CN115607675A - Nav1.9互作蛋白PRMT7及其下调剂在制备镇痛药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种Na_V1.9互作蛋白PRMT7及其下调剂在制备镇痛药物中的用途。揭示了一种Na_V1.9特异互作的蛋白——PRMT7，其具有对Na_V1.9的调节活性，能调节背根神经节神经元兴奋性，进而可用作抑制疼痛的靶点。本发明也提供了PRMT7抑制剂在疼痛治疗中的新用途和PRMT7作为靶点制备镇痛药物中的应用。

Description

Nav1.9互作蛋白PRMT7及其下调剂在制备镇痛药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，本发明涉及Na_V1.9互作蛋白PRMT7及其下调剂在制备镇痛药物中的用途。

背景技术

疼痛是由伤害感受系统激活所引起。全世界有高达10％的人群正在遭受慢性疼痛困扰，严重地影响了患者的生活质量。目前，镇痛药物按作用机制可分为解热镇痛药和中枢镇痛药。中枢镇痛药物包括阿片类和其他中枢镇痛药物，该类药物主要作用于中枢神经系统，长期使用容易产生依赖、成瘾和耐受；抗炎镇痛药，一般常见的是非甾体类抗炎药(布洛芬、阿司匹林等)，虽可以暂时缓解疼痛，但长期服用会损伤胃肠，肾脏和心血管。因此，筛选理想的镇痛药物靶点显得至关重要。

近年来，电压门控钠离子通道在疼痛信号传导的研究中取得了重要的进展，特别是外周神经系统。而Na_V1.7，Na_V1.8和Na_V1.9在外周神经系统中大量表达，主要调节外周神经元电信号的传导，其中Na_V1.7，Na_V1.8主要形成动作电位的上升支，而Na_V1.9作为阈值通道响应阈下刺激来调节动作电位发放频率。目前已知Na_V1.7功能获得性突变将导致小直径神经纤维痛、红斑性肢痛症等，但功能缺失性突变会导致先天性无痛症，因此研究人员认为Na_V1.7是一个理想的镇痛靶标，后续鉴定出多个Na_V1.7选择性抑制剂，包括蜘蛛毒素，小分子化合物等。然而，在研究中发现Na_V1.7选择性抑制剂在体外实验中具有良好的抑制作用，但在体内其镇痛效果受到限制。而Na_V1.8在疼痛的治疗中，其抑制剂A-803467由于溶解性差和口服生物利用度低进而限制了其利用；而对于其他抑制剂，由于选择性较低以及对其他通道具有抑制作用，因而存在较多的副作用。对于Na_V1.9，目前发现其通过促进钠电导调控静息膜电位，延长神经元对阈值下刺激的去极化反应，进而降低单个动作电位阈值增加重复放电频率。自2013年以来，发现该通道突变与发作性疼痛，内脏痛，先天性无痛等疾病相关联。并且该通道主要在背根神经节中表达，进而响应阈下刺激调节神经元活性，故在疼痛信号传导的起始阶段发挥重要作用。在本发明人针对Na_V1.9为靶点的治疗研究中，发现一种新的蜘蛛毒素HpTx1可以靶向Na_V1.9，遗憾的是HpTx1是Na_V1.9通道的激动剂，不能用来镇痛。

迄今为止，没有发现Na_V1.9通道选择性抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Na_V1.9特异互作的一个新蛋白——精氨酸甲基转移酶PRMT7，其能调节Na_V1.9电流和背根神经节神经元兴奋性的作用。

本发明的目的还在于提供PRMT7下调剂在制备镇痛治疗药物中的新用途，以及PRMT7作为靶点在制备镇痛药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供精氨酸甲基转移酶PRMT7的应用，用于作为缓解或抑制疼痛的靶标；或，作为筛选缓解或抑制疼痛的药物的靶标。

在本发明的另一方面，提供精氨酸甲基转移酶PRMT7的下调剂的应用，用于制备缓解或抑制疼痛的组合物。

在一个优选例中，所述的组合物还用于：抑制精氨酸甲基转移酶PRMT7与钠通道Na_V1.9的相互作用。

在另一优选例中，所述的组合物还用于：抑制钠通道Na_V1.9电流密度增加(降低钠通道Na_V1.9电流密度)，抑制神经元的兴奋性。

在另一优选例中，减少钠通道Na_V1.9的Loop1在细胞膜上的分布。

在另一优选例中，所述抑制精氨酸甲基转移酶PRMT7与钠通道Na_V1.9的相互作用为：抑制精氨酸甲基转移酶PRMT7的C端结构域与钠通道Na_V1.9的Loop1的相互作用。

在另一优选例中，精氨酸甲基转移酶PRMT7与钠通道Na_V1.9的相互作用中，所述精氨酸甲基转移酶PRMT7的C端结构域作用于钠通道Na_V1.9的第563-566位氨基酸以及第519位精氨酸。

在另一优选例中，所述精氨酸甲基转移酶PRMT7的下调剂包括(但不限于)：下调精氨酸甲基转移酶PRMT7活性的物质或下调精氨酸甲基转移酶PRMT7的表达、稳定性或减少其有效作用时间的物质。

在另一优选例中，所述下调剂包括选自(但不限于)：针对精氨酸甲基转移酶PRMT7的化学小分子拮抗剂或抑制剂；干扰或敲除精氨酸甲基转移酶PRMT7的试剂；特异性与精氨酸甲基转移酶PRMT7结合的结合分子(如抗体或配体)；或，干扰精氨酸甲基转移酶PRMT7与效应分子(如其下游蛋白或相互作用蛋白)的相互作用的试剂；较佳地该效应分子为钠通道Na_V1.9，更佳地所述下调剂靶向干扰精氨酸甲基转移酶PRMT7与钠通道Na_V1.9的Loop1的相互作用。

在另一优选例中，所述针对精氨酸甲基转移酶PRMT7的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括(但不限于)：DS-437(CAS No.1674364-87-4)，SGC8158(产品编号Sigma-SML2340)，或其盐、水合物、异构体、类似物或衍生物。

在另一优选例中，所述干扰或敲除精氨酸甲基转移酶PRMT7的试剂包括(但不限于)：特异性干扰精氨酸甲基转移酶PRMT7的编码基因表达的干扰分子，针对精氨酸甲基转移酶PRMT7的CRISPR基因编辑试剂，针对精氨酸甲基转移酶PRMT7的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将精氨酸甲基转移酶PRMT7进行功能丧失性突变，如靶向于其C端结构域进行功能丧失性突变。

在另一优选例中，所述干扰分子包括shRNA，siRNA，miRNA，反义核酸等，或能形成所述siRNA、shRNA，miRNA，反义核酸等的构建体；较佳地，所述的干扰分子为shRNA。

在另一优选例中，所述shRNA包括SEQ ID NO:2所示的正向序列和SEQ ID NO:3所示的反向序列。

在另一优选例中，用于将sgRNA或干扰分子等下调剂引入细胞内的表达构建物(表达载体)包括：病毒载体，非病毒载体；如所述的表达载体包括：腺相关病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体。

在另一优选例中，所述靶向干扰精氨酸甲基转移酶PRMT7与钠通道Na_V1.9的Loop1的相互作用包括：利用同源重组试剂或定点突变试剂对钠通道Na_V1.9的Loop1进行功能丧失性突变；较佳地，将钠通道Na_V1.9的第563-566位氨基酸或第519位精氨酸进行突变(包括点突变、缺失突变或插入突变)。

在本发明的另一方面，提供一种用于缓解或抑制疼痛的药物组合物或药盒，包括：精氨酸甲基转移酶PRMT7的下调剂；较佳地，所述下调剂为干扰分子，所述的干扰分子为shRNA；较佳地，所述shRNA包括SEQ ID NO:2所示的正向序列和SEQ ID NO:3所示的反向序列；或，所述下调剂为针对精氨酸甲基转移酶PRMT7的化学小分子拮抗剂或抑制剂，包括(但不限于)：DS-437，SGC8158，或其盐、水合物、异构体、类似物或衍生物。

在一个优选例中，所述的药物组合物中，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的另一方面，提供一种筛选缓解或抑制疼痛的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达精氨酸甲基转移酶PRMT7；和

(2)检测所述体系中精氨酸甲基转移酶PRMT7的表达或活性；若所述候选物质在统计学上下调(显著下调，如下调10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等，或使之不表达或没有活性)精氨酸甲基转移酶PRMT7的表达或活性，则该候选物质是缓解或抑制疼痛的潜在物质。

在本发明的另一方面，提供一种筛选缓解或抑制疼痛的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)将候选物与精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段相互作用的体系接触；

(2)检测候选物对精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段相互作用的影响；其中，若所述候选物可减弱(优选显著减弱，如减弱20％以上，较佳的减弱50％以上；更佳的减弱80％以上)两者的相互作用，则表明该候选物是缓解或抑制疼痛的物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达精氨酸甲基转移酶PRMT7的细胞或细胞培养物)、亚细胞(培养物)体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述体系为神经细胞(培养物)(如背根神经节细胞或其培养物)体系；步骤(2)还包括：检测所述体系中神经细胞的兴奋性；若兴奋性下降(显著下降，如下降10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等)，则该候选物质是缓解或抑制疼痛的潜在物质；或，步骤(2)还包括：检测神经细胞的细胞膜上的钠通道Na_V1.9的Loop1在细胞膜上的分布，若分布减少(显著减少，如减少10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等)，则该候选物质是缓解或抑制疼痛的潜在物质。

在另一优选例中，检测精氨酸甲基转移酶PRMT7的表达，或检测精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段相互作用的方法包括(但不限于)：Southern印迹法，Western印迹法，DNA序列分析，聚合酶链反应法，免疫共沉淀法，酵母双杂交法。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对PRMT7、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的调控分子或其构建体(如shRNA，siRNA，基因编辑试剂，表达载体，重组的病毒或非病毒构建体等)，化学小分子(如特异性抑制剂或拮抗剂)，相互作用分子等。

在另一优选方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段相互作用的机制或其相互作用位点设计的调控分子或其构建体(如shRNA，siRNA，基因编辑试剂，表达载体，重组的病毒或非病毒构建体等)，化学小分子(如特异性抑制剂或拮抗剂)，相互作用分子等。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制疼痛有用的物质。

在本发明的另一方面，提供一种复合体，其包括精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段，所述精氨酸甲基转移酶PRMT7结合于NaV1.9的Loop1段。

在一个优选例中，所述的复合体用于筛选通过精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段的相互作用而调节疼痛的物质(包括潜在物质)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、酵母双杂交筛选Na_V1.9互作蛋白。A.Na_V1.9通道结构示意图和mNa_V1.9的402-570残基作为酵母双杂交筛选的诱饵；B.酵母双杂交鉴定的Prmt7重复独立克隆的位置(蓝色系，594-692残基)和人的全长PRMT7的同源性比较；C.酵母克隆中纯化mPRMT7 594-692残基验证PRMT7与mLoop1互作；D.用ClustalW比较hLoop1和mLoop1的氨基酸序列。

图2、体内外验证PRMT7与Na_V1.9互作。A.GST-Pull down实验分析hLoop1与hPRMT7互作；B.正反向免疫共沉淀实验检测hLoop1与hPRMT7的相互作用；C.免疫共沉淀验证hPRMT7与hNa_V1.9互作的主要胞内区段；D.CO-IP验证小鼠DRG组织mPRMT7和mNa_V1.9互作；E.小鼠DRG组织mPRMT7和mNa_V1.9定位(比例尺：100μm)。

图3、hPRMT7对hNa_V1.9电流的影响。A-D.mNa_V1.9^-/-小鼠小直径DRG神经元中未转染，电转染hNa_V1.9与mock空载或PRMT7的典型的全细胞钠电流；E.hNa_V1.9电流与电压关系；F.共转染hNa_V1.9与mock或PRMT7后hNa_V1.9平均峰电流密度；G.电转hNa_V1.9与mock或PRMT7后hNa_V1.9激活曲线；H.电转hNa_V1.9与mock或PRMT7后hNa_V1.9稳态快失活曲线。

图4、mPRMT7对小鼠DRG神经元兴奋性的影响。A-B.mNa_V1.9^+/+小鼠DRG神经元电转Mock和Prmt7的动作电位示意图；C.mNa_V1.9^-/-和mNa_V1.9^+/+小鼠DRG神经元电转Mock和Prmt7的动作电位统计分析；D.mNa_V1.9^+/+小鼠DRG神经元电转Mock和Prmt7后静息膜电位(RPM)和动作电位发放的电压阈值(Vthreshold)。

图5、hPRMT7促进hLoop1在细胞膜上分布。A.HA-CD4-hLoop1载体构建示意图；B.非透膜的方式检测HA-CD4-hLoop1表达和定位(比例尺：10μm)；C.检测HA-CD4-hLoop1在细胞膜上分布(Mem：细胞膜，WCL：全细胞裂解液)；D.ImageJ软件定量分析HA-CD4-hLoop1在膜分布；E.ImageJ软件定量分析细胞裂解液中HA-CD4-hLoop1总蛋白表达。

图6、免疫荧光检测PRMT7促进hLoop1在细胞膜上分布。A.HEK293T细胞过表达HA-CD4-hLoop1与GFP-PRMT7或空载GFP检测HA-CD4-hLoop1定位；B.ImageJ软件分析共表达HA-CD4-hLoop1细胞膜上相对平均荧光强度，至少统计100个细胞。

图7、hLoop1与PRMT7结合位点的鉴定。A.SPPIDER软件预测hLoop1区段上PRMT7可能的结合位点；B.hLoop1截短体示意图(+：在QDO培养板酵母可以生长，-：不能生长)；C.hLoop1氨基酸563-572重叠丙氨酸突变体示意图；D.酵母在QDO培养基上不同突变体的生长情况；E.统计分析不同截短体酵母克隆生长数量占比。

图8、PRMT7对Na_V1.9甲基化水平的影响。A.通过免疫共沉淀检测hPRMT7对hLoop1甲基化水平；B.干扰质粒shPRMT7对内源PRMT7表达情况的影响；C.RNA干扰敲低PRMT7表达后对hLoop1甲基化水平检测；D.hLoop1上发生甲基化的潜在精氨酸残基鉴定。

图9、hPRMT7对hNa_V1.9结合位点(hNa_V1.9-4A)和甲基化位点(hNa_V1.9-R519A)突变体通道的影响。A.mNa_V1.9^-/-小鼠DRG神经元电转hNa_V1.9-4A和hNa_V1.9-R519A以及hPRMT7后各突变电流示意图；B.hNa_V1.9-4A和hNa_V1.9-R519A各突变体电流-电压曲线。

图10、DS-437抑制PRMT7活性对mNa_V1.9电流的影响。A-B.mNa_V1.9^+/+小鼠DRG神经元与DS-437处理或者未处理后mNa_V1.9电流示意图；C.mNa_V1.9电流与电压关系；D.mNa_V1.9平均峰电流密度；E.mNa_V1.9激活曲线；F.mNa_V1.9稳态快失活曲线。

图11、DS-437抑制PRMT7活性对mNa_V1.9^+/+和mNa_V1.9^A796G/A796G小鼠DRG神经元兴奋性的影响。A-B.DS-437对mNa_V1.9^+/+和mNa_V1.9^A796G/A796G小鼠DRG神经元动作电位示意图；C.DS-437对mNa_V1.9^+/+和mNa_V1.9^A796G/A796G小鼠DRG神经元动作电位统计分析；D.DS-437对mNa_V1.9^+/+和mNa_V1.9^A796G/A796G小鼠DRG神经元静息膜电位(RPM)和动作电位发放电压阈值(V_threshold)。

图12、PRMT7抑制剂对mNa_V1.9^A796G/A796G小鼠疼痛阈值的影响。A.PRMT7抑制剂对热疼痛阈值的影响；B.PRMT7抑制剂对机械疼痛阈值的影响。

图13、PRMT7抑制剂对5％福尔马林诱导的WT小鼠和mNa_V1.9^A796G/A796G小鼠疼痛阈值的影响。A.45分钟内每隔5分钟内mNa_V1.9^A796G/A796G小鼠舔爪或抬爪的总时间；B.mNa_V1.9^A796G/A796G小鼠福尔马林诱导的两相疼痛分析统计(I相：0-10分钟；II相：10-45分钟)。

具体实施方式

本发明人通过大样本量的分析研究，揭示了一种Na_V1.9特异互作的蛋白——精氨酸甲基转移酶PRMT7，其具有对Na_V1.9的调节活性，能调节背根神经节神经元兴奋性，进而可用作抑制疼痛的靶点。本发明也提供了PRMT7下调剂在疼痛治疗中的新用途和PRMT7作为靶点制备镇痛药物中的应用。

PRMT7与钠通道Na_V1.9相互作用

本发明人通过筛选钠通道Na_V1.9互作蛋白，首次发现PRMT7与钠通道Na_V1.9(尤其是其Loop1)相互作用。在进行深入的研究后，确定了PRMT7可作为疼痛的研究靶点。

本发明人的具体实验工作中，利用酵母双杂交筛选与Na_V1.9互作的蛋白，从而得到与Na_V1.9-Loop1互作的蛋白——PRMT7，且发现其C端结构域与Na_V1.9-Loop1存在相互作用。本发明人分别在体外与体内证实了PRMT7与Na_V1.9-Loop1的相互作用，并且PRMT7与Na_V1.9在DRG组织存在共定位。PRMT7增加Na_V1.9电流和DRG神经元兴奋性，促进hNa_V1.9-Loop1细胞膜上分布。

在PRMT7与hLoop1精细互作位点的鉴定中，本发明人发现hPRMT7与hLoop1上结合的关键氨基酸是hLoop1第563-566位氨基酸Trp、Leu、Cys和Val(WLCV)；并且，hPRMT7对hLoop1上精氨酸进行甲基化修饰，hLoop1的甲基化信号随hPRMT7表达量的增加而增强，R519位的精氨酸残基是hPRMT7的甲基化位点；shPRMT7干扰降低hPRMT7表达，hLoop1的甲基化信号发生显著减弱。hPRMT7增加Na_V1.91.9电流依赖于hLoop1上结合位点和甲基化位点。抑制Prmt7活性显著降低mNa_V1.9电流密度，但不影响mNa_V1.9通道特性。

进一步的研究中，本发明人利用PRMT7的小分子化合物抑制剂来对其进行抑制，结果发现其可以缓解动物的疼痛超敏。因此，PRMT7抑制剂在疼痛治疗中具有治疗用途，并且，PRMT7可作为制备镇痛药物的新型靶点。

本发明中，人源的PRMT7(hPRMT7)的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同。鼠源PRMT7(mPRMT7)的氨基酸序列可以与GenBank登录号NP_663379.1所示的序列基本上相同。应理解，根据需要，本领域技术人员还可应用来自其它物种的PRMT7的同源物。

本发明中，人源的Na_V1.9(hNa_V1.9)的氨基酸序列可以与GenBank登录号NP_001336182.1所示的序列基本上相同。鼠源Na_V1.9(mNa_V1.9)的氨基酸序列可以与GenBank登录号NP_036017.3所示的序列基本上相同。应理解，根据需要，本领域技术人员还可应用来自其它物种的Na_V1.9的同源物。

当被应用于本发明时，所述PRMT7或Na_V1.9可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的PRMT7或Na_V1.9也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组PRMT7或Na_V1.9，以应用于实验或临床。在应用时，可采用重组的PRMT7或Na_V1.9。所述的PRMT7或Na_V1.9包括全长的PRMT7或Na_V1.9或它们任一的生物活性片段。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的PRMT7或Na_V1.9的氨基酸序列也包括在本发明中。PRMT7或Na_V1.9或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种PRMT7或Na_V1.9的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，PRMT7或Na_V1.9的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的PRMT7或Na_V1.9的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长PRMT7或Na_V1.9的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长PRMT7或Na_V1.9的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。较佳地，所述PRMT7的生物活性片段包括PRMT7的C端结构域。较佳地，所述Na_V1.9的生物活性片段包括Na_V1.9的Loop1结构域。

本发明也可采用经修饰或改良的PRMT7或Na_V1.9，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的PRMT7或Na_V1.9。也就是说，任何不影响PRMT7或Na_V1.9的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

本发明所述的PRMT7或Na_V1.9可以构成复合体(蛋白复合体)，优选地为前者的具有活性的C端结构域与后者的Loop1区相互作用(结合)而形成的复合体，用于：作为调节(较佳地为缓解或抑制)疼痛的靶标，制备调节疼痛的药物；作为筛选调节疼痛的靶标，筛选调节疼痛的药物等。

PRMT7下调剂或PRMT7与Na_V1.9相互作用的下调剂及其应用

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种PRMT7或其编码基因的下调剂的用途，用于制备缓解或抑制疼痛的组合物。

如本文所用，所述的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”等，是指具有统计学意义的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。如与对照组相比，显著“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”；更具体例如20％以上、较佳的50％以上、更佳的80％以上的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。

如本文所用，所述的“下调剂”包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等，这些术语可互换使用。

所述的PRMT7或其编码基因的下调剂是指任何可降低PRMT7的活性、降低PRMT7或其编码基因的稳定性、下调PRMT7的表达、减少PRMT7有效作用时间、或抑制PRMT7基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调PRMT7有用的物质，从而可用于抑制疼痛。例如，所述的下调剂是：特异性干扰PRMT7基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；是特异性与PRMT7基因编码的蛋白结合的抗体或配体；等等。

作为本发明的一种优选方式，所述的下调剂是针对PRMT7的小分子化合物。本领域技术人员可以采用适于小分子化合物的筛选的方法，来进行这类小分子化合物的筛选。所述的筛选可以依托本领域现有的或将要开发的各种化合物库，或自行建立一些新化合物库。

作为本发明的优选方式，所述的小分子化合物是DS-437。DS-437是双重蛋白精氨酸甲基转移酶PRMT5/7抑制剂，其对PRMT5和PRMT7具有选择性。DS-437是SAM竞争性抑制剂。但是，其尚未被应用于抑制疼痛相关的治疗方案中。本发明首次揭示DS-437在缓解或治疗疼痛中的作用。DS-437的结构式如下：

作为本发明的优选方式，所述的小分子化合物是SGC8158，其尚未被应用于抑制疼痛相关的治疗方案中。本发明首次揭示SGC8158在缓解或治疗疼痛中的作用。SGC8158的结构式如下：

在本发明中，所述的小分子化合物(如DS-437或SGC8158)可以是纯净形式存在的化合物，或纯度大于85％(较佳地大于90％，例如大于95％，98％，99％)的化合物。在得知其化学结构的情况下，所述的小分子化合物可通过化学合成的方式获得。本发明还包括化合物的前体，所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有活性的该化合物。

本发明还包括上述DS-437或SGC8158的异构体、溶剂合物，或它们的药学上可接受的盐，只要它们也具有与DS-437或SGC8158具有相同或基本相同的功能。所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

作为本发明的一种优选方式，所述的下调剂可以是PRMT7特异性的干扰RNA分子(如siRNA、shRNA、miRNA等)，本领域人员可以理解到，根据本发明中提供的PRMT7序列信息，可以制备获得此类干扰RNA分子。对干扰RNA分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。所述的干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

在一些实施例中，RNAi用于抑制PRMT7。RNAi是一种进化上保守的细胞防御机制，用于控制包括人在内的大多数真核生物中外源基因的表达。RNAi通常由双链RNA(dsRNA)触发，并引起单链靶RNA的序列特异性mRNA降解。mRNA降解的介体是小干扰RNA双链体(siRNAs)，通常由长dsRNA在细胞内酶切产生。siRNAs的长度通常约为21个核苷酸(例如21-23个核苷酸)。在将小RNA或RNAi导入细胞后，据信该序列被传递到称为RISC(RNA诱导沉默复合物)的酶复合物。RISC识别目标并用核酸内切酶切割它。值得注意的是，如果较大的RNA序列被传递到细胞，RNA酶III酶(Dicer)会将较长的dsRNA转化为21-23nt的ds-siRNA片段。

在优选的实施例中，利用shRNA技术进行干扰作用。shRNA是一种RNA序列，它可以使一个紧密的发夹旋转，可以用来沉默基因表达通过RNA干扰。shRNA使用导入细胞的载体并利用启动子(如U6)来确保shRNA始终被表达。这种载体通常传递给子细胞，使基因沉默得以遗传。shRNA发夹结构被细胞机制切割成siRNA，然后与RNA诱导沉默复合物(RISC)结合。这种复合物结合并切割与它结合的siRNA相匹配的mRNAs。shRNA由RNA聚合酶III转录。

最为优选地，所述的干扰分子为shRNA；较佳地，所述shRNA包括SEQ ID NO:2所示的正向序列和SEQ ID NO:3所示的反向序列。所述的shRNA提供了适当的敲低效果，其可显著地降低hLoop1的甲基化信号，从而可实现对疼痛的显著缓解或抑制。

作为可选的实施方式，使用与编码PRMT7的一个或多个核酸特异性杂交的反义化合物来调节PRMT7表达。寡聚物与其靶核酸的特异性杂交干扰了核酸的正常功能。这种通过与靶核酸特异性杂交的化合物对靶核酸功能的调节通常被称为“反义”。

作为本发明的一种可选的方式，可采用CRISPR/Cas(如Cas9)系统进行靶向的基因编辑，从而在靶向疾病的区域敲除PRMT7基因。常见的敲除PRMT7基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9 mRNA。

作为本发明的一种可选的方式，可采用同源重组的方法，特异性地靶向于PRMT7，使之发生表达缺陷或缺失表达。也可应用Cre和loxp方法使动物或细胞的基因组中相关基因选择性的敲除，表达降低或失活。

以上为一些代表性的下调PRMT7的方式，应理解，本发明提供了一种全新的靶点，在本领域技术人员了解了本发明的总体方案后，还可以采取本领域已知的其它方法或正在发展的方法来对PRMT7进行调控，这些方法也包含在本发明中。

PRMT7与Na_V1.9作为药物筛选靶点

在得知了所述的PRMT7与Na_V1.9的功能和作用机制后，可以基于该特征来筛选抑制PRMT7与Na_V1.9相互作用的物质，所述物质对于缓解或抑制疼痛具有积极作用。

基于本发明人的新发现，一方面，本发明提供一种筛选缓解或抑制疼痛的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达精氨酸甲基转移酶PRMT7；和(2)检测所述体系中精氨酸甲基转移酶PRMT7的表达或活性；若所述候选物质在统计学上下调精氨酸甲基转移酶PRMT7的表达或活性，则该候选物质是缓解或抑制疼痛的潜在物质。

另一方面，本发明提供一种筛选缓解或抑制疼痛的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)将候选物与精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段相互作用的体系接触；(2)检测候选物对精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段相互作用的影响；其中，若所述候选物可减弱两者的相互作用，则表明该候选物是缓解或抑制疼痛的物质。

作为本发明的优选方式，在检测PRMT7与Na_V1.9相互作用的同时，还包括检测所述体系中神经细胞的兴奋性，若兴奋性下降，则该候选物质是缓解或抑制疼痛的潜在物质。

作为本发明的优选方式，在检测PRMT7与Na_V1.9相互作用的同时，还包括检测神经细胞的细胞膜上的钠通道Na_V1.9的Loop1在细胞膜上的分布，若分布减少，则该候选物质是缓解或抑制疼痛的潜在物质。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到PRMT7本身或其与Na_V1.9相互作用的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达PRMT7 Na_V1.9的体系。

所述的表达PRMT7的体系、表达PRMT7与Na_V1.9相互作用的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达PRMT7和/或Na_V1.9的细胞；或可以是重组表达PRMT7和/或Na_V1.9的细胞。所述的表达PRMT7和/或Na_V1.9的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于缓解或抑制疼痛真正有用的物质。

本发明对于PRMT7与Na_V1.9的表达、活性、存在量、相互作用的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的基因/蛋白定量或半定量检测技术、酶催化反应等，例如(但不限于)：免疫共沉淀、SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA，聚合酶链式反应技术(PCR)，Northern印迹法等等。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的化合物、生物大分子、组合物或药物，或一些潜在物质。一些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于缓解或抑制疼痛等真正有用的物质，从而用于临床。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的0.0001-10wt％)的所述的PRMT7或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。

在本发明的优选方式中，所述的下调剂包括但不限于：敲除或沉默PRMT7的试剂，特异性与PRMT7结合的结合分子(如抗体或配体)，针对PRMT7的化学小分子拮抗剂或抑制剂，等等。在更具体的方式中，所述的下调剂包括但不限于：针对PRMT7的CRISPR基因编辑试剂，特异性干扰PRMT7的编码基因表达的干扰分子，针对PRMT7或其效应分子(如钠通道Na_V1.9或其Loop1段)的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将PRMT7进行功能丧失性突变。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

在得知了所述PRMT7或其编码基因的下调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物或人。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将PRMT7的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带PRMT7的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的PRMT7下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明所述的PRMT7或其编码基因的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的PRMT7或其编码基因的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W^2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m²计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解的是，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。

本发明还提供了含有所述的药物组合物或直接含有所述的PRMT7或其编码基因的下调剂的药盒。此外，所述的药盒中还可包括说明药盒中药物的使用方法的说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、酵母双杂交筛选Na_V1.9特异互作的蛋白及其互作验证

(1)载体构建

本发明人将小鼠Na_V1.9(GenBank登录号：NP_036017.3)第一个胞内环(氨基酸402-570)亚克隆到pGBKT7载体中，进行酵母双杂交筛选实验；将人Na_V1.9(GenBank登录号：NP_001336182.1)第一个胞内环构建到pGEX-6P-1载体进行GST融合蛋白表达；FLAG和EGFP标签融合蛋白通过p3×FLAGCMV-7.1和pEGFP-C1载体构建。载体构建步骤如下：

引物设计：通过分析基因序列，加入限制性内切酶位点来设计引物而扩增目的片段。利用限制性内切酶位点进行酶切目的片段和载体，然后T4连接酶连接到特定载体上。

PCR扩增目的片段：根据目的基因表达的细胞系cDNA或含有目的基因DNA质粒作为模板进行扩增目的片段(高保真DNA聚合酶KOD-Plus反应体系)。

目的片段胶回收纯化：目的片段通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，然后割取目的条带胶块，根据PCR产物回收试剂盒(生工)实验流程进行。

目的片段和空载体双酶切：回收后目的片段及空载使用相对应的限制性内切酶进行双酶切，酶切体系及条件参考说明书(NEB)。

双酶切产物纯化和连接：通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，然后割取目的条带胶块，回收酶切后的目的片段和空载，T4连接酶体系及条件根据说明书(ThermoFisherscientific)。

大肠杆菌转化：将上步获得的连接产物加入到DH5α大肠杆菌感受态细胞后混匀，冰上静置30分钟，然后42℃水浴热激90s，取出后立即放置冰上3分钟，之后加500μL无抗生素的LB培养基，37℃摇床120rpm/min培养60分钟进行复苏菌体，然后3000rpm/min离心3分钟，弃部分上清后将剩余菌体涂到对应抗性的LB固体平板上，37℃培养箱中培养过夜。

菌液PCR鉴定：挑取部分单克隆于对应抗性的LB液体培养基中，37℃摇床220rpm/min培养4小时左右，之后进行菌液PCR筛选阳性克隆，最后送公司测序保证序列正确。

(2)酵母双杂交筛选小鼠DRG组织cDNA文库

首先构建pGBKT7-mLoop1“诱饵”载体，转化酵母AH109菌株，检测诱饵蛋白的表达情况，对宿主细胞的生长有无毒性作用以及能否激活自身报告基因表达。

采用SMART^TM III技术构建文库(Clontech Laboratories，Inc)，构建小鼠背根节(Dorsal root ganglia，DRG)组织cDNA酵母文库。酵母转化方法为：聚乙二醇/醋酸锂(PEG/LiAc)法(PT3024-1，Clontech Laboratories，Inc)。

酵母感受态制备：挑取相应固体培养板上直径2～3mm的酵母单克隆，放入3～5mL对应的液体培养基中过夜活化；取适量菌液加入到新鲜的扩大培养基中，使菌液的最终OD600值在0.2～0.3之间置于摇床中培养；当OD600达到0.4～0.6时，无菌条件下收集酵母菌体，并用无菌水清洗一次；然后加入适量的TE/LiAc轻轻重悬后，完成酵母感受态的制备。

转化过程：将质粒和转化试剂混合，加入适量的酵母感受态细胞进行转化；最后将含有质粒的酵母涂布于相应的固体培养板上观察酵母生长状况。

筛选方法：pGBKT7质粒含有GAL4启动子结合结构域和色氨酸(Trp)营养标记，酵母转化该质粒可在色氨酸缺陷的培养板上生长。pGADT7质粒含有GAL4的激活结构域和亮氨酸(Leu)营养标记，酵母转化该质粒可在色氨酸缺陷的培养板上生长。酵母AH109菌株，基因组上GAL4启动子可表达报告基因组氨酸(His)、腺嘌呤(Ade)、分泌型半乳糖苷酶(MEL)。pGBKT7和pGADT7上分别表达的融合蛋白若存在相互作用，则会激活GAL4下游基因表达，酵母就能在缺乏色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)的培养基上生长，半乳糖苷酶能与X-α-Gal底物作用显蓝色。

(3)细胞培养和转染

HEK293T细胞被用来进行体外实验。HEK293T细胞通过含10％胎牛血清(Gbico)的高糖DMEM培养基，37℃，5％CO₂条件下培养。细胞传代：细胞长密度后弃旧培养基，然后加入灭菌的PBS清洗细胞，弃PBS后加入适当体积的胰酶进行消化。消化好后加等体积含有10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞，收集到无菌离心管中1000g离心3min。弃上清，加入新鲜的培养基轻轻吹打重悬细胞，以适当的传代比例接种到培养皿中，继续培养。HEK293T细胞转染：转染之前使细胞密度达到90％左右，取适量的无血清DMEM培养基，分别稀释高纯质粒和相应量(1μg:2μL)脂质体LipoJet Transfection Reagent(SignaGen)，各自混匀后静置5min，然后将稀释的脂质体加入到稀释质粒中混合，室温静置15min后加入到细胞中，最后轻轻混匀。然后在培养箱中继续培养24～48h后进行实验。

(4)免疫共沉淀和免疫印迹

转染细胞弃去培养基，加入1mL预冷的PBS轻轻洗细胞两次。然后加入1mL细胞裂解液(碧云天)重悬细胞，置于冰上裂解30分钟，使用200W细胞超声破碎2s，2-3次，然后4℃，12000rpm/min，离心10分钟。收集上清到另一1.5mL管中。从上清中吸取100μL作为阳性对照(Input)，剩余上清等体积分成两管，分别加入2μg相应抗体和等量相对应抗体来源种属的IgG进行免疫共沉淀，置于4℃翻滚摇床过夜孵育抗体。抗体孵育后，加入70μL Prorein A琼脂糖珠子(Merck Millipore)，4℃孵育4小时，紧接着500g/min，离心30s，弃上清后加500μL细胞裂解液洗涤珠子3次。最后每个样品中加入100μL 2×Loading buffer，吹打混匀后沸水处理7分钟，置于冰上或者-20℃保存待用。然后配置10％聚丙烯酰胺凝胶，对处理好的蛋白样品进行电泳，55V恒压使蛋白分子量标准条带出现分离，然后110V恒压电泳使蛋白分开。电泳之后。200mA恒流湿式转膜至硝酸纤维素膜。之后使用5％脱脂牛奶室温封闭2小时，然后加入3％BSA稀释的一抗，4℃摇床过夜。次日使用TBST洗膜，12分钟/次，3次；最后室温条件下孵育5％脱脂牛奶稀释的同属HRP标记的二抗2小时，最后使用TBST洗膜，12分钟/次，3次；然后使用ECL免疫印迹化学发光底物(Merck Millipore)进行暗室压片显影检测。抗体信息如下：mouse anti-HA抗体(AE008，Abclonal)，mouse anti-GFP抗体(AE012，Abclonal)，rabbit antiPRMT7(A12159，Abclonal)，mouse anti-FLAG抗体(M185-3 L，MBL)，rabbit anti-Na_V1.9抗体(ASC-017，Alomone Labs)，rabbit anti-methyl(mono)arginine抗体(ICP0801，ImmuneChem)，control mouse IgG和rabbit IgG(B900620，30000-0-AP，ProteinTech)。

(5)融合蛋白沉降

GST融合蛋白在原核菌株中的诱导表达，首先pGEX-6P-1-hLoop1和pGEX-6P-1空载转化Rosseta大肠杆菌表达菌株，挑取单克隆到3mL氨苄抗性液体LB培养基中，37℃，220rpm/min摇床过夜培养。然后以1:100的比例接种于20mL培养基中扩大培养，当OD600达到0.6-0.8，使用不同终浓度IPTG和不同温度进行诱导表达。收集菌体后加入含PMSF蛋白酶抑制剂的PBS后置于冰上进行超声破碎。最后取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过考马斯亮蓝染色检测融合蛋白的表达水平，确定融合蛋白的最优表达条件。然后在最佳条件下表达GST/GST-hLoop1蛋白，先收集20mL表达融合蛋白的菌体，加预冷PBS洗涤2次，然后加入3mL含PMSF蛋白酶抑制剂的PBS重悬菌体，冰上200W/3s～3s超声破碎15分钟，12000rpm/min离心10分钟，然后加入适量谷胱甘肽琼脂糖珠(Thermo Scientific)4℃摇床孵育4小时，然后4℃，500g/min离心30秒，弃上清，加PBS进行洗涤珠子3次。进而得到纯化的融合蛋白，最后与表达PRMT7的细胞裂解后进行4℃摇床过夜。随后4℃，500g/min离心30秒，洗涤珠子3次，加入适量的2×Loading buffer沸水处理7分钟，置于4℃或-20℃保存待用。

(6)组织切片免疫荧光

收集小鼠DRG置于PBS中清洗，然后使用4％多聚甲醛4℃固定过夜；然后用PBS洗涤，加20％～30％的蔗糖进行脱水至组织沉降到管底；接着冰冻切片，厚度为12μm，片子可-20℃冰箱长期保存。免疫荧光实验时，组织切片通过EDTA(pH＝8.0)抗原修复液进行微波修复抗原，低火10min抗原修复，自然冷却后PBS中洗涤3次，5分钟/次。切片稍微晾干后，用组化笔在组织周围画圈，便于抗体孵育，然后加入含3％BSA和0.1％Triton X-100的PBS室温封闭1小时，弃封闭液，加入用0.1％TritionX-100和1％BSA PBS稀释的对应一抗，4℃湿盒孵育过夜；弃一抗，切片PBS中洗涤3次，5分钟/次，然后加入相应种属的二抗，避光室温孵育1小时，弃二抗，用PBS洗涤3次，5分钟/次，DAPI染核，避光室温孵育5min；切片PBS中洗涤3次，5分钟/次；最后抗荧光淬灭剂封片。样品制备好后通过Olympus FluoView 1000扫描共聚焦显微镜进行观察成像。

2、hPRMT7在hLoop1上互作位点和甲基化位点鉴定

(1)hPRMT7序列

hPRMT7的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

MKIFCSRANPTTGSVEWLEEDEHYDYHQEIARSSYADMLHDKDRNVKYYQGIRAAVSRVKDRGQKALVLDIGTGTGLLSMMAVTAGADFCYAIEVFKPMADAAVKIVEKNGFSDKIKVINKHSTEVTVGPEGDMPCRANILVTELFDTELIGEGALPSYEHAHRHLVEENCEAVPHRATVYAQLVESGRMWSWNKLFPIHVQTSLGEQVIVPPVDVESCPGAPSVCDIQLNQVSPADFTVLSDVLPMFSIDFSKQVSSSAACHSRRFEPLTSGRAQVVLSWWDIEMDPEGKIKCTMAPFWAHSDPEEMQWRDHWMQCVYFLPQEEPVVQGSALYLVAHHDDYCVWYSLQRTSPEKNERVRQMRPVCDCQAHLLWNRPRFGEINDQDRTDRYVQALRTVLKPDSVCLCVSDGSLLSVLAHHLGVEQVFTVESSAASHKLLRKIFKANHLEDKINIIEKRPELLTNEDLQGRKVSLLLGEPFFTTSLLPWHNLYFWYVRTAVDQHLGPGAMVMPQAASLHAVVVEFRDLWRIRSPCGDCEGFDVHIMDDMIKRALDFRESREAEPHPLWEYPCRSLSEPWQILTFDFQQPVPLQPLCAEGTVELRRPGQSHAAVLWMEYHLTPECTLSTGLLEPADPEGGCCWNPHCKQAVYFFSPAPDPRALLGGPRTVSYAVEFHPDTGDIIMEFRHADTPD(692aa)

(2)载体构建

构建hLoop1两端(N/C端)各缺失20和40个氨基酸的系列突变体pGADT7-hLoop1(Δ404-423/Δ404-443/Δ533-572/Δ553-572)；构建了hLoop1 C端缺失10个氨基酸的突变体pGADT7-hLoop1(Δ563-572)；构建酵母杂交载体pGADT7-hLoop1(563-566A/565-568A/567-570A/569-572A)，被用来鉴定hPRMT7在hLoop1上互作位点。pSIH1-H1-CopGFP-shRNA构建PRMT7基因RNA干扰实验载体，其中：

PRMT7 shRNA正向：5’-gatccggatgcagtgtgtgtacttccttcaagagaggaagtacacacactgcatcctttttg-3’(SEQ ID NO:2)；

PRMT7 shRNA反向：5’-aattcaaaaaggatgcagtgtgtgtacttcctctcttgaaggaagtacacacactgcatccg-3(SEQ ID NO:3)；

构建hLoop1-R519A，R521A和“R519A/521A(双突变)”突变体被用来鉴定hLoop1甲基化位点。

(3)酵母双杂交鉴定互作位点

将上述载体转化酵母，分析酵母在营养缺陷的培养基平板上生长情况，具体方法同前所述。

(4)鉴定hPRMT7在hLoop1甲基化位点

转染GFP-hPRMT7和FLAG-hLoop1载体，RNA干扰载体或者hLoop1-R519A，R521A和R519A/521A突变体后，通过免疫共沉淀和免疫印迹进行检测甲基化水平。

3、检测hPRMT7调节hLoop1在细胞膜上分布

(1)细胞培养和传染，同前所述；

(2)提取细胞膜和细胞质蛋白：24小时后收集转染的细胞，通过细胞膜蛋白与浆蛋白抽提试剂盒(P0033，碧云天)进行分离细胞膜和细胞质蛋白。最后通过免疫印迹进行检测。

(3)细胞免疫荧光实验：第一天将适量细胞接种到玻底皿中，过夜培养后转染质粒，转染24小时后进行实验。24小时后，弃培养基，用PBS洗细胞2次，然后加入4％多聚甲醛室温固定15分钟；PBS洗3次，5分钟/次。进行非透膜孵育抗体，直接加入5％BSA的PBS封闭1小时，弃封闭液，然后加入1％BSA稀释的相应抗体，4℃过夜。吸掉一抗，PBS洗涤3次，5分钟/次，然后加入1％BSA稀释的荧光二抗，室温2小时。2小时后弃二抗，PBS洗涤3次，5分钟/次，之后加入5μg/mL DAPI工作液室温5分钟。最后PBS洗涤3次，5分钟/次，加200μL 50％甘油PBS避光保存。样品制备好后通过Olympus FluoView 1000扫描共聚焦显微镜进行观察成像。

4、hPRMT7对hNa_V1.9电流调节

(1)载体构建

PRMT7基因克隆到pIRES2-EGFP载体，SCN11A基因构建到pcDNA3.1载体，被用来电转进行膜片钳记录；鼠Prmt7基因(GenBank登录号NP_663379.1)克隆到pcDNA3.1载体电转小鼠DRG神经元检测动作电位发放。构建方法同前所述

(2)小鼠DRG细胞分离及电转

细胞爬片包被：将泡在无水乙醇中的8mm×8mm玻片用镊子取出，于火焰上燃烧酒精，置于培养皿中，然后用poly-l-lysine(0.1％)包被玻片。待DRG细胞进行消化时将poly-l-lysine移除，然后用ddH₂O清洗玻片2遍，晾干后方可使用。

DRG分离：取4-6周C57BL/6J小鼠一只，腹腔注射水合氯醛进行麻醉。完成后，用酒精对小鼠皮肤进行消毒，严格按照无菌操作要求小鼠胸腰段脊柱，然后用小剪刀沿脊柱纵向剪开两端，使用预冷的PBS溶液洗去血液。然后放置于预冷的DMEM-F12培养基中，去除脊柱中白色的脊髓及被膜，暴露椎间孔中的背根神经节，用镊子将神经节挑出，置于DMEM-F12中。在体式显微镜下用眼科剪剪去DRG上附着的神经纤维、结缔组织膜和血块。弃掉培养基，然后将修剪好的DRG神经节剪碎，转移至1.5mL离心管中，加入1mL酶液(trysin I：0.3mg/mL和collagenase II：1mg/mL)，放入37℃培养箱中消化30min。消化过程中要摇晃数次。消化结束后，轻轻吸出上清，加入1mL DMEM-F12+10％FBS培养基终止消化，然后1000g/min离心3min，移出上清。加入600μL DMEM-F12+10％FBS培养基并进行吹打，直至组织块消失溶液变得浑浊。

电转：将上述细胞悬浮液1000g/min离心3分钟，弃上清，然后加入100μL buffer R重悬细胞。hNav1.9质粒和空载或实验组按照10:2的比例加入含有DRG细胞悬浮液中，使用Neon transfection system(Invitrogen)进行电转染，电转程序为1200V，20ms。转染后加入500μL DMEM-F12+10％FBS培养基，充分混匀后将细胞铺到多聚赖氨酸包被的细胞爬片上，放入37℃培养箱中静止1小时，然后加入完全培养基置于细胞培养箱中培养，培养36小时后进行电生理实验。

(3)膜片钳记录

电压钳记录，电极电阻为3-5MΩ，使用Axopatch 200b放大器进行记录。电极内液：135mM CsF，10mM NaCl，2.5mM MgCl₂，10mM HEPES，1mM EGTA，5mM TEA-Cl，和4mM Mg-ATP(pH＝7.4，用CsOH调节pH)，外液：140mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl₂，10mM HEPES，0.1mMCdCl₂，20mM TEA-Cl，0.001mM TTX，和10-30mM glucose(pH＝7.4，用NaOH调节pH)。电转质粒培养36小时后，选取有绿色荧光的小直径DRG神经细胞，钳制电压为-120mV，然后给予时长200ms的一系列-120～-10mV，增量为5mV的电压脉冲刺激。测量各电压下电流峰值。激活曲线由玻尔兹曼方程G/Gmax＝1/(1+exp[(V_1/2-Vm)/k])进行拟合，其中G是电压依赖的钠电导，Gmax是最大电导，V_1/2是电导(G)值为最大电导值(Gmax)一半时的电压，k是影响激活速率的因子，反映G-V曲线的斜率；稳态快失活曲线，首先500ms的一系列-120～0mV，增量为10mV的电压脉冲刺激，随后由-50mV电压诱发电流，曲线通过I/Imax＝1/(1+exp[(Vm–V_1/2)/k])进行拟合得到。

电流钳记录，电极内液：140mM KCl，0.5mM EGTA，5mM HEPES，和2mM Mg-ATP(pH＝7.3，用KOH调节)，并用葡萄糖将溶液渗透压调为315mOsm/L。外液：140mM NaCl，3mM KCl，2mM MgCl₂，2mM CaCl₂，10mM HEPES(pH＝7.3，用NaOH调节)。注入时长为500ms的一系从0～225pA，增量为25pA的电流。记录神经元细胞动作电位发放，统计分析静息膜电位和动作电位电压阈值。

5、PRMT7抑制剂DS-437对Na_V1.9电流，DRG神经元兴奋性和Na_V1.9^A796G/A796G小鼠镇痛的影响

(1)药物处理

DS-437通过DMSO配制成100mM母液，SGC8158通过DMSO配制成20mM母液，置于-20℃保存。分离小鼠背根神经节神经元，分离的神经元与100μM(使用10％FBS高糖DMEM培养基配制)DS-437在细胞培养箱中共孵育1小时；对照组通过含千分之一DMSO的10％FBS高糖DMEM培养基在细胞培养箱中共孵育1小时，之后进行膜片钳记录。

(2)膜片钳记录，同前所述

(3)福尔马林测试

8周大Na_V1.9^A796G/A796G小鼠(参见Pain，2020Jul；161(7):1470-1482.doi:10.1097/j.pain.0000000000001853)和WT小鼠被用来进行福尔马林测试，实验前半小时将小鼠放置在测试笼中适应环境。之后腹腔注射1.6mg/kg、0.8mg/kg DS-437，1.4μg/kg SGC8158或者等量的溶剂，等待1小时后，后爪皮下注射20μL 5％福尔马林溶液，然后记录小鼠45分钟内舔爪和抬爪的时间，每隔5分钟记录一个数据点。最后以0-10分钟为I相，15-45为II相进行统计分析。舔爪和抬爪的时间长/频繁表示小鼠对疼痛敏感。该实验为双盲实验。

(4)热板实验和vonfrey测痛

8周大Na_V1.9^A796G/A796G小鼠和WT小鼠被用来进行福尔马林测试，实验前半小时将小鼠放置在测试笼中适应环境。先进行测试小鼠基础疼痛阈值，之后腹腔注射1.6mg/kg,0.8mg/kg DS-437，1.4μg/kg SGC8158或者等量的溶剂，在注射1小时和2小时检测小鼠热疼痛阈值和机械疼痛阈值。热疼痛阈值：将热板调至52℃，将小鼠放置到热板时开始计时，待小鼠抬爪，退缩或者舔爪时停止计时，该时长则反应对热刺激的敏感性，每只小鼠测试3次；机械疼痛阈值：将小鼠放置在铁网上，通过vonfrey测痛仪up-down方式选择不同纤维丝刺小鼠后爪持续5s，小鼠抬爪证明对刺激敏感，每只小鼠测量3次。

实施例1、酵母双杂交筛选与Na_V1.9互作的蛋白

本发明人构建了小鼠DRG神经元cDNA文库，通过鼠源Na_V1.9(mNa_V1.9)第一个胞内结构域(Loop1)作为“诱饵”(图1A)，筛选与mNa_V1.9-Loop1互作的蛋白。经过大量研究筛选工作，本发明人筛选得到与mNa_V1.9-Loop1互作的蛋白——精氨酸甲基转移酶PRMT7，且其C端结构域与mNa_V1.9-Loop1存在相互作用(图1B，C)。

根据序列比较结果，mNa_V1.9-Loop1与人Na_V1.9-Loop1(hNa_V1.9-Loop1)序列相似性达到93.5％(图1D)。

因此，本发明人后续验证人PRMT7(hPRMT7)与hNa_V1.9-Loop1互作及功能。

实施例2、体外与体内验证PRMT7与Na_V1.9-Loop1互作

本发明人进行了GST-Pull down实验，如图2A；以及进行了正反向免疫共沉淀(CO-IP)实验，如图2B。该结果证实，Na_V1.9-Loop1(hLoop1)能够与hPRMT7发生相互作用。

进一步的实验证明，hPRMT7仅与hLoop1互作，而不是Na_V1.9的N端，C端和hLoop2，如图2C。

本发明人进行了体内实验，小鼠DRG组织中也证明PRMT7与Na_V1.9的内源性互作，如图2D。

本发明人进行了免疫荧光实验，结果证实PRMT7与Na_V1.9在小鼠DRG组织存在共定位，如图2E。

实施例3、PRMT7增加Na_V1.9电流和DRG神经元兴奋性

本发明人在Na_V1.9^-/-小鼠DRG神经元中电转PRMT7和SCN11A质粒检测Na_V1.9电流，发现hPRMT7明显地使Na_V1.9电流密度增加(Mock+hNa_V1.9:-51±5.86pA/pF，n＝13；hPRMT7+hNa_V1.9:-122±22.1pA/pF，n＝15)，如图3A-E；但不影响Na_V1.9通道激活曲线和稳态快失活，如图3F，G，H。

此外，本发明人在Na_V1.9^+/+小鼠和Na_V1.9^-/-小鼠DRG神经元中电转Prmt7质粒检测DRG神经元兴奋性。结果表明，mPRMT7使Na_V1.9^+/+小鼠DRG神经元动作电位发放频率增加，如图4A-C；但不影响动作电位电压阈值和DRG神经元静息膜电位，如图4D。反之，mPRMT7不影响Na_V1.9^-/-小鼠DRG神经元动作电位发放频率，如图4C。

该结果证明，在小鼠DRG神经元mPRMT7只通过调节Na_V1.9而影响神经元兴奋性。

实施例4、hPRMT7促进hNa_V1.9-Loop1细胞膜上分布

上述实验证明了PRMT7增加Na_V1.9电流，而电流密度的增加一般取决于通道蛋白在细胞膜上的分布，因此本发明人进一步探索hPRMT7对hNa_V1.9-Loop1(hLoop1)细胞膜上分布的影响。

首先，本发明人构建了膜报告分子嵌合载体pcDNA3.1-HA-hCD4-hLoop1。人源CD4(hCD4)是一个编码458个氨基酸的I型单次跨膜蛋白(GenBank登录号NP_000607.1中第1～458位)。该蛋白前25个氨基酸为信号肽，397-458位氨基酸位于细胞质内。以pcDNA3.1载体为骨架，用hLoop1区段取代hCD4的胞质片段(即其397-458位)，后在hCD4的信号肽与成熟蛋白之间插入HA标签，便于嵌合蛋白的检测，最终形成嵌合蛋白HA-hCD4-Loop1，如图5A，B。

然后，本发明人将pcDNA3.1-HA-hCD4-hLoop1质粒分别与pEGFP-C1空载和pEGFP-PRMT7质粒共同转染到HEK293T细胞中，进行细胞质和细胞膜组分分离，检测不同组分中蛋白表达，以Na⁺/K⁺-ATPase为膜蛋白内参。结果发现，过表达PRMT7能够显著地增加HA-hCD4-Loop1在细胞膜中分布，如图5C，D；但是细胞裂解液中PRMT7蛋白表达没有影响，如图5E。

同时，本发明人通过免疫荧光实验证明，PRMT7能够增加HA-hCD4-Loop1在细胞膜上分布，如图6A，B。

这些结果表明，PRMT7促进HA-hCD4-Loop1在细胞膜上的分布，但不影响细胞中HA-hCD4-Loop1的表达水平。

实施例5、hPRMT7与hLoop1精细互作位点鉴定

本发明人通过生物信息学工具预测了hLoop1氨基酸序列中易于与其他蛋白发生结合的区域，如图7A。

之后，本发明人构建了hLoop1两端(N/C端)各缺失20和40个氨基酸10个氨基酸的系列突变体。结果发现，hLoop1 C末端563-572位氨基酸对其与hPRMT7-C的互作至关重要，如图7B。

进一步地，本发明人对hLoop1的563-572位氨基酸进行了重叠丙氨酸突变，发现hLoop1第563-566氨基酸对两者互作起关键作用，如图7C-E。

以上实验证实，hPRMT7与hLoop1上结合的关键氨基酸是hLoop1第563-566位氨基酸Trp、Leu、Cys和Val(WLCV)。

实施例6、hPRMT7对hLoop1上精氨酸进行甲基化修饰

本发明人利用HEK293T细胞过表达hPRMT7和hLoop1，检测hPRMT7对hLoop1甲基化水平。结果发现，hLoop1的甲基化信号随hPRMT7表达量的增加而增强，如图8A。

本发明人利用shPRMT7，通过RNA干扰降低hPRMT7表达，如图8B。结果发现，hLoop1的甲基化信号发生显著减弱，如图8C。

由于PRMT7偏好性地识别底物上的RXR基序，而loop1区段中存在一个R⁵¹⁹QR⁵²¹基序。本发明人的测定结果显示，无法检测到R519A和R519A/521A突变体甲基化信号，可检测到R521A突变体甲基化信号，但都能检测GFP-hPRMT7融合蛋白，表明R519位的精氨酸残基是hPRMT7的甲基化位点，且精氨酸位点的改变不影响hLoop1与hPRMT7的结合，如图8D。

实施例7、hPRMT7增加Na_V1.9电流依赖于hLoop1上结合位点和甲基化位点

由于PRMT7通过与Na_V1.9互作和甲基化调节其电流密度，因此本发明人构建了PRMT7结合位点突变体hNa_V1.9-4A(563-566A)和甲基化位点突变体hNa_V1.9-R519A。然后电转Na_V1.9^-/-小鼠DRG神经元。结果发现，hNa_V1.9-4A和hNa_V1.9-R519A突变体本身平均峰电流密度较低，且PRMT7不影响hNa_V1.9-4A和hNav1.9-R519A突变体峰电流密度，如图9A，B。

这些结果表明，PRMT7依赖与hNa_V1.9的结合和甲基化作用调节hNa_V1.9电流密度，并且563-566位氨基酸以及519位精氨酸对hNa_V1.9通道功能至关重要。

实施例8、抑制PRMT7活性使Na_V1.9电流减小

通过PRMT7抑制剂DS-437抑制PRMT7活性检测Na_V1.9电流。将DRG神经元与Prmt7抑制剂DS-437(10μM，100μM)共同孵育1小时后，结果发现DRG细胞mNa_V1.9峰电流密度(Control:-223.17±35.19pA/pF，n＝11；10μM：131.48±20.55pA/pF，n＝13；100μM：-104.40±29.40pA/pF，n＝10，p<0.05)明显降低(图10A-D)，但并不影响mNa_V1.9电压依赖的激活曲线(V_1/2，Control：-58.08±0.84mV；10μM：-57.38±1.39mV；100μM：-56.75±0.62mV)和稳态快失活曲线(V_1/2，Control：-60.59±1.44mV；10μM：-60.20±5.59；100μM：-61.20±1.19)(图10E，F)。

上述结果表明，抑制Prmt7活性显著降低mNa_V1.9电流密度，但不影响mNa_V1.9通道特性。

实施例9、抑制PRMT7活性降低Na_V1.9^A796G/A796G小鼠DRG神经元兴奋性

由于PRMT7抑制剂DS-437可以明显抑制Na_V1.9电流，因此本发明人研究抑制PRMT7活性是否对小鼠DRG神经元兴奋性产生影响。

首先，本发明人将野生型小鼠DRG神经元与PRMT7抑制剂DS-437(100μM)共同孵育1小时后检测动作电位，结果表明PRMT7抑制剂DS-437不影响野生型小鼠DRG神经元动作电位发放，电压阈值和静息膜电位(图11A-C)，该结果与Na_V1.9敲除不影响小鼠DRG神经元动作电位发放的结果一致。

因此，为了进一步验证抑制PRMT7活性对DRG神经元兴奋性的影响，本发明人选择疼痛小鼠模型Na_V1.9^A796G/A796G小鼠来进行验证。结果表明，PRMT7抑制剂DS-437可以明显地降低Na_V1.9^A796G/A796G小鼠DRG神经元动作电位发放频率(图11B，C)，但不影响动作电位发放电压阈值和静息膜电位(图11D)。

实施例10、抑制PRMT7活性抑制Na_V1.9^A796G/A796G小鼠疼痛超敏和Na_V1.9^A796G/A796G小鼠与WT小鼠福尔马林诱导的疼痛超敏

为进一步测试PRMT7抑制剂在镇痛中的可应用行，本发明人以疼痛小鼠模型——Na_V1.9^A796G/A796G小鼠来进行测试。

小鼠行为学实验表明，PRMT7抑制剂DS-437和SGC8158可以缓解Na_V1.9^A796G/A796G小鼠疼痛超敏(图12A，B)，以及Na_V1.9^A796G/A796G小鼠和WT小鼠福尔马林诱导的疼痛超敏(图13A，B)。

该结果表明，抑制PRMT7活性降低Na_V1.9^A796G/A796G小鼠DRG神经元兴奋性和缓解福尔马林诱导的小鼠疼痛超敏。

综上，本发明论证了PRMT7作为靶点制备镇痛药物新的用途，以及PRMT7抑制剂在疼痛治疗中新的治疗用途。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心

<120> Nav1.9互作蛋白PRMT7及其下调剂在制备镇痛药物中的用途

<130> 212246

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 692

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Lys Ile Phe Cys Ser Arg Ala Asn Pro Thr Thr Gly Ser Val Glu

1 5 10 15

Trp Leu Glu Glu Asp Glu His Tyr Asp Tyr His Gln Glu Ile Ala Arg

20 25 30

Ser Ser Tyr Ala Asp Met Leu His Asp Lys Asp Arg Asn Val Lys Tyr

35 40 45

Tyr Gln Gly Ile Arg Ala Ala Val Ser Arg Val Lys Asp Arg Gly Gln

50 55 60

Lys Ala Leu Val Leu Asp Ile Gly Thr Gly Thr Gly Leu Leu Ser Met

65 70 75 80

Met Ala Val Thr Ala Gly Ala Asp Phe Cys Tyr Ala Ile Glu Val Phe

85 90 95

Lys Pro Met Ala Asp Ala Ala Val Lys Ile Val Glu Lys Asn Gly Phe

100 105 110

Ser Asp Lys Ile Lys Val Ile Asn Lys His Ser Thr Glu Val Thr Val

115 120 125

Gly Pro Glu Gly Asp Met Pro Cys Arg Ala Asn Ile Leu Val Thr Glu

130 135 140

Leu Phe Asp Thr Glu Leu Ile Gly Glu Gly Ala Leu Pro Ser Tyr Glu

145 150 155 160

His Ala His Arg His Leu Val Glu Glu Asn Cys Glu Ala Val Pro His

165 170 175

Arg Ala Thr Val Tyr Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Arg Met Trp Ser

180 185 190

Trp Asn Lys Leu Phe Pro Ile His Val Gln Thr Ser Leu Gly Glu Gln

195 200 205

Val Ile Val Pro Pro Val Asp Val Glu Ser Cys Pro Gly Ala Pro Ser

210 215 220

Val Cys Asp Ile Gln Leu Asn Gln Val Ser Pro Ala Asp Phe Thr Val

225 230 235 240

Leu Ser Asp Val Leu Pro Met Phe Ser Ile Asp Phe Ser Lys Gln Val

245 250 255

Ser Ser Ser Ala Ala Cys His Ser Arg Arg Phe Glu Pro Leu Thr Ser

260 265 270

Gly Arg Ala Gln Val Val Leu Ser Trp Trp Asp Ile Glu Met Asp Pro

275 280 285

Glu Gly Lys Ile Lys Cys Thr Met Ala Pro Phe Trp Ala His Ser Asp

290 295 300

Pro Glu Glu Met Gln Trp Arg Asp His Trp Met Gln Cys Val Tyr Phe

305 310 315 320

Leu Pro Gln Glu Glu Pro Val Val Gln Gly Ser Ala Leu Tyr Leu Val

325 330 335

Ala His His Asp Asp Tyr Cys Val Trp Tyr Ser Leu Gln Arg Thr Ser

340 345 350

Pro Glu Lys Asn Glu Arg Val Arg Gln Met Arg Pro Val Cys Asp Cys

355 360 365

Gln Ala His Leu Leu Trp Asn Arg Pro Arg Phe Gly Glu Ile Asn Asp

370 375 380

Gln Asp Arg Thr Asp Arg Tyr Val Gln Ala Leu Arg Thr Val Leu Lys

385 390 395 400

Pro Asp Ser Val Cys Leu Cys Val Ser Asp Gly Ser Leu Leu Ser Val

405 410 415

Leu Ala His His Leu Gly Val Glu Gln Val Phe Thr Val Glu Ser Ser

420 425 430

Ala Ala Ser His Lys Leu Leu Arg Lys Ile Phe Lys Ala Asn His Leu

435 440 445

Glu Asp Lys Ile Asn Ile Ile Glu Lys Arg Pro Glu Leu Leu Thr Asn

450 455 460

Glu Asp Leu Gln Gly Arg Lys Val Ser Leu Leu Leu Gly Glu Pro Phe

465 470 475 480

Phe Thr Thr Ser Leu Leu Pro Trp His Asn Leu Tyr Phe Trp Tyr Val

485 490 495

Arg Thr Ala Val Asp Gln His Leu Gly Pro Gly Ala Met Val Met Pro

500 505 510

Gln Ala Ala Ser Leu His Ala Val Val Val Glu Phe Arg Asp Leu Trp

515 520 525

Arg Ile Arg Ser Pro Cys Gly Asp Cys Glu Gly Phe Asp Val His Ile

530 535 540

Met Asp Asp Met Ile Lys Arg Ala Leu Asp Phe Arg Glu Ser Arg Glu

545 550 555 560

Ala Glu Pro His Pro Leu Trp Glu Tyr Pro Cys Arg Ser Leu Ser Glu

565 570 575

Pro Trp Gln Ile Leu Thr Phe Asp Phe Gln Gln Pro Val Pro Leu Gln

580 585 590

Pro Leu Cys Ala Glu Gly Thr Val Glu Leu Arg Arg Pro Gly Gln Ser

595 600 605

His Ala Ala Val Leu Trp Met Glu Tyr His Leu Thr Pro Glu Cys Thr

610 615 620

Leu Ser Thr Gly Leu Leu Glu Pro Ala Asp Pro Glu Gly Gly Cys Cys

625 630 635 640

Trp Asn Pro His Cys Lys Gln Ala Val Tyr Phe Phe Ser Pro Ala Pro

645 650 655

Asp Pro Arg Ala Leu Leu Gly Gly Pro Arg Thr Val Ser Tyr Ala Val

660 665 670

Glu Phe His Pro Asp Thr Gly Asp Ile Ile Met Glu Phe Arg His Ala

675 680 685

Asp Thr Pro Asp

690

<210> 2

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(62)

<223> shRNA

<400> 2

gatccggatg cagtgtgtgt acttccttca agagaggaag tacacacact gcatcctttt 60

tg 62

<210> 3

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(62)

<223> shRNA

<400> 3

aattcaaaaa ggatgcagtg tgtgtacttc ctctcttgaa ggaagtacac acactgcatc 60

cg 62

Claims (18)

1.精氨酸甲基转移酶PRMT7的应用，用于：作为缓解或抑制疼痛的靶标；或作为筛选缓解或抑制疼痛的药物的靶标。

2.精氨酸甲基转移酶PRMT7的下调剂的应用，用于制备缓解或抑制疼痛的组合物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的组合物还用于：抑制精氨酸甲基转移酶PRMT7与钠通道Na_V1.9的相互作用；

抑制钠通道Na_V1.9电流密度增加，抑制神经元的兴奋性；

减少钠通道Na_V1.9的Loop1在细胞膜上的分布。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制精氨酸甲基转移酶PRMT7与钠通道Na_V1.9的相互作用为：抑制精氨酸甲基转移酶PRMT7的C端结构域与钠通道Na_V1.9的Loop1的相互作用。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，精氨酸甲基转移酶PRMT7与钠通道Na_V1.9的相互作用中，所述精氨酸甲基转移酶PRMT7的C端结构域作用于钠通道Na_V1.9的第563-566位氨基酸以及第519位精氨酸。

6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述精氨酸甲基转移酶PRMT7的下调剂包括：下调精氨酸甲基转移酶PRMT7活性的物质或下调精氨酸甲基转移酶PRMT7的表达、稳定性或减少其有效作用时间的物质。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述下调剂包括选自：

针对精氨酸甲基转移酶PRMT7的化学小分子拮抗剂或抑制剂；

干扰或敲除精氨酸甲基转移酶PRMT7的试剂；

特异性与精氨酸甲基转移酶PRMT7结合的结合分子；或

干扰精氨酸甲基转移酶PRMT7与效应分子的相互作用的试剂；较佳地该效应分子为钠通道Na_V1.9，更佳地所述下调剂靶向干扰精氨酸甲基转移酶PRMT7与钠通道Na_V1.9的Loop1的相互作用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述针对精氨酸甲基转移酶PRMT7的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括：DS-437，SGC8158，或其盐、水合物、异构体、类似物或衍生物。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述干扰或敲除精氨酸甲基转移酶PRMT7的试剂包括：特异性干扰精氨酸甲基转移酶PRMT7的编码基因表达的干扰分子，针对精氨酸甲基转移酶PRMT7的CRISPR基因编辑试剂，针对精氨酸甲基转移酶PRMT7的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将精氨酸甲基转移酶PRMT7进行功能丧失性突变，如靶向于其C端结构域进行功能丧失性突变。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述干扰分子包括shRNA，siRNA，miRNA，反义核酸等，或能形成所述siRNA、shRNA，miRNA，反义核酸等的构建体；较佳地，所述的干扰分子为shRNA。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述shRNA包括SEQ ID NO:2所示的正向序列和SEQ ID NO:3所示的反向序列。

12.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述靶向干扰精氨酸甲基转移酶PRMT7与钠通道Na_V1.9的Loop1的相互作用包括：利用同源重组试剂或定点突变试剂对钠通道Na_V1.9的Loop1进行功能丧失性突变；较佳地，将钠通道Na_V1.9的第563-566位氨基酸或第519位精氨酸进行突变。

13.一种用于缓解或抑制疼痛的药物组合物或药盒，包括：精氨酸甲基转移酶PRMT7的下调剂；较佳地，所述下调剂为干扰分子，所述的干扰分子为shRNA；较佳地，所述shRNA包括SEQ ID NO:2所示的正向序列和SEQ ID NO:3所示的反向序列；或

所述下调剂为针对精氨酸甲基转移酶PRMT7的化学小分子拮抗剂或抑制剂，包括：DS-437，SGC8158，或其盐、水合物、异构体、类似物或衍生物。

14.一种筛选缓解或抑制疼痛的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达精氨酸甲基转移酶PRMT7；和

(2)检测所述体系中精氨酸甲基转移酶PRMT7的表达或活性；若所述候选物质在统计学上下调精氨酸甲基转移酶PRMT7的表达或活性，则该候选物质是缓解或抑制疼痛的潜在物质。

15.一种筛选缓解或抑制疼痛的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)将候选物与精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段相互作用的体系接触；

(2)检测候选物对精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段相互作用的影响；其中，若所述候选物可减弱两者的相互作用，则表明该候选物是缓解或抑制疼痛的物质。

16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述体系为神经细胞体系；

步骤(2)还包括：检测所述体系中神经细胞的兴奋性；若兴奋性下降，则该候选物质是缓解或抑制疼痛的潜在物质；或

步骤(2)还包括：检测神经细胞的细胞膜上的钠通道Na_V1.9的Loop1在细胞膜上的分布，若分布减少，则该候选物质是缓解或抑制疼痛的潜在物质。

17.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，检测精氨酸甲基转移酶PRMT7的表达，或检测精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段相互作用的方法包括：Southern印迹法，Western印迹法，DNA序列分析，聚合酶链反应法，免疫共沉淀法，酵母双杂交法。

18.一种复合体，其包括精氨酸甲基转移酶PRMT7及钠通道Na_V1.9或其Loop1段，所述精氨酸甲基转移酶PRMT7结合于NaV1.9的Loop1段。

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