KR101083852B1 - 유전자 전사 조절제 및 히스톤 탈아세틸화효소 저해 화합물의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

HDART는 HDAC (히스톤 탈아세틸화 효소)에 결합하여 억제 인자로서 기능한다. 또한, HDART는 핵내 수용체의 전사 보조 활성화 인자로서 기능하는 Skip와 직접 결합하여, 핵내 수용체의 전사를 억제한다. 또한, HDART는 핵내 수용체의 전사보조 억제 인자 중 하나이고, HDAC와 결합하여 HDAC의 히스톤 탈아세틸화에 의해 보다 강력하게 전사를 억제할 수 있다. 한편, HDART의 우성 음성 펩티드도 얻었으며, 이 펩티드는 전장의 HDART 단백질과는 반대로 전사를 활성화시킨다는 것도 확인하였다. 특히, 이 펩티드에 의한 레티노산 수용체의 전사 활성화능은 올-트랜스 레티노산 (all-trans Retinoic Acid; ATRA)을 상회하는 활성을 갖고 있었다.

전사 조절 인자, 전사 억제, 전사 활성화

Description

유전자 전사 조절제 및 히스톤 탈아세틸화효소 저해 화합물의 스크리닝 방법 {A GENE TRANSCRIPTION REGULATOR AND A SCREENING METHOD FOR A COMPOUND INHIBITING HISTONE DEACETYLASE}

본 발명은 전사 조절 인자 등에 관한 것이며, 특히 핵내 호르몬계 수용체에서 기인한 전사를 조절할 수 있는 인자 또는 펩티드에 관한 것이다.

호르몬이나 지용성 비타민 등은 생물의 항상성 유지, 에너지 대사, 분화, 성장 등에 중요한 역할을 하고 있다. 이들 호르몬 등의 수용체는 핵내에 존재하는 전사 조절 인자이고, 크로마틴 DNA의 특정 부위에 결합하여 유전자의 전사 반응을 조절한다. 많은 경우, 호르몬 등의 리간드가 수용체에 결합하지 않은 경우에는 전사가 억제되며, 수용체에 리간드가 결합하면 크로마틴의 구조 변화 등에 의해 전사가 활성화된다. 이 핵내 수용체로부터 전사 장치에 이르는 경로에는 보조 활성화 인자 (co-activator)나 보조 억제 인자 (co-repressor)라고 불리는 많은 인자가 복합체를 형성하여 기능하고 있음이 보고되어 있다. 리간드가 결합하지 않은 수용체에는 히스톤 탈아세틸화 효소를 포함하는 보조 억제 인자 복합체가 결합하여 유전자 발현을 억제하는 한편, 리간드가 결합함으로써 수용체의 구조가 변화되면 보조 억제 인자 복합체가 떨어져 나가고 대신에 히스톤 아세틸화 효소를 포함하는 보조 활성화 인자 복합체가 모이게 된다. 이러한 보조 활성화 인자의 일례로서는 Skip (Ski 상호작용 단백질, 또한 N-CoA62라고도 불리고 있다)가 있고, 몇개의 핵내 수용체 (예를 들면, 비타민 3 수용체, 레티노산 수용체, 에스트로겐 수용체 및 글루코코르티코이드 수용체)와 직접 결합하여 이들 핵내 수용체가 매개하는 유전자 발현을 증강시킬 수 있다 (Baudino, T. A., Kraichely, D. M., Jefcoat, S. C., Jr., Winchester, S. K., Partridge, N. C., and MacDonald, P. N. (1998) J Biol Chem 273 (26), 16434-41; MacDonald, P. N., Baudino, T. A., Tokumaru, H., Dowd, D. R., and Zhang, C. (2001) Steroids 66 (3-5), 171-6).

<발명의 개요>

상술한 바와 같이, 핵내 수용체를 통한 전사의 제어 메카니즘의 개요는 분명해지고 있지만, 그 메카니즘에 어떤 인자가 관여하는지의 해명은 남겨져 있다. 그래서, 본 발명은 전사 조절 인자, 특히 핵내 수용체의 전사 조절에도 관여할 수 있는 새로운 인자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본원 발명자들은 초파리의 crn (crooked neck) 유전자의 인간 상동체의 클로닝 및 그 기능 분석의 연구를 통하여, 이 인간 상동체가 핵내 수용체를 통한 전사 조절에 관여한다는 것을 발견하였다. 또한, 이 초파리 crn 유전자 자체는 배아 형성의 초기 단계에서 발현 수준이 최대가 되는 유전자이고, 이 유전자의 불활성화는 배아 형성의 결함을 일으켜 주로 신경계의 발달에 영향을 미친다는 것이 보고되어 있다 (Zhang, K., Smouse, D., and Perrimon, N. (1991) Genes Dev 5 (6), 1080-91). crn 단백질의 1가지 독특한 특징은 종렬로 방향지어진 테트라 트리코 펩티드 반복부 (TPR; Tetra trico peptide repeat)가 16 카피수로 존재하는 것이다. TPR 은 여러가지 단백질에서 발견되고, 진화 과정을 통해 널리 퍼진 동의성의 34개 아미노산 반복 모티브이다. TPR 단백질이 관여하는 과정으로는 세포 주기 제어, 전사 억제, 스트레스 반응, 단백질 키나아제 억제 및 단백질 수송이 포함된다 (Lamb, J. R., Tugendreich, S., and Hieter, P. (1995) Trends Biochem Sci 20 (7), 257-9).

상기 crn 유전자의 인간 상동체에는, 카피수가 15로 다르기는 하지만 상기 초파리 crn 유전자와 같이 다수의 TPR이 존재한다. 본원 발명자들이 클로닝한 인간 crn 유전자는, 이미 보고되어 있는 전사와 관련한 전사 공액 DNA 복구에 관여하는 단백질 (XAB2)을 코딩하는 유전자 (Yoshimichi et al., Jounal. Biol. Chem. 275: 34931-34937)와 일치하는 것이지만, 본원 발명자들은 본 유전자 산물이 전사 억제에 관여한다는 것을 새롭게 발견하였다. 특히, 본 유전자 산물은 HDAC (히스톤 탈아세틸화 효소)에 결합하여 억제 인자로서 기능하기 때문에, 본 명세서에서는 "HDART (HDAC associated repressor TPR)" 단백질이라 칭한다. 또한, 본원 발명자들은, HDART가 상술한 핵내 수용체의 전사 보조 활성화 인자로서 기능하는 Skip와 직접 결합하여, 핵내 수용체의 전사를 억제한다는 것도 발견하였다. 또한, HDART가 핵내 수용체의 전사 보조 억제 인자 중 하나이고, HDAC와 결합하여 HDAC의 히스톤 탈아세틸화에 의해 강력하게 전사를 억제할 수 있다는 것도 밝혔다. 한편, HDART의 우성 음성 펩티드도 얻었으며, 이 펩티드는 전장 HDART와는 반대로 전사를 활성화시킨다는 것까지도 확인하였다. 즉, 본원 발명은 HDART의 새롭게 해명된 여러가지 기능에 기초하는 것으로, 구체적으로는 이하와 같다.

(1) 본 발명은 전사 억제 인자를 코딩하는 DNA로서, (A) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA, 또는 (B) 서열 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA이다.

(2) 본 발명은 전사 억제 인자를 코딩하는 DNA로서, (A) 서열 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA, 또는 (B) 서열 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA이다.

(3) 본 발명은 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 DNA에 의해 코딩되는 전사 억제 인자이다.

(4) 본 발명은 핵내 호르몬계 수용체에서 기인한 전사를 억제할 수 있는 상기 (3)에 기재된 전사 억제 인자이다.

(5) 본 발명은 전사를 활성화시킬 수 있는 펩티드를 코딩하는 DNA로서, (A) 서열 2에서의 1 내지 179 위치의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 DNA, 또는 (B) 서열 1에서의 1 내지 537 염기의 염기 서열을 포함하는 DNA이다.

(6) 본 발명은 전사를 활성화시킬 수 있는 펩티드를 코딩하는 DNA로서, (A) 서열 2에서의 1 내지 179 위치의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코딩하는 DNA, 또는 (B) 서열 1에서의 1 내지 537 염기의 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA이다.

(7) 본 발명은 상기 (5) 또는 (6)에 기재된 DNA에 의해 코딩되는 전사 활성 화 펩티드이다.

(8) 본 발명은 상기 (1), (2), (5) 및 (6) 중 어느 하나에 기재된 DNA 중에서, 15개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는 DNA이다.

(9) 본 발명은 상기 (1), (2), (5) 및 (6) 중 어느 하나에 기재된 DNA가 삽입된 벡터이다.

(10) 본 발명은 상기 (1), (2), (5) 및 (6) 중 어느 하나에 기재된 DNA, 또는 상기 (9)에 기재된 벡터를 보유하는 숙주 세포이다.

(11) 본 발명은 상기 (3)에 기재된 인자 또는 상기 (7)에 기재된 펩티드에 결합할 수 있는 항체이다.

(12) 본 발명은 상기 (1), (2), (5) 및 (6) 중 어느 하나에 기재된 DNA와 혼성화되고, 10개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브이다.

(13) 본 발명은 이하의 (A) 내지 (D) 중 어느 하나가 고정된 기판이다.

(A) 상기 (12)에 기재된 올리고뉴클레오티드 프로브,

(B) 상기 (3) 또는 (4)에 기재된 전사 억제 인자, 또는 이 인자의 부분 펩티드,

(C) 상기 (7)에 기재된 전사 활성화 펩티드, 또는 이 펩티드의 부분 펩티드,

(D) 상기 (11)에 기재된 항체.

이하, 본 발명의 실시 형태에 대해서 상세히 설명한다. 또한, 본 명세서에 서 사용하는 약어를 미리 설명한다: HAT (히스톤 아세틸트랜스퍼라제 또는 히스톤 아세틸화 효소), HDAC (히스톤 데아세틸라제 또는 히스톤 탈아세틸화 효소), DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌), RAR (레티노산 수용체), GR (글루코코르티코이드 수용체), DBD (DNA 결합 도메인), AD (활성화 도메인), ATRA (all-trans Retinoic Acid: 올-트랜스 레티노산).

본 발명은, 전사 조절에 관여하는 인자에 관한 것이다. 이 전사 조절 인자에는 전사를 억제하는 인자와 전사를 활성화시키는 인자가 포함된다. 우선, 전사 억제 인자에 대해서 설명한다. 본 발명의 전사 억제 인자의 예로는 HDART가 있으며, HDART의 아미노산 서열은 서열 2를 포함한다. 단, 본 발명의 전사 억제 인자는 서열 2에 기재된 HDART로만 한정되지는 않고, 전사 억제 활성을 나타내는 범위에서 서열 2에 기재된 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및 HDART를 코딩하는 DNA (서열 1)와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩된 단백질까지도 포함한다.

상기 HDART 단백질은, 인간 세포의 핵내에서 발현되기 때문에, 인간 세포의 핵으로부터 얻을 수 있다. 원료가 되는 상기 인간 세포는 특별히 한정되지는 않지만, 일례를 들면 HDART를 내재적으로 발현하고 있는 것으로 확인된 293 세포를 사용할 수 있다.

또한, 아미노산 치환 등을 갖는 HDART 유사 단백질의 제조는, 예를 들면 공 지된 기술인 파지 라이브러리 스크리닝 기술 (Molecular Cloning 3^rd Ed, Chapter 2, pp. 2. 1-2. 117)이나 중합효소 연쇄 반응 (PCR: Molecular Cloning 3^rd Ed, Chapter 8, pp. 8. 1-8. 126) 기술을 이용하여 실시할 수가 있다. 구체적으로는 HDART를 코딩하는 DNA (서열 1) 또는 그 일부를 프로브나 프라이머로서 사용하여 서열 1과 상동성이 있는 DNA를 얻고, 이 DNA를 기초로 단백질을 생성함으로써 얻을 수 있다. 여기서 얻어지는 단백질은, 통상 HDART와 아미노산 서열에 있어서 높은 상동성을 갖는다. 이 높은 상동성은 적어도 40 ％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 더욱 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 가장 바람직하게는 적어도 97 ％ 이상 (예를 들면, 98 내지 99 ％)의 염기 서열이 일치하는 것을 의미한다.

또한, 상기 "엄격한 혼성화 조건"은 당업자라면 적절하게 선택할 수가 있다. 일례로서는, 25 ％ 포름아미드 (보다 엄격한 조건으로서는 50 ％ 포름아미드), 4×SSC, 50 mM Hepes (pH 7.0), 10×덴하르트 용액, 20 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 혼성화 용액 중 42 ℃에서 하룻밤 인큐베이션시킴으로써 예비 혼성화를 행한 후, 표지한 프로브를 첨가하여 42 ℃에서 하룻밤 인큐베이션시킴으로써 혼성화를 실시하는 것을 들 수 있다. 그 후의 세정에 있어서의 세정액 및 온도 조건은 1×SSC, 0.1 ％ SDS, 37 ℃ 정도이고, 보다 엄격한 조건은 0.5×SSC, 0.1 ％ SDS, 42 ℃ 정도이고, 더욱 엄격한 조건은 0.2×SSC, 0.1 ％ SDS, 65 ℃ 정도이다. 이들 SSC, SDS 및 온도 조건의 조합은 예시일 뿐이고, 당업자라면 적절하게 변형할 수 있다.

서열의 상동성은, BLASTn (핵산 수준)이나 BLASTx (아미노산 수준)의 프로그램 (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)을 이용하여 결정할 수가 있다. 이 프로그램은 카를린과 알트슐 (Karlin and Altschul)에 의한 알고리즘인 BLAST (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5877, 1993)에 기초하고 있다. BLASTN에 의해서 염기 서열을 분석할 경우에는, 예를 들어 파라미터를 스코어=100, 워드 길이=12로 한다. 또한, BLASTX에 의해서 아미노산 서열을 분석할 경우에는, 예를 들어 파라미터를 스코어=50, 워드 길이=3으로 한다. 또한, 갭 BLAST (Gapped BLAST) 프로그램을 이용하여 아미노산 서열을 분석하는 경우에는 문헌 [Altschul et al., Nucleic. Acids. Res. 25: 3389-3402, 1997]에 기재되어 있는 바와 같이 행할 수 있다. BLAST와 갭 BLAST 프로그램을 이용할 경우에는 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 이용한다. 이러한 분석 방법의 구체적인 절차는 공지되어 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

서열 2에 기재된 서열을 인위적으로 변형시킬 경우에는, 일반적으로는 전체 아미노산의 10 ％ 이내, 바람직하게는 전체 아미노산의 5 ％ 이내, 더욱 바람직하게는 전체 아미노산의 1 ％ 이내를 변형시키는 것이 고려되지만, 전사 억제 활성을 유지할 수 있는 범위 내이면 상기 변형 비율을 초과하여 아미노산 서열을 치환할 수도 있다. 인위적으로 아미노산 서열을 변형시키는 기술은, 예를 들면 공지된 절차인 결실-돌연변이체 제조 방법, PCR법, 부위-지정 돌연변이 유발법 (site-directed mutagenesis) 등에 의해 수행할 수 있다. 또한, 이와 같이 변형된 단백 질이 HDART와 같이 전사 억제 활성을 나타내는지 아닌지는, 후술하는 실시예에 기재된 바와 같은 여러가지 리포터 분석법 등을 이용하여 전사 억제능을 분석함으로써 결정할 수가 있다.

상기 HDART 또는 이와 유사한 단백질은 상술한 바와 같이 전사 억제 활성을 갖기 때문에, 이 기능을 이용하여 원하는 전사 장치와의 조합을 통해 원하는 유전자의 전사를 억제할 수가 있다. 이 전사 장치는 시험관내 전사 시스템 또는 생체내 전사 시스템 중 어느 것이어도 무방하다. 또한, HDART의 전사 억제능은 자발적인 것이기 때문에, 본 발명의 전사 억제 인자를 단독으로 사용하여 전사를 억제할 수 있다. 단, 이 경우에 HDART가 DNA 결합능을 갖지 않기 때문에, DNA 결합 영역을 융합시킨 융합 단백질로서 사용하는 것이 바람직하다. 또한, HDART는 HDAC와의 결합능을 갖기 때문에, HDART는 HDAC를 모이게 하여 히스톤 탈아세틸화 활성에 의해 전사를 강력하게 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 전사 억제 인자는 HDAC와 함께 사용하거나, 또는 HDAC를 유도함으로써 전사를 억제할 수 있다. 또한, HDAC에는 유형 I (HDAC1, HDAC2, HDAC3)과 유형 II (HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8)가 존재한다고 알려져 있다. 본 발명의 HDART는 HDAC2, HDAC5, HDAC7, HDAC8 등과 결합한다고 생각되기 때문에, 본 발명에 있어서는 HDAC2, HDAC5, HDAC7, HDAC8을 바람직하게 사용할 수가 있지만, 이러한 HDAC에 특별히 한정되는 것은 아니고 유형 I 또는 II에 속하는 어느 하나의 HDAC를 사용할 수 있다.

또한, HDART는 핵내 수용체의 전사를 억제할 수 있기 때문에, 본 발명의 전사 억제 인자에 의해 억제할 수 있는 전사 장치로는 핵내 수용체를 통해 작동하는 전사 장치를 들 수 있다. 이 핵내 수용체로는 레티노산 수용체, 글루코코르티코이드 수용체를 바람직하게 들 수 있고, 또한 본 발명의 인자가 전사를 억제할 수 있는 범위에, 레티노인 (retinoin) X 수용체, 비타민 D 수용체, 안드로겐 수용체, 에스트로겐 수용체, 갑상선 호르몬 수용체 등의 호르몬이나 지용성 비타민 등에 대한 핵내 수용체 등을 포함시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 전사 억제 인자는 이러한 핵내 수용체로부터의 전사의 부조화, 특히 지나치게 전사가 촉진되는 것에서 기인한 질환의 치료에 유용하다. 특히, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, HDART는 레티노산 수용체의 전사를 억제하고, 또한 이 레티노산 수용체의 전사에 의해 유도되는 분화까지도 억제함이 분명하기 때문에, 본 발명의 전사 억제 인자를 레티노산 수용체의 전사에 의해 분화가 증가되는 질환의 치료약으로서 응용할 수도 있다.

본 발명은 상기 전사 억제 인자를 코딩하는 DNA에 관한 것이다. 이 DNA로서는, 예를 들면 서열 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA를 들 수 있지만 이에 한정되지는 않고, 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA, 서열 2에 기재된 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA, 및 서열 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA 등도 포함된다.

상기 DNA는, 서열 1에 기재된 DNA 또는 그 일부를 프로브 또는 프라이머로서 사용하여, 예를 들면 인간 세포 (예를 들면, 후술하는 실시예 1에 나타내는 인간 췌장의 소도 세포)의 cDNA 라이브러리 등으로부터 혼성화 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 얻을 수 있다. 다른 방법으로, 인간 세포의 mRNA를 주형으로 사용하 고 서열 1에 기재된 DNA의 일부를 프라이머로 사용하는 RT-PCR (Molecular Cloning 3^rd Ed, Chapter 8, Protocol 8, pp. 8. 46-8. 53)에 의해 얻을 수도 있다. 또한, 여기서는 인간 세포를 예로 들었지만, 그것 이외의 포유 동물 세포, 진핵 세포 등을 이용하여 제조할 수도 있다. 또한, DNA를 단리하기 위한 혼성화 조건은 상술한 바와 같다.

DNA를 클로닝하는 상기 방법 이외에도, DNA 합성기에 의해 서열 1에 기재된 DNA와 그 상보쇄를 각각 합성하고, 이들을 어닐링시켜 생성할 수도 있다.

상기 DNA는 전사 억제 인자를 코딩하기 때문에, 전사 억제 인자를 생산하기 위한 도구로서, 또는 세포나 개체 내에 도입하여 전사 억제 인자를 발현시키기 위한 도구로서 사용할 수 있다. 이러한 목적으로 사용하는 경우에는, 상기 DNA를 발현 벡터 등에 혼입시키는 것이 바람직하다. 발현 벡터는 단백질 생산에 이용되는 번역 시스템에 의해 또는 도입될 세포에 따라 적절하게 선택할 수가 있다.

상기 DNA가 혼입된 벡터를 사용하여 전사 억제 인자를 생산하기 위해서는, 우선 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 이 숙주 세포를 배양한다. 이에 따라, 숙주 세포에서는 상기 전사 억제 인자가 생산된다. 여기서, 벡터를 세포에 도입하는 절차는 사용되는 세포의 유형에 따라서 적절하게 선택할 수가 있다. 예를 들면, 바이러스 벡터나 파지를 통한 생물학적 기술, 인산칼슘법, 리포펙션 (lipofection)법 등의 화학적 기술, 진 건 (gene gun), 전기천공법 등의 물리적 기술 등을 이용할 수 있다. 숙주 세포에서 생산된 단백질은, 필요에 따라서 정제 ( 예를 들면, 친화도 정제 등)을 행한 후에 사용할 수 있다.

상기 DNA가 혼입된 발현 벡터는 세포 내 또는 개체 내의 원하는 전사를 억제할 목적으로 사용할 수도 있다. 즉, 이 발현 벡터를 세포 또는 개체 내에 도입하여 상기 전사 억제 인자를 발현시킴으로써 원하는 전사 시스템을 억제할 수가 있다. 특히, HDART는 자발적인 전사 억제능을 갖기 때문에, 본 발명의 전사 억제 인자는 단독으로 전사 억제 활성을 발휘할 수 있다. 단, HDART 자신은 DNA 결합능을 갖지 않기 때문에, 본 발명의 전사 억제 인자는 원하는 유전자의 제어 영역의 DNA에 결합할 수 있는 DNA 결합 영역과의 융합 단백질로서 발현시키는 것이 바람직하다. 이와 같이, 표적 유전자의 전사를 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 전사 억제 인자는 HDAC와의 결합능을 갖기 때문에, 본 발명의 전사 억제 인자를 발현시킴으로써 HDAC를 모이게 하여 전사를 더욱 강하게 억제할 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA에 코딩되는 전사 억제 인자는 핵내 수용체의 전사를 효과적으로 억제할 수 있기 때문에, 이들 핵내 수용체의 전사 증가에서 기인한 질환의 치료용 조성물로서 본 발명의 DNA가 혼입된 벡터를 응용할 수도 있다. 이러한 치료 목적의 벡터로서는, 예를 들면 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 알파 바이러스 벡터, EB 바이러스 벡터, 파필로마 바이러스 벡터, 포미 (foamy) 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 전사 조절 인자 중에서 상기와는 반대로 전사를 활성화시킬 수 있는 펩티드에 관한 것이다. 전장의 HDART는 전사 억제 인자로서 기능하지만, HDART의 우성 음성 펩티드는 반대로 전사 활성화 인자로서 기능한다. 이 우성 음성 펩티드의 예로는 N 말단의 4개의 TPR (이하, "N4TPR"이라 약칭함)을 코딩하고 있는 펩티드, 즉 서열 2에서의 1 내지 179 위치의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 들 수 있지만 이에 한정되지는 않고, 전사 활성화능을 갖는 범위에서 서열 2에서의 1 내지 179 위치의 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가된 아미노산 서열을 갖는 펩티드도 포함시킬 수 있다.

상기 우성 음성 펩티드는 서열 1 중 1 내지 537의 염기 서열을 포함하는 DNA를 기초로 펩티드를 합성함으로써 제조할 수 있다. 또한, 상기 펩티드, 및 아미노산 서열에 치환 등을 갖는 펩티드는, 상기 서열 1 중 1 내지 537의 염기 서열에 변이 (치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가)를 가하여 코돈을 바꾼 DNA를 기초로 펩티드를 합성함으로써 제조할 수도 있다.

상기 펩티드는 전사 활성화능을 갖기 때문에, 원하는 전사 시스템의 전사를 촉진시키기 위해서 사용할 수 있다. 특히, 실시예에 나타낸 바와 같이, HDART의 N4TPR은 핵내 수용체의 전사를 활성화시키기 때문에, 이들 핵내 수용체의 전사를 촉진시키기 위해서 사용할 수 있다. 이 핵내 수용체로서, 적합하게는 Skip가 작용하는 핵내 수용체, 예를 들면 레티노산 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 비타민 D 수용체, 에스트로겐 수용체를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드가 전사를 활성화시킬 수 있는 범위에서 레티노인 X 수용체, 안드로겐 수용체, 갑상선 호르몬 수용체 등의 호르몬이나 지용성 비타민 등에 대한 핵내 수용체 등을 포함할 수 있다.

상기 N4TPR에 의한 레티노산 수용체의 전사 활성화능은 ATRA에 의한 전사 활성화능보다도 높다는 것이 후술하는 실시예에 나타나 있다. 그 때문에, 현재 ATRA에 의해 촉진되는 레티노산 수용체의 전사 활성화에 의한 백혈병 등의 악성 종양의 분화 유도 요법이 행하여지고 있다. 또한, 비타민 A나 ATRA를 비롯한 그 유도체는, 백혈병 이외에도 간세포암 (Okuno, M. et al., (2002) Front Biosci 7, 204-18), 난소암 (Zhang D. et al., (2000) J Cell Physiol 185 (1), 1-20), 갑상선암 (Schmutzler C. and Kohrle J. (2000) Thyroid 10 (5), 393-406), 피부암 (Niles R. M. (2000) Nutrition 16 (11-12), 1084-9), 췌장암 (Riecken E. O. and Rosewicz S. (1999) 10 Suppl 4, 197-200) 등의 치료에 사용되기 시작하였으며, 이 ATRA 대신에 또는 ATRA와 조합하여 본 발명의 펩티드를 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 전사 활성화능을 갖는 펩티드를 코딩하는 DNA에 관한 것이다. 이 DNA로서는 구체적으로 서열 2에 있어서의 1 내지 179 위치의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 DNA, 예컨대 서열 1의 1 내지 537 염기의 염기 서열로 이루어진 DNA를 들 수 있지만 이에 한정되지는 않고, 전사 활성화능을 갖는 범위에서 서열 2에서의 1 내지 179 위치의 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코딩하는 DNA, 또는 서열 1에서의 1 내지 537 염기의 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA를 포함시킬 수 있다.

전사 활성화 펩티드를 코딩하는 상기 DNA는, 상술한 전사 억제 인자를 코딩하는 DNA를 얻은 후, 예를 들면 C 말단측을 결실시킴으로써 제조할 수 있다. 또 는, DNA 합성기에 의해 합성하여 상기 DNA를 제조할 수도 있다.

상기 DNA는 상기 전사 활성화 펩티드를 생산할 목적으로, 또는 세포 또는 개체 내에 도입하여 상기 전사 활성화 펩티드를 발현시킬 목적으로 사용될 수 있다. 펩티드를 생산할 목적으로 상기 DNA를 사용하는 경우에는 발현 벡터에 혼입시키는 것이 바람직하다. 이 경우, 발현 벡터는 펩티드를 생산하기 위한 전사ㆍ번역 시스템에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 이 전사ㆍ번역 시스템은 시험관내 또는 생체내 시스템 중 어느 하나일 수 있다. 생체내 시스템의 경우에는, 상기 DNA가 혼입된 발현 벡터를 세포에 도입하고, 이 세포를 배양함으로써, 세포 내에서 상기 전사 활성화 펩티드가 생산된다. 세포로의 도입 방법 등에 대해서는 상술한 바와 동일하다.

상기 DNA를 세포 또는 개체 내에 도입하여 상기 전사 활성화 펩티드를 발현시킬 목적으로 사용하는 경우에는 상기 DNA를 직접 세포 내 등에 도입하여 일시적으로 발현시킬 수도, 또는 염색체에 삽입시켜 안정적으로 발현시킬 수도 있으며, 또한 발현 벡터에 혼입시켜 세포 등에 도입할 수도 있다.

상술한 바와 같이, 전사 활성화 펩티드는 ATRA와 같이 악성 종양의 분화 유도 요법에 응용할 수 있기 때문에, 전사 활성화 펩티드를 직접 사용하는 것 대신에, 본 발명의 DNA를 환자에게 주입하는 것 등에 의해 상기 전사 활성화 펩티드를 발현시켜, 상기 치료 방법에 이용할 수도 있다. 이러한 목적으로 사용하기 위해서는, 상기 DNA를 원하는 조직 또는 세포에 이 DNA를 운반하기 위한 벡터에 혼입시켜 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 치료 목적의 벡터로서는, 상술한 레트로바이러 스 벡터 등의 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명의 전사 억제 인자를 코딩하는 DNA는, 코딩하는 DNA의 N 말단 측을 짧게 함으로써 상기 전사 활성화 펩티드를 코딩하는 DNA로 변형될 수 있다. 이 이외에도, 상기 전사 억제 인자를 코딩하는 DNA 또는 전사 활성화 펩티드를 코딩하는 DNA는 혼성화용 프로브, PCR 프라이머 또는 리보자임 (ribozyme) 유도체로서 사용하기 위한 더욱 짧은 일부 단편으로서 제공될 수 있다. 이들 목적으로 상기 DNA의 일부를 사용하는 경우에는 상기 단편이 프로브 등으로서의 특이성을 유지할 수 있는 길이 (예를 들면, 15개의 뉴클레오티드 길이)를 갖고 있는 것이 바람직하다. 본 발명은, 본 발명의 DNA (예를 들면, 서열 1에 기재된 DNA 등)와 혼성화되며 10개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공한다. 예를 들면, 이러한 폴리뉴클레오티드로서는, 서열 1에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는 그 상보쇄와 특이적으로 혼성화되는 것을 들 수 있다. 여기서, "특이적으로 혼성화된다"란, 혼성화시에 다른 단백질을 코딩하는 DNA와 유의한 교차 혼성화가 발생하지 않는 것을 의미한다. 상기 프로브 및 프라이머는 전사 억제 인자 등을 코딩하는 DNA의 클로닝 등에 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 전사 억제 인자 또는 전사 활성화 펩티드에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는, 상기 전사 억제 인자 또는 전사 활성화 펩티드와 특이적으로 결합할 수 있는 것이면, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 어느 것이어도 무방하다. 폴리클로날 항체는 본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩티드를, 필요에 따라서 프로인트 면역보강제 (Freund's adjuvant) 등과 혼합하고, 주지된 방법에 의해 토끼, 염소, 기니아 피그 등의 비-인간 동물을 면역화시키고, 항체가가 상승한 것을 확인한 후에 면역화 동물의 말초 혈액으로부터 혈청을 회수함으로써 제조할 수 있다. 한편, 모노클로날 항체는 상기 전사 억제 인자 또는 전사 활성화 펩티드 또는 그의 부분 펩티드를 사용하여 주지된 방법에 의해 마우스 등의 동물을 면역화시키고, 항체가가 상승한 면역화 동물의 비장 또는 림프절을 채취하고, 이들 조직 중의 항체 생산 세포와 미엘로마 (myeloma) 세포를 융합시켜 하이브리도마 (hybridoma)를 생성함으로써 제조한다. 그 후, 하이브리도마로부터 생산되는 항체를 배양 상층액에서 회수함으로써 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.

이들 항체는, 상기 전사 억제 인자 또는 전사 활성화 펩티드의 친화도 정제 등에 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 여러가지 세포 내에서 전사 억제 인자의 발현량을 면역학적으로 분석하거나, 또는 전사 억제 인자를 저해할 목적으로 사용할 수도 있다.

또한 본 발명은, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드가 고정된 기판을 제공한다. 이 기판을 바이오칩 (biochip)으로 사용함으로써, 예를 들면 피검 생물체 (세포)에서 본 발명의 DNA의 발현 상태를 분석할 수 있다.

바람직한 실시 형태에서, 우선 피검 생물체 (세포)로부터 본 발명의 DNA (예를 들면, 서열 1에 기재된 DNA, 또는 그의 부분 DNA 영역)을 증폭한다. 계속해서, 이 DNA와 혼성화되는 뉴클레오티드 프로브가 고정된 기판을 준비한다. 계속해서, 이 DNA와 이 기판을 접촉시킨다. 또한, 기판에 고정된 뉴클레오티드 프로브와 혼 성화되는 DNA를 검출함으로써, 본 발명의 DNA의 발현 상태를 분석할 수 있다.

이러한 방법으로서는 DNA 어레이법 (DNA array method)을 예시할 수 있다. 피검 생물체 (세포)로부터의 DNA 샘플의 제조는 당업자에게 주지된 방법으로 행할 수 있다. 이 DNA 샘플을 제조하는 바람직한 실시 형태에서는, 세포로부터 추출한 염색체 DNA를 기초로 제조할 수 있다. 염색체 DNA에서 본 방법의 DNA 샘플을 제조하기 위해서는, 예를 들면 본 발명의 DNA에 혼성화되는 프라이머를 사용하고 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 등에 의해서 본 발명의 DNA를 제조할 수 있다. 이와 같이 제조한 DNA 샘플에는, 필요에 따라서 당업자에게 주지된 방법에 의해 검출을 위한 표지를 실시할 수 있다.

본 발명에서 "기판"이란, 뉴클레오티드를 고정할 수 있는 판상의 재료를 의미하고, 통상 칩이라고도 불린다. 본 발명에 있어서, 뉴클레오티드에는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명의 기판은 뉴클레오티드를 고정할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없지만, 일반적으로 DNA 어레이 기술에 사용되는 기판을 바람직하게 사용할 수 있다.

일반적으로 DNA 어레이는, 고밀도로 기판에 프린트된 추천개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 통상, 이러한 DNA는 비투과성 (non-porous) 기판의 표층에 프린트된다. 기판의 표층은 일반적으로는 유리이지만, 투과성 (porous) 막, 예를 들면 니트로셀룰로오스 막을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 뉴클레오티드의 고정 (어레이) 방법으로, 어피메트릭스사 (Affymetrix Inc.)에서 개발한, 올리고뉴클레오티드를 기본으로 한 어레이를 예시 할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 어레이에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 통상 제자리 (in situ) 합성된다. 예를 들면, 포토리소그래피 (photolithography) 기술 (어피메트릭스사) 및 화학 물질을 고정시키기 위한 잉크 젯 기술 (로세타 인파르마틱스사 (Rosetta Inpharmatics LLC Co.)) 등에 의한 올리고뉴클레오티드의 제자리 합성법이 이미 알려져 있고, 이들 모든 기술을 본 발명의 기판 제조에 이용할 수 있다.

기판에 고정되는 뉴클레오티드 프로브는, 본 발명의 DNA를 검출할 수 있는 것이면 특별히 제한되지는 않는다. 즉, 이 프로브는, 예를 들면 서열 1에 기재된 DNA와 특이적으로 혼성화되는 것과 같은 프로브이다. 특이적인 혼성화가 가능하다면, 뉴클레오티드 프로브가 본 발명의 DNA에 대하여 완전히 상보적일 필요는 없다.

본 발명에 있어서, 기판에 결합시키는 뉴클레오티드 프로브의 길이는, 올리고뉴클레오티드를 고정하는 경우에 통상 10 내지 100 염기이고, 바람직하게는 10 내지 50 염기이고, 더욱 바람직하게는 15 내지 25 염기이다.

본 발명에 있어서는, 그 후에 DNA 샘플과 상기 기판을 접촉시킨다. 본 공정에 의해, 상기 뉴클레오티드 프로브에 대하여 DNA 샘플을 혼성화시킨다. 혼성화의 반응액 및 반응 조건은, 기판에 고정되는 뉴클레오티드 프로브의 길이 등과 같은 여러가지 요인에 의해 변동될 수 있지만, 일반적으로 당업자에게 주지된 방법에 의해 행할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 그 후에 상기 DNA 샘플과 기판에 고정된 뉴클레오티드 프로브와의 혼성화 유무 또는 강도를 검출한다. 이 검출은, 예를 들면 형광 시그 널을 스캐너 등에 의해서 판독함으로써 행할 수 있다. 또한, DNA 어레이에 있어서는, 일반적으로 슬라이드글라스에 고정된 DNA를 프로브라고 하는 한편, 용액 중의 표지된 DNA를 표적이라고 한다. 따라서, 기판에 고정된 상기 뉴클레오티드를 본 명세서에서 뉴클레오티드 프로브라고 기재한다. 본 방법에서는, 필요에 따라 검출된 혼성화의 강도를 대조군과 비교한다. 상기 방법으로서는, 예를 들면 DNA 어레이법 (SNP 유전자 변이의 전략, 마쯔바라 겐이찌ㆍ사까이 요시유끼, 나까야마 쇼뗀, p 128-135, Nature Genetics (1999) 22:164-167) 등을 들 수 있고, 당업자라면 공지된 문헌 등을 참조하여 적절하게 실시할 수가 있다.

또한 본 발명은, 본 발명의 단백질 또는 이 단백질의 부분 단편이 고정된 기판을 제공한다. 이 기판을 바이오칩으로 사용함으로써, 예를 들면 본 발명의 단백질과 결합하는 분자의 탐색, 또는 HDAC 저해 화합물의 스크리닝 등을 행할 수 있게 된다.

일반적으로, 단백질을 기판에 고정시킨 것을 단백질 칩 (protein chip)이라 부른다. 그 원리는 DNA 칩과 마찬가지로, 슬라이드글라스나 막 위에 단백질을 고밀도로 고정하고, 이들과 상호작용하는 단백질이나 핵산 등을 검출한다.

본 발명의 HDART 단백질은 여러가지 HDAC 단백질과 결합하기 때문에, HDAC 저해 화합물의 스크리닝에 응용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 HDART 단백질을 고상 표면에 고정시킴으로써 하나의 면에 여러가지 HDAC를 결합시킬 수 있다. 이 고상 표면에 여러가지 화합물을 결합시켜 HDAC 활성을 계측함으로써, HDAC 저해 화합물을 스크리닝할 수 있다.

상기 스크리닝에 의해서 취득되는 HDAC 저해 화합물의 예로는, 암의 분화 유도 요법에서 약제로 사용되는 트리코스타틴 (tricostatin) A를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 항체가 고정된 기판을 바이오칩으로 사용할 수도 있다. 고순도로 분리 정제된 항체를 칩 표면에 고정시킴으로써 고밀도화가 가능해진다.

본 발명의 바람직한 실시 형태에 있어서는, 기판 상에 샘플을 스폿팅 (spotting)한 후, 스폿팅된 표면에 대하여 친화성을 나타내지 않는 단백질이나 그 밖의 협잡물을 세정에 의해 용출시킬 수 있다. 그 후의 검출 공정은, 당업자라면 기판의 종류 등을 고려하여, 공지된 방법으로 적절하게 상기 친화성의 유무 (강약)을 검출할 수 있다. 예를 들어, 세정 후의 상기 기판에 에너지 흡수 분자 (EAM)를 첨가하고, 건조 후, 질량 분석계 (TOF-MS) 장치에 가함으로써 스폿팅된 표면에 결합하고 있었던 단백질의 분자량 스펙트럼을 측정할 수가 있다.

또한, 임의의 DNA 또는 펩티드를 기판에 고정시키는 것은, 당업자라면 공지된 방법에 의해 적절하게 실시할 수 있다.

도 1은 HDART가 TPR (테트라 트리코 펩티드 반복부; Tetra trico peptide repeat) 단백질임을 나타내고, 또한 그 구성 및 관련 유전자와의 관계를 나타낸다. 또한, HDART의 1차 구조의 개략적 구성을 나타내고, TPR, 산성 영역, Skip 상호작용 영역 및 CRN 상동성 영역을 나타내고 있다.

도 2는 인간 HDART와 인간 CRN 사이의 CRN 상동성 영역을 비교한 도면이다.

도 3은 HDART/CRN 단백질 사이의 계통수를 도시한 도면이다. 이 계통수는 GENETYX-MAC 프로그램을 이용하여 구축하였다 (소프트웨어 개발).

도 4는 외래 또는 내재 HDART와 외래 Skip와의 상호작용을 면역침강 분석에 의해 동정한 결과를 나타내는 사진이다.

(A) 외래 HDART와 외래 Skip와의 상호작용을 분석한 결과를 나타낸다. 레인 1은 GFP-HDART 단독에 대한 것이고, 레인 4는 Flag-Skip 단독에 대한 것이며, 레인 2, 3은 둘 다를 293 세포내에서 발현시킨 것에 대한 것이다. 레인 5는, 벡터를 전혀 도입하지 않은 대조군 세포이다. 또한, 레인 1, 2, 4 및 5는 항-Flag 항체에 의해, 레인 3은 대조군 마우스 IgG에 의해 면역침강시킨 샘플이다. 상부 2 개의 패널은 발현된 각 단백질의 발현을 나타내고, 하부 2 개의 패널은 면역침강물을 나타내고 있다. 또한, 각각 상단은 항-GFP 항체, 하단은 항-Flag 항체로 면역블롯팅 (immunoblotting)한 결과를 나타낸다.

(B) 내재 HDART와 외래 Skip와의 상호작용을 분석한 결과를 나타낸다. 내부에 HDART를 보유하는 293 세포에 Flag-Skip (레인 1) 또는 Flag-루시퍼라제 (레인 2)를 도입한 후, 세포 추출액을 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 벡터를 전혀 도입하지 않은 대조군 실험도 병행하였다 (레인 3). 세포 내에서의 HDART 단백질의 발현 상황 (상부 패널), 면역침강된 Flag (중앙 패널), 또는 HDART (하부 패널)을, 패널 좌측에 "WB"로서 나타내는 항체를 사용한 면역블롯팅에 의해 동정하였다.

도 5는 Skip, HDART의 2가지 단백질 상의 상호작용 영역을 동정한 결과를 나타낸 것이다.

(A) Skip 상의 HDART 결합 영역 부위의 맵핑. 플러스 (+)는, 효모 투 하이 브리드 시스템 (yeast two-hybrid system)에 있어서의 β-갈락토시다제 활성에 기초하여 상호작용이 검출된 것을 나타낸다. 플러스의 수는 그 상호작용의 상대적 강도를 나타낸다.

NHR 결합: 핵내 호르몬계 수용체 결합 도메인, TA: 트랜스 활성화 도메인.

(B) HDART 상의 Skip 결합 영역의 맵핑. 기호는 상술한 바와 동일하다.

도 6은 핵내 호르몬 (레티노산 또는 글루코티코이드)에 의한 전사 활성화를 HDART가 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.

(A) HDART에 의한, 레티노산으로 활성화된 전사의 농도 의존적 억제 결과를 나타낸다. 리간드의 부재하에 공 벡터 (vacant vector)(1.0 ㎍)를 도입하였을 때의 CAT 활성을 기준으로 보정된 CAT 활성을 나타내었다. 3회의 반복 실험에 대한 평균으로 나타내고, 에러 바는 S.D.를 나타낸다.

(B) HDART에 의한, 글루코코르티코이드로 활성화된 전사의 농도 의존적 억제 결과를 나타낸다.

도 7은 HDART의 세포내 국재 (localization)를 나타내는 사진이다.

(A) 내재성 HDART 단백질의 국재화. 좌측 패널은 항-HDART 항체 (상단) 또는 면역화 전의 혈청 (하단)을 사용한 면역 형광 염색 결과를, 우측 패널은 좌측 패널과 대응되는 시야에 있어서의 DAPI 염색 결과를 나타낸다.

(B) 생존 세포 중의 HDART의 국재화. Hela 세포에 GFP-HDART 발현 벡터 (좌측 위) 또는 GFP 발현 벡터 (좌측 밑)를 도입한 후의 GFP에 의한 형광 발광을 관찰한 결과, 및 획스트 (Hoechst) 33342 염료를 사용하여 핵을 시각화한 결과 (우측 위)를 나타낸다.

도 8은 HDART의 자발적인 프로모터 억제 활성을 나타낸다.

(A) Gal4 리포터 (루시퍼라제) 플라스미드를 보유하는 NIH3T3 세포에 상이한 양의 Gal4 DBD-HDART 발현 플라스미드 (0, 0.1, 0.3, 0.5 ㎍)를 도입하였을 때의 프로모터 억제 활성을 검토한 결과를 나타낸다. 공 벡터만 도입하였을 때의 루시퍼라제 활성 (100 ％)을 기준으로 보정된 루시퍼라제 값을 나타내었다. 3 회의 반복 실험 결과에 대한 평균으로 나타내고, 에러 바는 S.D.를 나타낸다.

(B) U-20S 세포를 사용한 결과를 나타낸다.

도 9는 HDART와 HDAC와의 직접적인 상호작용을 나타내는 사진이다.

(A) HDART와 HDAC와의 상호작용. 293 세포에 GFP-HDART 발현 벡터와 Flag-HDAC 발현 벡터 (레인 1; HDAC1, 레인 3; HDAC3, 레인 4; HDAC4, 레인 5; HDAC6)을 동시 형질감염시킨 후, 항-Flag 항체로 면역침강시켜, 표지된 항체 (항-Flag 항체 또는 항-GFP 항체)에 의해 면역블롯팅을 행한 결과를 나타낸다 (각각 중앙 패널, 하부 패널). 또한, 레인 2는 GFP-HDART만이 도입된 샘플이다. 또한, 상부 패널은 면역침강 전의 샘플을 사용하여 GFP-HDART 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.

(B) HDART와 HDAC3과의 직접적인 상호작용을 나타내는 결과이다.

도 10은 HDART의 억제가 2종의 HDAC 저해 물질 (트리코스타틴 A, 부티르산나트륨)에 의해 각각 HDART 억제를 저해한다는 것을 나타낸다 (C, D).

도 11은 HDART N 말단의 4개의 TPR (N4TPR)에 의한 우성 음성 효과를 나타낸 도면 및 사진이다.

(A) N4TPR에 의한 내재성 HDART와 Skip와의 상호작용 저해. Flag-Skip와 GFP (레인 1) 또는 GFP-N4TPR (레인 2)가 형질감염된 293 세포의 세포 추출액을 항-Flag 항체로 면역침강시켜, 이 침강 산물을 SDS-PAGE로 분리한 결과를 나타낸다. 하측의 3 개의 패널은, 각각 면역침강된 Skip (상단), 내재성 HDART (중앙) 및 N4TPR (하단)을 나타낸다. 면역침강 전의 HDART 단백질의 발현은 가장 위쪽의 패널에 나타내고 있다.

(B) 레티노산 수용체에서 기인한 전사를 N4TPR에 의해서 활성화시키는 것을 나타내는 그래프이다.

(C) 글루코코르티코이드에서 기인한 전사를 N4TPR에 의해서 활성화시키는 것을 나타내는 그래프이다.

도 12는 MM-1-19-P 세포 내에서의 레티노산에 의한 분화 유도를 HDART가 저해한다는 것을 나타낸 도면 및 사진이다. HDART 발현 벡터 또는 공 벡터를 도입한 MM-1-19-P 세포를 ATRA (2 μM)의 존재 또는 부재하에서의 분화 유도에 대해 분석하였다. 형질이입된 (transduced) 세포를 동정하기 위해서, 상기 벡터와 함께 GFP 벡터를 동시 형질감염시켰다. GFP에 의한 녹색 형광 발광을, 표준 현미경 사진으로 촬영한 사진 (A, B, C, D) 및 위상차 현미경에서 촬영한 사진 (E, F)으로 나타낸다.

(A) ATRA (-) 및 공 벡터 도입 샘플, (B) ATRA (+) 및 공 벡터 도입 샘플, (C) ATRA (-) 및 HDART 발현 벡터, (D) ATRA (+) 및 HDART 발현 벡터, (E) (C)와 동일 시야의 위상차 사진, (F) (D)와 동일 시야의 위상차 사진. 패널 F에서, 흑색 화살표는 미분화 GFP 양성 세포를 나타내고, 백색 화살표는 분화된 세포를 나타낸다. (G) 그래프는 GFP 양성 세포 중 형태학적으로 분화된 세포의 ％를 나타낸다. 4 회의 독립적인 실험으로부터의 결과를 평균 및 S.D. (에러 바)로 제시하였다 (모의 시험과 ATRA (+)에서의 HDART 사이에서 P<1 ％, 스튜던트 t 테스트 (sutdent t-test)).

이하, 본 발명에 대해서 실시예를 이용하여 상세히 설명하지만, 본 발명은 이 실시예에 한정되지는 않는다.

<실시예 1>

인간 HDART의 클로닝

BLAST 데이타베이스를 이용하여 초파리 crn 유전자의 인간 상동체를 검색하였더니, 췌장 소도의 mRNA에서 유래한 인간 EST (발현 서열 태그; expressed sequence tag) 클론 #52930이 상기 crn 유전자와 높은 상동성을 갖는 것으로 나타났다. 이 클론 #52930의 완전한 서열을 통상적인 방법에 따라 결정하였다. 또한, 5'-RACE법 (5'-rapid amplification of cDNA ends strategy)에 의해, 본 유전자는 그 전장의 cDNA가 2660 염기를 포함하고 하나의 긴 판독 프레임 (reading frame)을 구비하는 것을 확인하였다. 또한, 여기서 확인된 단백질은 후술하는 바와 같이 HDAC (히스톤 탈아세틸화 효소)에 결합하여 억제 인자로서 기능하기 때문에 "HDART (HDAC associated repressor TPR)" 단백질이라 칭한다. HDART는 855개의 아미노산 을 코딩하는 고도로 보존된 TPR 단백질이다 (도 1). DNA 서열로부터 추정되는 HDART 단백질은, 인간 CRN 단백질과 분명히 유사하였다. 특히, HDART 단백질의 262 잔기 내지 779 잔기의 영역은, HDART와 인간 CRN 단백질에서 고도로 보존되어 있었다 (도 1, 2). 여러 종족 사이에서 이 단백질을 유전자 분석한 결과, 이들은 유전자 패밀리를 형성하고 있는 것으로 나타났다 (도 3).

<실시예 2>

HDART와 전사 보조 활성화 인자 Skip와의 직접적인 상호작용

HDART 상에 존재하는 몇개의 TPR 영역에 착안하여, 이들 TPR을 통하여 HDART와 상호작용할 수 있는 단백질이 존재하는지를 분석하였다.

이 HDART와 결합하는 단백질의 단리를 위해 효모 투 하이브리드 시스템을 이용했다. 구체적으로는 효모 MATCHMAKER 투 하이브리드 분석 키트 (Clontech)를 이용하여 실시하였다. pAS-1 벡터 (Clontech) 중에, Gal4 DNA 결합 도메인과 판독 프레임이 맞도록 전장의 HDART ORF를 삽입하였다. 이 베이트 (bait) 플라스미드를, HeLa cDNA 라이브러리 (Clontech)가 서브클로닝된 pACT2 프레이 (prey) 플라스미드와 함께 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) Y190에 형질전환시켰다. 2가지 플라스미드가 도입된 클론의 스크리닝은 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 실시하였다. 이와 같이 약 1×10⁷개를 클로닝한 결과, 수개의 클론을 단리하였다. 이들 클론을 분석한 결과, 하나는 Skip와 일치하였다.

포유 동물 세포 내에서의 HDART와 Skip와의 상호작용을 면역침강 분석에 의 해 확인하였다. 이 확인을 위해, 우선 Flag-Skip 융합 단백질을 발현하는 Flag-Skip 발현 벡터 및 GFP-HDART 융합 단백질을 발현하는 GFP-HDART 발현 벡터 (도 4A)를 HEK 293 세포에 이펙텐 (Effectene) 키트 (QIAGEN)를 사용하여 형질감염시켰다. 또한, 대조군 실험으로서, Flag-Skip 발현 벡터만, 그리고 GFP-HDART 발현 벡터만을 동 세포에 동 조건으로 형질감염시켰다.

형질감염 24 시간 후, 얼음에서 30 분간, 10 ㎕의 프로테아제 저해 물질 칵테일 (Sigma #p8340) 100 ㎕를 함유하는 노니뎃 (Nonidet) P-40 완충액 (50 mM 트리스 HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5 ％ 노니뎃 P-40, 1 mM PMSF) 중에서 세포 용해함으로써, 세포 추출물 (1 mg)을 제조하였다. 이 추출물을 단백질 A/G 세파로스 비드 40 ㎕와 함께 30 분간 4 ℃에서 인큐베이션시킴으로써, 예비적으로 맑게하였다 (clarification). 다음으로, 맑아진 상층액 추출물을 1 시간 동안 항-Flag 항체 또는 음성 대조군인 마우스 IgG 항체 (2 ㎍)과 함께 인큐베이션시키고, 그 후 40 ㎕의 단백질 A/G 세파로스 비드를 사용하여 30 분간 침강시켰다. 면역침강물을 노니뎃 P-40 완충액으로 4 회 세정하였다. 결합한 단백질을 SDS 로딩 완충 중에서 A/G 세파로스 비드로부터 용출시키고, 용출액을 SDS-PAGE로 전개하였다. 전개 후, 막에 전사하고, 이 막을 통상적인 방법에 따라 면역블롯팅시켰다. 이 면역블롯팅용 항체로서는, 항-Flag 항체 M2 (Sigma) 및 항-GFP 모노클로날 항체 클론 1E4 (MBL)를 사용하였다.

상기 면역침강 분석의 결과를 도 4A에 나타내었다. 도면에서, 상부 2 개의 패널은 각 단백질의 발현 결과를 나타내고, 하부 2 개의 패널은 면역침강물을 나타 내고 있다. 도 4A에 나타내고 있는 바와 같이, 상기 2가지 복합 단백질이 발현되는 경우에만 항-Flag 항체에 의해 GFP-HDART 단백질이 Flag-Skip 융합 단백질과 함께 면역침강되었다 (레인 2). Flag-Skip가 발현되지 않는 조건에서는 항-Flag 항체에 의해 GFP-HDART의 침전을 볼 수 없었고 (레인 1), 또한 음성 대조군 항체를 사용한 경우에도 마찬가지로 침전은 관찰되지 않았다 (레인 3). 이 결과는, HDART와 Skip가 생체내에서 특이적으로 상호작용한다는 것을 시사하고 있다.

또한, 내재 HDART와 외부에서 도입한 Skip와의 상호작용을 분석하였다. 293 세포 (HDART가 고도로 발현되고 있는 세포)에 Flag-Skip 발현 벡터 또는 Flag-루시퍼라제 발현 벡터를 형질감염시키고, 상술한 바와 마찬가지의 방법으로 형질감염 24 시간 후에 세포 추출액을 제조하였다. 이 세포 추출액을 항-Flag 항체와 인큐베이션시켜 면역침강을 행하였다. 면역 복합체, 또는 면역침강 전의 세포 추출액을 SDS-PAGE로 전개하여 막에 전사하였다. 동일한 막을 항-HDART 항체 또는 항-Flag 항체를 사용하여 면역블롯팅을 실시하였다. 그 결과를 도 4B에 나타내었다. 또한, 도 4B에서, 상부 패널은 세포 추출액을 항-HDART 항체로 면역블롯팅한 결과를, 중앙 패널은 항-Flag 항체를 사용하여 면역침강시킨 후에 항-Flag 항체로 면역블롯팅한 결과를, 하부 패널은 항-Flag 항체를 사용하여 면역침강시킨 후에 항-HDART 항체로 면역블롯팅한 결과를 나타낸다.

도 4B에 나타낸 바와 같이, Flag-Skip가 발현되는 조건에서만 항-Flag 항체 사용시 HDART가 동시 침전되고 (도 4B, 레인 1), Flag-Luc 단백질이 발현되는 조건 (레인 2) 및 아무것도 형질감염되지 않은 모 293 클론을 사용한 경우 (레인 3)에는 HDART가 동시 침전되지 않았다.

<실시예 3>

HDART와 Skip와의 결합 영역

HDART와의 상호작용에 관여하는 Skip 상의 영역을 맵핑하기 위해서, Skip 상의 여러가지 영역 (N-말단 영역 (코돈 1-220), 핵내 호르몬 결합 영역 (NHR binding, 코돈 221-388), 트랜스 활성화 영역 (TA, 코돈 438-536))을 결실시킨 결실 변이 시리즈를 제조하고, 상기 실시예 2에 기재된 Gal4 DBD-HDART를 사용한 효모 투 하이브리드 분석에 의해 HDART와 변이 Skip와의 상호작용을 분석하였다. 분석 결과를 도 5A에 나타내었다. 도 5A의 우측에 표시된 "+" 기호는 β-갈락토시다제 활성의 필터 리프트 분석 (filter lift analysis)에 의해 상호작용이 검출된 것을 나타내고, "+"의 수는 그 상호작용의 상대적 강도를 나타낸다. "-" 기호는 상호작용이 검출되지 않은 것을 나타낸다.

도 5A에 나타낸 바와 같이, 2개의 다른 영역이 HDART와의 상호작용에 관여하는 것을 발견하였다. 이들 영역은, 하나가 97-119 잔기 내에 있었고, 또 하나는 220-437 잔기 내에 있었다. Skip의 트랜스 활성화 영역은 HDART와의 결합 활성에는 거의 관여하지 않는 것으로 나타났다. 동일한 방법을 HDART 상에서의 Skip와의 상호작용에 관여하는 영역을 분석하기 위해서 실시하였다. 즉, Gal4 DBD-HDART의 여러가지 결실 돌연변이체를 제조하고, 이것을 Gal4AD-Skip와 작용시켰을 때의 갈락토시다제 활성을 분석하였다. 이 분석 결과를 도 5B에 나타내었다. 4 개의 TPR을 포함하는 N 말단 영역 (1-179 잔기)은 Skip와의 상호작용에 필요 충분 조건인 것으로 나타났다 (도 5B). 따라서, HDART는 N 말단의 4 개의 TPR 영역을 통하여 Skip와 직접 상호작용한다.

<실시예 4>

HDART에 의한, 핵내 수용체에서 기인한 유전자의 전사 억제

상기 실시예에서 HDART가 Skip와 상호작용할 수 있는 것으로 나타났기 때문에, 핵내 수용체에서 기인한 전사 경로에 대한 HDART의 기능적인 역할을 분석하였다. 우선, 레티노산 수용체에 의한 전사 제어에 있어서의 HDART의 작용을 분석하였다. 이 목적을 위하여, 레티노이드 반응 요소 (retinoid response element)의 하류에 티미딘 키나아제 최소 프로모터 (pTREpal-tata)와 CAT 유전자를 조합한 RAR (레티노산 수용체; retinoic acid receptor) 리포터 플라스미드를 사용하여 CAT 분석을 행하였다.

구체적으로는, HepG2 세포에 RAR 리포터 플라스미드와 동시에, HDART를 정상적으로 발현하는 pcDNA3-HDART를 이펙텐 키트 (QIAGEN)에 의해 형질감염시켰다. 또한, pcDNA3-HDART 발현 벡터의 도입량을 0, 0.5, 1.0 ㎍으로 다르게 하고, 각 형질감염의 DNA량을 동일하게 하기 위하여 pcDNA 공 벡터로 1 ㎍이 되도록 조정하였다. 형질감염 후, ATRA (10^-8 M)의 존재 또는 부재하에 생육시켜, 그 때의 CAT 활성을 측정하였다. 측정 결과 (도 6)는, ATRA 부재하에 공 벡터 1.0 ㎍을 도입한 CAT 활성을 기준으로 보정한 값을 나타내었다. 또한, 3 회의 실험 결과에 대한 평균, 및 에러 바에 의한 표준 편차를 나타내었다.

도 6A에 나타낸 바와 같이, CAT 활성은 공 벡터 (pcDNA)가 도입된 세포를 사용한 경우와 비교시 ATRA에 의해 5 배 상승하였다. 그러나, ATRA에서 유도된 상기 CAT 활성은 HDART에 의해 농도 의존적으로 억제되었다.

또한, 글루코코르티코이드 수용체 (GR)에 의한 전사 제어에 있어서의 HDART의 작용은, GR 양성 Hela 세포 내에서 GR 리포터 플라스미드를 사용하여 분석하였다. 글루코코르티코이드 반응성 프로모터의 전사 활성화는, HeLa 세포 및 10^-8 M의 덱사메타존을 대신 사용한 점을 제외하고 상기 레티노산 수용체에 대한 실험과 동일하게 행하였다. 측정 결과의 표시도 상기와 동일하게 행하였다.

HDART의 동시 발현은, RAR (레티노산 수용체)에서 기인한 트랜스 활성화로 인해 관찰된 억제와 동일한 정도로, 글루코코르티코이드에 반응한 리포터 유전자의 활성화를 억제하였다 (도 6B). 이러한 결과는, HDART가 핵내 수용체에 의해서 활성화된 전사를 선택적으로 억제한다는 것을 나타낸다.

<실시예 5>

세포 핵내에서의 HDART의 국재

HDART가 전사 제어에 직접 관여하는 것으로 나타났기 때문에, HDART는 세포의 핵내에 국재할 것으로 예상된다. 그 때문에, HDART 재조합 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 제조하고, 이것을 면역 형광 실험에 의해 HDART의 세포 내의 국재를 분석하였다.

폴리클로날 항체의 제조는, 우선 대장균에서 His-HDART (아미노산 잔기 296- 431)의 융합 단백질로서 생산시키고, His와 친화성이 있는 Ni-NTA 수지 (QIAGEN)로 정제하였다. 다음으로, 이 His-HDART 단백질을 토끼에게 면역화시키고, 얻어진 항-HDART 항혈청을, 프로트온 (ProtOn) 키트 1 (MPS)를 사용한 친화도-크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 이와 같이 정제된 토끼 항-HDART 항체를, 내재적으로 HDART를 보유하는 Hela 세포와 인큐베이션시키고, 그 후 PE (피코에리트린; Phycoerythrin) 융합 항-토끼 항체와 인큐베이션시켜 면역 형광 염색을 행하였다. 또한, 대조군 실험으로서 토끼 항-HDART 항체 대신에 면역화 전의 토끼 혈청을 사용하여 동일한 조작을 수행하였다. 또한, 핵의 소재를 명확하게 하기 위해서 DAPI 염색도 행하였다.

도 7A에 나타낸 바와 같이, 항-HDART 항체를 사용한 면역 형광 염색상은 DAPI 염색상과 일치하였다. 한편, 면역화 전의 혈청에 대해서는 핵이 염색되지 않았다. 이들 결과로부터, HDART는 Hela 세포의 핵내에 우세하게 국재하고 있는 것이 확인되었다 (도 7).

또한, 생존하고 있는 세포에서의 HDART의 국재를 분석하였다. Hela 세포에 GFP 또는 GFP-HDART 발현 벡터를 형질감염시키고, 24 시간 후에 GFP에 의한 형광 발광을 검출하였다. 또한, GFP-HDART 세포에 있어서는, 핵을 시각화하기 위해 획스트 33342 염료를 사용하여 인큐베이션을 행하였다.

도 7B에 나타낸 바와 같이, GFP-HDART 벡터로 형질감염된 세포에 대해서는, 획스트 33342 염료 (우측 상단 패널)로 시각화된 핵이 GFP에 의해 형광을 발광하고 있다는 것이 확인되었다 (좌측 상단 패널). 특히, GFP-HDART는 이미 보고되어 있 는 Skip 분자의 핵 스펙클 (speckle) 패턴 (17)과 부분적으로 유사한 패턴을 나타내었다. 유사한 결과가 HT1080 세포 및 293 세포에 대해서도 관찰되었다 (도시하지 않음).

<실시예 6>

HDART에 의한 자발적인 억제 기능

HDART가 보다 직접적인 억제에 관여한다고 가정한 경우, 자발적인 억제 기능을 가질 것으로 예상되었다. 이 예상을 확인하기 위해서, HDART를 DNA에 접속시키기 위해 전장의 HDART cDNA를 Gal4 DNA 결합 영역 (Gal4 DBD: Gal4 DNA와의 결합 영역만을 갖고, 전사 제어 영역을 갖지 않는 영역)에 융합시켜, NIH3T3 세포 내에서 Gal4 프로모터로부터의 전사를 조절할 수 있는지 분석하였다.

구체적으로는, Gal4 리포터 플라스미드 (pGal4-Luciferase)가 미리 도입된 NIH3T3 세포에, HDART 전장 단백질과 Gal4 DBD와의 융합 단백질을 발현하는 Gal4 DBD-HDART 플라스미드를 상이한 도입량 (0, 0.1, 0.3, 0.5 ㎍)으로 형질감염시켰다. 또한, 형질감염에 사용된 전체 DNA량을 균일하게 하기 위해서, 각각의 형질감염에 있어서 Gal4 DBD의 공 벡터를 사용하여 발현 벡터의 양을 0.5 ㎍으로 조정하였다. 형질감염 24 시간 후에, 프로모터로부터의 리포터 유전자 발현 활성 (루시퍼라제 활성)을 분석하였다. 각 샘플의 루시퍼라제 활성은, 공 벡터만 도입하였을 때의 루시퍼라제 활성 (100 ％)을 기준으로 보정한 값으로 나타내었다 (도 8). 또한, 분석 결과는 3 회의 실험 결과에 대한 평균으로 나타내고, 또한 표준 편차를 에러 바에 의해 나타내었다 (도 8A). 또한, Gal4 DBD-HDART (도입량 0 또는 0.5 ㎍)을 사용하여 별도의 세포인 U-2OS 세포에서도 동일한 분석을 행하였다 (도 8B).

HDART는 NIH-3T3 세포 내에서의 프로모터 활성을 농도 의존적으로 현저히 억제하고, 가장 높은 농도 (0.5 ㎍)에서는 루시퍼라제의 발현을 80 ％ 저하시켰다 (도 8A). 유사한 결과가 U-2OS 세포에서도 관찰되었다 (도 8B). 이들 결과로부터, HDART는 그 자체가 자발적인 전사 억제 작용을 갖고 있음을 알 수 있었다.

또한, Gal4 DNA 결합 영역을 갖지 않은 HDART의 경우에는, 루시퍼라제의 발현 억제가 전혀 나타나지 않았다 (도시하지 않음). 이로부터, HDART는 그 자체가 프로모터 영역의 DNA로의 결합 활성을 갖지 않는 것으로 여겨진다.

<실시예 7>

HDART에서 기인한 억제 메카니즘

급성의 전사 조절은, HAT (히스톤 아세틸화 효소)에 의한 활성화, 및 HDAC (히스톤 탈아세틸화 효소)에 의한 억제가 관여하는 메카니즘을 통한 코어 히스톤의 아세틸화 상태에 의해 제어된다는 것이 보고되어 있다. HDART에서 기인한 유전자 억제의 메카니즘을 밝히기 위해서, HDART의 기능이 HDAC와의 복합체 형성을 통하여 발휘되는지 아닌지를, Flag-HDAC 발현 벡터를 사용한 면역침강 분석에 의해 조사하였다.

다른 유형의 HDAC (1, 3, 4 또는 6)을 발현할 수 있는 Flag-HDAC 발현 벡터, 및 GFP-HDART 발현 벡터를 실시예 2와 마찬가지로 293 세포에 동시 형질감염시키고, 형질감염 24 시간 후에 세포 추출액을 제조하였다. 각 세포 추출액을 항-Flag 항체와 인큐베이션시켜 면역침강을 행하였다. 면역침강 산물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 분리한 패턴을 막에 전사한 후, 항-Flag 항체 또는 항-GFP 항체를 사용하여 면역블롯팅을 행하였다. 참고로, 각 세포에 있어서의 GFP-HDART 단백질의 발현을 확인하기 위해, 면역침강 전의 각 샘플을 마찬가지로 SDS-PAGE로 전개하고, 항-GFP 항체를 사용하여 면역블롯팅을 수행하였다. 또한 도 9A에서, 상부 패널은 면역침강 전의 GFP-HDART 단백질의 발현 결과를 나타내고, 중앙 패널은 면역침강 산물을 항-Flag 항체로 면역블롯팅한 결과를 나타내고, 하부 패널은 면역침강 산물을 항-GFP 항체로 면역블롯팅한 결과를 나타낸다. 또한, HDAC의 종류는 도면 좌측에서부터 레인 1; HDAC 1, 레인 3; HDAC 3, 레인 4; HDAC 4, 레인 5; HDAC 6이다. 또한, 레인 2는 GFP-HDART만을 발현시킨 샘플이다.

도 9A에 나타낸 바와 같이, Flag-HDAC 발현 벡터와 GFP-HDART 발현 벡터가 동시 형질감염된 293 세포 유래의 추출액에 대해서는, 항-Flag 항체에 의해서 GFP-HDART가 면역침강된 것으로 확인되었다 (하부 패널, 좌측에서부터 레인 1, 3, 4, 5). 그러나, Flag-HDAC 부재하 (Flag-HDAC 발현 벡터가 도입되지 않은 세포주)에서는, 항-Flag 항체를 첨가하여도 GFP-HDART의 침강은 볼 수 없었다 (하부 패널, 레인 2). 따라서, 항-Flag 항체에 의한 GFP-HDART의 침전은 Flag-HDAC와 GFP-HDART 사이의 특이적인 상호작용에 의한 것으로 증명되었다. 또한, HDART는 유형 I (HDAC 1 및 3)과 유형 II (HDAC 4 및 6)의 2가지 유형의 HDAC와 상호작용한다는 것도 입증되었다.

또한, HDART와 HDAC3 사이의 직접적인 상호작용을 GST 풀다운 (pulldown) 분석에 의해 조사하였다. GST 풀다운 분석은 기본적으로 이미 알려진 방법에 의해서 실시하였다 (Tzamarias, D., and Struhl, K. (1995) Genes Dev 9 (7), 821-31). TNT (등록 상표) 시험관내 전사ㆍ번역 시스템 (Promega)을 사용하여, ³⁵S-메틸오닌의 존재하에서 HDAC3의 시험관내 번역을 행하였다. GST 단백질 또는 GST-HDART 융합 단백질은, 각각 대장균 내에서 발현시키고, GST 결합 완충액 (50 mM 트리스-HCl, 200 mM LiCl, 0.5 ％ NP40, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF) 중에서 글루타티온 세파로스를 사용하여 정제하였다. GST 결합 완충액 1 ml 중, GST-HDART 융합 단백질 또는 대조군 GST 단백질 (약 1 ㎍)과 ³⁵S-방사선 표지 시험관내 번역 산물 (10 ㎕)을 함유하는 결합 반응액을 제조하였다. 이 반응액을 진탕하면서 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세파로스-GST 단백질 복합체를 GST 결합 완충액으로 5 회 세정하였다. GST 단백질에 결합한 단백질을 도데실 황산나트륨 (SDS) 함유 샘플 완충액 중에서 비등시킴으로서 용출시켜, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. GST 융합 단백질이 동등하게 전기영동되어 있다는 것을 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue) 염색에 의해 확인하였고, 또한 방사선 분석법에 의해 ³⁵S-방사선으로 표지된 HDAC를 검출하였다.

도 9B에 나타내고 있는 바와 같이, 시험관내에서 번역된 HDAC3은 GST 단백질 단독과는 결합하지 않아서 풀다운시킬 수 없었지만, GST-HDART 융합 단백질을 사용한 경우에 풀다운되는 것으로 나타났다 (도 9B). 또한, 도면에는 표시되어 있지 않지만, HDAC1에서도 동일한 결과가 나타났다. 이것으로부터, HDART와 HDAC와의 상호작용은 직접적인 것으로 시사되었다.

또한, HDART의 전사 억제 작용에 대한 HDAC의 탈아세틸화 활성의 영향을 분석하기 위해, HDAC를 특이적으로 저해하는 트리코스타틴 A (TSA)의 존재하에 실시예 4와 마찬가지로 CAT 리포터 분석을 행하였다 (도 10의 C 및 D). 단, 본 실시예에서는 일정량의 pcDNA3-HDART 발현 벡터 (1 ㎍)를 사용하고 (도 10 중 "HDART+"), 또한 리간드 (ATRA 또는 덱사메타존)와 함께 100 nM TSA 또는 1 mM 부티르산나트륨을 첨가하였다.

도 10의 C, D에 나타낸 바와 같이, 리간드만 사용하는 경우에는 대응하는 프로모터로부터의 리포터 유전자 발현이 상승하고, 거기에 HDART를 발현시키면 발현 활성이 억제되었다. 또한, 트리코스타틴 A가 첨가되면, HDART에 의한 발현 억제가 완전히 중화되었다. 동일한 결과가 또 다른 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제, 부티르산나트륨 (Buty)을 첨가한 경우에도 관찰되었다. 이들 결과는, HDART에 의한 전사 억제가 탈아세틸화 효소의 활성을 통해 발휘하고 있다는 것을 뒷받침하고 있다.

<실시예 8>

HDART-Skip 상호작용에 의한 리간드 비결합형 수용체 (unliganded receptor)의 능동 억제

RAR 및 TR은 생체내 (Baniahmad, A., Kohne, A. C., and Renkawitz, R. (1992) Embo J 11 (3), 1015-23) 및 시험관내 (Fondell, J. D., Roy, A. L., and Roeder, R. G. (1993) Genes Dev 7 (7B), 1400-10)에서 리간드 부재하에 유전자 활성화를 억제한다. 이러한 사실로부터 이를 능동 억제 (active repression)라 칭하고 있다. 또한, Skip은 리간드에 독립적으로 NHR과 상호작용한다 (MacDonald, P. N., Baudino, T. A., Tokumaru, H., Dowd, D. R., and Zhang, C. (2001) Steroids 66 (3-5), 171-6). 그 때문에, 이들 억제 효과 및 Skip와의 생리적인 관여에 의해, HDART-Skip 복합체가 리간드 비결합형 수용체 상에 존재할 가능성, 또는 이 상호작용이 수용체의 능동 억제에 관여할 가능성이 시사되었다. 이들 가능성을 밝히기 위해서, HDART의 우성 음성 세포주를 과다발현시켜, 그 때의 RAR에서 기인한 전사에 대한 영향을 조사하였다. 실시예 2에 나타낸 바와 같이, HDART N 말단의 4개의 TPR (N4TPR)은 Skip 결합 영역이기 때문에, 이 영역의 발현이 내재 HDART와 Skip와의 상호작용을 저해함으로써 HDART의 천연 기능을 저해하여 우성 음성으로 기능한다는 것이 예상되었고, 따라서 본 실시예에서는 N4TPR을 우성 음성 후보로서 사용하였다.

293 세포에 Flag-Skip 및 GFP 또는 GFP 태그가 부착된 (tagged) N4TPR을 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후에 세포 추출물을 제조하고, 항-Flag 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물을 SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 또한, 면역침강 전의 내재성 HDART의 발현을 확인하기 위해서, 면역침강 전의 세포 추출액도 마찬가지로 SDS-PAGE로 분리하였다. 분리 후의 패턴을 막에 전사하였다. 그리고, Flag-Skip의 발현에 대해서는 항-Flag 항체를 사용하여 검출하고, GFP 및 GFP-N4TPR의 발현에 대해서는 항-GFP 항체를 사용하여 검출하였으며, 내재 HDART의 발현에 대해서는 항-HDART 항체를 사용하여 검출하였다 (도 11A). 또한, 도 11A에서, 하측의 3개의 패널은 각각 면역침강된 Skip (하부 위), 내재성 HDART (하부 중앙) 및 N4TPR (하부 밑)을 나타내고, 상부의 1개의 패널은 면역침강 전의 내재성 HDART 단 백질의 발현을 나타낸다.

도 11A에 나타낸 바와 같이, N4TPR의 발현은 N4TPR을 발현하지 않은 대조군 (GFP 단독, 레인 1)에 비하여 Skip와 동시 침전된 HDART의 양을 감소시켰다 (하부 중앙 패널, 레인 2). 한편, N4TPR의 과다발현은 N4TPR와 Skip와의 상호작용을 증가시켜, 동시 침전된 Skip의 양을 현저히 상승시켰다 (하부 밑 패널, 레인 2). 대조군 단백질 (GFP)의 발현은 HDART와 Skip와의 상호작용에 대하여 영향이 없었다 (레인 1). 이 결과는, N4TPR가 HDART 대신 Skip와 상호작용하는 우성 음성 단백질로서 작용한다는 것을 나타내고 있다.

다음으로, N4TPR의 과다발현이 RAR 또는 글루코코르티코이드 반응성 프로모터로부터의 전사에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 여기서는 GFP-N4TPR 발현 벡터 (0, 0.3, 0.5 ㎍)을 사용한 점을 제외하고, 상기 실시예 4에 기재된 리포터 분석과 동일한 방법에 의해 검토하였다.

결과는 도 11의 B, C에 나타낸 바와 같이, 리간드 부재하에 N4TPR을 제한하여 발현시킴으로써 (도입량 0.3 ㎍), RAR 및 글루코코르티코이드 반응성 프로모터로부터의 전사 활성을 리간드 존재하에서 유도한 전사 활성의 정도 (회색 칼럼)까지 증가시켰다. N4TPR의 가장 높은 발현 수준에서는 (도입량 0.5 ㎍), 리간드 부재하에서 전사 활성을 강하게 증가 (약 20 배까지)시켰다. 이들의 결과는 HDART가 RAR이나 글루코코르티코이드 수용체 등 핵내 호르몬계 수용체의 능동 제어에 있어 필요하다는 것을 시사하고 있다.

<실시예 9>

레티노산 유도에 의한 횡문근육종 유래 세포주 (rhabdomyosarcoma cell line)의 근 조직으로의 분화를 HDART의 과다발현에 의해 저해함

ATRA (올-트랜스 레티노산)는 종양 세포의 분화에 중요한 유도물질인 것으로 알려져 있다 (20-22). 인간 횡문근육종 유래의 세포주 MM-1-19-P는 주로 작은 다각형의 세포로부터 구성되고, 최종적으로 레티노산을 구비한 근관 모양의 거대 세포로 분화된다. 핵내 호르몬계 수용체에서 기인한 반응에 있어서의 HDART의 생리학적인 역할을 밝히기 위해서, ATRA에 의한 MM-1-19-P의 근조직 분화에 대하여 HDART 발현이 미치는 영향을 분석하였다.

100 mm의 페트리 접시 상에 MM-1-19-P 세포를 플레이팅하고, 이 세포에 0.4 ㎍의 pGFP 벡터와 2 ㎍의 pcDNA3 (공 벡터) 또는 pcDNA3-HDART (HDART 발현 벡터)를 동시 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후에, 배지를 ATRA 함유 (2 μM) 또는 ATRA 무함유의 신선한 배지로 교환하였다. 48 시간의 유도 후, 세포가 근관 모양의 거대 세포를 나타내는 가늘고 긴 방추 세포로 변화된 시점에서, 형태학적으로 분화한 것으로서 세포를 평가하였다. 모든 실험을 4 회 반복하고, GFP에 대해서 양성인 것과 평가가 끝난 세포의 수를 계수하였다. 결과를 도 12에 나타내었다. 또한, 도 12에 있어서, GFP의 녹색 발광의 표준 현미경 사진을 패널 A, B, C, D에 나타내고, 위상차 현미경 사진을 패널 E, F에 나타내었다. 또한, (A)는 ATRA 비처리 및 공 벡터 도입 세포, (B)는 ATRA 처리 및 공 벡터 도입 세포, (C)는 ATRA 비처리 및 HDART 발현 벡터 도입 세포, (D)는 ATRA 처리 및 HDART 발현 벡터 도입 세포, (E)는 상기 (C)와 동일한 조건의 세포, (F)는 상기 (D)와 동일한 조건의 세포 를 나타낸다. 또한, 패널 F에서, 흑색 화살표는 미분화 GFP 양성 세포를 나타내고, 백색 화살표는 분화된 세포를 나타낸다. (G) 그래프는 GFP 양성 세포 중 형태학적으로 분화된 세포의 백분률을 4회의 독립적인 실험 결과에 대한 평균으로 나타내고, 또한 표준 편차는 에러 바로 표시하였다 (공 벡터 및 ATRA (+)와 HDART 발현 벡터 사이에서 P<1 ％, 스튜던트 t 테스트).

각 실험에 있어서, GFP 양성 세포수는 30 내지 70개였다. 공 벡터를 도입하여 ATRA로 처리한 세포에서는 GFP 양성의 세포수가 ATRA의 세포 독성 효과로 인해 30 ％ 미만인 한편, HDART 발현 벡터를 도입한 세포에서는 ATRA 처리군과 비처리군에 대해 GFP 양성의 세포수가 동일하였다.

공 벡터가 도입된 세포의 대부분은, ATRA 처리에 의해서, 근관 모양의 거대 세포의 출현으로 알 수 있듯이 근 조직으로 분화되었다 (도 12B, 도 12G). 또한, 공 벡터가 도입된 세포에서는, ATRA 처리에 의한 표현형의 변화 정도가 GFP 양성 및 음성의 세포 둘 다에서 동일하였다. 그러나, HDART가 도입된 세포의 경우, GFP 양성 세포는 ATRA 처리를 행하여도 표현형의 변화가 거의 없었지만 (도 12D의 흑색 화살표, 도 12G), GFP 음성 세포에서는 특징적인 근관 모양의 거대 세포가 관찰되었다 (도 12F의 백색 화살표). 이 결과는, HDART의 발현이 레티노산에 의한 분화를 억제하는 것을 나타내고 있다. 그리고, 이 결과는 리포터 분석에서 HDART가 RAR에 의한 전사 활성화를 억제한다는 결과와 일치한다. 이러한 결과는, HDART가 적어도 레티노산 수용체에 있어서의 생리학적인 전사의 보조 억제 인자임을 나타내고 있다.

상술한 바와 같이 본 발명의 전사 억제 인자는, 자발적으로 전사를 억제하고, 특히 핵내 수용체의 전사를 억제하기 때문에, 원하는 전사 시스템에 작용시켜 이 전사 시스템의 전사를 억제할 목적으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 전사 억제 인자는 HDAC와의 결합능을 가지고, 이 HDAC의 히스톤 탈아세틸화 활성을 통하여 전사 억제능을 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명의 전사 억제 인자를 이용하여 HDAC를 모이게 함으로써, HDAC의 작용에 의해서 전사를 억제할 수도 있다. 본 발명의 전사 억제 인자의 이러한 작용은, 예를 들면 핵내 수용체의 전사 증가에서 기인하는 질환에 응용할 수 있는 것으로, 이러한 질환의 치료약으로서 본 발명의 전사 억제 인자가 유익하다.

또한, 상기 전사 억제 인자의 우성 음성 펩티드는 전사 활성화 인자로서 기능한다. 따라서, 이 우성 음성 펩티드는 전사를 촉진시키기 위해 사용할 수 있다. 또한, 이 우성 음성 펩티드는 핵내 수용체의 전사에 작용하여 그 전사를 반대로 촉진시킨다. 그 때문에, 핵내 수용체의 전사 촉진 물질로서 본 발명의 펩티드가 유익하다. 특히, HDART의 N 말단측의 4 개의 TPR (N4TPR)는, ATRA에 비하여 레티노산 수용체의 전사 활성화능이 높기 때문에, 현재 ATRA가 사용되고 있는 질환의 치료 (예를 들면, 악성 종양의 분화 유도 요법 등)에 있어서, ATRA 대신에 또는 ATRA와 함께 본 발명의 펩티드를 치료약으로서 응용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> MIZUTANI, Shuki YAMADA, Takayuki <120> Transcription regulating factors <130> SEN-A0122P <140> <141> <150> JP 2002-217233 <151> 2002-07-25 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2684 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (37)..(2601) <400> 1 agcgcgcgac tctcctgtac ctgggcatcc agaaaa atg gtg gtg atg gcg cga 54 Met Val Val Met Ala Arg 1 5 ctt tcg cgg ccc gag cgg ccg gac ctt gtc ttc gag gaa gag gac ctc 102 Leu Ser Arg Pro Glu Arg Pro Asp Leu Val Phe Glu Glu Glu Asp Leu 10 15 20 ccc tat gag gag gaa atc atg cgg aac caa ttc tct gtc aaa tgc tgg 150 Pro Tyr Glu Glu Glu Ile Met Arg Asn Gln Phe Ser Val Lys Cys Trp 25 30 35 ctt cgc tac atc gag ttc aaa cag ggc gcc ccg aag ccc agg ctc aat 198 Leu Arg Tyr Ile Glu Phe Lys Gln Gly Ala Pro Lys Pro Arg Leu Asn 40 45 50 cag cta tac gag cgg gca ctc aag ctg ctg ccc tgc agc tac aaa ctc 246 Gln Leu Tyr Glu Arg Ala Leu Lys Leu Leu Pro Cys Ser Tyr Lys Leu 55 60 65 70 tgg tac cga tac ctg aag gcg cgt cgg gca cag gtg aag cat cgc tgt 294 Trp Tyr Arg Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ala Gln Val Lys His Arg Cys 75 80 85 gtg acc gac cct gcc tat gaa gat gtc aac aac tgt cat gag agg gcc 342 Val Thr Asp Pro Ala Tyr Glu Asp Val Asn Asn Cys His Glu Arg Ala 90 95 100 ttt gtg ttc atg cac aag atg cct cgt ctg tgg cta gat tac tgc cag 390 Phe Val Phe Met His Lys Met Pro Arg Leu Trp Leu Asp Tyr Cys Gln 105 110 115 ttc ctc atg gac cag ggg cgc gtc aca cac acc cgc cgc acc ttc gac 438 Phe Leu Met Asp Gln Gly Arg Val Thr His Thr Arg Arg Thr Phe Asp 120 125 130 cgt gcc ctc cgg gca ctg ccc atc acg cag cac tct cga att tgg ccc 486 Arg Ala Leu Arg Ala Leu Pro Ile Thr Gln His Ser Arg Ile Trp Pro 135 140 145 150 ctg tat ctg cgc ttc ctg cgc tca cac cca ctg cct gag aca gct gtg 534 Leu Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Ser His Pro Leu Pro Glu Thr Ala Val 155 160 165 cga ggc tat cgg cgc ttc ctc aag ctg agt cct gag agt gca gag gag 582 Arg Gly Tyr Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ser Pro Glu Ser Ala Glu Glu 170 175 180 tac att gag tac ctc aag tca agt gac cgg ctg gat gag gcc gcc cag 630 Tyr Ile Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Arg Leu Asp Glu Ala Ala Gln 185 190 195 cgc ctg gcc acc gtg gtg aac gac gag cgt ttc gtg tct aag gcc ggc 678 Arg Leu Ala Thr Val Val Asn Asp Glu Arg Phe Val Ser Lys Ala Gly 200 205 210 aag tcc aac tac cag ctg tgg cac gag ctg tgc gac ctc atc tcc cag 726 Lys Ser Asn Tyr Gln Leu Trp His Glu Leu Cys Asp Leu Ile Ser Gln 215 220 225 230 aat ccg gac aag gta cag tcc ctc aat gtg gac gcc atc atc cgc ggg 774 Asn Pro Asp Lys Val Gln Ser Leu Asn Val Asp Ala Ile Ile Arg Gly 235 240 245 ggc ctc acc cgc ttc acc gac cag ctg ggc aag ctc tgg tgt tct ctc 822 Gly Leu Thr Arg Phe Thr Asp Gln Leu Gly Lys Leu Trp Cys Ser Leu 250 255 260 gcc gac tac tac atc cgc agc ggc cat ttc gag aag gct cgg gac gtg 870 Ala Asp Tyr Tyr Ile Arg Ser Gly His Phe Glu Lys Ala Arg Asp Val 265 270 275 tac gag gag gcc atc cgg aca gtg atg acc gtg cgg gac ttc aca cag 918 Tyr Glu Glu Ala Ile Arg Thr Val Met Thr Val Arg Asp Phe Thr Gln 280 285 290 gtg ttt gac agc tac gcc cag ttc gag gag agc atg atc gct gca aag 966 Val Phe Asp Ser Tyr Ala Gln Phe Glu Glu Ser Met Ile Ala Ala Lys 295 300 305 310 atg gag acc gcc tcg gag ctg ggg cgc gag gag gag gat gat gtg gac 1014 Met Glu Thr Ala Ser Glu Leu Gly Arg Glu Glu Glu Asp Asp Val Asp 315 320 325 ctg gag ctg cgc ctg gcc cgc ttc gag cag ctc atc agc cgg cgg ccc 1062 Leu Glu Leu Arg Leu Ala Arg Phe Glu Gln Leu Ile Ser Arg Arg Pro 330 335 340 ctg ctc ctc aac agc gtc ttg ctg cgc caa aac cca cac cac gtg cac 1110 Leu Leu Leu Asn Ser Val Leu Leu Arg Gln Asn Pro His His Val His 345 350 355 gag tgg cac aag cgt gtc gcc ctg cac cag ggc cgc ccc cgg gag atc 1158 Glu Trp His Lys Arg Val Ala Leu His Gln Gly Arg Pro Arg Glu Ile 360 365 370 atc aac acc tac aca gag gct gtg cag acg gtg gac ccc ttc aag gcc 1206 Ile Asn Thr Tyr Thr Glu Ala Val Gln Thr Val Asp Pro Phe Lys Ala 375 380 385 390 aca ggc aag ccc cac act ctg tgg gtg gcg ttt gcc aag ttt tat gag 1254 Thr Gly Lys Pro His Thr Leu Trp Val Ala Phe Ala Lys Phe Tyr Glu 395 400 405 gac aac gga cag ctg gac gat gcc cgt gtc atc ctg gag aag gcc acc 1302 Asp Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ala Arg Val Ile Leu Glu Lys Ala Thr 410 415 420 aag gtg aac ttc aag cag gtg gat gac ctg gca agc gtg tgg tgt cag 1350 Lys Val Asn Phe Lys Gln Val Asp Asp Leu Ala Ser Val Trp Cys Gln 425 430 435 tgc gga gag ctg gag ctc cga cac gag aac tac gat gag gcc ttg cgg 1398 Cys Gly Glu Leu Glu Leu Arg His Glu Asn Tyr Asp Glu Ala Leu Arg 440 445 450 ctg ctg cga aag gcc acg gcg ctg cct gcc cgc cgg gcc gag tac ttt 1446 Leu Leu Arg Lys Ala Thr Ala Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Tyr Phe 455 460 465 470 gat ggt tca gag ccc gtg cag aac cgc gtg tac aag tca ctg aag gtc 1494 Asp Gly Ser Glu Pro Val Gln Asn Arg Val Tyr Lys Ser Leu Lys Val 475 480 485 tgg tcc atg ctc gcc gac ctg gag gag agc ctc ggc acc ttc cag tcc 1542 Trp Ser Met Leu Ala Asp Leu Glu Glu Ser Leu Gly Thr Phe Gln Ser 490 495 500 acc aag gcc gtg tac gac cgc atc ctg gac ctg cgt atc gca aca ccc 1590 Thr Lys Ala Val Tyr Asp Arg Ile Leu Asp Leu Arg Ile Ala Thr Pro 505 510 515 cag atc gtc atc aac tat gcc atg ttc ctg gag gag cac aag tac ttc 1638 Gln Ile Val Ile Asn Tyr Ala Met Phe Leu Glu Glu His Lys Tyr Phe 520 525 530 gag gag agc ttc aag gcg tac gag cgc ggc atc tcg ctg ttc aag tgg 1686 Glu Glu Ser Phe Lys Ala Tyr Glu Arg Gly Ile Ser Leu Phe Lys Trp 535 540 545 550 ccc aac gtg tcc gac atc tgg agc acc tac ctg acc aaa ttc att gcc 1734 Pro Asn Val Ser Asp Ile Trp Ser Thr Tyr Leu Thr Lys Phe Ile Ala 555 560 565 cgc tat ggg ggc cgc aag ctg gag cgg gca cgg gac ctg ttt gaa cag 1782 Arg Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Glu Arg Ala Arg Asp Leu Phe Glu Gln 570 575 580 gct ctg gac ggc tgc ccc cca aaa tat gcc aag acc ttg tac ctg ctg 1830 Ala Leu Asp Gly Cys Pro Pro Lys Tyr Ala Lys Thr Leu Tyr Leu Leu 585 590 595 tac gca cag ctg gag gag gag tgg ggc ctg gcc cgg cat gcc atg gcc 1878 Tyr Ala Gln Leu Glu Glu Glu Trp Gly Leu Ala Arg His Ala Met Ala 600 605 610 gtg tac gag cgt gcc acc agg gcc gtg gag ccc gcc cag cag tat gac 1926 Val Tyr Glu Arg Ala Thr Arg Ala Val Glu Pro Ala Gln Gln Tyr Asp 615 620 625 630 atg ttc aac atc tac atc aag cgg gcg gcc gag atc tat ggg gtc acc 1974 Met Phe Asn Ile Tyr Ile Lys Arg Ala Ala Glu Ile Tyr Gly Val Thr 635 640 645 cac acc cgc ggc atc tac cag aag gcc att gag gtg ctg tcg gac gag 2022 His Thr Arg Gly Ile Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Val Leu Ser Asp Glu 650 655 660 cac gcg cgt gag atg tgc ctg cgg ttt gca gac atg gag tgc aag ctc 2070 His Ala Arg Glu Met Cys Leu Arg Phe Ala Asp Met Glu Cys Lys Leu 665 670 675 ggg gag att gac cgc gcc cgg gcc atc tac agc ttc tgc tcc cag atc 2118 Gly Glu Ile Asp Arg Ala Arg Ala Ile Tyr Ser Phe Cys Ser Gln Ile 680 685 690 tgt gac ccc cgg acg acc ggc gcg ttc tgg cag acg tgg aag gac ttt 2166 Cys Asp Pro Arg Thr Thr Gly Ala Phe Trp Gln Thr Trp Lys Asp Phe 695 700 705 710 gag gtc cgg cat ggc aat gag gac acc atc aag gaa atg ctg cgt atc 2214 Glu Val Arg His Gly Asn Glu Asp Thr Ile Lys Glu Met Leu Arg Ile 715 720 725 cgg cgc agc gtg cag gcc acg tac aac acg cag gtc aac ttc atg gcc 2262 Arg Arg Ser Val Gln Ala Thr Tyr Asn Thr Gln Val Asn Phe Met Ala 730 735 740 tcg cag atg ctc aag gtc tcg ggc agt gcc acg ggc acc gtg tct gac 2310 Ser Gln Met Leu Lys Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly Thr Val Ser Asp 745 750 755 ctg gcc cct ggg cag agt ggc atg gac gac atg aag ctg ctg gaa cag 2358 Leu Ala Pro Gly Gln Ser Gly Met Asp Asp Met Lys Leu Leu Glu Gln 760 765 770 cgg gca gag cag ctg gcg gct gag gcg gag cgt gac cag ccc ttg cgc 2406 Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Glu Ala Glu Arg Asp Gln Pro Leu Arg 775 780 785 790 gcc cag agc aag atc ctg ttc gtg agg agt gac gcc tcc cgg gag gag 2454 Ala Gln Ser Lys Ile Leu Phe Val Arg Ser Asp Ala Ser Arg Glu Glu 795 800 805 ctg gca gag ctg gca cag cag gtc aac ccc gag gag atc cag ctg ggc 2502 Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gln Val Asn Pro Glu Glu Ile Gln Leu Gly 810 815 820 gag gac gag gac gag gac gag atg gac ctg gag ccc aac gag gtt cgg 2550 Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Met Asp Leu Glu Pro Asn Glu Val Arg 825 830 835 ctg gag cag cag agc gtg cca gcc gca gtg ttt ggg agc ctg aag gaa 2598 Leu Glu Gln Gln Ser Val Pro Ala Ala Val Phe Gly Ser Leu Lys Glu 840 845 850 gac tgacccgtcc ctcccccatc ccccctcccc accccctccc caatacagct 2651 Asp 855 acgtttgtac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2684 <210> 2 <211> 855 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Val Met Ala Arg Leu Ser Arg Pro Glu Arg Pro Asp Leu Val 1 5 10 15 Phe Glu Glu Glu Asp Leu Pro Tyr Glu Glu Glu Ile Met Arg Asn Gln 20 25 30 Phe Ser Val Lys Cys Trp Leu Arg Tyr Ile Glu Phe Lys Gln Gly Ala 35 40 45 Pro Lys Pro Arg Leu Asn Gln Leu Tyr Glu Arg Ala Leu Lys Leu Leu 50 55 60 Pro Cys Ser Tyr Lys Leu Trp Tyr Arg Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ala 65 70 75 80 Gln Val Lys His Arg Cys Val Thr Asp Pro Ala Tyr Glu Asp Val Asn 85 90 95 Asn Cys His Glu Arg Ala Phe Val Phe Met His Lys Met Pro Arg Leu 100 105 110 Trp Leu Asp Tyr Cys Gln Phe Leu Met Asp Gln Gly Arg Val Thr His 115 120 125 Thr Arg Arg Thr Phe Asp Arg Ala Leu Arg Ala Leu Pro Ile Thr Gln 130 135 140 His Ser Arg Ile Trp Pro Leu Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Ser His Pro 145 150 155 160 Leu Pro Glu Thr Ala Val Arg Gly Tyr Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ser 165 170 175 Pro Glu Ser Ala Glu Glu Tyr Ile Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Arg 180 185 190 Leu Asp Glu Ala Ala Gln Arg Leu Ala Thr Val Val Asn Asp Glu Arg 195 200 205 Phe Val Ser Lys Ala Gly Lys Ser Asn Tyr Gln Leu Trp His Glu Leu 210 215 220 Cys Asp Leu Ile Ser Gln Asn Pro Asp Lys Val Gln Ser Leu Asn Val 225 230 235 240 Asp Ala Ile Ile Arg Gly Gly Leu Thr Arg Phe Thr Asp Gln Leu Gly 245 250 255 Lys Leu Trp Cys Ser Leu Ala Asp Tyr Tyr Ile Arg Ser Gly His Phe 260 265 270 Glu Lys Ala Arg Asp Val Tyr Glu Glu Ala Ile Arg Thr Val Met Thr 275 280 285 Val Arg Asp Phe Thr Gln Val Phe Asp Ser Tyr Ala Gln Phe Glu Glu 290 295 300 Ser Met Ile Ala Ala Lys Met Glu Thr Ala Ser Glu Leu Gly Arg Glu 305 310 315 320 Glu Glu Asp Asp Val Asp Leu Glu Leu Arg Leu Ala Arg Phe Glu Gln 325 330 335 Leu Ile Ser Arg Arg Pro Leu Leu Leu Asn Ser Val Leu Leu Arg Gln 340 345 350 Asn Pro His His Val His Glu Trp His Lys Arg Val Ala Leu His Gln 355 360 365 Gly Arg Pro Arg Glu Ile Ile Asn Thr Tyr Thr Glu Ala Val Gln Thr 370 375 380 Val Asp Pro Phe Lys Ala Thr Gly Lys Pro His Thr Leu Trp Val Ala 385 390 395 400 Phe Ala Lys Phe Tyr Glu Asp Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ala Arg Val 405 410 415 Ile Leu Glu Lys Ala Thr Lys Val Asn Phe Lys Gln Val Asp Asp Leu 420 425 430 Ala Ser Val Trp Cys Gln Cys Gly Glu Leu Glu Leu Arg His Glu Asn 435 440 445 Tyr Asp Glu Ala Leu Arg Leu Leu Arg Lys Ala Thr Ala Leu Pro Ala 450 455 460 Arg Arg Ala Glu Tyr Phe Asp Gly Ser Glu Pro Val Gln Asn Arg Val 465 470 475 480 Tyr Lys Ser Leu Lys Val Trp Ser Met Leu Ala Asp Leu Glu Glu Ser 485 490 495 Leu Gly Thr Phe Gln Ser Thr Lys Ala Val Tyr Asp Arg Ile Leu Asp 500 505 510 Leu Arg Ile Ala Thr Pro Gln Ile Val Ile Asn Tyr Ala Met Phe Leu 515 520 525 Glu Glu His Lys Tyr Phe Glu Glu Ser Phe Lys Ala Tyr Glu Arg Gly 530 535 540 Ile Ser Leu Phe Lys Trp Pro Asn Val Ser Asp Ile Trp Ser Thr Tyr 545 550 555 560 Leu Thr Lys Phe Ile Ala Arg Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Glu Arg Ala 565 570 575 Arg Asp Leu Phe Glu Gln Ala Leu Asp Gly Cys Pro Pro Lys Tyr Ala 580 585 590 Lys Thr Leu Tyr Leu Leu Tyr Ala Gln Leu Glu Glu Glu Trp Gly Leu 595 600 605 Ala Arg His Ala Met Ala Val Tyr Glu Arg Ala Thr Arg Ala Val Glu 610 615 620 Pro Ala Gln Gln Tyr Asp Met Phe Asn Ile Tyr Ile Lys Arg Ala Ala 625 630 635 640 Glu Ile Tyr Gly Val Thr His Thr Arg Gly Ile Tyr Gln Lys Ala Ile 645 650 655 Glu Val Leu Ser Asp Glu His Ala Arg Glu Met Cys Leu Arg Phe Ala 660 665 670 Asp Met Glu Cys Lys Leu Gly Glu Ile Asp Arg Ala Arg Ala Ile Tyr 675 680 685 Ser Phe Cys Ser Gln Ile Cys Asp Pro Arg Thr Thr Gly Ala Phe Trp 690 695 700 Gln Thr Trp Lys Asp Phe Glu Val Arg His Gly Asn Glu Asp Thr Ile 705 710 715 720 Lys Glu Met Leu Arg Ile Arg Arg Ser Val Gln Ala Thr Tyr Asn Thr 725 730 735 Gln Val Asn Phe Met Ala Ser Gln Met Leu Lys Val Ser Gly Ser Ala 740 745 750 Thr Gly Thr Val Ser Asp Leu Ala Pro Gly Gln Ser Gly Met Asp Asp 755 760 765 Met Lys Leu Leu Glu Gln Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Glu Ala Glu 770 775 780 Arg Asp Gln Pro Leu Arg Ala Gln Ser Lys Ile Leu Phe Val Arg Ser 785 790 795 800 Asp Ala Ser Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gln Val Asn Pro 805 810 815 Glu Glu Ile Gln Leu Gly Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Met Asp Leu 820 825 830 Glu Pro Asn Glu Val Arg Leu Glu Gln Gln Ser Val Pro Ala Ala Val 835 840 845 Phe Gly Ser Leu Lys Glu Asp 850 855

Claims (13)

1. 삭제
2. 삭제
3. (a) 서열 2에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 단백질, 또는

   서열 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가된 아미노산 서열을 갖고, 전사 억제 활성을 갖는 단백질, 또는

   (b) 상기 단백질이 발현가능한 벡터

   를 함유하는, 레티노산 수용체 및(또는) 글루코코르티코이드 수용체에 의해 전사조절되는 유전자의 전사를 억제하는 것인 유전자 전사 억제제.
4. 서열 2에 기재된 1 내지 179 위치의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, 또는

   서열 2에 기재된 1 내지 179 위치의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가된 아미노산 서열을 갖고, 전사 활성화 활성을 갖는 펩티드

   를 함유하는 유전자 전사 활성화제.
5. 서열 2에 기재된 1 내지 179 위치의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, 또는

   서열 2에 기재된 1 내지 179 위치의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가된 아미노산 서열을 갖고, 전사 활성화 활성을 갖는 펩티드

   가 발현가능한 벡터를 함유하는 유전자 전사 활성화제.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 레티노산 수용체 및(또는) 글루코코르티코이드 수용체에 의해 전사조절되는 유전자의 전사를 활성화하는 것인 유전자 전사 활성화제.
7. 피검물질의 존재 하 및(또는) 비존재 하에 있어서,

   서열 2에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 단백질, 또는

   서열 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및(또는) 부가된 아미노산 서열을 갖고, 전사 억제 활성을 갖는 단백질

   과 히스톤 탈아세틸화효소와의 결합 반응을 수행하는 단계를 포함하는 히스톤 탈아세틸화효소 저해 화합물의 스크리닝 방법.
8. 삭제
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12. 삭제
13. 삭제

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