CN1671843A

CN1671843A - 参与转录调控的因子

Info

Publication number: CN1671843A
Application number: CNA038178338A
Authority: CN
Inventors: 水谷修纪; 山田孝之
Original assignee: Sony Corp
Current assignee: Sony Corp
Priority date: 2002-07-25
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2005-09-21
Anticipated expiration: 2023-07-25
Also published as: JP4508872B2; KR20050034720A; JPWO2004031388A1; EP1541685A4; US20080145928A1; CN1671843B; AU2003252693A1; US20120088301A1; WO2004031388A1; US8889408B2; EP1541685B1; KR101083852B1; EP1541685A1

Abstract

HDART结合于HDAC(组蛋白脱乙酰基酶)并起到阻遏物的作用。同样，HDART直接结合于起核内受体共活化物作用的Skip，以抑制核内受体的转录。并且，HDART能结合于作为核内受体的转录共阻遏物之一的HDAC，由此强烈的抑制通过HDAC的组蛋白脱乙酰作用的转录。另一方面，获得了一种HDART的显性阴性肽，并证实该肽活化转录，与全长HDART蛋白作用相反。特别是，该肽在活化视黄酸受体转录的活性方面优于全反式视黄酸(ATRA)。

Description

参与转录调控的因子

技术领域

本发明涉及转录调控因子等等，更具体地，涉及能控制核激素受体引起的转录的因子或肽。

背景技术

激素，脂溶性维生素等在生物的稳定维持、能量代谢、分化、生长等方面起着重要的作用。这些激素的受体等是存在于核内的转录调控因子，并且与染色质DNA的特定位点结合从而控制基因的转录反应。在大多数情况下，当配体如激素等不与受体结合时，转录的发生将会受到抑制。一旦配体(如激素)与受体结合，转录将通过染色质结构的改变而活化。据报道，从核内受体到转录装置(transcriptor)的路程中，许多称作共活化物(co-activator)和共阻遏物(co-repressor)的因子形成复合体。配体未结合型受体与包含组蛋白脱乙酰基酶的共阻遏物结合，从而抑制基因表达。另一方面，当受体结构经过与配体的结合而发生变化时，共阻遏物复合体被释放，包含组蛋白乙酰基转移酶的共活化物复合体被募集(recruited)。比如Skip共活化物(即Ski相互作用蛋白，也称作N-CoA62)，它直接结合于某些类型的核内受体(比如维生素3受体，视黄酸受体，雌激素受体以及糖皮质激素受体)以增强由这些核内受体引起的基因表达(Baudino，T.A.，Kraichely，D.M.，Jefcoat，S.C.，Jr.，winchester，S.K.，Partridge，N.C.，and MacDonald，P.N.(1998)J.Biol Chem 273(26)，16434-41，MacDonaldo，P.N.，Baudio，T.A.，Tokumaru，H.，Dowd，D.R.，and Zhang，C.(2001)Streoids 66(3-5)，171-6)。

发明内容

如上所述，尽管目前经由核内受体介导的转录调控机制的概要已明确，参与该机制的因子仍有待说明。因此，本发明的目的是提供转录控制因子，尤其是能参与核内转录受体的转录控制的新的因子。

本发明在果蝇crn(弯曲颈(crooked neck))基因的人同系物克隆及其功能分析方面进行了研究，通过该研究发现，该基因的人同系物参与核内受体介导的转录调控。应注意，果蝇crn基因本身是一种在胚胎形成早期就达到最大表达水平的基因。有报道该基因的失活导致胚胎发生缺陷并主要地影响神经系统的发育(Zhang，K.，Smouse，D.，and Perrimon，N.(1991)GenesDev5(6)，1080-91)。crn蛋白的一个独特特征是存在16个拷贝的纵向定向tetratricopepeiderepeat(TRP)。TRP可见于多功能蛋白，它是在进化过程中扩散的34个氨基酸的同义重复基序。有TPR蛋白参与的进程包括细胞周期控制、转录抑制、应激反应，蛋白激酶抑制以及蛋白运输(Lamb，J.R.，Tugendreich，S.，and Hiter，P.(1995)Trends Biochem Sci 20(7)，257-9)。

与上述果蝇crn基因一样，一定数目的TPR也存在于人crn基因同系物中，但拷贝数不是15。由我们克隆出的人crn基因与编码蛋白(XAB2)的基因(Yoshimichi et al.，Journal.Biol.Chem.275：34931-34937)一致，该蛋白与迄今所报道的转录相关性转录结合DNA的修复有关。但是，我们新近发现，来自该基因的产物参与转录抑制。尤其是，由于基因产物在结合HDAC(组蛋白脱乙酰基酶)后起阻遏物的作用，其在这里被称作“HDART”(HDAC相关阻遏物TRP)蛋白。并且，我们发现，HDART直接与前述作为核内受体转录共活化物的Skip结合，从而抑制核内受体的转录。此外，也证实HDART是核内受体的转录辅助阻遏物之一，并且HDART与HDAC结合从而能通过HDAC的组蛋白脱乙酰作用强烈抑制转录。另一方面，证实获得了显性阴性肽，与全长HDART不同，该肽可用于活化转录。更具体而言，本发明建立在HDART的新发现的各种功能之上，并且尤其集中在下面所要陈述的内容：

(1)本发明在于编码转录抑制因子的DNA，包括

(A)编码含有如序列2所示的氨基酸序列的蛋白的DNA，或

(B)由序列1所示的碱基序列组成的DNA。

(2)本发明在于编码转录抑制因子的DNA，包括

(A)编码蛋白的DNA，所述蛋白具有在序列2所示氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一或多个氨基酸所得到的氨基酸序列，或

(B)在严格条件下与由序列1所示碱基序列组成的DNA杂交的DNA。

(3)本发明在于上述(1)或(2)所述的DNA编码的转录抑制因子。

(4)本发明在于上述(3)所述转录抑制因子并且该转录抑制因子能抑制核激素受体引起的转录。

(5)本发明在于一种由能活化转录的肽编码的DNA，包括

(A)编码由序列2的第1-179位所示氨基酸序列组成的肽的DNA，或

(B)由序列1的第1-537位碱基所示碱基序列组成的DNA。

(6)本发明在于编码能活化转录的肽的DNA，包括

(A)编码肽的DNA，所述肽具有在序列2的第1-179位氨基酸所示氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，或

(B)与序列1的第1-537位碱基序列组成的DNA杂交的DNA。

(7)本发明在于上述(5)或(6)所述的DNA编码的转录活化肽。

(8)本发明在于选自上述(1)、(2)、(5)或(6)之一的DNA并具有至少15个核苷酸长度的DNA。

(9)本发明在于插入了上述(1)、(2)、(5)或(6)之一的DNA的载体。

(10)本发明在于具有上述(1)、(2)、(5)或(6)之一的DNA或上述(9)的载体的宿主细胞。

(11)本发明在于能结合(3)所述因子或(7)所述肽的抗体。

(12)本发明在于能与(1)、(2)、(5)或(6)之一的DNA杂交并且至少具有10个核苷酸长度的寡核苷酸探针。

(13)本发明在于固定了下述(A)至(D)之一者的基板：

(A)如上(12)所述寡核苷酸探针；

(B)如上(3)或(4)所述的转录抑制因子或其中的部分肽；

(C)如上(7)所述的转录活化肽或其中的部分肽；

(D)如上(11)所述的抗体。

本发明的具体内容将更加详细的予以描述。用于说明书中的缩写词事先说明如下：HAT(组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltranspherase)或组蛋白乙酰基转移酶(histone acetylase))；HDAC(组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase或histone deacetylizing enzyme)；DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole)；RAR(视黄酸受体)；GR(糖皮质激素受体)；DBD(DNA结合域)；AD(活化域)；和ATRA(全反式视黄酸)。

本发明涉及一种与转录调控相关的因子。该转录调控因子包括转录抑制因子和活化因子。首先，描述转录抑制因子。本发明的转录抑制因子的例子包括HDART，其氨基酸序列如序列2所示。但是，应注意，根据本发明的转录抑制因子并不限于序列2所示的HDART，而是当转录抑制活性在一定范围内时，所述因子包括具有在序列2所示氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一或多个氨基酸所得的氨基酸序列的蛋白，和在严格条件下与编码HDART的DNA(序列1)杂交的DNA所编码的蛋白。

HDART蛋白在人细胞核内表达并且能从人细胞核中获取。起始人细胞并不是关键，例如，明显内源表达HDART的293细胞。

具有氨基酸取代的与HDART相似的蛋白的制备，能用例如已知的技术比如噬菌体文库筛选技术(Molecular Cloning 3^rd Ed，Chapter 2pp.2.1-2.117)，聚合酶链反应(PCR：Molecular Cloning 3^rd Ed，Chapter 8，pp.8.1-8.126)技术而进行。更具体而言，该蛋白通过使用HDART编码的DNA或者其中的部分作为探针或引物从而获得由序列1提供的DNA和同系物，接着在该DNA的基础上制备蛋白。如此获得的蛋白通常与HDART以及氨基酸序列具有高度同源性。这种高度同源性意味着至少有40％或者更高的碱基序列一致性，优选的，60％或者更高，更优选80％或者更高，进一步优选90％或更高，更进一步优选95％或更高，最优选97％或更高(即从98％到99％)。

“严格杂交条件”是指能由本领域技术人员适当的选择的那些条件。例如，所提到的杂交通过在杂交溶液中进行预杂交而实现，杂交溶液包括25％的甲酰胺或严格条件下的50％的甲酰胺，4XSSC，50mM Hepes pH7.0，10XDenhalt溶液，20μg/ml改良鲑精在42℃过夜后，将标记探针加入溶液中，在42℃过夜。用于随后洗涤的洗涤液和温度条件包括1XSSC，0.1％SDS和大约37℃，较严格的条件包括0.5XSSC，0.1％SDS和大约42℃，进一步的严格条件包括0.2XSSC，0.1％SDS和大约65℃。该SSC，SDS和温度的结合仅仅作为例证而提及，本领域的技术人员可以进行适当的改变。

序列的同源性可利用BLASTn(核酸水平)或BLASTx(氨基酸水平)程序确定(Altschul et al.J.Mol.Biol.215：403-420，1990)。该程序基于Karlin和Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sei.USA 87：2264-2268，1990，Proc.Natl.Acad.Sei.USA 90：5873-5877，1993)。根据BLASTN分析碱基序列时，其参数例如score＝100和wordlength＝12。另一方面，根据BLASTX分析氨基酸序列时，其参数例如score＝50和wordlength＝3。使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列时，该分析能通过Altechul等描述的方式进行(Nucleic.Acids.Res.25：3389-3402，1997)。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各自程序的默认参数。这些分析的专门程序是本领域已知的(heep：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。

倘若序列2所示序列经人工修饰，则认为该修饰通常在总氨基酸的10％以内，优选在总氨基酸的5％以内，更优选在总氨基酸的1％以内。在能保持转录抑制活性的范围内，氨基酸序列可以被取代至超过上述指出的修饰百分比的程度。人工修饰氨基酸序列的技术能通过例如已知的方法完成，包括缺失突变体的制备，PCR法，定点诱变等。应注意，以这种方式修饰的蛋白是否具有与HDART一样的转录抑制活性，能，用，下文实施例中描述的多种报告子分析方法进行确定，从而分析转录抑制能力。

该HDART以及与之相似蛋白具有如上所述的转录抑制活性，所以该功能被用来通过与所需转录装置结合而抑制所需基因的转录。该转录装置可以是体外转录系统或体内转录系统。由于HDART的转录抑制能力是自主的，本发明的转录抑制因子单独使用时能抑制转录。但是，在这种场合，HDART没有结合DNA的能力，应该优先被用作与DNA结合区融合的融合蛋白。HDART具有结合HDAC的能力，因此能募集HDAC从而通过组蛋白脱乙酰基酶活性强烈抑制转录。在这一点，本发明的转录抑制因子能通过与HDAC一同使用或通过诱导HDAC而抑制转录。已知HDAC具有I型(HDAC1，HDAC2，HDAC3)和II型(HDAC4，HDAC5，HDAC6，HDAC7，HDAC8)。本发明的HDART被认为与HDAC2，HDAC5，HDAC7，HDAC8等结合。因此，在本发明实践过程中，HDAC2，HDAC5，HDAC7和HDAC8能被很方便地使用。但是，不应该仅仅限于这些HDAC的使用，属于I型或II型的HDAC也可以使用。

由于HDART能抑制核内受体转录，通过核内受体起作用的转录装置可以很方便地用作能借助本发明的转录抑制因子而受到抑制的转录装置。适宜的核内受体是视黄酸和糖皮质激素受体。此外，针对激素和脂溶性维生素的核内受体，比如retinoin X受体，维生素D受体，雄激素受体，雌激素(esterogen)受体，tiroid激素受体等，也可以包括在本发明的范围内，其中本发明的因子确保能抑制转录。因此，本发明的转录抑制因子对于治疗由那些核内受体因子的转录失调引起的疾病是有用的。尤其是，对于过度转录而引起的疾病的治疗有用。特别是，如下文所述例子中，由于清楚地解释了HDART抑制视黄酸受体的转录并且也抑制由视黄酸受体转录引起的分化，本发明的转录抑制因子可以被用作针对由视黄酸受体转录引起的分化亢进的治疗性药物。

本发明涉及编码转录抑制因子的DNA。所提到的DNA，例如是由序列1所示的碱基序列组成的DNA，尽管并不限于此。此外，也可以是编码序列2所示的氨基酸序列的DNA，编码蛋白的DNA(所述蛋白具有其中一个或一个以上的氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加至如序列2所示的氨基酸序列的氨基酸序列)，以及在严格条件下与由序列1所示的碱基序列组成的DNA杂交的DNA。

上述DNA用序列1所示DNA或其部分作为探针或引物，与例如人细胞cDNA文库进行杂交或聚合酶链反应(PCR)而获得，例如，所述人细胞为在下文实施例1中的人胰岛细胞。或者，该DNA可以通过另一种方法从RT-PCR获得(Molecular Cloning 3^rd Ed，Chapter 8，Protocol8，pp.8.46-8.53)，用其中人细胞的mRNA作模板，并且用序列1所示DNA的一部分作引物。应注意，尽管人细胞的例子如上阐述，除此之外，其制备还可以通过利用除此之外的其它哺乳动物细胞，真核细胞等进行。此外，分离DNA的杂交条件如前所述。

除了上述的克隆DNA的方法，该DNA可以用DNA合成仪分别合成序列1及其互补链所示的DNA，然后退火来形成。

上述DNA由转录抑制因子编码，因此能作为一种制备转录抑制因子的工具，或者在导入细胞或个体后作为表达转录抑制因子的工具。当用于这一目的时，优选将所述DNA掺入表达载体或类似载体。表达载体的类型可以根据用于制备蛋白的转录系统或者将被导入的细胞进行适当的选择。

为了利用DNA结合载体制备转录抑制因子，将该载体首先导入到宿主细胞中，然后对宿主细胞进行培养。通过这种方法在宿主细胞中产生转录抑制因子。将载体引入细胞的方法可以根据所使用细胞的类型加以适当的选择。例如，可以使用病毒载体或者噬菌体介导的生物技术；化学技术如磷酸钙法、脂质转染法等；物理技术如基因枪法和电穿孔法等。如果需要，宿主细胞中所产生的蛋白质可以在经过纯化后(如通过亲和纯化)加以利用。

掺入了DNA的表达载体还可以用来抑制在细胞或个体内的所需转录。更具体而言，当表达载体被导入细胞或个体以表达转录表达因子时，所需转录系统能被抑制。特别是HDART具有自主的转录抑制能力，从而使本发明的转录抑制因子在单独使用时表现出具有转录抑制活性。应注意HDART不具备结合到DNA上的能力，优选将本发明的转录抑制因子作为一种融合蛋白加以表达，该融合蛋白具有一个能与所期望基因的控制区DNA相结合的DNA结合区。通过这样做，目标基因的转录能被抑制。本发明的转录抑制因子具有结合到HDAC的能力，所以当表达转录抑制因子时，HDAC得以募集，由此使得转录的抑制更加强烈。

由于本发明DNA所编码的转录抑制因子具有有效地抑制核内受体转录的能力，所以掺入了这些DNA的载体可以用来作为治疗由这些核内受体引发的不断增加的转录所导致疾病的成分。用于治疗目的的载体例如逆转录酶病毒载体、腺病毒载体、相关腺病毒载体、牛痘病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、alpha病毒载体、EB病毒载体、papiroma病毒载体、泡沫病毒载体等等。

本发明还涉及选自转录抑制因子的一种肽，它具有与上面示例所不同的活化转录能力。HDART以其全部长度起到转录抑制因子的功能。相反，HDART的显性阴性肽起到转录活化剂的作用。该显性阴性肽的例子包括N末端四个TPR编码的肽(此后简称为“4NTPR”)，也就是，包含序列2中从位置1到位置179的氨基酸序列的肽，但并不受限于此。还可以包括其中的一个或多个氨基酸被取代、删除、插入和\或添加到序列2中的位置1到179的氨基酸序列中的那些肽，只要它们具有转录活性。

显性阴性肽能通过以由序列1中1到537的碱基序列组成的DNA为基础合成的肽来制备。而且，该肽以及其中1到537碱基序列之后的碱基被取代的肽能通过基于DNA而合成的肽来制备，其中DNA的密码子通过将变异(取代、缺失、插入和/或加入)添加到氨基酸序列的1到537位的碱基序列中而改变。

上述肽具有转录活化活性并且用于促进所需转录系统的转录。特别如实施例所示，因为HDART的N4TPR活化了核内受体的转录，它可以用来促进这些核内受体的转录。核内受体优选例如Skip作用于其上的核内受体如视黄酸受体、糖皮质激素受体、维生素D受体、雌激素受体等。在本发明的肽确保转录活性的范围内，还可以包括针对激素或者脂溶性维生素的核内受体，如retinoin X受体、雄激素受体、tiroid激素受体等。

此后文中的实施例显示，在N4TPR作用下，视黄酸受体引起的转录活化活性比由ATRT引起的转录活化活性高。因此，恶性肿瘤如白血病的分化诱导治疗目前通过依靠ATRA促进的视黄酸受体转录活化活性而进行。而且维生素A以及其衍生物包括ATRA已经开始用于治疗除了白血病以外的肝细胞癌(okuno，M.et al.，(2002)Front Biosci 7，204-18)，卵巢癌(Zhang D.et.al.，(2000)J，cell physiol 185(1)，1-20)，甲状腺癌(Schmutzler C.and KohrleJ.(2000) Tyroid 10(5)，393-406)，皮肤癌(Niles R.M.(2000) Nutrition16(11-12)，1084-9)，胰腺癌(Riecken E.O.and Rosewicz S.(1999)10 suppl 4，197-200)等。本发明的肽可用来取代ATRA或者与ATRA相结合。

本发明还涉及编码具有上述转录活化活性的肽的DNA。所述DNA例如编码由序列2的1至179位氨基酸序列组成的肽的DNA，例如由序列1中的1到537位碱基所示碱基序列组成的DNA。但并不限于此，它们还可包括：编码具有在序列2中从1到179的氨基酸序列中替换、删除、插入和\或添加一个或多个氨基酸得到的氨基酸序列的肽的DNA，还可以包括由序列1中的1到537位碱基的碱基序列组成的DNA，以及在严格条件下杂交的DNA，只要它们具有转录活化活性。

编码转录活化肽的DNA能通过获得编码前述转录抑制因子的DNA并使例如C末端缺失而制备。可以选择的是，DNA还可以通过DNA合成仪合成。

该DNA能用于导入细胞个体后产生转录活化肽或者表达所述转录活化肽。当使用DNA产生肽时，它优选掺入表达载体。在这种情况下，表达载体可以根据用于产生肽的转录/翻译系统加以适当选择。该转录/翻译系统可以在体外或体内。对于体内系统，掺入了所述DNA的表达载体被导入细胞然后对细胞进行培养从而在细胞内部产生转录活化肽。导入细胞的步骤与此前所述相似。

被引入细胞或个体的DNA用于表达转录活化肽时，该DNA可以被直接导入细胞进行短时表达或者插入染色体后进行稳定的表达，也可以在掺入表达载体之后被导入细胞中。

如上所述，转录活化肽可以与ATRA一样用于恶性肿瘤的分化诱导治疗，其中所述治疗不直接应用转录活化肽，而是将该DNA注射或施用于病人以表达转录活化肽，并由此能被用于这样的治疗。由此，优选使用掺入载体的DNA以将该DNA携带到所需组织或细胞中。用于该类型的治疗的载体可以使用病毒载体，如前所示的逆转录酶病毒载体等。

如上所述，编码本发明转录抑制因子的DNA能通过使其N末端侧的DNA变短而被修饰为编码转录活化肽的DNA。此外，编码转录抑制因子的DNA或者编码转录活化肽的DNA能以更短片段的形式用作杂交探针，PCR引物或核酶衍生物。当DNA的一部分用于这一目的时，优选该片段具有能保留作为一个探针或类似物的足够特异性的长度，具体地，保留15个核苷酸的长度。通过与本发明的DNA(如序列1所示的DNA或同系物)杂交，本发明提供了一种具有至少10个核苷酸长度的寡核苷酸探针。例如，包括由序列1所示的碱基序列构成的一条DNA或者与其中的互补链特异杂交的DNA的多核苷酸。本文术语“特异性杂交”指在杂交过程中，没有与编码其它蛋白类型的DNA有明显杂交的发生。上面提到的探针或引物能被用于克隆编码转录抑制因子等的DNA等。

本发明涉及一种能结合到转录抑制因子或者转录活化肽的抗体。本发明的抗体可以是能特异结合到转录抑制因子或者转录活化肽的多克隆抗体或单克隆抗体。该多克隆抗体能通过如下的方法加以制备：将本发明的蛋白或者部分肽与Freund’s佐剂相混合；如果必要，根据已知的方法对非人的动物如兔、山羊、豚鼠等进行免疫；然后在确定抗体水平提高后从免疫过的动物外围血中收集血清。另一方面，单克隆抗体可以通下如下方法加以制备：根据已知的方法，利用转录抑制因子、转录活化肽或其部分肽对动物如小鼠进行免疫；从抗体水平已经增加的免疫过的动物中移去脾脏或者淋巴结；使抗体生成细胞与组织中的mieroma细胞融合从而制备杂交瘤；其后，从培养物上清液中收集产生自杂交瘤的抗体从而获得单克隆抗体。

这些抗体不仅可以用于转录抑制因子或者转录活性肽的亲和纯化，也可以用于在不同细胞中对转录抑制因子表达量进行免疫学分析，或者可以用于抑制转录抑制因子。

本发明提供了一种与其上寡核苷酸固定的基板。该基板采用生物芯片的形式，使人们能在测试生物(细胞)时，分析本发明的DNA的表达条件。

在一个优选的实施方式中，本发明的DNA(如序列1中所示的DNA或其部分DNA片段)从测试的生物(细胞)中扩增，接下来提供使有待与DNA杂交的寡核苷酸探针固定的基板。之后，使该DNA和基板开始彼此接触。当与固定在基板上的核酸探针杂交的DNA被检测到时，能对本发明DNA的表达时的状态加以分析。

这样的方法包括，例如，DNA阵列技术，通过本领域已知的技术从测试生物(细胞)中制备DNA样品是可行的。在一个优选的制备DNA样品的实施方式中，以从细胞中提取的染色体DNA为基础进行制备是可能的。对于从染色体DNA中制备本方法的DNA样品来说，可通过PCR，使用染色体DNA作为模板，使用比如将与本发明的DNA杂交的引物制备本发明的DNA。如果需要的话，如此制备的DNA样品可以通过本领域已知的方法加以标记以用于检测。

本发明中所用的术语“基板”是指一种能固定核酸的平板状材料，通常被称作芯片。在本发明的一个实际应用中，核苷酸包括寡核苷酸和多核苷酸。尽管本发明的基板并不是关键的，只要它能固定其上的核苷酸即可，优选使用通常被用于DNA阵列技术的基板。

通常，DNA阵列包括以高密度印在基板上的几千个核苷酸。这些DNA常常被印在非透过性基板的表层。该基板的表层通常由玻璃组成，并且可以使用透过性膜，如硝化纤维膜。

在本发明的实际应用中，一种基于寡核苷酸并且由Affymetrix Inc.开发的阵列被作为核苷酸的固定阵列方法的示例。在寡核苷酸阵列中，寡核苷酸在原位合成。例如，已知的寡核苷酸原位合成方法包括如，光蚀刻技术(photolithography)(Affymetrix Inc.)，固定化学物质的喷墨技术(ink-jettechnique)(Rosetta Inpharmatics LLC Co.)等等。所有这些技术都可以被用来制造本发明的基板。

固定在基板上的核苷酸探针的类型并不是关键的，只要能检测到用于本发明的DNA。更具体而言，该探针是例如与序列1所示的DNA进行特异杂交的探针。如果特异杂交是可能的，则该核苷酸探针相对于本发明的DNA不必是完全互补的。

在本发明的实际应用中，当核苷酸被固定时，结合到基板上的核苷酸长度一般为10到100个碱基，优选为10到50个碱基，更优选为15到25个碱基。

在本发明的实际应用中，使DNA样品和基板随后彼此接触。根据这一方法，DNA样品与核苷酸探针杂交。用于杂交的反应溶液和反应条件可以根据包括待固定在基板上的核苷酸长度等在内的因素进行改变，而所述杂交按本领域技术中众所周知的方法来进行。

接下来，根据本发明，可以检测到在DNA样品与固定在基板上的核苷酸探针之间的杂交的有无或者杂交的强度。例如，该检测可以通过诸如用扫描仪等读取荧光信号的办法来实施。应当指出，在DNA阵列里，一般把固定在载片上的DNA称作探针，把溶液中标记的DNA称作目标。因此，固定在基板上的核苷酸在本说明书被作为核苷酸探针加以陈述。上述方法中如果必要的话，将如此检测到的杂交强度与对照相比较。本方法例如DNA阵列法(Tactics of SNP Gene Variation，by Kenichi Matsubara and YosiyukiSakaki，published by Nakayama Shoten，p.128-135，Nature Genetics(1999)22：164-167)等，这些方法能由本领域技术人员通过已知的有关文献而适当地加以实施。

本发明提供了一种基板，在其上固定了本发明的蛋白或蛋白的部分片段。当使用那些基板作为生物芯片时，检测结合本发明的蛋白的分子成为可能，筛选HDAS抑制复合物等成为可能。

通常，固定有蛋白的基板被称作蛋白芯片。同DNA芯片一样，该原理是蛋白以高密度被固定在载片上或者薄膜上以用于检测此间相互作用的蛋白或核酸。

因为与不同类型的HDAC蛋白相结合，本发明的HDART蛋白可以被用于HDAC抑制化合物的筛选。更具体而言，本发明的HDART蛋白在固相表面的固定允许不同类型的HDAC结合到一个表面。当不同类型的化合物被固定到这一固相表面并且测量HDAC活性时，HDAC抑制化合物得以筛选。

通过筛选而收集的HDAC抑制复合物的实例包括在癌症的分化诱导治疗中用作药物的tricostatin A。

本发明固定抗体的基板能被用作生物芯片。分离和纯化的高纯度抗体在芯片表面的固定可以高密度化(densification)。

在本发明一个优选的实施方案中，在将样品点样到基板上之后，那些对点样表面不显示任何亲和力的蛋白或者夹杂物通过冲洗而被溶出。随后的检测步骤可由本领域的技术人员根据基板类型的适当的、已知的处理方法进行操作是可行的，从而检测到亲和力的有无(或亲和力的水平)。例如，能量吸收分子(EAM)被添加到洗净后的基板上，烘干并且通过质谱仪(TOF-MS)测量结合在点样表面的蛋白的分子量范围。

任意一种DNA的固定可以由本领域的技术人员根据已知的方法方便地加以实施。

附图说明

图1表明HDART是TPR(tetra trico pepeide repeat)蛋白，并且显示了它的结构和与相关基因的关系，还显示了HDART的一级结构，并显示了TRP，酸性区，skip相互作用区和CRN同源区。

图2显示人HDART与人CTN的CRN同源区的比较。

图3显示HDART/CRN蛋白-蛋白的系统树。该系统树用GENETYX-MAC程序构建(软件开发)。

图4的照片显示免疫沉淀分析所鉴定的结果，分析的是外源或内源HDART与外源skip之间的相互作用。

(A)显示外源HDART与外源skip之间相互作用的分析结果。条带1是单独的GFP-HDART，条带4是单独的Flag-Skip，条带2和条带3分别表示上述二者在293细胞中的表达，条带5表示不含任何载体的对照。条带1、2、4和5分别指示与抗-flag抗体发生免疫沉淀的样品。条带3指示与对照小鼠IgG发生免疫沉淀的样品。上方的两个图分别显示蛋白的表达，下方的两个图分别显示免疫沉淀。应注意，上面的两个图显示用抗-GFP抗体进行免疫印迹的结果，下面的两个图显示用抗-flag抗体进行免疫印迹的结果。

(B)显示内源HDART与外源Skip之间相互作用的分析结果。将Flag-Skip(条带1)或Flag-萤光素酶(条带2)导入含有内源HDART的293细胞，然后使细胞提取物与抗-flag抗体进行免疫沉淀。同时进行不含载体的对照实验(条带3)。HDART蛋白在细胞中的表达状况(上图)，免疫沉淀的Flag(中图)或HDART(下图)用图左侧显示为“WB”的抗体进行免疫印迹法而加以鉴别。

图5显示Skip和HDART蛋白上相互作用区的鉴别结果。

(A)显示Skip上HDART结合区位点的图谱。加号(+)表示在酵母双杂交系统β-半乳糖苷酶活性基础上检测到相互作用。加号的数量指示相互作用的相对强度。NHR结合：核激素受体结合区，TA：反式活化区。

(B)显示HDART上Skip结合区的图谱，符号定义如上。

图6显示HDART对核激素(视黄酸或糖皮质激素)引起的转录活性的抑制作用。

(A)显示了HDART对由视黄酸活化的转录的浓度依赖性抑制作用的结果。根据在缺乏配体的情况下导入空载体(1.0μg)时所测定的CAT活性为基准而修正的CAT活性也在图中示出。图中还显示了三次重复测量的平均结果以及用于表示S.D.的误差棒。

(B)显示了HDART对由糖皮质激素活化的转录的浓度依赖性抑制作用的结果。

图7的照片显示HDART在细胞中的定位。

(A)显示了内源HDART蛋白的定位。左侧图是用抗-HDART抗体(上图)或免疫前血清(下图)进行免疫荧光染色的结果，右侧图是在左侧图的相应视野中进行DAPI染色的结果。

(B)显示了HDART在活细胞中的定位。图中还显示了将GFP-HDART表达载体(左上)或GFP表达载体(左下)导入Hela细胞后由GFP引起的荧光的观察结果，以及用Hoechest 33342染料(右上)观察细胞核的结果。

图8显示了HDART的自主性启动子抑制活性。

(A)显示，将不同量的Gal4 DBD-HDART表达质粒(0，0.1，0.3，0.5ug)导入载有报告子(萤光素酶)质粒的NIH3T3细胞时，启动子抑制活性的研究结果。根据单独导入空载体所获得的萤光素酶活性(100％)而修正的萤光素酶值也显示在图中。图中还显示了三次重复测量的平均结果以及用于表示S.D.的误差棒。

(B)显示了使用U-20S细胞获得的结果。

图9的照片显示HDART与HDAC之间的直接相互作用。

(A)显示HDART与HDAC之间的相互作用。在将GFP-HDART表达载体和FLAG-HDAC表达载体(条带1；HDAC1，条带3；HDAC3，条带4；HDAC4，条带5；HDAC6)共同转染至293细胞后，采用被抗FLAG免疫沉淀并标记的抗体(抗-Flag抗体或抗-GFP抗体)进行免疫印迹的结果也显示在图中(分别在中图和下图)。应注意，条带2表示仅导入了GFP-HDART的样品。上图显示用免疫沉淀以前的样品确认GFP-HDART蛋白表达的结果。

(B)显示了HDART与HDAC3直接相互作用的结果。

图10显示两种类型的HDAC抑制物质(tricostatin A，丁酸钠)(C，D)对HDART抑制作用的阻遏。

图11包括图表和照片，它们显示HDART N末端的四个TPR(N4TPR)的显性阴性效果。

(A)显示了N4TPR对内源HDART，Skip和相互作用的抑制。在另一项检测中，用Flag-skip和GFP(条带1)或GFP-N4TRP(条带2)转染293细胞，使细胞提取物与抗-Flag抗体进行免疫沉淀，所得沉淀产物用SDS-Page进行分离，最终的结果也显示在图中。下方三个图分别表示：免疫沉淀的Skip(上图)、内源HDART(中图)和N4TPR(下图)。免疫沉淀之前的HDART蛋白表达见最上图。

(B)显示N4TPR对由视黄酸受体引起的转录的活化。

(C)显示N4TPR对由糖皮质激素受体引起的转录的活化。

图12包括图表和照片，它们显示HDART对MM-1-19-P细胞内由视黄酸诱导的分化进行的抑制。将HDART表达载体或空载体导入MM-1-19-P细胞，分析有或无ATRA(2μM)时对分化的诱导。为了鉴定被转导的细胞，将GFP载体与上述的载体一起转染。用标准显微照相术拍摄的GFP绿色荧光照片(12A，12B，12C和12D)以及在相差显微镜下拍摄的照片(12E，12F)也显示在图中。

(A)为ATRA(-)且导入了空载体的样品，(B)为ATRA(+)且导入了空载体的样品，(C)为ATRA(-)且表达了HDART的载体，(D)为ATRA(+)且表达了HDART的载体，(E)是与(C)为同一区域的相差照片，(F)是与(D)为同一区域的相差照片。在(F)中，黑色箭头指示非特异性GFP阳性细胞，白色的箭头指示特异性GFP阳性细胞。在(G)中，图表显示了在GFP阳性细胞中的形态学分化细胞的百分比。四个独立试验的结果用平均值和S.D.(误差棒)表示(在ATRA(+)条件下，模拟与HDART之间P＜1％，student t-检验)。

实施本发明的最佳方式

本发明用实施例进行详细描述，但不应被解释为本发明仅限于此。

[实施例1]

人HDART的克隆

用BLAST数据库检索果蝇(Drosophila)crn基因的人同系物，结果显示源自胰岛的人EST(表达序列标签)克隆#52930与crn基因具有高度同源性。克隆#52930的完整序列按照常规方法确定。另外，根据5’-RACE法(cDNA5’末端快速扩增策略)，将该基因鉴定为由2660个碱基组成的全长cDNA，带有一个长阅读框。应注意，所鉴定的蛋白在结合HDAC(组蛋白脱乙酰基酶)之后起到如下将要描述的阻遏物的作用，并因此被称作“HDART(HDAC结合型阻遏物TPR)”蛋白。HDART是由855个氨基酸编码的高度保守性TPR蛋白(图1)。由DNA序列推定的人HDART蛋白明显表明与人CRN蛋白相似。尤其是，人HDART蛋白的262-770残基区域在HDART和CRN蛋白中高度保守(图1、2)。对多个物种的上述蛋白的遗传分析表明，这些蛋白构成了一个基因家族(图3)。

[实施例2]

HDART与转录共活化物Skip的直接相互作用

我们注意到HDART上存在的多个TPR区域，并分析了是否存在任何能通过这些TPs与HDART发生相互作用的蛋白。

为了分离与HDART结合的蛋白，使用了酵母双杂交系统。更具体地，用酵母MATCHMAKET双杂交分析试剂盒(Clontech)进行分离。插入HDART的ORF全长，使在pAS-1载体(Clontech)中Gal4 DNA结合区与阅读框彼此一致。该诱饵质粒随同亚克隆有HeLa cDNA(Clontech)的pACT2捕获质粒一起被转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y190。根据试剂盒所附的操作说明对导入有两种质粒的克隆进行筛选。如此得到约1×107水平的克隆，从而能分离多个克隆。对这些克隆的分析显示，有一个与Skip相一致。

哺乳动物细胞内HDART与Skip之间的相互作用通过免疫沉淀分析确认。为了进行确认，用Effectene试剂盒(QIAGEN)将表达Flag-Skip融合蛋白的Flag-Skip表达载体与表达GFP-HDART融合蛋白的GFP-HDART表达载体(图4A)转染到HEK293细胞。应注意，对照实验是将Flag-Skip表达载体和GFP-HDART表达载体在相同条件下分别转染到相同类型的细胞中。

转染24小时后，将细胞置于含有10μl蛋白酶抑制物质混合物(Sigma#p8340)的100μl Nonidet P-40缓冲液(50mM tris HCL(pH7.6)，150mM NaCl，5mM EDTA，0.5％Nonidet P-40，1mM PMSF)中，在冰上静置30分钟，进行细胞溶解，以便制备细胞提取物(1mg)。将该提取物与40μl蛋白A/GSepharose一起于4℃保温30分钟以达到初步澄清。再将上述澄清的上清液提取物与抗-Flag抗体或阴性对照小鼠IgG抗体(2μg)一起保温1小时，然后用40μl蛋白A/G Sepharose珠沉淀30分钟。所得免疫沉淀物用Nonidet P-40缓冲液洗4次。结合的蛋白在SDS-加载缓冲液中从A/G Sepharose珠上解离，洗脱物通过SDS-PAGE展开。之后，转移到膜上，接下来用常规方法对膜进行免疫印迹。用抗-FLAG抗体M2(Sigma)和抗-GFP单克隆抗体锥(cone)1E4(MBL)作为免疫印迹抗体。

免疫沉淀分析的结果显示于图4A中。在该图中，上方两个图显示各自蛋白的表达结果，下方两个图显示免疫沉淀的结果。如图4A所示，只有当上述两种符合蛋白都被表达时，GFP-HDART蛋白才能与Flag-Skip融合蛋白一起借助抗-Flag抗体产生免疫沉淀反应(条带2)。在没有FLAG-skip表达的情况下，未观察到GFP-HDART被抗-FLAG抗体沉淀(条带1)，同样的，在使用阴性对照抗体的情况下，也未观察到沉淀(条带3)。这些结果提示HDART和Skip在体内特异地相互作用。

进一步，对内源HDART与外源导入的Skip之间的相互作用进行分析。用Flag-skip表达载体或者Flag-萤光素酶表达载体转染293细胞(既高表达HDART的细胞)，24小时后用上述同样的方法制备细胞提取物。将该细胞提取物与抗-Flag抗体一起温育，进行免疫沉淀。将免疫沉淀前的免疫复合物或细胞提取物用SDS-PAGE展开，然后转移到膜上。同一膜用抗-HDART抗体或抗-Flag抗体进行免疫印迹。结果显示于图4B。应注意，在图4B中，上图显示细胞提取物用抗-HDART抗体进行免疫印迹的结果，中图显示用抗-Flag抗体进行免疫沉淀后，用抗-Flag抗体进行免疫印迹的结果，下图显示用抗-Flag抗体进行免疫沉淀后，用抗-HDART抗体进行免疫印迹的结果。

如图4B所示，HDART只有在表达Flag-Skip的条件下才能借助抗-Flag抗体共沉淀(图4B，条带1)，而在有Flag-Luc蛋白表达(条带2)以及无任何转染的亲本293克隆(条带3)的条件下，没有观察到共沉淀。

[实施例3]

HDART与Skip的结合区

为了定为Skip上参与与HDART的相互作用的区域，检测了Skip不同区域(N末端区(密码子1-220)，核激素结合区(NHR结合，密码子221-388)以及反式活化区(TA，密码子438-536))中的一系列缺失突变。使用实施例2提到的Gal4DBD-HDART，按照酵母双杂交分析法，对HDART和突变的Skip之间的相互作用进行了分析。分析结果显示于图5A中。图5A右侧显示的符号“+”表示，通过β-半乳糖苷酶活性的filter lift分析观察到的相互作用，“+”号的数量表明相互作用的相对强度。符号“-”表示没有检测到相互作用。

如图5A中所示，我们发现两个不同的区域参与了与HDART的相互作用。者两个区域一个在97-119残基内，另一个在220-437残基内。另外还显示，Skip的反式活化区很少参与与HDART的结合活性。用类似的方法分析HDART上参与与Skip的相互作用的区域。更具体地，制备Gal4DBD-HDART的各种等位基因缺失突变，通过与Gal4DBD-Skip的相互作用分析半乳糖激酶。分析结果见图5B，它们证实包括四个TPRs(1-179残基)在内的N-末端区确保了与Skip最大程度的相互作用(图5B)。因此，HDART能通过N-末端的四TPR区直接与Skip发生相互作用。

[实施例4]

HDART对核内受体随引起的基因转录的抑制

由于上述实施例显示HDART能与Skip相互作用，分析了HDART对核内受体引起的转录途径的作用。首先，分析了HDART对由视黄酸受体进行的转录调控的作用。为此目的，用RAR(视黄酸受体)进行CAT分析，在该受体中，掺入胸苷激酶最小启动子(pTREpal-tata)，且其中视黄醛衍生物反应元件下游使用的是CAT基因。

更具体地，用Effectene试剂盒(QIAGEN)将RAR报告质粒和能稳定表达HDART的pcDNA3-HDART同时转染至HepG2细胞。应注意，pcDNA3-HDART表达载体的导入量为0，0.5和1.0μg，并且每次转染中的DNA量在pcDNA空载体控制下均为相同的1μg。转染之后，在有或无ARTA(10^-8M)的情况下进行培养以检测当时的CAT活性。根据无ATRA时导入1.0μg空载体所获得的CAT活性，修正测量值，结果见图6。图中还显示了三次实验结果的平均值以及根据误差棒表示的标准偏差。

如图6A所示，细胞中导入空载体后，在ATRA的作用下，CAT的活性是未导入时的5倍。然而，对这种ARTA诱导的CAT活性的抑制取决于HDART的浓度。

进一步，HDART对糖皮质激素受体(GR)的转录调控的作用通过使用GR阳性Hela细胞内的GR报告质粒而加以分析。除了使用Hela细胞以及10^-8M地塞米松外，按照与视黄酸受体实验相同的方式进行糖皮质激素应答性启动子的转录活性的测试。测试的结果以与上面相同方式显示。

HDART的共同表达受到抑制，且抑制程度与RAR(视黄酸受体)诱导的反式活化的观察结果相似，因此与糖皮质激素相关的报告基因的活化也受到抑制(图6B)。这些结果显示HDART选择性抑制由核内受体活化的转录。

[实施例5]

HDART在细胞核中的定位

由于HDART显示出直接参与了转录控制，因此假定HDART定位在细胞核。在此基础上，制备出针对HDART重组蛋白的多克隆抗体，通过免疫荧光实验分析HDART在细胞内的定位。

在大肠杆菌(Escherichia coli)中制备His-HDART(氨基酸残基296-431)融合蛋白形式的多克隆抗体，用对His具有亲和力的Ni-NTA树脂(QIAGEN)纯化。接下来，用His-HDART蛋白免疫兔子，产生的抗-HDART抗血清用ProtOn试剂盒1(MPS)通过亲和层析纯化。如此纯化的兔抗-HDART抗体与含有内源HDART的Hela细胞一起保温，再与PE(藻红蛋白)融合的兔抗体一起保温，进行免疫荧光染色。需要注意的是，对照实验是在免疫前使用兔血清取代兔抗HDART抗体并重复类似的步骤。另外，为了明确在核中的位置，还进行了DAPI染色。

如图7A所示，使用抗-HDART抗体进行免疫荧光染色的图像与用DAPI染色的图像一致。另一方面，免疫前的血清中核未被染色。从这些结果可以看出，HDART主要定位在Hela细胞的核内(图7)。

分析了HADRT在活细胞中的定位。用GFP或GFP-HDART表达载体转染Hela细胞。24小时后，检测GFP荧光。GFP-HDART细胞用Hoechest 33342染料进行保温，从而使核可见。

如图7B中所示，在被GFP-HDART载体转染的细胞中，用Hoechest 33342染料(右上图)观察到核发出GFP荧光(左上图)。尤其是，GFP-HDART显示出与迄今报导的Skip分子的核斑点图案部分相似的图案。在HT1080细胞和293细胞中也观察到相似的结果(未显示)。

[实施例6]

HDART引起的自主抑制功能

假定HDART参与了更加直接的抑制作用，预计它有自主抑制功能。为了确认上述预计，将能使HDART与DNA相结合的全长HDART cDNA与到Gal4 DNA结合区(GAL4DBD：一个仅具有与GAL4 DNA相结合的区、不具有转录控制区的区域)融合，分析在NIH3T3细胞内由GAL4A启动子引起的转录过程是否可以控制。

更具体地，将能表达HDART全长蛋白与Gal4 DBD的融合蛋白的Gal4DBD-HDART质粒以不同的量(0，0.1，0.3和0.5ug)转染至事先已导入了Gal4报告质粒(pGal4-萤光素酶)的NIH3T3细胞。应注意，为了使转染所用的DNA的总量相一致，在每次转染时用Gal4 DBD空载体将表达载体的量控制在0.5μg。转染24小时以后，分析由启动子引起的报告基因的表达活性(萤光素酶活性)。每份试样的萤光素酶活性表示为，根据单独导入空载体所获得的萤光素酶活性参考值(％)而修正的值(图8)。应注意，分析的结果表示为三次实验结果的平均值，标准偏差以误差棒表示(图8A)。用另一种细胞U-20S以及Gal4 DBD-HDART(0或0.5μg)进行类似的分析(图8B)。

HDART以浓度依赖方式明显抑制NIH-3T3细胞内的启动子活性，在最高浓度(0.5ug)使萤光素酶表达降低了80％(图8A)。使用U-20S细胞(图8B)观测到相似的结果。这些结果显示，HDART自身具有自主转录抑制作用。

对于不具有GAL4 DNA结合区的HDART，没有观察到萤光素酶的表达抑制(未显示)。可见，HDART不具备启动子区与DNA结合的活性。

[实施例7]

归因于HDART的抑制机制

有报道认为，通过实现这一机制，快速转录通过一种有HDAC(组蛋白脱乙酰基酶)抑制作用参与的机制而受HAT(组蛋白乙酰基酶)活化以及核心组蛋白乙酰化的程度的调控。为了说明由HDART引起的遗传抑制机制，根据用Flag-HDAC表达载体所进行的免疫沉淀分析，检测HDART的这种作用是否通过与HDAC形成复合体来表现。

能表达不同类型HDAC(1，3，4，或6)的Flag-HDAC表达载体和GFP-HDART表达载体以与实施例2相应的方式分别与293细胞共转染，在转染24小时后提供细胞提取物。各自的细胞提取物与抗-Flag抗体一起保温，接下来进行免疫沉淀反应。所得免疫沉淀物用SDS-PAGE分离，将分离模式转移到膜上，用抗-Flag抗体或抗-GFP抗体进行免疫印迹。作为参考，为了确认GFP-HDART蛋白在各自细胞中的表达，免疫沉淀反应前的各个样品用SDS-PAGE进行同样的展开，用抗-GFP抗体进行免疫印迹。应注意，图9A中，上图显示免疫沉淀反应前的GFP-HDART蛋白的表达结果，中图显示物免疫沉淀用抗-Flag抗体进行免疫印迹的结果，下图显示免疫沉淀物用抗-GFP抗体进行免疫印迹的结果。图左侧如下显示HDAC的类型：条带1；HDAC1，条带3；HDAC3，条带4；HDAC4，条带5；HDAC6。应注意，条带2是仅仅由GFP-HDAR表达的样品。

如图9A所示，在用Flag-HDAC表达载体和GFP-HDART表达载体共转染的293细胞的提取物中，确认GFP-HDART与抗-Flag抗体发生免疫沉淀(下图左起，条带1，3，4，5)。但是，当加入抗-Flag抗体时(下图，条带2)，在缺少Flag-HDAC(未导入Flag-HDAC表达载体的细胞系)的条件下没有观察到GFP-HDART沉淀。因此，证实GFP-HDART与抗-Flag抗体的沉淀依赖于Flag-HDAC与GFP-DART之间特异性的相互作用。而且，还表明HDART与包括I型(HDAC 1和3)和II型(HDAC 4和6)在内的两种类型HDAC都发生相互作用。

进一步，通过GST pulldown分析检测HDART与HDAC3之间的直接相互作用。GST pulldown分析基本上按照已知方法进行(Tzamarias，D.，andStruhl，K.(1995)Gene Dev 9(7)，821-31.)。使用TNT(注册商标)体外转录/翻译系统(Promega)，在³⁵S-蛋氨酸存在的条件下进行HDAC3的体外翻译。GST蛋白或者GST-HDART融合蛋白分别在大肠杆菌中表达，接下来，在GST结合缓冲溶液(50mM tris-Hcl，200mM Licl，0.5％ NP40，5mM EDTA，1mMPMSF)中利用glutachion Sepharose进行纯化。制备1ml GST结合缓冲溶液，其中有包含GST-HDART融合蛋白或对照GST蛋白(大约1μg)的结合反应溶液和1ml ³⁵S-放射标记的体外翻译产物(10μl)。将该反应溶液4℃振荡保温1小时，然后将所得Sepharose-GST蛋白复合物用GST结合缓冲溶液洗5次。与GST蛋白结合的蛋白通过在含有十二烷基硫酸钠(SDS)的样品缓冲液中煮沸而解离，接下来用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。通过考马斯亮兰(Coomassie brilliant blue)染色证实，GST融合蛋白进行同等地泳动，通过放射自显影检测到³⁵S-放射标记的HDAC。

如图9B所示，体外翻译的HDAC3并不与纯GST结合且不能被洗脱下来(pull down)，但在使用GST-HDART融合蛋白时被洗脱下来(图9B)。从HDAC1可获得同样结果，但未在附图中显示。由此可见，HDART和HDAC之间的相互作用事实上是直接的。

为了分析HDART转录抑制作用对HADC脱乙酰化的影响，在有特异性抑制HDAC的tricostatin A(TSA)存在的条件下，采用与实施例4同样的方式进行CAT报告子分析(图10C和D)。但是，在该实施例中，一定量的pcDNA3-HDART表达载体(1μg)(图10中“HDART+”)和100nM TSA或1mA丁酸钠与配体(ATRA或地塞米松)一起添加。

如图10C和D所示，与单独的配体对应的启动子所导致报告基因的表达增加了，其中当HDART表达时，表达活性受到抑制。当进一步加入triconstatin A时，HDART引起的表达抑制被完全抵消。当加入另一种类型组蛋白脱乙酰基酶抑制因子和丁酸钠(Buty)时观察到了相同的结果。这些结果说明，HDART的转录抑制作用通过脱乙酰基酶活性来表现。

[实施例8]

HDART-Skip相互作用对配体未结合型受体的主动抑制

在体内(Baniahmad，A.，Kohne，A.C.，and Renkawitz，R.(1992)Embo J11(3)，1015-23)和体外(Fondell，J.D.，Roy，A.L.，and Roeder，R.G.(1993)GenesDev 7(7B)，1400-10)缺少配体的情况下，RAR和TR抑制基因活性。因此这被称作主动抑制。Skip在不依赖于配体的情况下与NHR相互作用(MacDonald，P.N.，Baudino，T.A.，Toumaru，H.Dowd，D.R.，and zhang，C.(2001)Steroids 66(3-5)，171-6)。这些抑制效果与Skip生理学的关系提示，配体未结合型受体表面可能存在HDART-Skip复合体或者所述相互作用可能参与受体的主动抑制。为了澄清这些可能性，使HDART显性阴性株过度表达，以此检测RAR对转录的影响。如实施例2所示，HDART N末端的四个TRP(N4TRP)属于Skip结合区，从而可以预计，当这一区域的表达抑制内源HDART与Skip之间的相互作用时，HDART作为显性阴性肽的固有功能被抑制。为此，本实施例中用N4TPR作为显性阴性肽的候选者。

Flag-Skip与带有GFP标记的N4TPR，或与GFP一起被转染至293细胞。转染24小时后，制备细胞提取物，用抗-Flag抗体进行免疫沉淀反应。所得免疫沉淀产物通过SDS-PAGE分离。为了确认免疫沉淀反应前的内源HDART的表达，将免疫沉淀反应前的细胞提取物同样用SDS-PAGE分离。分离后的图案拷贝到膜上。用抗-Flag抗体检测Flag-Skip的表达，用抗-GFP抗体检测GFP和GFP-N4TPR的表达，用抗-HDART抗体检测内源HDART的表达(图11A)。应注意，在图11A中，下面的三个图分别显示沉淀的Skip(下面三个图中最上图)，内源HDART(下面三个图中的中间图)，和N4TPR(下面三个图中的最下图)，上面的一个图显示了免疫沉淀反应前的内源HDART的表达。

如图11A所示，N4TPR的表达导致HDART与Skip共沉淀的量相比于N4TPR未表达的对照(仅GFP，条带1)来讲更加减少(下部中图，条带2)。另一方面，N4TPR的过表达使得N4TPR和Skip之间的相互作用增加，并且共沉淀的Skip的量明显增加(条带2，下面的底部条板)。对照蛋白(GFP)的表达没有表现出对HDAR和Skip之间的相互作用(条带1)产生影响。这些结果显示，N4TPR起到代替HDART而与Skip相互作用的显性阴性蛋白的作用。

其次，检测了N4TRP的过表达对于RAR或糖皮质激素应答性启动子所导致的转录的影响。应注意，该检测采用实施例4中报告子分析所用的相同方法进行，但使用了GFP-N4TPR表达载体(0，0.3和0.5μg)。

该结果如图11B，C所示，其中与在缺乏配体时限制N4TPR的情况下(导入量0.3μg)相比，由RAR或糖皮质激素应答性启动子诱导的转录活性增强，达到了在有配体存在时允许表达的情况下所诱导的转录活性(灰柱)的程度。在N4TPR的最高表达水平(导入量：0.5μg)，缺乏配体时的转录活性被显著增强(达到约20倍)。这些结果提示，HDART是主动抑制RAR和糖皮质激素受体等核激素受体所必需的。

[实施例9]

通过HDART的过表达来抑制视黄酸诱导横纹肌肉瘤细胞系分化为肌肉组织

已知ATRA(全反式视黄酸)是肿瘤细胞分化的重要诱导剂(20-22)。人横纹肌肉瘤细胞系MM-1-19-P主要由多角形细胞组成，并最终由视黄酸诱导分化为肌管状巨细胞。为了明确HDART在归因于核激素受体的反应中的生理学作用，分析了HDART表达对ATRA所致MM-1-19-P分化的影响。

将MM-1-19-P细胞置于100mM Petri培养皿中，用0.4μg pGFP载体和2μg pcDNA3(空载体)或pcDNA3-HDART(HDART表达载体)共转染。转染24小时后，将培养基替换为含有ATRA(2μM)或不含ATRA的新鲜培养基。诱导24小时后，在细胞变为具有肌管状巨细胞表型的细长纺锤形细胞时，评价该细胞已有形态学分化。所有试验重复4次，GFP阳性用所评价的细胞数确定。该结果见图12。应注意，在图12中，GFP绿色荧光的标准显微照片见图12A、12B、12C和12D，相差显微照片见图12E和12F。图12A显示未经ATRA处理但导入了空载体的细胞，12B显示经过ATRA处理且导入了空载体的细胞，12C显示未经ATRA处理但导入了HDART表达载体的细胞，12D显示经过ATRA处理且导入了HDART表达载体的细胞，12E显示与12C同样条件下的细胞，12F显示与12D同样条件下细胞。此外，图12F中的黑色箭头显示未分化的GFP阳性细胞，白色箭头显示分化的细胞。图12G的图表显示GFP阳性细胞中形态分化细胞的百分比，其表示为四个独立试验的平均值，标准偏差用误差棒表示(在空载体和ATRA(+)和HDART表达载体之间P＜1％，Student t检验)。

在各个实验中，GFP阳性细胞数为30-70。在导入了空载体并经ATRA处理的细胞中，由于ATRA所诱导的细胞毒性，GFP阳性细胞数不到30％。在导入了HDART表达载体的细胞中，ATRA处理组和非处理组的GFP阳性细胞数是相同的。

大多数导入了空载体的细胞分化为具有肌管状巨细胞表型的肌肉组织(图12B，12G)。在导入了空载体的细胞中，ATRA处理引起表型变化的程度对于阳性和阴性细胞是等同的。但是，在导入了HDART的细胞中，当GFP阳性细胞受到ATRA处理时，表型变化很少(图12D，12G中的黑色箭头)。另一方面，在GFP阴性细胞中，可观察到特征性肌管状巨细胞(图12F中的白色箭头)。这些结果表明，HDART的表达可抑制视黄酸诱导的分化。所述结果与报告子分析中HDART抑制RAR转录活性的结果一致。这些结果揭示，HDART至少作为视黄酸受体生理性转录的共阻遏物而起作用。

工业实用性

如上所述，本发明的转录阻遏物可以自主抑制转录，特别是核内受体的转录，并因此作用于所需转录系统，和用于抑制转录系统的转录。并且，本发明的转录阻遏物具有HDAC结合能力，可通过HDAC的组蛋白脱乙酰化活性来发挥转录抑制能力。因此，用本发明的转录阻遏物可以募集HDAC，从而借助HDAC作用来抑制转录。本发明转录阻遏物的这一作用可适用于例如因核内受体转录增加而导致的疾病。本发明的转录阻遏物可作为用于治疗这些疾病的药物。

转录阻遏物的显性阴性肽可作为转录活性因子起作用。因此，显性阴性肽能用于促进转录。该显性阴性肽也可作用于核内受体的转录和反向促进转录。因此，该肽可作为核内受体的转录促进物质。尤其是，在HDARTN末端的4个TRR(N4TPR)具有比ATRA更高的视黄酸受体转录活性，因此，本发明的肽适于在目前采用ATRA进行的疾病治疗中(例如在恶性肿瘤的分化诱导治疗中)代替ATRA或与ATRA一起作为治疗药物。

序列表

<110>水谷修纪(MIZUTANI，Shuki)

山田孝之(YAMADA，Takayuki)

<120>参与转录调控的因子

<130>SEN-A0122P

<140>

<141>

<150>JP 2002-217233

<151>2002-07-25

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>2684

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(37)..(2601)

<400>1

agcgcgcgac tctcctgtac ctgggcatcc agaaaa atg gtg gtg atg gcg cga 54

Met Val Val Met Ala Arg

1 5

ctt tcg cgg ccc gag cgg ccg gac ctt gtc ttc gag gaa gag gac ctc 102

Leu Ser Arg Pro Glu Arg Pro Asp Leu Val Phe Glu Glu Glu Asp Leu

10 15 20

ccc tat gag gag gaa atc atg cgg aac caa ttc tct gtc aaa tgc tgg 150

Pro Tyr Glu Glu Glu Ile Met Arg Asn Gln Phe Ser Val Lys Cys Trp

25 30 35

ctt cgc tac atc gag ttc aaa cag ggc gcc ccg aag ccc agg ctc aat 198

Leu Arg Tyr Ile Glu Phe Lys Gln Gly Ala Pro Lys Pro Arg Leu Asn

40 45 50

cag cta tac gag cgg gca ctc aag ctg ctg ccc tgc agc tac aaa ctc 246

Gln Leu Tyr Glu Arg Ala Leu Lys Leu Leu Pro Cys Ser Tyr Lys Leu

55 60 65 70

tgg tac cga tac ctg aag gcg cgt cgg gca cag gtg aag cat cgc tgt 294

Trp Tyr Arg Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ala Gln Val Lys His Arg Cys

75 80 85

gtg acc gac cct gcc tat gaa gat gtc aac aac tgt cat gag agg gcc 342

Val Thr Asp Pro Ala Tyr Glu Asp Val Asn Asn Cys His Glu Arg Ala

90 95 100

ttt gtg ttc atg cac aag atg cct cgt ctg tgg cta gat tac tgc cag 390

Phe Val Phe Met His Lys Met Pro Arg Leu Trp Leu Asp Tyr Cys Gln

105 110 115

ttc ctc atg gac cag ggg cgc gtc aca cac acc cgc cgc acc ttc gac 438

Phe Leu Met Asp Gln Gly Arg Val Thr His Thr Arg Arg Thr Phe Asp

120 125 130

cgt gcc ctc cgg gca ctg ccc atc acg cag cac tct cga att tgg ccc 486

Arg Ala Leu Arg Ala Leu Pro Ile Thr Gln His Ser Arg Ile Trp Pro

135 140 145 150

ctg tat ctg cgc ttc ctg cgc tca cac cca ctg cct gag aca gct gtg 534

Leu Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Ser His Pro Leu Pro Glu Thr Ala Val

155 160 165

cga ggc tat cgg cgc ttc ctc aag ctg agt cct gag agt gca gag gag 582

Arg Gly Tyr Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ser Pro Glu Ser Ala Glu Glu

170 175 180

tac att gag tac ctc aag tca agt gac cgg ctg gat gag gcc gcc cag 630

Tyr Ile Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Arg Leu Asp Glu Ala Ala Gln

185 190 195

cgc ctg gcc acc gtg gtg aac gac gag cgt ttc gtg tct aag gcc ggc 678

Arg Leu Ala Thr Val Val Asn Asp Glu Arg Phe Val Ser Lys Ala Gly

200 205 210

aag tcc aac tac cag ctg tgg cac gag ctg tgc gac ctc atc tcc cag 726

Lys Ser Asn Tyr Gln Leu Trp His Glu Leu Cys Asp Leu Ile Ser Gln

215 220 225 230

aat ccg gac aag gta cag tcc ctc aat gtg gac gcc atc atc cgc ggg 774

Asn Pro Asp Lys Val Gln Ser Leu Asn Val Asp Ala Ile Ile Arg Gly

235 240 245

ggc ctc acc cgc ttc acc gac cag ctg ggc aag ctc tgg tgt tct ctc 822

Gly Leu Thr Arg Phe Thr Asp Gln Leu Gly Lys Leu Trp Cys Ser Leu

250 255 260

gcc gac tac tac atc cgc agc ggc cat ttc gag aag gct cgg gac gtg 870

Ala Asp Tyr Tyr Ile Arg Ser Gly His Phe Glu Lys Ala Arg Asp Val

265 270 275

tac gag gag gcc atc cgg aca gtg atg acc gtg cgg gac ttc aca cag 9l8

Tyr Glu Glu Ala Ile Arg Thr Val Met Thr Val Arg Asp Phe Thr Gln

280 285 290

gtg ttt gac agc tac gcc cag ttc gag gag agc atg atc gct gca aag 966

Val Phe Asp Ser Tyr Ala Gln Phe Glu Glu Ser Met Ile Ala Ala Lys

295 300 305 310

atg gag acc gcc tcg gag ctg ggg cgc gag gag gag gat gat gtg gac 1014

Met Glu Thr Ala Ser Glu Leu Gly Arg Glu Glu Glu Asp Asp Val Asp

315 320 325

ctg gag ctg cgc ctg gcc cgc ttc gag cag ctc atc agc cgg cgg ccc 1062

Leu Glu Leu Arg Leu Ala Arg Phe Glu Gln Leu Ile Ser Arg Arg Pro

330 335 340

ctg ctc ctc aac agc gtc ttg ctg cgc caa aac cca cac cac gtg cac 1110

Leu Leu Leu Asn Ser Val Leu Leu Arg Gln Asn Pro His His Val His

345 350 355

gag tgg cac aag cgt gtc gcc ctg cac cag ggc cgc ccc cgg gag atc 1158

Glu Trp His Lys Arg Val Ala Leu His Gln Gly Arg Pro Arg Glu Ile

360 365 370

atc aac acc tac aca gag gct gtg cag acg gtg gac ccc ttc aag gcc 1206

Ile Asn Thr Tyr Thr Glu Ala Val Gln Thr Val Asp Pro Phe Lys Ala

375 380 385 390

aca ggc aag ccc cac act ctg tgg gtg gcg ttt gcc aag ttt tat gag 1254

Thr Gly Lys Pro His Thr Leu Trp Val Ala Phe Ala Lys Phe Tyr Glu

395 400 405

gac aac gga cag ctg gac gat gcc cgt gtc atc ctg gag aag gcc acc 1302

Asp Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ala Arg Val Ile Leu Glu Lys Ala Thr

410 415 420

aag gtg aac ttc aag cag gtg gat gac ctg gca agc gtg tgg tgt cag 1350

Lys Val Asn Phe Lys Gln Val Asp Asp Leu Ala Ser Val Trp Cys Gln

425 430 435

tgc gga gag ctg gag ctc cga cac gag aac tac gat gag gcc ttg cgg 1398

Cys Gly Glu Leu Glu Leu Arg His Glu Asn Tyr Asp Glu Ala Leu Arg

440 445 450

ctg ctg cga aag gcc acg gcg ctg cct gcc cgc cgg gcc gag tac ttt 1446

Leu Leu Arg Lys Ala Thr Ala Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Tyr Phe

455 460 465 470

gat ggt tca gag ccc gtg cag aac cgc gtg tac aag tca ctg aag gtc 1494

Asp Gly Ser Glu Pro Val Gln Asn Arg Val Tyr Lys Ser Leu Lys Val

475 480 485

tgg tcc atg ctc gcc gac ctg gag gag agc ctc ggc acc ttc cag tcc 1542

Trp Ser Met Leu Ala Asp Leu Glu Glu Ser Leu Gly Thr Phe Gln Ser

490 495 500

acc aag gcc gtg tac gac cgc atc ctg gac ctg cgt atc gca aca ccc 1590

Thr Lys Ala Val Tyr Asp Arg Ile Leu Asp Leu Arg Ile Ala Thr Pro

505 510 515

cag atc gtc atc aac tat gcc atg ttc ctg gag gag cac aag tac ttc 1638

Gln Ile Val Ile Asn Tyr Ala Met Phe Leu Glu Glu His Lys Tyr Phe

520 525 530

gag gag agc ttc aag gcg tac gag cgc ggc atc tcg ctg ttc aag tgg 1686

Glu Glu Ser Phe Lys Ala Tyr Glu Arg Gly Ile Ser Leu Phe Lys Trp

535 540 545 550

ccc aac gtg tcc gac atc tgg agc acc tac ctg acc aaa ttc att gcc 1734

Pro Asn Val Ser Asp Ile Trp Ser Thr Tyr Leu Thr Lys Phe Ile Ala

555 560 565

cgc tat ggg ggc cgc aag ctg gag cgg gca cgg gac ctg ttt gaa cag 1782

Arg Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Glu Arg Ala Arg Asp Leu Phe Glu Gln

570 575 580

gct ctg gac ggc tgc ccc cca aaa tat gcc aag acc ttg tac ctg ctg 1830

Ala Leu Asp Gly Cys Pro Pro Lys Tyr Ala Lys Thr Leu Tyr Leu Leu

585 590 595

tac gca cag ctg gag gag gag tgg ggc ctg gcc cgg cat gcc atg gcc 1878

Tyr Ala Gln Leu Glu Glu Glu Trp Gly Leu Ala Arg His Ala Met Ala

600 605 610

gtg tac gag cgt gcc acc agg gcc gtg gag ccc gcc cag cag tat gac 1926

Val Tyr Glu Arg Ala Thr Arg Ala Val Glu Pro Ala Gln Gln Tyr Asp

615 620 625 630

atg ttc aac atc tac atc aag cgg gcg gcc gag atc tat ggg gtc acc 1974

Met Phe Asn Ile Tyr Ile Lys Arg Ala Ala Glu Ile Tyr Gly Val Thr

635 640 645

cac acc cgc ggc atc tac cag aag gcc att gag gtg ctg tcg gac gag 2022

His Thr Arg Gly Ile Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Val Leu Ser Asp Glu

650 655 660

cac gcg cgt gag atg tgc ctg cgg ttt gca gac atg gag tgc aag ctc 2070

His Ala Arg Glu Met Cys Leu Arg Phe Ala Asp Met Glu Cys Lys Leu

665 670 675

ggg gag att gac cgc gcc cgg gcc atc tac agc ttc tgc tcc cag atc 2118

Gly Glu Ile Asp Arg Ala Arg Ala Ile Tyr Ser Phe Cys Ser Gln Ile

680 685 690

tgt gac ccc cgg acg acc ggc gcg ttc tgg cag acg tgg aag gac ttt 2166

Cys Asp Pro Arg Thr Thr Gly Ala Phe Trp Gln Thr Trp Lys Asp Phe

695 700 705 710

gag gtc cgg cat ggc aat gag gac acc atc aag gaa atg ctg cgt atc 2214

Glu Val Arg His Gly Asn Glu Asp Thr Ile Lys Glu Met Leu Arg Ile

715 720 725

cgg cgc agc gtg cag gcc acg tac aac acg cag gtc aac ttc atg gcc 2262

Arg Arg Ser Val Gln Ala Thr Tyr Asn Thr Gln Val Asn Phe Met Ala

730 735 740

tcg cag atg ctc aag gtc tcg ggc agt gcc acg ggc acc gtg tct gac 2310

Ser Gln Met Leu Lys Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly Thr Val Ser Asp

745 750 755

ctg gcc cct ggg cag agt ggc atg gac gac atg aag ctg ctg gaa cag 2358

Leu Ala Pro Gly Gln Ser Gly Met Asp Asp Met Lys Leu Leu Glu Gln

760 765 770

cgg gca gag cag ctg gcg gct gag gcg gag cgt gac cag ccc ttg cgc 2406

Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Glu Ala Glu Arg Asp Gln Pro Leu Arg

775 780 785 790

gcc cag agc aag atc ctg ttc gtg agg agt gac gcc tcc cgg gag gag 2454

Ala Gln Ser Lys Ile Leu Phe Val Arg Ser Asp Ala Ser Arg Glu Glu

795 800 805

ctg gca gag ctg gca cag cag gtc aac ccc gag gag atc cag ctg ggc 2502

Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gln Val Asn Pro Glu Glu Ile Gln Leu Gly

810 815 820

gag gac gag gac gag gac gag atg gac ctg gag ccc aac gag gtt cgg 2550

Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Met Asp Leu Glu Pro Asn Glu Val Arg

825 830 835

ctg gag cag cag agc gtg cca gcc gca gtg ttt ggg agc ctg aag gaa 2598

Leu Glu Gln Gln Ser Val Pro Ala Ala Val Phe Gly Ser Leu Lys Glu

840 845 850

gac tgacccgtcc ctcccccatc ccccctcccc accccctccc caatacagct 2651

Asp

855

acgtttgtac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2684

<210>2

<211>855

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Met Val Val Met Ala Arg Leu Ser Arg Pro Glu Arg Pro Asp Leu Val

1 5 10 15

Phe Glu Glu Glu Asp Leu Pro Tyr Glu Glu Glu Ile Met Arg Asn Gln

20 25 30

Phe Ser Val Lys Cys Trp Leu Arg Tyr Ile Glu Phe Lys Gln Gly Ala

35 40 45

Pro Lys Pro Arg Leu Asn Gln Leu Tyr Glu Arg Ala Leu Lys Leu Leu

50 55 60

Pro Cys Ser Tyr Lys Leu Trp Tyr Arg Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ala

65 70 75 80

Gln Val Lys His Arg Cys Val Thr Asp Pro Ala Tyr Glu Asp Val Asn

85 90 95

Asn Cys His Glu Arg Ala Phe Val Phe Met His Lys Met Pro Arg Leu

100 105 110

Trp Leu Asp Tyr Cys Gln Phe Leu Met Asp Gln Gly Arg Val Thr His

115 120 125

Thr Arg Arg Thr Phe Asp Arg Ala Leu Arg Ala Leu Pro Ile Thr Gln

130 135 140

His Ser Arg Ile Trp Pro Leu Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Ser His Pro

145 150 155 160

Leu Pro Glu Thr Ala Val Arg Gly Tyr Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ser

165 170 175

Pro Glu Ser Ala Glu Glu Tyr Ile Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Arg

180 185 190

Leu Asp Glu Ala Ala Gln Arg Leu Ala Thr Val Val Asn Asp Glu Arg

195 200 205

Phe Val Ser Lys Ala Gly Lys Ser Asn Tyr Gln Leu Trp His Glu Leu

210 215 220

Cys Asp Leu Ile Ser Gln Asn Pro Asp Lys Val Gln Ser Leu Asn Val

225 230 235 240

Asp Ala Ile Ile Arg Gly Gly Leu Thr Arg Phe Thr Asp Gln Leu Gly

245 250 255

Lys Leu Trp Cys Ser Leu Ala Asp Tyr Tyr Ile Arg Ser Gly His Phe

260 265 270

Glu Lys Ala Arg Asp Val Tyr Glu Glu Ala Ile Arg Thr Val Met Thr

275 280 285

Val Arg Asp Phe Thr Gln Val Phe Asp Ser Tyr Ala Gln Phe Glu Glu

290 295 300

Ser Met Ile Ala Ala Lys Met Glu Thr Ala Ser Glu Leu Gly Arg Glu

305 310 315 320

Glu Glu Asp Asp Val Asp Leu Glu Leu Arg Leu Ala Arg Phe Glu Gln

325 330 335

Leu Ile Ser Arg Arg Pro Leu Leu Leu Asn Ser Val Leu Leu Arg Gln

340 345 350

Asn Pro His His Val His Glu Trp His Lys Arg Val Ala Leu His Gln

355 360 365

Gly Arg Pro Arg Glu Ile Ile Asn Thr Tyr Thr Glu Ala Val Gln Thr

370 375 380

Val Asp Pro Phe Lys Ala Thr Gly Lys Pro His Thr Leu Trp Val Ala

385 390 395 400

Phe Ala Lys Phe Tyr Glu Asp Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ala Arg Val

405 410 415

Ile Leu Glu Lys Ala Thr Lys Val Asn Phe Lys Gln Val Asp Asp Leu

420 425 430

Ala Ser Val Trp Cys Gln Cys Gly Glu Leu Glu Leu Arg His Glu Asn

435 440 445

Tyr Asp Glu Ala Leu Arg Leu Leu Arg Lys Ala Thr Ala Leu Pro Ala

450 455 460

Arg Arg Ala Glu Tyr Phe Asp Gly Ser Glu Pro Val Gln Asn Arg Val

465 470 475 480

Tyr Lys Ser Leu Lys Val Trp Ser Met Leu Ala Asp Leu Glu Glu Ser

485 490 495

Leu Gly Thr Phe Gln Ser Thr Lys Ala Val Tyr Asp Arg Ile Leu Asp

500 505 510

Leu Arg Ile Ala Thr Pro Gln Ile Val Ile Asn Tyr Ala Met Phe Leu

515 520 525

Glu Glu His Lys Tyr Phe Glu Glu Ser Phe Lys Ala Tyr Glu Arg Gly

530 535 540

Ile Ser Leu Phe Lys Trp Pro Asn Val Ser Asp Ile Trp Ser Thr Tyr

545 550 555 560

Leu Thr Lys Phe Ile Ala Arg Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Glu Arg Ala

565 570 575

Arg Asp Leu Phe Glu Gln Ala Leu Asp Gly Cys Pro Pro Lys Tyr Ala

580 585 590

Lys Thr Leu Tyr Leu Leu Tyr Ala Gln Leu Glu Glu Glu Trp Gly Leu

595 600 605

Ala Arg His Ala Met Ala Val Tyr Glu Arg Ala Thr Arg Ala Val Glu

610 615 620

Pro Ala Gln Gln Tyr Asp Met Phe Asn Ile Tyr Ile Lys Arg Ala Ala

625 630 635 640

Glu Ile Tyr Gly Val Thr His Thr Arg Gly Ile Tyr Gln Lys Ala Ile

645 650 655

Glu Val Leu Ser Asp Glu His Ala Arg Glu Met Cys Leu Arg Phe Ala

660 665 670

Asp Met Glu Cys Lys Leu Gly Glu Ile Asp Arg Ala Arg Ala Ile Tyr

675 680 685

Ser Phe Cys Ser Gln Ile Cys Asp Pro Arg Thr Thr Gly Ala Phe Trp

690 695 700

Gln Thr Trp Lys Asp Phe Glu Val Arg His Gly Asn Glu Asp Thr Ile

705 7l0 715 720

Lys Glu Met Leu Arg Ile Arg Arg Ser Val Gln Ala Thr Tyr Asn Thr

725 730 735

Gln Val Asn Phe Met Ala Ser Gln Met Leu Lys Val Ser Gly Ser Ala

740 745 750

Thr Gly Thr Val Ser Asp Leu Ala Pro Gly Gln Ser Gly Met Asp Asp

755 760 765

Met Lys Leu Leu Glu Gln Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Glu Ala Glu

770 775 780

Arg Asp Gln Pro Leu Arg Ala Gln Ser Lys Ile Leu Phe Val Arg Ser

785 790 795 800

Asp Ala Ser Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gln Val Asn Pro

805 810 815

Glu Glu Ile Gln Leu Gly Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Met Asp Leu

820 825 830

Glu Pro Asn Glu Val Arg Leu Glu Gln Gln Ser Val Pro Ala Ala Val

835 840 845

Phe Gly Ser Leu Lys Glu Asp

850 855

Claims

1.编码转录抑制因子的DNA，包括(A)编码具有序列2所示氨基酸序列的蛋白的DNA，或(B)由序列1所示碱基序列组成的DNA。

2.编码转录抑制因子的DNA，包括(A)编码蛋白的DNA，所述蛋白具有在序列2所示氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一或多个氨基酸所得到的氨基酸序列，或(B)在严格条件下与由序列1所示碱基序列组成的DNA杂交的DNA。

3.转录抑制因子，由权利要求1或2所述的DNA编码。

4.权利要求3的转录抑制因子，其可抑制核激素受体引起的转录。

5.编码能活化转录的肽的DNA，包括(A)编码由序列2的第1-179位所示氨基酸序列组成的肽的DNA，或(B)由序列1的第1-537位碱基所示碱基序列组成的DNA。

6.编码能活化转录的肽的DNA，包括(A)编码肽的DNA，所述肽具有在序列2的第1-179位氨基酸所示氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，或(B)与序列1的第1-537位碱基序列组成的DNA杂交的DNA。

7.转录活化肽，由权利要求5或6的DNA编码。

8.DNA，选自权利要求1、2、5或6之一的DNA并具有至少15个核苷酸的长度。

9.载体，插入了权利要求1、2、5或6之一的DNA。

10.宿主细胞，具有权利要求1、2、5或6之一的DNA或权利要求9的载体。

11.抗体，能结合权利要求3的因子或权利要求7的肽。

12.寡核苷酸探针，其能与权利要求1、2、5或6之一的DNA杂交并具有至少10个核苷酸的长度。

13.基板，固定了以下(A)至(D)之一：

(A)权利要求12的寡核苷酸探针；

(B)权利要求3或4的转录抑制因子或该因子的部分肽；

(C)权利要求7的转录活化肽或该肽的部分肽；

(D)权利要求11的抗体。