KR101478395B1 - 세포사멸을 유도하는 방법 및 그 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포사멸을 유도하는 방법 및 이를 이용한 세포사멸 유도용 약학 조성물을 제공하고자 하며, 보다 구체적으로 SET 도메인을 함유한 단백질을 과발현시키면 이의 HMTase 활성에 의해 전사가 활성화되고 세포사멸과 관련된 유전자들이 조절되어 세포 생존력을 낮추므로, 본 발명에서는 SET 도메인을 함유한 단백질을 과발현시켜 세포사멸을 유도하는 방법을 제공하며, 또한 세포사멸을 유도함으로 암, 당뇨병, 관절염, 염증성 장 질환, 죽상동맥경화증, 자가면역 질환, 이식 거부, 외상후 면역 반응, 감염성 질환, 림프계 종양, 림프종, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루프스, 경피증, 허혈, 뇌졸중, 포도막염 또는 당뇨 망막증을 예방 및 치료에 본 발명의 조성물이 제공될 수 있다.

Description

세포사멸을 유도하는 방법 및 그 조성물 {Method for inducing apoptosis and the Composition}

본 발명은 세포사멸을 유도하는 신규한 방법 및 이를 이용한 세포사멸 유도용 약학 조성물을 제공하고자 한다.

세포사멸 (apoptosis)은 생리적 조건하에서 세포 스스로가 적극적으로 일으키는 세포사이며, 환경악화에 의한 세포사 (괴사: necrosis)와 명확하게 구별되고 있다. 이 세포사멸은 세포핵의 염색체응집, 세포핵의 단편화, 세포표층 미융모 (microvillus)의 소실, 세포질의 응집 등을 형태학적인 특징으로 하고 있다. 세포사멸이 일어나는 세포는 위축 (atrophy)되고, 세포 내용물은 외부에 방출되지 않고 마크로파아지 또는 주위의 세포에 신속하게 함입되기 때문에, 염증이 일어나지 않고 주위의 세포에 영향을 주지 않는다. 따라서, 그 존재가 숙주생물에 있어서 유해한 세포 (예를 들어, 암세포 등)에 세포사멸을 유도하여 질환을 치료하는 시도가 많아지고 있다.

지금까지, 세포사멸을 유도하는 수단, 인자로서는 예를 들어, 글루코코르티코이드 처리, 사이토 톡신-T 세포에 의한 세포장해, 호르몬 의존성 조직의 위축, 방사선 조사(照射), 자연살상 (NK) 세포, 살상 세포 (killer cell), 종양괴사인자 (TNF), 림포톡신 (LT) 등의 사이토카인류 (類) 등이 보고되어 있다 (참조: Wyllie, A. H., Nature, 284:555-556, 1986; Wyllie, A. H. et al., Int. Rev. Cytol., 69:251, 1980; Duvall, E. and Wyllie, A. H.,Immunology Today, 7:115-119, 1986; Sellins, K. S. et al., J. Immunol., 139:3199, 1987; Yamada, T. et al., Int. J. Radiat. Biol., 53:65, 1988; Schmid, D. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:1881-1885, 1986; John, C. et al., J. Immunol., 129(4):1782-1787, 1982; Howell, D. M. et al., J. Immunol., 140:689-692, 1988; Gillian, B. et al., Eur J. Immunol., 17:689-693, 1987). 또한, 항체 (예를 들어, 항 CD3항체, 항 APO-I항체 등)에 있어서도 세포사멸이 유도되는 것이 알려져 있다 (참조: Trauth, B. C. et al.,Science, 245:301-305, 1989; Smith, C. A. et al., Nature, 337:181-184, 1989; Tadakuma, T. et al., Eur.J, Immunol., 20:779, 1990). 아울러, 단백질 합성저해제인 시클로헥시미드 (cycloheximide)는 급성백혈병 세포에, RNA 합성저해제인 액티노마이신 D (Actinomycin D)는 소장장샘세포 (small intestine crypt cell)에, 그리고 둘다는 HL-60 세포에 각각 세포사멸을 유도하는 것도 보고되고 있다 (참조: Martin, S. J. et al., J. Immunol., 145:1859-1867, 1990).

그러나, 이와 같은 세포사멸의 유도에 관한 대부분의 선행기술들은 자가면역 질환, 림프구 증식성 질환, 염증 및 암 등과 같이, 바람직하지 못한 세포 증식을 특징으로 하는 질환 및 증상을 치료하기 위한 임상용으로 적절하지 않은 것으로 증명되어 왔다. 이들 치료의 다수는 효과가 없거나 독성이 있고, 부작용을 일으키며, 약물 내성이나 면역감작의 발달을 초래하고, 피치료자를 쇠약하게 만든다.

따라서 세포, 특히 암세포에서 세포 증식을 억제하고, 세포 주기 정지 및 세포사멸을 유도하며, 이들 질환 및 증상을 치료할 수 있는 신규의 조성물 및 방법 필요하다.

본 발명에서는 바람직하지 못한 세포 증식을 억제하고, 세포 주기 정지 및 세포사멸을 유도하는 신규의 조성물 및 유도방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 SET 도메인을 함유한 단백질을 과발현시켜 세포사멸을 유도하는 방법을 제공하고자 한다.

상기 SET 도메인을 함유한 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 setd3일 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 SET 도메인을 함유한 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 세포사멸 유도용 약학 조성물을 제공하고자 한다.

상기 SET 도메인을 함유한 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 setd3일 수 있다.

상기 조성물은 세포사멸을 유도함으로 암, 당뇨병, 관절염, 염증성 장 질환, 죽상동맥경화증, 자가면역 질환, 이식 거부, 외상후 면역 반응, 감염성 질환, 림프계 종양, 림프종, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루프스, 경피증, 허혈, 뇌졸중, 포도막염 또는 당뇨 망막증을 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명에 따라 세포내에서 SET 도메인을 함유한 단백질을 과발현함으로써 카스파아제 의존성 세포사멸을 증가시켜 세포, 즉 자가면역 질환, 림프구 증식성 질환, 염증 및 암세포 등의 이상증식을 억제하는 효과를 나타내므로, 다양한 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 제브라피쉬 setd3이 보존된 SET 도메인을 지님을 나타낸 것이다. 도 1A는 전체길이 setd3 및 SET 도메인의 도식도를 나타낸 것이고, 도 1B는 아미노산 서열에 대한 이차 구조적 요소를 나타낸 것으로, 붉은색 막대기는 setd3내에 α-helices를, 파란색 화살표는 β-sheets를 나타낸 것이고, SET 도메인은 회색 박스로 나타내었다. 도 1C는 setd3 (77-490 aa)을 3차원적으로 모델링한 것으로, 이차구조는 다른 색상으로 가시화 하였고, 붉은 점선은 setd3내의 틈부분을 나타낸다.도 1D와 1E는 SET 도메인의 3차원 모델링한 것으로, setd3의 ssDNA 결합 모티브를 나타낸다. SET 도메인의 구조는 195 aa~314 aa로 생성되고 (도 1D), 이러한 DNA 결합 모티브는 269 aa~ 314 aa 로 나타난다 (도 1E). 화살표는 DNA 결합모티브에서 플립루프 (flip-loop) 사슬을 나타내며, 핑크색 리본은 α-helices를 나타내고, β-sheets는 노란색과 녹색 리본으로 나타난다 (도 1D 및 1E).
도 2는 신규한 HMTase로서 제브라피쉬 setd3를 나타낸 것이다. 도 2A는 코어 히스톤이 HMTase 분석에서 기질로서 사용된다. 도 2B는 GST-setd3 및 코어 히스톤으로 HMTase 분석을 하고, α-H3K4-me2, α-H3K9-me2, α-H3K27-me2, α-H3K36-me1, α-H3K36-me2, α-H3K36-me3, 및 α-H4K20-me2 항체에 대해 웨스턴 블롯팅을 한 것이다. 도 2C는 HEK293 세포는 pcDNA6 또는 pcDNA6-setd3으로 트랜스펙션시키고 트랜스펙션시킨 세포에서 cDNA를 추출하였다. PCR 산물을 setd3 에 특이적 프라이머를 사용하여 증폭시켰다 (upper panel). HEK293 세포를 pcDNA6 또는 myc-tagged setd3으로 트랜스펙션 시켰다. 전체 단백질을 용해 버퍼를 사용하여 트랜스펙션된 세포로부터 추출하였다. 웨스턴 블롯 분석이 α-myc 또는 α-β-actin 항체로 이루어졌다 (lower panel). 도 2D는 pcDNA6-setd3-트랜스펙션된 세포 추출물이 웨스턴 블롯 분석에 사용되었고, 히스톤 메틸화 수준의 변화를 α-H3K4-me2, α-H3K9-me2, α-H3K27-me2, α-H3K36-me1, α-H3K36-me2, α-H3K36-me3, 및 α-H4K20-me2 항체를 사용하여 검출하였다.
도 3은 제브라피쉬 setd3이 전사활성을 유도하는 것을 나타낸 것이다. 도 3A는 setd3 야생형과 결손 돌연변이체의 도메인 구조의 도식도를 나타낸 것이다. 도 3B 및 3C는 HEK293 세포를 pcDNA6-setd3 (50, 100, 또는 150 ng), pcDNA6-setd3-N (50, 100, 또는 150 ng), pcDNA6-setd3-C (50, 100, 또는 150 ng), MH100-SV40-Luc 벡터 (100 ng) (도 3B), 및 MH100-TK-Luc 벡터 (100 ng) (도 3C)로 일시적으로 동시에 트랜스펙션시킨 것이다.
도 4는 제브라피쉬 setd3이 세포 생존력을 억제함을 나타낸 것이다. 생포생존력은 setd3이 HEK293 (도 4A), HeLa (도 4B), 및 NIH-3T3 (도 4C)세포에서 과발현되었을 때, MTT 분석으로 확인된다. 이러한 세포들은 pcDNA6-setd3으로 트랜스펙션된 것으로, 포르마잔 (formazan)은 각 시점 (24, 36, 또는 48 h)에서 ELISA 리더 (570 nm)를 사용하여 탐지되었는데, pcDNA6 empty vector를 대조군으로 사용하였다. 도 4D는 pcDNA6-setd3-transfected HeLa 세포로부터 총단백질을 추출한 것으로 특정한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 적용하였다. β-액틴 (β-Actin)은 로딩 대조군으로 사용되었다.

본 발명은 SET 도메인을 함유한 단백질을 과발현시켜 세포사멸을 유도하는 방법, 및 SET 도메인을 함유한 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 세포사멸 유도용 약학 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

종래의 세포사멸의 유도에 관한 대부분의 선행기술들 다수가 임상에서 효과가 없거나 독성이 있고, 부작용을 일으키며, 약물 내성이나 면역감작의 발달을 초래하고, 피치료자를 쇠약하게 만드는 등 자가면역 질환, 림프구 증식성 질환, 염증 및 암 등과 같이, 바람직하지 못한 세포 증식을 특징으로 하는 질환 및 증상을 치료하기 위해 적절하지 않았기에, 본 발명에서는 바람직하지 못한 세포 증식을 억제하고, 세포 주기 정지 및 세포사멸을 유도하며, 이들 질환 및 증상을 치료할 수 있는 신규의 조성물 및 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 SET 도메인을 함유한 단백질을 과발현시켜 세포사멸을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 SET 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하되 이에 한정되지 않고, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성, 바람직하게는 90%이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 단백질은 본 발명의 단백질에 포함될 수 있다.

본 발명에서 SET 도메인을 함유한 단백질의 종류는 특별히 한정된 것은 아니나, setd3일 수 있다.

하기 도 1에서 나타난 바와 같이, 상기 setd3은 N-말단에 SET 도메인이 C-말단에 Rubis-subs-bind 도메인이 존재할 수 있으며, 상기 setd3 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하되 이에 한정되지 않고, 상기 아미노산 서열과 85% 이상의 상동성, 바람직하게는 90%이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 단백질은 본 발명의 단백질에 포함될 수 있다.

본 발명의 SET 도메인을 함유한 단백질, 일례로 setd3은 신규한 HMTase로서 히스톤 H3K36을 메틸화시키며, 이러한 H3K36 HMTase 활성을 통해 전사를 활성화시키고, 카스파제-9와 카스파제-3과 같은 세포사멸과 관련된 유전자를 조절하여 세포 생존력을 낮춘다.

본 발명에서 사용되는 SET 도메인을 함유한 단백질은 화학적으로 합성하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당해 분야에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, SET 도메인을 함유한 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 SET 도메인을 함유한 단백질이 발현되도록 숙주세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 SET 도메인을 함유한 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피 (겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.

본 발명은 SET 도메인을 함유한 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 세포사멸 유도용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 SET 도메인을 함유한 단백질은 화학적으로 합성하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 상기의 각 단백질을 코딩하는 게놈 DNA (genomic DNA), 게놈 DNA의 전사산물인 mRNA, 이 mRNA를 주형으로 합성되는 cDNA 등을 이용할 수 있지만, cDNA가 특히 바람직하다. 이 cDNA는 공지의 방법에 따라 수득할 수 있다. 예를 들어, 공지의 방법 (참조: Mol. Cell Biol., 2:161-170, 1982; J.Gene, 25:263-269, 1983; Gene, 150:243-250, 1994)을 이용하여 cDNA 라이브러리 (cDNA library)를 합성하고, 제작한 프로브 DNA (probe DNA)를 이용하여 목적의 cDNA를 분리할 수 있다. 수득된 cDNA는 예를 들어, PCR (Polymerase Chain Reaction)법, NASBN (Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA (Transcription-mediated amplification)법 및 SDA (Strand displacement amplification)법 등의 통상 수행되는 유전자 증폭법에 의해 증폭될 수 있다.

본 발명에서 SET 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하되 이에 한정되지 않고, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성, 바람직하게는 90%이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 단백질은 본 발명의 단백질에 포함될 수 있다.

본 발명에서 SET 도메인을 함유한 단백질의 종류는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 setd3일 수 있다.

하기 도 1에서 나타난 바와 같이, 상기 setd3은 N-말단에 SET 도메인이 C-말단에 Rubis-subs-bind 도메인이 존재할 수 있으며, 상기 setd3 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하되 이에 한정되지 않고, 상기 아미노산 서열과 85% 이상의 상동성, 바람직하게는 90%이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 단백질은 본 발명의 단백질에 포함될 수 있다.

본 발명의 SET 도메인을 함유한 단백질, 일례로 setd3은 신규한 HMTase로서 히스톤 H3K36을 메틸화시키며, 이러한 H3K36 HMTase 활성을 통해 전사를 활성화시키고, 카스파제-9와 카스파제-3과 같은 세포사멸과 관련된 유전자를 조절하여 세포 생존력을 낮추므로, 본 발명에서의 상기 조성물은 비정상적인 세포 성장 또는 비정상적인 성장 조절로 인해 유발되는 질환 및 증상, 일례로 암, 당뇨병, 관절염, 염증성 장 질환, 죽상동맥경화증, 자가면역 질환, 이식 거부, 외상후 면역 반응, 감염성 질환, 림프계 종양, 림프종, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루프스, 경피증, 허혈, 뇌졸중, 포도막염 또는 당뇨 망막증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

상기 암은 특별히 한정된 것은 아니나, 암은 흑색종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 폐암, 간암, 망막모세포종, 성상아교세포종, 아교모세포종, 치은암, 설암, 백혈병, 신경모세포종, 두부암, 경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 난소암, 중피종, 자궁경부암, 위장관암, 림프종, 뇌암, 결장암, 육종 또는 방광암을 포함할 수 있으며, 본 발명의 조성물은 암 세포를 치사시키고 암세포내 아폽토시스를 유도하고 암 세포의 성장 속도를 감소시키고 전이의 발생 또는 수를 감소시키거나 종양 크기를 감소시키거나 종양 성장을 억제하거나 종양 또는 암 세포로의 혈액 공급을 감소시키거나 암세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진시키거나 암의 진행을 예방하거나 억제하여 암에 걸린 환자의 수명을 연장시킬 수 있다.

본 발명의 SET 도메인을 함유한 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분이 0.1 내지 90 중량%로 포함한다.

본 발명의 SET 도메인을 함유한 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA).

상기 SET 도메인을 함유한 단백질을 세포 내에 도입가능한 형태로 만들기 위해서는, 예를 들어 이하의 수단을 사용한다.

SET 도메인을 함유한 단백질은 예를 들어, 그 구조나 기능을 변경하지 않고, 약리학적으로 허용되는 담체용액에 단백질 분자를 혼합해서 제제화하여 세포 내에 도입가능한 형태로 만들 수 있다.

이러한 약제는 예를 들어, 시험관내 (in vitro) 세포에 대해서는 마이크로인젝션법 (microinjection method)에 의해 세포 내에 도입할 수 있다. 또는, 지질에 의한 세포 내 도입법 (BioPORTER(Gene Therapy Systems사, 미국), Chariot (Active Motif사, 미국) 등)을 채용할 수도 있다.

또한, 다른 일례로는 단백질의 N 말단측에 세포막 통과 펩티드를 연결시킨 융합 단백질을 제조하여 단백질을 세포 내에 도입가능한 형태로 만들 수도 있다. 이 세포막 통과 펩티드를 가지고 단백질은 세포막을 통과해서 세포 내에 받아들여진다. 세포막 통과 펩티드로서는 HIV-TㆍTAT의 PTD (protein transduction domain) 또는 초파리 호메오박스 단백질 안티나페디아 (drosophila homeobox protein antennapedia)의 PTD 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, HIV-1ㆍTAT의 경우에는 그 아미노산 서열 및 그의 cDNA의 염기서열이 공지이며 (참조: Science, 285:1569-1572, 1999; Genbank Accession NO. U39362 M96155), 그 PTD에 상당하는 영역 (HIVㆍTAT의 47 내지 57번 아미노산 서열)을 코딩하는 DNA 단편을 상기 cDNA와 연결해서 융합 DNA 단편을 수득하고, 이 융합 DNA 단편을 대장균 등의 숙주세포에서 발현시켜 N 말단측에 PTD 펩티드를 연결해서 융합 단백질을 제조할 수 있다. 또한, 안티나페디아의 PTD도 공지이므로 (예를 들어, GenBank Accession No. AE001573), PTD를 연결한 융합 단백질을 쉽게 제조할 수 있다. 또한, 2가 가교제 (divalent crosslinking agent)(예를 들어, EDC 또는 β-알라닌 등)를 개입시켜, 폴리펩티드와 PTD 펩티드를 결합시켜 세포막 통과 펩티드를 연결한 융합 단백질을 제조할 수도 있다.

본 발명의 SET 도메인을 함유한 단백질을 코딩하는 유전자는 주사제로 직접 투여될 수 있다. 선택적으로 본 발명의 SET 도메인을 함유한 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한 벡터가 투여될 수 있다.

체내 (in vivo) 세포 (즉, 동물개체 내의 세포)에 대해서는, 세포 내의 촉진이나 표적세포의 지향성을 높이는 목적으로, 예를 들어, 바이러스성 또는 비바이러스성의 유전자 도입용 벡터 등의 수단에 의해 세포 내에 도입할 수 있다. 이와 같은 형태로 한 약제는 유전자 치료용으로 생체 내에 도입할 수 있다 (예를 들어, 특개 2003-24092호 공보, 특개 2003-501445호 공보 등). 상기에서, 바이러스성 벡터로서는, 예를 들어, 아데노바이러스 (adenovirus) 벡터, 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터, 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터, AAV (adeno-associated virus) 벡터, 백시니아바이러스 (vaccinia virus) 벡터, 사람면역결핍바이러스 (human immunodeficiency virus)(HIV) 벡터, 헤르페스바이러스 (herpes virus) 벡터 등을 들 수 있다. 또한, 비바이러스성 벡터로서는, 리포솜, 인공 지질 매개체 (artificial lipid vehicle), 중공 나노입자 (hollow nanoparticle), 덴드리머 (dendrimer) 등의 고분자 화합물 등을 예로 들 수 있다. 이 경우, 시판의 도입용 시약 (예를 들어, 리포펙틴 (lipofectin), 리포펙타민 (lipofectamine), DMRIE-C (Invitrogen사 제품), 메타펙텐 (Metafectene), DOTAP (BioTex사 제품), Tfx 시약 (Promega사 제품)) 등을 이용할 수 있다.

SET 도메인을 함유한 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 활성성분으로 가지는 세포사멸 유도제, 및 세포사멸관련 질환 치료용 약학적 조성물은 당업계의 공지된 담체 및 희석제와 함께 적절한 제형으로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하주사, 좌제 등의 제형을 가질 수 있다.

약학 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 즉, 경구용 고형제제를 제조하는 경우는, 주약에 부형제, 추가로 필요에 따라 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제 등을 첨가한 후, 통상적인 방법에 의해 정제, 피복정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등 형태의 제제를 조제할 수 있다. 사용되는 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분 (corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스 (tragacanth), 젤라틴, 셀락 (shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴 (pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의 (糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

경구 투여를 위한 액체제제, 예를 들면 유제, 시럽제, 현탁제, 액제의 제조에는 일반적으로 사용되는 불활성인 희석제, 예를 들면 물 또는 식물유를 사용할 수 있다. 이 제제에는 불활성인 희석제 이외에 보조제, 예를 들면 습윤제, 현탁 보조제, 감미제, 방향제, 착색제 또는 보존제를 배합할 수 있다. 액체제제를 조제한 후, 젤라틴과 같은 흡수될 수 있는 물질의 캡슐 속에 충전해도 된다. 비경구 투여용 제제, 예를 들면 주사제 또는 좌제 등의 제조에 사용되는 용제 또는 현탁제로서는, 예를들면 물, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 벤질알코올, 올레산에틸, 레시틴을 들 수 있다. 좌제의 제조에 사용되는 기제로서는, 예를 들면 카카오버터, 유화 카카오버터, 라우린버터, 위텝졸을 들 수 있다. 제제의 조제방법은 특별히 한정되지 않고, 당업계에서 범용되고 있는 방법은 모두 이용 가능하다.

주사제의 형태로 하는 경우에는, 담체로서 예를 들면 물, 에틸알코올, 마크로골 (macrogol), 프로필렌글리콜, 구연산, 초산, 인산, 젖산, 젖산나트륨, 황산 및 수산화나트륨 등의 희석제; 구연산나트륨, 초산나트륨 및 인산나트륨 등의 pH 조정제 및 완충제; 피로아황산나트륨, 에틸렌디아민사초산, 티오글리콜산 및 티오젖산 등의 안정화제 등을 사용할 수 있다. 또한, 이 경우, 등장성 용액을 조제하기 위해 충분한 양의 식염, 포도당, 만니톨 또는 글리세린을 제제 중에 배합해도 되고, 통상의 용해 보조제, 무통화제 또는 국소 마취제 등을 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 약학의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 성인 1일당 유효성분인 상기 물질의 중량으로서 통상 1kg당 1 ng 내지 10 mg의 양으로 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 이 투여량을 환자의 연령, 병태, 증상에 따라 적절히 증감(增減)하는 것이 바람직하다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일 (數日) 간격으로 간헐 (間歇)투여해도 된다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 상기 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 종래의 소염 조성물, 화학치료요법, 수술, 방사선조사, 호르몬 치료요법 또는 유전자 치료요법과 병용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 들은 본 발명을 예시한 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: setd3 단백질의 구조분석

1-1. 플라스미드 구조체 ( Plasmid constructs )

모든 구조체의 서열을 DNA 시퀸싱으로 확인하였다. 제브라피쉬 setd3 cDNA의 전체 길이의 오픈 리딩 플레임 (full-length open reading frame)을 Openbiosystems로부터 구입하였는데, 이는 주형으로서 PCR 증폭에서 사용되었다.

pGEX4T1-setd3는 제브라피쉬 setd3 (GeneBank accession no. BC055261)에 대한 특별한 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭으로 만들어졌다. PCR 프라이머 서열은 다음 괄호 안의 내용과 같다. (SalI site-introduced primer, 포워드 프라이머 (forward primer)는 5'-GTCGACGGATGGGCAAAAAGAGCAGAGTG-3'이며, NotI-site introduced primer, 리버스 프라이머 (reverse primer)로서 5'-GCGGCGGCCCCTATTTGCCAGCATCTTTTGG-3'임).

진핵생물 발현에 있어서, PCR 산물을 HA/myc/His-tagged pcDNA6 (Invitrogen,Carlsbad, CA)로 서브클로닝하였다. setd3의 코딩서열을 특정 프라이머를 가지고 증폭하였다. PCR 프라이머 서열은 다음 괄호안의 내용과 같다 (HindⅢ-site introduced primer, 포워드 프라이머 (forward primer)는 5'-GCGAAGCTTATGGGCAAAAAGAGCAGAGTG-3'이며 NotI-site introduced primer, 리버스 프라이머 (reverse primer)는 5'-GCGCTCGAGTTTGCCAGCATCTTTTGGTTC-3'임).

1-2. 이차구조의 모델링 ( Modeling of secondary structures )

setd3 단백질의 분자적 모델은 자동화된 유사성 모델링 서버 SWISS-Model (http://swissmodel.expasy.org/)를 사용하여 만들어졌다. 전체 길이 (77-490 aa), SET 도메인, 및 ssDNA 결합 모티브를 포함하여, 생성된 setd3 단백질 구조는 SWISS-Pdb Viewer로 가시화되었는데, 이는 다른 색상에서 사슬들 chains, α-helix, 및 β-sheet를 나타낸다.

1-3. setd3 단백질의 구조분석 및 그 결과

생거 웹사이트 (Sanger web site)에 있는 데이터 마이닝 툴 (data mining tool)인, EnsMart에 SET 도메인을 함유한 단백질을 리스트하였다. 이러한 단백질들 가운데, 본 발명자는 setd3을 선택하였는데, 이는 SET 도메인을 함유한다. Setd3은 제브라피쉬 14번째 염색체에 존재하는 것으로 예측된다.

하기 도 1A에서 나타난 바와 같이, 보존된 도메인 데이터베이스 (Conserved Domain Database)에 대한 blasting setd3으로부터의 데이터는 setd3 구조를 제시하였다. SET 및 Rubis-subs-bind 도메인은 N-말단 (SET domain, 195-314 aa) 및 C-말단 (the Rubis-subs-bind domain, 343-475 aa)에 위치한다 (도 1A). Rubis-subs-bind 도메인은 이러한 단백질이 히스톤 H3 및 H4의 N-말단 꼬리 (N-terminal tails)와 같은 기질과 결합하는 것을 허용한다.

setd3 단백질은 이차구조에서 17 α-helices 및 8 β-sheets로 구성된다 (도 1B). setd3의 이차구조에서, SET 도메인은 세개의 α-helices 와 세개의 β-sheets를 가지고 있다 (도 1B , gray box).

setd3 단백질의 3차원적 예측은 SWISS-Model server를 사용하여 수행되었다. setd3 단백질 이차구조는 완전한 길이를 지닌 77 aa에서 490 aa가지 생성되었다 (도 1C). 3D 단백질 모델링에서, setd3은 중앙에 한 개의 오목한 갈라진 틈을 가진다 (도 1C, red dotted line). SET 도메인은 갈라진 틈 부분에 존재하고, 이러한 지역은 기질에 대한 결합 자리를 함유할 것이다 (도 1D). setd3내의 ssDNA-결합 모티브의 3차원 구조는 두가지 역평행한 β-sheets (yellow ribbons) 및 α-helix (pink ribbon)로 구성된다 (도 1E).

실시예 2: setd3 의 HMTase 활성

2-1. 세포배양 ( Cell culture )

37℃, 5% CO₂ 대기에서 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum , FBS, Welgene) 및 0.5% 항생제 (antibiotics)를 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's 배지 (DMEM, Welgene,Daegu, Korea)에서 세포들을 생장시켰다.

2-2. 단백질 정제 ( Protein purification )

HMTase 활성 분석을 위해, setd3 cDNA 의 전체 길이 오픈 리딩 프레임 (full-length open reading frame)을 pGEX4T1 벡터에 삽입하였다. 야생형 단백질은 37℃에서 4시간 동안 대장균 BL21 (DE3) (Invitrogen)에서 발현되었고 글루타티온-세파로오스 4B (Glutathione-Sepharose 4B)로 정제하였다. 이러한 야생형의 농도는 SDS-PAGE 12% gel의 쿠마시브릴리언트블루 R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250) 염색으로 결정하였다. 비드에 결합된 융합 단백질을 실험관에서 HMTase 활성 분석에 사용하였다.

2-3. HMTase 분석( HMTase assay )

시험관내 50mM Tris (pH 8.5), 20mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM 베타 메르캅토에탄올 (beta-mercaptoethanol), 1.25M 수크로오스 (sucrose), 100nCi S-아데노실-[메틸-¹⁴C]-_L-메티오닌 (S-adenosyl-[methyl-¹⁴C]-_L-methionine ,Amersham Bioscience), 송아지 흉선으로부터의 1-㎍/㎕ 코어 히스톤 (Roche, Basel, Switzerland), 및 0.5 내지 2.5㎍의 GST-setd3 또는 GST를 포함한 50㎕ volumes의 반응버퍼에서 30℃, 2 시간 동안 HMTase 분석을 수행하였다.

단백질을 p81 필터 페이퍼 (filter paper, Millipore, Bedford, MA, USA)를 사용하여 여과하였고, 실온에서 5분 동안 미리 차갑게 한 10% TCA 및 95% 에탄올로 3번 세척하였다. 여과기는 공기건조한 2 mL Gold Ultra (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하였고, 섬광계측기 (scintillation counter, Perkin Elmer)를 사용하여 ¹⁴C-SAM을 측량하였다.

pcDNA6-setd3로 트랜스펙션시킨 HEK293 세포 각각으로부터 총 RNA 샘플을 Trizol reagent (Invitrogen)을 사용하여 추출하였다. 총 RNA (2 ㎍)는 cDNA를 합성하기 위해 사용되었다. cDNA합성에는 oligo-dT 프라이머 (Fermentas,Vilnius, Lithuania)을 사용하였고 정량된 cDNA는 setd3 mRNA 발현 패턴 분석에 사용되었다. 이러한 프라이머 서열 포워드는, 5'-GACGATATCAAAAGAGAAGATTACTTCCCTG-3'이고 리버스는 5'-GGATTCCACAAACTCTGCATTTGACCG-3'이다.

2-4. 웨스턴 블롯

HEK293 세포를 pcDNA6 벡터 또는 pcDNA6-setd3으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포를 용해하고 14% SDS-PAGE에 로딩하고 니트로셀롤로오스 막에 옮겼다. 4℃에서 밤새동안 anti-cleaved caspase-3 (Millipore), anti-procaspase-9 (Santa Cruz Biotechnology), anti-H3K4-me2, anti-H3K9-me2, anti-H3K27-me2, anti-H3K36-me1,anti-H3K36-me2, anti-H3K36-me3, 및 anti-H4K20-me2 (Millipore)로 막을 탐침하였다.

이러한 블롯을 HRP-conjugated goat anti-rabbit antibodies (Santa Cruz Biotechnology)와 함께 배양하고 ECL 시스템 (Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 검출하였다.

2-5. setd3 의 HMTase 활성분석 및 그 결과

SET 도메인은 진화적으로 인간으로부터 하등 진행생물까지 잘 보존되어 있는데, 이는 SET 도메인에서 HMTase 활성의 중요성을 제시한다. setd3의 HMTase 활성을 특정화하기 위해, 본 발명자는 시험관에서 섬광예측기로 정제된 GST-setd3 융합단백질을 가지고 HMTase 분석을 수행하였다.

코어 히스톤과 S-adenosyl [methyl-¹⁴C]-_L-methionine (SAM)을 기질 및 메틸기 도너로서 각각 사용하였다. 시험관내 분석은 용량에 의존적인 방식 (dose-dependent manner)으로 코어 히스톤에서의 setd3의 HMTase 활성을 보여주나 (도 2A), HMTase 활성은 GST 단백질에서는 관찰되지 않는다 (도 2A).

웨스턴 블롯 분석의 결과는 GST-setd3가 H3K36-me1/-me2/-me3를 메틸화시킨다는 것을 나타낸다 (도 2B). 다음 본 발명자는 생체내에서 setd3의 HMTase 활성을 확인하고자 한다. Setd3을 진핵생물 발현 벡터에 클로닝하였다. 본 발명자는 HEK293 세포를 pcDNA6-setd3로 트랜스펙션시키고 총 RNA를 분리하고 setd3 mRNA를 특정 프라이머를 사용하여 증폭시켰다 (도 2C, upper panel). 일시적으로 진핵세포로 트랜스펙션된 pcDNA6-setd3을 anti-myc 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다 (도 2C, lower panel).

setd3이 히스톤을 메틸화시킬 수 있는지를 조사하기 위해, HEK293 세포를 pcDNA6-setd3로 트랜스펙션시키고 anti-H3K4-me2, anti-H3K9-me2, anti-H3K27-me2, anti-H3K36-me1/-me2/-me3, 및 anti-H4K20-me2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 조사된 다른 위치와 비교할 때, setd3의 히스톤 H3K36-모노, 디-, 트리메틸화 활성 (H3K36-mono, -di, and -trimethylating activities)이 증가됨이 밝혀졌다. (도 2D). 총체적으로, 이러한 결과는 setd3이 생체내와 생체밖에서 모두 H3K36 잔기의 모노-, 디-, 트리메틸화에 대해 특이적으로 HMTase 활성을 가짐을 나타낸다.

실시예 3: Setd3 의 전사활성 유도

3-1. 일시적 트랜스펙션 리포터 분석 ( Transient transfection reporter assay )

트랜스펙션 분석은 지시된 부분에서 내부 컨트롤 (internal controls)로서 pcDNA6-setd3, MH100-SV40-Luc, 및 MH100-TK-luc을 사용하여 수행되었다. 48-well 플레이트에서, HEK293 세포는 트랜스펙션 효율성을 표준화하기 위해 pcDNA6-setd3 (50, 100, 또는 150 ng) 및 pCMV-b-gal 플라스미드 (50 ng)의 존재 및 부존재하에서 각 리포터 플라스미드 (100 ng)과 리포펙타민 2000 (Invitrogen)으로 공동 트랜스펙션시켰다.

세포들을 트랜스펙션 후 48시간에 수집하여 세포 배양 시약 (cell culture lysis reagent, Promega, Madison, WI)으로 용해시켰다. 루시퍼라아제 활성을 Glomax 20/20 루미노미터 (Promega)을 사용하여 측정하였다. 루시퍼라아제 활성은 β-갈락토시다아제에 대해 표준화하였다.

3-2. Setd3 의 전사활성 유도 및 그 결과

setd3의 H3K36 메틸화가 일반적 전사의 활성에 기여할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자는 MH100-SV40-Luc 및 MH100-Tk-Luc 리포터 시스템을 사용하여 일시적 트랜스펙션 분석을 수행하였다.

pcDNA6-setd3의 HEK293로의 트랜스펙션결과 용량 의존적인 방식 (dose-dependent manner)으로 양쪽 리포터 시스템에서 루시퍼라아제 활성을 활성화시켰다. 이는 상대적 루시퍼라아제 활성이 최종적으로 양쪽 시스템에서 기본 전사 (basal transcription)의 2.2 배 및 5배 가량 증가하였음을 나타낸다 (도 3B 및 C).

setd3의 전사 조절에서 SET 도메인의 역할을 조사하기 위해, setd3 결실 돌연변이체를 가지고 리포터 분석을 수행하였다 (도 3A). setd3 야생형과 유사하게, 전사 활성은 SET 도메인 손상없는 setd3-N 돌연변이체로 트랜스펙션된 세포 (SET domain intact setd3-N mutant transfected cells)에서만 증가되었다. 그러나, SET 도메인 결핍된 setd3-C는 어떤 시스템에서도 전사가 활성화되지 않았다 (도 3B 및 C). 이러한 결과는 setd3가 H3K36 HMTase 활성을 통해 전사를 활성화시킴을 나타낸다.

실시예 4: Setd3 에 의한 세포사멸

4-1. MTT (3-(4,5- dimethylthiazol -2- yl )-2,5- diphenyltetrazolium bromide) 분석

HEK293, HeLa, 및 NIH-3T3 세포를 48-well 플레이트 (2 x 10³ cells/well)에서 접종하였고 일시적으로 pcDNA6-setd3으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시킨 후 0 내지 48시간에, MTT가 세포에 첨가되었고 (20 ㎕, 최종농도 0.5 mg/mL), 이것을 37℃에서 4시간 동안 배양하고 배지를 aspiration시키고 DMSO (150 ㎕)를 첨가하였다. OD는 570nm 파장에서 ELISA 리더 (Biochrom, Cambridge, England)로 결정하였다. DMSO만 첨가된 대조군 (blank)을 측정하고 그 값을 빼 주었다.

4-2. Setd3 에 의한 세포사멸 및 그 결과

여러가지 HMTases는 발생과 세포성장에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 세포성장에서 setd3의 영향을 조사하기 위해, MTT 분석을 수행하였고, 세포 생존력을 트랜스펙션 후 12시간 마다 모니터하였다.

setd3의 일반적 효과를 보기 위해 다른 인간 조직 (embryonic kidney and cervical cancer)과 다른 종 (mouse fibroblast)으로부터 얻은 세포주 (Cell lines)를 사용하였다. 트랜스펙션 후 48시간에 무처리 세포에서와 비교할 때, 바늘과 같은 크리스탈인, MTT 포르마잔 엑소시토시스 (MTT formazan exocytosis)의 마커의 형성이 setd3 과발현된 세포에서 상당히 감소하였다.

setd3 트랜스펙션된 세포에서의 상대적 생존력을 대조군 세포와 비교할 때, 사용된 세포주 모두에서 대략 40%가량이 점차적으로 감소되었다 (도 4A, B 및 C).

이러한 결과는 setd3이 세포증식을 저해한다는 것을 설명한다. 제브라피쉬 setd3 과발현된 세포는 세포사멸과 관련된 단백질의 발현수준 변화가 있는지를 결정하기 위하여, 본 발명자는 웨스턴 블롯 분석에 의해 카스파제-9 및 카스파제-3과 같은 세포사멸에서의 중요한 조절자의 발현을 조사하였다. 비활성형태의 프로카스파제-9의 수준은 무처리 (untreated)된 것이나 mock와 비교할 때, 제브라피쉬 setd3 트랜스펙션된 세포에서 감소되었다.

프로카스파제-9 (procaspase-9) 수준과 대비하여, 카스파제-3 (p17)의 활성형태인 절단된 카스파제-3은 제브라피쉬 setd3 과발현 세포에서 상당히 증가되었다 (도 4D). 이러한 결과는 제브라피쉬 setd3 과발현이 카스파제-의존적 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다.

<110> CHUNG ANG University Industry Academic Cooperation <120> Method for inducing apoptosis and the Composition <130> DP-2011-0218 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Set domain # 1 aa in Zebrafish <400> 1 Arg His Leu Leu Ala Thr Gln Ala Ile Gln Asp Val Leu Ser Gln Tyr 1 5 10 15 Lys Asn Thr Ala Arg Gln Tyr Ala Tyr Phe Tyr Lys Val Ile His Thr 20 25 30 His Pro Asn Ala Ser Lys Leu Pro Leu Lys Asp Ala Phe Thr Phe Asp 35 40 45 Asp Tyr Arg Trp Ala Val Ser Ser Val Met Thr Arg Gln Asn Gln Ile 50 55 60 Pro Thr Ala Asp Gly Ser Arg Val Thr Leu Ala Leu Ile Pro Leu Trp 65 70 75 80 Asp Met Cys Asn His Thr Asn Gly Leu Ile Thr Thr Gly Tyr Asn Leu 85 90 95 Glu Asp Asp Arg Cys Glu Cys Val Ala Leu Lys Asp Tyr Lys Glu Gly 100 105 110 Glu Gln Ile Tyr Ile Phe Tyr Gly 115 120 <210> 2 <211> 596 <212> PRT <213> Setd3 #2 aa in Zebrafish <400> 2 Met Gly Lys Lys Ser Arg Val Lys Thr Gln Lys Ser Gly Thr Gly Ala 1 5 10 15 Thr Ala Ala Val Ser Pro Lys Glu Met Met Asn Leu Ile Ser Glu Leu 20 25 30 Leu Gln Lys Cys Ser Ser Ala Ala Pro Ser Pro Gly Lys Glu Trp Glu 35 40 45 Glu Tyr Val Gln Ile Arg Ala Leu Val Glu Lys Ile Arg Lys Lys Gln 50 55 60 Lys Gly Met Ser Val Ser Phe Glu Gly Ile Arg Glu Asp Phe Phe Ser 65 70 75 80 Glu Leu Met Ala Trp Ala Ala Glu Cys Arg Ala Ser Cys Asp Gly Phe 85 90 95 Glu Ile Ser Asn Phe Ala Asp Glu Gly Tyr Gly Leu Lys Ala Thr Lys 100 105 110 Asp Ile Lys Ala Glu Glu Leu Phe Leu Trp Ile Pro Arg Lys Met Leu 115 120 125 Met Thr Val Glu Ser Ala Lys Asn Ser Val Leu Gly Pro Leu Tyr Ser 130 135 140 Gln Asp Arg Ile Leu Gln Ala Met Gly Asn Val Thr Leu Ala Leu His 145 150 155 160 Leu Leu Cys Glu Arg Ala Asn Pro Ser Ser Pro Trp Leu Pro Tyr Ile 165 170 175 Lys Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Asp Thr Pro Leu Tyr Phe Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Val Arg His Leu Leu Ala Thr Gln Ala Ile Gln Asp Val Leu Ser 195 200 205 Gln Tyr Lys Asn Thr Ala Arg Gln Tyr Ala Tyr Phe Tyr Lys Val Ile 210 215 220 His Thr His Pro Asn Ala Ser Lys Leu Pro Leu Lys Asp Ala Phe Thr 225 230 235 240 Phe Asp Asp Tyr Arg Trp Ala Val Ser Ser Val Met Thr Arg Gln Asn 245 250 255 Gln Ile Pro Thr Ala Asp Gly Ser Arg Val Thr Leu Ala Leu Ile Pro 260 265 270 Leu Trp Asp Met Cys Asn His Thr Asn Gly Leu Ile Thr Thr Gly Tyr 275 280 285 Asn Leu Glu Asp Asp Arg Cys Glu Cys Val Ala Leu Lys Asp Tyr Lys 290 295 300 Glu Gly Glu Gln Ile Tyr Ile Phe Tyr Gly Thr Arg Ser Asn Ala Glu 305 310 315 320 Phe Val Ile His Asn Gly Phe Phe Phe Glu Asp Asn Ala His Asp Arg 325 330 335 Val Lys Ile Lys Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Arg Leu Tyr Ala Met 340 345 350 Lys Ala Glu Val Leu Ala Arg Ala Gly Ile Pro Ala Ser Ser Ile Phe 355 360 365 Ala Leu His Cys Ser Glu Pro Pro Ile Ser Ala Gln Leu Leu Ala Phe 370 375 380 Leu Arg Val Phe Cys Met Thr Glu Glu Glu Leu Arg Asp Tyr Leu Val 385 390 395 400 Gly Asp His Ala Ile Asn Lys Ile Phe Thr Leu Gly Asn Thr Glu Phe 405 410 415 Pro Val Ser Trp Glu Asn Glu Ile Lys Leu Trp Thr Phe Leu Glu Thr 420 425 430 Arg Ala Ala Leu Leu Leu Lys Thr Tyr Lys Thr Ala Ser Glu Glu Asp 435 440 445 Arg Ser Met Leu Glu Lys Pro Asp Leu Ser Leu His Ser Arg Ile Ala 450 455 460 Ile Lys Leu Arg Leu Ala Glu Lys Glu Ile Leu Glu His Ala Val Ser 465 470 475 480 Cys Gly Arg Ala Lys Arg Leu His Phe Gln Lys Gln Leu Asp Glu Gly 485 490 495 Ala Pro Leu Pro Leu Tyr Glu Glu Ser Asp Ile Ala Leu Leu Glu Asn 500 505 510 Ala Asp Ala Lys Leu Pro Ile Ile Leu Arg Lys Leu Glu Glu Glu Glu 515 520 525 Glu Glu His Val Glu Glu Met Asn Gln Leu Thr Pro Asp Ala Val Cys 530 535 540 Met Asn Ser Ser Lys Ile Pro Val Leu Asn Gly Gln Cys Lys Asp Leu 545 550 555 560 Asn Gly Thr Gln Glu Asp Pro Pro Gly Gly Gly Ala Val Val Lys Glu 565 570 575 Ile Glu Lys His Asp Pro Ser Ala Lys Arg Thr Glu Gly Glu Pro Lys 580 585 590 Asp Ala Gly Lys 595

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 setd3을 유효성분으로 포함하는, 암질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
4. 삭제
5. 제 3항에 있어서, 상기 암질환은 자궁경부암인 것을 특징으로 하는 암질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.

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