JP2001054391A - 小胞体ストレス転写因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】小胞体シャペロン遺伝子の発現を効率よく制御
しうる因子及びそれをコードする核酸又はその相補鎖、
小胞体シャペロン遺伝子の発現制御方法並びに外来タン
パク質の発現方法を提供すること。 【解決手段】配列番号：１のエレメントまたは配列番
号：１の配列中１〜３個の塩基の置換を有する塩基配列
のエレメントが有する転写誘導活性を調節しうる小胞体
ストレス転写因子；該因子を発現させることを特徴とす
る小胞体シャペロン遺伝子の発現制御方法；該発現制御
方法により、小胞体シャペロン遺伝子の発現を正に調節
することを特徴とする、外来タンパク質の発現方法；活
性化型ＡＴＦ６、活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰ、抑制型ＡＴ
Ｆ６または抑制型ＣＲＥＢ−ＲＰをコードする核酸また
はその相補鎖。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、小胞体シャペロン
遺伝子の発現を効率よく制御しうる因子およびそれをコ
ードする核酸またはその相補鎖核酸、小胞体シャペロン
遺伝子の発現制御方法ならびに外来タンパク質の発現方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳類細胞は、他の真核細胞および原核
細胞と同様に、それらの生存を脅かす多様な生理的条件
および環境的条件にうまく対処するために、数々のホメ
オスタティック機構を発達させてきた。なかでも、熱シ
ョックタンパク質（ＨＳＰ）の厳密に制御された合成
は、全生物に普遍的に見られるよく知られた機構であ
る。また、前記ＨＳＰとは異なる機構によるグルコース
調節タンパク質（ＧＲＰ）の制御された合成が、真核生
物の小胞体に特異的に見出されている〔Lee.A.S., Cur
r. Opin. Cell Biol., 4, 267-273, 1992; Morimoto,
R. I. et al., The Biology of HEAT SHOCK PROTEINS a
nd MOLECULAR CHAPERONES, Cold Spring HarborLaborat
ory, (1994)〕。

【０００３】哺乳類においては、８種類のＧＲＰ、すな
わち、ＧＲＰ７８／Ｂｉｐ、ＧＲＰ９４／ＥＲｐ９９、
ＯＲＰ１５０／ＧＲＰ１７０、ＥＲｐ７２、ＧＲＰ５８
／ＥＲｐ６０／ＥＲｐ６１、カルレティキュリン、プロ
テインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）およびＦＫ
ＢＰ１３が同定されている。これらのＧＲＰは、小胞体
内にフォールディングされないかフォールディングを誤
ったタンパク質（以下、アンフォールドタンパク質とい
う）が蓄積すること（小胞体ストレス）によってその発
現が誘導される一連の小胞体固有の分子シャペロンまた
はフォールディング酵素であり〔Kozutsumi,Y. et al.,
Nature, 332, 462-464 (1988); Lee, A. S., Trends B
iochem. Sci., 12, 20-23 (1987)〕、小胞体内での新生
分泌タンパク質や膜タンパク質の折り畳み（フォールデ
ィング）に極めて重要な役割を果たしているので、以
下、該ＧＲＰを「小胞体シャペロン」と総称する。

【０００４】小胞体シャペロンは、タンパク質のＮ−グ
リコシル化を阻害するツニカマイシン、カルシウム貯蔵
を涸渇させるカルシウムイオノフォアＡ２３１８７また
はカルシウムＡＴＰアーゼを阻害するタプシガーギン
（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）などの試薬によってもそ
の発現が誘導される。これらの試薬は、一般的に小胞体
の機能不全の原因となり、小胞体ストレスを誘発すると
考えられている。

【０００５】小胞体ストレスによる前記小胞体シャペロ
ンの誘導は、最初に転写レベルで制御される。小胞体シ
ャペロンは、熱ショックストレスによって誘導されず、
小胞体シャペロン遺伝子のプロモーター配列には、いか
なる熱ショックエレメントをも含まないので、小胞体シ
ャペロンの誘導は、ＨＳＰ誘導とは異なった制御機構に
よることが示唆されるが、小胞体ストレス応答は、共通
の機構によって制御されているのか、あるいは個々の小
胞体シャペロンごとに何種類もの多様な機構によって制
御されているのか、不明のままである。

【０００６】ラットＧＲＰ７８遺伝子については、すで
にある程度解析が行なわれており、上流域に存在するＣ
ＯＲＥ領域とＣＣＡＡＴ配列を含むＣ１領域が転写制御
に重要であることが明らかにされているが〔Resendez,
E. et al., Mol. Cell. Biol., 8, 4579-4584 (1988);
Wooden, S. K. et al., Mol. Cell. Biol., 11, 5612-5
623 (1991); Li, W. W. et al., Mol. Cell. Biol., 1
4, 5533-5546 (1994)〕（第１図を参照）、転写制御配
列は確定されていない。一方、酵母においては、出芽酵
母のＧＲＰ７８遺伝子の転写制御配列（ＵＰＲＥ配列：
ＣＡＧＮＧＴＧ）が明らかにされている〔Mori, K. et
al., Genes Cells, 1, 803-817 (1996) 〕。ヒトＧＲＰ
７８遺伝子の上流域にも前記ＵＰＲＥに類似した配列が
存在しているが、該ＵＰＲＥに類似した配列を有するＤ
ＮＡには、小胞体ストレスによって、転写を誘導する活
性は検出されていない。このように、哺乳類、特にヒト
の小胞体ストレス応答に関与する転写制御領域は、いま
だ決定されていないのが現状である。

【０００７】癌細胞では小胞体シャペロンの発現レベル
が高く、例えば細胞内ＧＲＰ７８レベルと癌の大きさが
よく相関しているとの報告〔Cai, J. W. et al., J. Ce
ll.Physiol., 154, 229-237, (1993)〕や、アンチセン
ス法によりＧＲＰ７８の発現を抑制すると細胞傷害性Ｔ
細胞（ＣＴＬ）や腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する感受
性が高まったり〔Sugawara, S. et al., Cancer Res. 5
3, 6001-6005, (1993)〕、マウスへの生着が悪く、生着
してもすぐに退縮する〔Jamora, C. et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 93, 7690-7694, (1996)〕との報告
がある。

【０００８】また、動脈硬化巣に浸潤しているマクロフ
ァージでＯＲＰ１５０が強く誘導されていることが示さ
れ、また、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理して
ＯＲＰ１５０の発現を抑制したマクロファージは低酸
素、特に変性ＬＤＬ（低密度リポ蛋白質）存在下におけ
る低酵素暴露で生存率が低下することが示されている
〔Tsukamoto, Y. et al., J. Clin. Invest., 98, 193
0-1941, (1996)〕。動脈硬化巣のマクロファージは、腫
瘍壊死因子、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、イン
ターロイキン−６（ＩＬ−６）、繊維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トラン
スフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）などのサイトカ
インを遊離するので、動脈硬化巣における細胞間応答の
中心に位置づけられ、動脈硬化の進展に大きな役割を果
たしていると考えられている。

【０００９】嚢胞性繊維症は、嚢胞性繊維症膜貫通調節
蛋白質(cystic fibrosis transmembrane conductance r
egulator; ＣＦＴＲ）遺伝子の変異に基づく遺伝性疾患
で、最も多くみられる変異は、５０８番フェニルアラニ
ンの欠失（Δ５０８Ｆ）である〔Welsh, M. J. & Smit
h, A. E., Cell, 73, 1251-1254, (1993)〕。ＣＦＴＲ
Δ５０８Ｆは糖鎖付加が異常になり、小胞体からゴルジ
体に輸送されず分解されてしまう。しかし、低温では、
小胞体から漏れて細胞膜に局在し、そのため、Δ５０８
Ｆ変異体でも活性を示すことが報告されている〔Dennin
g, G. M. et al.,Nature 358, 761-764, (1992)〕。小
胞体での新生膜蛋白質の品質管理の厳密性を適度に緩め
ることができれば、ＣＴＦＲΔ５０８Ｆを細胞膜に局在
させ、機能させることが可能と考えられる。

【００１０】さらに、ラット脳虚血においてＨＳＰ７０
とともにＧＲＰ７８のｍＲＮＡが誘導されること〔Wan
g, S. et al., Neurochem. Int., 23, 575-582, (199
3); Higashi, T. et al., Brain Res., 650, 239-248,
(1994) 〕、カイニン酸による痙攣発作を誘発したとき
海馬歯状回でＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４のｍＲＮＡが
誘導されること〔Lowenstein, D. H. et al., Mol. Bra
in Res., 22, 299-308, (1994); Little, E. et al.,
Neuroscience, 75, 209-219, (1996) 〕、マウス虚血脳
でＯＲＰ１５０が誘導されること〔Kuwabara, K. et a
l., J. Biol. Chem.,271, 5025-5032, (1996) 〕が観察
されており、脳虚血などによる神経細胞の損傷に対し、
小胞体シャペロンは保護的に作用していると考えられて
いる。

【００１１】また、創傷組織や潰瘍組織においても、小
胞体シャペロンはＨＳＰと同様に組織修復に重要な役割
を果たしていることが予想される。

【００１２】一方、外来遺伝子を細胞に導入して有用タ
ンパク質を生産させるとき、目的の遺伝子産物が細胞毒
性を示したり細胞機能に影響したりする場合には、導入
した遺伝子の発現を制御することが必要である。また、
組換えＤＮＡにより外来の有用タンパク質を宿主で発現
させるとき、目的のタンパク質が正しい立体構造を保
ち、高レベルに発現できないことも多い。大量のタンパ
ク質の発現と正しい立体構造の形成に対応するために
は、通常の宿主に存在する小胞体シャペロンやフォール
ディング酵素量では不足することが示唆される。

【００１３】したがって、小胞体シャペロンの発現を効
率よく制御することが可能な技術が要求されている。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、小胞体シャ
ペロン遺伝子の発現を増大または減少させ得る、該遺伝
子の発現制御方法、外来タンパク質の発現方法、該遺伝
子の発現を制御しうる小胞体ストレス転写因子およびそ
れをコードする核酸またはその相補鎖核酸を提供するこ
とを目的とする。

【００１５】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、〔１〕 配列番号：１に示される塩基配列からなる
エレメント、または配列番号：１に示される塩基配列に
おいて、１〜３個の塩基の他の塩基への置換を有する塩
基配列からなるエレメント、の有する転写誘導活性を調
節しうる小胞体ストレス転写因子、〔２〕 前記〔１〕
記載の小胞体ストレス転写因子を発現させることを特徴
とする小胞体シャペロン遺伝子の発現制御方法、〔３〕
前記〔２〕記載の方法により、小胞体シャペロン遺伝
子の発現を正に調節することを特徴とする、外来タンパ
ク質の発現方法。〔４〕 活性化型ＡＴＦ６をコードす
る核酸またはその相補鎖、〔５〕 活性化型ＣＲＥＢ−
ＲＰをコードする核酸またはその相補鎖、〔６〕 抑制
型ＡＴＦ６をコードする核酸またはその相補鎖、ならび
に〔７〕 抑制型ＣＲＥＢ−ＲＰをコードする核酸また
はその相補鎖、に関する。

【００１６】

【発明の実施の形態】本明細書において、「小胞体シャ
ペロン」とは、小胞体ストレスによって、その発現が誘
導される一連の小胞体固有のタンパク質で分泌タンパク
質や膜タンパク質の折り畳みや立体構造の形成を助けた
り触媒する活性を有するタンパク質および酵素を指し、
例えば、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ＯＲＰ１５０、ＥＲ
ｐ７２、ＧＲＰ５８、カルレティキュリン、ＰＤＩ、Ｆ
ＫＢＰ１３などをいう。前記小胞体シャペロンは、哺乳
類などに代表される動物や植物などに由来するタンパク
質をも包含する。

【００１７】また、本明細書においては、前記小胞体シ
ャペロンをコードする遺伝子を「小胞体シャペロン遺伝
子」という。

【００１８】（１）小胞体シャペロン遺伝子の発現を制
御しうる小胞体ストレス転写因子およびそれをコードす
る核酸 「小胞体シャペロン遺伝子の発現を制御しうる小胞体ス
トレス転写因子」は、前記小胞体シャペロン遺伝子に存
在する小胞体ストレス応答エレメント（以下、ＥＲＳＥ
という）との相互作用により発現を制御しうる因子をい
う。したがって、本発明の小胞体ストレス転写因子によ
れば、前記小胞体シャペロン遺伝子の発現を一挙に制御
するという優れた効果を発揮する。

【００１９】ここで、ＥＲＳＥとは、配列番号：１に示
される塩基配列からなるエレメント、または配列番号：
１に示される塩基配列において、１〜３個の塩基の他の
塩基への置換を有する塩基配列からなるエレメントであ
って、小胞体ストレスにより転写を誘導する活性を有す
るエレメントをいう。

【００２０】前記小胞体ストレス転写因子としては、具
体的には、配列番号：１に示される塩基配列からなるエ
レメント、または配列番号：１に示される塩基配列にお
いて、１〜３個の塩基の他の塩基への置換を有する塩基
配列からなるエレメント、の有する転写誘導活性を調節
しうる小胞体ストレス転写因子があげられる。

【００２１】なお、「１〜３個の塩基の他の塩基への置
換を有する塩基配列」とは、天然に存在する１〜３個の
塩基が他の塩基に置換された塩基配列および人為的に１
〜３個の塩基を他の塩基に置換した塩基配列をも意味す
る。

【００２２】小胞体ストレス転写因子としては、例え
ば、ｂＺＩＰ転写因子などがあげられ、より具体的に
は、ＡＴＦ６〔Hai, T.W. et al., Genes Dev. 3, 2083
-2090, (1989) 〕、ＣＲＥＢ−ＲＰ〔Min, J. et al.,
Genomics, 30, 149-156, (1995)〕、ＸＢＰ−１／ＴＲ
ＥＢ５〔Liou, H.C. et al., Science 247, 1581-1584
(1990), Yoshimura, T. et al., EMBO J. 9, 2537-2542
(1990) 〕などがあげられる。

【００２３】前記ＡＴＦ６の塩基配列およびアミノ酸配
列をそれぞれ配列番号：３１および３２に示す。また、
ＣＲＥＢ−ＲＰの塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞ
れ配列番号：３３および３４に示す。

【００２４】本発明の小胞体ストレス転写因子は、
（Ａ）前記配列番号：３１に示される塩基配列からなる
核酸、（Ｂ）配列番号：３３に示される塩基配列からな
る核酸、（Ｃ）前記（Ａ）または（Ｂ）記載の核酸の塩
基配列において、１個以上の塩基の置換、欠失、付加も
しくは挿入を有する塩基配列からなる核酸、ならびに
（Ｄ）前記（Ａ）〜（Ｃ）いずれか記載の核酸の相補鎖
とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸
によりコードされうるポリペプチドからなり、前記小胞
体ストレス応答エレメントの有する転写誘導活性を調節
しうる因子を包含する。

【００２５】なお、本明細書において、「１個以上の塩
基の置換、欠失、付加もしくは挿入を有する」とは、天
然にまたは人為的に、１個以上の塩基が、置換、欠失、
付加もしくは挿入された状態をいう。また、「１個以上
の塩基」は、小胞体ストレス応答エレメントの有する転
写誘導活性を調節しうる範囲で選択される。

【００２６】さらに、「核酸」とは、例えば、ＤＮＡお
よびそれに対応するＲＮＡなどをいう。

【００２７】また、「ストリンジェントな条件」として
は、例えば、モレキュラークローニング：ア ラボラト
リー マニュアル第２版〔Sambrook, J. et al.,(198
9)〕などに記載の条件などがあげられる。

【００２８】さらに、本発明の小胞体ストレス転写因子
には、前記小胞体ストレス応答エレメントの有する転写
誘導活性を調節しうる因子であれば、配列番号：３２お
よび３４に示されるそれぞれのアミノ酸配列において、
１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入を
有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含す
る。

【００２９】なお、本明細書において、「１個以上のア
ミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入を有する」と
は、天然にまたは人為的に、１個以上のアミノ酸が、置
換、欠失、付加もしくは挿入された状態をいう。また、
「１個以上のアミノ酸」は、小胞体ストレス応答エレメ
ントの有する転写誘導活性を調節しうる範囲で選択され
る。

【００３０】本発明においては、この他にも、下記のよ
うにして取得しうる小胞体ストレス転写因子も包含され
る。

【００３１】小胞体シャペロン遺伝子の発現を増大させ
る小胞体ストレス転写因子（以下、活性化型小胞体スト
レス転写因子という）を取得する方法としては、特に限
定されないが、例えば、後述のＥＲＳＥを用い、酵母を
宿主としたワン−ハイブリッド法により、小胞体ストレ
スの非存在下または存在下におけるＥＲＳＥの下流に組
み込まれたレポーター遺伝子の発現量を比較して、その
発現量の増加を指標として得る方法が挙げられる。

【００３２】一方、小胞体シャペロン遺伝子の発現を減
少させる小胞体ストレス転写因子（以下、抑制型小胞体
ストレス転写因子という）については、小胞体ストレス
非存在下または存在下におけるＥＲＳＥの下流に組み込
まれたレポーター遺伝子の発現量を比較して、その発現
量の減少を指標として、前記と同様にして得ることがで
きる。

【００３３】活性化型小胞体ストレス転写因子として
は、例えば、ＡＴＦ６などが挙げられる。

【００３４】前記ＡＴＦ６は、本明細書中の下記実施例
において、小胞体の膜タンパク質であることが示唆され
ており、小胞体シャペロンの発現を増大させる性質を有
するｂＺＩＰ転写因子である。前記ＡＴＦ６の存在によ
り、配列番号：１に示される塩基配列中の完全なＣＣＡ
ＡＴおよびＣＣＡＣＧ部分を有するＥＲＳＥが存在する
小胞体シャペロン遺伝子の転写増大活性を示すことがで
きる。

【００３５】前記ＡＴＦ６は、通常、分子量約９０ｋＤ
ａのタンパク質（以下、ｐ９０ＡＴＦ６という）である
が、小胞体ストレスの存在下ではｐ９０ＡＴＦ６から５
０ｋＤａタンパク質（以下、ｐ５０ＡＴＦ６という）の
活性化型へ変換される。前記ｐ５０ＡＴＦ６は、本明細
書中の下記実施例において、前記ｐ９０ＡＴＦ６のＮ末
端領域部分であり、核に局在することが強く示唆されて
いるものである。ｐ５０ＡＴＦ６は、小胞体シャペロン
遺伝子の発現を増大させる活性が活性化されたものであ
るため好ましい。

【００３６】なお、「小胞体ストレス」とは、タンパク
質の正常なフォールディングを妨げる多様な条件下で、
小胞体内にアンフォールドタンパク質が蓄積する現象を
いう。前記小胞体ストレスは、具体的には、グルコース
飢餓、ツニカマイシン〔Kozutsumi, Y. et al., Natur
e, 332, 462-464 (1988) 〕、カルシウムイオノフォア
Ａ２３１８７〔Watowich, S. K., Mol. Cell. Biol., 1
1, 5612-5623 (1991) 〕、タプシガーギン（ｔｈａｐｓ
ｉｇａｒｇｉｎ）〔Li, W. W., J. Biol. Chem.,268, 1
2003-12009 (1993)〕、２−デオキシグルコース、低酸
素曝露などの処理により引き起こすことができる。

【００３７】前記小胞体ストレスによって、ｐ５０ＡＴ
Ｆ６を得る条件としては、特に限定されないが、例え
ば、ツニカマイシンを用いた場合には、細胞を０．５〜
８μｇ／ｍｌのツニカマイシンで２〜８時間処理するこ
とにより小胞体ストレスを誘発し、ｐ９０ＡＴＦ６をｐ
５０ＡＴＦ６に変換することができる。

【００３８】また、活性化型ＡＴＦ６としては、Ｎ末端
領域（アミノ酸１〜３７３領域もしくはまたは１〜３６
６領域の全部または一部）を含むポリペプチドがあげら
れ、小胞体シャペロン遺伝子の発現を増大させる活性を
十分に発揮させる観点から、好ましくはアミノ酸１〜４
３領域を含み、より好ましくはアミノ酸１〜１５０領域
を含むポリペプチドがあげられる。例えば、かかる活性
化ＡＴＦ６は、目的のアミノ酸領域が終結する位置に終
止コドンを導入することにより作製することができる。

【００３９】一方、抑制型小胞体ストレス転写因子とし
ては、例えば、抑制型ＡＴＦ６、ＣＲＥＢ−ＲＰなどが
挙げられ、これらは、小胞体シャペロン遺伝子の発現を
減少させる性質を有する。

【００４０】前記抑制型ＡＴＦ６は、ＡＴＦ６もしくは
活性化型ＡＴＦ６からアミノ酸１〜１５０領域の全部ま
たは一部が破壊されたポリペプチドである。かかる抑制
型ＡＴＦ６は、ドミナントネガティブ体として作用し、
小胞体シャペロン遺伝子の発現を減少させる性質を有す
る。

【００４１】なお、「全部または一部の破壊」は、例え
ば、欠失、挿入、置換などの変異により、活性化型の転
写因子の有する機能が発揮できない状態をいう。

【００４２】ところで、小胞体ストレスによりｐ９０Ａ
ＴＦ６がｐ５０ＡＴＦ６に変換されるのと同様に、前記
ＣＲＥＢ−ＲＰは通常１１０ｋＤａのタンパク質（以
下、ｐ１１０ＣＲＥＢ−ＲＰという）であるが、小胞体
ストレスの存在下ではｐ１１０ＣＲＥＢ−ＲＰから６０
ｋＤａのタンパク質（以下、ｐ６０ＣＲＥＢ−ＲＰとい
う）に変換される。驚くべきことに、ｐ１１０ＣＲＥＢ
−ＲＰとは異なり、ｐ６０ＣＲＥＢ−ＲＰは小胞体シャ
ペロン遺伝子の発現を増大させる活性を有し、活性化型
小胞体ストレス転写因子として作用する。すなわち、前
記ＡＴＦ６（ｐ９０ＡＴＦ６およびｐ５０ＡＴＦ６）に
加え、ｐ６０ＣＲＥＢ−ＲＰも活性化型小胞体ストレス
転写因子としてあげることができる。

【００４３】さらに、前記活性型ＣＲＥＢ−ＲＰからア
ミノ酸１〜３０７領域の全部または一部が破壊されたポ
リペプチドは、ドミナントネガティブ体として作用し、
小胞体シャペロン遺伝子の発現を減少させる性質を有
し、抑制型小胞体ストレス転写因子としてあげることが
できる。

【００４４】前記小胞体ストレス転写因子（例えば、ｂ
ＺＩＰ転写因子など）による小胞体シャペロン遺伝子の
発現の有無は、例えば、ｍＲＮＡを定量し転写の有無を
評価することにより確認することができる。すなわち、
細胞よりＲＮＡを抽出し、ノーザンハイブリダイゼーシ
ョンやＲＮＡプロテクションアッセイなどにより、目的
の遺伝子が転写されているかどうかを調べることができ
る。また、前記小胞体シャペロン遺伝子とクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（以下、ＣＡＴと
いう）遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などのレポー
ター遺伝子との融合遺伝子を組み込んだプラスミドを細
胞に導入し、レポーター遺伝子産物であるＣＡＴまたは
ルシフェラーゼの活性を測定することにより、転写量を
相対的に調べることができる。

【００４５】前記小胞体ストレス転写因子（例えば、ｂ
ＺＩＰ転写因子など）の発現は、慣用の技術により、該
小胞体ストレス転写因子をコードする遺伝子を含有した
ＤＮＡを宿主の染色体に組み込んで得られた細胞または
一般に使用されるベクターに組み込んだのち、宿主に導
入して得られた細胞を用いて行なうことができる。

【００４６】前記小胞体ストレス転写因子をコードする
遺伝子は、適切なプロモーターなどを配置し、用いても
よい。前記プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０プ
ロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター、レト
ロウィルスＬＴＲプロモーター、β−アクチンプロモー
ター、酵母ＡＤＨ１プロモーター、酵母ＧＡＰ−ＤＨプ
ロモーターなどがあげられる。

【００４７】ベクターに組み込んで行なう場合、前記一
般に用いられるベクターとしては、プラスミド、コスミ
ド、ウィルスなどがあげられる。具体的には、特に限定
されないが、ｐＫＣＲ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＣＡＧＧ
Ｓ、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクタ
ー、アデノ随伴ウィルスベクター、酵母用ベクター：Ｙ
Ｉｐ、ＹＣｐ、ＹＥｐ、ＹＲｐ系プラスミドなどがあげ
られる。

【００４８】前記宿主としては、特に限定されないが、
例えば、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＦＭ３Ａ細胞、Ｌ
細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＥＳ細
胞、酵母サッカロミセス・セレビシエなどがあげられ
る。

【００４９】前記小胞体ストレス転写因子をコードする
遺伝子を含有したＤＮＡを宿主に導入するための方法と
しては、特に限定されないが、例えば、リン酸カルシウ
ム法、エレクトロポーレーション法、リポフェクション
法、ＤＥＡＥデキストラン法などの慣用の方法があげら
れる。

【００５０】本発明の小胞体ストレス転写因子は、該遺
伝子中のＥＲＳＥの塩基配列により、発現の増大または
減少の効果を発揮する程度が異なる場合がある。

【００５１】前記ＥＲＳＥとしては、例えば、配列番
号：１に示される塩基配列からなるエレメント〔ＣＣＡ
ＡＴ（Ｎ₉ ）ＣＣＡＣＧ〕があげられる。前記配列は、
ＧＲＰの１種であるヒトＧＲＰ７８タンパク質をコード
する遺伝子の転写制御領域（配列番号：４、図１）の解
析を行なうことによって、小胞体ストレスによる転写制
御に関与する領域であることが初めて明らかにされ、得
られたものである。

【００５２】前記配列番号：１に示される塩基配列は、
ヒトＧＲＰ７８のＥＲＳＥ１（配列番号：５）、マウス
ＧＲＰ７８のＥＲＳＥ１（配列番号：６）、ラットＧＲ
Ｐ７８のＥＲＳＥ１（配列番号：７）、ヒトＧＲＰ９４
のＥＲＳＥ１（配列番号：８）、ニワトリＧＲＰ９４の
ＥＲＳＥ１（配列番号：９）、ヒトＧＲＰ９４のＥＲＳ
Ｅ３（配列番号：１０）、ニワトリＧＲＰ９４のＥＲＳ
Ｅ３（配列番号：１１）、ヒトカルレティキュリンのＥ
ＲＳＥ３（配列番号：１２）、マウスカルレティキュリ
ンのＥＲＳＥ３（配列番号：１３）などでよく保存され
た配列である。

【００５３】また、前記ＥＲＳＥは、配列番号：１に示
される塩基配列において、１〜３個の塩基の他の塩基へ
の置換を有する塩基配列であって、小胞体ストレスによ
って、転写を誘導する活性を発揮しうるエレメントであ
ってもよい。かかるエレメントは、配列番号：１の塩基
配列において、遺伝子工学的手法により１〜３個の塩基
の置換を導入して得られたＤＮＡであってもよく、１〜
３個の塩基が置換された塩基配列からなる天然由来のＤ
ＮＡであってもよい。かかる天然由来のＤＮＡとして
は、例えば、ヒトＧＲＰ７８のＥＲＳＥ２（配列番号：
１４）、マウスＧＲＰ７８のＥＲＳＥ２（配列番号：１
５）、ラットＧＲＰ７８のＥＲＳＥ２（配列番号：１
６）、ヒトＧＲＰ７８のＥＲＳＥ３（配列番号：１
７）、マウスＧＲＰ７８のＥＲＳＥ３（配列番号：１
８）、ラットＧＲＰ７８のＥＲＳＥ３（配列番号：１
９）、ヒトＧＲＰ９４のＥＲＳＥ２（配列番号：２
０）、ヒトＧＲＰ９４のＥＲＳＥ４（配列番号：２
１）、ニワトリＧＲＰ９４のＥＲＳＥ２（配列番号：２
２）、ヒトカルレティキュリンのＥＲＳＥ１（配列番
号：２３）、ヒトカルレティキュリンのＥＲＳＥ２（配
列番号：２４）、マウスカルレティキュリンのＥＲＳＥ
２（配列番号：２５）、マウスＥＲｐ７２のＥＲＳＥ１
（配列番号：２６）、マウスＥＲｐ７２のＥＲＳＥ２
（配列番号：２７）、ヒトプロテインジスルフィドイソ
メラーゼのＥＲＳＥ１（配列番号：２８）、ヒトプロテ
インジスルフィドイソメラーゼのＥＲＳＥ２（配列番
号：２９）、ヒトＧＲＰ５８のＥＲＳＥ１（配列番号：
３０）などがあげられる。なお、前記ＥＲＳＥは、脊椎
動物、植物、カビなどにも類似の配列が見出されている
（図５）。

【００５４】前記ＥＲＳＥは、配列番号：１〜３に示さ
れるＥＲＳＥ１〜３の３つのエレメントが共存すること
により、さらに発現制御を効果的に行なうことができ
る。

【００５５】前記ＥＲＳＥを得る方法としては、特に限
定されないが、例えば、下記実施例のようにして得るこ
とができる。

【００５６】前記小胞体ストレス転写因子をコードする
核酸は、虚血性疾患や癌などの遺伝子治療に用いること
ができるという優れた性質を有する。例えば、小胞体シ
ャペロン遺伝子の発現を正（発現量の増大）に調節する
ことにより虚血性疾患の治療が可能になり、逆に負（発
現量の減少）に制御することにより癌の治療が可能にな
ることが期待される。

【００５７】小胞体シャペロン遺伝子の発現を正に調節
する場合、小胞体ストレス転写因子をコードする核酸と
して、活性化型ＡＴＦ６をコードする核酸または活性化
型ＣＲＥＢ−ＲＰをコードする核酸を用いることができ
る。

【００５８】活性化型ＡＴＦ６をコードする核酸として
は、具体的には、（ａ）配列番号：３２のアミノ酸番
号：１〜３７３に示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列からなる核酸、（ｂ）配列番号：３２のアミノ酸
番号：１〜３６６に示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列からなる核酸、（ｃ）配列番号：３１の塩基番
号：６９〜１１８７に示される塩基配列からなる核酸、
（ｄ）配列番号：３１の塩基番号：６９〜１１６６に示
される塩基配列からなる核酸、（ｅ）前記（ａ）〜
（ｄ）いずれか記載の核酸において、少なくとも１塩基
の置換、欠失、付加もしくは挿入を有する塩基配列から
なる核酸、（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）いずれか記載の核
酸の相補鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイ
ズする核酸からなる群より選ばれた核酸が挙げられる。
また、活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰをコードする核酸として
は、具体的には、（ｇ）配列番号：３４のアミノ酸番
号：１〜３８９に示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列からなる核酸、（ｈ）配列番号：３３の塩基番
号：４７〜１２１３に示される塩基配列からなる核酸、
（ｉ）前記（ｇ）または（ｈ）いずれか記載の核酸にお
いて、少なくとも１塩基の置換、欠失、付加もしくは挿
入を有する塩基配列からなる核酸、および（ｊ）前記
（ｇ）〜（ｉ）いずれか記載の核酸の相補鎖にストリン
ジェントな条件下にハイブリダイズする核酸からなる群
より選ばれた核酸があげられる。

【００５９】小胞体シャペロン遺伝子の発現を負（発現
量の減少）に制御する場合、小胞体ストレス転写因子を
コードする核酸として、例えば、前記活性化型ＡＴＦ６
をコードする核酸の相補鎖核酸、前記活性化型ＣＲＥＢ
−ＲＰをコードする核酸をコードする核酸の相補鎖核
酸、抑制型ＡＴＦ６をコードする核酸、抑制型ＣＲＥＢ
−ＲＰをコードする核酸などを用いることができる。

【００６０】具体的には、前記活性化型ＡＴＦ６をコー
ドする核酸の相補鎖核酸としては、前記（ａ）〜（ｆ）
からなる群より選ばれた核酸の相補鎖核酸が挙げられ
る。前記活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰをコードする核酸をコ
ードする核酸の相補鎖核酸としては、前記（ｇ）〜
（ｊ）からなる群より選ばれた核酸の相補鎖核酸が挙げ
られる。抑制型ＡＴＦ６をコードする核酸としては、
（ｋ）配列番号：３２のアミノ酸番号：１５１〜６７０
に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる
核酸、（ｌ）配列番号：３２のアミノ酸番号：１５１〜
３７３に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列か
らなる核酸、（ｍ）配列番号：３２のアミノ酸番号：１
５１〜３６６に示されるアミノ酸配列をコードする塩基
配列からなる核酸、（ｎ）配列番号：３１の塩基番号：
５１９〜２０７８に示される塩基配列からなる核酸、
（ｏ）配列番号：３１の塩基番号：５１９〜１１８７に
示される塩基配列からなる核酸、（ｐ）配列番号：３１
の塩基番号：５１９〜１１６６に示される塩基配列から
なる核酸、（ｑ）前記（ｋ）〜（ｐ）いずれか記載の核
酸の塩基配列において、少なくとも１種の塩基の置換、
欠失、付加もしくは挿入を有する塩基配列からなる核
酸、および（ｒ）前記（ｋ）〜（ｑ）いずれか記載の核
酸の相補鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイ
ズする核酸からなる群より選ばれた核酸があげられる。
抑制型ＣＲＥＢ−ＲＰをコードする核酸としては、
（ｓ）配列番号：３４のアミノ酸番号：３０８〜３８６
に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる
核酸、（ｔ）配列番号：３３の塩基番号：９６８〜１２
０４に示される塩基配列からなる核酸、（ｕ）配列番
号：３４のアミノ酸番号：１５１〜３８９に示されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、（ｖ）
配列番号：３３の塩基番号：４９７〜１２１３に示され
る塩基配列からなる核酸、（ｗ）配列番号：３４のアミ
ノ酸番号：８１〜３８９に示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなる核酸、（ｘ）配列番号：３３の
塩基番号：２８７〜１２１３に示される塩基配列からな
る核酸、（ｙ）前記（ｓ）〜（ｘ）いずれか記載の核酸
において、少なくとも１塩基の置換、欠失、付加もしく
は挿入を有する塩基配列からなる核酸、および（ｚ）前
記（ｓ）〜（ｙ）いずれか記載の核酸の相補鎖にストリ
ンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸からなる
群より選ばれた核酸があげられる。

【００６１】小胞体シャペロンの発現を抑制する活性を
有する物質〔例えば、抑制型ＡＴＦ６、（ｋ）〜（ｒ）
の核酸、（ａ）〜（ｆ）の核酸の相補鎖、抑制型ＣＲＥ
Ｂ−ＲＰ、（ｓ）〜（ｚ）の核酸、（ｇ）〜（ｊ）の核
酸の相補鎖など〕は、癌、動脈硬化症または嚢胞性繊維
症の治療薬あるいは予防薬になることが期待される。ま
た、小胞体シャペロンの発現を誘導する活性を有する物
質〔例えば、活性化型ＡＴＦ６、（ａ）〜（ｆ）の核
酸、活性型ＣＲＥＢ−ＲＰ、（ｇ）〜（ｊ）の核酸な
ど〕は、虚血性疾患、創傷または潰瘍の治療薬あるいは
予防薬になることが期待される。

【００６２】小胞体シャペロンの発現を抑制する活性を
有する物質または小胞体シャペロンの発現を誘導する活
性を有する物質を疾患の治療薬あるいは予防薬として用
いる場合、その投与形態としては、経口投与、吸入投
与、静脈内注射、皮下注射などが挙げられる。

【００６３】本発明の核酸またはその相補鎖の投与方法
としては、該核酸またはその相補鎖の細胞内への導入の
容易性の観点から、ウイルスベクターに該核酸またはそ
の相補鎖を組み込んだ構築物を、経口投与、吸入投与、
静脈内注射、皮下注射などによる投与方法、本発明の核
酸またはその相補鎖を保持する発現プラスミドを含有し
た組成物を直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン
法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロイン
ジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレ
ーション法などが挙げられる。

【００６４】本発明の核酸またはその相補鎖は、細胞内
への移行性または細胞内での安定性を高めるため、例え
ば、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート、アルキ
ルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキ
ルホスホアミデートなどの化学的修飾核酸であっても
い。

【００６５】（２）小胞体シャペロン遺伝子の発現制御
方法 本発明の小胞体シャペロン遺伝子の発現制御方法は、本
発明の小胞体ストレス転写因子（例えば、ｂＺＩＰ転写
因子など）を発現させて用いることを１つの大きな特徴
とする。本発明の小胞体シャペロン遺伝子の発現制御方
法によれば、小胞体ストレス転写因子を用いて小胞体シ
ャペロン遺伝子を発現制御することにより、癌、動脈硬
化症、嚢胞性繊維症、虚血性疾患、創傷、潰瘍の治療あ
るいは予防が可能になるという優れた効果を発揮する。
また、本発明の小胞体シャペロン遺伝子の発現制御方法
によれば、組換えＤＮＡによる外来タンパク質の発現に
おいて、正しい立体構造を保ち、かつ高レベルに目的タ
ンパク質を発現させることが可能になるという優れた効
果を発揮する。

【００６６】本発明の小胞体ストレス転写因子は、前記
小胞体シャペロン遺伝子の発現を一挙に制御しうるの
で、本発明の小胞体ストレス転写因子を用いる方法は、
個々の小胞体シャペロン遺伝子の発現を制御する方法に
比べ、格段に優れた制御効果が期待される。

【００６７】本発明においては、細胞内の小胞体ストレ
ス転写因子の発現量を調節することにより、小胞体シャ
ペロン遺伝子の発現制御をすること、または細胞内で発
現させる小胞体ストレス転写因子の選択により、小胞体
シャペロン遺伝子の発現を正または負に調節する活性を
調節することができる。

【００６８】小胞体ストレス転写因子の発現量を調節す
ることにより、小胞体シャペロン遺伝子の発現制御を行
なう場合、発現量の調節は、小胞体ストレス転写因子を
コードするＤＮＡあるいは小胞体ストレス転写因子のア
ンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、あるいはアンチ
センスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより
行なうことができる。

【００６９】発現させる小胞体ストレス転写因子の選択
により、小胞体シャペロン遺伝子の発現を正（発現量の
増大）または負（発現量の減少）に調節する場合、例え
ば、ｂＺＩＰ転写因子であるＡＴＦ６、ＣＲＥＢ−Ｒ
Ｐ、ＸＢＰ−１／ＴＲＥＢ５などから、発現の調節の方
向（正または負）に応じて、選択することにより発現を
調節することができる。この他にも、前記（１）に記載
の小胞体ストレス転写因子（例えば、ｂＺＩＰ転写因
子）または核酸の有する性質により適宜選択してもよ
い。

【００７０】小胞体シャペロン遺伝子の発現量を増大さ
せる場合、例えば、ＡＴＦ６を細胞内でｐ９０ＡＴＦ６
として発現させ、小胞体ストレスによりｐ５０ＡＴＦ６
を生じさせて用いてもよく、ｐ５０ＡＴＦ６をコードす
るＤＮＡを発現させて用いてもよい。さらに、ｐ６０Ｃ
ＲＥＢ−ＲＰをコードするＤＮＡを発現させても用いて
もよい。

【００７１】また、前記ＡＴＦ６を用いる場合、Ｎ末端
領域（アミノ酸１〜３７３領域もしくは１〜３６６領域
の全部または一部）を含むポリペプチドを用いることが
でき、小胞体シャペロン遺伝子の発現を増大させる活性
を十分に発揮させる観点から、好ましくはアミノ酸１〜
４３領域を含み、さらに好ましくはアミノ酸１〜１５０
領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞内で
発現させて用いてもよい。

【００７２】さらに、前記活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰを用
いる場合、Ｎ末端領域（アミノ酸１〜３８９領域の全部
または一部）を含むポリペプチドを用いることができ、
かかるポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞内で発現
させても用いてもよい。

【００７３】また、小胞体シャペロン遺伝子の発現量を
減少させる場合、ＡＴＦ６あるいは活性化型ＡＴＦ６か
らアミノ酸１〜１５０領域の全部または一部が破壊され
たポリペプチドをドミナントネガティブ体として用いる
ことにより、小胞体シャペロン遺伝子の発現を減少させ
ることができる。この場合、かかるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを細胞内で発現させてもよい。

【００７４】一方、小胞体シャペロン遺伝子の発現量を
減少させる場合、前記活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰからアミ
ノ酸１〜３０７領域の全部または一部が破壊されたポリ
ペプチドをドミナントネガティブ体として用いることに
より、小胞体シャペロン遺伝子の発現量を減少させるこ
とができる。この場合、かかるポリペプチドをコードす
るＤＮＡを細胞内で発現させても用いてもよい。

【００７５】（３）外来タンパク質の発現方法 本発明の小胞体シャペロン遺伝子の発現制御方法によ
り、さらに、外来遺伝子の発現方法が提供される。かか
る外来遺伝子の発現方法も本発明に含まれる。

【００７６】外来遺伝子の発現制御に利用する場合、
１）前記活性化型小胞体ストレス転写因子をコードする
遺伝子と、小胞体シャペロン遺伝子のプロモーター下流
に配置した外来遺伝子とを同時に発現させてもよく、ま
た、２）前記活性化型小胞体ストレス転写因子をコード
する遺伝子と、前記小胞体シャペロン遺伝子のＥＲＳＥ
部分を含有したＤＮＡの下流に、適切なプロモーター、
外来遺伝子等を配置したＤＮＡとを同時に発現させても
よい。

【００７７】１） 前記活性化型小胞体ストレス転写因
子をコードする遺伝子と、小胞体シャペロン遺伝子のプ
ロモーター下流に配置した外来遺伝子とを同時に発現さ
せる場合 活性化型小胞体ストレス転写因子をコードする遺伝子を
含有したベクターと、小胞体シャペロン遺伝子の下流に
配置した外来遺伝子を含有したベクターとを共発現させ
てもよく、あらかじめ小胞体ストレスにより活性化型小
胞体ストレス転写因子をコードする遺伝子を発現制御す
ることが可能な宿主を作成し、該宿主に、前記外来遺伝
子を含有したベクターを導入し、該外来遺伝子を発現さ
せてもよい。

【００７８】ベクターとしては、特に限定されないが、
前記のベクターがあげられる。発現に用いられる宿主と
しては、特に限定されないが、前記の宿主があげられ
る。

【００７９】ベクターを用いたトランスフェクションの
方法としては、特に限定されないが、前記慣用の方法が
あげられる。

【００８０】２） 前記活性化型小胞体ストレス転写因
子をコードする遺伝子と、前記小胞体シャペロン遺伝子
のＥＲＳＥ部分を含有したＤＮＡの下流に、適切なプロ
モーター、外来遺伝子等を配置したＤＮＡとを同時に発
現させる場合 前記プロモーターは、ヒトＧＲＰ７８遺伝子、ヒトＧＲ
Ｐ９４遺伝子、ヒトカルレティキュリン遺伝子に由来す
るプロモーターのみならず、いかなる外来性のプロモー
ターをも含む。前記外来性のプロモーターの具体例とし
ては、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウィルスプ
ロモーター、レトロウィルスＬＴＲプロモーター、β−
アクチンプロモーターなどがあげられる。

【００８１】前記小胞体シャペロン遺伝子のＥＲＳＥ部
分を含有したＤＮＡは、転写開始点の上流のいかなる位
置に置くことも可能であるが、転写開始点より６００塩
基以内に存在することが好ましい。さらに、前記ＤＮＡ
の方向性はどちらの向きでも使用することができる。

【００８２】小胞体シャペロン遺伝子のＥＲＳＥ部分を
含有したＤＮＡは、上記一般に用いられているプラスミ
ド、コスミド、ウイルスなどに含有させることによっ
て、発現ベクターとして使用することができる。

【００８３】発現に用いられる細胞としては、前記の細
胞があげられる。また、発現ベクターのトランスフェク
ションは、前記した慣用のトランスフェクションの方法
により行なうことができる。

【００８４】以下に本発明の調製例および実施例を示
し、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら
の実施例などによって限定されるものではない。

【００８５】

【実施例】実施例１ ＥＲＳＥの単離 （１）細胞培養 ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）を、１０％ ウシ
胎児血清、２ｍＭ グルタミン、１００ユニット／ｍｌ
ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン
を含む、ダルベッコ変法イーグル培地（４．５ｇ／Ｌグ
ルコース）中で加湿した５％ＣＯ₂ ／９５％大気中３７
℃で培養した。

【００８６】（２）ＥＲＳＥ単離用のレポータープラス
ミドの構築 組み換えＤＮＡ技法は、モレキュラークローニング ア
ラボラトリーマニュアル 第２版 コールドスプリン
グハーバーラボラトリー １９８９年発行などに記載の
慣用の手法により行なった。

【００８７】ティングら（前述）によって開示されてい
るヒトＧＲＰ７８遺伝子の配列に基づいて作製した２つ
のオリゴヌクレオチドをそれぞれ＋鎖および−鎖のプラ
イマーとして用い、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲ法によって、ヒトＧＲＰ７８プロモーター
領域（〔−３０４〜＋７〕領域、転写開始点のヌクレオ
チドの位置を＋1 とする）の３１１ｂｐ断片を増幅させ
た。ホタルルシフェラーゼをコードする配列を有し、真
核生物のプロモーターまたはエンハンサーを持たないｐ
ＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）のＫｐｎ
Ｉ−ＸｈｏＩ部位に、得られた増幅断片を挿入し、クロ
ーン化した。

【００８８】ＰＣＲ法によって、−３０４〜＋７領域の
様々な長さのプロモーターの欠失断片を調製した。

【００８９】得られたＰＣＲ増幅断片を、ｐＧＬ２−Ｂ
ａｓｉｃベクターまたはホタルルシフェラーゼをコード
する配列の上流のＳＶ４０基本プロモーターを含むｐＧ
Ｌ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター（プロメガ社製）のＫ
ｐｎＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、一連の欠失変異体のレ
ポータープロモーターを作製した。

【００９０】−１３９〜−６２領域および−６５〜−２
６領域の点変異体を構築するために、適当な塩基置換を
有するオリゴヌクレオチドを合成し、アニーリング後、
ｐＧＬ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター（プロメガ社製）
のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ部位に連結した。ストラタジーン
社製エクスサイト サイト−ディレクティッド ミュー
タジェネシス キット（Ｅｘｓｉｔｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用
いてＧＲＰ７８プロモーター内のＥＲＳＥ配列に部位特
異的変異を導入した。得られた断片をｐＧＬ３−Ｂａｓ
ｉｃベクター（プロメガ社製）のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄII
I 部位に挿入した。

【００９１】チャンら〔Chang, S. C. et al., Mol. Ce
ll. Biol., 9, 2153-2162 (1989)〕によって開示されて
いるヒトＧＲＰ９４遺伝子の配列に基づいて作製したオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＨｅＬａ細
胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって、ヒト
ＧＲＰ９４プロモーター領域（−３６３〜＋３４領域）
の３９７ｂｐ断片を増幅させた。

【００９２】マッコーリッフェら〔McCauliffe, D. P.
et al. J.Biol.Chem. 267, 2557-2562 (1992) によって
開示されているヒトカルレティキュリン遺伝子の配列に
基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣ
Ｒ法によって、ヒトカルレティキュリンプロモーター領
域（−４５９〜＋５２領域）の５１１ｂｐ断片を増幅さ
せた。

【００９３】これらの２つのプロモーターは、ＥＲＳＥ
配列の破壊実験に用いた。一過性のトランスフェクショ
ンには、慣用の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）法によって精
製したプラスミドを用いた。

【００９４】（３）ＥＲＳＥ単離用レポータープラスミ
ドの一過性の発現のためのトランスフェクション実験 トランスフェクションは、前記モレキュラークローニン
グなどに記載の慣用のリン酸カルシウム法によって行な
った。ＨｅＬａ細胞は、トランスフェクション前日に、
２４穴ディッシュに約１０％のコンフルエンシーになる
ようにプレーティングした。ＥＲＳＥ単離用レポーター
プラスミド１μｇおよびリファレンスプラスミド〔ＳＶ
４０エンハンサーおよびプロモーターをＲｅｎｉｌｌａ
（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ遺伝子のすぐ上流に保
持するｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター（プロメガ社製）〕
０．１μｇを、２５０ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む１×ＨＥ
ＰＥＳ緩衝生理食塩水（組成：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、
２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 、
ｐＨ７．０８）中室温で混合し、ＣａＰＯ₄ −ＤＮＡ複
合体を形成させた。細胞をＣａＰＯ₄ −ＤＮＡ複合体と
３７℃で１６時間インキュベートしたのち、リン酸緩衝
化生理食塩水で３回洗浄し、新しい培地中でさらにイン
キュベートした。

【００９５】（４）活性測定 前記（３）で得られたトランスフェクション細胞を、４
８時間培養後、ラバーポリースマンで細胞を集め、１０
０μｌの溶解緩衝液（１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝
液、１ｍＭ ジチオスレイトール、ｐＨ７．８）中に懸
濁した。得られた細胞懸濁液の凍結融解を３回繰り返す
ことによって、細胞を破砕し、無細胞抽出液を得た。

【００９６】なお、小胞体ストレス応答を誘導するた
め、細胞を集める１６時間前に、細胞を２μｇ／ｍＬの
ツニカマイシンで処理した。

【００９７】ホタル及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ
活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシ
ステム（プロメガ社製）を用いて、製造業者の指示に従
って、５μｌの細胞溶解液を用いて測定した。なお、前
記活性は、ルミノメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社
製、商品名：ルミノスキャン）を用いて、測定数値に直
線性が得られる範囲内で測定した。ホタルルシフェラー
ゼ活性をＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に対して標
準化し、ルシフェラーゼ相対活性とした。

【００９８】（５）ＥＲＳＥの同定 哺乳類ＧＲＰ遺伝子の小胞体ストレス応答プロモーター
は多数のＣＣＡＡＴモチーフを含むことが注目された。
図３に示すように、ＣＣＡＡＴ−９ｎｔ−ＣＣＡＣＧの
構造的なモチーフがＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４およびカル
レティキュリンのプロモーター中に存在し、図３および
図４に示すように、これらのＣＣＡＡＴおよび隣接する
配列に、ＦＫＢＰ１３を除く試験された全てのＧＲＰプ
ロモーターが多コピーの類似モチーフを含むことを見出
した。図１に示すように、以前、ＧＲＰ７８プロモータ
ーにおいて定義されたＣＯＲＥおよびＣ１領域の両方は
実際にこのモチーフを含む。興味深いことに、図２に示
すように、哺乳類のＧＲＰ７８プロモーターは連続した
繰り返し配列からなり、それぞれがこのモチーフを含
み、それは進化の過程の複製により生じることが推定さ
れる。共に得られたこれらの知見は、前記モチーフは哺
乳類のアンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）に特異
的に含まれることを示唆した。酵母のＵＰＲに応答する
ＵＰＲＥとは構造的に異なるので、このモチーフを小胞
体ストレス応答エレメント（ＥＲＳＥ）と称する。ま
た、前記ＥＲＳＥ様配列は、図５に示すように脊椎動
物、植物、カビ等に見出される。

【００９９】（６）ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４およびカル
レティキュリンのＥＲＳＥモチーフの転写誘導への関与 ＥＲＳＥモチーフがＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４およびカル
レティキュリンの誘導に重要であるかどうかを試験する
ため、図６のライン１〜１４に示すそれぞれのプロモー
ターを、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ
遺伝子に連結し、前記（３）と同様に、ＨｅＬａ細胞に
トランスフェクトした。タンパク質のＮ−グリコシル化
の阻害剤であるツニカマイシン（以下、ＴＭという）を
用い、ＵＰＲを誘導した。

【０１００】図６に示すように、インタクトＧＲＰ７８
プロモーターは、ＴＭ処理細胞におけるルシフェラーゼ
発現（図６、ライン２、黒棒）を対照（ライン２、白
棒）の５倍に増大させた。発現の程度は〔Ting, J. et
al., DNA, 7, 275-28 6, (1988) ;Wooden, S. K. et a
l., Mol. Cell Biol. 11, 5612-5623, (1991)〕の以前
の研究において観察されたもの（５〜７倍）、ならびに
図１９のパネル（Ｃ）に示される内在性のＧＲＰ７８タ
ンパク質レベル（５〜８倍）に匹敵した。

【０１０１】完全なＧＲＰ９４プロモーターおよびカル
レティキュリンプロモーターは、図６のライン８および
１２に示すように、ＴＭ処理によりルシフェラーゼ発現
をそれぞれ８倍および４倍に増大し、この発現量は、
〔Ramakrishnan, M. et al., DNA Cell Biol. 14, 373-
384, (1995); Waser, M. et al., J. Cell Biol., 138,
547-557, (1997)〕の以前の報告に一致するものであっ
た。

【０１０２】また、図６のライン３に示すように、ＥＲ
ＳＥ１モチーフをＧＲＰプロモーターから選択的に除去
した場合、ルシフェラーゼの誘導を著しく減少させた。
図６のライン４〜６に示すように、ＥＲＳＥ１モチーフ
の除去により減少したルシフェラーゼの誘導は、ＥＲＳ
Ｅ２および／またはＥＲＳＥ３のさらなる破壊により完
全に破壊された。

【０１０３】ＧＲＰ７８の場合のように、ＧＲＰ９４プ
ロモーターのＥＲＳＥ１の破壊（図６のライン９に示
す）は著しく誘導を減少させ、ライン１０に示すよう
に、ＥＲＳＥ１およびＥＲＳＥ３の同時除去により誘導
が完全に破壊された。

【０１０４】図６のライン１３に示すように、カルレテ
ィキュリンプロモーターの遠位のＥＲＳＥ３単独の除去
はほとんど影響をしなかったが、ライン１４に示すよう
に、カルレティキュリンプロモーターのＥＲＳＥ３およ
びＥＲＳＥ２の両方の破壊は誘導を完全に妨げた（ライ
ン１４）。

【０１０５】図７に示すように、いくつかのフランキン
グ配列を有する推定ＥＲＳＥ（ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９
４、カルレティキュリンのそれぞれのＥＲＳＥ）を、異
種プロモーターであるＳＶ４０最小プロモーターの上流
に置いた場合、これらのＥＲＳＥは、ルシフェラーゼ活
性を顕著に誘導したため、これらのＥＲＳＥが実際に機
能していることが示唆された。

【０１０６】また、ヒトＧＲＰ７８プロモーター由来の
ＥＲＳＥ１の方向による影響を調べた結果、その方向に
かかわらず、等しい活性を示した。以上の結果より、Ｅ
ＲＳＥモチーフは、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４およびカル
レティキュリン、ならびにおそらくは他のＧＲＰの誘導
に必要かつ十分なシス活性化エレメントであることが示
唆された。

【０１０７】ＥＲＳＥモチーフにおいて、不可欠なヌク
レオチド配列が実際にＣＣＡＡＴ（Ｎ）₉ ＣＣＡＣＧで
あるかどうかを決定するために、前記実験に使用したヒ
トＧＲＰ７８プロモーター由来のＥＲＳＥ１のそれぞれ
のヌクレオチドに点変異（トランスバージョン）を導入
した。

【０１０８】その結果、図８および９に示すように、他
のヌクレオチドの置換は、ほとんど影響しないが、−６
１〜−５７（図８、ライン７〜１１）または−４６〜−
４３（図８、ライン２２〜２５）のヌクレオチドのうち
のいくつかの置換はほとんど完全に誘導を妨げた。この
結果により、ＣＣＡＡＴ（−６１〜−５７）およびＣＡ
ＣＧ（−４６〜−４３）が誘導に不可欠であることが強
く示唆された。

【０１０９】図３に示すようにヌクレオチドＣ〔−４
７〕も良く保存されていたため、さらに詳しく解析し
た。この実験には、いかに〔−６５〜−４２〕セグメン
ト（図９、ライン２７）より顕著に低い応答を示す〔−
６５〜−３８〕セグメントを使用した。Ｃ〔−４７〕を
Ａに変えるとほとんど影響しないが（ライン３０；ライ
ン２１を参照）、図９のライン３１および３２に示すよ
うに、Ｃ〔−４７〕をＧまたはＴに変えると完全に誘導
を破壊したため、Ｃ〔−４７〕も不可欠であることが示
された。対照的に、Ａ〔−４２〕の他のヌクレオチドへ
の変換は、ほとんど効果を示さなかった。さらに、ライ
ン３８〜４０に示す１〜３ヌクレオチドの挿入は、完全
にルシフェラーゼの誘導を破壊したため、ＣＣＡＡＴ
（−６１〜−５７）とＣＣＡＣＧ（−４７〜−４３）と
の間の距離が重要であることが示された。これらの結果
は、ヒトＧＲＰ７８プロモーターのＥＲＳＥ１モチーフ
の不可欠な配列は、１９ヌクレオチドのストレッチ〔Ｃ
ＣＡＡＴ（Ｎ）₉ ＣＣＡＣＧ〕であることを示す。

【０１１０】（７）他の小胞体ストレス誘導剤への応答 哺乳類のＧＲＰの小胞体ストレス応答を実験的に誘導す
るために、全ての実験で使われたツニカマイシンに加え
て、小胞体のカルシウム貯蔵を涸渇させるカルシウムイ
オノフォアＡ２３１８７、小胞体のＣａ²⁺−ＡＴＰアー
ゼおよび小胞体からのカルシウムイオンの排出を阻害す
るタプシガーギンなどの種々の薬品で細胞を処理した。
Ａ２３１８７およびタプシガーギンに対するヒトＧＲＰ
プロモーターの小胞体ストレス応答を試験した。結果を
図１０に示す。なお、図中ライン１、５、９、１３、１
７および２１は対照として誘導剤無添加時の相対活性を
示す。また、ライン２、６、１０、１４、１８および２
２はツニカマイシン添加、ライン３、７、１１、１５、
１９および２３はカルシウムイオノフォアＡ２３１８７
添加、ライン４、８、１２、１６、２０および２４はタ
プシガーギン添加時の相対活性を示す。

【０１１１】ＧＲＰ７８（図１０、ライン１〜４）、Ｇ
ＲＰ９４（図１０、ライン９〜１２）およびカルレティ
キュリン（図１０、ライン１７〜２０）のそれぞれの処
理に対する転写誘導は、図１０のライン５〜８、１３〜
１６、および２１〜２４に示すように、ＥＲＳＥを破壊
することによって完全に妨げられたため、ＥＲＳＥが、
ツニカマイシンによってだけでなく、他の誘導剤による
ＧＲＰの誘導にも必要であることが示された。

【０１１２】実施例２ ＥＲＳＥ結合タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡのワン−ハイブリッドスクリーニング ワン−ハイブリッドスクリーニング用のレポータープラ
スミドを、基本的には〔Mori,K. et al., Genes Cells,
1, 803-817 (1996)〕の記載に従って構築した。

【０１１３】ヒトＧＲＰ７８プロモーター由来のＥＲＳ
Ｅ１配列〔５’−ＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＧＧ
ＣＣＴＣＣＡＣＧＡＣＧＧ−３’（配列番号：３５）〕
の６つのタンデムリピートをＩＲＥ１プロモーターに連
結した酵母ＨＩＳ３遺伝子の上流に挿入し、一方、変異
ＥＲＳＥ〔５’−ＣＣＴＴＣＡｇａｃｔａＣＧＧＣＧＧ
ＣＣＴｇａｔｇｔＡＣＧＧ−３’（配列番号：３６）〕
の６つのタンデムリピートをＩＲＥ１プロモーターに連
結した大腸菌由来ｌａｃＺ遺伝子の上流に挿入した。前
記レポータープラスミドの構造を概略的に図１１に示
す。

【０１１４】前記レポータープラスミドをＵＲＡ３遺伝
子に存在するＮｃｏＩ部位で開環状にし、酵母ＫＭＹ１
０１５株（ＭＡＴα ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３
−５２ ｈｉｓ３−Δ２００ ｔｒｐ−Δ９０１ ｌｙ
ｓ２−８０１ ｉｒｅ１Δ：：ＴＲＰ１）〔Mori,K. et
al., Genes Cells, 1, 803-817 (1996)〕のｕｒａ３−
５２座に１コピー組み込んだ。得られた酵母株（以下、
ＫＭＹ１０１５−ＥＲＳＥという）をＵＰＲ経路の予期
できない活性化を排除するための宿主として使用した。
ＫＭＹ１０１５−ＥＲＳＥは、ヒスチジン非存在下では
生育できず、ＩＲＥ１プロモーターの低い基底活性によ
る低いβ−ガラクトシダーゼ活性を発現した。

【０１１５】酵母転写活性化因子Ｇａｌ４ｐ（ＧＡＬ４
ＡＤ）の活性化ドメインをｃＤＮＡクローニング部位の
すぐ上流に保持する多コピープラスミドベクターを用い
て作製されたヒトリンパ球ｃＤＮＡライブラリーは、金
沢大学のハヤシ博士(N.Hayashi) を通じて、ベイラー医
科大学のエレッジ博士(S.J.Elledge) により供与され
た。

【０１１６】ＥＲＳＥ結合タンパク質は、酵母転写因子
Ｇａｌ４ｐ（ＧＡＬ４ＡＤ）の活性化ドメインと融合さ
せた場合、酵母細胞内でも、レポーター遺伝子であるＨ
ＩＳ３の転写をＥＲＳＥに依存して活性化することが期
待される。そこで、前記のエレッジ博士から供与された
ヒトリンパ球ｃＤＮＡライブラリーを用いて、酵母を宿
主とした形質転換体を調製し、約４３０万個の形質転換
体をスクリーニングした。その結果、強いＨｉｓ⁺ 表現
型を示す８つのクローンを得た。得られたクローンの中
で、上流領域に機能的なＥＲＳＥが存在しないにもかか
わらず高レベルのβ−ガラクトシダーゼを発現するクロ
ーンを除外した。その結果、ＥＲＳＥに依存してレポー
ター遺伝子の転写を増大するクローン＃３を得た。

【０１１７】クローン３による転写活性化のＥＲＳＥ依
存性を試験するため、ＩＲＥ１プロモーターに連結した
ｌａｃＺ遺伝子の上流に完全なＥＲＳＥまたは変異ＥＲ
ＳＥを配置した種々のレポータープラスミドと共にクロ
ーン３−ＧＡＬ４ＡＤ融合タンパク質を発現させた。そ
の結果を図１２に示す。

【０１１８】図１２に示すように、完全なＥＲＳＥをレ
ポーター遺伝子の上流に用いた場合、エフェクターとし
てのクローン３−ＧＡＬ４ＡＤを発現するプラスミドに
よるβ−ガラクトシダーゼ活性レベル（ライン５）は、
ＧＡＬ４ＡＤ単独を発現する対照プラスミドによるβ−
ガラクトシダーゼ活性レベル（ライン１）と比較して、
顕著に増大した。

【０１１９】また、クローン３−ＧＡＬ４ＡＤによる増
大は、図１２のライン６〜８に示すように、ＣＣＡＡＴ
またはＣＣＡＣＧのいずれかまたは両方を欠損する変異
ＥＲＳＥを用いることにより完全に破壊された。この結
果は、図８および９に示すように、ＨｅＬａ細胞におい
て観察される転写活性化に完全なＣＣＡＡＴおよびＣＣ
ＡＣＧ部分を要求することに関連する。

【０１２０】酵母細胞におけるクローン３由来のタンパ
ク質の異所性の発現が、クローン３−ＧＡＬ４ＡＤ融合
タンパク質の小胞体内腔への局在により、小胞体ストレ
スを引き起こし、結果として、間接的に酵母ＵＰＲ経路
を介してレポータ遺伝子の転写を増大させた可能性は下
記の２つの点でありそうにない。１番目に、小胞体スト
レスのセンサー分子であるＩｒｅ１ｐを欠いた宿主とし
て、酵母株を使用した；２番目に、ＥＲＳＥはＵＰＲ特
異的シス活性化エレメントとして、酵母では機能的しな
い。

【０１２１】慣用の方法により塩基配列解析を行なった
結果、クローン３は、公知の転写因子、ＤＮＡ結合ドメ
インとしてｂＺＩＰモチーフを含むＡＴＦ／ＣＲＥＢフ
ァミリーのメンバーであるＡＴＦ６〔Hai, T.W. et a
l., Genes Dev. 3, 2083-2090,(1989) 〕をコードする
ことが明らかとなった。

【０１２２】興味深いことに、図１３に示すように、Ａ
ＴＦ６の塩基性領域は酵母Ｈａｃ１ｐの塩基性領域との
顕著な類似性を呈する。ＡＴＦ６は、その機能は明らか
ではないが、ｃＡＭＰ応答エレメントと弱く結合する部
分的なｃＤＮＡとして最初にクローン化され、また、血
清応答因子に結合するタンパク質として、最近再単離さ
れたタンパク質である。

【０１２３】実施例３ ＡＴＦ６およびＣＲＥＢ−ＲＰ
をコードする全長ｃＤＮＡの単離 クローン＃３において欠損していると思われるＡＴＦ６
のｍＲＮＡの５’領域の部分を、ＨｅＬａ細胞ＲＮＡを
用い、５’ＲＡＣＥにより単離した。なお、５’ＲＡＣ
Ｅ法には、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ製）を用いた。このよ
うにして得られた完全なＡＴＦ６ ｃＤＮＡは２５０９
ｂｐ長であり、６７０アミノ酸のタンパク質がコードさ
れていた（ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースのアクセッシ
ョン番号は、ＡＢ０１５８５６である）。予想されたア
ミノ酸配列は、ズーら（Zhu et al.) により報告された
配列〔Zhu, C. et al., Mol. Cell. Biol. 17, 4957-49
66,(1997) 〕とは、対立多型を反映することが推定され
る４残基が異なっていた。

【０１２４】分子構造が似ており、アミノ酸配列に相同
性を有するＣＲＥＢ−ＲＰの全長ｃＤＮＡを、公表され
た配列〔Min, J. et al., Genomics, 30, 149-156, (19
95);Khanna, A. et al., Biochem. J. 319, 81-89, (19
96)〕に基づきＨｅＬａ細胞ＲＮＡからＰＣＲによりク
ローン化した。

【０１２５】実施例４ エフェクタープラスミドの構築 ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン社
製）のＣＭＶプロモーターの直ぐ下流のＨｉｎｄＩＩＩ
−ＸｈｏＩまたはＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位それぞれ
への全長ｃＤＮＡの挿入し、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢ−
ＲＰを発現させるためのエフェクタープラスミドを構築
した。

【０１２６】実施例５ 転写活性のＥＲＳＥ依存性 （１）ＡＴＦ６の転写活性のＥＲＳＥ依存性の試験 ＡＴＦ６が哺乳類細胞におけるＧＲＰ遺伝子の転写制御
に関与するかどうかを試験するため、全長のＡＴＦ６ｃ
ＤＮＡを保持するエフェクタープラスミドおよび本来の
ＧＲＰプロモーターあるいは変異ＧＲＰプロモーターの
下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポータ
ープラスミドをＨｅＬａ細胞にコトランスフェクトし、
ルシフェラーゼ活性により、ＧＲＰプロモーター活性を
調べた。結果を図１４に示す。

【０１２７】図１４のライン１および２の白棒で示すよ
うに、ＴＭの非存在下には、ＡＴＦ６発現プラスミドは
完全なＥＲＳＥを有するＧＲＰ７８プロモーターからの
ルシフェラーゼ発現を、前記のベクター対照レベルの５
倍に増大させたが、３つのＥＲＳＥ配列全てを欠損する
変異ＧＲＰ７８プロモーターからの発現には影響しなか
った。

【０１２８】また、ＴＭの存在下に、図１４のライン１
および２の黒棒に示すＡＴＦ６エフェクタープラスミド
は完全なＥＲＳＥを有するＧＲＰ７８プロモーターから
のβ−ガラクトシダーゼ発現レベルの増加をさらに増大
したが、ライン３および４の黒棒に示す変異ＧＲＰ７８
プロモーターからのルシフェラーゼ発現レベルは増大し
なかった。

【０１２９】類似の結果が他のＧＲＰプロモーター：Ｇ
ＲＰ９４、カルレティキュリン、ＥＲｐ７２およびＧＲ
Ｐ５８においても示された。ライン５〜１６に示す結果
は、小胞体ストレスの存在下または非存在下にかかわら
ず、ＡＴＦ６の強化された発現がＥＲＳＥを通して特異
的にＧＲＰ遺伝子の転写を活性化することができること
をはっきりと示唆した。

【０１３０】（２）ＣＲＥＢ−ＲＰの転写活性のＥＲＳ
Ｅ依存性の試験 図１５に示すように、ＣＲＥＢ−ＲＰ〔Min, J. et a
l., Genomics, 30, 149-156, (1995) 〕はＡＴＦの全体
の構造と予想されるアミノ酸配列のとりわけ塩基性領域
との両方への顕著な類似性を呈し、２３残基中２１残基
が同一であり、２つは塩基性を呈する類似した残基であ
る。また、図１３に示すように、ヒトＡＴＦ／ＣＲＥＢ
ファミリーの公知のメンバーにわたって最も高い類似性
を有する。

【０１３１】そこで、ＣＲＥＢ−ＲＰの過剰発現がＧＲ
Ｐプロモーターの活性に影響しないかどうか試験した。
興味深いことに、図１６のライン１および２の白棒に示
すように、ＣＲＥＢ−ＲＰ発現プラスミドのコトランス
フェクションはＴＭの非存在下における完全なＧＲＰ７
８プロモーターからのレポーター発現にほとんど影響し
ないが、ＴＭの存在下における発現を顕著に抑制した。

【０１３２】対照的に、ライン３および４に示すよう
に、ＣＲＥＢ−ＲＰの過剰発現は、ＴＭの存在下または
非存在下の変異ＧＲＰ７８プロモーターからの発現に影
響しなかった。類似の結果がＧＲＰ９４またはカルレテ
ィキュリンプロモーターにより得られたため、ＣＲＥＢ
−ＲＰの過剰発現は、内在性トランスアクティベーター
により仲介されるＧＲＰ遺伝子の小胞体ストレス誘導転
写を妨げることが示唆された。

【０１３３】実施例５の（１）および（２）の結果よ
り、近縁の転写因子ＡＴＦ６とＣＲＥＢ−ＲＰとが、標
的遺伝子の誘導に対して明らかに逆の影響を及ぼすこと
を示すと同時に、ＡＴＦ６の過剰発現が、ＨｅＬａ細胞
の小胞体ストレスを生成することにより、単に間接的に
ＧＲＰ転写を活性化しただけであるという可能性に対す
る反論となる。

【０１３４】実施例６ ＡＴＦ６の小胞体ストレスによ
る制御 ＡＴＦ６の発現がｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベ
ルのいずれかで小胞体ストレスにより制御されるかどう
かを試験した。

【０１３５】（１）ノーザンブロットハイブリダイゼー
ション ノーザンブロットをモレキュラークローニング：ア ラ
ボラトリー マニュアル第２版〔Sambrook, J. et al.,
(1989)〕記載の標準法にしたがって行なった。オリゴ
（ｄＴ）磁気粒子（ダイナビーズ社製）を用いてＨｅＬ
ａ細胞から調製された１０μｇのポリＡ⁺ ＲＮＡを２．
２Ｍホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル電気泳
動に供し、ナイロンメンブランに転写し、ＡＴＦ６また
はＧＡＰＤＨのいずれかに特異的な放射標識ｃＤＮＡと
ハイブリダイズした。

【０１３６】図１７に示すように、ノーザンブットハイ
ブリダイゼーション解析により、ズーらの報告〔Zhu,
C. et al., Mol. Cell Biol., 17, 4957-4966, (199
7)〕の報告と同様、未処理のＨｅＬａ細胞において２．
５ｋｂのＡＴＦ６ｍＲＮＡの単一バンドの存在が明らか
になった。さらに、最近同定された小胞体ストレスによ
り特異的に誘導される酵母ＨＡＣ１ｍＲＮＡのスプライ
シングシステム〔Cox, J.S. et al., Cell, 87, 391-40
4, (1996); Kawahara, T. et al., Mol. Biol. Cell,
8, 1845-1862, (1997)〕とは異なり、ＡＴＦ６ｍＲＮＡ
のレベルまたはサイズのいずれもがＴＭ処理により影響
を受けることはなかった。

【０１３７】（２）抗血清調製およびイムノブロッティ
ング ＡＴＦ６に対する２つのタイプの抗血清、抗Ｂ０３Ｎお
よび抗ＡＴＦ６（Ｎ２１−３４）を調製した。抗Ｂ０３
Ｎ抗血清は、大腸菌細胞で発現させ、精製したＡＴＦ６
のＮ末端部分（残基６−３０７）と大腸菌マルトース結
合タンパク質との融合タンパク質をウサギに免疫するこ
とにより得た。得られた抗Ｂ０３抗血清は、マルトース
結合タンパク質発現プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２（ニュー
イングランド バイオラボ社製）で形質転換した大腸菌
の可溶性タンパク質を固定化したＣＨ−セファロース４
Ｂ（アマシャム ファルマシア バイオテック社製）で
処理し、非吸着画分を得て生成ＡＴＦ６抗体とした。抗
ＡＴＦ６（Ｎ２１−３４）抗血清は、ＡＴＦ６のＮ末端
１４アミノ酸（残基２１−３４）のスカシガイのヘモシ
アニン共役合成ペプチドを免疫して得た。抗ＧＲＰ７８
および抗ＨＳＰ７０抗血清をＳｔｒｅｓｓｇｅｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐから得た。

【０１３８】ＡＴＦ６のインビトロ翻訳をＡＴＦ６ ｃ
ＤＮＡおよびＴＮＴ Ｔ７クイックカップルドトランス
クリプション／トランスレーションシステム（プロメガ
社製）を用いて行なった。

【０１３９】１×１０⁶ ＨｅＬａ細胞を６０μｌの１×
試料緩衝液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
６．８），２％ ＳＤＳ，３５０ｍＭ ジチオスレイト
ールおよび０．０１％ブロモフェノールブルー）で溶解
させることにより全細胞抽出物を調製した。標準プロト
コール（モレキュラークローニング ア ラボラトリー
マニュアル第２版）にしたがって、溶解物を煮沸し、一
部（２μｌ）を１０％ゲルを用いたＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供し、Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬフィ
ルター（アマシャム ファルマシア バイオテック社
製）に転写し、各種抗血清と反応させた。プレ染色ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ標品（バイオラッド社製）をサイズマーカ
ーとして用いた。ＥＣＬウエスタンブロッティング検出
キット（アマシャム ファルマシア バイオテック社
製）を用いてそれぞれの抗原を検出した。

【０１４０】ＡＴＦ６はＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞
の両方で構成的に発現することが以前に示されている
〔Zhu, C. et al., Mol. Cell Biol. 17, 4957-4966 (1
997)〕が、イムノブロッティングにより解析を行なっ
た。その結果を図１８に示す。

【０１４１】網状赤血球溶解物を用いてインビトロで翻
訳した場合、図１８のレーン２に示すように、ＡＴＦ６
は、抗Ｂ０３Ｎ抗血清により、分子量９０ｋＤａの単一
バンドとして検出された。また、抗ペプチド〔抗ＡＴＦ
６（Ｎ２１−３４）〕抗血清によっても、分子量９０ｋ
Ｄａの単一バンドとして検出された。これらの分子量
は、Zhu らの報告と同様、計算された分子量７４．５７
ｋＤａよりも大きかった。

【０１４２】対照的に、レーン３に示すように、抗Ｂ０
３Ｎ抗血清は未処理のＨｅＬａ細胞の抽出物中の数種類
のタンパク質と反応した。それらのなかで、白矢印によ
り示されるバンドの移動度はインビトロで翻訳したＡＴ
Ｆ６のバンドに一致した。ＨｅＬａ細胞をＴＭで４時間
処理した場合、レーン４に示すように、９０ｋＤａバン
ドは減少し、代わりに黒矢印で示される５０ｋＤａの新
たなバンドが現れた。他の交差反応したバンドに影響は
見られなかった。

【０１４３】重要なことに、この５０ｋＤａタンパク質
は抗ペプチド（抗ＡＴＦ６（Ｎ２１〜３４））抗血清に
よっても検出された（レーン６）。さらに、９０ｋＤａ
および５０ｋＤａタンパク質の両方がＡＴＦ６過剰発現
細胞（レーン８）から調製された抽出物に構成的に存在
するが、対照細胞（レーン７）からのものには存在せ
ず、他のタンパク質バンドがこの条件下には過剰生産さ
れず、これらの２種のタンパク質は実際にＡＴＦ６ｃＤ
ＮＡによりコードされることを示唆する。９０ｋＤａお
よび５０ｋＤａのタンパク質をそれぞれｐ９０ＡＴＦ６
およびｐ５０ＡＴＦ６とした。

【０１４４】実施例７ ｐ５０ＡＴＦ６と細胞内ＵＰＲ
活性との関連 ｐ５０ＡＴＦ６の出現が細胞内ＵＰＲ活性に関連するか
どうか試験するため、ストレスによるｐ５０ＡＴＦ６の
出現とＧＲＰ７８の誘導を経時的にイムノブロッティン
グで調べた。その結果を図１９に示す。

【０１４５】図１９に示すように、ＧＲＰ７８の増加
は、ＴＭ処理後、８時間で検出されたが、ｐ５０ＡＴＦ
６は２時間以内に検出可能になり、４〜８時間でピーク
に達し、ついで減少した。同様に、Ａ２３１８７または
タプシガーギン（図中、Ｔｇで示す）で処理した細胞に
おいても、ｐ５０ＡＴＦ６は、ＧＲＰ７８誘導に先立っ
て出現した。

【０１４６】しかしながら、ヒートショックをうけた細
胞ではＨＳＰ７０の明らかな誘導が認められるにもかか
わらず、ｐ５０ＡＴＦ６はほとんど検出されなかった。

【０１４７】これらの結果は、ｐ９０ＡＴＦ６からｐ５
０ＡＴＦ６への変換が、哺乳類ＵＰＲにおける重要な制
御過程であることを強く示唆している。

【０１４８】実施例８ 小胞体ストレスによるｐ９０Ａ
ＴＦ６からｐ５０ＡＴＦ６への変換 ｐ９０ＡＴＦ６が小胞体ストレスにより直接ｐ５０ＡＴ
Ｆ６に変換されるのかどうかを明らかにするため、ＴＭ
処理したHeLa細胞中のｐ９０ＡＴＦ６とｐ５０ＡＴＦ
６、さらに標的タンパク質であるＧＲＰ７８の量的変化
を精製ＡＴＦ６抗体を用いたイムノブロッティングによ
り経時的に調べた。

【０１４９】図２０に示すように、ｐ５０ＡＴＦ６はＴ
Ｍ処理後２時間で出現し、４時間まで検出された（レー
ン３〜５）。一方、ｐ９０ＡＴＦ６はＴＭ処理後、経時
的に減少し、ｐ５０ＡＴＦ６の増加ときれいな逆相関を
示した（レーン１〜６）。また、ＧＲＰ７８の発現の増
大は８時間後以降に認められた。これらの結果は、ＡＴ
Ｆ６は前駆体タンパク質（ｐ９０ＡＴＦ６）として合成
され、小胞体ストレスにより特異的に成熟型タンパク質
（ｐ５０ＡＴＦ６）に変換されることを示唆している。

【０１５０】図２０に示した経時変化の実験において、
ＴＭ処理したＨｅＬａ細胞中に、ｐ５０ＡＴＦ６のほか
にｐ９０ＡＴＦ６よりも若干移動度の速い新たなバンド
が観察されたため、ｐ９０ＡＴＦ６は糖鎖付加の修飾を
受けており、したがって小胞体に会合している可能性が
示唆された。実際、ストレスに曝されていないＨｅＬａ
細胞について、抗Ｂ０３Ｎ抗体を用いて間接蛍光抗体法
で分析すると、核の周囲に細かい網状の染色像が観察さ
れた。この染色パターンは、ＧＲＰ７８やＧＲＰ９４の
主要小胞体シャペロンを認識する抗ＫＤＥＬ抗体（１０
Ｃ３；ストレスジェン社製）を用いて観察されるパター
ンと同様であった。さらに、コンピューターによるハイ
ドロパシー解析を行なうと、図２１に示すように、膜を
１回貫通するのに十分な長さである２１アミノ酸からな
る疎水性領域が存在することがわかった。これらの結果
は、ｐ９０ＡＴＦ6 が小胞体の膜タンパク質であるとい
う考えを強く支持するものである。

【０１５１】次に、無処理または４時間ＴＭ処理したＨ
ｅＬａ細胞のホモジネートを遠心分離で分画し、ｐ９０
ＡＴＦ６とｐ５０ＡＴＦ６の局在を調べた（図２２）。
はじめの低速遠心分離では、大部分のｐ９０ＡＴＦ６は
可溶性画分に回収された（レーン５）が、ｐ５０ＡＴＦ
６は核タンパク質ラミンＢと同様に核画分にのみ分画さ
れた（レーン４）。次の高速遠心分離では、すべてのｐ
９０ＡＴＦ６は膜画分に回収された（レーン９）。ｐ９
０ＡＴＦ６の分配パターンは小胞体の膜貫通型シャペロ
ンであるカルネキシンとほぼ一致したが、ラミンＢや細
胞質タンパク質のＨＳＰ７０とは全く異なっていた。な
お、ラミンＢとＨＳＰ７０は、それぞれ抗ラミンＢ抗体
（サンタクルーズ社製）および抗ＨＳＰ７０抗体（Ｃ９
２Ｆ３Ａ−５；ストレスジェン社製）を用いて検出し
た。

【０１５２】実施例９ ｐ９０ＡＴＦ６のトポロジー ｐ９０ＡＴＦ６が膜表在性か膜内在性かを検討した。低
速遠心分離で得られた可溶性画分について種々の処理を
行なったのち、高速遠心分離で分画した。精製ＡＴＦ６
抗体を用いてイムノブロッティングを行なった結果、図
２３に示すように、表在性膜タンパク質が抽出される
０．５Ｍ ＮａＣｌあるいは０．１Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ
₃ （ｐＨ１１）処理では、ｐ９０ＡＴＦ６は内在性膜タ
ンパク質カルネキシンと同様に膜から遊離されなかっ
た。対照的に、ｐ９０ＡＴＦ６もカルネキシンも１％Ｓ
ＤＳや１％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）とい
った界面活性剤により可溶性画分に遊離した。１％Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００はｐ９０ＡＴＦ６を凝集させるの
かもしれない。

【０１５３】次いで、トリプシン処理により膜に対する
ｐ９０ＡＴＦ６の方向性を調べた（図２４）。Ｉ型膜タ
ンパク質であるカルネキシンを対照に用いて、小胞体内
腔側に存在するカルネキシンＮ末端領域（カルネキシン
−Ｎ）、あるいは細胞質側に存在するカルネキシンＣ末
端領域（カルネキシン−Ｃ）を認識する抗体（ストレス
ジェン社製）を用いて、トリプシン消化をモニターし
た。全長カルネキシン量を減少させるトリプシン濃度
で、抗カルネキシンＣ抗体では消化されないカルネキシ
ン断片の出現が観察されない（レーン１１、１２）が、
抗カルネキシンＮ抗体ではカルネキシンＮ末端側領域に
相当する大きさの断片の出現が観察された（レーン７、
８）。この結果は、内腔側の領域が期待どおりトリプシ
ン消化に抵抗性であったことを示している。

【０１５４】このような実験条件で、ｐ９０ＡＴＦ６
は、行なった範囲内では最も低濃度のトリプシンで消失
し、ＡＴＦ６のＮ末端側領域を認識する抗ＡＴＦ６抗体
により５０ｋＤａに相当する断片を検出することはでき
なかった（レーン２）。これは、ｐ９０ＡＴＦ６がＮ末
端側領域が細胞質側を向いたII型膜タンパク質であるこ
とを強く示唆するものである。

【０１５５】実施例１０ ｐ５０ＡＴＦ６の細胞内局在 ｐ９０ＡＴＦ６からｐ５０ＡＴＦ６に変換することによ
り細胞内局在が変化するかどうかを、ＡＴＦ６発現プラ
スミドで形質転換したＨｅＬａ細胞を用いて、間接蛍光
抗体法で調べた。全長のＡＴＦ６を発現するプラスミド
ｐＣＧＮ−ＡＴＦ６［Zhu et al. (1997) Mol. Cell. B
iol.17, 4957-4966 ］は、コロンビア大学Prywes博士よ
り入手し、以下、ｐＣＧＮ−ＡＴＦ６（６７０）と称す
る。このプラスミドは、動物細胞発現ベクターｐＣＧＮ
のＸｂａＩ部位にＡＴＦ６ｃＤＮＡを挿入したもので、
インフルエンザウィルスのヘムアグルチニン（ＨＡ）エ
ピトープをＮ末端に結合したＡＴＦ６が、サイトメガロ
ウィルスプロモーターの制御下に発現する。ＡＴＦ６の
Ｎ末端側断片を発現するｐＣＧＮ−ＡＴＦ６（４０
２）、ｐＣＧＮ−ＡＴＦ６（３７３）、ｐＣＧＮ−ＡＴ
Ｆ６（３６６）およびｐＣＧＮ−ＡＴＦ６（３３０）
は、それぞれアミノ酸１−４０２、１−３７３、１−３
６６および１−３３０をコードする領域をＰＣＲにより
調製し、ストップコドン（ＴＡＧ）とともにｐＣＧＮの
ＸｂａＩ部位に挿入して作製した。

【０１５６】これらのプラスミドから発現するＡＴＦ６
ならびに各変異体の構造を模式的に図２５に示す。ＡＴ
Ｆ（４０２）は、Ｃ末端内腔ドメインの大部分を欠く
が、膜貫通ドメイン（Ｖ³³⁴ −Ｌ³⁹⁸ ）は残しており、
一方、３つの変異体ＡＴＦ６（３７３）、ＡＴＦ６（３
６６）およびＡＴＦ６（３３０）は内腔ドメインおよび
膜貫通ドメインの両方を欠く。ＡＴＦ６（３７３）は、
塩基性領域（Ｒ³⁰⁸ −Ｒ ³³⁰ ）とロイシンジッパー（Ｌ
³³⁴ −Ｌ³⁶⁹ ）を全て含む。ＡＴＦ６（３６６）は、塩
基性領域全てと大部分のロイシンジッパー領域を含む。
ＡＴＦ（３３０）は、塩基性領域を含むが、ロイシンジ
ッパー領域を完全に欠く。なお、いずれのタンパク質も
Ｎ末端部にＨＡエピトープを結合している。

【０１５７】次に、これらのＡＴＦ６ならびに各変異体
の発現プラスミドでＨｅＬａ細胞を一過的に形質転換
し、抗ＨＡエピトープ抗体（Ｙ１１；サンタクルーズ社
製）を用いて間接蛍光抗体法を行なったところ、膜貫通
ドメインを持つＡＴＦ６（６７０）とＡＴＦ６（４０
２）の発現は、小胞体に局在することが観察され、抗Ｋ
ＤＥＬ抗体を用いて蛍光染色した場合の染色像と同様で
あった。

【０１５８】これに対し、内腔ドメインおよび膜貫通ド
メインの両方を欠いた変異体ＡＴＦ６であるＡＴＦ６
（３７３）、ＡＴＦ６（３６６）またはＡＴＦ６（３３
０）を発現する細胞では、抗ＨＡ抗体で核が明瞭に染ま
った。これらの結果から、ｐ９０ＡＴＦ６は、小胞体膜
に埋め込まれており、ｐ５０ＡＴＦ６は、膜貫通ドメイ
ンよりＮ末端側で切断され、核に局在することが強く示
唆された。

【０１５９】実施例１１ ｐ５０ＡＴＦ６産生の際の切
断部位の推定 小胞体ストレスに応答するｐ５０ＡＴＦ６産生に関する
切断部位を推定するために、実施例１０で作製した種々
のＣ末端欠失変異体でトランスフェクトしたＨｅＬａ細
胞の免疫ブロッティング解析を行なった。結果を図２６
に示す。ｐＣＧＮ−ＡＴＦ６（６７０）でトランスフェ
クトした細胞において、約５０ｋＤａの位置に検出され
た２本のタンパク質バンド（レーン２）はｐ５０ＡＴＦ
６のちょうどよい分子量マーカーとなった。これらのタ
ンパク質は、トランスフェクト細胞においてＨＡ標識Ａ
ＴＦ６（６７０）の過剰発現により構成的に活性化され
たタンパク質分解により生産されたｐ５０ＡＴＦ６であ
ると考えられる。移動度の大きいバンドは、ＨＡ標識を
失ったことに起因すると考えられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上の種々のＣ末端欠失変異体の移動度の比較からｐ５０
ＡＴＦ６の大きさがＡＴＦ６（３７３）の大きさに近い
ことがわかり、細胞が小胞体ストレスを受けたとき、ｐ
９０ＡＴＦ６は、ｂＺＩＰと膜貫通ドメインとの間で切
断され、ｐ５０ＡＴＦ６を生成することが示唆された。

【０１６０】実施例１２ ＡＴＦ６の転写活性化ドメイ
ン 酵母転写活性化因子Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン
（アミノ酸１−１４７；ＧＡＬ４ＤＢと称す）をサイト
メガロウィルスプロモーターの制御下に発現するプラス
ミドｐＢＩＮＤ（プロメガ社製）のＸｂａＩ部位に、Ｐ
ＣＲにより増幅したＡＴＦ６の様々な領域を挿入し、Ａ
ＴＦ６の断片とＧＡＬ４ＤＢとの融合タンパク質を発現
するプラスミドを作製した。これらの発現プラスミドを
アデノウイルス主要後期プロモーターの上流に５個のＧ
ａｌ４ｐ結合部位を含むレポータープラスミドｐＧ５ｌ
ｕｃ（プロメガ社製）とともにＨｅＬａ細胞に一過的に
導入して、ルシフェラーゼ遺伝子の転写活性化能を調べ
た。図２７に示すように、転写活性化能はＮ末端１５０
アミノ酸の領域にマップされ（ライン６、９−１２）、
特にＮ末端４３アミノ酸の寄与が大きい（ライン６−
８）ことがわかった。転写活性化ドメインがＮ末端に存
在することは、ｐ５０ＡＴＦ６が核で転写因子として機
能することを保証するものである。

【０１６１】実施例１３ ＡＴＦ６のＣ末端欠失体の転
写活性 ヒトＧＲＰ７８プロモーター（−１３２〜＋７、番号は
転写開始点を＋１とする）下流にホタルルシフェラーゼ
遺伝子を連結したレポータープラスミドｐＧＬ３−Ｇ７
８（−１３２）〔実施例１（図６ライン２）参照〕と実
施例１０のＡＴＦ６Ｃ末端欠失変異体発現プラスミドで
コトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を用いて、ＥＲＳ
Ｅを介した転写活性化に対する過剰発現した各ＡＴＦ６
のＣ末端欠失変異体の影響を調べた。

【０１６２】その結果、ｐＣＧＮ−ＡＴＦ６（６７０）
を用いて全長ＡＴＦ６、すなわちＡＴＦ６（６７０）を
一過的に過剰発現させると、実施例５での結果（図１
４）と同様に、ＥＲＳＥを有するＧＲＰ７８プロモータ
ーからのルシフェラーゼ遺伝子の転写を小胞体ストレス
のない状態で構成的に活性化することがわかった（図２
６ライン２）。実施例５の結果（図１４）に比べてルシ
フェラーゼの相対活性が高いのは、ｐｃＤＮＡ−ＡＴＦ
６を用いたトランスフェクト細胞よりも、ｐＣＧＮ−Ａ
ＴＦ６を用いたトランスフェクト細胞のほうがより多く
のＡＴＦ６を発現することによると考えられた。さら
に、ルシフェラーゼ遺伝子の構成的な転写活性化は、前
記ｐＣＧＮ−ＡＴＦ６（６７０）でトランスフェクトさ
れた細胞中でｐ５０ＡＴＦ６様タンパク質が構成的に生
産された（図２８、レーン２を参照のこと）ことでよく
説明できる。同様に、レポータールシフェラーゼ活性
は、小胞体局在型のＡＴＦ６（４０２）の過剰発現〔図
２８のライン３の白棒〕によっても構成的に促進され
た。

【０１６３】図２８のライン４および５の白棒とライン
２および３の白棒との結果から、核局在型ＡＴＦ６変異
体であるＡＴＦ６（３７３）およびＡＴＦ６（３６６）
の過剰発現により、小胞体局在型ＡＴＦ6 であるＡＴＦ
（６７０）またはＡＴＦ（４０２）の場合に比べ５倍以
上高いルシフェラーゼ活性が得られることが示された。
これらの結果は、核タンパク質ｐ５０ＡＴＦ６がＡＴＦ
６の活性化型を示すことと一致する。

【０１６４】一方、他の核局在型ＡＴＦ６（３３０）
は、ほぼ同レベルの発現にもかかわらず（図２６）、Ａ
ＴＦ６（３７３）またはＡＴＦ（３６６）よりも顕著に
低い活性を示し、ＡＴＦ６の転写活性におけるロイシン
ジッパーの重要性が示された（図２８のライン６とライ
ン４および５とを比較のこと）。

【０１６５】実施例１４ ＡＴＦ６の転写活性化ドメイ
ン欠失変異体 Ｎ末端アミノ酸１〜１５０領域を欠失したＡＴＦ６ある
いは実施例１０で作製したＡＴＦ６変異体を発現するｐ
ＣＧＮ−ＡＴＦ６（１５１−６７０）、ｐＣＧＮ−ＡＴ
Ｆ６（１５１−４０２）、ｐＣＧＮ−ＡＴＦ６（１５１
−３７３）、ｐＣＧＮ−ＡＴＦ６（１５１−３６６）お
よびｐＣＧＮ−ＡＴＦ６（１５１−３３０）を、それぞ
れアミノ酸１５１−６７０、１５１−４０２、１５１−
３７３、１５１−３６６、１５１−３３０をコードする
領域をＰＣＲにより調製し、ストップコドンとともにｐ
ＣＧＮのＸｂａＩ部位に挿入し作製した（図２５参
照）。

【０１６６】これらのプラスミドから発現するＡＴＦ６
（１５１−６７０）、ＡＴＦ６（１５１−４０２）、Ａ
ＴＦ６（１５１−３７３）、ＡＴＦ６（１５１−３６
６）およびＡＴＦ６（１５１−３３０）は、それぞれＡ
ＴＦ６（６７０）、ＡＴＦ６（４０２）、ＡＴＦ６（３
７３）、ＡＴＦ６（３６６）およびＡＴＦ６（３３０）
からＮ末端の１５０アミノ酸（Ｍ¹ −Ｌ¹⁵⁰ ）を欠失し
たものである。

【０１６７】実施例１０と同様に、各ＡＴＦ６転写活性
化ドメイン欠失変異体発現プラスミドでＨｅＬａ細胞を
一過的に形質転換し、抗ＨＡエピトープ抗体（Ｙ１１；
サンタクルーズ社製）を用いた間接蛍光抗体法により、
発現したＡＴＦ６転写活性化ドメイン欠失変異体の細胞
内局在性を調べた。その結果、ＡＴＦ６（１５１−６７
０）とＡＴＦ６（１５１−４０２）は、それぞれ対応す
るＡＴＦ６（６７０）およびＡＴＦ６（４０２）と同様
に小胞体に局在していることがわかった。また、ＡＴＦ
６（１５１−３７３）、ＡＴＦ６（１５１−３６６）お
よびＡＴＦ６（１５１−３３０）については、ＡＴＦ６
（３７３）、ＡＴＦ６（３６６）およびＡＴＦ６（３３
０）と同様にいずれも核に局在した。

【０１６８】次に、実施例１３と同様に、各ＡＴＦ６転
写活性化ドメイン欠失変異体の過剰発現によるＥＲＳＥ
を介した転写活性化に対する影響を、レポータープラス
ミドｐＧＬ３−Ｇ７８（−１３２）とのコトランスフェ
クションにより調べた。

【０１６９】その結果、図２８のライン７から１１に示
されるように、いずれのＡＴＦ６転写活性化ドメイン欠
失変異体も、レポーター遺伝子の発現を対照のｐＣＧＮ
ベクターを用いた場合（ライン１）以下に強く抑制し
た。ＡＴＦ６（１５１−３７３）、ＡＴＦ６（１５１−
３６６）およびＡＴＦ６（１５１−３３０）は核内で内
在性ｐ５０ＡＴＦ６に対し、ドミナントネガティブに作
用することが示された。一方、ＡＴＦ６（１５１−６７
０）とＡＴＦ６（１５１−４０２）は、小胞体での過剰
発現により小胞体ストレスを誘導し、その結果生じる転
写活性化ドメインを欠失したｐ５０ＡＴＦ６が核に移行
して、内在性ｐ５０ＡＴＦ６に対しドミナントネガティ
ブに作用すると考えられた。

【０１７０】実施例１５ 小胞体ストレスによるｐ１１
０ＣＲＥＢ−ＲＰからｐ６０ＣＲＥＢ−ＲＰへの変換 全長型のＣＲＥＢ−ＲＰ（ｐ１１０ＣＲＥＢ−ＲＰ）が
小胞体ストレスによりｐ６０ＣＲＥＢ−ＲＰに変換され
るのかどうかを明らかにするため、ＴＭ処理したHeLa細
胞中のｐ１１０ＣＲＥＢ−ＲＰとｐ６０ＣＲＥＢ−ＲＰ
の量的変化を精製ＣＲＥＢ−ＲＰ抗体を用いたイムノブ
ロッティングにより経時的に調べた。ＣＲＥＢ−ＲＰ抗
体は、大腸菌で発現させたＣＲＥＢ−ＲＰのアミノ酸１
〜３０７領域とＧＳＴとの融合タンパク質をウサギに免
疫して作製し、ＧＳＴと細菌タンパク質で吸収、ＧＳＴ
−ＣＲＥＢ−ＲＰ融合タンパク質でアフィニティー精製
したものを用いた。

【０１７１】実施例８と同様にしてｐ９０ＡＴＦ６から
ｐ５０ＡＴＦ６への変換と標的タンパク質であるＧＲＰ
７８の量も同時に調べたところ、図２９に示すように、
ｐ６０ＣＲＥＢ−ＲＰはＴＭ処理後２時間で出現し、ｐ
５０ＡＴＦ６の場合と異なり、その後、持続的に発現し
ていることがわかった。

【０１７２】実施例１６ 活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰ 実施例４で作製したＣＲＥＢ−ＲＰの発現プラスミドか
ら、ＰＣＲによりＣＲＥＢ−ＲＰのアミノ酸１〜３８９
領域をコードするＤＮＡ断片を調製し、ｐｃＤＮＡ３．
１（＋）ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。こ
のプラスミドから発現するＣＲＥＢ−ＲＰ（１−３８
９）は、ＣＲＥＢ−ＲＰのＮ末端から塩基性領域、ロイ
シンジッパー領域までを含んでおり、小胞体ストレスに
よりｐ１１０ＣＲＥＢ−ＲＰから変換されるｐ６０ＣＲ
ＥＢ−ＲＰに相当するものである。

【０１７３】ＣＲＥＢ−ＲＰ（１−３８９）発現プラス
ミドと、ＧＲＰ７８プロモーターあるいは変異ＧＲＰ７
８プロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した
レポータープラスミドをHeLa細胞に導入し、ＥＲＳＥを
介した転写活性化に対するＣＲＥＢ−ＲＰ（１−３８
９）過剰発現の影響を調べた。

【０１７４】図３０に示すように、ｐ６０ＣＲＥＢ−Ｒ
Ｐに相当すると考えられるＣＲＥＢ−ＲＰ（１−３８
９）の過剰発現は、ｐ５０ＡＴＦ６と同様に転写を構成
的に活性化した。この転写活性化は変異ＥＲＳＥを用い
た場合には観察されないことから、ＥＲＳＥ依存的であ
ることがわかる。

【０１７５】実施例１７ 抑制化型ＣＲＥＢ−ＲＰ 実施例４で作製したＣＲＥＢ−ＲＰの発現プラスミドか
ら、ＰＣＲによりＮ末端にＭｅｔを付加したＣＲＥＢ−
ＲＰのアミノ酸３０８〜３８６領域をコードするＤＮＡ
断片を調製し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位に挿入した。このプラスミドから発現す
るＣＲＥＢ−ＲＰ（３０８−３８６）は、ＣＲＥＢ−Ｒ
ＰのＮ末端領域に存在する転写活性化ドメインを含ま
ず、ほぼ塩基性領域とロイシンジッパー領域だけを含む
ものである。

【０１７６】実施例１６と同様に、ＥＲＳＥを介した転
写活性化に対するＣＲＥＢ−ＲＰ（３０８−３８６）過
剰発現の影響を調べたところ、図３１に示すように、Ｔ
Ｍ処理によるＥＲＳＥ依存的な転写誘導を強く抑制し
た。この結果は、ＣＲＥＢ−ＲＰ（３０８−３８６）が
内在性小胞体ストレス転写因子に対しドミナントネガテ
ィブに作用することを示している。

【０１７７】さらに、実施例１６と同様に、ＥＲＳＥを
介した転写活性化に対するＣＲＥＢ−ＲＰ（８１−３８
９）またはＣＲＥＢ−ＲＰ（１５１−３８９）の過剰発
現の影響を調べたところ、図３２に示すように、ＴＭ処
理によるＥＲＳＥ依存的な転写誘導を強く抑制した。こ
の結果は、ＣＲＥＢ−ＲＰ（８１−３８９）およびＣＲ
ＥＢ−ＲＰ（１５１−３８９）が内在性小胞体ストレス
転写因子に対しドミナントネガティブに作用することを
示している。

【０１７８】配列表フリーテキスト 配列番号：１において、ｎはＡまたはＣまたはＧまたは
Ｔである。また、配列番号：１に示される配列は、ＥＲ
ＳＥ１のコンセンサス配列である。

【０１７９】配列番号：２において、ｎはＡまたはＣま
たはＧまたはＴである。また、配列番号：２に示される
配列は、ＥＲＳＥ２のコンセンサス配列である。

【０１８０】配列番号：３において、ｎはＡまたはＣま
たはＧまたはＴである。また、配列番号：３に示される
配列は、ＥＲＳＥ３のコンセンサス配列である。

【０１８１】

【発明の効果】本発明の小胞体ストレス転写因子によ
り、小胞体シャペロン遺伝子の発現の増大および減少の
制御を行なうことができる。本発明の小胞体シャペロン
遺伝子の発現制御方法によれば、小胞体シャペロン遺伝
子の発現の増大および減少の制御を行なうことができ
る。さらに本発明の小胞体シャペロン遺伝子の発現制御
方法により、癌、動脈硬化症、嚢胞性繊維症、虚血性疾
患、創傷、潰瘍の治療あるいは予防が可能になり、さら
には該発現制御方法を外来の有用タンパク質の発現に応
用することにより、外来の有用タンパク質を正しい立体
構造を保ち、かつ高レベルで発現させうるという優れた
効果を奏する。

【０１８２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> HSP RESEARCH INSTITUTE <120> Endoplasmic reticulum stress transcription factor <130> HSP-11-007 <150> JP 10-324227 <151> 1998-11-13 <150> JP 11-163112 <151> 1999-6-9 <160> 36

【０１８３】 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 <223> "n" is A or C or G or T. <220> <223> The sequence as shown in SEQ ID NO: 1 is the ERSE1 consensus seque nce. <400> 1 ccaatnnnnn nnnnccacg 19

【０１８４】 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 <223> "n" is A or C or G or T. <220> <223> The sequence as shown in SEQ ID NO: 2 is the ERSE2 consensus seque nce. <400> 2 ccaatnnnnn nnnnccaac 19

【０１８５】 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <222> 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 <223> "n" is A or C or G or T. <220> <223> The sequence as shown in SEQ ID NO: 3 is the ERSE3 consensus seque nce. <400> 3 cgaatnnnnn nnnnccagc 19

【０１８６】 <210> 4 <211> 122 <212> DNA <213> human <400> 4 ggagggggcc gcttcgaatc ggcggcggcc agcttggtgg cctgggccaa tgaacggcct 60 ccaacgagca gggccttcac caatcggcgg cctccacgac ggggctgggg gagggtatat 120 aa 122

【０１８７】 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 5 ccaatcggcg gcctccacg 19

【０１８８】 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> murine <400> 6 ccaatcggag gcctccacg 19

【０１８９】 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> rat <400> 7 ccaatcggag gcctccacg 19

【０１９０】 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 8 ccaatcgcgc cgcaccacg 19

【０１９１】 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> chicken <400> 9 ccaatgggag cgcaccacg 19

【０１９２】 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 10 ccaatcggaa ggagccacg 19

【０１９３】 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> chicken <400> 11 ccaatcgacg ccggccacg 19

【０１９４】 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 12 ccaatgatgg tcgaccacg 19

【０１９５】 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> murine <400> 13 ccaatgaggg tcgaccacg 19

【０１９６】 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 14 ccaatgaacg gcctccaac 19

【０１９７】 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> murine <400> 15 ccaatcagcg gcctccaac 19

【０１９８】 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> rat <400> 16 ccaaccagcg gcctccaac 19

【０１９９】 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 17 cgaatcggcg gcggccagc 19

【０２００】 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> murine <400> 18 cgaatcggca gcagccagc 19

【０２０１】 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> rat <400> 19 cgaatcggca gcggccagc 19

【０２０２】 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 20 ccaatcggag ctgtccagg 19

【０２０３】 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> chicken <400> 21 ccaatcgtgg ctttccatg 19

【０２０４】 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 22 ccaatcaaat ggctccgcg 19

【０２０５】 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 23 ccaatgacaa agtggcagg 19

【０２０６】 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 24 ccaatagaaa tcggccatc 19

【０２０７】 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> murine <400> 25 ccaatagaaa tcagccatc 19

【０２０８】 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> murine <400> 26 ccaatcagaa gggggcacc 19

【０２０９】 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> murine <400> 27 ccaatcacgg gctgccact 19

【０２１０】 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> rat <400> 28 ccagtcagaa tgcaacacg 19

【０２１１】 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> rat <400> 29 ccaactggca cgccccccg 19

【０２１２】 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> human <400> 30 ccaatcagcg gctgccaca 19

【０２１３】 <210> 31 <211> 2509 <212> DNA <213> human <400> 31 tttttgtccg cctgccgccg ccgtcccaga tattaatcac ggagttccag ggagaaggaa 60 cttgtgaaat gggggagccg gctggggttg ccggcaccat ggagtcacct tttagcccgg 120 gactctttca caggctggat gaagattggg attctgctct ctttgctgaa cttggttatt 180 tcacagacac tgatgagctg caattggaag cagcaaatga gacgtatgaa aacaattttg 240 ataatcttga ttttgatttg gatttgatgc cttgggagtc agacatttgg gacatcaaca 300 accaaatctg tacagttaaa gatattaagg cagaacccca gccactttct ccagcctcct 360 caagttattc agtctcatct cctcggtcag tggactctta ttcttcaact cagcatgttc 420 ctgaggagtt ggatttgtct tctagttctc agatgtctcc cctttcctta tatggtgaaa 480 actctaatag tctctcttca ccggagccac tgaaggaaga taagcctgtc actggttcta 540 ggaacaagac tgaaaatgga ctgactccaa agaaaaaaat tcaggtgaat tcaaaacctt 600 caattcagcc caagccttta ttgcttccag cagcacccaa gactcaaaca aactccagtg 660 ttccagcaaa aaccatcatt attcagacag taccaacgct tatgccattg gcaaagcagc 720 aaccaattat cagtttacaa cctgcaccca ctaaaggcca gacggttttg ctgtctcagc 780 ctactgtggt acaacttcaa gcacctggag ttctgccctc tgctcagcca gtccttgctg 840 ttgctggggg agtcacacag ctccctaatc acgtggtgaa tgtggtacca gccccttcag 900 cgaatagccc agtgaatgga aaactttccg tgactaaacc tgtcctacaa agtaccatga 960 gaaatgtcgg ttcagatatt gctgtgctaa ggagacagca acgtatgata aaaaatcgag 1020 aatccgcttg tcagtctcgc aagaagaaga aagaatatat gctagggtta gaggcgagat 1080 taaaggctgc cctctcagaa aacgagcaac tgaagaaaga aaatggaaca ctgaagcggc 1140 agctggatga agttgtgtca gagaaccaga ggcttaaagt ccctagtcca aagcgaagag 1200 ttgtctgtgt gatgatagta ttggcattta taatactgaa ctatggacct atgagcatgt 1260 tggaacagga ttccaggaga atgaacccta gtgtgagccc tgcaaatcaa aggaggcacc 1320 ttctaggatt ttctgctaaa gaggcacagg acacatcaga tggtattatc cagaaaaaca 1380 gctacagata tgatcattct gtttcaaatg acaaagccct gatggtgcta actgaagaac 1440 cattgcttta cattcctcca cctccttgtc agcccctaat taacacaaca gagtctctca 1500 ggttaaatca tgaacttcga ggatgggttc atagacatga agtagaaagg accaagtcaa 1560 gaagaatgac aaataatcaa cagaaaaccc gtattcttca gggtgctctg gaacagggct 1620 caaattctca gctgatggct gttcaataca cagaaaccac tagtagtatc agcaggaact 1680 cagggagtga gctacaagtg tattatgctt cacccagaag ttatcaagac ttttttgaag 1740 ccatccgcag aaggggagac acattttatg ttgtgtcatt tcgaagggat cacctgctgt 1800 taccagctac cacccataac aagaccacaa gaccaaaaat gtcaattgtg ttaccagcaa 1860 taaacataaa tgagaatgtg atcaatgggc aggactacga agtgatgatg cagattgact 1920 gtcaggtgat ggacaccagg atcctccata tcaaaagttc gtcagttcct ccttacctcc 1980 gagatcagca gaggaatcaa accaacacct tctttggctc ccctcccgca gccacagagg 2040 caacccacgt tgtcagcacc atccctgagt cattacaata gcaccctgca gctatgctgg 2100 aaaactgagc gtgggaccct gccagactga agagcaggtg agcaaaatgc tgctttctgc 2160 cttggtggca ggcagagaac tgtctcgtac tagaattcaa ggaggaaaga agaagaaata 2220 aaagaagctg ctccattttt catcatctac ccatctattt ggaaagcact ggaattcaga 2280 tgcaagagaa caatgtttct tcagtggcaa atgtagccct gcatcctcca gtgttacctg 2340 gtgtagattt ttttttctgt acctttctaa acctctcttc cctctgtgat ggttttgtgt 2400 ttaaacaatc atcttctttt aaataatatc cacctctcct ttttgccatt tcacttattg 2460 attcataaag tgaattttat ttaaagctat gccacacatg catgttcaa 2509

【０２１４】 <210> 32 <211> 670 <212> PRT <213> human <400> 32 Met Gly Glu Pro Ala Gly Val Ala Gly Thr Met Glu Ser Pro Phe 1 5 10 15 Ser Pro Gly Leu Phe His Arg Leu Asp Glu Asp Trp Asp Ser Ala 20 25 30 Leu Phe Ala Glu Leu Gly Tyr Phe Thr Asp Thr Asp Glu Leu Gln 35 40 45 Leu Glu Ala Ala Asn Glu Thr Tyr Glu Asn Asn Phe Asp Asn Leu 50 55 60 Asp Phe Asp Leu Asp Leu Met Pro Trp Glu Ser Asp Ile Trp Asp 65 70 75 Ile Asn Asn Gln Ile Cys Thr Val Lys Asp Ile Lys Ala Glu Pro 80 85 90 Gln Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Ser Tyr Ser Val Ser Ser Pro 95 100 105 Arg Ser Val Asp Ser Tyr Ser Ser Thr Gln His Val Pro Glu Glu 110 115 120 Leu Asp Leu Ser Ser Ser Ser Gln Met Ser Pro Leu Ser Leu Tyr 125 130 135 Gly Glu Asn Ser Asn Ser Leu Ser Ser Pro Glu Pro Leu Lys Glu 140 145 150 Asp Lys Pro Val Thr Gly Ser Arg Asn Lys Thr Glu Asn Gly Leu 155 160 165 Thr Pro Lys Lys Lys Ile Gln Val Asn Ser Lys Pro Ser Ile Gln 170 175 180 Pro Lys Pro Leu Leu Leu Pro Ala Ala Pro Lys Thr Gln Thr Asn 185 190 195 Ser Ser Val Pro Ala Lys Thr Ile Ile Ile Gln Thr Val Pro Thr 200 205 210 Leu Met Pro Leu Ala Lys Gln Gln Pro Ile Ile Ser Leu Gln Pro 215 220 225 Ala Pro Thr Lys Gly Gln Thr Val Leu Leu Ser Gln Pro Thr Val 230 235 240 Val Gln Leu Gln Ala Pro Gly Val Leu Pro Ser Ala Gln Pro Val 245 250 255 Leu Ala Val Ala Gly Gly Val Thr Gln Leu Pro Asn His Val Val 260 265 270 Asn Val Val Pro Ala Pro Ser Ala Asn Ser Pro Val Asn Gly Lys 275 280 285 Leu Ser Val Thr Lys Pro Val Leu Gln Ser Thr Met Arg Asn Val 290 295 300 Gly Ser Asp Ile Ala Val Leu Arg Arg Gln Gln Arg Met Ile Lys 305 310 315 Asn Arg Glu Ser Ala Cys Gln Ser Arg Lys Lys Lys Lys Glu Tyr 320 325 330 Met Leu Gly Leu Glu Ala Arg Leu Lys Ala Ala Leu Ser Glu Asn 335 340 345 Glu Gln Leu Lys Lys Glu Asn Gly Thr Leu Lys Arg Gln Leu Asp 350 355 360 Glu Val Val Ser Glu Asn Gln Arg Leu Lys Val Pro Ser Pro Lys 365 370 375 Arg Arg Val Val Cys Val Met Ile Val Leu Ala Phe Ile Ile Leu 380 385 390 Asn Tyr Gly Pro Met Ser Met Leu Glu Gln Asp Ser Arg Arg Met 395 400 405 Asn Pro Ser Val Ser Pro Ala Asn Gln Arg Arg His Leu Leu Gly 410 415 420 Phe Ser Ala Lys Glu Ala Gln Asp Thr Ser Asp Gly Ile Ile Gln 425 430 435 Lys Asn Ser Tyr Arg Tyr Asp His Ser Val Ser Asn Asp Lys Ala 440 445 450 Leu Met Val Leu Thr Glu Glu Pro Leu Leu Tyr Ile Pro Pro Pro 455 460 465 Pro Cys Gln Pro Leu Ile Asn Thr Thr Glu Ser Leu Arg Leu Asn 470 475 480 His Glu Leu Arg Gly Trp Val His Arg His Glu Val Glu Arg Thr 485 490 495 Lys Ser Arg Arg Met Thr Asn Asn Gln Gln Lys Thr Arg Ile Leu 500 505 510 Gln Gly Ala Leu Glu Gln Gly Ser Asn Ser Gln Leu Met Ala Val 515 520 525 Gln Tyr Thr Glu Thr Thr Ser Ser Ile Ser Arg Asn Ser Gly Ser 530 535 540 Glu Leu Gln Val Tyr Tyr Ala Ser Pro Arg Ser Tyr Gln Asp Phe 545 550 555 Phe Glu Ala Ile Arg Arg Arg Gly Asp Thr Phe Tyr Val Val Ser 560 565 570 Phe Arg Arg Asp His Leu Leu Leu Pro Ala Thr Thr His Asn Lys 575 580 585 Thr Thr Arg Pro Lys Met Ser Ile Val Leu Pro Ala Ile Asn Ile 590 595 600 Asn Glu Asn Val Ile Asn Gly Gln Asp Tyr Glu Val Met Met Gln 605 610 615 Ile Asp Cys Gln Val Met Asp Thr Arg Ile Leu His Ile Lys Ser 620 625 630 Ser Ser Val Pro Pro Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Arg Asn Gln Thr 635 640 645 Asn Thr Phe Phe Gly Ser Pro Pro Ala Ala Thr Glu Ala Thr His 650 655 660 Val Val Ser Thr Ile Pro Glu Ser Leu Gln 665 670

【０２１５】 <210> 33 <211> 2620 <212> DNA <213> human <400> 33 ggcgggcctt gggaaccgtc tcctggttgt ggggtggggg ggaaagatgg cggagctgat 60 gctgctcagc gagattgctg acccgacgcg tttcttcacc gacaacctgc ttagcccgga 120 ggactgggac agcaccttgt attctggcct agatgaagtg gccgaggagc agacgcagct 180 cttccgttgc ccggagcagg atgtcccgtt tgacggcagc tccctggacg tggggatgga 240 tgtcagcccc tctgagcccc catgggaact cctgccgatc ttcccagatc ttcaggtgaa 300 gtctgagcca tcttccccct gctcttcctc ctccctcagc tccgagtcat cgcgtctctc 360 cacagagcca tccagcgagg ctcttggggt aggggaggtg ctccatgtga agacagagtc 420 cttggcaccc ccactgtgtc tcctgggaga tgacccaaca tcctcatttg aaaccgtcca 480 gatcaacgtt atccccacct ctgatgattc ctcagatgtc cagaccaaga tagaacctgt 540 ctctccatgt tcttccgtca actctgaggc ctccctgctc tcagccgact cctccagcca 600 ggcttttata ggagaggagg tcctggaagt gaagacagag tccctgtccc cttcaggatg 660 cctcctgtgg gatgtcccag ccccctcact tggagctgtc cagatcagca tgggcccatc 720 ccttgatggc tcctcaggca aagccctgcc cacccggaag ccgccactgc agcccaaacc 780 tgtagtgcta accactgtcc caatgccatc cagagctgtg cctcccagca ccacagtcct 840 tctgcagtcc ctcgtccagc cacccccagt gtccccagtt gtcctcatcc agggtgctat 900 tcgagtccag cctgaagggc cggctccctc tctaccacgg cctgagagga agagcatcgt 960 tcccgctcct atgcctggaa actcctgccc gcctgaagtg gatgcaaagc tgctgaagcg 1020 gcagcagcga atgatcaaga accgggagtc agcctgccag tcccggagaa agaagaaaga 1080 gtatctgcag ggactggagg ctcggctgca agcagtactg gctgacaacc agcagctccg 1140 ccgagagaat gctgccctcc ggcggcggct ggaggccctg ctggctgaaa acagcgagct 1200 caagttaggg tctggaaaca ggaaggtggt ctgcatcatg gtcttccttc tcttcattgc 1260 cttcaacttt ggacctgtca gcatcagtga gcctccttca gctcccatct ctcctcggat 1320 gaacaagggg gagcctcaac cccggagaca cttgctgggg ttctcagagc aagagccagt 1380 tcagggagtt gaacctctcc aggggtcctc ccagggccct aaggagcccc agcccagccc 1440 cacagaccag cccagtttca gcaacctgac agccttccct gggggcgcca aggagctact 1500 actaagagac ctagaccagc tcttcctctc ctctgattgc cggcacttca accgcactga 1560 gtccctgagg cttgctgacg agttgagtgg ctgggtccag cgccaccaga gaggccggag 1620 gaagatccct cagagggccc aggagagaca gaagtctcag ccacggaaga agtcacctcc 1680 agttaaggca gtccccatcc aaccccctgg acccccagaa agggattctg tgggccagct 1740 gcaactatat cgccacccag accgttcgca gccagcattc ttggatgcaa ttgaccgacg 1800 ggaagacaca ttttatgttg tctctttccg aaggggccac ctgctgctcc cagccatcag 1860 ccacaacaag acctcccggc ccaagatgtc cctggtgatg cctgccatgg cccccaatga 1920 gaccctgtca ggccgtgggg ccccggggga ctatgaggag atgatgcaga tcgagtgtga 1980 ggtcatggac accagggtga ttcacatcaa gacctccaca gtgcccccct cgctccgaaa 2040 acagccatcc ccaaccccag gcaatgccac aggtggcccc ttgccagtct ctgcagccag 2100 ccaggcccac caggcctccc accagcccct ctacctcaat catccctgac ctctgccatt 2160 cacactgact tagaacgggg ggagggggta ccaggtggcc aggtgggact gtttcaaatt 2220 tccctgatcc ccaggcttgg ggcaattggt aaaggaaaga gcaggtgtgg gggttaagca 2280 cttatttgag gtgggggtgt tcacctctct tctcatccct ttatcagaat atagggctcc 2340 tctcattcct gtgaaccccc agtcctggct tctttgtttg aggggattgt gtgaggttca 2400 gttgtggggt gggtggtgag ctgctgcata ttttttattg tgtttctcta gtgttatggc 2460 agtggaggtg ggaatttagt ccccaggtgg gacaagggaa gttttttcat tttggagcta 2520 gttactggga gtaagggagg gtggggtggg ggggagttca ggtttatgtg tgtgcatttc 2580 ttttttatta ttactaaata aacaacttgg agggagttga 2620

【０２１６】 <210> 34 <211> 700 <212> PRT <213> human <400> 34 Met Ala Glu Leu Met Leu Leu Ser Glu Ile Ala Asp Pro Thr Arg 1 5 10 15 Phe Phe Thr Asp Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Trp Asp Ser Thr 20 25 30 Leu Tyr Ser Gly Leu Asp Glu Val Ala Glu Glu Gln Thr Gln Leu 35 40 45 Phe Arg Cys Pro Glu Gln Asp Val Pro Phe Asp Gly Ser Ser Leu 50 55 60 Asp Val Gly Met Asp Val Ser Pro Ser Glu Pro Pro Trp Glu Leu 65 70 75 Leu Pro Ile Phe Pro Asp Leu Gln Val Lys Ser Glu Pro Ser Ser 80 85 90 Pro Cys Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Glu Ser Ser Arg Leu Ser 95 100 105 Thr Glu Pro Ser Ser Glu Ala Leu Gly Val Gly Glu Val Leu His 110 115 120 Val Lys Thr Glu Ser Leu Ala Pro Pro Leu Cys Leu Leu Gly Asp 125 130 135 Asp Pro Thr Ser Ser Phe Glu Thr Val Gln Ile Asn Val Ile Pro 140 145 150 Thr Ser Asp Asp Ser Ser Asp Val Gln Thr Lys Ile Glu Pro Val 155 160 165 Ser Pro Cys Ser Ser Val Asn Ser Glu Ala Ser Leu Leu Ser Ala 170 175 180 Asp Ser Ser Ser Gln Ala Phe Ile Gly Glu Glu Val Leu Glu Val 185 190 195 Lys Thr Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Cys Leu Leu Trp Asp Val 200 205 210 Pro Ala Pro Ser Leu Gly Ala Val Gln Ile Ser Met Gly Pro Ser 215 220 225 Leu Asp Gly Ser Ser Gly Lys Ala Leu Pro Thr Arg Lys Pro Pro 230 235 240 Leu Gln Pro Lys Pro Val Val Leu Thr Thr Val Pro Met Pro Ser 245 250 255 Arg Ala Val Pro Pro Ser Thr Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Val 260 265 270 Gln Pro Pro Pro Val Ser Pro Val Val Leu Ile Gln Gly Ala Ile 275 280 285 Arg Val Gln Pro Glu Gly Pro Ala Pro Ser Leu Pro Arg Pro Glu 290 295 300 Arg Lys Ser Ile Val Pro Ala Pro Met Pro Gly Asn Ser Cys Pro 305 310 315 Pro Glu Val Asp Ala Lys Leu Leu Lys Arg Gln Gln Arg Met Ile 320 325 330 Lys Asn Arg Glu Ser Ala Cys Gln Ser Arg Arg Lys Lys Lys Glu 335 340 345 Tyr Leu Gln Gly Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ala Val Leu Ala Asp 350 355 360 Asn Gln Gln Leu Arg Arg Glu Asn Ala Ala Leu Arg Arg Arg Leu 365 370 375 Glu Ala Leu Leu Ala Glu Asn Ser Glu Leu Lys Leu Gly Ser Gly 380 385 390 Asn Arg Lys Val Val Cys Ile Met Val Phe Leu Leu Phe Ile Ala 395 400 405 Phe Asn Phe Gly Pro Val Ser Ile Ser Glu Pro Pro Ser Ala Pro 410 415 420 Ile Ser Pro Arg Met Asn Lys Gly Glu Pro Gln Pro Arg Arg His 425 430 435 Leu Leu Gly Phe Ser Glu Gln Glu Pro Val Gln Gly Val Glu Pro 440 445 450 Leu Gln Gly Ser Ser Gln Gly Pro Lys Glu Pro Gln Pro Ser Pro 455 460 465 Thr Asp Gln Pro Ser Phe Ser Asn Leu Thr Ala Phe Pro Gly Gly 470 475 480 Ala Lys Glu Leu Leu Leu Arg Asp Leu Asp Gln Leu Phe Leu Ser 485 490 495 Ser Asp Cys Arg His Phe Asn Arg Thr Glu Ser Leu Arg Leu Ala 500 505 510 Asp Glu Leu Ser Gly Trp Val Gln Arg His Gln Arg Gly Arg Arg 515 520 525 Lys Ile Pro Gln Arg Ala Gln Glu Arg Gln Lys Ser Gln Pro Arg 530 535 540 Lys Lys Ser Pro Pro Val Lys Ala Val Pro Ile Gln Pro Pro Gly 545 550 555 Pro Pro Glu Arg Asp Ser Val Gly Gln Leu Gln Leu Tyr Arg His 560 565 570 Pro Asp Arg Ser Gln Pro Ala Phe Leu Asp Ala Ile Asp Arg Arg 575 580 585 Glu Asp Thr Phe Tyr Val Val Ser Phe Arg Arg Gly His Leu Leu 590 595 600 Leu Pro Ala Ile Ser His Asn Lys Thr Ser Arg Pro Lys Met Ser 605 610 615 Leu Val Met Pro Ala Met Ala Pro Asn Glu Thr Leu Ser Gly Arg 620 625 630 Gly Ala Pro Gly Asp Tyr Glu Glu Met Met Gln Ile Glu Cys Glu 635 640 645 Val Met Asp Thr Arg Val Ile His Ile Lys Thr Ser Thr Val Pro 650 655 660 Pro Ser Leu Arg Lys Gln Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asn Ala Thr 665 670 675 Gly Gly Pro Leu Pro Val Ser Ala Ala Ser Gln Ala His Gln Ala 680 685 690 Ser His Gln Pro Leu Tyr Leu Asn His Pro 695 700

【０２１７】 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 35 ccttcaccaa tcggcggcct ccacgacgg 29

【０２１８】 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> human <400> 36 ccttcagact acggcggcct gatgtacgg 29

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒトＧＲＰ７８プロモーター−１４０
〜−１９の近位領域の塩基配列を示す図である。Ｃ１〜
Ｃ５で示されたＣＣＡＡＴ様モチーフおよびＴＡＴＡ配
列は、それぞれボックスおよびアンダーラインを付し
た。また、ＣＯＲＥおよびＣ１領域、ＳＩＣＲおよびＣ
ＣＡＡＴ（Ｎ₉ ）ＣＣＡＣＧモチーフの局在を示す。

【図２】図２は、ヒトＧＲＰ７８プロモーターの−１３
９〜−４２領域のタンデムリピート構造を示す図であ
る。この領域内の３つの繰り返し配列を整列させ、少な
くとも２つの繰り返し配列間で保存された塩基を網かけ
で示す。ＥＲＳＥコンセンサスを最上部に示す。

【図３】図３は、公知の哺乳類およびニワトリＧＲＰプ
ロモーターのＥＲＳＥ様配列（配列番号：５〜３０）を
示す図である。コンセンサスと一致する塩基を網かけで
示す。図中、ＣＲＴはカルレティキュリンを示す。

【図４】図４は、種々のＧＲＰプロモーター内のＥＲＳ
Ｅ様配列の位置および方向を黒矢印で示す。ＣＣＡＡＴ
およびＴＡＴＡ配列は、それぞれ白矢印および小さいボ
ックスで示す。

【図５】図５は、脊椎動物、植物、およびカビにおける
ＥＲＳＥ様モチーフを示す図である。図中、ＣＲＴはカ
ルレティキュリン、ＰＤＩはプロテインジスルフィドイ
ソメラーゼ、Ｄｍはドロスフィラ・メラノガスター（Ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、Ｃ
ｅはカエノルハディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒ
ｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、Ａｔはアラビド
シス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉ
ａｎａ）、Ｓｏはスピナシア・オレラシア（Ｓｐｉｎａ
ｃｉａ ｏｒｅｒａｃｅａ）、Ｒｃはリチヌス・コミュ
ニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、Ａｎはア
スペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｇａｒ）を示す。

【図６】図６は、ＥＲＳＥ破壊の影響を示す図である。
パネル（Ａ）はヒトＧＲＰ７８、パネル（Ｂ）はＧＲＰ
９４、パネル（Ｃ）はカルレティキュリンのそれぞれの
プロモーター活性に対するＥＲＳＥ破壊の影響を示す。
ＧＲＰ７８プロモーターのＥＲＳＥ１、ＥＲＳＥ２およ
びＥＲＳＥ３、ＧＲＰプロモーターのＥＲＳＥ１および
ＥＲＳＥ３、ならびにカルレティキュリンプロモーター
のＥＲＳＥ２およびＥＲＳＥ３のそれぞれを、ｇａｔｃ
Ｔ（Ｎ₉ ）ａａｃａｔ、Ｃｔｃｇａ（Ｎ₉）ａａｃａ
ｃ、ｇａｇｃＴ（Ｎ₉ ）ａａｃｇｃ、ａｔｇｔｔ
（Ｎ₉ ）Ａｇｃｔｃ、ｇａｔｃＴ（Ｎ₉ ）ａａｃｔｃお
よびａｔｇｔｔ（Ｎ₉ ）Ａｇａｔｃとなるように変異さ
せることにより破壊した。完全なまたは得られた変異プ
ロモーターはｐＧＬ３−ベーシックベクターのＫｐｎＩ
−ＸｈｏＩ部位に挿入した。左パネルは、完全なまたは
変異ＥＲＳＥ破壊構築物の概略図を示す。矢印の数字
は、転写開始部位からのヌクレオチド位置を示す。黒塗
りボックスおよび斜線のボックスは、それぞれ完全なＥ
ＲＳＥモチーフおよびＥＲＳＥコンセンサス配列に顕著
な相同性を示すＥＲＳＥモチーフを示す。バツ印は、破
壊されたＥＲＳＥを示す。中央のパネルは、細胞へのト
ランスフェクションによるホタルルシフェラーゼの相対
活性を示す。黒棒および白棒は、それぞれ２μｇ／ｍｌ
のツニカマイシン（図中、ＴＭと示す）による１６時間
処理および未処理の前記構築物による一過性トランスフ
ェクトＨｅＬａ細胞を示す。右パネルはリポーター活性
の基底レベルに対する誘導された活性の誘導倍率を示
す。ルシフェラーゼ相対活性および誘導倍率は、４回の
独立した一過性発現アッセイにより決定した。

【図７】図７は、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４およびカルレ
ティキュリンのＥＲＳＥモチーフの転写誘導への関与を
調べた結果を示す図である。図中に示すフランキング領
域を有する各々のＥＲＳＥをコードするオリゴヌクレオ
チドをｐＧＬ３−プロモーターベクターのＢｇｌＩＩ部
位に挿入した。ルシフェラーゼ相対活性および誘導倍率
を図６で記載されたと同様に、４回の独立した一過性発
現アッセイにより決定した。

【図８】図８は、ヒトＧＲＰ７８プロモーター由来のＥ
ＲＳＥ１において、転写誘導に必要とされるヌクレオチ
ドを調べた結果の図である。セグメント〔−６５〜−４
３〕の各ヌクレオチドをトランスバージョンにより置き
換え（図中、置換ヌクレオチドを小文字で示す）、変異
断片をｐＧＬ２−プロモーターベクターのＸｈｏＩ−Ｂ
ｇｌＩＩ部位に挿入した。データは、４回の独立した実
験の平均で示す。

【図９】図９は、ヒトＧＲＰ７８プロモーター由来のＥ
ＲＳＥ１において、転写誘導に必要とされるヌクレオチ
ドを調べた結果の図である。ＣＣＡＣＧの各ヌクレオチ
ドとその近傍の配列を小文字で示すように変化させた。
セグメント〔−６５〜−３８〕の変異フラグメントを、
図８と同様にｐＧＬ２−プロモーターベクターに挿入し
た。また、ＣＣＡＡＴとＣＣＡＣＧの間に付加的なＡを
含む挿入変異をライン３８〜４０に示す。データは、４
回の独立した実験の平均で示す。

【図１０】図１０は、ヒトＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４およ
びカルレティキュリンのＥＲＳＥ媒介誘導における様々
な小胞体ストレス誘導剤の影響を示す図である。示され
た構築物による一過性トランスフェクト細胞を２μｇ／
ｍｌのＴＭ（黒棒）、１μＭのＡ２３１８７（斜線を付
した棒）、または１００ｎＭのＴｇ（点を付した棒）で
１６時間処理した。図中に示された各構築物は、図６の
構築物に対応する。データは４回の独立した実験から得
た。

【図１１】図１１は、酵母におけるワン−ハイブリッド
スクリーニングに用いたレポータプラスミドの構造を示
す。

【図１２】図１２は、レポータ遺伝子発現におけるクロ
ーン３−ＧＡＬ４ＡＤ融合タンパク質の影響を示す図で
ある。ＧＡＬ４ＡＤタンパク質単独またはクローン３−
ＧＡＬ４ＡＤ融合タンパク質のそれぞれをコードする遺
伝子を有するエフェクタープラスミドを完全なＥＲＳＥ
（５’−ＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＴＣ
ＣＡＣＧＡＣＧＧ−３’）または変異ＥＲＳＥ（図中、
小文字部分を変異）の制御下にｌａｃＺ遺伝子のレポー
タープラスミドを保持する酵母株ＫＭＹ１０１５に導入
した。

【図１３】図１３は、ヒトＡＴＦ６の塩基性領域の比較
を示す図である。パネル（Ａ）は酵母Ｈａｃ１ｐ、パネ
ル（Ｂ）はヒトＡＴＦ／ＣＲＥＢファミリー、パネル
（Ｃ）はｂＺＩＰタンパク質との比較を示す。

【図１４】図１４は、ＧＲＰプロモーターにおけるＡＴ
Ｆ６過剰発現の影響を示す図である。全長ＡＴＦ６ ｃ
ＤＮＡを保持するエフェクタープラスミドまたはプラス
ミドベクター単独１００ｎｇ、完全なまたは変異ＧＲＰ
プロモーターと融合させたルシフェラーゼ遺伝子を含む
レポータープラスミド１μｇを有するＨｅＬａ細胞にコ
トランスフェクトした。使用した変異プロモーター構築
物は、図６の構築物に対応する。黒棒および白棒は、そ
れぞれ２μｇ／ｍｌのツニカマイシン（図中、ＴＭに示
す）による１６時間処理および未処理の細胞を示す。実
験は４回繰り返した。

【図１５】図１５は、ＡＴＦ６とＣＲＥＢ−ＲＰとの構
造的相同性を示す。顕著な相同性を示す領域は、ボック
スで示し、同一性を％で示した。

【図１６】図１６は、ＧＲＰプロモーターにおけるＣＲ
ＥＢ−ＲＰの過剰発現の影響を示す図である。全長ＣＲ
ＥＢ−ＲＰを含むエフェクタープラスミドを図１４と同
様にレポータプラスミドを有するＨｅＬａ細胞にコトラ
ンスフェクトした。実験は４回繰り返した。図中、ＴＭ
は、ツニカマイシンを示す。

【図１７】図１７は、ＡＴＦ６ｍＲＮＡのノーザンブロ
ットハイブイリダイゼーション解析を示す図である。Ｈ
ｅＬａ細胞は、２μｇ／ｍｌのツニカマイシン（図中、
ＴＭとする）で示された時間処理した。

【図１８】図１８は、ＡＴＦ６タンパク質のイムノブロ
ッティング解析を示す図である。インビトロ翻訳を対照
ベクター（レーン１）またはＡＴＦ６ｃＤＮＡ（レーン
２）を有する網状赤血球の溶解物を用いて行なった。全
細胞抽出物は、２μｇ／ｍｌのＴＭで４時間処理（レー
ン４および６）もしくは未処理（レーン３または５）の
ＨｅＬａ細胞、または対照ベクター（レーン７）もしく
はＡＴＦ６発現プラスミド（レーン８）でトランスフェ
クトしたＨｅＬａ細胞から調製した。タンパク質は、抗
Ｂ０３Ｎ抗血清（レーン１〜４、７および８）または抗
ペプチド〔抗ＡＴＦ６（Ｎ２１−３４）〕抗血清（レー
ン５および６）を用いて検出した。白矢印および黒矢印
は、それぞれｐ９０ＡＴＦ６およびｐ５０ＡＴＦ６の位
置を示す。

【図１９】図１９は、ｐ５０ＡＴＦ６の出現と細胞内Ｕ
ＰＲ活性との関連性を示す図である。２μｇ／ｍｌのＴ
Ｍ、７μＭのＡ２３１８７または３００ｎＭのタプシガ
ーギン（図中、Ｔｇとする）で示された時間、ＨｅＬａ
細胞を処理した。また、前記処理した細胞群とは別のＨ
ｅＬａ細胞を、４３℃で１時間、ヒートショックし、３
７℃で示された時間回復した。全細胞抽出物を調製し、
抗Ｂ０３Ｎ抗血清またはＧＲＰ７８もしくはＨＳＰ７０
に特異的な抗血清を用いてイムノブロッティングにより
解析した。

【図２０】図２０は、ＡＴＦ６のイムノブロット解析の
結果を示す図である。６０ｍｍディッシュ中で６０％の
コンフルエンシーになるまで培養したＨｅＬａ細胞を２
μｇ／ｍｌのツニカマイシン（ＴＭ）の存在下に示され
た時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ラ
バーポリスマンで剥がし、ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳサン
プルバッファー１００μｌに溶解した。５分間煮沸した
のち、１×１０⁵ 個の細胞に対応するアリコートをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供し、抗ＡＴＦ６抗体ま
たはＧＲＰ７８を認識するＫＤＥＬ抗体でイムノブロッ
トすることにより解析した。ｐ９０ＡＴＦ６およびｐ５
０ＡＴＦ６の位置をそれぞれ白矢印および黒矢印で示
す。星印は糖鎖が付加していないｐ９０ＡＴＦ６のバン
ドを示す。分子量マーカー（バイオラッド社製プレ染色
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標品）の位置をも示す。

【図２１】図２１は、６７０アミノ酸からなるＡＴＦ６
の概略図である。セリンクラスター、塩基性領域、およ
びロイシンジッパー〔Zhu et al., Mol. Cell. Biol.
17, 4957-4966 (1997)〕、ならびに本発明において同定
された膜貫通ドメインの位置を示す。太い下線は、抗Ａ
ＴＦ６抗体を作製するために、大腸菌マルトース結合タ
ンパク質と融合させた領域（アミノ酸６〜３０７）を示
す。ハイドロパシー指標を〔Kyte and Doolittle, J. M
ol. Biol. 157, 105-132 (1982)〕の方法により計算し
た。

【図２２】図２２は、ＨｅＬａ細胞の各画分中のｐ９０
ＡＴＦ６およびｐ５０ＡＴＦ６の分布を示す図である。
１７５ｃｍ² フラスコ中６０〜８０％のコンフルエンシ
ーまで培養したＨｅＬａ細胞を２μｇ／ｍｌのツニカマ
イシン（ＴＭ）の存在下（＋）または非存在下（−）に
４時間インキュベートした。基本的に〔Dignam etal.,
(1983) 〕に記載に沿って、細胞を集め、Ｄｏｕｎｃｅ
型ホモジナイザーで破砕し、ついで、破砕物を１，００
０×ｇで１０分間遠心分離して核ペレット（図中、Ｎで
示す）および上清（Ｓ）を得た。得られた上清（Ｓ）を
さらに１００，０００×ｇで１時間遠心分離し、不溶性
膜画分（Ｍ）と可溶性サイトゾル画分（Ｃ）とを分離し
た。由来する細胞が０．５×１０⁵ 個の細胞に対応する
示された画分ならびに分画していないＨｅＬａ細胞（全
細胞破砕物：Ｗ）のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１
０％ゲル）に供し、抗ＡＴＦ６抗体または示された種々
の抗体によるイムノブロッティングにより解析した。ｐ
９０ＡＴＦ６およびｐ５０ＡＴＦ６を、それぞれ白矢印
および黒矢印で示す。

【図２３】図２３は、ｐ９０ＡＴＦ６の可溶化の度合い
を示す図である。図２２と同様に得られた、ストレスを
かけていないＨｅＬａ細胞由来の１，０００×ｇ上清
（Ｓ）画分を、０．１倍容量の下記溶液：Ｈ₂ Ｏ、５Ｍ
ＮａＣｌ、１Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ₃ （ｐＨ１１．０）、１
０％ ＳＤＳ、１０％ トリトンＸ−１００または１０
％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）からなる群よ
り選ばれた１種と混合した。室温で１５分間のインキュ
ベーション後、混合物を１００，０００×ｇで１時間の
遠心分離をして上清（Ｓ）とペレット（Ｐ）とを分離し
た。ついで、得られた試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％
ゲル）に供し、抗ＡＴＦ６抗体または抗Ｎ末端カルネキ
シン抗体を用いてイムノブロッティングを行なった。

【図２４】図２４は、ｐ９０ＡＴＦ６のトポロジーを示
す図である。ストレスをかけていないＨｅＬａ細胞から
調製された１，０００×ｇ上清（Ｓ）画分（５０μｇタ
ンパク質）をトリプシンの量を増加させて（レーン１、
５および９は０μｇ；レーン２、６および１０は０．１
μｇ；レーン３、７および１１は０．３μｇ；ならびに
レーン４、８および１２は１．０μｇ）、室温で１５分
間インキュベートした。等量の２×ＬａｅｍｍｌｉのＳ
ＤＳ試料緩衝液の添加後、５分間の煮沸により消化を終
了した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供
し、抗ＡＴＦ６抗体（レーン１〜４）、抗カルネキシン
Ｎ末端ドメイン抗体（カルネキシン−Ｎ、レーン５〜
８）、または抗カルネキシンＣ末端ドメイン抗体（カル
ネキシン−Ｃ、レーン９〜１２）によるイムノブロッテ
ィングで解析した。ｐ９０ＡＴＦ６の位置を矢印で示
す。全長カルネキシンの位置およびその細胞質ドメイン
を欠いた切形型を概略的に示す。

【図２５】図２５は、哺乳類発現ベクターｐＣＧＮに挿
入した全長ＡＴＦ６ ｃＤＮＡであるＡＴＦ６（６７
０）および各種欠失変異体の概略図を示す。図中、塩基
性領域、ロイシンジッパーおよび膜貫通ドメインの位置
を示す。ＨＡエピトープは、各欠失変異体のＮ末端に結
合している。

【図２６】図２６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける種々の
Ｃ末端欠失変異体の移動度とｐ９０ＡＴＦ６およびｐ５
０ＡＴＦ６の移動度との比較を示す図である。６０ｍｍ
ディッシュ中のＨｅＬａ細胞をｐＣＧＮベクター単独
（Ｖｅｃ）またはＡＴＦ６のＣ末端欠失変異体発現プラ
スミドで一過的に形質転換した。全タンパク質を１×Ｌ
ａｅｍｍｌｉのＳＤＳ試料緩衝液で直接抽出し、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）に供し、抗ＡＴＦ６抗体を用
いた免疫ブロッティングにより解析した。ｐ９０ＡＴＦ
６およびｐ５０ＡＴＦ６の移動位置を、それぞれ白矢印
および黒矢印で示す。

【図２７】図２７は、ＡＴＦ６の転写活性化ドメインを
解析した結果を示す図である。右パネルは、ＡＴＦ６な
らびに種々のＡＴＦ６サブ領域と酵母Ｇａｌ４ｐのＤＮ
Ａ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７；ＧＡＬ４ＤＢ）
との間の融合タンパク質の概略的構造を示す図である。
図中、点線は、構築物から欠損させた領域を示す。塩基
性ロイシンジッパー領域（ｂＺＩＰ）および膜貫通ドメ
イン（ＴＭＤ）の位置を示す。右パネルは、種々の融合
タンパク質の転写活性を示す図である。２４ウェルプレ
ート中ＨｅＬａ細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の
上流に５つのＧａｌ４ｐ結合部位を含むレポータープラ
スミドｐＧ５ｌｕｃと共に各々の融合タンパク質発現プ
ラスミドで一過的にトランスフェクトした。構成的に発
現されたルシフェラーゼ活性を測定し、実施例に記載の
ように標準化した。相対活性を４回の独立した実験（各
３連の測定）の平均±標準偏差（バー）で示す。製造者
により供給された陽性対照（ｐＢＩＮＤ−Ｉｄ＋ｐＡＣ
Ｔ−ＭｙｏＤ対照ベクター；プロメガ社製）は、本アッ
セイで４．６±０．３の相対活性を示した。

【図２８】図２８は、ＥＲＳＥを介した転写における全
長ＡＴＦ６、Ｃ末端欠失変異体および転写活性化ドメイ
ン欠失変異体の過剰発現の影響を示す図である。２４ウ
ェルプレート中ＨｅＬａ細胞をｐＣＧＮベクター単独
（Ｖｅｃ）または各ＡＴＦ６発現プラスミドとともにヒ
トＧＲＰ７８プロモーターの制御下にホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子を発現するレポータープラスミドｐＧＬ−Ｇ
７８（−１３２）で一過的に形質転換した。ルシフェラ
ーゼ活性を測定する１６時間前に、トランスフェクト細
胞を２μｇ／ｍｌのツニカマイシン（ＴＭ）で処理（黒
棒）または処理しなかった（白棒）。相対活性を４回の
独立した実験（各３連の測定）の平均±標準偏差（バ
ー）で示す。

【図２９】図２９は、ＣＲＥＢ−ＲＰのイムノブロット
解析の結果を示す図である。図２０で記載された方法と
同様にして細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗Ｃ
ＲＥＢ−ＲＰ抗体または抗ＡＴＦ６抗体または抗ＫＤＥ
Ｌ抗体でイムノブロットすることにより解析した。

【図３０】図３０は、ＥＲＳＥを介した転写におけるｐ
６０ＣＲＥＢ−ＲＰおよびｐ５０ＡＴＦ６の過剰発現の
影響を示す図である。９６ウェルプレート中ＨｅＬａ細
胞をｐｃＤＮＡ３．１ベクター単独またはＡＴＦ６（１
−３７３）発現プラスミドまたはＣＲＥＢ−ＲＰ（１−
３８９）発現プラスミドとともにヒトＧＲＰ７８プロモ
ーターの制御下にホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現す
るレポータープラスミドｐＧＬ−Ｇ７８（−１３２）で
一過的に形質転換した。相対活性を４回の独立した実験
（各３連の測定）の平均±標準値（バー）で示す。

【図３１】図３１は、ＥＲＳＥを介した転写におけるＣ
ＲＥＢ−ＲＰ転写活性化ドメイン欠失体の過剰発現の影
響を示す図である。９６ウェルプレート中ＨｅＬａ細胞
をｐｃＤＮＡ３．１ベクター単独またはＣＲＥＢ−ＲＰ
（３０８−３８６）発現プラスミドとともにヒトＧＲＰ
７８プロモーターの制御下にホタルルシフェラーゼ遺伝
子を発現するレポータープラスミドｐＧＬ−Ｇ７８（−
１３２）で一過的に形質転換した。ルシフェラーゼ活性
を測定する１６時間前に、トランスフェクト細胞を２μ
ｇ／ｍｌのツニカマイシンで処理（黒棒）または処理し
なかった（白棒）。相対活性を４回の独立した実験（各
３連の測定）の平均±標準偏差（バー）で示す。

【図３２】図３２は、ＥＲＳＥを介した転写におけるＣ
ＲＥＢ−ＲＰ転写活性化ドメイン欠失体であるＣＲＥＢ
−ＲＰ（１５１−３８９）およびＣＲＥＢ−ＲＰ（８１
−３８９）の過剰発現の影響を示す図である。図中、黒
棒および白棒は、図３１と同様である。

フロントページの続き (72)発明者 由良 隆 京都市左京区修学院狭間町12 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA03 EA04 GA11 HA01 4B064 AG02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA05

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に示される塩基配列からな
   るエレメント、または配列番号：１に示される塩基配列
   において、１〜３個の塩基の他の塩基への置換を有する
   塩基配列からなるエレメント、の有する転写誘導活性を
   調節しうる小胞体ストレス転写因子。
2. 【請求項２】 小胞体ストレス転写因子がｂＺＩＰ転写
   因子である、請求項１記載の小胞体ストレス転写因子。
3. 【請求項３】 ｂＺＩＰ転写因子が、ＡＴＦ６（配列番
   号：３２）またはＣＲＥＢ−ＲＰ（配列番号：３４）で
   ある請求項２記載の小胞体ストレス転写因子。
4. 【請求項４】 （Ａ）配列番号：３１に示される塩基配
   列からなる核酸、（Ｂ）配列番号：３３に示される塩基
   配列からなる核酸、（Ｃ）前記（Ａ）または（Ｂ）記載
   の核酸の塩基配列において、１個以上の塩基の置換、欠
   失、付加もしくは挿入を有する塩基配列からなる核酸、
   および（Ｄ）前記（Ａ）〜（Ｃ）いずれか記載の核酸の
   相補鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイズす
   る核酸からなる群より選ばれた核酸によりコードされう
   るポリペプチドからなる、請求項２記載の小胞体ストレ
   ス転写因子。
5. 【請求項５】 ｂＺＩＰ転写因子が、活性化型ＡＴＦ６
   である請求項２記載の小胞体ストレス転写因子。
6. 【請求項６】 活性化型ＡＴＦ６が、小胞体ストレスに
   よりプロセシングされたｐ５０ＡＴＦ６である請求項５
   記載の小胞体ストレス転写因子。
7. 【請求項７】 活性化型ＡＴＦ６が、ｐ５０ＡＴＦ６を
   コードするＤＮＡを発現させて得られるポリペプチドで
   ある、請求項５記載の小胞体ストレス転写因子。
8. 【請求項８】 活性化型ＡＴＦ６が、ＡＴＦ６のアミノ
   酸１〜３７３領域もしくは１〜３６６領域の全部または
   一部を含むポリペプチドである請求項５記載の小胞体ス
   トレス転写因子。
9. 【請求項９】 ｂＺＩＰ転写因子が、活性化型ＣＲＥＢ
   −ＲＰである請求項２記載の小胞体ストレス転写因子。
10. 【請求項１０】 活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰが、小胞体ス
    トレスによりプロセシングされたｐ６０ＣＲＥＢ−ＲＰ
    である請求項９記載の小胞体ストレス転写因子。
11. 【請求項１１】 活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰが、ｐ６０Ｃ
    ＲＥＢ−ＲＰをコードするＤＮＡを発現させて得られる
    ポリペプチドである、請求項９記載の小胞体ストレス転
    写因子。
12. 【請求項１２】 活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰが、ＣＲＥＢ
    −ＲＰのアミノ酸１〜３８９領域の全部または一部を含
    むポリペプチドである請求項９記載の小胞体ストレス転
    写因子。
13. 【請求項１３】 ｂＺＩＰ転写因子が、抑制型ＡＴＦ６
    である請求項２記載の小胞体ストレス転写因子。
14. 【請求項１４】 抑制型ＡＴＦ６が、ＡＴＦ６のアミノ
    酸１〜１５０領域の全部または一部が破壊されたポリペ
    プチドである請求項１３記載の小胞体ストレス転写因
    子。
15. 【請求項１５】 抑制型ＡＴＦ６が、請求項５〜８いず
    れか記載の活性化型ＡＴＦ６のアミノ酸１〜１５０領域
    の全部または一部が破壊されたポリペプチドである請求
    項１３記載の小胞体ストレス転写因子。
16. 【請求項１６】 ｂＺＩＰ転写因子が、抑制型ＣＲＥＢ
    −ＲＰである請求項２記載の小胞体ストレス転写因子。
17. 【請求項１７】 抑制型ＣＲＥＢ−ＲＰが、ＣＲＥＢ−
    ＲＰのアミノ酸１〜３０７領域の全部または一部が破壊
    されたポリペプチドである請求項１６記載の小胞体スト
    レス転写因子。
18. 【請求項１８】 抑制型ＣＲＥＢ−ＲＰが、請求項９〜
    １２いずれか記載の活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰのアミノ酸
    １〜３０７領域の全部または一部が破壊されたポリペプ
    チドである請求項１６記載の小胞体ストレス転写因子。
19. 【請求項１９】 請求項１〜１８いずれか記載の小胞体
    ストレス転写因子を発現させることを特徴とする小胞体
    シャペロン遺伝子の発現制御方法。
20. 【請求項２０】 細胞内の小胞体ストレス転写因子の発
    現量を調節する、請求項１９記載の発現制御方法。
21. 【請求項２１】 発現させる小胞体ストレス転写因子の
    選択により、小胞体シャペロン遺伝子の発現を正または
    負に調節する、請求項１９または２０記載の発現制御方
    法。
22. 【請求項２２】 請求項１９〜２１いずれか記載の方法
    により、小胞体シャペロン遺伝子の発現を正に調節する
    ことを特徴とする、外来タンパク質の発現方法。
23. 【請求項２３】 請求項６〜８いずれかにおいて規定さ
    れた活性化型ＡＴＦ６をコードする核酸またはその相補
    鎖。
24. 【請求項２４】 （ａ）配列番号：３２のアミノ酸番
    号：１〜３７３に示されるアミノ酸配列をコードする塩
    基配列からなる核酸、（ｂ）配列番号：３２のアミノ酸
    番号：１〜３６６に示されるアミノ酸配列をコードする
    塩基配列からなる核酸、（ｃ）配列番号：３１の塩基番
    号：６９〜１１８７に示される塩基配列からなる核酸、
    （ｄ）配列番号：３１の塩基番号：６９〜１１６６に示
    される塩基配列からなる核酸、（ｅ）前記（ａ）〜
    （ｄ）いずれか記載の核酸において、少なくとも１塩基
    の置換、欠失、付加もしくは挿入を有する塩基配列から
    なる核酸、および（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）いずれか記
    載の核酸の相補鎖にストリンジェントな条件下にハイブ
    リダイズする核酸からなる群より選ばれた、請求項１６
    記載の核酸またはその相補鎖。
25. 【請求項２５】 請求項１０〜１２いずれかにおいて規
    定された活性化型ＣＲＥＢ−ＲＰをコードする核酸また
    はその相補鎖。
26. 【請求項２６】 （ｇ）配列番号：３４のアミノ酸番
    号：１〜３８９に示されるアミノ酸配列をコードする塩
    基配列からなる核酸、（ｈ）配列番号：３３の塩基番
    号：４７〜１２１３に示される塩基配列からなる核酸、
    （ｉ）前記（ｇ）または（ｈ）いずれか記載の核酸にお
    いて、少なくとも１塩基の置換、欠失、付加もしくは挿
    入を有する塩基配列からなる核酸、および（ｊ）前記
    （ｇ）〜（ｉ）いずれか記載の核酸の相補鎖にストリン
    ジェントな条件下にハイブリダイズする核酸からなる群
    より選ばれた、請求項２５記載の核酸またはその相補
    鎖。
27. 【請求項２７】 請求項１４または１５において規定さ
    れた抑制型ＡＴＦ６をコードする核酸またはその相補
    鎖。
28. 【請求項２８】 （ｋ）配列番号：３２のアミノ酸番
    号：１５１〜６７０に示されるアミノ酸配列をコードす
    る塩基配列からなる核酸、（ｌ）配列番号：３２のアミ
    ノ酸番号：１５１〜３７３に示されるアミノ酸配列をコ
    ードする塩基配列からなる核酸、（ｍ）配列番号：３２
    のアミノ酸番号：１５１〜３６６に示されるアミノ酸配
    列をコードする塩基配列からなる核酸、（ｎ）配列番
    号：３１の塩基番号：５１９〜２０７８に示される塩基
    配列からなる核酸、（ｏ）配列番号：３１の塩基番号：
    ５１９〜１１８７に示される塩基配列からなる核酸、
    （ｐ）配列番号：３１の塩基番号：５１９〜１１６６に
    示される塩基配列からなる核酸、（ｑ）前記（ｋ）〜
    （ｐ）いずれか記載の核酸の塩基配列において、少なく
    とも１塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入を有する塩
    基配列からなる核酸、および（ｒ）前記（ｋ）〜（ｑ）
    いずれか記載の核酸の相補鎖にストリンジェントな条件
    下にハイブリダイズする核酸からなる群より選ばれた、
    請求項２７記載の核酸またはその相補鎖。
29. 【請求項２９】 請求項１７または１８において規定さ
    れた抑制型ＣＲＥＢ−ＲＰをコードする核酸またはその
    相補鎖。
30. 【請求項３０】 （ｓ）配列番号：３４のアミノ酸番
    号：３０８〜３８６に示されるアミノ酸配列をコードす
    る塩基配列からなる核酸、（ｔ）配列番号：３３の塩基
    番号：９６８〜１２０４に示される塩基配列からなる核
    酸、（ｕ）配列番号：３４のアミノ酸番号：１５１〜３
    ８９に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から
    なる核酸、（ｖ）配列番号：３３の塩基番号：４９７〜
    １２１３に示される塩基配列からなる核酸、（ｗ）配列
    番号：３４のアミノ酸番号：８１〜３８９に示されるア
    ミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、（ｘ）
    配列番号：３３の塩基番号：２８７〜１２１３に示され
    る塩基配列からなる核酸、（ｙ）前記（ｓ）〜（ｘ）い
    ずれか記載の核酸において、少なくとも１塩基の置換、
    欠失、付加もしくは挿入を有する塩基配列からなる核
    酸、および（ｚ）前記（ｓ）〜（ｙ）いずれか記載の核
    酸の相補鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイ
    ズする核酸からなる群より選ばれた、請求項２９記載の
    核酸またはその相補鎖。