ン法などの化学的な手法、 ジーンガン、 エレクト口ポーレシヨン法などの物理 的な手法などを用いることができる。 宿主細胞において生産されたタンパク質は、 必要に応じて、 精製 （例えば、 ァフィ二ティ一精製など） を行った上で使用する ことができる。
上記 DNAが組み込まれた発現ベクターはまた、 細胞内あるいは個体内の所望の 転写を抑制する目的で用いることができる。 すなわち、 この発現ベクターを細胞 または個体内に導入し上記転写抑制因子を発現させることにより、 所望の転写系 を抑制することができる。 特に、 HDARTは自律的な転写抑制能を有するため、 本 発明の転写抑制因子は単独でも転写抑制活性を発揮し得る。 但し、 HDART自身は DNA結合能を有しないため、 好ましくは、 本転写抑制因子は、 所望の遺伝子の制 御領域の DNAに結合し得る DNA結合領域との融合タンパク質として発現させるこ とがよい。 これに、 標的となる遺伝子の転写を抑制することが可能となる。 また、 本転写抑制因子は HDACと結合能を有することから、 本転写抑制因子を発現させ ることにより、 HDACをリクルートさせて転写をさらに強く抑制し得る。
また、 本発明の DNAにコードされた転写抑制因子は核内レセプターの転写を効 果的に抑制し得ることから、 これら核内レセプターの転写亢進に起因した疾患の 治療用組成物として、 本 DNAが組み込まれたベクタ一を応用してもよい。 こうし た治療目的のベクタ一としては、 例えば、 レトロウイルスベクタ一、 アデノウィ ルスベクター、 アデノ関連ウィルスベクター、 ワクシニアウィルスベクター、 レ ンチウィルスベクター、 ヘルぺスウィルスベクタ一、 アルファウィルスベクター、 EBウィルスベクター、 パピ口一マウィルスベクタ一、 フォーミーウィルスべク 夕一などのウィルスベクターなどが挙げられる。
本発明は転写調節因子のうち、 上記とは反対に転写を活性化し得るペプチドに も関する。 HDARTは全長であれば、 転写抑制因子として機能するが、 HDARTのド ミナントネガティブペプチドは、 逆に転写活性化因子として機能する。 このドミ ナントネガティブペプチドを例示すると、 N末端の 4つの TPR (以下、 「N4TPR」 と省略する） をコードしているペプチド、 すなわち、 配列番号 2における 1から 179位のアミノ酸配列からぺプチドを挙げることができるが、 これに限定されず 転写活性化能を有する範囲で、 配列番号 2における 1から 179位のアミノ酸配列 において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入および Zまたは付加され たアミノ酸配列を有するペプチドを含めることができる。 上記ドミナントネガティブペプチドの調製は、 配列番号 1のうち 1から 537ま での塩基配列からなる DNAを基にぺプチドを合成することにより調整することが できる。 また、 このペプチドとアミノ酸配列において置換等を有するペプチドの 合成は、 上記配列番号 1のうち 1から 537までの塩基配列に変異 （置換、 欠失、 挿入および/または付加） を加えコドンを変えた DNAを基にペプチド合成するこ とにより調製することができる。
上記ペプチドは、 転写活性化能を有するため、 所望の転写系の転写を促進させ るために用いることができる。 特に、 実施例に示した通り、 HDARTの N4TPRは核 内レセプ夕一の転写を活性化することから、 これら核内レセプターの転写を促進 させるために用いることができる。 この核内レセプ夕一として、 好適には、 Skip が作用する核内レセプター、 例えば、 レチノイン酸レセプ夕一、 ダルココルチコ イドレセプター、 ビタミン！）レセプ夕一、 エストロゲンレセプターを挙げること ができる。 また、 本発明のペプチドが転写活性化し得る範囲でレチノイン Xレセ プター、 アンドロゲンレセプ夕一、 チロイドホルモンレセプ夕一などのホルモン や脂溶性ピタミンなどに対する核内レセプ夕一などを含めてもよい。
上記 N4TPRによるレチノイン酸レセプターの転写活性化能は、 ATRAによる転 写活性化能よりも高いことが後述する実施例で示されている。 そのため、 現在、 ATRAによるレチノイン酸レセプ夕一の転写活性化による白血病などの悪性腫瘍 の分化誘導療法が行われている。 さらに、 ビタミン Aや ATRAを含むその誘導体 は、 白血病以外にも肝細胞癌 (Okuno, M. et al. , (2002) Front Biosci 7, 204- 18)、 卵巣癌（Zhang D. et a (2000) J Cel l Phys iol 185 (1) , 1-20) , 甲状腺 癌（Schmutzler C. and Kohrle J. (2000) Thyroid 10 (5) , 393-406) , 皮膚癌 (Ni les R. M. (2000) Nutri t ion 16 (11-12) , 1084-9)、 膝癌 (Riecken E. 0. and Rosewicz S. (1999) 10 Suppl 4, 197- 200)等で治療に使用され始めており、 こ の ATRAに代えて又は ATRAと組合せて、 本ペプチドを用いることができる。
本発明は、 上記転写活性化能を有するペプチドをコードした DNAに関する。 こ の DNAとしては、 具体的には、 配列番号 2における 1から 179位のアミノ酸配列 からなるペプチドをコードした DNA、 一例としては、 配列番号 1から 537塩基ま での塩基配列からの DNAを挙げることができるが、 これに限定されるものではな く、 転写活性化能を有する範囲で、 配列番号 2における 1から 179位のアミノ酸 配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入および/または付加 されたアミノ酸配列を有するぺプチドをコ一ドした DNA、 または配列番号 1にお ける 1から 537塩基までの塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下で ハイプリダイズする DNAを含めることができる。
上記転写活性化べプチドをコ一ドした DNAは、 上述した転写抑制因子をコード した DNAを得た後、 例えば、 C末端側を欠失させることに調製することができる。 または、 DNA合成機により合成し調製してもよい。
上記 DNAは、 上記転写活性化ペプチドを生産するため、 または、 細胞または個 体内に導入して上記転写活性化ペプチドを発現させる目的で用いることができる。 ぺプチドを生産する目的で上記 DNAを用いる場合には、 発現ベクターに組み込む ことが望ましい。 この場合の発現べクタ一は、 ペプチドを生産するための転写- 翻訳系によって適宜選択することができる。 この転写，翻訳系は、 in vitro、 in r/raのいずれでもよい。 In /ra系の場合には、 上記 DNAが組み込まれた発現べ クタ一を細胞に導入し、 細胞を培養することにより、 細胞内で上記転写活性化べ プチドが生産される。 細胞への導入方法などについては上述と同様である。
上記 DNAを細胞または個体内に導入して上記転写活性化べプチドを発現させる 目的で用いる場合には、 上記 DNAを直接、 細胞内等に導入し一時的に発現または 染色体に挿入させて安定的に発現させてもよく、 また、 発現ベクターに組み込ん で細胞等に導入してもよい。
上述した通り、 転写活性化ペプチドは、 ATRAのように悪性腫瘍の分化誘導療 法に応用し得るため、 転写活性化ペプチドを直接用いる代わりに、 本 DNAを患者 に注入等し上記転写活性化ペプチドを発現させて、 上記治療方法に利用してもよ レ^ このような目的で使用するためには、 上記 DNAを所望の組織または細胞に該 DNAを運搬するためのベクターに組み込み使用することが好ましい。 こうした治 療目的のベクターとしては、 上述したレトロウイルスベクター等のウィルスべク 夕一を用いることができる。
以上の通り、 本発明の転写抑制因子をコードした DNAは、 N末端側をコードし た DNAに短くすることにより上記転写活性化べプチドをコードした DNAに改変し 得る。 これ以外にも、 上記転写抑制因子をコードした DNAまたは転写活性化ぺプ チドをコードした DNAはさらに短い一部フラグメントとしても、 ハイプリダイゼ ーシヨン用プローブ、 PCRプライマーまたはリポザィム誘導体として利用するこ とができる。 これら目的で上記 DNAの一部を用いる場合には、 プローブ等として の特異性を保持できる長さ、 例えば、 15ヌクレオチド長を有していることが好 ましい。 本発明は、 本発明の DNA (例えば、 配列番号 1に記載の DNA等） とハイ ブリダィズし、 少なくとも 10ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプロ ーブを提供する。 例えば、 こうしたポリヌクレオチドとしては、 配列番号 1に記 載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖と特異的にハイブリダィズするもの が挙げられる。 ここで、 「特異的にハイブリダィズする」 とは、 ハイブリダィゼ —シヨンにおいて、 他のタンパク質をコードする DNAとクロスハイブリダィゼー シヨンが有意に生じないことを意味する。 上記プローブ、 プライマーは、 転写抑 制因子等をコードした DNAのクローニング等に利用することができる。
本発明はまた、 上記転写抑制因子または転写活性化べプチドに結合し得る抗体 に関する。 本発明の抗体は、 上記転写抑制因子または転写活性化ペプチドと特異 的に結合し得るものであれは、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体のいず れでもよい。 ポリクローナル抗体は、 本発明のタンパク質またはその部分べプチ ドを必要に応じてフロイントアジュバント等と混合し、 周知の方法によりゥサギ、 ャギ、 モルモットなどの非ヒト動物を免疫し、 抗体価が上昇したことを確認した 上で免疫動物の末梢血から血清を回収することにより調製することができる。 一 方、 モノクローナル抗体はまた、 上記転写抑制因子もしくは転写活性化ペプチド またはその部分ペプチドを用い、 周知の方法によりマウスなどの動物を免疫し、 抗体価が上昇した免疫動物の脾臓またはリンパ節を採取し、 これら組織中の抗体 産生細胞とミエローマ細胞とを融合させハイプリドーマを調製する。 ハイプリド 一マから産生される抗体を培養上清から回収することにより得ることができる。 これら抗体は、 上記転写抑制因子または転写活性化べプチドをァフィニティ一 精製する際等に利用することができる他、 種々の細胞内における転写抑制因子の 発現量を免疫学的に解析するなどの目的で、 または転写抑制因子を阻害する目的 で利用してもよい。
また本発明は、 本発明の上記オリゴヌクレオチドが固定された基板を提供する。 該基板をバイオチップとすることにより、 例えば、 被検生物 （細胞） における本 発明の DNAの発現状態を解析することが可能である。
好ましい態様においては、 まず、 被検生物 （細胞） から本発明の DNA (例えば、 配列番号 1に記載の DNA、 またはその部分 DNA領域） を増幅する。 次いで、 該 DNAとハイブリダィズするヌクレオチドプローブが固定された基板を用意する。 次いで、 該 DNAと該基板を接触させる。 さらに、 基板に固定されたヌクレオチド プローブにハイプリダイズした DNAを検出することにより、 本発明の DNAの発現 状態を解析することができる。
このような方法としては、 DNAアレイ法が例示できる。 被検生物 （細胞） から の DNA試料の調製は、 当業者に周知の方法で行うことができる。 該 DNA試料の調 製の好ましい態様においては、 細胞から抽出した染色体 DNAを基に調製すること ができる。 染色体 DNAから本方法の DNA試料を調製するには、 例えば本発明の DNAにハイブリダイズするプライマ一を用いて、 染色体 DNAを铸型とした PCR等 によって本発明の DNAを調製することも可能である。 調製した DNA試料には、 必 要に応じて、 当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。 本発明において 「基板」 とは、 ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材 料を意味し、 通常、 チップとも呼ばれる。 本発明においてヌクレオチドには、 ォ リゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。 本発明の基板は、 ヌクレ ォチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、 一般に DNAァレイ技術 で使用される基板を好適に用いることができる。
一般に DNAアレイは、 高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで 構成されている。 通常これらの DNAは非透過性 (non- porous)の基板の表層にプ リントされる。 基板の表層は、 一般的にはガラスであるが、 透過性 (porous)の膜、 例えば二トロセルロースメンブレムを使用することができる。
本発明において、 ヌクレオチドの固定 （アレイ） 方法として、 Af fymetrix社 開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。 オリゴヌクレ ォチドのアレイにおいて、 オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（in s i tu)で 合成される。 例えば、 photol i thographicの技術 (Af fymetr ix社) 、 および化学 物質を固定させるためのインクジエツト（Roset ta Inpharmat ics社）技術等によ るオリゴヌクレオチドのィンサイチュ合成法が既に知られており、 いずれの技術 も本発明の基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、 本発明の DNAを検出することができ るものであれば、 特に制限されない。 即ち該プローブは、 例えば、 配列番号 1に 記載の DNAと特異的にハイブリダィズするようなプローブである。 特異的なハイ ブリダィズが可能であれば、 ヌクレオチドプローブは、 本発明の DNAに対し、 完 全に相補的である必要はない。
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、 オリゴヌク レオチドを固定する場合は、 通常 10〜100ベースであり、 好ましくは 10〜50ベ —スであり、 さらに好ましくは 15〜25ベースである。
本発明においては、 次いで、 DNA試料と該基板を接触させる。 本工程により、 上記ヌクレオチドプローブに対し、 DNA試料をハイブリダィズさせる。 ハイプリ ダイゼ一ションの反応液および反応条件は、 基板に固定するヌクレオチドプロ一 ブの長さ等の諸要因により変動しうるが、 一般的に当業者に周知の方法により行 うことができる。
本発明においては、 次いで、 該 DNA試料と基板に固定されたヌクレオチドプロ ーブとのハイブリダィズの有無または強度を検出する。 この検出は、 例えば、 蛍 光シグナルをスキャナ一等によって読み取ることによって行うことができる。 尚、 DNAアレイにおいては、 一般的にスライドガラスに固定した DNAをプロ一ブとい 一方溶液中のラベルした DNAをターゲットという。 従って、 基板に固定され た上記ヌクレオチドを、 本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。 本 方法においては、 必要に応じて、 検出したハイブリダィズの強度を対照と比較す る。 上記方法としては、 例えば、 DNAアレイ法 （SNP遺伝子変異の戦略、 松原謙 一 ·榊佳之、 中山書店、 l28-135 Nature Genet ics (1999) 22 : 164-167) 等が挙 げられ、 当業者においては、 公知の文献等を参照して、 適宜、 実施することがで ぎる。
また本発明は、 本発明のタンパク質もしくは該タンパク質の部分断片が固定さ れた基板を提供する。 該基板をバイオチップとすることにより、 例えば、 本発明 のタンパク質と結合する分子の探索、 または HDAC阻害化合物のスクリーニング 等を行うことが可能である。
一般的に、 タンパク質を基板へ固定させたものを、 プロテインチップと呼ぶ。 その原理は DNAチップと同様、 スライドガラスや膜の上にタンパク質を高密度に 固定し、 それらと相互作用する蛋白質や核酸などを検出する。
本発明の HDART夕ンパク質は、 種々の HDAC夕ンパク質と結合することから、 HDAC阻害化合物のスクリーニングに応用することができる。 より具体的には、 本発明の HDART夕ンパク質を固相表面に固定することにより、 一つの面に種々の HDACを結合させることができる。 この固相表面に種々の化合物を結合させ、 HDAC活性を計測することにより、 HDAC阻害化合物をスクリ ングすることが できる。 上記スクリ一二ングによって取得される HDAC阻害化合物の例としては、 癌の 分化誘導療法で薬剤として用いられるトリコスタチン Aを示すことができる。 また、 本発明の抗体が固定された基板をバイオチップとすることも可能である。 高純度で分離精製された抗体をチップ表面に固定化することにより高密度化が可 能である。
本発明の好ましい態様においては、 基板上にサンプルをスポットした後、 スポ ット表面に対して親和性を示さない夕ンパク質やその他の夾雑物を洗浄すること により、 溶出させることができる。 その後の検出の工程は、 当業者においては、 基板の種類等を考慮し、 適宜、 公知の方法で、 上記親和性の有無 （強弱） を検出 することができる。 一例を示せば、 洗浄後の上記基板へ、 エネルギー吸収分子 (EAM)を添加し、 乾燥後、 質量分析計 (T0F- MS)装置にかけることにより、 スポッ ト表面に結合していたタンパク質の分子量スベクトルを測定することができる。 また、 任意の DNA、 もしくはペプチドの基板への固定は、 当業者においては、 公知の方法によつて適宜実施することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 HDARTは TPR (Je tra tr ico pept ide repeat) タンパク質であり、 そ の構成および類縁の遺伝子との関係を示す。 HDART—次構造の概略的構成を示し、 TPR、 酸性領域、 Skip相互作用領域および CRN相同性領域を示している。
図 2は、 ヒト HMRTとヒト CRNとの間の CRN相同性領域の比較を示す図である。 図 3は、 HDARTZCRNタンパク質間の系統樹を示す図である。 この系統樹は、 GENETYX- MACプログラムを用いて構築した （ソフトウェア開発） 。
図 4は、 外来または内在 HDARTと外来 S kipと相互作用を免疫沈降解析により 同定した結果を示す写真である。
(A) 外来 HDARTと外来 Skipとの相互作用を解析した結果を示す。 レーン 1は GFP— HDARTのみ、 レーン 4は Flag—Skipのみ、 またはレーン 2 , 3はその両方 を 293細胞内で発現させた。 レーン 5は、 何もベクターを導入していないコント ロールの細胞である。 また、 レーン 1、 2、 4および 5は、 抗ー Fl ag抗体によ り、 レーン 3は対照マウス IgGにより免疫沈降させたサンプルである。 上部 2つ のパネルは、 発現された各タンパク質の発現を示し、 下部 2つのパネルは免疫沈 降物を示している。 なお、 それぞれ上段は抗 GFP抗体、 下段は抗 Fl ag抗体で免 疫ブロットした結果を示す。
( B ) 内在 HDARTと外来 Skipとの相互作用を解析した結果を示す。 内在に HDARTを保持する 293細胞に Fl ag—Skip (レーン 1 ) または Fl ag—ルシフェラ —ゼ （レーン 2 ) を導入後、 細胞抽出液を抗 Fl ag抗体で免疫沈降させた。 何も ベクターを導入していないコントロール実験も並行させた （レーン 3 ) 。 細胞内 での HDARTタンパク質の発現状況 （上部パネル） 、 免疫沈降した Fl ag (中央パ ネル） 、 または HDART (下部パネル） をパネル左 「WB」 として示す抗体を用いた 免疫プロッティングにより同定した。
図 5は、 Skip、 HDART両タンパク質上の相互作用領域の同定結果を示す。
(A) Skip上の HDART結合領域部位のマッピング。 プラス （+) は、 酵母ツー ハイプリッドシステムにおける /3—ガラクトシダ一ゼ活性に基づき、 相互作用 が検出されたことを示す。 プラスの数は、 その相互作用の相対的強度を表わす。 NHR結合：核ホルモン受容体結合ドメイン、 TA； トランス活性化ドメイン。
(B ) HDART上の Skip結合領域のマッピング。 記号は上述と同様である。
図 6は、 核内ホルモン (レチノイン酸またはダルココルチコィド) による転写 活性化を HDARTが抑制することを示すグラフである。
(A) HDARTによるレチノイン酸で活性化された転写の濃度依存的抑圧結果を示 す。 リガンドの不在下で空ベクター （l . O ^ g) を導入した際の CAT活性を基準 として、 補正された CAT活性を表わした。 3回の反復実験平均および、 エラ一バ 一は S. D.を示す。
( B ) HDARTによるダルココルチコィド活性化を受けた転写の濃度依存的に抑圧 結果を示す。
図 7は、 HDARTの細胞内局在を示す写真である。
(A) 内因性 HDARTタンパク質の局在化。 左側パネルは抗 HDART抗体 （上段） ま たは免疫前血清 （下段） を用いた免疫蛍光染色結果を、 右側パネルは左側パネル と対応した視野における DAPI染色結果を示す。
( B ) 生存細胞中の HDARTの局在化。 He la細胞に GFP— HDART発現ベクター （左 上） または GFP発現ベクター （左下） を導入後の GFPによる蛍光発光を観察した 結果、 および Hoeches t 3 3 3 4 2染料を用い核を視覚化した結果 （右上） を示 す。
図 8は、 HDARTの自律的なプロモータ抑制活性を示す。
(A) GaMリポーター （ルシフェラーゼ） プラスミドを保持する NIH3T3細胞に 異なる量の Gal4 DBD- HDART発現プラスミド （0、 0 . 1、 0 . 3、 0 . 5 g) を 導入した際のプロモータ抑制活性を検討した結果を示す。 空べクタ一のみ導入し た際のルシフェラ一ゼ活性を基準 （100%) として、 補正済みルシフェラーゼ値 を表した。 3回の反復実験結果の平均で示し、 エラ一バーは S. D.を示す。
( B ) U-20S細胞を用いた結果を示す。
図 9は、 HDARTと HDACとの直接的な相互作用を示す写真である。
(A) HDARTと HDACとの相互作用。 293細胞に GFP-HDART発現ベクターと Fl ag - HDACs 発現ベクター （ （レーン 1 ； HDAC 1、 レーン 3 ； HDAC 3、 レーン 4 ； HDAC4、 レーン 5 ； HDAC 6) とをコトランスフエクシヨンした後、 抗 FLAG抗体で免疫沈降 および表示された抗体 （抗 Flag抗体または抗 GFP抗体） により免疫プロッティ ングを行った結果を示す （それぞれ中央パネル、 下部パネル） 。 なお、 レーン 2 は GFP— HDARTのみが導入されたサンプルである。 また、 上部パネルは免疫沈降 前のサンプルを用いて GFP- HDARTタンパク質の発現を確認した結果を示す。
( B ) HDARTと HDAC3との直接的相互作用を示す結果である。
図 1 0は、 HDARTの抑制は 1種の HDAC阻害物質 （トリコス夕チン A、 酪酸ナト リウム） によりそれぞれ HDARTの抑制が阻害されたことを示す （C、 D) 。
図 1 1は、 HDARTの N末端における 4つの TPR (N4TPR) のドミナントネガティ プ効果を示す図および写真である。
(A) N4TPRによる内因性 HDARTと Skipと相互作用の阻害。 Fl ag— Skipと GFP (レーン 1 ) または GFP- N4TPR (レーン 2 ) とがトランスフエクシヨンされた 293細胞の細胞抽出液を抗 Fl ag抗体で免疫沈降させ、 この沈降産物を SDS— PAGE で分離した結果を示す。 下方の 3つのパネルは、 それぞれ免疫沈降された Skip
(上段） 、 内因性 HDART (中央） および N4TPR (下段） を示す。 免疫沈降前の HDARTタンパク質の発現は最上の一つのパネルに示されている。
( B ) レチノイン酸レセプターに起因した転写を N4TPRによって活性化すること を示すグラフである。
(0 ダルココルチコィドに起因した転写を N4TPRによって活性化することを示 すグラフである。
図 1 2は、 匪- 1-19-P細胞内でのレチノイン酸による分化誘発を HDARTが阻害 することを示す図および写真である。 HDART発現べクタ一または空ベクターを導 入した醒-卜 19-P細胞を ATRA (2 xM) 存在下、 非存在下での分化誘発を解析し た。 形質移入された細胞を同定するため、 上記ベクターとともに GFPベクタ一を コトランスフエクシヨンした。 GFPによる緑色螢光発光を標準的顕微鏡写真によ り撮影した写真 （A、 B、 C、 D) 、 および位相差顕微鏡下で撮影した写真 （E、 F ) を示す。
(A) ATRA (一） かつ空ベクター導入サンプル、 （B ) ATRA (I) かつ空べクタ —導入サンプル、 （c) ATRA (一） かつ HDART発現ベクター、 （D) ATRA ( + ) かつ HDART発現べクタ一、 （E ) ( C ) と同一視野の位相差写真、 （F ) (D) と同一視野の位相差写真。 パネル Fにおいて、 黒色矢印ヘッドは未分化 GFP陽性 細胞を表わし、 白色矢印ヘッドは分化された細胞を表わす。 （G) グラフは、 GFP陽性細胞中形態学的に分化した細胞の百万率を示す。 4つの独立した実験か らの結果は、 平均および S. D. (エラ一バー） として提示されている （Mockおよ び ATRA ( + ) での HDARTの間で Pく 1 %， スチューデントの tテスト） 。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について、 実施例を用いて詳細に説明するが、 本発明はこの実施 例に限定されるものではない。
[実施例 1 ] ヒト HDARTのクローニング
BLASTデ一夕ベースを用いてショウジヨウバエ cm遺伝子のヒトホモログを検 索したところ、 膝臓の小島 mRNA由来ヒト EST (expressed sequence tag)クロ一 ン #52930が上記 crn遺伝子と高い相同性を有することが示された。 このクロ一 ン W52930の完全な配列を定法に従い決定した。 また更に 5' -RACE法 (5' -rapid ampl if icat ion of cDNA ends strategy) により、 本遺伝子は、 その cDNAの完全 長が 2660塩基からなり、 一つの長い読み枠を備えていることを同定した。 なお、 ここで同定したタンパク質は、 後述するように HDAC (ヒストン脱ァセチル化酵 素） に結合しリブレッサ一として機能することから、 「HDART (a HDAC
associated repressor JPR) 」 タンパク質と称する。 HDARTは 855アミノ酸をコ —ドした高度に保存された TPRタンパク質である （図 1 ) 。 DNA配列から推定さ れる HDART夕ンパク質は、 ヒト CRN夕ンパク質と明らかに類似していることが示 されている。 特に、 HDARTタンパク質の 2 6 2残基から 7 7 9残基の領域は、 HDARTとヒト CRNタンパク質とで高度に保存されている （図 1、 2 ) 。 数種の種 族間でのこのタンパク質の遺伝解析ではこれらは遺伝子ファミリ一を形成してい ることを示した （図 3 ) 。
[実施例 2 ] HDARTと転写コアクチベータ一 Skipとの直接的な相互作用
HDART上に存在するいくつかの TPR領域に着目し、 これら TPRを介して HDART と相互作用し得るタンパク質が存在するかを解析することとした。 この HDARTと結合するタンパク質の単離のために、 酵母ツーハイプリットシス テムを用いた。 具体的には、 酵母 MATCHMAKERツーハイブリッド解析キット
(Clontech) を用いて実施した。 pAS- 1ベクター (Clontech) 内で Gal4 DNA結 合ドメインと読み枠を合わせるように HDARTの 0RF全長を挿入した。 この bait plasmidは、 HeLa cDNAライブラリ一 （Clontech) がサブクローニングされた PACT2 prey plasmidと共に、 サッカロマイセルセルピジエ Saccharoniyces cerevisiae) Y190に形質転換した。 両プラスミドが導入されたクローンのスク リーニングは、 キットに添付されたプロトコルに従って実施した。 このようにし て、 約 1X107をクローンした結果、 数個のクローンを単離した。 これらクロ一 ンを解析した結果、 一つは Skipと一致していた。
哺乳動物細胞内での HDARTと Skipとの相互作用を免疫沈降解析により確認し た。 この確認のために、 先ず、 Flag- Skip融合タンパク質を発現する Flag- Skip 発現べクタ一および GFP- HDART融合夕ンパク質を発現する GFP-HDART発現べクタ 一と （図 4A) を HEK293細胞に Eifecteneキット （QIAGEN) を用いてトランスフ ェクシヨンした。 なお、 対照実験として、 Flag-Skip発現ベクターのみ、 GFP- HDART発現べクタ一のみを同細胞に、 同条件でトランスフエクシヨンを行った。
トランスフエクシヨンの 24時間後、 氷上で 30分間、 10 lのプロテア一 ゼ阻害物質カクテル （Sigma #p 8340) 100 1を含有する NonidetP— 40 緩衝液 （5 OmM トリス HC1 (pH7. 6) 、 1 5 OmM NaCK 5mM EDTA、 0. 5 % Nonidet P- 40、 1 mM PMSF) 中で細胞溶解することによって、 細胞抽出物 (lmg) を調製した。 この抽出物をタンパク質 A/Gセファロースビーズ 40 l とともに 30分間 4°Cでインキュベートすることによって、 予備的に清澄化した。 次に、 清澄した上清抽出物を 1時間抗 Flag抗体または陰性対照のマウス IgG抗 体 (2 a g) と共にインキュベートし、 その後、 40 lのタンパク質 A/Gセフ ァロースピーズを用いて 30分間沈降させた。 免疫沈降物を 4回 Nonidet P-40 緩衝液で洗浄した。 結合したタンパク質を SDS口一ディングバッファ中で A/ G セファロースビーズから溶出させ、 溶出液を SDS—PAGEで展開した。 展開後、 メ ンブレンに転写し、 メンブレンを定法に従い免疫プロットを実施した。 この免疫 プロット用の抗体としては、 抗 FLAG抗体 M 2 (S igma) および抗 GFPモノクロ一 ナル抗体クローン 1 E 4 (MBL) を用いた。
上記免疫沈降解析の結果を図 4 Aに示す。 図において上部 2つのパネルは、 各 タンパク質の発現結果を示し、 下部 2つのパネルは免疫沈降物を示している。 図 4 Aに示されている通り、 上記両複合タンパク質が発現している場合のみ、 抗 Fl ag抗体により GFP-HDARTタンパク質が Fl ag-Skip融合タンパク質と共に免疫 沈降した （レーン 2 ) 。 FLAG-Skipが発現していない条件では、 抗 FLAG抗体に より GFP- HDARTの沈殿はみられず （レーン 1 ) 、 また、 陰性対照の抗体を用いた 場合も同様に沈殿は観察されなかった （レーン 3 ) 。 この結果は、 HDARTと Skip とが in /raにおいて特異的に相互作用することを示唆している。
さらに、 内在 HDARTと外来から導入した Skipとの相互作用を解析した。 293 細胞 （HDARTが高発現している細胞） に Flag— Skip発現べクタ一、 または Flag ールシフェラーゼ発現べクタ一をトランスフエクションし、 上述と同様の方法で トランスフエクシヨンから 2 4時間後に細胞抽出液を調整した。 この細胞抽出液 を抗 Fl ag抗体とインキュベートし免疫沈降を行った。 免疫複合体または免疫沈 降前の細胞抽出液を SDS-PAGEで展開し、 メンブレンに転写した。 この同一のメ ンブレンを抗 HDART抗体または抗 Flag抗体とを用いて免疫プロッティングを実 施した。 その結果を図 4 Bに示す。 なお、 図 4 Bにおいて、 上部パネルは細胞抽 出液を抗 HDART抗体で免疫プロットした結果を、 中央パネルは抗 Flag抗体を用 いて免疫沈降後に抗 Fl ag抗体で免疫プロットした結果を、 下部パネルは抗 Fl ag 抗体を用いて免疫沈降後に抗 HDART抗体で免疫プロットした結果を示す。
図 4 Bに示されているように、 Fl ag-Skipが発現している条件においてのみ、 抗 Fl ag抗体で HDARTが共沈殿し （図 4 B、 レーン 1 ) 、 Fl ag-Lucタンパク質が 発現している条件 (レーン 2 ) および何もトランスフエクションされていない親 の 293クローンでは （レーン 3 ) 、 HDARTの共沈殿は見られなかった。
[実施例 3 ] HDARTと Skipとの結合領域
HDARTとの相互作用に関与する Skip上の領域をマツビングするために、 Skip (N-末端領域 （コドン 1-220) 、 核内ホルモン結合領域 （NHR bindng、 コドン 221-388) 、 トランスアクティベーション領域 （TA、 コドン 438- 536) ) 上の 様々な領域を欠失させた欠失変異シリーズを作成し、 上記実施例 2に記載した Gal4 DBD- HDARTを用いた酵母ッ一ハイプリッド解析により HDARTと変異 Skip との相互作用を解析した。 解析結果を図 5Aに示す。 図 5 Aの右に示された 「 +」 記号は β—ガラクトシダーゼ活性のフィルターリフト解析により相互作 用が検出されたことを示し、 「+」 数はその相互作用の相対的強度を示す。
「一」 記号は相互作用が検出されなかつたことを示す。
図 5 Αに示すように、 二つの異なる領域が HDARTとの相互作用に関与すること を発見した。 これら領域は、 一つが 97- 119残基内であり、 もう一つは 220-437 残基内であった。 Skipのトランスアクティベーション領域は HDARTとの結合活 性には、 ほとんど関与しないことが示された。 同様のアプローチを HDART上での Skipとの相互作用に関与する領域を解析するために実施した。 すなわち、 Gal4 DBD-HDARTのさまざまな欠失突然変異体を作製し、 これを Gal4AD— Skipと作用 させた際のガラクトシダーゼ活性を解析した。 この解析結果を図 5 Bに示す。 4 つの TPRを含む N末端領域 (1-179残基） は Skipとの相互作用に必要十分であ ることが示された （図 5 B) 。 したがって、 HDARTは N末端の 4つの TPR領域を 介して Skipと直接相互作用する。
[実施例 4] HDARTによる核内レセプターに起因した遺伝子の転写抑制
上記実施例において HDARTが Skipと相互作用し得ることが示されたことから、 次に、 核内レセプ夕一に起因した転写経路に対する HDARTの機能的な役割を解析 W
- 25 - した。 先ず、 レチノィン酸レセプ夕一による転写制御に対する HDARTの作用を解 祈した。 この目的のため、 CAT解析をレチノイドレスポンスエレメント
(ret inoid response e l ement) の下流にチミジンキ^ "一ゼ最小プロモータ (pTREpal-tata) と CAT遺伝子を組み込んだ RAR (ret ino id ac id receptor) レ ポー夕一プラスミドを用いて、 CAT解析を行った。
具体的には、 HepG2細胞に RARレポータープラスミドと同時に、 HDARTを定常 的に発現する pcDNA3- HDARTを Eiiecteneキット （QIAGEN) によりトランスフエ クシヨンした。 なお、 pcDNA3-HDART発現ベクターの導入量を変えて 0、 0 . 5、 1 . 0 gとし、 '各々のトランスフエクションの DNA量を同一にするために pcDNA の空のベクターで 1 gになるように調整した。 トランスフエクシヨン後、 ATRA ( 1 0— 8 M) の存在下または非存在下で生育させ、 その際の CAT活性を測定し た。 測定結果 （図 6 ) は、 ATRA不存在下での空ベクター 1 . 0 /i gを導入した CAT活性を基準にして補正した値を表わした。 また、 3回の実験結果の平均およ びエラーバーにより標準偏差を示す。
図 6 Aに示すように、 CAT活性は空のベクター （pcDNA) が導入された細胞では ATRAにより 5倍上昇した。 しかしながら、 この ATRAで誘導された CAT活性は HDARTにより濃度依存的に抑制された。
さらにダルココルチコイドレセプター （GR) による転写制御に対する HDARTの 作用は GR陽性 Hel a細胞内で GRレポ一タ一プラスミドを用いて解析した。 ダル ココルチコイド応答性プロモータの転写活性化は、 HeLa細胞および 1 0— 8 Mの デキサメタゾンを代りに使用した点を除いて上記レチノイン酸レセプ夕一に対す る実験と同様に行った。 測定結果の表示も上記と同様に行った。
HDARTの共発現は、 RAR (レチノイン酸レセプ夕一） 起因トランスァクティべ ーシヨンで観察された抑制と同程度で、 ダルココルチコィドに応答したレポ一夕 —遺伝子の活性化を抑制した （図 6 B) 。 これらの結果は、 HDARTが核内レセプ ターによって活性化された転写を選択的に抑制することを示している。 [実施例 5 ] 細胞核内における HDARTの局在
HDARTが転写制御に直接関与することが示されたため、 HDARTは細胞の核内に 局在することが予想される。 そのため、 HDART組換えタンパク質に対するポリク ローナル抗体を作製し、 これを免疫蛍光実験により HDARTの細胞内の局在を解析 することとした。
ポリクロ一ナル抗体の作製は、 先ず、 大腸菌中で His-HDART (アミノ酸残基 296-431) の融合タンパク質として産生させ、 Hisと親和性がある Ni-NTA樹脂 (QIAGEN) で精製した。 次に、 この His— HDARTタンパク質をゥサギに免疫し、 得られた抗 HDART抗血清を、 ProtOnキット 1 (MPS) を用いたァフィ二ティーク 口マトグラフィ一によりさらに精製した。 ここで精製されたゥサギ抗 HDART抗体 を、 内在的に HDARTを保持する Hela細胞とインキュベートし、 その後、 PE (Phycoerythrin) 融合抗ゥサギ抗体とインキュベートして、 免疫螢光染色を行 つた。 なお、 コントロール実験として、 ゥサギ抗 HDART抗体に代えて免疫前のゥ サギ血清を用いて同様の操作を実行した。 また、 核の所在を明確にするために、 DAPI染色も行った。
図 7 Aに示されているように、 抗 HDART抗体を用いた免疫蛍光染色像は、 DAPI 染色像と一致した。 一方、 免疫前血清では、 核は染色されなかった。 これら結果 より、 HDARTは Hela細胞の核内に優勢的に局在していることが示された （図 7 ) 。
また、 生存している細胞での HMRTの局在を解析した。 Hela細胞に GFPまた は GFP- HDART発現ベクターをトランスフエクシヨンし、 2 4時間後に GFPによる 蛍光発光を検出した。 また、 GFP— HDART細胞については、 核を視覚化するため に Hoechest33342染料を用いてィンキュベーションを行った。
図 7 Bに示すように、 GFP- HDARTベクタ一をトランスフエクシヨンした細胞で は、 Hoecliest33342染料 （右上パネル） で視覚化された核が GFPにより蛍光発光 していることが確認された (左上パネル) 。 特に、 GFP- HDARTは、 既に報告され ている Skip分子の核スペックルパターン （1 7 ) と部分的に類似のパターンを 示した。 類似の結果は HT1080細胞および 293細胞においても観察された （図示 せず） 。
[実施例 6 ] HDARTによる自律的な抑制機能
HDARTがより直接的な抑制に関与すると仮定した場合、 自律的な抑制機能を持 つであろうことが予想された。 この予想を確認するために、 HDARTを DNAに接続 させるために完全長の HDART cDNAを Gal 4 DNA結合領域 （GAL4DBD： GAL4DNAと の結合領域のみを持ち、 転写制御領域を持たない領域） に融合させ、 NIH3T3細 胞内で GAL4プロモータからの転写を調節し得るかを解析した。
具体的には、 Gal4レポ一夕一プラスミド （pGal4— Luc i ierase) が予め導入さ れた NIH3T3細胞に、 HDART全長タンパク質と Gal4 DBDとの融合タンパク質を発 現する Gal4 DBD- HDARTプラスミドを導入量を変えて （0、 0 . 1、 0 . 3、 0 . 5 a g) 卜ランスフエクシヨンした。 なお、 卜ランスフエクシヨンに用いる I 夕 ル DNA量を揃えるために、 各々のトランスフエクシヨンにおいて GaM DBDの空 のべクタ一を用いて発現べクタ一の量を 0 . 5 に調整した。 トランスフエク シヨン 24時間後に、 プロモータからのレポ一ター遺伝子の発現活性 （ルシフエ ラーゼ活性) を解析した。 各サンプルのルシフェラ一ゼ活性は、 空のベクターの み導入した際のルシフェラ一ゼ活性を基準 （100%) として補正した値で表した (図 8 ) 。 なお、 解析結果は 3回の実験結果の平均で示し、 また、 標準偏差をェ ラ一バ一により示した （図 8 A) 。 また、 Gal4 DBD- HDART (導入量 0または 0 . 5 li g) を用いて別の細胞 U-20S細胞においても同様の解析を行った （図 8 B) 。
HDARTは NIH- 3T3細胞内におけるプロモータ活性を濃度依存的に著しく抑制し、 最も高い濃度 （0. 5 g) ではルシフェラーゼの発現を 80%低下させた （図 8 A) 。 類似の結果は！ J-20S細胞でも観察された （図 8 B) 。 これら結果より、 HDARTそ れ自身で自律的な転写抑制作用を有していることが示された。
また、 GAL4 DNA結合領域をもたない HDARTの場合には、 ルシフェラーゼの発 現抑制は全く示されなかった （図示せず） 。 このことは、 HDARTそれ自身ではプ 口モータ領域の DNAへの結合活性を有していないと考えられる。
[実施例 7 ] HDARTに起因した抑制メカニズム
急性の転写調節は、 HAT (ヒストンァセチル化酵素） による活性化および HDAC (ヒストン脱ァセチル化酵素） による抑制が関与するメカニズムを介したコアヒ ストンのァセチル化の状態により制御されていることが報告されている。 HDART が起因する遺伝子抑制のメカニズムを明らかにするために、 この HDARTの機能が HDACとの複合体形成を介して発揮されるか否かを Flag-HDAC発現べクタ一を用 いた免疫沈降解析により調べた。
異なるタイプの HDAC ( 1， 3 , 4または 6 ) を発現し得る Flag- HDACs発現べ クタ一と GFP-HDART発現べクタ一とを実施例 2と同様に 293細胞にコトランスフ ェクシヨンし、 トランスフエクシヨン 2 4時間後に細胞抽出液を調整した。 各細 胞抽出液を抗 Flag抗体とィンキュベートして免疫沈降を行つた。 免疫沈降産物 を SDS-PAGEにより分離し、 分離したパターンをメンブレンに転写後、 抗 Fl ag抗 体または抗 GFP抗体を用いて免疫ブロッテイングを行った。 参照として、 各細胞 における GFP- HDARTタンパク質の発現を確認するために、 免疫沈降前の各試料を 同様に SDS-PAGEで展開し、 抗 GFP抗体を用いた免疫プロッティングを実行した。 なお、 図 9 Aにおいて、 上部パネルに免疫沈降前の GFP- HDARTタンパク質の発現 結果を示し、 中央パネルは免疫沈降産物を抗 Fl ag抗体で免疫プロッティングし た結果を示し、 さらに、 下部パネルは免疫沈降産物を抗 GFP抗体で免疫ブロッテ イングした結果を示す。 また、 HDACの種類は図左から次の通り ： レーン 1 ； HDAC L レーン 3 ； HDAC 3、 レーン 4 ； HDAC4、 レーン 5 ； HDAC6である。 なお、 レーン 2は GFP— HDARTのみを発現させたサンプルである。 図 9 Aに示すように、 Flag- HDAC発現ベクターと GFP- HDART発現ベクターとが コトランスフエクシヨンされた 293細胞由来の抽出液では、 抗 FLAG抗体によつ て GFP- HDARTが免疫沈降したことが確認された （下部パネル、 左よりレーン 1 , 3 , 4， 5 ) 。 しかし、 FLAG- HDAC非存在下 （Flag- HDAC発現ベクターが導入さ れていない株） では、 抗 FLAG抗体を添加しても GFP- HDARTの沈降は見られなか つた （下部パネル、 レーン 2 ) 。 従って、 抗 FLAG抗体による GFP-HDARTの沈殿 は、 Flag-HDACと GFP-HDARTとの特異的な相互作用によることが示された。 また、 HDARTはタイプ I (HDAC1および 3 ) とタイプ I I (HDAC4および 6)の両タイプの HDACと相互作用することも示された。
さらに、 HDARTと HDAC3との直接的な相互作用を GSTプルダウン解析により調 ベた。 GSTプルダウン解析は基本的に既知の方法に従って実施した （Tzamarias, D. , and Struhl, K. (1995) Genes Dev 9 (7) , 821-31. ) 。 TNT (登録商標) in Ρ ' /Ό転写 ·翻訳システム （Promega) を用い、 3 5 S—メチォニン存在下で HDAC3の in ^/ 翻訳を行つた。 GST夕ンパク質または GST— HMRT融合タンパ ク質は、 それぞれ大腸菌内で発現させ、 GST結合緩衝液 （50 トリスー HC1、
200mM LiCK 0. 5% NP40、 5mM EDTA、 lmM PMSF) 中、 ダルタチオンセファロ一ス を用いて精製した。 GST結合緩衝液 l ml中 GST— HDART融合タンパク質または対 照 GSTタンパク質 （約 1 /i g) と3 5 S—放射線標識^ 翻訳産物 （10 l) とを含有した結合反応液を調製した。 この反応液を振とうしながら 4 °C、 1時間 インキュベートした後、 セファロース- GSTタンパク質複合体を GST結合緩衝液 で 5回洗浄した。 GSTタンパク質に結合したタンパク質をドデシル硫酸ナトリゥ ム （SD.S) 含有サンプル緩衝液中で沸とうさせることにより溶出させ、 SDS-ポリ アクリルアミドゲル電気泳動により分離した。 GST融合タンパク質が同等に泳動 されていることをクーマシーブリリアントブルー染色により確認し、 さらにォー トラジオグラフィにより3 5 S—放射線標識された HDACを検出した。
図 9 Bに示されているように、 In vitroで翻訳された HDAC3は、 単なる GST 夕ンパク質とは結合せずプルダウンさせることができなかつたが、 GST— HDART 融合タンパク質を用いることによりプルダウンされることが示された （図 9 B) 。 また図には示されていないが HMC1でもまた同様の結果が示された。 このことか ら、 この HDARTと HDACとの相互作用は直接的であることが示唆された。
さらに HDARTの転写抑制作用に対する HDACの脱ァセチル化活性への影響を解 析するために、 HDACを特異的に阻害するトリコスタチン A (TSA) 存在下で、 実 施例 4と同様に CATレポ一ター解析を行った （図 1 0 Cおよび D) 。 但し、 本実 施例では、 一定量の pcDNA3— HDART発現ベクター ( 1 ja g) を用い （図 1 0中 「HDART十」 ） 、 またリガンド （ATRAまたはデキサメタゾン） と共に ΙΟΟηΜ TSA または 1mA酪酸ナトリウムを添加した。
図 1 0 C、 Dに示すように、 リガンドのみでは対応するプロモ一夕からのリポ 一夕一遺伝子の発現は上昇し、 そこに HDARTを発現させると、 発現活性が抑制さ れた。 さらにトリコスタチン Aが添加されると、 HMRTによる発現抑制が完全に 中和された。 同一の結果がもう一つのヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤、 酪酸ナ トリウム （Buty) を添加した場合にも観察された。 これら結果は、 HDARTによる 転写抑制が脱ァセチル化酵素活性を介して発揮していることを裏付けている。
[実施例 8 ] HDART- Skip相互作用によるリガンド非結合型レセプター
(unl iganded receptor) の能動抑制
RARおよび TRは、 / 7 rゾ' (Baniahmad, A. , Kohne, A. C. , and Renkawi tz, R. (1992) Enibo J 11 (3) , 1015-23) および in vitro (Fonde l l, J. D. , Roy, A. L.， and Roeder, R. G. (1993) Genes Dev 7 (7B) , 1400-10. ) においてリガンド 非存在下で遺伝子活性化を抑制する。 このことから、 これを能動抑制 （act ive repress ion) と称している。 また、 Skipはリガンド非依存的に NHRと相互作用 する （MacDonald, P. N. , Baud ino, Τ. A. , Tokumaru, H. , Dowd, D. R. , and Zhang, C. (2001) Steroids 66 (3-5) , 171-6. ) 。 そのため、 これら抑制効果お よび Skipとの生理的な関与により、 HDART- Skip複合体がリガンド非結合型レセ プター上に存在する可能性、 また、 この相互作用がレセプ夕一の能動抑制に関与 する可能性が示唆された。 これら可能性を明らかにするために、 HDARTのドミナ ントネガティブ株を過剰発現させ、 その際の RARに起因した転写に対する影響を 調べた。 実施例 2に示した通り HDARTにおける N末端の 4つの TPR (N4TPR) は Skip結合領域であるため、 この領域の発現が内在 HDARTと Skipとの相互作用を 阻止することで HDARTの天然の機能を阻害してドミナントネガティブとして機能 することが予想されたため、 本実施例では N4TPRをドミナントネガティブ候補と して用いた。
293細胞に Flag— Skipおよび GFPまたは GFPで夕グ付けされた N4TPRをトラ ンスフエクシヨンした。 トランスフエクシヨン 2 4時間後に細胞抽出物を調製し、 抗 Flag抗体で免疫沈降させた。 免疫沈降物を SDS- PAGE上で分離した。 また、 免 疫沈降前の内在性 HDARTの発現を確認するために、 免疫沈降前の細胞抽出液も同 様に SDS- PAGEで分離した。 分離後のパターンをメンブレンに転写した。 そして、 Flag- Skipの発現については抗 FLAG抗体を用い、 GFPおよび GFP-N4TPRの発現に ついては抗 GFP抗体を用い、 さらに、 内在 HDARTの発現については抗 HMRT抗体 を用いて、 それぞれ検出した （図 1 1 A) 。 なお、 図 1 1 Aにおいて、 下方の 3 つのパネルは、 それぞれ免疫沈降された Skip (下部上） 、 内因性 HDART (下部中 央） および N4TPR (下部下） を示し、 上部の一枚のパネルには、 免疫沈降前の内 因性 HDARTタンパク質の発現を示す。
図 1 1 Aに示されているように、 N4TPRの発現は、 N4TPRを発現していない対 照 （GFPのみ、 レーン 1 ) に比べて Skipと共沈殿した HDARTの量を減少させた
(下部中央パネル、 レーン 2 ) 。 一方、 N4TPRの過剰発現は、 N4TPRと Skipとの 相互作用が増加し、 共沈殿した Skipの量を著しく上昇させた （レーン 2、 lower bot tom panel) 。 コントロールのタンパク質 （GFP) の発現は HDARTと Skipとの 相互作用に対して影響はなかった （レーン 1 ) 。 この結果は、 N4TPRが HDARTに 代わって Skipと相互作用するドミナントネガティブタンパク質として作用する ことを示している。
次に、 N4TPRの過剰発現が MRまたはダルココルチコィド応答性プロモータか らの転写に与える影響を調べた。 なお、 ここでは、 GFP— N4TPR発現ベクター ( 0、 0. 3、 0. 5 g) を用いた点を除いて、 上記実施例 4に記載したレポ一 ター解析と同様の方法により検討した。
結果は図 1 1 B、 Cに示した通り、 リガンド非存在下で N4TPRを制限して発現 させることにより （導入量 0. 3 ; g) 、 RARおよびダルココルチコイド応答性プロ モータからの転写活性をリガンド存在下で誘導した転写活性の程度 （グレー力ラ ム） まで増加させた。 N4TPRの最も高い発現レベルでは （導入量 0. 5 z g) 、 リガ ンド非存在下で転写活性を強く増加 （〜約 20倍） させた。 これらの結果は HDARTが RARやダルココルチコィドレセプタ一など核内ホルモンレセプ夕一の能 動抑制にとつて必要であることを示唆している。 [実施例 9 ] レチノイン酸誘導による黄紋筋筋腫由来細胞株 （rhabdomyosarcoma cel l l ine) の筋組織への分化を HMRTの過剰発現により阻害
ATRA (Al l-trans ret inoic acid) は、 腫瘍細胞分化の重要な誘導剤であるこ とが知られている (20— 22) 。 ヒト黄紋筋筋腫由来細胞株醒- 1-19-Pは主に小さ な多角形の細胞から構成され、 最終的にレチノイン酸を備えた筋管様の巨大細胞 に分化する。 核内ホルモンレセプ夕一に起因した反応における HDARTの生理学的 な役割を明らかにするために、 ATRAによる匪-卜 19-Pの筋組織の分化に対して
HDART発現が与える影響を解析した。
lOOmMのべトリ皿上に匪-卜 19-P細胞を植えつけ、 この細胞に 0. 4 z gの GFP ベクタ—と 2 gの pc丽 （空ベクター） または PCDNA3- HDART (HDART発現べク 夕一） とをコトランスフエクシヨンした。 I、ランスフエクシヨンから 2 4時間後 に、 培地を ATRA含有 （2 Μ) または非含有の新鮮な培地と交換した。 4 8時 間の誘導後、 細胞が筋管様の巨大細胞を示す細長い紡錘細胞へと変化した時点で、 形態学的に分化したものとして細胞を評価した。 すべての実験を 4回反復し、 GFPについて陽性と評価済みの細胞の数をカウントした。 結果を図 1 2に示す。 なお、 図 1 2において、 GFP の緑色螢光の標準的顕微鏡写真をパネル A、 B、 C , Dに、 位相差顕微鏡写真をパネル E、 Fに示す。 また、 （A) は ATRA非処理か つ空ベクター導入細胞、 （B ) ATRA処理かつ空ベクター導入細胞、 （C ) ATRA 非処理かつ HDART発現べクタ一導入細胞、 （D ) ATRA処理かつ HDART発現べク 夕一導入細胞、 （E ) 上記 （C ) と同一条件の細胞、 （F ) 上記 （D ) と同一条 件の細胞を示す。 また、 パネル Fでは、 黒色矢印は、 未分化 GFP陽性細胞を表わ し、 白色矢印は分化された細胞を指す。 （G) グラフは、 GFP陽性細胞中の形態 学的に分化された細胞の百分率を 4回の独立した実験結果の平均で示し、 また標 準偏差はエラーバーで示されている （空ベクターかつ ATRA (+ ) と HDART発現 ベクタ一との間で Pく 1 %， スチューデントの tテスト） 。
各実験において、 GFP陽性細胞数は 3 0〜7 0であった。 空ベクターを導入し ATRA処理した細胞では、 GFP陽性の細胞数は ATRAの細胞毒性効果のため 3 0 % 未満であつたが、 一方、 HDART発現ベクターを導入した細胞では、 ATRA処理群、 非処理群とで GFP陽性の細胞数は同じであった。
空のベクターが導入された細胞の多くは、 ATRA処理によって、 筋管様の巨大 細胞の出現で示されるように筋組織に分化した （図 1 2 B、 図 1 2 G) 。 また、 空 のベクターが導入された細胞では、 ATRA処理による表現型の変化の程度は GFP 陽性および陰性の細胞の双方で同一であった。 しかしながら、 HDARTが導入され た細胞では、 GFP陽性細胞は ATRA処理を行っても表現型の変化はほとんどない が （図 1 2 D中黒色矢印、 図 1 2 G) 、 一方の GFP陰性細胞では特徴的な筋管様 巨大細胞が観察された （図 1 2 F中白色矢印） 。 この結果は、 HDARTの発現がレ チノイン酸による分化を抑制することを示している。 そして、 この結果はレポ一 夕一解析において HDARTが RARによる転写活性化を抑制した結果と一致する。 こ れらの結果は HDARTが少なくともレチノイン酸レセプターにおける生理学的な転 写のコリプレッサーであることを示している。 産業上の利用の可能性
上述した通り、 本発明の転写抑制因子は、 自律的に転写を抑制し、 特に、 核内 レセプ夕一の転写を抑制するため、 所望の転写系に作用させ、 該転写系の転写を 抑制する目的で用いることができる。 また、 本発明の転写抑制因子は HDACと結 合能を有し、 この HDACのヒストン脱ァセチル化活性を介して転写抑制能を発揮 し得る。 したがって、 本発明の転写抑制因子を用いて HDACをリクルートさせ、 HDACの作用によって転写抑制を行うこともできる。 本発明の転写抑制因子のこ のような作用は、 例えば核内レセプ夕一の転写亢進が起因している疾患に応用し 得るものであり、 こうした疾患の治療薬として本転写抑制因子が有益となる。 また、 上記転写抑制因子のドミナントネガティブペプチドは、 転写活性化因子 として機能する。 したがって、 このドミナントネガティブペプチドは、 転写を促 進させるために用いることができる。 このドミナントネガティブペプチドもまた、 核内レセプターの転写に作用し、 その転写を逆に促進させる。 そのため、 核内レ セプタ一の転写促進物質として本ペプチドが有益となる。 特に、 HDARTの N末端 側の 4つの TPR (N4TPR) は、 ATRAに比してレチノイン酸レセプターの転写活性 化能が高いため、 現在 ATRAが用いられている疾患治療 （例えば、 悪性腫瘍の分 化誘導療法など） において、 ATRAに代えてまたは ATRAと共に本ペプチドを治療 薬として応用し得る。

Claims

請求の範囲
1 . 転写抑制因子をコードした DNAであって、
(A) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードした DNA、 または、
(B) 配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNA。
2 . 転写抑制因子をコードした DNAであって、
(A) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタン パク質をコードした DNA、 または
(B) 配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下 でハイブリダィズする DNA。
3 . 請求項 1または 2に記載の DNAによりコ一ドされた転写抑制因子。
4. 核内ホルモンレセプターに起因した転写を抑制し得る請求項 3記載の転写 抑制因子。
5 . 転写を活性化し得るぺプチドをコ一ドした DNAであって、
(A) 配列番号 2における 1から 179位のアミノ酸配列からなるペプチドをコ ードした DNA、 または
(B) 配列番号 1における 1から 537塩基までの塩基配列からなる DNA。
6 . 転写を活性化し得るペプチドをコードした DNAであって、
(A) 配列番号 2における 1から 179位のアミノ酸配列において 1若しくは複 数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配 列を有するペプチドをコードした DNA、 または
(B) 配列番号 1における 1から 537塩基までの塩基配列からなる DNAとスト リンジェントな条件下でハイブリダイズする DNAo
7 . 請求項 5または 6に記載の DNAによりコードされた転写活性化べプチド。
8 . 請求項 1、 2、 5または 6のいずれかに記載の DNAのうち、 少なくとも 1 5ヌクレオチド長を有する DNA
9 . 請求項 1、 2、 5または 6のいずれかに記載の DNAが揷入されたべクタ
10. 請求項 1、 2、 5または 6のいずれかに記載の DNAまたは請求項 9に記載 のベクターを保持する宿主細胞。
11. 請求項 3に記載の因子または請求項 7に記載のペプチドに結合し得る抗体。
12. 請求項 1、 2、 5または 6のいずれかに記載の DNAとハイプリダイズし、 少なくとも 10ヌクレオチド長を有する、 オリゴヌクレオチドプローブ。
13. 以下の （A) 〜 （D) のいずれかが固定された基板。
(A) 請求項 1 2に記載のオリゴヌクレオチドプローブ
(B) 請求項 3または 4に記載の転写抑制因子、 もしくは該因子の部分べプチド (0 請求項 7に記載の転写活性化ペプチド、 もしくは該ペプチドの部分べプチ ド'
(D) 請求項 1 1に記載の抗体
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