JP2000135090A - ヒトＨ３７タンパク質と、このタンパク質をコードする ｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ヒト細胞の複製を制御するタンパク質Ｃdc７
の活性制御サブユニットであるヒトＨ３７タンパク質
と、このタンパク質をコードするヒト遺伝子およびその
ｃＤＮＡ、Ｈ３７タンパク質に対する抗体、並びにこれ
らの遺伝子工学材料や抗体を用いてヒト細胞の増殖を制
御する方法の提供。 【解決手段】 特定の２種類の中のいずれかのアミノ酸
配列を有するヒトＨ３７タンパク質、上記のヒトＨ３７
タンパク質をコードするヒト遺伝子、このヒト遺伝子の
ｃＤＮＡであって、特定の２種類の中のいずれかの塩基
配列を有するｃＤＮＡ、これらｃＤＮＡの一部配列から
なるＤＮＡ断片、上記ｃＤＮＡを保有する組換えベクタ
ー、ヒトＨ３７タンパク質に対する抗体、並びに上記Ｄ
ＮＡまたは抗体を細胞内に導入することによる細胞増殖
制御方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願は、ヒトＨ３７タン
パク質と、このタンパク質をコードするｃＤＮＡに関す
るものである。さらに詳しくは、この出願は、ヒト細胞
の複製を制御するタンパク質Ｃdc７の活性制御サブユニ
ットであるヒトＨ３７タンパク質と、このタンパク質を
コードするヒト遺伝子およびそのｃＤＮＡ、Ｈ３７タン
パク質に対する抗体、並びにこれらの遺伝子工学材料や
抗体を用いてヒト細胞の増殖を制御する方法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】細胞の増殖は、増殖因子と呼ばれる液性
因子が細胞表面の受容体に結合し、細胞内に増殖にシグ
ナルが伝達されることによって開始される。従って、培
養細胞の増殖を人為的に誘導するためには、細胞培地に
増殖因子を過剰量添加したり、あるいはその細胞が本来
は持っていない受容体を細胞表面に発現させ、その受容
体に特異的な因子を培地に添加する方法等がとられてき
た。また、細胞増殖を抑制するためには、受容体タンパ
ク質に対する抗体や拮抗分子等を培地に添加し、受容体
への増殖因子の結合を阻害する方法等が採用されてき
た。

【０００３】一方、受容体への増殖因子の結合によって
増殖シグナルが発せられた細胞は、そのゲノムＤＮＡを
複製し、娘細胞に均等に配分したのち分裂するというサ
イクルを繰り返す。このサイクルを、特に真核生物につ
いては「細胞周期」という。細胞周期は基本的に４期間
に区分されている。すなわち、染色体ＤＮＡが複製する
Ｓ期、複製した染色体が紡錘体によって分裂したのち細
胞質が分裂するＭ期、Ｍ期が終わりＳ期が始まるまでの
Ｇ１期、そしてＳ期が完了してＭ期が始まるまでのＧ２
期である。特にＧ１期からＳ期への移行は厳密に制御さ
れており、ＤＮＡ複製はＳ期において１回だけ生じるよ
うになっている。

【０００４】このような細胞周期は、酵母や高等真核細
胞での研究からサイクリン依存性キナーゼがその進行に
重要な役割を果たしていることが証明されいる（Nature
292:558-560, 1981; Cell 66:731-742, 1991; Nature
349:338-393, 1991; Science257:1958-1961, 1992; Bio
essays 17:471, 1995）。また、酵母における遺伝学的
解析からは、Ｓ期の開始時（Ｇ１−Ｓ移行）には別のセ
リン／スレオニンキナーゼが重要な役割を果たしている
ことが明らかになっている。すなわち、細胞分裂周期変
異株の一つとして単離されたcdc7変異（J. Mol. Biol.
59:183-194, 1971）において、Ｃdc７タンパク質キナー
ゼは染色体ＤＮＡの複製の開始直前に機能すること、そ
してＳ期を通じて各複製起点の活性化に必要とされてい
ることが明らかになってきた（Mol. Cell. Biol. 6:159
0-1598, 1986; Genes Dev. 15:480-490, 1998; Genes D
ev. 15:491-501, 1998）。また、Ｃdc７のキナーゼ活性
は制御サブユニットであるＤbf４の存在に依存すること
も明らかにされている（Genetics 131:21-29, 1992; Mo
l. Cell. Biol. 13:2899-2908, 1993 ）。Ｄbf４の発現
は周期的であって、転写レベルおよび翻訳後レベルの両
方で制御されており（Exp. Cell Res. 180:419-428, 19
89）、Ｇ１−Ｓ境界期におけるＣdc７キナーゼ活性の増
加の少なくとも一部はＤbf４の発現がＧ１後期に増加す
ることによって説明されている（Mol. Cell. Biol. 13:
2899-2908, 1993; Exp. Cell Res. 180:419-428, 1989
）。さらに、Ｄbf４は細胞内で複製起点と相互に作用
する（Science 265:1243-1246, 1994 ）ことから、Ｃdc
７は複製起点上に形成される複製装置を直接的に活性化
することによりＳ期開始の引き金になっていると考えら
れている。

【０００５】そしてさらに、この出願の発明者らは、こ
れまでに酵母Ｃdc７に類似したキナーゼを分裂酵母、ア
フリカツメガエル、マウスおよびヒトから単離し、真核
細胞の染色体複製は種差を超えて共通に保存されたこの
キナーゼファミリーを含む機構によって制御されている
ことを指摘している（J. Biol. Chem. 273:23248-2325
7, 1998; EMBO J. 16:4340-4351, 1997; EMBO J. 14:30
94-3104, 1995）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】以上のとおりの酵母お
よび高等真核生物における知見から、細胞内のＣdc７キ
ナーゼ活性をコントロールすることによって、増殖因子
／受容体結合の操作による従来方法とは全く別の手続に
よる細胞増殖の人為的制御が可能になるものと期待され
る。

【０００７】しかしながら、この出願の発明者らはま
た、ヒトのＣdc７ホモログの候補であるhuＣdc７を動物
細胞で増産させても、あるいは昆虫細胞で発現させても
それ単独ではほとんどキナーゼ活性を示さないことを見
出している。そこで、ヒトＣdc７の制御サブユニットの
存在を想定し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを探索した結
果、huＣdc７に結合してそのキナーゼ活性を制御する新
規なタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離することに
成功し、このｃＤＮＡにコードされたタンパク質をＨ３
７タンパク質と命名した。

【０００８】この出願の発明は、発明者らによって取得
されたこの新規タンパク質Ｈ３７を産業上利用可能な形
態として提供することを課題としている。またこの出願
は、このタンパク質をコードするヒト遺伝子、この遺伝
子のｃＤＮＡおよびタンパク質に対する抗体等の遺伝子
操作材料を提供することを課題としている。

【０００９】さらにこの出願は、これらの遺伝子操作材
料を用いてヒト細胞の増殖を人的に制御する方法を提供
することを課題としてもいる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】この出願は、上記の課題
を解決する発明として、配列番号１または２のアミノ酸
配列を有するヒトＨ３７タンパク質を提供する。また、
この出願は、配列番号１または２のアミノ酸配列におけ
る１もしくは複数のアミノ酸残基が、欠失、置換もしく
は付加されたアミノ酸配列を有するヒトＨ３７タンパク
質を提供する。

【００１１】さらに、この出願は、上記のヒトＨ３７タ
ンパク質をコードするヒト遺伝子、このヒト遺伝子のｃ
ＤＮＡであって、配列番号３または４の塩基配列を有す
るｃＤＮＡ、およびこれらｃＤＮＡのの一部配列からな
るＤＮＡ断片を提供する。さらにまたこの出願は、上記
ｃＤＮＡを保有する組換えベクター、およびヒトＨ３７
タンパク質に対する抗体を提供する。

【００１２】そしてまたこの出願は、前記ｃＤＮＡまた
はその部分的あるいは一部を改変し変異を導入したＤＮ
Ａ断片を発現制御配列とともに細胞内に導入することを
特徴とする細胞の増殖促進方法、ならびに前記抗体を細
胞内に導入することを特徴とする細胞の増殖抑制方法を
提供する。以下、この発明の実施の形態について詳しく
説明する。

【００１３】

【発明の実施の形態】この発明のヒトＨ３７タンパク質
は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、配列番号３に塩
基配列を示したｃＤＮＡの 518から2541番目までの配列
領域にコードされているタンパク質分子である。この発
明のＨ３７タンパク質はまた、配列番号２のアミノ酸配
列を有し、配列番号４のｃＤＮＡにおける 518から1222
番目までの配列領域にコードされているタンパク質であ
る。配列番号３および４は同一のゲノム遺伝子から転写
されたｍＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡであるが、配列番
号４のｃＤＮＡは、配列番号３とは別のスプライシング
フォームであり、配列番号３の1199-1259 番目までが欠
失している。

【００１４】これらのＨ３７タンパク質は公知の方法、
すなわちヒトの臓器、細胞株などから単離する方法、こ
の発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合
成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの発明
によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ
技術で生産する方法などにより取得することができる。
例えば、組換えＤＮＡ技術によってＨ３７タンパク質を
取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を有するベ
クターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、こ
れを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりイン
ビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方法により
適当な発現ベクターに組換えてやれば、大腸菌、枯草
菌、酵母、動物細胞等で、ｃＤＮＡがコードするＨ３７
タンパク質を大量に発現させることができる。

【００１５】この発明のヒトＨ３７タンパク質を大腸菌
などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可
能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃ
ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発
現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を挿入結
合して組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクタ
ーで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体
を培養してやれば、ｃＤＮＡがコードしているＨ３７タ
ンパク質を微生物内で大量生産することができる。ある
いは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させること
もできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで
切断することによって、ｃＤＮＡがコードするタンパク
質部分のみを取得することもできる。

【００１６】この発明のヒトＨ３７タンパク質を動物細
胞で発現させる場合には、この発明のｃＤＮＡの翻訳領
域を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、
ポリ(A) 付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに
組換え、動物細胞内に導入してやれば、この発明のＨ３
７タンパク質を動物細胞内で発現できる。以上のとおり
の方法によって得られるヒトＨ３７タンパク質は、例え
ば、細胞内のhuＣdc７のキナーゼ活性を阻害することに
よって細胞の増殖を抑制するための抗体作成のための抗
原として使用することができる。

【００１７】また、この発明のヒトＨ３７タンパク質
は、後記する実施例において実証されているように、構
造上はこれまでに明らかにされているサイクリンとはほ
とんど類似性を持たないが、その発現が細胞周期によっ
て制御されること、またhuＣdc７触媒サブユニットに結
合してそのキナーゼ活性を活性化するという点で、huＣ
dc７キナーゼのサイクリン様構成因子とみなすことがで
きる。従って、Ｈ３７タンパク質は増殖因子によって誘
導される細胞増殖のためのシグナル伝達経路において非
常に重要な標的因子と考えられることから、Ｈ３７タン
パク質の発現あるいはその活性がＧ１−Ｓ期の細胞周期
のシグナルによってどのように制御されているかを明ら
かにすることが、動物細胞における細胞複製の細胞周期
制御の分子機構を明らかにする上で大きな新しい知見を
提供するものと期待される。

【００１８】この発明のヒトＨ３７タンパク質には、配
列番号１または２で表されるアミノ酸配列のいかなる部
分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以
上）も含まれる。これらのペプチド断片もまた抗体を作
製するための抗原として用いることができる。この発明
の遺伝子は、上記ヒトＨ３７タンパク質をコードするヒ
トの遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまた
はその一部配列をプローブとして、既存のゲノムライブ
ラリーから単離することができる。

【００１９】この発明のｃＤＮＡは、配列番号３または
４で表される塩基配列を有することを特徴とするもので
あり、例えばヒト細胞由来ｃＤＮＡライブラリーからク
ローン化することができる。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽
出したポリ(A)⁺ ＲＮＡを鋳型として合成する。ヒト細
胞としては、人体から手術などによって摘出されたもの
でも培養細胞でも良い。ｃＤＮＡは、岡山−Berg法（Ok
ayama, H. and Berg,P., Mol. Cell. Biol., 2:161-17
0, 1982 ）、Gubler−Hoffman 法（Gubler, U.and Hoff
man. J. Gene, 25:263-269, 1983 ）、キャッピング法
〔Kato, S. etal., Gene, 150:243-250, 1994）などの
公知の方法を用いて作製することができる。

【００２０】この発明のヒトＨ３７タンパク質は脳およ
び腎臓以外のいかなる組織でも発現しているので、配列
番号３または４に記載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて
合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細
胞から作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることにより、この発明のｃＤＮＡと同一のクロ
ーンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成する
こともできる。

【００２１】一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻
繁に認められる。従って配列番号３または４において、
１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／ま
たは他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮ
Ａもこの発明に含まれる。同様に、これらの変更によっ
て生じる１または複数個のアミノ酸残基の付加、欠失お
よび／または他のアミノ酸残基による置換がなされてい
るタンパク質も、配列番号１または２で表されるアミノ
酸配列を有するタンパク質の活性を有する限り、この発
明に含まれる。また、人為的に１または複数個のアミノ
酸残基の付加、欠失および／または他のアミノ酸残基に
よる置換を導入した変異タンパク質もこの発明に含まれ
る。

【００２２】この発明のＤＮＡ断片には、配列番号３ま
たは４で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含
むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）、あるいはそれらのア
ンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片も含まれる。この発明
のヒトＨ３７タンパク質に対する抗体は、タンパク質そ
れ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の
方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル
抗体として得ることができる。

【００２３】この発明の細胞増殖促進方法は、配列番号
３または４の塩基配列を有するｃＤＮＡ、もしくはそれ
らの一部配列からなるＤＮＡ断片（例えば後記実施例３
に示したように、Ｃ端側の419 個のアミノ酸配列領域を
コードするＤＮＡ断片）とその発現制御配列（動物細胞
用プロモーターおよび／またはエンハンサー配列）から
なる組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、配列番号１また
は２のアミノ酸配列を有するＨ３７タンパク質を細胞核
内で過剰発現させることによって行うことができる。組
換えＤＮＡの細胞内への導入は公知の方法により行うこ
とができる。例えばリン酸カルシウム法、リポソームや
赤血球ゴーストを用いる方法、エレクトロポレーション
法、レトロウイルスやアデノウイルスをベクターとして
用いる方法、ガラスピペットによる微量注入法等であ
る。このような細胞増殖の促進は、例えば、ヒト疾患の
治療に有用な幹細胞を大量に取得するために有用であ
る。すなわち、血液幹細胞や神経幹細胞など、他種類の
細胞に分化する幹細胞は、ヒトの身体を構成する多くの
タンパク質を作り出すことができるため、白血病等の疾
患において幹細胞の移植は極めて重要な治療手段であ
る。しかしながら、幹細胞を分化させることなしに自己
増殖させる液性因子は同定されていないため、治療に必
要な量の幹細胞を調製することは容易ではなかった。こ
の発明の方法は、幹細胞内の増殖プログラムを操作する
ことによって試験管内で無制限に細胞を自己複製、自己
増殖させることを可能にする。また、このような試験内
での細胞増殖促進は、ex vivo 方式による遺伝子治療の
ための遺伝子導入用細胞を大量に調製するためにも有用
である。

【００２４】この発明の細胞増殖抑制方法は、前記の抗
体を細胞内に注入することによって行うことができる。
あるいは、細胞内在性のＨ３７タンパク質遺伝子の発現
を阻害することによっても行うことができる。例えば、
遺伝子の転写産物に対するアンチセンス配列またはリボ
ザイム配列をコードするＤＮＡを細胞内に導入する方法
等である。このような細胞増殖の抑制は、例えば癌細胞
の過剰増殖を抑制するための新たな手段を提供するもの
と期待される。

【００２５】

【実施例】次に実施例を示しこの発明をさらに詳細かつ
具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定され
るものではない。 実施例１：ＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリーをｐＧ
ＡＤ−ＧＨベクターを用いて作成し、huＣdc７が Gal４
のＤＮＡ結合ドメインに融合された組換えプラスミドを
保有する酵母ＣＧ1945株に各ベクターを導入した。約３
×１０⁵ 個の形質転換体酵母をスクリーニングした結
果、ベータガラクトシダーゼが陽性のクローンを５個得
た。インサートのＤＮＡ塩基配列を決定し、データベー
スを検索た結果、これらは全て新しいｃＤＮＡであっ
た。そのうち３クローンは同一のものであり、配列番号
１の塩基配列を有していた。このｃＤＮＡをＨ３７と命
名した。他の２つは単独のクローンであり、それぞれＨ
１およびＨ１８と命名した。

【００２６】これらの陽性クローンによるコードされる
タンパク質とhuＣdc７との相互作用を動物細胞における
増産系を用いてさらに検討した。すなわち、myc エピト
ープで標識したＨ１、Ｈ１８およびＨ３７のそれぞれの
発現プラスミドを全長huＣdc７発現プラスミドとともに
動物細胞Ｃos７にトランスフェクションした。結果は図
１に示したとおりである。huＣdc７に対する抗体による
免疫沈降によってＨ３７タンパク質は共沈殿されたが、
Ｈ１およびＨ１８タンパク質は共沈殿されなかった（図
１：上段レーン２−４）。逆に、myc抗体を用いた免疫
沈降により、huＣdc７は myc標識のＨ３７を共発現して
いる細胞においてのみ共沈殿された（図１：下段レーン
４）。この結果から、Ｈ３７ｃＤＮＡのみがhuＣdc７と
効率よく相互作用するタンパク質をコードしていること
が確認された。

【００２７】次いで、内在性のＨ３７タンパク質につい
て調べるために、Ｈ３７のＮ端およびＣ端領域に対する
抗体（抗Ｈ３７Ｎ抗体、抗Ｈ３７Ｃ抗体）をそれぞれ作
成した。さらに、Ｈ３７のＣ端オリゴペプチドに対する
抗体（抗Ｈ３７Ｃpep 抗体）およびhuＣdc７のＣ端オリ
ゴペプチドに対する抗体（抗huＣdc７Ｃpep 抗体）も作
成した。そして、各抗体と細胞内における内在性huＣdc
７およびＨ３７との会合を測定した。結果は図２に示し
たとおりである。すなわち、Ｈ３７に対する抗体はいず
れもＣos細胞で発現した90kDa のmyc 標識Ｈ３７タンパ
ク質と特異的に反応した（図２：レーン１−４）。アフ
ィニティ精製した抗ペプチド抗体を用いてヒトＣＥＭ細
胞から調製した複合体を共沈殿することができた。huＣ
dc７およびＨ３７免疫沈殿物中にいずれもhuＣdc７が含
まれていることが抗huＣdc７Ｃpep 抗体を用いた免疫ブ
ロットにより確認された（図２：レーン５および７）。
このＨ３７とhuＣdc７との相互作用は、抗体作成の抗原
として用いたペプチドと抗体とを予めpre-incubationす
ることによって完全に消失した（図２：レーン８）。Ｈ
ｅＬａ細胞の抽出液においては、Ｃdc７抗体およびＨ３
７抗体はいずれも、Ｈ３７抗体と特異的に反応する80kD
a の１本のポリペプチドを共沈殿することができた（図
２：レーン９−１３）。

【００２８】以上の結果から、内在性のhuＣdc７とＨ３
７タンパク質が複合体として細胞内に存在していること
が判明した。 実施例２ Ｈ３７タンパク質がhuＣdc７を活性化する能力があるか
否かを調べるために、myc 標識したＨ３７と野生型ある
いはキナーゼ失活型のhuＣdc７をＣos細胞で発現させて
得たhuＣdc７／Ｈ３７キナーゼ複合体を、huＣdc７抗体
またはmyc 抗体で免疫沈殿し、続いてＧＳＴ−ＭＣＭ３
融合タンパク質を基質として用いて、invitro のキナー
ゼ反応を測定した。結果は図３および図４に示したとお
りである。野生型のhuＣdc７の存在下では、huＣdc７抗
体の免疫沈降物およびmyc 抗体の免疫沈降物の両方にお
いてＭＣＭ３タンパク質の効率のよいリン酸化観察され
た（図３：レーン２および７）。さらに、もう２本のリ
ン酸化タンパク質が観察され、それらはトランスフェク
ションされたhuＣdc７および mycＨ３７であると同定さ
れた（データ示さず）。これらのリン酸化はキナーゼ失
活型のhuＣdc７では全く検出されないことから、huＣdc
７のキナーゼ活性がこれらのリン酸化に作用しているこ
とが確認された。ただし、キナーゼ失活型のhuＣdc７も
Ｈ３７タンパク質と複合体を形成することができる（図
３：レーン３および８、図４：レーン２および４）。さ
らにタンパクゲル電気泳動上でのＨ３７タンパク質の移
動度は野生型huＣdc７が共発現されている場合は遅くな
り、複数のバンドとして検出されたが、この移動度の変
化はキナーゼ失活型huＣdc７では観察されなかった（図
４：レーン１および３）。移動度が遅くなっているバン
ドは脱リン酸化酵素処理により消失することから、それ
らは過リン酸化されたＨ３７タンパク質であることが確
認された（データ示さず）。また、昆虫細胞においてhu
Ｃdc７とＨ３７タンパク質を共発現することにより、Ｍ
ＣＭ２およびＭＣＭ３タンパク質を効率よくリン酸化す
ることのできる極めて強いキナーゼ活性を再構成するこ
とができた（データ示さず）。

【００２９】以上の結果は、Ｈ３７タンパク質がhuＣdc
７キナーゼを活性化し、さらにＨ３７タンパク質自身が
huＣdc７によりリン酸化されることを示している。ま
た、これらの実験条件下では、huＣdc７触媒サブユニッ
トのみが発現された場合には、内在性のＨ３７タンパク
質のレベルが低すぎるためにキナーゼ活性は僅かであっ
た（図３：レーン４および９）。これらの事実から、Ｈ
３７タンパク質がhuＣdc７の制御細胞ユニットをコード
し、そのキナーゼ活性を特異的に活性化していることが
確認された。 実施例３ Ｈ３７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を検討
した。その結果、図５および図６に示したように、出芽
酵母Ｄbf４と３３％の相同性を有するアミノ酸配列領域
が見出された。この保存ドメイン（Ｈ３７モチーフＣ）
は、ラット、ショウジョウバエおよび分裂酵母で同定さ
れたＨ３７類似遺伝子にも存在する（図６）。また、Ｈ
３７のもう一つのアミノ酸領域（Ｈ３７モチーフＮ）は
ラットおよびショウジョウバエのＨ３７類似遺伝子に保
存されていた。ただし、このＨ３７モチーフＮは出芽酵
母のＤbf４タンパク質には保存されていなかった（図
６）。

【００３０】次に、huＣdc７との結合に必須なＨ３７タ
ンパク質上の領域を決定するために、図７に示したよう
な一連のＨ３７Ｎ端およびＣ端欠失変異を作成し、各々
をＧal４活性化ドメインとの融合タンパク質として酵母
内で発現させて、それぞれの欠失変異体とhuＣdc７との
相互作用をtwo-hybridアッセイで検討した。結果は図８
に示したとおりである。Ｎ端の欠失の結果、Ｎ端255 ア
ミノ酸を削除してもhuＣdc７との相互作用には影響を与
えなかった（ΔＮ２）。しかしながら、さらにＮ端５０
アミノ酸を削除してＨ３７モチーフＣを欠失させるとhu
Ｃdc７との相互作用は完全に失われた（ΔＮ３）。

【００３１】一方、Ｃ端からの欠失においては、２０ア
ミノ酸を削除しただけでhuＣdc７との結合能力が約６０
％まで低下した（ΔＣ）。さらに、243 あるいは369 ア
ミノ酸をＣ端から欠失させると（ΔＰ２およびΔＢ）、
相互作用は全長クローンの約１０％までに低下した。Ｎ
端の235 アミノ酸のみを含むΔＰ１はhuＣdc７と相互作
用しなかった。ただし、ΔＢとΔＮ２に共通に存在する
５０アミノ酸はhuＣdc７との効率のよい相互作用のため
には充分ではなかった（データ示さず）。

【００３２】以上に述べたＨ３７欠失誘導体の一部をhu
Ｃdc7 とともにＣＯＳ７細胞内に共発現し、huＣdc7 タ
ンパク質と複合体を形成するかを抗体共沈法により確認
した。その結果、two-hybrid assayの結果と同様に、全
長Ｈ３７タンパク質の他に、deltaB、deltaN2 のＨ３７
欠失誘導体のみがhuＣdc7 と複合体を形成することが明
らかにされた（図９）。

【００３３】以上の結果は、Ｈ３７モチーフＣがＨ３７
タンパク質とhuＣdc７触媒サブユニットとの相互作用に
必須であること、しかしそれのみでは充分ではないこと
を示している。出芽酵母においては、Ｈ３７モチーフＣ
を含む領域がＣdc７との結合に充分であるということが
既に報告されている（Mol. Cell. Biol. 15:6775-6782,
1996 ）。さらに、これらの欠失変異を用いてin vitro
キナーゼ反応を行った結果、Ｄbf４モチーフＣを含むＣ
端の419 アミノ酸のみでリン酸化活性で充分であること
が判明した（データ示さず）。 実施例４ 種々のヒト組織および癌細胞におけるＨ３７ｍＲＮＡの
発現パターンをノーザンブロットにより検討した。結果
は図１０ａ、ｂに示したとおりである。Ｈ３７ｃＤＮＡ
特異的プローブにより、脳と腎臓以外の全ての組織にお
いて、また全ての癌細胞において、２．５kbの転写産物
が検出された。このことは、huＣdc７のｍＲＮＡは脳と
腎臓においても比較的高い発現が観察されること（EMBO
J. 16:4340-4351, 1997）とは対照的であった。検査し
た組織の中では、Ｈ３７ｍＲＮＡの発現が最も高かった
のは睾丸、次いで胸腺であり、この両組織はhuＣdc７触
媒サブユニットの発現が特に高い組織でもあることが発
明者等によって報告されている（EMBO J. 16:4340-435
1, 1997）。また、睾丸においては６kbと４kbの２本の
別のＲＮＡバンドも検出された（図１０ａ）が、これら
の転写産物の正体は不明である。さらに、Ｈ３７ｍＲＮ
Ａは、肺癌細胞Ａ549 を除いたほとんど全ての癌細胞に
おいて極めて高いレベルで発現していることが確認され
た（図１０ｂ）。このことは、活発な増殖能を有する細
胞でもＨ３７タンパク質の重要な役割を示している。 実施例５ Ｈ３７の発現が細胞周期によって制御されているかどう
かを検討するため、ヒト正常線維芽細胞ＷＩ38細胞を血
清飢餓によりＧ０期に同調させ（図１１）、トータルＲ
ＮＡを血清添加後の種々の時間に調整し、ノーザンブロ
ットでＨ３７ｍＲＮＡのレベルを検討した。結果は図１
２に示したとおりである。Ｈ３７ｍＲＮＡレベルは、休
止期の細胞では低く、細胞がＧ１−Ｓ境界に近づくに従
って徐々に増加していき、血清添加後２０時間で最大に
達した。この図１２に示した発現パターンは、増殖刺激
によって誘導されることが知られているhuＣdc６の転写
産物の発現パターン（Mol. Cell. Biol. 15:4215-4224,
1995; Proc. Natl. Acad.Sci. USA 94:142-147, 1997
）に似ている。

【００３４】さらに、Ｈ３７の細胞周期内で発現変動を
調べるために、エルトリエーション法によりヒトＣＥＭ
細胞を各細胞周期に分画し（図１３）、ノーザンブロッ
トを行った（図１４）。その結果、Ｈ３７ｍＲＮＡはＧ
１期には低く、Ｇ１後期からＳ期にかけて上昇し、Ｓ期
の間は高く維持され、Ｇ２期にやや減少するがまだ高く
維持されていることが示された。また、ノコダゾールに
よりHeLa細胞をＧ２後期に停止させ、同調的に細胞周期
を移行させた実験（図１５）においてもＨ３７ｍＲＮＡ
はＧ２からＧ１への移行に従って減少し、Ｓ期への移行
の際に再び上昇することが示された（図１６）。Ｃdc６
の発現も同様にＧ１からＳ期への移行に伴って上昇する
が、Ｓ期が進行するにつれて減少し、Ｇ２期には低く抑
えられる点がＨ３７とは異なる。この結果は、Ｈ３７ｍ
ＲＮＡの発現は進行する細胞周期のなかでも変動し、そ
れが機能すると考えられるS 期に最大になることを示
す。

【００３５】Ｈ３７の発現をさらに調べるために動物細
胞内におけるＨ３７タンパク質の細胞内局在を測定し
た。２種類のＨ３７特異的抗体を用いて間接蛍光抗体法
を行った結果、ＨｅＬａ細胞とＷＩ38細胞の両方におい
て、内在性Ｈ３７タンパク質は核内に非常に明確な数々
のスポットとして観察された（図１７）。これらの結果
および発明者らがすでに報告しているhuＣdc７触媒サブ
ユニットの核内局在（EMBO J. 16:4340-4351, 1997）と
あわせて、huＣdc７／Ｈ３７複合体は核に局在するキナ
ーゼであり、その制御細胞ユニットは細胞周期のシグナ
ルに依存して発現していることが確認された。 実施例６ 細胞周期のＧ１−Ｓ移行における内在性Ｈ３７タンパク
質の機能を抗体微量注入法により検討した。Ｈ３７タン
パク質のＮ端３０５アミノ酸に対する抗体（抗Ｈ３７Ｎ
抗体）およびＣ端のオリゴペプチドに対する抗体（抗Ｈ
３７Ｃpep 抗体）をアフィニティ精製し、これらの抗体
をヒト唇由来の正常線維芽細胞（ＫＤ細胞）に微量注入
した。ＫＤ細胞は予め血清飢餓によってＧ０期に停止さ
せておき、血清再添加によって同調的に細胞周期へと進
行させたものを使用した。ヌクレオチド誘導体であっ
て、細胞内に取り込まれるＢrdＵ陽性の細胞数を測定す
ることにより、どれくらいの画分の細胞が決定添加後の
種々の時期にＳ期に存在するかを調べた。結果は図１８
に示したとおりである。細胞は血清添加後約１８時間で
ＤＮＡ合成を始め、２４時間後にはほぼ９０％の細胞が
Ｓ期に入っていることを確認した。

【００３６】従って、この実施例では、細胞がまだＧ１
後期の状態である血清添加後１２時間の時点で抗体を微
注入し、ほぼ完全にＳ期に入ったと考えられる２６時間
後の時点で細胞を固定してＢrdＵ陽性細胞を計測した。
結果は図１９に示したとおりである。抗Ｈ３７Ｎ抗体を
微注入した細胞の７０％がＳ期に移行することができな
かったのに対し、コントロール抗体による影響はほとん
ど見られなかった。また、抗Ｈ３７Ｃpep 抗体の微注入
によっても抗Ｈ３７Ｎ抗体と同等あるいはそれ以上のＳ
期移行阻害効果が観察された。しかも、抗Ｈ３７Ｃpep
抗体作成のための抗原であるペプチドと抗Ｈ３７Ｃpep
抗体とを同時に細胞内に微注入した場合には、７０％以
上の細胞がＳ期に移行することができた。

【００３７】図２０は、ＢrdＵと微注入抗体の染色例で
ある。抗体は細胞がＧ１中期から後期にある段階で微注
入されており、この時期にはＨ３７タンパク質の発現は
低いと考えられる。微注入された抗体は、新しく合成さ
れたＨ３７タンパク質に効率よく結合し、その結果、Ｈ
３７タンパク質の核内への移行を阻害すると考えられ
る。これらの結果は、Ｈ３７の機能、すなわちhuＣdc７
／Ｈ３７複合体の機能が動物細胞のＳ期進行に要求され
ることを強く示唆する。

【００３８】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、ヒト細胞の複製を制御するタンパク質Ｃdc７の
活性制御サブユニットであるヒトＨ３７タンパク質と、
このタンパク質をコードするヒト遺伝子およびそのｃＤ
ＮＡ、Ｈ３７タンパク質に対する抗体、並びにこれらの
遺伝子工学材料や抗体を用いてヒト細胞の増殖を制御す
る方法が提供される。これによって、各種のヒト疾患の
治療に用いられる幹細胞等の必要量を調整することが可
能となり、あるいは癌細胞の増殖抑制のための新規な手
段を開発することが可能となる。

【００３９】

【配列表】 <110> 出願人氏名：科学技術振興事業団 <120> 発明の名称：ヒトＨ３７タンパク質と、このタンパク質をコードする ｃＤＮＡ <160> 配列の総数：４ <210> 配列番号：１ <211> 配列の長さ：６７４ <212> 配列の型：ＰＲＴ <213> ホモ−サピエンス <400> 配列 Met Asn Ser Gly Ala Met Arg Ile His Ser Lys Gly His Phe Gln Gly 1 5 10 15 Gly Ile Gln Val Lys Asn Glu Lys Asn Arg Pro Ser Leu Lys Ser Leu 20 25 30 Lys Thr Asp Asn Arg Pro Glu Lys Ser Lys Cys Lys Pro Leu Trp Gly 35 40 45 Lys Val Phe Tyr Leu Asp Leu Pro Ser Val Thr Ile Ser Glu Lys Leu 50 55 60 Gln Lys Asp Ile Lys Asp Leu Gly Gly Arg Val Glu Glu Phe Leu Ser 65 70 75 80 Lys Asp Ile Ser Tyr Leu Ile Ser Asn Lys Lys Glu Ala Lys Phe Ala 85 90 95 Gln Thr Leu Gly Arg Ile Ser Pro Val Pro Ser Pro Glu Ser Ala Tyr 100 105 110 Thr Ala Glu Thr Thr Ser Pro His Pro Ser His Asp Gly Ser Ser Phe 115 120 125 Lys Ser Pro Asp Thr Val Cys Leu Ser Arg Gly Lys Leu Leu Val Glu 130 135 140 Lys Ala Ile Lys Asp His Asp Phe Ile Pro Ser Asn Ser Ile Leu Ser 145 150 155 160 Asn Ala Leu Ser Trp Gly Val Lys Ile Leu His Ile Asp Asp Ile Arg 165 170 175 Tyr Tyr Ile Glu Gln Lys Lys Lys Glu Leu Tyr Leu Leu Lys Lys Ser 180 185 190 Ser Thr Ser Val Arg Asp Gly Gly Lys Arg Val Gly Ser Gly Ala Gln 195 200 205 Lys Thr Arg Thr Gly Arg Leu Lys Lys Pro Phe Val Lys Val Glu Asp 210 215 220 Met Ser Gln Leu Tyr Arg Pro Phe Tyr Leu Gln Leu Thr Asn Met Pro 225 230 235 240 Phe Ile Asn Tyr Ser Ile Gln Lys Pro Cys Ser Pro Phe Asp Val Asp 245 250 255 Lys Pro Ser Ser Met Gln Lys Gln Thr Gln Val Lys Leu Arg Ile Gln 260 265 270 Thr Asp Gly Asp Lys Tyr Gly Gly Thr Ser Ile Gln Leu Gln Leu Lys 275 280 285 Glu Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Cys Glu Cys Cys Leu Gln Lys Tyr Glu 290 295 300 Asp Leu Glu Thr His Leu Leu Ser Glu Gln His Arg Asn Phe Ala Gln 305 310 315 320 Ser Asn Gln Tyr Gln Val Val Asp Asp Ile Val Ser Lys Leu Val Phe 325 330 335 Asp Phe Val Glu Tyr Glu Lys Asp Thr Pro Lys Lys Lys Arg Ile Lys 240 245 350 Tyr Ser Val Gly Ser Leu Ser Pro Val Ser Ala Ser Val Leu Lys Lys 355 360 365 Thr Glu Gln Lys Glu Lys Val Glu Leu Gln His Ile Ser Gln Lys Asp 370 375 380 Cys Gln Glu Asp Asp Thr Thr Val Lys Glu Gln Asn Phe Leu Tyr Lys 385 390 395 400 Glu Thr Gln Glu Thr Glu Lys Lys Leu Leu Phe Ile Ser Glu Pro Ile 405 410 415 Pro His Pro Ser Asn Glu Leu Arg Gly Leu Asn Glu Lys Met Ser Asn 420 425 430 Lys Cys Ser Met Leu Ser Thr Ala Glu Asp Asp Ile Arg Gln Asn Phe 435 440 445 Thr Gln Leu Pro Leu His Lys Asn Lys Gln Glu Cys Ile Leu Asp Ile 450 455 460 Ser Glu His Thr Leu Ser Glu Asn Asp Leu Glu Glu Leu Arg Val Asp 465 470 475 480 His Tyr Lys Cys Asn Ile Gln Ala Ser Val His Val Ser Asp Phe Ser 485 490 495 Thr Asp Asn Ser Gly Ser Gln Pro Lys Gln Lys Ser Asp Thr Val Leu 500 505 510 Phe Pro Ala Lys Asp Leu Lys Glu Lys Asp Leu His Ser Ile Phe Thr 515 520 525 His Asp Ser Gly Leu Ile Thr Ile Asn Ser Ser Gln Glu His Leu Thr 530 535 540 Val Gln Ala Lys Ala Pro Phe His Thr Pro Pro Glu Glu Pro Asn Glu 545 550 555 560 Cys Asp Phe Lys Asn Met Asp Ser Leu Pro Ser Gly Lys Ile His Arg 565 570 575 Lys Val Lys Ile Ile Leu Gly Arg Asn Arg Lys Glu Asn Leu Glu Pro 580 585 590 Asn Ala Glu Phe Asp Lys Arg Thr Glu Phe Ile Thr Gln Glu Glu Asn 595 600 605 Arg Ile Cys Ser Ser Pro Val Gln Ser Leu Leu Asp Leu Phe Gln Thr 610 615 620 Ser Glu Glu Lys Ser Glu Phe Leu Gly Phe Thr Ser Tyr Thr Glu Lys 625 630 635 640 Ser Gly Ile Cys Asn Val Leu Asp Ile Trp Glu Glu Glu Asn Ser Asp 645 650 655 Asn Leu Leu Thr Ala Phe Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Thr Phe Thr 660 665 670 Gly Phe 674 <210> 配列番号：２ <211> 配列の長さ：２３４ <212> 配列の型：ＰＲＴ <213> ホモ−サピエンス <400> 配列 Met Asn Ser Gly Ala Met Arg Ile His Ser Lys Gly His Phe Gln Gly 1 5 10 15 Gly Ile Gln Val Lys Asn Glu Lys Asn Arg Pro Ser Leu Lys Ser Leu 20 25 30 Lys Thr Asp Asn Arg Pro Glu Lys Ser Lys Cys Lys Pro Leu Trp Gly 35 40 45 Lys Val Phe Tyr Leu Asp Leu Pro Ser Val Thr Ile Ser Glu Lys Leu 50 55 60 Gln Lys Asp Ile Lys Asp Leu Gly Gly Arg Val Glu Glu Phe Leu Ser 65 70 75 80 Lys Asp Ile Ser Tyr Leu Ile Ser Asn Lys Lys Glu Ala Lys Phe Ala 85 90 95 Gln Thr Leu Gly Arg Ile Ser Pro Val Pro Ser Pro Glu Ser Ala Tyr 100 105 110 Thr Ala Glu Thr Thr Ser Pro His Pro Ser His Asp Gly Ser Ser Phe 115 120 125 Lys Ser Pro Asp Thr Val Cys Leu Ser Arg Gly Lys Leu Leu Val Glu 130 135 140 Lys Ala Ile Lys Asp His Asp Phe Ile Pro Ser Asn Ser Ile Leu Ser 145 150 155 160 Asn Ala Leu Ser Trp Gly Val Lys Ile Leu His Ile Asp Asp Ile Arg 165 170 175 Tyr Tyr Ile Glu Gln Lys Lys Lys Glu Leu Tyr Leu Leu Lys Lys Ser 180 185 190 Ser Thr Ser Val Arg Asp Gly Gly Lys Arg Val Gly Ser Gly Ala Gln 195 200 205 Lys Thr Arg Thr Gly Arg Leu Lys Lys Pro Phe Val Lys Val Glu Asp 210 215 220 Met Ser Gln Ser Pro Ala Val His Leu Met 225 230 234 <210> 配列番号：３ <211> 配列の長さ：２７８０ <212> 配列の型：ＤＮＡ <213> ホモ−サピエンス <400> 配列 AATTCGGCAC GAGCTCTCTG AGGCTGCGCC AAGACCTGAA GCGGCGGACC GAGAGCCCGG 60 GTCTGAGACT GAGAGAGCAA CGGAATGGAG GCGGGGTAGA GGCGGAAACA CAACCTGCAG 120 GGCCAGAGCG AGGCGCGAGA AGGACGGCGG CGTGAGGGGG CGGGGCGCGC AGCGCGAGAA 180 GGCAGGCACG AGGGGCGAGC GCGAGGCGGG GCACGGCGCG TGGCGTGAGA CGGGGCGGGG 240 CGCGCGTATC GGCGCCGCGG CCGCGTGACG CGTTTTCAAA TCTTCAACCG CCGCAGCCCA 300 CTCGTTTGTG CTTTGCGCCT TCCTCCTCCG CGCCTTGGAG CCGGATCCGG CCCCGGAAAC 360 CCGACCTGCA GACGCGGTAC CTCTACTGCG TAGAGGCCGT AGCTGGCGGA AGGAGAGAGG 420 CGGCCGTCCT GTCAACAGGC CGGGGGAAGC CGTGCTTTCG CGGCTGCCCG GTGCGACACT 480 TTCTCCGGAC CCAGCATGTA GGTGCCGGGC GACTGCCATG AACTCCGGAG CCATGAGGAT 540 CCACAGTAAA GGACATTTCC AGGGTGGAAT CCAAGTCAAA AATGAAAAAA ACAGACCATC 600 TCTGAAATCT CTGAAAACTG ATAACAGGCC AGAAAAATCC AAATGTAAGC CACTTTGGGG 660 AAAAGTATTT TACCTTGACT TACCTTCTGT CACCATATCT GAAAAACTTC AAAAGGACAT 720 TAAGGATCTG GGAGGGCGAG TTGAAGAATT TCTCAGCAAA GATATCAGTT ATCTTATTTC 780 AAATAAGAAG GAAGCTAAAT TTGCACAAAC CTTGGGTCGA ATTTCTCCTG TACCAAGTCC 840 AGAATCTGCA TATACTGCAG AAACCACTTC ACCTCATCCC AGCCATGATG GAAGTTCATT 900 TAAGTCACCA GACACAGTGT GTTTAAGCAG AGGAAAATTA TTAGTTGAAA AAGCTATCAA 960 GGACCATGAT TTTATTCCTT CAAATAGTAT ATTATCAAAT GCCTTGTCAT GGGGAGTAAA 1020 AATTCTTCAT ATTGATGACA TTAGATACTA CATTGAACAA AAGAAAAAAG AGTTGTATTT 1080 ACTCAAGAAA TCAAGTACTT CAGTAAGAGA TGGGGGCAAA AGAGTTGGTA GTGGTGCACA 1140 AAAAACAAGA ACAGGAAGAC TCAAAAAGCC TTTTGTAAAG GTGGAAGATA TGAGCCAACT 1200 TTATAGGCCA TTTTATCTTC AGCTGACCAA TATGCCTTTT ATAAATTATT CTATTCAGAA 1260 GCCCTGCAGT CCATTTGATG TAGACAAGCC ATCTAGTATG CAAAAGCAAA CTCAGGTTAA 1320 ACTAAGAATC CAAACAGATG GCGATAAGTA TGGTGGAACC TCAATTCAAC TCCAGTTGAA 1380 AGAGAAGAAG AAAAAAGGAT ATTGTGAATG TTGCTTGCAG AAATATGAAG ATCTAGAAAC 1440 TCACCTTCTA AGTGAGCAAC ACAGAAACTT TGCACAGAGT AACCAGTATC AAGTTGTTGA 1500 TGATATTGTA TCTAAGTTAG TTTTTGACTT TGTGGAATAT GAAAAGGACA CACCTAAAAA 1560 GAAAAGAATA AAATACAGTG TTGGATCCCT TTCTCCTGTT TCTGCAAGTG TCCTGAAAAA 1620 GACTGAACAA AAGGAAAAAG TGGAATTGCA ACATATTTCT CAGAAAGATT GCCAGGAAGA 1680 TGATACAACA GTGAAGGAGC AGAATTTCCT GTATAAAGAG ACCCAGGAAA CTGAAAAAAA 1740 GCTCCTGTTT ATTTCAGAGC CCATCCCCCA CCCTTCAAAT GAATTGAGAG GGCTTAATGA 1800 GAAAATGAGT AATAAATGTT CCATGTTAAG TACAGCTGAA GATGACATAA GACAGAATTT 1860 TACACAGCTA CCTCTACATA AAAACAAACA GGAATGCATT CTTGACATTT CCGAACACAC 1920 ATTAAGTGAA AATGACTTAG AAGAACTAAG GGTAGATCAC TATAAATGTA ACATACAGGC 1980 ATCTGTACAT GTTTCTGATT TCAGTACAGA TAATAGTGGA TCTCAACCAA AACAGAAGTC 2040 AGATACTGTG CTTTTTCCAG CAAAGGATCT CAAGGAAAAG GACCTTCATT CAATATTTAC 2100 TCATGATTCT GGTCTGATAA CAATAAACAG TTCACAAGAG CACCTAACTG TTCAGGCAAA 2160 GGCTCCATTC CATACTCCTC CTGAGGAACC CAATGAATGT GACTTCAAGA ATATGGATAG 2220 TTTACCTTCT GGTAAAATAC ATCGAAAAGT GAAAATAATA TTAGGACGAA ATAGAAAAGA 2280 AAATCTGGAA CCAAATGCTG AATTTGATAA AAGAACTGAA TTTATTACAC AAGAAGAAAA 2340 CAGAATTTGT AGTTCACCGG TACAGTCTTT ACTAGACTTG TTTCAGACTA GTGAAGAGAA 2400 ATCAGAATTT TTGGGTTTCA CAAGCTACAC AGAAAAGAGT GGTATATGCA ATGTTTTAGA 2460 TATTTGGGAA GAGGAAAATT CAGATAATCT GTTAACAGCG TTTTTCTCGT CCCCTTCAAC 2520 TTCTACATTT ACTGGCTTTT AGAATTTAAA AAATGCATAC TTTTCAGAAG TGATAAGGAT 2580 CATATTCTTG AAATTTTTAT AAATATGTAT GGAAATTCTT AGGATTTTTT TACCAGCTTT 2640 GTTTACAGAC CCAAATGTAA ATATTAAAAA TAAATATTTG CAATTTTCTA CAGAATTGAA 2700 TACCTGTTAA AGAAAAATTA CAGAATAAAC TTGTGACTGG TCTTGTTTTA CATTAAAAAA 2760 AAAAAAAAAA AAAACTCGAG 2780 <210> 配列番号：４ <211> 配列の長さ：２７１９ <212> 配列の型：ＤＮＡ <213> ホモ−サピエンス <400> 配列 AATTCGGCAC GAGCTCTCTG AGGCTGCGCC AAGACCTGAA GCGGCGGACC GAGAGCCCGG 60 GTCTGAGACT GAGAGAGCAA CGGAATGGAG GCGGGGTAGA GGCGGAAACA CAACCTGCAG 120 GGCCAGAGCG AGGCGCGAGA AGGACGGCGG CGTGAGGGGG CGGGGCGCGC AGCGCGAGAA 180 GGCAGGCACG AGGGGCGAGC GCGAGGCGGG GCACGGCGCG TGGCGTGAGA CGGGGCGGGG 240 CGCGCGTATC GGCGCCGCGG CCGCGTGACG CGTTTTCAAA TCTTCAACCG CCGCAGCCCA 300 CTCGTTTGTG CTTTGCGCCT TCCTCCTCCG CGCCTTGGAG CCGGATCCGG CCCCGGAAAC 360 CCGACCTGCA GACGCGGTAC CTCTACTGCG TAGAGGCCGT AGCTGGCGGA AGGAGAGAGG 420 CGGCCGTCCT GTCAACAGGC CGGGGGAAGC CGTGCTTTCG CGGCTGCCCG GTGCGACACT 480 TTCTCCGGAC CCAGCATGTA GGTGCCGGGC GACTGCCATG AACTCCGGAG CCATGAGGAT 540 CCACAGTAAA GGACATTTCC AGGGTGGAAT CCAAGTCAAA AATGAAAAAA ACAGACCATC 600 TCTGAAATCT CTGAAAACTG ATAACAGGCC AGAAAAATCC AAATGTAAGC CACTTTGGGG 660 AAAAGTATTT TACCTTGACT TACCTTCTGT CACCATATCT GAAAAACTTC AAAAGGACAT 720 TAAGGATCTG GGAGGGCGAG TTGAAGAATT TCTCAGCAAA GATATCAGTT ATCTTATTTC 780 AAATAAGAAG GAAGCTAAAT TTGCACAAAC CTTGGGTCGA ATTTCTCCTG TACCAAGTCC 840 AGAATCTGCA TATACTGCAG AAACCACTTC ACCTCATCCC AGCCATGATG GAAGTTCATT 900 TAAGTCACCA GACACAGTGT GTTTAAGCAG AGGAAAATTA TTAGTTGAAA AAGCTATCAA 960 GGACCATGAT TTTATTCCTT CAAATAGTAT ATTATCAAAT GCCTTGTCAT GGGGAGTAAA 1020 AATTCTTCAT ATTGATGACA TTAGATACTA CATTGAACAA AAGAAAAAAG AGTTGTATTT 1080 ACTCAAGAAA TCAAGTACTT CAGTAAGAGA TGGGGGCAAA AGAGTTGGTA GTGGTGCACA 1140 AAAAACAAGA ACAGGAAGAC TCAAAAAGCC TTTTGTAAAG GTGGAAGATA TGAGCCAAAG 1200 CCCTGCAGTC CATTTGATGT AGACAAGCCA TCTAGTATGC AAAAGCAAAC TCAGGTTAAA 1260 CTAAGAATCC AAACAGATGG CGATAAGTAT GGTGGAACCT CAATTCAACT CCAGTTGAAA 1320 GAGAAGAAGA AAAAAGGATA TTGTGAATGT TGCTTGCAGA AATATGAAGA TCTAGAAACT 1380 CACCTTCTAA GTGAGCAACA CAGAAACTTT GCACAGAGTA ACCAGTATCA AGTTGTTGAT 1440 GATATTGTAT CTAAGTTAGT TTTTGACTTT GTGGAATATG AAAAGGACAC ACCTAAAAAG 1500 AAAAGAATAA AATACAGTGT TGGATCCCTT TCTCCTGTTT CTGCAAGTGT CCTGAAAAAG 1560 ACTGAACAAA AGGAAAAAGT GGAATTGCAA CATATTTCTC AGAAAGATTG CCAGGAAGAT 1620 GATACAACAG TGAAGGAGCA GAATTTCCTG TATAAAGAGA CCCAGGAAAC TGAAAAAAAG 1680 CTCCTGTTTA TTTCAGAGCC CATCCCCCAC CCTTCAAATG AATTGAGAGG GCTTAATGAG 1740 AAAATGAGTA ATAAATGTTC CATGTTAAGT ACAGCTGAAG ATGACATAAG ACAGAATTTT 1800 ACACAGCTAC CTCTACATAA AAACAAACAG GAATGCATTC TTGACATTTC CGAACACACA 1860 TTAAGTGAAA ATGACTTAGA AGAACTAAGG GTAGATCACT ATAAATGTAA CATACAGGCA 1920 TCTGTACATG TTTCTGATTT CAGTACAGAT AATAGTGGAT CTCAACCAAA ACAGAAGTCA 1980 GATACTGTGC TTTTTCCAGC AAAGGATCTC AAGGAAAAGG ACCTTCATTC AATATTTACT 2040 CATGATTCTG GTCTGATAAC AATAAACAGT TCACAAGAGC ACCTAACTGT TCAGGCAAAG 2100 GCTCCATTCC ATACTCCTCC TGAGGAACCC AATGAATGTG ACTTCAAGAA TATGGATAGT 2160 TTACCTTCTG GTAAAATACA TCGAAAAGTG AAAATAATAT TAGGACGAAA TAGAAAAGAA 2220 AATCTGGAAC CAAATGCTGA ATTTGATAAA AGAACTGAAT TTATTACACA AGAAGAAAAC 2280 AGAATTTGTA GTTCACCGGT ACAGTCTTTA CTAGACTTGT TTCAGACTAG TGAAGAGAAA 2340 TCAGAATTTT TGGGTTTCAC AAGCTACACA GAAAAGAGTG GTATATGCAA TGTTTTAGAT 2400 ATTTGGGAAG AGGAAAATTC AGATAATCTG TTAACAGCGT TTTTCTCGTC CCCTTCAACT 2460 TCTACATTTA CTGGCTTTTA GAATTTAAAA AATGCATACT TTTCAGAAGT GATAAGGATC 2520 ATATTCTTGA AATTTTTATA AATATGTATG GAAATTCTTA GGATTTTTTT ACCAGCTTTG 2580 TTTACAGACC CAAATGTAAA TATTAAAAAT AAATATTTGC AATTTTCTAC AGAATTGAAT 2640 ACCTGTTAAA GAAAAATTAC AGAATAAACT TGTGACTGGT CTTGTTTTAC ATTAAAAAAA 2700 AAAAAAAAAA AAACTCGAG 2719

【図面の簡単な説明】

【図１】動物細胞で発現させたhuＣdc７とＨ３７の共免
疫沈降を測定したウェスタンブロッティングの結果であ
る。レーン１−４：免疫沈降物、レーン５−７：細胞総
抽出液、上段および中段：huＣdc７抗体No.1により免疫
沈降したもの、下段：myc 抗体により免疫沈降したも
の。抽出液は、huＣdc７とＨ１（レーン２、５）、Ｈ１
８（レーン３、６）Ｈ３７（レーン４、７）またはhuＣ
dc７のみ（レーン１）をトランスフェクションしたＣos
７細胞から作成した。ウェスタンブロッティングは、抗
myc 抗体（上段）または抗huＣdc７抗体No.1（中段およ
び下段）を用いて行った。

【図２】Ｈ３７タンパク質に対する抗体と細胞内におけ
る内在性huＣdc７とＨ３７との会合を測定したウェスタ
ンブロッティングの結果である。myc 標識したＨ３７を
トランスフェクションしたＣos７から作成した核抽出液
を、抗Ｈ３７Ｃ抗体（レーン１）、抗Ｈ３７Ｎ抗体（レ
ーン２）、抗Ｈ３７Ｃpep 抗体（レーン３）あるいは抗
myc 抗体（レーン４）によりブロットした。矢印は、my
c タグに加えて5'非コード領域に由来する６３アミノ酸
を含んでいるＨ３７タンパク質の位置を示している。Ｃ
ＥＭ細胞から作成した抽出液を抗huＣdc７Ｃ-pep抗体
（レーン５、６）、あるいは抗Ｈ３７Ｃ-pep抗体（レー
ン７、８）により免疫沈降し、タンパクゲル電気泳動し
たのち、huＣdc７モノクローナル抗体（４Ａ８）を用い
てブロットした。−と＋は、免疫沈降の際にそれぞれの
抗原が存在するか否かを示している。レーン９−１３は
ＨｅＬａ細胞の核抽出液のウェスタンブロッティングで
あり、抗huＣdc７抗体No.1（レーン９）、抗huＣdc７モ
ノクローナル抗体４Ａ８（レーン１０）、抗Ｈ３７Ｃ抗
体（レーン１１）、抗Ｈ３７Ｎ抗体（レーン１２）、抗
Ｈ３７Ｃ-pep抗体（レーン１３）を用いている。

【図３】抗huＣdc７抗体No.1（レーン１−５）または抗
myc 抗体（レーン６−１０）を用いてmyc 標識Ｈ３７の
み（レーン１、６）、myc 標識Ｈ３７と野生型huＣdc７
（レーン２、７）、myc 標識Ｈ３７とキナーゼ失活型hu
Ｃdc７（レーン３、８）をトランスフェクションしたＣ
os７細胞の抽出液から免疫沈降を行った結果を示す。コ
ントロールとして野生型huＣdc７のみ（レーン４、９）
およびキナーゼ失活型huＣdc７（レーン５、１０）も同
様に測定した。

【図４】野生型huＣdc７の共発現により誘導されるＨ３
７の電気泳動上での移動度の変化である。野生型または
キナーゼ失活型のhuＣdc７をmyc 標識Ｈ３７とともに発
現しているＣos７細胞から抽出液を作製し、抗huＣdc７
抗体No.1（レーン１、２）または抗myc 抗体（レーン
３、４）で免疫沈降し、抗myc 抗体（上段）または抗hu
Ｃdc７抗体（下段）でブロットした。試料は８％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥタンパクゲルに流した。

【図５】配列番号１と同一の全長Ｈ３７タンパク質のア
ミノ酸配列である。

【図６】Ｄbf４とＨ３７の構造を比較した模式図と２つ
の保存領域のアミノ酸配列の比較である。Ｄbf４上の両
向きの矢印で示された領域は、Ｃdc７との相互作用に充
分であると報告されている領域である。Ｈ３７上の両向
き矢印で示された領域は、それぞれhuＣdc７との相互作
用に必須である（しかし充分ではない）領域と、huＣdc
７キナーゼ活性の促進に充分な領域を示す。

【図７】Ｈ３７タンパク質のＮ端およびＣ端欠失変異の
模式図である。それぞれのバー端部の数字は欠失の端の
アミノ酸番号（配列番号１に対応）を示す。斜線領域は
Ｄbf４モチーフＣを示す。

【図８】Ｈ３７欠失変異体のhuＣdc７とのtwo-hybridア
ッセイにおけるlacＺ活性を示す。

【図９】Ｈ３７欠失変異体の一部をhuＣdc７とともにＣ
ＯＳ７細胞内に共発現し、huＣdc７タンパク質と複合体
を形成するかを抗体共沈法により検討した結果を示す。

【図１０】ａは種々の臓器でのＨ３７ｍＲＮＡ発現のサ
ザン解析の結果であり、ｂは種々の癌細胞でのＨ３７ｍ
ＲＮＡ発現のノザン解析の結果である。

【図１１】休止期にあるＷＩ38細胞を１０％血清添加に
より増殖刺激し、様々な時間経過においてそのＤＮＡ含
量をＦＡＣＳで解析した結果を示す。

【図１２】図１１に示した細胞からＲＮＡを抽出し、Ｈ
３７およびhuＣdc６の発現をノザン解析した結果（上
段）と、それぞれのｍＲＮＡの相対的発現量を示したグ
ラフ図（中、下段）である。

【図１３】エルトリエーション法によるヒトＣＥＭ細胞
の各細胞周期分画を示したグラフ図である。

【図１４】図１３に示した各分画のＨ３７およびＣycli
n Ｅの発現をノザン解析した結果（上段）と、それぞれ
のｍＲＮＡの相対的発現量を示したグラフ図（中、下
段）である。

【図１５】ノコダゾールによりHeLa細胞をＧ２後期に停
止させ、同調的に細胞周期を移行させた場合のＤＮＡ含
量をＦＡＣＳで解析した結果を示す。

【図１６】図１５に示した各細胞周期におけるＨ３７お
よびＣyclin Ｅの発現をノザン解析した結果（上段）
と、それぞれのｍＲＮＡの相対的発現量を示したグラフ
図（中、下段）である。

【図１７】間接蛍光抗体法によるＨ３７の細胞局在の解
析結果を示す。使用した抗体は、抗Ｈ３７Ｃ抗体
（Ａ）、抗Ｈ３７Ｎ抗体（Ｃ）、コントロール抗体
（Ｅ）、Ｂ、Ｄ、ＦはＤＡＰＩ染色像である。

【図１８】血清刺激後のＫＤ細胞におけるＤＮＡ合成の
誘導の時間的変化をＢrdＵ取り込み量を指標として調べ
た結果を示す。

【図１９】血清飢餓により同調したＫＤ細胞に、血清添
加後１２時間の時点で各抗体を微注入し、さらに１６時
間後にＢrdＵ取り込み量を測定して計測したＤＮＡ合成
を行っている細胞の割合を示す。

【図２０】抗Ｈ３７Ｃ-pep抗体（左側）または抗Ｈ３７
Ｃ-pepとペプチドの混合物を微注入された細胞を例示し
た顕微鏡写真である。取り込まれたＢrdＵ（上段）、注
入された抗体（中段）、細胞（下段）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３Ｂ ４Ｃ０８７ 43/00 39/395 Ｅ ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｋ 39/395 48/00 48/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 新井 賢一 東京都目黒区目黒１−９−６−206 (72)発明者 正井 久雄 東京都港区三田５−７−８ シャンボール 三田620号 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA41 BA61 BA80 CA04 CA06 CA07 DA02 EA04 FA01 FA10 GA11 HA01 4B064 AG01 AG26 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA20 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 CA25 CA53 DA39 NA14 ZB262 ZC802 4C085 AA13 AA14 AA17 AA18 BB11 DD62 4C087 AA01 AA02 AA10 BB33 BB65 BC83 CA12 CA16 CA44 ZB26 ZC80 4H045 AA10 AA11 BA10 CA41 DA75 DA76 DA86 EA28 FA72 FA74 HA05

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト
   Ｈ３７タンパク質。
2. 【請求項２】 配列番号１のアミノ酸配列における１も
   しくは複数のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加
   されたアミノ酸配列を有するヒトＨ３７タンパク質。
3. 【請求項３】 配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト
   Ｈ３７タンパク質。
4. 【請求項４】 配列番号２のアミノ酸配列における１も
   しくは複数のアミノ酸残基が、欠失、置換もしくは付加
   されたアミノ酸配列を有するヒトＨ３７タンパク質。
5. 【請求項５】 請求項１また２のヒトＨ３７タンパク質
   をコードするヒト遺伝子。
6. 【請求項６】 請求項５のヒト遺伝子のｃＤＮＡであっ
   て、配列番号３の塩基配列を有するｃＤＮＡ、または配
   列番号３の塩基配列における１もしくは複数の塩基が欠
   失、置換もしくは付加された塩基配列を有するｃＤＮ
   Ａ。
7. 【請求項７】 請求項５のヒト遺伝子のｃＤＮＡであっ
   て、配列番号４の塩基配列を有するｃＤＮＡ、または配
   列番号４の塩基配列における１もしくは複数の塩基が欠
   失、置換もしくは付加された塩基配列を有するｃＤＮ
   Ａ。
8. 【請求項８】 請求項６のｃＤＮＡの一部配列からなる
   ＤＮＡ断片。
9. 【請求項９】 請求項７のｃＤＮＡの一部配列からなる
   ＤＮＡ断片。
10. 【請求項１０】 請求項６のｃＤＮＡを保有する組み換
    えベクター。
11. 【請求項１１】 請求項７のｃＤＮＡを保有する組み換
    えベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１または２のヒトＨ３７タンパ
    ク質に対する抗体。
13. 【請求項１３】 請求項３または４のヒトＨ３７タンパ
    ク質に対する抗体。
14. 【請求項１４】 請求項６のｃＤＮＡまたは請求項８の
    ＤＮＡ断片を発現制御配列とともに細胞内に導入するこ
    とを特徴とする細胞の増殖促進方法。
15. 【請求項１５】 請求項７のｃＤＮＡまたは請求項９の
    ＤＮＡ断片を発現制御配列とともに細胞内に導入するこ
    とを特徴とする細胞の増殖制御方法。
16. 【請求項１６】 請求項１０の抗体を細胞内に導入する
    ことを特徴とする細胞の増殖抑制方法。
17. 【請求項１７】 請求項１１の抗体を細胞内に導入する
    ことを特徴とする細胞の増殖抑制方法。