KR20190047489A - 53bp1의 신규한 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 53BP1 유전자 또는 단백질의 항암 용도 및 53BP1 점돌연변이체의 항암보조제 용도에 관한 것으로, 일반 고형암뿐만 아니라, p53 변이성 암세포에서 민감하게 세포 사멸을 유도하는 효과를 가지며, 종래의 항암제와 함께 처리하는 경우 항암효과를 현저히 향상시킬 수 있어, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

53BP1의 신규한 용도{NOVEL USE OF 53BP1}

본 발명은 53BP1 유전자 또는 단백질의 항암 용도 및 53BP1 점돌연변이체의 항암보조제 용도에 관한 것이다.

유전자 안정성은 세포내의 다양한 인자들에 의해 염색체 안정이 유지되고 있으며 이는 염색체 불안정화에 의해 유발 가능한 다양한 질환으로부터 인체를 보호하고 있다. 특히 중심체의 수나 구조에서의 이상은 유전자 불안정성을 유발하는 인자 중 하나로 알려져 있으며 암, 섬모질환 등과 같은 질환에서 중심체의 구조와 수가 비정상적인 것이 잘 알려져 있다(Nigg and Raff, Cell 139(2009) 663-638). 중심체는 마이크로튜불을 관장하는 중심으로 세포 분열시 방추사 형성 또는 섬모 형성에 관여하고 있다. 2개의 중심소체로 구성되어 있는 데, DNA 복제기에 중심소체도 복제되어 모중심소체와 딸중심소체가 1쌍을 이루다가 세포분열과 함께 나누어진다(Nigg, Trends Cell Biol 17(2007) 215-221). 이러한 중심체는 중심소체의 과복제, 세포 분열의 실패, 세포간 융합 등의 과정이 존재하면 하나의 세포에 과잉의 중심체가 존재하게 된다(Ganem et al., Nature 460(2009) 278-282; Godinho and Pellman, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 369(2014) 20130467). 과잉의 중심체 또는 중심소체의 존재는 세포 분열기에 양극의 방추극체 형성이 아닌 과잉의 방추극체가 다극을 형성하게 하여 세포 분열이 정상적으로 이루어지지 않아 세포분열기가 억제되거나, mitotic catastrophe를 통한 사멸을 할 수 있다. 하지만 암세포의 경우 생존을 위하여 과잉의 중심체를 양극으로 결집하여 유사 이중 방추극체 형성을 통하여 생존하게 되며 이러한 경우 유전적 불안정성이 야기된다. 따라서 과잉의 중심체는 암, 섬모질환에서 관찰되는 현상이며, 세포의 유전적 불안정성 유발을 통한 암세포 발달의 원인으로 작용하게 된다. 실제로 유방암, 전립선암, 대장암, 폐암, 간암 등 거의 모든 암 종에서 과잉중심체가 존재함이 잘 알려져 있다(Zyss and Gergely, Trends in Cell Biol 19(2009) 334-346). 따라서 유전적 불안정성의 원인이 되는 과잉중심체 형성세포 제거를 통한 질환치료 약물개발은 차세대 항암치료 및 섬모질환 치료에 있어 중요한 이슈가 되고 있다. 최근 탁솔(taxol) 이나 그리세오풀빈(griseofulvin) 등을 골격으로하는 화합물이 비정상적인 중심체 형성 암세포를 제거하는 약물 개발의 후보군으로 연구되고 있으나(Godinho and Pellman, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 369(2014) 20130467) 아직까지 뚜렷한 연구 결과를 이끌어 내지 못하고 있다.

p53-binding protein 1(53BP1)은 p53에 결합하는 단백질로 처음 발견되었다(Iwabuchi et al., Proc Natl Acad Sci USA 91(1994) 6098-6102). 53BP1은 구조적으로 1972개 아미노산을 지니고 있고 BRCA 유전자에서 도메인(domain)인 BRCT 도메인(domain)을 지닌 단백질이며, 기능적으로 DNA 손상 복구 신호를 전달하는 중간 매개체로서의 작용(Wang et al, Science 298(2002) 1435-1438)이 많이 연구되었다. 최근 DNA 손상 복구 경로를 결정하는 인자임이 밝혀져 53BP1의 세포 손상 복구에서의 중요성이 부각되고 있다(Panier and Boulton, Nature Rev Mol Cell Biol 15(2014); Kim and Yim, Frontiers in Bioscience, in press; 7-18). 또한 53BP1은 DNA 손상 기전과는 별개로 세포 주기에서 세포 분열을 조절하는 인자로도 많은 증거들이 축적되어 있다. 세포 분열기에 53BP1 발현이 증가되며 결핍 시에는 세포 분열이 지연되는데 이는 53BP1의 중심체 조절기능과 연관성이 제기되었다(Meitinger et al., J Cell Biol 214(2016) 155-166; Lambrus et al., J Cell Biol 214(2016) 143-153; Yim et al, Oncogene 36(2017) 966-978). 항암치료제에 대한 저항성을 나타내는 암세포의 경우, 53BP1의 존재가 암세포에서의 DNA손상 유발 항암제의 민감도를 높혀 주는 기능을 한다고 보고되어 있다(Li et al, Plos One(2013) e74928). 그러나, 53BP1 자체가 항암 활성을 갖는지에 대해서는 어떠한 언급 또는 개시가 없다.

본 발명은 암의 치료에 있어서 53BP1의 mRNA 발현 조절이 암의 예방 또는 치료와 직접적인 관련이 있음을 밝혀 새로운 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 53BP1 단백질의 점돌연변이체가 암의 예방 또는 치료와 직접적인 관련이 있음을 밝혀 그 새로운 용도를 제공하는데 목적이 있다.

또한, 본 발명은 53BP1 단백질의 점돌연변이체가 항암제의 민감성을 개선, 향상 또는 증대시키는 항암보조제로서 용도를 새롭게 밝히고 그 용도를 제공하는데 목적이 있다.

본 발명자들은 암세포에서의 암세포 사멸 활성을 촉진시키고 p53이 돌연변이 된 암세포 에 대하여 선택적으로 증식을 억제할 수 있는 항암물질 개발에 노력한 결과, 53BP1의 발현을 억제하는 shRNA를 제작하여 렌티바이러스를 이용하여 암세포의 그 사멸에 미치는 효과를 관찰한 결과 강력한 암세포 사멸 유도제로서 효과를 확인하였고, 특히 p53 돌연변이성 암세포에 대하여 민감하고 선택적인 사멸 효과를 보여줌으로써, 항암작용이 뛰어난 물질임을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 또한 53BP1 단백질의 점돌연변이체를 제작하여 안정적으로 단백질 발현이 유지됨으로써, 항암제에 대한 민감도를 개선 또는 향상시킬 수 있음을 확인하고, 53BP1 단백질 변이체는 DNA 손상성 항암제에 의한 항암치료를 증진시킬 수 있어 약물저항성이 유발된 항암치료에서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이러한 측면에서 본 발명은 53BP1 억제제 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 S380 변이를 포함하는 53BP1 변이단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 표시되는 염기서열에서 연속되는 10 내지 20 뉴클레오티드를 표적서열로 하여 53BP1의 mRNA 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 제공한다.

또 다른 일 측면에서, 본 발명은 상기 올리고 뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.

또 다른 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 S380 변이를 포함하는 53BP1 변이단백질을 유효성분으로 포함하고, 항암제의 민감성을 개선, 향상 또는 증대시키는 항암보조제용 조성물을 제공한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 53BP1의 발현 억제제 또는 53BP1 변이단백질은 암의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있고, 항암제에 대한 보조치료제 또는 병용치료제로서 53BP1 변이단백질을 함께 투여하는 경우 다양한 암종에서 기존 항암제의 민감도를 향상, 개선 또는 증진시키는 효과가 있어, 암 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1a 및 1b는 본 발명의 실시예에 따라 53BP1 단백질의 세포분열기에 따른 선택적 발현을 확인한 결과로, 1a는 면역블롯 분석 결과이고, 1b는 FACS 분석법을 통해서 세포주기를 관찰한 결과를 나타내며, Plk1은 세포분열기 양성 대조군 NZ(Nocodazole)은 세포분열기 유도 약물을 의미한다.
도 2a, 2b 및 2c는 는 본 발명의 실시예에 따른 53BP1 shRNA가 53BP1 발현 억제를 통한 고형암에서의 세포 분열 억제 효과를 확인한 것으로, 2a는 3BP1 shRNA에 의해 53BP1 단백질 발현 억제율; 2b는 53BP1 shRNA에 의해 증가되는 세포분열기 세포를 p-H3항체와 MPM2 항체로 검출한 각 항체에 대한 양성세포 측정도; 그리고 2c는 53BP1 shRNA에 의해 증가되는 세포분열기 결함을 각 형태별로 분석한 결과를 나타낸다.
도 3a, 3b 및 3c는 은 본 발명의 실시예에 따른 53BP1 shRNA가 53BP1 발현 억제를 통한 고형암세포에서의 세포 사멸 촉진을 통한 항암효과를 확인한 것으로, 3a는 53BP1 shRNA에 의한 암세포 선택적 사멸 효과; 3b는 53BP1 shRNA에 의한 세포분열기 증가 및 DNA 절단에 의한 사멸세포 증가도; 그리고 3c는 53BP1 shRNA에 의한 활성형 caspase 3 양성세포 증가도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a, 4b 및 4c는 는 본 발명의 실시예에 따라 53BP1 mRNA를 유전자가위(CRISPR/Cas9)로 제거한 경우 다양한 고형암에서 과잉중심체 형성을 통한 암세포 사멸효과를 확인한 것으로, 4a는 53BP1 유전자가위(CRISPR/Cas9)를 이용한 53BP1 발현 억제; 4b는 53BP1 유전자가위(CRISPR/Cas9) 발현에 의한 자궁경부암 세포주(HeLa), 육종 세포주(U2OS), 폐암 세포주(NCI-H460)에서의 DNA 절단에 의한 암세포 사멸도; 4c는 53BP1 유전자가위(CRISPR/Cas9) 발현에 의한 자궁경부암 세포주(HeLa), 육종 세포주(U2OS), 폐암 세포주(NCI-H460)에서의 과잉의 중심체 형성에 의한 세포분열 교란을 관찰한 도면을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 본 발명의 실시예에 따라 53BP1 mRNA를 유전자가위(CRISPR/Cas9)로 제거한 경우 p53 결핍성 고형암에서 선택적이고 민감한 항암효과를 확인한 것으로, 5a는 p53 원형인 폐암세포주 NCI-H460(H460^Ctrl)과 p53을 결핍시킨 폐암세포주 NCI-H460(H460^{p53 -})에서 53BP1 결핍에 의한 과잉의 중심체 형성 증가 효과; 그리고 5b는 p53을 결핍시킨 폐암세포주 NCI-H460((H460^{p53 -})에서 53BP1 결핍에 의한 사멸세포 증가도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6a, 6b 및 6c는 은 본 발명의 실시예에 따라 점 돌연변이를 함유하는 53BP1 단백질이 안정적으로 발현되는 효과를 확인한 것으로, 6a는 HA-53BP1의 아스파르트(aspart) 돌연변이체의 안정적 발현 양상; 6b는 HA-53BP1의 아스파르트(aspart) 돌연변이체 발현이, 53BP1 결핍에 의해 유발되는 과잉 중심체 형성을 감소시켜 유전자 안정화를 증가시킨 양상; 그리고 6c는 HA-53BP1의 아스파르트(aspart) 돌연변이체 발현이, 53BP1 결핍에 의해 증가되는 사멸세포를 감소시킨 양상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7a, 7b 및 7c는 본 발명의 53BP1의 mRNA 서열(Gene accession no. AF078776)이다. 노란색 음영으로 표시된 부분은 mRNA 전체 서열 중 코딩부위를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 53BP1 단백질의 아미노산 서열이다.
도 9a, 9b, 9c 및 9d는 본 발명의 53BP1 단백질의 제조에 사용된 cDNA 서열이다. 각 서열에서 별도의 노란색 또는 붉은색으로 표시된 서열은 본 발명의 일 실시예에 따른, 표적서열을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

본 발명은 53BP1(p53-binding protein 1) 억제제 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 S380 변이를 포함하는 53BP1 변이단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본원발명에서 "p53-결합 단백질 1(p53-binding protein 1; 53BP1, gene access no. AF078776;서열번호 1, 서열번호 3)"은 p53에 결합하는 단백질로 처음 발견된 것으로, 53BP1 단백질은 구조적으로 1972개 아미노산을 지니고 있고 BRCA 유전자에서 도메인(domain)인 BRCT 도메인(domain)을 지닌 단백질이며, 기능적으로 DNA 손상 복구 신호를 전달하는 중간 매개체로서의 작용(Wang et al, Science 298(2002) 1435-1438)하는 것으로 많이 연구되었다. 최근 DNA 손상 복구 경로를 결정하는 인자 또는 DNA 손상 기전과는 별개로 세포 주기에서 세포 분열을 조절하는 인자로서 기능이 밝혀지고 있으나, 53BP1 자체가 항암 활성을 갖는지에 대해서는 보고된 바 없었다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서 53BP1 mRNA의 발현을 억제하는 shRNA를 이용하여 상기 mRNA의 발현을 억제하는 경우, 암세포에서만 특이적으로 세포사멸이 촉짐됨 확인하였고, 53BP1 단백질 변이체를 처리하는 경우, 암세포의 사멸효과를 나타냄을 확인함으로서, 53BP1이 암 치료 타겟으로 적합함을 확인하였다.

본 발명에서 "53BP1 억제제"는 53BP1 mRNA 또는 53BP1 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로는 53BP1에 직접적으로 작용하거나, 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 방식으로 53BP1의 발현을 전사 수준에서 방해하거나 그 활성을 저해하여 53BP1의 발현 또는 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 "53BP1"은 별도의 언급이 없는 한 53BP1 mRNA와 단백질을 모두 지칭하는 것으로 해서될 수 있다.

상기 53BP1 억제제는 53BP1 mRNA 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한없이 모두 본 발명에 포함된다. 상기 53BP1 억제제는 이에 제한되는 것은 아니나, 구체적으로 53BP1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드; 또는 53BP1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편일 수 있다.

이러한 측면에서 본 발명은 서열번호 1의 표시되는 염기서열에서 연속되는 5 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 30 뉴클레오티드를 표적서열로 하여 53BP1의 mRNA 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 표적서열은 서열번호 4 내지 18의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열 일 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 상기 서열번호 1의 53BP1(p53-binding protein 1) mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터일 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 약학적 조성물은 53BP1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 상기 뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터의 형태로 포함할 수 있고, 따라서, 본 발명은 53BP1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 상기 뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 도입 시킬 수 있는 것을 의미하며, 도입 및 발현할 수 있는 발현벡터를 포함하며, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 벡터는 예를 들어 바이러스 벡터일 수 있다. 더욱 바람직하게는 유전자 발현이 안정적이고, 세포에 효과적으로 유전자를 전달할 수 있는 렌티 바이러스 벡터(Lenti Viral Vector), 아데노 바이러스 벡터(Adono Viral Vector) 또는 아데노-관련 바이러스 벡터(Adeno-associated Viral Vector, AAV) 일 수 있다. 바람직하게는 렌티 바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터 일 수 있다. 렌티바이러스를 벡터로 사용하는 경우 유전자 전달 효율이 높고, 면역 반응 부작용이 거의 없다는 장점이 있다. 상기 벡터는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것을 이용할 수 있다. 상기 벡터는 본 발명의 올리고 뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것으로, 개체 내에 투여되는 경우, 장시간에 걸쳐 올리고 뉴클레오티드를 제공함으로써, 우수한 항암효과를 가질 수 있다.

상기 53BP1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 표시되는 염기서열에서 연속되는 5 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 30 뉴클레오티드를 표적서열로 하여 53BP1의 발현 또는 활성을 억제하는 것 일 수 있다. 구체적인 예로, 서열번호 3의 서열에서 3785~3805 위치의 서열(서열번호 4), 2686~2706 위치의 서열(서열번호 5), 5276~5296 위치의 서열(서열번호 6), 198~218 위치의 서열(서열번호 7), 841~861 위치의 서열(서열번호 8), 3208~3228 위치의 서열(서열번호 9), 407~427 위치의 서열(서열번호 10), 1982~2002 위치의 서열(서열번호 11), 4726~4746 위치의 서열(서열번호 12), 4584~4604 위치의 서열(서열번호 13), 4028~4048 위치의 서열(서열번호 14), 1992~2012 위치의 서열(서열번호 15), 3978~3998 위치의 서열(서열번호 16), 1420~1440 위치의 서열(서열번호 17) 또는 2836~2856 위치의 서열(서열번호 18)을 표적서열로 하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열을 표적으로하는 경우, 더욱 효과적으로 53BP1의 발현 또는 활성을 억제할 수 있다.

상기 53BP1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 53BP1 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.

본 발명에서 "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특성 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 할 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 53BP1 서열에 상보적이고, 상기 서열에 결합할 수 있는 DAN 또는 RNA 서열을 의미한다. 일 예로, 서열번호 4 내지 18로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열에 상보적인 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 것 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 5 내지 100 염기, 또는 8 재니 60 염기, 또는 10 내지 40 염기, 또는 10 내지 30 염기 일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여되거나, 생체 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드가 합성는 형태로 투여될 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 생물/화학적인 방법에 의하여 합성될 수 있다. 또한, 생체 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드가 합성되도록 하는 형태는 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 발현시키는 재조합벡터 등을 이용하여 실현할 수 있고, 이러한 상법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 디자인은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기서열을 참조하여, 본 발명의 기술분야에서 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다. 일 예로, 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 18의 서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 것 일 수 있다.

본 발명에서 "앱타머(aptamer)"는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로, 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 서열에 따라 다양한 3 차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적에 결합함으로써, 소정의 표적의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 53BP1 mRNA에 결합하여 53BP1의 발현 또는 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 53BP1의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고 뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀(hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서(dicer)에 의해 절단되면서 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고 뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 목적상 53BP1에 특이적으로 작용하여 53BP1 mRNA 분자를 절단하여 RNA 간섭(RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 53BP1을 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

특히, 본 발명의 53BP1에 대한 siRNA는 서열번호 4 내지 서열번호 18 중 어느 하나의 올리고 뉴클레오티드 및 이의 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 이중 가닥으로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 shRNA는 서열번호 4 내지 서열번호 18 중 어느 하나의 서열을 표적서열로 하는 것 일 수 있다. 구체적으로 서열번호 4 내지 서열번호 18 중 어느 하나의 서열의 센스 뉴클레오티드와 이와 상보적인 서열의 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 센스와 안티센스 뉴클레오티드 사이에 루프서열을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이에 제한되는 것은 아니나, 더욱 구체적인 예로, 본 발명의 shRNA는 서열번호 19 내지 48 중 어느 하나의 프라이머 쌍으로 제작한 재조합 벡터로 발현될 수 있다. 본 발명의 shRNA에 사용되는 루프서열은 53BP1의 발현 또는 활성 억제를 위해서 그 표적서열을 명확히 하는 경우, 상기 루프서열은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 서열을 이용할 수 있으므로, 권리범위가 여기에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "miRNA(micro RNA)"는 세포 내에서 자연적으로 존재하는 물질로, RNAi 현상을 유도하여 특정한 유전자의 조절에 관여하는 물질을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 하나의 항체 분자는 두 개의 중쇄(heavy chain) 및 두 개의 경쇄(light chain)로 구성되어 있으며, 이들 각각의 중쇄 및 경쇄는 가변 영역과 고정 영역을 포함한다. 상기 가변 영역은 3개의 상보성 결정 부위(Complementarity Cetermining Region: CDR) 및 4개의 구조 형성 부위(Framework Region; FR)를 포함하며, 상기 상보성 결정 부위들에 의해 항체와 항원 사이의 결합 부위가 형성되어 특정 항원에 대한 항체의 결합 특이성이 생성될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 53BP1 단백질의 활성을 억제하는 항체라면 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어, 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항체 단편 등을 모두 포함할 수 있다. 또한, 키메라성 항체 또는 이종 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 암의 예방 또는 치료는 암 세포 특이적 세포 사멸(apoptosis)에 의하여 달성되는 것일 수 있다. 상기 세포 사멸은 세포가 죽는 일 형태로서 물리적으로 세포가 파괴되는 세포 괴사(necresis)와는 구별되는데, 예정세포사(programmed cell death)로도 일컬어지며 DNA가 손상되거나 불필요하게 된 세포가 스스로 사멸하는 과정을 말한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 53BP1 shRNA에 의한 암세포 사멸 촉진 효과는 53BP1을 억제하여 세포주기에서 세포분열을 차단함으로써 세포 사멸을 유도하고, 정상세포에 대해서는 53BP1 억제에 의한 세포사멸이 나타나지 않음을 확인하였는바, 본 발명의 53BP1의 억제는 상당히 엄격하게 암 세포 특이적으로 세포사멸을 유도할 수 있고, 따라서 본 발명의 53BP1 억제제가 항암제로 사용될 경우 정상 세포에는 영향을 미치는 부작용 없이 암세포 특이적 세포사멸을 유도할 수 있음을 시사하는 것이다.

또한, 본 발명은 53BP1 변이단백질에 관한 것이다.

상기 53BP1 변이단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 S380 변이를 포함하는 것 일 수 있다. 상기 53BP1 변이단백질은 서열번호 2의 380 위치의 세린(serine; S)이 아스파라긴산(aspartic acid; D)으로 치환된 S380D 53BP1 변이단백질 또는 알라닌(alanine; A)으로 치환된 S380A 53BP1 변이단백질 일 수 있다. 바람직하게는 S380A 53BP1 변이단백질이 본 발명의 약학적 조성물에서 우수한 항암활성을 가지는 것을 일 실시예에서 확인 하였다. 또한, S380D 53BP1 변이단백질 이 암세포에서도 안정적으로 발현되는 특성을 나타냄을 본 발명의 일 실시예에서 확인 하였다.

구체적인 일 실시예에서, S380D 및 S380A 53BP1 변이단백질에 의하여 암세포의 사멸이 촉진되는 효과(도 6c)를 확인하였는바, 본 발명의 S380D 및 S380A 53BP1 변이단백질 본 발명의 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있다. 이러한 측면에서 본 발명은 53BP1 변이단백질을 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

바람직하게 항암용 조성물의 유효성분으로서 상기 변이단백질은 S380A 53BP1 변이단백질 일 수 있다. S380A 변이가 53BP1 단백질의 불안정화를 유발하여 단백질 분해를 촉진함으로써, 암세포의 사멸 촉진에서 우수한 효과를 가질 수 있다. 구체적으로 S380A 53BP1 변이단백질의 경우 암세포의 사멸을 촉진하는 효과가 대조군 또는 다른 변이단백질 보다 우수함을 도 6c를 참고하면 알 수 있다.

본 발명의 S380 53BP1 변이단백질은 이를 코딩하는 유전자 또는 이를 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 벡터 형태로 약학적 조성물의 유효성분으로서 포함될 수 있다따라서, 본 발명은 서열번호 2에서 S380 변이를 포함하는 53BP1 변이단백질을 코딩하는 폴리뉴클레티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 이러한 측면에서 본 발명은 53BP1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터; 서열번호 2에서 S380 변이를 포함하는 53BP1 변이단백질을 코딩하는 폴리뉴클레티드; 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양(tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양(benign tumor)과 악성 종양(malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 암의 진행에 따라 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어날 수 있다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암(cancer)'이라 한다.

본 발명에서 상기 암은 구체적으로 항암제 등의 치료를 받지 않았거나, 항암치료에 의하여 항암제에 대한 내성(저항성)이 발생하지 않은 경우 또는 다른 조직으로 전이되는 전이성 암으로 발달되지 않은 경우를 "1차 암"으로 구분하여 정의할 수 있다. 항암제에 대한 내성이 발생하거나 전이성 암으로 발달되는 경우, 1차 암세포와 표현형 및 암세포의 성질이 상이해지는 특성이 나타나는데, 본 발명의 경우 53BP1의 발현 억제가 1차 암종에 대하여 우수한 세포사멸 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 본 발명의 53BP1 억제제 또는 변이단백질을 포함하는 약학적 조성물은 1차 암의 예방 또는 치료용 일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서, 53BP1 shRNA에 의한 암세포 사멸 촉진 효과는 53BP1의 발현을 억제하여 세포주기에서 세포분열을 차단함으로써 세포 사멸을 유도함을 관찰하였고, 특히 p53이 결핍된 폐암에서의 세포분열 억제 및 세포사멸 촉진효과가 p53 원형의 폐암에서보다 강력한 항암효과가 있음을 확인하였는바, 본원발명에서 상기 암의 구체적으로 p53의 결핍 또는 저해를 나타내는 p53 결핍 또는 돌연변이성 고형암 일 수 있다. 또한, 이러한 측면에서 본원발명의 약학적 조성물은 p53 결핍 또는 돌연변이성 고형암의 예방 또는 치료용일 수 있고, 또는 p53 결핍 또는 돌연변이성 고형암 환자의 예방 또는 치료용 일 수 있다.

상기 암은 고형암일 수 있고, 구체적인 암의 종류로는 뇌종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 본 발명의 암의 종류가 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "개체"는 암 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물 또는 항암보조제용 조성물을 개체에 투여함으로써, 간암을 비롯한 암을 완화 또는 치료할 수 있다. 상기 완화는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

구체적으로 상기 개체는 p53 결핍 또는 돌연변이성 암 질환을 보유하고 있는 개체 일 수 있다. 또한, 상기 개체는 종래에 항암치료를 받지 않았거나, 항암치료를 받았음에도 내성(저항성)이 나타나지 않은 1차 암을 가지는 개체일 수 있다.

본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 53BP1을 억제하는 물질 또는 53BP1 변이단백질을 포함하는 조성물의 투여로 암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다.

또한, "예방"은 본 발명에 따른 53BP1을 억제하는 물질 또는 53BP1 변이단백질을 포함하는 조성물의 투여로 상기 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 치료를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

또한, 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 선택하는 것이 바람직하며, 본 발명의 암세포사멸 촉진 효과를 나타내는 항암용 조성물은 성인의 체중 1㎏ 당 1 내지 100 ㎎, 바람직하게는 1 내지 10 ㎎의 투여양으로 매일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 암세포 사멸 촉진 항암제는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구로 투여할 경우, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용으로 제제화하기 위해서는 상기 세포사멸 촉진 항암제를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, '약제학적으로 허용가능한 담체'는 투여용 약제학적 활성 화합물을 제형화할 경우에 유용하고 사용 조건하에 사실상 비독성 및 비민감성인 공지된 약제학적 부형제를 의미한다. 이러한 부형제의 정확한 비율은 유효성분의 용해도와 화학적 특성, 선택된 투여경로뿐만 아니라, 표준 약제학적 관행에 의해 결정된다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 발명의 약학 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다. 또한, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따라 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 S380 변이를 포함하는 53BP1 변이단백질을 유효성분으로 포함하고, 항암제의 민감성을 개선, 향상 또는 증대시키는 항암보조제용 조성물에 관한 것이다.

53BP1 변이단백질에 대해서는 상기한 사항을 준용할 수 있다.

본 발명에서 "항암보조제"는 항암제의 전/후/또는 함께 개체에 투여됨으로써 항암제의 항암활성을 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 것으로, 항암제에 대한 보조치료제 또는 병용치료제 일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 변이 단백질은 암세포 또는 암을 가진 개체의 항암제에 대한 민감성(감수성)을 높여줌으로써 항암제의 항암활성을 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 것을 의미한다.

상기 항암제는 바람직하게는 DNA 손산성 항암제 일 수 있다. DNA 손상성 항암제는 본 발명의 기술분야에서 알려져있거나, 상업적으로 판매되는 것이라면 모두 포함된다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 서열번호 2의 380 위치의 세린(serine; S)에 점 돌연변이를 포함하는 53BP1 변이단백질의 경우 암 세포 내에서 53BP1 단백질이 안정적으로 발현함을 확인하였다. 특히, 본 발명의 S380 53BP1 변이단백질의 경우 암세포 내에서 53BP1 더욱 안정적으로 발현됨을 확인하였다. 이는 암세포에서 DNA 손상성 항암제의 감수성(민감성)과 관련이 있는 53BP 단백질의 특성과 관련하여, 항암제 치료시 항암제의 민감성을 개선, 향상 또는 증대시키는 항암보조제로서 본 발명의 변이단백질이 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.

본 발명 항암보조제용 조성물에서 상기 변이단백질은 바람직하게는 S380D 53BP1 변이단백질 일 수 있다. S380D 53BP1 변이단백질의 경우 암세포 에서 53BP1 결핍에 의해 유발되는 과잉 중심체 형성을 감소시켜 유전자 안정화를 증가시김을 확인하였는바, 암세포 내에서 더욱 안정적으로 발현하여, 항암제에 대한 감수성을 높여줄 수 있다.

따라서, 본 발명의 53BP1 변이단백질은 암세포 내에서 안정적으로 발현할 수 있으므로, DNA 손산성 항암제과 함께 투여 시 병용/순차 투여하는 방법으로 상기 항암제에 의한 암세포의 민감성을 향상시킬 수 있고, 변이 단백질 자체의 항암효과도 기대할 수 있어, 항암보조제로서 유용하게 사용될 수 있다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 53BP1 단백질의 세포분열기 선택적 발현 검토를 위한 면역블럿팅 분석 및 유세포분석

53BP1 단백질의 기능을 연구하기 위하여 세포주기 중 상기 단백질이 발현되는단계를 확인하였다.

세포를 같은 주기로 모아주기 위하여 사람의 자궁암 세포주(HeLa; ATCC, USA)를 10 ㎜ 플레이트에 1x10⁶의 세포수로 분주한 후 37℃, 이산화탄소 5% 조건하에서 24시간 동안 배양한 다음, 티미딘(thymidine; Sigma-Aldrich, USA)을 상기 세포에 16시간 처리한 후, 새로운 배지로 교환하여 8시간을 배양하고 다시 여기에 티미딘(thymidine)을 16시간 처리하여 같은 세포주기에 모으는 동기화(synchronization)를 유발하였다. 새 배지로 교환하고 9시간이 지난 후 세포분열기에 있는 세포를 모아서 다시 플레이트에 깔고 12시간 이후부터 2시간 간격으로 세포를 수취하였다. 수취한 세포에 100㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질을 정량하였다.

구체적으로 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 53BP1항체, Plk1항체, Erk2 항체를 이용하여 면역블랏(immunoblot)을 수행하여 53BP1의 발현의 증가를 관찰하였다(도1의 A). 노코다졸(Nocodazole;NZ; Sigma-Aldrich, USA)은 세포분열기에 세포를 모으는 약물이며, Plk1은 세포분열기에 발현이 증가되는 단백질로 양성대조군으로 사용되었다.

또한 53BP1의 발현이 증가된 시기가 세포주기 중 어느 단계인지를 유세포 분석(FACS)을 통하여 검토하였다. 구체적으로, 사람의 자궁암 세포주(HeLa)를 10 ㎜ 플레이트에 1x10⁶의 세포수로 분주한 후 37℃, 이산화탄소 5% 조건하에서 24시간 동안 배양한 다음, 16시간-8시간-16시간의 간격으로 티미딘(thymidine) 처리-새배지 교환-티미딘(thymidine)처리의 방식으로 세포를 DNA 합성 초기에 모은 후, 새로운 배지로 교환하였다. 새로운 배지로 교환하고 9시간 후에 세포를 떼어서 10 ㎜ 플레이트에 1x10⁶의 세포수로 분주한 후 37℃, 이산화탄소 5% 조건하에서 12시간 동안 배양한 다음 2시간 간격으로 세포를 수취하였다. 이 때 세포는 1x 트립신(trypsin)을 처리하여 세포 하나 하나를 떼어내었으며, 이를 70% 에탄올에 고정시킨 후 DNA 함량 분석을 위하여 프로피디움 요오드화물(propidium iodide; Sigma-Aldrich, USA) 염색액으로 염색하여 유세포 분석(FACS)을 실시하였다(도 1b).

도 1에 나타낸 바와 같이, 세포분열기에 발현이 증가되는 PLK1 단백질의 양이증가됨을 확인할 수 있고(도 1a), 2배수(2N)의 DNA 양을 지닌 세포수가 18시간에 가장 많이 증가하였는바(도 1b), 양성 대조군인 NZ 처리군과 비교해서 53BP1의 발현이 18시간 구간에서 가장 많은 발현을 나타내었는바, 53BP1은 세포분열기에 그 발현이 증가됨을 알 수 있다.

< 실시예 2> 53BP1 mRNA의 shRNA 및 렌티바이러스 제작

53BP1의 mRNA 발현 억제에 의한 효과를 확인하기 위하여, shRNA 및 이를 포함하는 렌티바이러스를 제작하였다.

shRNA 제작을 위한 구체적인 표적서열은 하기 표 1과 같다.

서열번호	위치(서열번호 3 기준)	서열
4	3785~3805	GAACAGAAGTAGAAAGAAAAG
5	2686~2706	TGTGAAAGTTCTAGTGAAACC
6	5276-5296	GTGAAGAAGAGGAGGAATTTT
7	198-218	ACAAACAGCTGGAGAAGAACG
8	841-861	GCACAAGAACTTATGGAAAGT
9	3208-3228	GGAGAAGAGGAGAAAGAAAAA
10	407-427	GAGAAGAGTTGGAACAGAAGG
11	1982-2002	GGTCTGAGGTGGAAGAAATCC
12	4726-4746	GGCCAAAGAAAGTGGTATAAG
13	4584-4604	GGGCAAAGACATTCTGTTATG
14	4028-4048	GGACAGAACCCGCAGATTTTG
15	1992-2012	GGAAGAAATCCCTGAGACACC
16	3978-3998	CAGTGGAAGCTCAGGGAAAGG
17	1420-1440	GGGAAGAAAGATGGAGATATG
18	2836-2856	CCAGAAAGCACCATAGCAACC

본 발명의 shRNA 제조에 사용할 수 있는 구체적인 프라이머서열은 하기와 표 2와 같다.

서열번호	설명	서열
19/20	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 3785~3805	FW: 5’-CCGGGAACAGAAGTAGAAAGAAAAGCTCGAGCTTTTCTTTCTACTTCTGTTC TTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGAACAGAAGTAGAAAGAAAAGCTCGAGCTTTTCTTTCTACTTCTGTTC 3’
21/22	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 2686~2706	FW: 5’- CCGGTGTGAAAGTTCTAGTGAAACCCTCGAGGGTTTCACTAGAACTTTCACA TTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAATGTGAAAGTTCTAGTGAAACCCTCGAGGGTTTCACTAGAACTTTCACA-3’
23/24	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 5276~5296	FW: 5’- CCGGGTGAAGAAGAGGAGGAATTTTCTCGAGAAAATTCCTCCTCTTCTTCACTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGTGAAGAAGAGGAGGAATTTTCTCGAGAAAATTCCTCCTCTTCTTCAC-3’
25/26	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 198~218	FW: 5’- CCGGACAAACAGCTGGAGAAGAACGCTCGAGCGTTCTTCTCCAGCTGTTTGTTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAACAAACAGCTGGAGAAGAACGCTCGAGCGTTCTTCTCCAGCTGTTTGT-3’
27/28	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 841~861	FW: 5’- CCGGGCACAAGAACTTATGGAAAGTCTCGAGACTTTCCATAAGTTCTTGTGCTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGCACAAGAACTTATGGAAAGTCTCGAGACTTTCCATAAGTTCTTGTGC-3’
29/30	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 3208~3228	FW: 5’- CCGGGGAGAAGAGGAGAAAGAAAAACTCGAGTTTTTCTTTCTCCTCTTCTCCTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGGAGAAGAGGAGAAAGAAAAACTCGAGTTTTTCTTTCTCCTCTTCTCC-3’
31/32	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 407~427	FW: 5’- CCGGGAGAAGAGTTGGAACAGAAGGCTCGAGCCTTCTGTTCCAACTCTTCTCTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGAGAAGAGTTGGAACAGAAGGCTCGAGCCTTCTGTTCCAACTCTTCTC-3’
33/34	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 1982~2002	FW: 5’- CCGGGGTCTGAGGTGGAAGAAATCCCTCGAGGGATTTCTTCCACCTCAGACCTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGGTCTGAGGTGGAAGAAATCCCTCGAGGGATTTCTTCCACCTCAGACC-3’
35/36	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 4726~4746	FW: 5’- CCGGGGCCAAAGAAAGTGGTATAAGCTCGAGCTTATACCACTTTCTTTGGCCTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGGCCAAAGAAAGTGGTATAAGCTCGAGCTTATACCACTTTCTTTGGCC-3’
37/38	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 4584~4604	FW: 5’- CCGGGGGCAAAGACATTCTGTTATGCTCGAGCATAACAGAATGTCTTTGCCCTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGGGCAAAGACATTCTGTTATGCTCGAGCATAACAGAATGTCTTTGCCC-3’
39/40	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 4028~4048	FW: 5’- CCGGGGACAGAACCCGCAGATTTTGCTCGAGCAAAATCTGCGGGTTCTGTCCTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGGACAGAACCCGCAGATTTTGCTCGAGCAAAATCTGCGGGTTCTGTCC-3’
41/42	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 1992~2012	FW: 5’- CCGGGGAAGAAATCCCTGAGACACCCTCGAGGGTGTCTCAGGGATTTCTTCCTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGGAAGAAATCCCTGAGACACCCTCGAGGGTGTCTCAGGGATTTCTTCC-3’
43/44	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 3978~3998	FW: 5’- CCGGCAGTGGAAGCTCAGGGAAAGGCTCGAGCCTTTCCCTGAGCTTCCACTGTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAACAGTGGAAGCTCAGGGAAAGGCTCGAGCCTTTCCCTGAGCTTCCACTG-3’
45/46	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 1420~1440	FW: 5’- CCGGGGGAAGAAAGATGGAGATATGCTCGAGCATATCTCCATCTTTCTTCCCTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAAGGGAAGAAAGATGGAGATATGCTCGAGCATATCTCCATCTTTCTTCCC-3’
47/48	shRNA 제작 프라이머-표적서열 위치: 2836~2856	FW: 5’- CCGGCCAGAAAGCACCATAGCAACCCTCGAGGGTTGCTATGGTGCTTTCTGGTTTTTG-3’ RV: 5’- AATTCAAAAACCAGAAAGCACCATAGCAACCCTCGAGGGTTGCTATGGTGCTTTCTGG-3’

우선 인간 53BP1의 염기서열 서열번호 3의 3785~3805 위치의 뉴클레오티드(서열번호 4)를 표적서열로 하는 shRNA를 만들고자 센스 올리고뉴클레오티드로는 5'-GAACAGAAGTAGAAAGAAAAG-3'를; 안티센스 올리고뉴클레오티드로는 5'-CTTTTCTTTCTACTTCTGTTC-3'를 이용하였다. shRNA 제조에 사용한 루프서열은 5'-CTCGAG-3' (서열번호 49) 이고, 이는 프라이머에 포함된 형태로 제조하였다.

이를 pLKO- puro.1 벡터에 서브클로닝을 진행하고자 포워드 프라이머로 5'-CCGGGAACAGAA GTAGAAAGAAAAGCTCGAGCTTTTCTTTCTACTTCTGTTCTTTTTG-3'를 리버스 프라이머로 5'-AATTCAAAAAGAACAGAAGTAGAAAGAAAAGCTCGAGCTTTTCTTTC TACTTCTGTTC-3'를 사용하였다. 올리고머(oligomer)를 1 ㎍/㎕로 증류수에 녹인 후 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 각각 5 ㎕씩 넣고 여기에 10x NEB buffer2를 5 ㎕, 증류수 35 ㎕를 넣은 후 95℃에서 10분 동안 가열 후, 80℃에서 10분 동안 반응시키고, 실온에서 하룻밤 동안 방치하였다. pLKO-puro 1 벡터는 EcoRI과 AgeI 효소로 37℃에서 각각 90분 동안 절단시켰다. pLKO-puro1 벡터와 올리고뉴클레오티드를 T4 리가아제(ligase) 로 17℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 pLKO-puro.1-53BP1 플라스미드를 제작하였다. 제작된 pLKO-puro.1-53BP1 플라스미드를 이용하여 전통적인 렌티바이러스 제작방법을 통하여 바이러스에 삽입하였다. 구체적으로, 바이러스 발현을 위하여 사람의 배아신장세포인HEK293T 세포에 형질도입용 시약(Polyplus, invitrogen)을 이용하여 2㎍ pHR'-CMV-VSV-G, 4㎍ pHR'-CMV-△R8.2VPR, 4㎍ pLKO-puro.1(대조군) 또는 pLKO-puro.1-53BP1(53BP1 shRNA 실험군)를 넣어 16시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후로부터 12시간 간격으로 5회 동안 배지를 거두고, 모은 배지는 4℃, 17000 rpm에서 2시간 동안 원심분리 한 뒤 상층액을 제거하고 TNE 완충용액(50 mM Tris, pH 7.5, 130 mM NaCl, 1mM EDTA)에 넣어주었다. 완충용액에 담긴 바이러스는 4℃에서 16시간 안정화시킨 뒤 사용하였다.

< 실시예 3> 53BP1 shRNA에 의한 고형암에서의 세포 분열 억제 효과

실시예 2에서 제작한 53BP1 shRNA를 이용하여 53BP1 mRNA의 발현억제를 통한 암세포에서의 세포분열에 미치는 효과를 관찰하고자 하였다.

사람의 자궁암 세포주(HeLa; ATCC, USA)를 10 ㎜ 플레이트에 5x10⁵의 세포수로 분주한 후 37℃, 이산화탄소 5% 조건하에서 24시간 동안 배양한 다음, pLKO-puro.1 벡터(vector)로부터 얻은 대조군 바이러스와 53BP1 shRNA가 발현되는 렌티 바이러스를 상기 세포에 각가 24시간 처리한 후, 1 ㎍/ml 푸로마이신(puromycin)으로 2일 동안 처리하여 바이러스에 감염된 세포를 선별한 다음 세포를 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl₂, 1 mM TT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질을 정량하였다. 구체적으로 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 53BP1 항체, Actin 항체를 이용하여 면역블랏(immunoblot)을 수행하여 53BP1의 발현의 억제를 관찰하였다(도 2a).

또한, 53BP1 shRNA가 암세포에서의 세포분열에 미치는 효과를 관찰하였다. 구체적으로, 12well 플레이트에 멸균한 커버클라스(coverglass)를 깐 후, 사람의 자궁암 세포주(HeLa; ATCC, USA)를 5x10⁴의 세포수로 분주한 후 37℃, 이산화탄소 5% 조건하에서 24시간 동안 배양한 다음, 대조군 바이러스와 53BP1 shRNA 렌티바이러스를 상기 세포에 24시간 처리하였다. 그 후 푸로마이신(puromycin)으로 2일 동안 처리하여 바이러스에 감염된 세포를 선별한 다음 세포를 새배지에 교환하였다. 이를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정한 후 4% 소혈청알부민 용액에 반응시켰다. 세포분열기 마커인 p-Histone H3(p-H3)와 phospho-MPM2(MPM2)의 항체(도 2b 참고) 또는 Plk1과 53BP1의 항체(도 2c 참고)를 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 항원-항체반응을 시킨 후, 0.05%의 Tween20이 함유된 PBS 용액(8 g NaCl, 0.2 g KCl, 2.68 g Na₂HPO₄-7H₂O, 0.24 g KH₂PO₄, 1L DW)으로 7분씩 3회 실온에서 세척하여 항체를 제거해 주었다. 여기에 2차 항체인 anti-FITC와 anti-Cy3 항체를 각각 1:200으로 4% 소혈청알부민(BSA)에 희석한 뒤, 커버글라스(coverglass)에 떨어뜨려 실온에서 4시간 동안 항체와 반응하도록 하였다. 그리고 0.05%의 Tween20이 함유된 PBS 용액으로 7분씩 3회 실온에서 2차 항체를 세척해 주었다. 핵을 염색을 위하여 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색액을 사용하였으며 100% 글리세롤(glycerol)을 50 ㎕씩 현미경 관찰용 슬라이드에 떨어뜨리고 그 위에 항체가 결합된 세포가 있는 커버글라스를 뒤집어 놓아 글라스안의 기포를 빼어주고 형광현미경 사진을 촬영하였다.

도 2a, 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 shRNA를 처리하는 경우 53BP1의 발현이 억제됨을 알 수 있었다(도 2a). 도 2b에서 관찰된 바와 같이 53BP1이 결핍된 세포(53BP1 shRNA)에서 대조군 대비 세포분열기 마커인 p-Histone H3(p-H3)에 양성인 세포와 phopspho-MPM2(MPM2)에 양성인 세포의 수가 증가됨을 관찰할 수 있었으며 이를 백분율로 도식화하였다. 또한 도 2c에서 53BP1이 결핍된 세포의 경우 세포분열기의 방추극의 형성이 불완전하고 방추사가 교란되어 있음이 관찰되었으며 또한 염색체의 양극으로의 분리가 교란됨을 관찰 할 수 있어 이를 전체 세포에서의 백분율로 표기하여 도식화하였다. 이를 통해 53BP1단백질이 정상적인 세포 분열을 위하여 필요한 인자임을 확인하였다.

< 실시예 4> 53BP1 shRNA를 이용한 암세포 선택적 사멸 촉진 효과 및 항암효과

53BP1 shRNA에 의해 고형암에서 일어나는 세포분열 교란이 세포사멸에 영향을 미치는 지, 이러한 53BP1 shRNA에 의한 세포사멸은 정상세포에는 영향이 없이 암세포 선택적으로 일어나는 현상인지 관찰하고자 유세포분석과 세포사멸과정의 마커인 활성형 카스파아제(caspase) 3을 이용한 면역형광염색 실험을 진행하고, 그 결과를 도 3a 내지 3c에 나타내었다.

먼저 암세포 선택적 사멸효과를 관찰하기 위하여 정상세포(MRC5; ATCC, USA)와 비소세포폐암(A549, NCI-H460; ATCC, USA)에 대조군 바이러스(실시예 2의 pLKO-puro.1의 벡터)와 53BP1 shRNA 렌티 바이러스를 24시간 동안 처리한 후 푸로마이신을 1 ㎍/ml 농도로 2일 동안 처리하여 바이러스에 감염된 세포를 선별하였다. 선별한 세포를 수취하여 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질을 정량하였다. 구체적으로 정량한 단백질을 이용하여 세포사멸이 일어나는 세포에서 증가되는 caspase-3의 활성을 Ac-DEVD-AMC(BD Biosciences, USA) 형광기질을 이용하여 측정하여 도 3a와 같이 나타내었다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, 정상세포인 MRC5세포에서는 죽어가는 세포에서 측정되는 카스파제 활성이 대조군과 53BP1 shRNA를 처리한 실험군에서 거의 유사하게 나왔으나 암세포인 A549와 NCI-H460세포에서는 그 활성이 53BP1 shRNA 처리에 의하여 카스파아제-3활성이 대조군 대비 약 5 내지 12배 가량 증가됨을 관찰하였다. 따라서 53BP1 shRNA처리에 의한 53BP1 발현억제는 정상세포 사멸에는 영향을 미치지 않으면서 암세포 선택적 사멸을 유발함을 알 수 있었다.

또한, 자궁암 세포주(HeLa)에 대조군 바이러스와 53BP1 shRNA 렌티 바이러스를 24시간 동안 처리한 후 푸로마이신을 1 ㎍/ml 농도로 2일 동안 처리하여 바이러스에 감염된 세포를 선별하였다. 배지 교환 후 선별된 세포들을 24시간 동안 37℃, 이산화탄소 5% 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 1x 트립신(trypsin)을 처리하여 플레이트에서 세포를 떼어내었다. 세포는 15 ml 튜브에 모아 1000 xg에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 상층액을 분리하였고 상층액을 제거 한 뒤 1XPBS 용액으로 1.5 ml 튜브로 옮겨 담아 다시 1000 xg, 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 남겨진 세포를 70% 에탄올 1 ml으로 고정한 뒤 4℃에서 16시간 이상 보관한 후 30 ㎍/ml 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)으로 상온에서 30분 동안 핵을 염색하였다. Millipore회사의 유세포분석기를 이용하여 DNA 함량을 측정하였고 이를 세포주기 SubG1, G1, S, G2/M 단계로 구분하여 도식화하였다(도 3b 참조).

도 3b에 나타낸 바와 같이, 53BP1이 결핍된 세포의 경우 세포 분열기인 G2 상의 세포가 약 40% 존재하여 또한 세포 사멸이 일어나 DNA 절단이 일어난 세포(subG1에 존재하는 세포)도 약 13%에 이르는 것을 관찰하였다.

다음으로, 세포분열차단세포가 세포사멸이 일어나는지 관찰하고자 면역염색실험을 진행하고자 유사분열 마커인 phospho-MPM2와 세포사멸 마커인 절단형의 활성화된 caspase-3 항체를 이용하였다. 구체적으로 면역염색실험을 진행하기 위해 24well 플레이트에 멸균한 커버글라스를 깐 후, 사람의 자궁암 세포주(HeLa)를 5x10⁴의 세포수로 분주한 후 37℃, 이산화탄소 5% 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 다음 날, 상기 세포에 대조군 바이러스와 53BP1 shRNA 렌티 바이러스를 24시간 동안 처리한 후 푸로마이신을 1 ㎍/ml 농도로 2일 동안 처리하여 바이러스에 감염된 세포를 선별하였다. 배지 교환 후 선별된 세포들을 24시간 동안 37℃, 5%의 이산화탄소가 존재하는 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 100% 메탄올로 세포에 대한 항체용액의 투과성을 증가시켰다. 4% 소혈청알부민(BSA; Bovine Serum Albumin)용액을 4℃에서 1시간동안 반응시킨 후, phospho-MPM2와 활성형 caspase 3의 항체로 16시간동안 항원-항체반응을 시켜주었다. 실온에서 각 실험군 당 50 ㎕ PBS-0.05% Tween20 용액(0.05% Tween 20, 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 2.68 g Na₂HPO₄-7H₂O, 0.24 g KH₂PO₄, 1L DW)으로 7분씩 3회 세척을 하여 1차 항체를 제거해 주었고 2차 항체인 anti-FITC와 anti-Cy3 항체를 각 1:200으로 비율로 4% BSA에 희석한 뒤, 커버글라스에 점적하여 실온에서 1시간 동안 항체와 반응하도록 하였다. 여기에 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색액을 함께 넣어 핵을 염색하였다. 반응 후 PBS-0.05% Tween20용액으로 7분씩 3회 세척하여 항체를 제거해 준 다음 100 % 글리세롤을 50 ㎕씩 슬라이드에 떨어뜨리고 그 위에 커버글라스를 뒤집어 놓아 글라스안의 기포를 빼주고 형광현미경 사진을 촬영하였다(도 3c 참조).

도 3c에 나타낸 바와 같이, 53BP1이 결핍된 세포의 경우 세포분열단계가 억제되면서 세포사멸이 일어난다는 사실을, phospho-MPM2 염색된 세포 또는 세포분열기의 핵 분열 모양을 지닌 세포에서 세포사멸 마커인 caspase-3가 활성화됨을 관찰함으로써 증명할 수 있었다.

< 실시예 5> 53BP1 유전자가위( CRISPR / Cas9 )에 의한 다양한 고형암에서 과잉중심체 형성을 통한 항암효과

본 발명자들은 53BP1의 결핍을 유발하는 렌티바이러스 시스템 외에도 이를 추가적으로 증명하기 위한 방법으로 유전자가위(CRISPR/Cas9)시스템을 이용하여 53BP1의 발현을 차단하고 세포사멸에 미치는 효과를 관찰하고자 하였다.

구체적으로 53BP1 CRISPR/Cas9을 발현시켜 53BP1이 발현되지 않는(knock out) 세포주를 구축하기 위하여 사람의 자궁암 세포(HeLa), 사람의 골육종 세포(U2OS), 사람의 비소세포폐암 세포(NCI-H460)에 형질도입 시약을 이용하여 5 ㎍ 53BP1 CRISPR/Cas9 플라스미드와 5 ㎍ 53BP1 HDR 플라스미드를 함께 세포에 처리하고 24시간 동안 37℃, 이산화탄소 5% 세포 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 1 ㎍/ml 푸로마이신을 2일 동안 처리하여 대조군과 53BP1 CRISPR/Cas9 유전자가 발현된 세포를 선택적으로 선별하였다. 53BP1 CRISPR/Cas9에 의한 53BP1의 발현억제가 세포에서 잘 작동되는지 확인하기 위하여 면역브롯(immunoblot)을 진행하였다. 수취한 세포에 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질을 정량하여 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 53BP1 항체, 액틴(actin) 항체를 이용하여 면역브롯(immunoblot)을 수행하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 53BP1 CRISPR/Cas9 유전자가 발현된 세포(53 BP1 KO)의 경우, 53BP1의 발현이 잘 억제됨을 관찰하였다.

유전자가위(CRISPR/Cas9)를 이용하여 53BP1 발현을 억제시킨 경우, 53BP1 shRNA처리에 의해 발현이 억제되었을 때와 같이, 암세포들의 세포분열 억제 및 사멸 촉진 현상을 관찰하기 위하여 면역형광염색법을 진행하였다.

먼저 24 well의 플레이트에 멸균된 커버글라스를 부착한 뒤 53BP1 CRISPR/Cas9이 발현된 자궁암 세포(HeLa), 육종세포(U2OS), 폐암세포(H460)를 5x10⁴ cells/ml의 세포 수로 깐 후 37℃, 이산화탄소 5% 세포 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 배지를 깨끗이 제거해주고 500 ㎕ 1XPBS 용액을 분주하여 남아 있는 배지를 제거하였다. 세포를 차가운 4% 파라포름알데히드로 10분간 고정하고 100% 메탄올을 2분간 방치하여 투과성이 좋아지도록 하였다. 4% BSA 용액으로 세포를 처리한 후 페리센트린(pericentrin) 항체를 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 항원-항체 반응을 시키고 그 후 PBST 용액(0.05% Tween 20, 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 2.68 g Na₂HPO₄-7H₂O, 0.24 g KH₂PO₄, 1L DW)으로 7분씩 3회 세척하여 1차 항체를 제거해 주었다. anti-Cy3 항체를 1:200으로 4% BSA에 희석한 뒤, 커버글라스에 점적하여 실온에서 4시간 동안 항체와 반응하도록 하였다. 이후 PBS-0.05% Tween20 용액으로 7분씩 3회 실온에서 항체를 제거하였다. 또한 핵 염색을 위하여, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 염료를 이용하였다. 현미경 시료를 만들기 위해서 100% 글리세롤을 50 ㎕씩 슬라이드에 점적하여 커버글라스를 부착하고 기포를 빼어주었다. CRISPR/Cas9 플라스미드에는 초록색 형광 단백질(GFP)이 표지되어있어 형광현미경 촬영시, 선별된 53BP1 발현 억제 자궁 암세포들은 초록색 형광을 나타내었다.

도 4b 및 4c에 나타낸 바와 같이, DAPI 핵 염색을 통해 53BP1 CRISPR/Cas9이 발현된 세포(53BP1 KO)에서는 대조군에 비하여 핵의 절편화가 일어나 세포사멸이 약 15% 증가됨을 발견하였다(도 4b). 이러한 세포사멸이 증가하는 원인을 연구한 결과, 53BP1 CRISPR/Cas9이 발현된 세포에서 중심체에 존재하는 페리센트린(pericentrin)이 다량 존재함을 면역염색실험을 통하여 증명하였다. 따라서 53BP1의 결핍은 비정상적으로 과잉의 중심체가 형성됨으로써 세포 분열을 차단하고, 이는 암세포의 사멸을 유도한다는 사실을 발견하였다(도 4c).

< 실시예 6> p53결핍성 고형암에서 53BP1 발현 억제에 의한 세포사멸 증대 효과

본 발명자들은 종양억제자인 p53 단백질이 결핍된 고형암에서 유전자 가위를 이용하여 53BP1을 억제시켰을 때, 암세포 사멸에 미치는 효과를 관찰하고자 p53이 결핍된 폐암세포를 만들어서(H460^{p53 -} 실험군), p53이 정상인 폐암세포(H460^ctrl 대조군)와 그 효과를 비교 분석하였다.

구체적으로, p53 단백질이 발현되지 않는 세포주를 만들기 위하여 p53 shRNA를 발현시킬 수 있는 pLKO-puro.1-p53 플라스미드를 이용하여 <실시예2>와 같이 렌티바이러스 시스템을 구축하였다. 사람의 비소세포폐암 세포(NCI-H460)는 p53이 원형으로 존재하는 세포로, 여기에 p53 shRNA를 발현시키는 바이러스를 감염시킨 후 1 ㎍/ml 푸로마이신으로 48시간 동안 선택적 선별하였다. 다음으로, 선별된 puro H460^ctrl, H460^{p53 -} 세포에 형질도입시약를 이용하여 5 ㎍ CRISPR/Cas9 넉아웃(KO) 플라스미드와 5 ㎍ 53BP1 HDR 플라스미드를 함께 주입하고 24시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소의 세포배양기에서 배양하였다. 페리센트린(pericentrin) 항체를 이용한 면역형광염색을 진행하기 위하여 24 well의 플레이트에 멸균된 커버글라스를 부착한 뒤 각 5x10⁴cells/ml의 세포수를 37℃, 5% 이산화탄소의 세포배양기에서 배양하였다. 24시간 후 배지를 깨끗이 제거해주고 500 ㎕ 1XPBS 용액을 분주하여 남아 있는 배지를 제거한 후 <실시예 5>에서와 같이 면역형광염색실험을 수행하였다.

도 5a 및 b에 나타낸 바와 같이, 53BP1의 발현이 억제되고, p53 발현은 억제되지 않은 H460^ctrl(H460^ctrl/53BP1 KO)대비 53BP1과 p53의 발현이 동시에 억제된 H460^p53-(H460^p53 /53BP1 KO)세포에서 페리센트린(pericentrin)으로 염색되는 중심체 수가 증가됨을 관찰할 수 있었다(도 5a). DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)염색을 통해 핵의 절편을 관찰한 결과, 53BP1과 p53의 발현이 동시에 억제된 H460^{p53 -}(H460^p53 /53BP1 KO)세포에서 p53은 원형이면서 53BP1의 발현이 억제된 H460^ctrl(H460^ctrl/53BP1 KO)대비 세포사멸이 2배 이상으로 증가하였음을 관찰하였다(도 5b). 따라서, 종양억제유전자인 p53이 결핍되거나 기능을 못하는 고형암에서 53BP1이 결핍될 경우 암세포의 세포사멸 효과가 더욱 증가됨을 확인하여 본 발명이 유효성분의 항암효과가 증대될 수 있음을 증명하였다.

< 실시예 7> 점 돌연변이를 함유하는 53BP1 단백질의 안정적 발현효과

53BP1의 인산화 유사체인 S380D 돌연변이체를 제작하여 380번 위치의 세린잔기를 아스파르트 잔기로 치환시켜 발현시킴으로써, 인산화 형태와 유사한 구조의 53BP1 단백질로 제작하였다. 이를 발현시켜 안정적 발현여부를 시간에 따라 관찰하고자 하였다. 구체적으로, 자궁암세포(HeLa)에 53BP1의 돌연변이체들을 형질도입시료를 이용하여 플라스미드를 넣어준 후 16시간-8시간-16시간의 간격으로 티미딘(thymidine) 처리-새배지 교환-티미딘(thymidine)처리의 방식으로 세포를 DNA 합성 초기에 모은 후 새로운 배지로 교환하였다. 새 배지로 교환한 지 8시간과 12시간 후에 세포를 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl₂, 1 mM TT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질을 정량하였고 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 53BP1 항체, Plk1의 항체, GFP 항체, 액틴(Actin) 항체를 이용하여 53BP1의 발현을 관찰하였다. GFP는 형질 도입여부를 확인하기 위한 대조군으로 형질도입시에 함께 삽입하였다.

도 6a에 나타낸 바와 같이, S380위치의 인산화 모방성 아스파르트(aspartate) 점 돌연변이체(SA)는 안정적으로 발현되었으나, S380의 탈인산화 모방성 알라닌(alanine) 점 돌연변이체(SD)는 안정적이지 않았다(도 6a).

또한 53BP1을 제거시킨 후 53BP1-S380D 단백질을 안정적으로 발현시켰을 때, 53BP1 발현억제에 의한 세포사멸을 극복할 수 있는지 관찰하고자 면역형광염색실험을 수행하였다. 사람의 자궁암 세포(HeLa)에 53BP1 shRNA 발현성 렌티바이러스를 감염시켜 감염된 세포를 푸로마이신으로 선별한 후 HA-53BP1의 원형, S380D, S380A의 점 돌연변이체를 형질도입시료를 이용하여 세포에 24시간 발현시킨 후 페리센트린(pericentrin)과 HA 항체를 이용하여 <실시예 5>에서와 동일하게 면역형광염색을 진행하였다.

도 6b 및 6c에 나타낸 바와 같이, HA 표지된 세포를 이용하여 분석이 이루어졌으며, 53BP1 발현이 억제된 자궁암세포(HeLa) 중 대조군인 HA의 경우, 중심체의 수가 증가하였으며 이는 암세포 사멸로 이어져 약 18%의 암세포가 사멸하였다. 53BP1 발현 억제 후 S380A 점돌연변이를 발현시킨 경우(SA), 원형(WT)이나 S380D가 발현되었을 때(SD) 보다 중심체의 수가 많아진 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 이들 세포에서 또한 핵 절편화를 통해 관찰한 결과, 암세포의 사멸이 증가된 것을 관찰할 수 있었다(도 6b 및 6c). 하지만, 53BP1 발현 억제 후 S380D 점돌연변이체를 발현시킨 경우, 53BP1 결핍에 의해 나타나던 과잉의 중심체 형성을 차단되었으며 유전적 안정화가 일어나 결과적으로 세포사멸로 죽는 세포 수가 현저히 감소됨을 관찰하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> NOVEL USE OF 53BP1 <130> P20170696OP <160> 48 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 6266 <212> DNA <213> Human <400> 1 cgttgtttgg cgtgtttttt tttttgtttt ttgtcactgc ctgcctgggt cctgcccgag 60 gtctccatcc tcggtttccc tgtccttgcc ccgggccctg ggagtgctct ggaaggctgc 120 gcagtattgg aggggacaga atgaccttcc ggccttgagt ccctggggag cagatggacc 180 ctactggaag tcagttggat tcagatttct ctcagcaaga tactccttgc ctgataattg 240 aagattctca gcctgaaagc caggttctag aggatgattc tggttctcac ttcagtatgc 300 tatctcgaca ccttcctaat ctccagacgc acaaagaaaa tcctgtgttg gatgttgtgt 360 ccaatcctga acaaacagct ggagaagaac gaggagacgg taatagtggg ttcaatgaac 420 atttgaaaga aaacaaggtt gcagaccctg tggattcttc taacttggac acatgtggtt 480 ccatcagtca ggtcattgag cagttacctc agccaaacag gacaagcagt gttctgggaa 540 tgtcagtgga atctgctcct gctgtggagg aagagaaggg agaagagttg gaacagaagg 600 agaaagagaa ggaagaagat acttcaggca atactacaca ttcccttggt gctgaagata 660 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Glu Ala Lys Glu Gln Leu Ser Ala Gln Glu Leu Met Glu Ser Gly 275 280 285 Leu Gln Ile Gln Lys Ser Pro Glu Pro Glu Val Leu Ser Thr Gln Glu 290 295 300 Asp Leu Phe Asp Gln Ser Asn Lys Thr Val Ser Ser Asp Gly Cys Ser 305 310 315 320 Thr Pro Ser Arg Glu Glu Gly Gly Cys Ser Leu Ala Ser Thr Pro Ala 325 330 335 Thr Thr Leu His Leu Leu Gln Leu Ser Gly Gln Arg Ser Leu Val Gln 340 345 350 Asp Ser Leu Ser Thr Asn Ser Ser Asp Leu Val Ala Pro Ser Pro Asp 355 360 365 Ala Phe Arg Ser Thr Pro Phe Ile Val Pro Ser Ser Pro Thr Glu Gln 370 375 380 Glu Gly Arg Gln Asp Lys Pro Met Asp Thr Ser Val Leu Ser Glu Glu 385 390 395 400 Gly Gly Glu Pro Phe Gln Lys Lys Leu Gln Ser Gly Glu Pro Val Glu 405 410 415 Leu Glu Asn Pro Pro Leu Leu Pro Glu Ser Thr Val Ser Pro Gln Ala 420 425 430 Ser Thr Pro Ile Ser Gln Ser Thr Pro Val Phe Pro Pro Gly Ser Leu 435 440 445 Pro Ile Pro Ser Gln Pro Gln Phe Ser His Asp Ile Phe Ile Pro Ser 450 455 460 Pro Ser Leu Glu Glu Gln Ser Asn Asp Gly Lys Lys Asp Gly Asp Met 465 470 475 480 His Ser Ser Ser Leu Thr Val Glu Cys Ser Lys Thr Ser Glu Ile Glu 485 490 495 Pro Lys Asn Ser Pro Glu Asp Leu Gly Leu Ser Leu Thr Gly Asp Ser 500 505 510 Cys Lys Leu Met Leu Ser Thr Ser Glu Tyr Ser Gln Ser Pro Lys Met 515 520 525 Glu Ser Leu Ser Ser His Arg Ile Asp Glu Asp Gly Glu Asn Thr Gln 530 535 540 Ile Glu Asp Thr Glu Pro Met Ser Pro Val Leu Asn Ser Lys Phe Val 545 550 555 560 Pro Ala Glu Asn Asp Ser Ile Leu Met Asn Pro Ala Gln Asp Gly Glu 565 570 575 Val Gln Leu Ser Gln Asn Asp Asp Lys Thr Lys Gly Asp Asp Thr Asp 580 585 590 Thr Arg Asp Asp Ile Ser Ile Leu Ala Thr Gly Cys Lys Gly Arg Glu 595 600 605 Glu Thr Val Ala Glu Asp Val Cys Ile Asp Leu Thr Cys Asp Ser Gly 610 615 620 Ser Gln Ala Val Pro Ser Pro Ala Thr Arg Ser Glu Ala Leu Ser Ser 625 630 635 640 Val Leu Asp Gln Glu Glu Ala Met Glu Ile Lys Glu His His Pro Glu 645 650 655 Glu Gly Ser Ser Gly Ser Glu Val Glu Glu Ile Pro Glu Thr Pro Cys 660 665 670 Glu Ser Gln Gly Glu Glu Leu Lys Glu Glu Asn Met Glu Ser Val Pro 675 680 685 Leu His Leu Ser Leu Thr Glu Thr Gln Ser Gln Gly Leu Cys Leu Gln 690 695 700 Lys Glu Met Pro Lys Lys Glu Cys Ser Glu Ala Met Glu Val Glu Thr 705 710 715 720 Ser Val Ile Ser Ile Asp Ser Pro Gln Lys Leu Ala Ile Leu Asp Gln 725 730 735 Glu Leu Glu His Lys Glu Gln Glu Ala Trp Glu Glu Ala Thr Ser Glu 740 745 750 Asp Ser Ser Val Val Ile Val Asp Val Lys Glu Pro Ser Pro Arg Val 755 760 765 Asp Val Ser Cys Glu Pro Leu Glu Gly Val Glu Lys Cys Ser Asp Ser 770 775 780 Gln Ser Trp Glu Asp Ile Ala Pro Glu Ile Glu Pro Cys Ala Glu Asn 785 790 795 800 Arg Leu Asp Thr Lys Glu Glu Lys Ser Val Glu Tyr Glu Gly Asp Leu 805 810 815 Lys Ser Gly Thr Ala Glu Thr Glu Pro Val Glu Gln Asp Ser Ser Gln 820 825 830 Pro Ser Leu Pro Leu Val Arg Ala Asp Asp Pro Leu Arg Leu Asp Gln 835 840 845 Glu Leu Gln Gln Pro Gln Thr Gln Glu Lys Thr Ser Asn Ser Leu Thr 850 855 860 Glu Asp Ser Lys Met Ala Asn Ala Lys Gln Leu Ser Ser Asp Ala Glu 865 870 875 880 Ala Gln Lys Leu Gly Lys Pro Ser Ala His Ala Ser Gln Ser Phe Cys 885 890 895 Glu Ser 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gtattgattc ccctcaaaag ttggcaatac ttgaccaaga attggaacat 2220 aaggaacagg aagcttggga agaagctact tcagaggact ccagtgttgt cattgtagat 2280 gtgaaagagc catctcccag agttgatgtt tcttgtgaac ctttggaggg agtggagaag 2340 tgctcagatt cccagtcatg ggaggatatt gctccagaaa tagaaccatg tgctgagaat 2400 agattagaca ccaaggaaga aaagagtgta gaatatgaag gagatctgaa atcagggact 2460 gcagaaacag aacctgtaga gcaagattct tcacagcctt ccttaccttt agtgagagca 2520 gatgatcctt taagacttga ccaggagttg cagcagcccc aaactcagga gaaaacaagt 2580 aattcattaa cagaagactc aaaaatggct aatgcaaagc agctaagctc agatgcagag 2640 gcccagaagc tggggaagcc ctctgcccat gcctcacaaa gcttctgtga aagttctagt 2700 gaaaccccat ttcatttcac tttgcctaaa gaaggtgata tcatcccacc attgactggt 2760 gcaaccccac ctcttattgg gcacctaaaa ttggagccca agagacacag tactcctatt 2820 ggtattagca actatccaga aagcaccata gcaaccagtg atgtcatgtc tgaaagcatg 2880 gtggagaccc atgatcccat acttgggagt ggaaaagggg attctggggc tgccccagac 2940 gtggatgata aattatgtct aagaatgaaa ctggttagtc ctgagactga ggcgagtgaa 3000 gagtctttgc 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Claims (15)

1. 서열번호 1의 53BP1(p53-binding protein 1) mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드; 53BP1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편; 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 S380 변이를 포함하는 53BP1 변이단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   53BP1의 mRNA 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 53BP1 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 것인 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 53BP1의 mRNA 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 18의 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 표적서열로 하여 53BP1 mRNA 발현을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
4. 제2항에 있어서,
   상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 18의 서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
5. 제2항에 있어서,
   상기 siRNA는 서열번호 4 내지 18의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 올리고 뉴클레오티드; 및 상기 올리고 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오디트의 이중가닥으로 이루어지는 것인, 약학적 조성물.
6. 제2항에 있어서,
   상기 shRNA는 서열번호 4 내지 18의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 표적서열로 하여 53BP1 mRNA 발현을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 53BP1 변이단백질은 서열번호 2의 380 위치의 세린(serine; S)이 아스파라긴산(aspartic acid; D)으로 치환된 S380D 53BP1 변이단백질 또는 알라닌(alanine; A)으로 치환된 S380A 53BP1 변이단백질 인, 약학적 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 1차 암의 예방 또는 치료용인 약학적 조성물.
9. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 p53 결핍 또는 돌연변이성 고형암의 치료용인, 약학적 조성물.
10. 서열번호 1의 표시되는 염기서열에서 연속되는 5 내지 50 뉴클레오티드를 표적서열로 하여 53BP1의 mRNA 발현을 억제하는 siRNA 또는 shRNA 올리고 뉴클레오티드.
11. 제10항에 있어서,
    표적서열은 서열번호 4 내지 18의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열인, siRNA 또는 shRNA 올리고 뉴클레오티드.
12. 제10항의 siRNA 또는 shRNA 올리고 뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터.
13. 서열번호 2의 아미노산 서열에서 S380 변이를 포함하는 53BP1 변이단백질을 유효성분으로 포함하고, 항암제의 민감성을 개선, 향상 또는 증대시키는 항암보조제용 조성물.
14. 제13항에 있어서,
    상기 변이단백질은 서열번호 2의 380 위치의 세린(serine; S)이 아스파라긴산(aspartic acid; D)으로 치환된 S380D 53BP1 변이단백질인, 항암보조제용 조성물.
15. 53BP1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터; 서열번호 2에서 S380 변이를 포함하는 53BP1 변이단백질을 코딩하는 폴리뉴클레티드; 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전자 치료용 조성물.

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