KR20230082009A - 비멘틴 발현 억제용 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
비멘틴 발현 억제용 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230082009A KR20230082009A KR1020230068084A KR20230068084A KR20230082009A KR 20230082009 A KR20230082009 A KR 20230082009A KR 1020230068084 A KR1020230068084 A KR 1020230068084A KR 20230068084 A KR20230068084 A KR 20230068084A KR 20230082009 A KR20230082009 A KR 20230082009A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- vimentin
- cancer
- expression
- cells
- shrna
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 171
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 168
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 151
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 99
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 title claims abstract description 96
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 34
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 12
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 title abstract description 302
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 title abstract description 302
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 title abstract description 294
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 title description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 85
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 85
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 37
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 12
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 12
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 257
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 2
- 208000037843 metastatic solid tumor Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 102100031463 Serine/threonine-protein kinase PLK1 Human genes 0.000 description 89
- 108010056274 polo-like kinase 1 Proteins 0.000 description 89
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 88
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 88
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 70
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 70
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 70
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 61
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 61
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 61
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 39
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 32
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 18
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 18
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 17
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 16
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 15
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 15
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 14
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 14
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 13
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 12
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 12
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 12
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 12
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 11
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 10
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 10
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 10
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 10
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 9
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 9
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 102100025805 Cadherin-1 Human genes 0.000 description 7
- 108091007854 Cdh1/Fizzy-related Proteins 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 102100036364 Cadherin-2 Human genes 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000714537 Homo sapiens Cadherin-2 Proteins 0.000 description 6
- 206010050017 Lung cancer metastatic Diseases 0.000 description 6
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102220624471 Phospholemman_S83E_mutation Human genes 0.000 description 4
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 231100000405 induce cancer Toxicity 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 4
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 101000803403 Homo sapiens Vimentin Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical group CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical group C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014434 POLO box domains Human genes 0.000 description 3
- 108050003399 POLO box domains Proteins 0.000 description 3
- 102220624468 Phospholemman_S83A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Chemical group C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 102000057393 human VIM Human genes 0.000 description 3
- 238000003331 infrared imaging Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Chemical group 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- 208000025760 Benign familial haematuria Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 2
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 2
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 2
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N (+)-haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WZXXZHONLFRKGG-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrachlorothiophene Chemical compound ClC=1SC(Cl)=C(Cl)C=1Cl WZXXZHONLFRKGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 1
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000019739 Dicalciumphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Natural products C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001086785 Homo sapiens Occludin Proteins 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 101000633054 Homo sapiens Zinc finger protein SNAI2 Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032604 Occludin Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100029887 Translationally-controlled tumor protein Human genes 0.000 description 1
- 101710157927 Translationally-controlled tumor protein Proteins 0.000 description 1
- 101710175870 Translationally-controlled tumor protein homolog Proteins 0.000 description 1
- 102100029570 Zinc finger protein SNAI2 Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- NEFBYIFKOOEVPA-UHFFFAOYSA-K dicalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O NEFBYIFKOOEVPA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038472 dicalcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000390 dicalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MVPICKVDHDWCJQ-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-pyrrolidin-1-ylpropanoate Chemical compound CCOC(=O)CCN1CCCC1 MVPICKVDHDWCJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Substances OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000034272 protein filaments Human genes 0.000 description 1
- 108091005974 protein filaments Proteins 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940045902 sodium stearyl fumarate Drugs 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 비멘틴 발현 억제를 통해 암세포의 종양생성능과 이동성 및 침습성을억제하는 것에 효과적인 shRNA 등에 관한 것으로서 세포의 비정상적인 성장에 의한 각종 질환, 특히 일차성 및 전이성 고형암과 백혈병 등의 같은 퇴행성 질환 치료에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 비멘틴 발현 억제를 통해 암세포의 종양생성능과 이동성 및 침습성을억제하는 것에 효과적인 shRNA 등에 관한 것이다.
Vimentin은 중간엽 세포에서 주로 발현되는 중간 필라멘트(IF) 단백질로서 미세소관 및 미세 필라멘트와 함께 세포 골격 네트워크를 형성하여 세포 항상성을 유지하는 역할을 한다(Goldman, R.D. et al., J Cell Biol 134 (1996) 971-983). 특히, 상피간엽이행(EMT) 과정에서는 세포의 이동성과 침습성을 조절하는 중요한 조절 인자로 알려져 있다(Eckes, B. et al., J Cell Sci 111 (Pt 13) (1998) 1897-1907; Liu, C.Y. et al., Oncotarget 6 (2015) 15966-15983). 이러한 vimentin은 유방암, 폐암, 위암 빛 기타 많은 고형암에서 과발현되어 있음이 보고되었으며, 암의 악성 단계가 높을수록 vimentin의 발현이 증가됨이 보고되었다(Yamashita, N. et al., J Cancer Res Clin Oncol 139 (2013) 739-746; Ye, Z. et al., PLoS One 11 (2016) e0163162; Yin, S. et al., Pathol Res Pract 214 (2018) 1376-1380). 고형암에서 vimentin은 상피간엽이행 동안 세포 골격 재구성에 관여하는데 이는 상피간엽이행에 관련 신호전달을 조절함으로써 암세포의 이동성과 침습성을 촉진하기 때문으로 알려져 있다. 또한 vimentin이 결여된 배아세포는 세포의 이동성이 감소되며, vimentin이 결핍된 마우스의 경우 상처 부위에서 근섬유 아세포의 이동성 손상으로 상처 부위의 회복이 잘 안됨이 보고되었다(Eckes, B. et al., J Cell Sci 111 (Pt 13) (1998) 1897-1907; Eckes, B. et al., J Cell Sci 113 (Pt 13) (2000) 2455-2462). 세포의 이동성에 vimentin의 인산화가 관여되어 있는 것으로 알려져 있는데, vimentin가 인산화되면 중간 필라멘트(IF)의 결합구조를 조절하여 세포의 이동을 증가시킨다고 알려져 있다(Eriksson, J.E. et al., J Cell Sci 117 (2004) 919-932; Zhu, Q.S. et al., Oncogene 30 (2001) 457-470). 이러한 vimentin은 상피간엽이행(EMT)에 대한 마커로 알려져 있지만, 이러한 과정을 매개하는데 있어서 그 역할은 정확하게 알려져 있지 않다.
Polo-like kinase 1(PLK1)은 최근 발암의 원인 및 전이의 원인이 되는 타겟분자로 연구되고 있으며, 이를 기반으로 PLK1에 대한 억제제 개발을 통한 항암제 개발 연구가 다국적기업을 중심으로 경쟁적으로 진행되고 있다(Yim, Anti-Cancer Drugs 24(2013) 999-1006; Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761 (2014) 31-39). PLK1은 구조적으로 인산화효소 활성을 지닌 효소활성 도메인과 기질과 결합하는 폴로박스 도메인을 지니고 있으며, T210위치에서의 인산화가 PLK1의 활성화를 유발시킨다. 기질의 폴로박스 도메인 결합에 의해 활성화된 PLK1의 인산화 효소는 기질의 Ser/Thr 잔기에 인산화를 유도하는 효소이다(Barr et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5 (2004) 429-440). 기능적으로는 성장 및 분열하는 세포에서 발현이 증가되는데 특히 세포주기 중 세포분열기에서의 발현과 활성이 정점을 이루고 있다. 따라서 빠르게 성장하는 암세포에서 또한 그 발현율이 높은 것으로 알려져 있으며(Yim, Anti-Cancer Drugs 24(2013) 999-1006; Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761 (2014) 31-39), 암세포의 단계별 악성화 과정에서 많은 경우 그 발현이 증가되는 것이 실험적으로 보고되었다. 특히 비소세포 폐암, 두부경부암, 후두암, 유방암, 간암, 자궁내막암, 대장암, 난소암, 췌장암, 전립선암 등에서 악성 단계가 높을수록 그 발현이 증가되어 있음이 보고되었다(Yim, Anti-Cancer Drugs 24(2013) 999-1006; Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761 (2014) 31-39). 최근 연구보고와 본 발명자들의 연구에 의하면 활성형의 PLK1이 암의 전이성을 증가시키는 데 관여하고 있음이 관찰되었고 이에 전이성 암을 치료하기 위한 분자 타겟으로써 PLK1에 대한 가치가 최근 부각되기 시작하였다(Cai et al., Am J Transl Res 8 (2016) 4172-4183; Wu et al., eLife 5 (2016) e10734; 개인 연구결과). 따라서 PLK1의 인산화기질의 기능 조절을 타겟으로 하는 항암제의 경우 원발성 암 뿐만 아니라 전이성 암의 치료에도 효과가 뛰어날 것으로 기대하고 있다.
암전이는 암의 진행의 결과로 나타나는 현상이나, 실질적으로 원발소 암을 제거 또는 치료한다고 하더라도, 전이를 막을 수 없다면 암의 재발 등에 의해서 생존률이 매우 낮아진다. 전이암은 전체 암환자 사망의 90%를 차지하고 있어 그 위험도를 가늠할 수 있다 (Valastyan, S. and Weinberg, R.A., Cell 147 (2011) 275-292; Khan, I. and Steeg, P.S., Lab Invest 98 (2018) 198-210). 암의 크기가 커질수록 주변 림프절 및 다른 조직으로 전이하는 비율이 높은 것으로 여겨지나, 암의 크기가 작음에도 불구하고 전이가 되는 경우가 있어, 아직까지 암의 전이와 증식의 관계는 여전히 명확하게 규명되어 있지 않다 (Valastyan, S. and Weinberg, R.A., Cell 147 (2011) 275-292; Shibue, T. and Weinberg, Semin Cancer Biol 21 (2011) 99-106). 암의 치료에 있어, 암 세포의 증식 억제와 전이의 억제가 항상 같이 나타나는 효과가 아니고, 암의 전이를 억제할 수 있다면 많은 암의 치료 효율을 비약적으로 개선할 수 있다는 측면에서, 전이성 암의 치료를 위한 암의 전이 및 침윤을 효과적으로 억제하는 치료 타겟 또는 치료제의 개발이 필요하다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 비멘틴 단백질 발현 억제에 효과적인 shRNA를 암의 예방 또는 치료 용도에 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 비멘틴(Vimentin) 발현 억제용 shRNA(short hairpin RNA)를 제공한다.
본 발명의 비멘틴 발현 억제용 shRNA는 서열번호 11 내지 13 중 어느 하나의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 11의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 종양형성능을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 암세포의 이동성 및 침습성을 감소시켜 암의 전이를 억제할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 전이암의 예방을 위한 용도에 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 비멘틴(Vimentin) 돌연변이체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 비멘틴 돌연변이체는 비멘틴 단백질에서 327번째 아미노산인 트레오닌(Threonine)이 글리신(Glycine), 알라닌(Alanine), 발린(Valine), 루신(Leucine), 아이소루신(Isoleucine), 프롤린(Proline), 페닐알라닌(Phenylalanine), 메티오닌(Methionine) 또는 트립토판(Tryptophan)으로 치환된 것(서열번호 1)일 수 있으며, 바람직하게는 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 비멘틴 돌연변이체는 비멘틴 단백질에서 339번째 아미노산인 세린(Serine)이 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 아이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환된 것(서열번호 2)일 수 있으며, 바람직하게는 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 비멘틴 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 로딩한 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 상기 비멘틴 돌연변이체를 암호화하는 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 바이러스 벡터(viral vector)일 수 있고, 바람직하게는 렌티 바이러스 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 shRNA를 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 암은 고형암일 수 있고, 상기 고형암은 비소세포폐암일 수 있으며, 상기 비소세포폐암은 특히 선암일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 shRNA를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 개체는 암의 예방 또는 치료가 필요한 인간일 수 있으며, 이미 암이 발생되어 치료 중에 있는 환자, 또는 암의 완치 후 전이를 예방하기 위한 환자일 수 있다.
또한, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 shRNA의 용도를 제공한다.
본 발명의 vimentin shRNA 및/또는 vimentin 돌연변이체는 암세포의 전이성, 침습성 및 선택적 종양형성에 대한 강력한 억제 효과를 갖는 바, 세포의 비정상적인 성장에 의한 각종 질환, 특히 원발성 및 전이성 고형암과 백혈병 등의 같은 퇴행성 질환 치료에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1(1a 및 1b)은 전이성 폐암세포에서 vimentin과 활성형 PLK1의 임상적 연관성을 분석한 결과이다.
A : KEGG 2019 pathway 분석을 통해서 폐암세포 A549의 암전이 조건에서 활성형 PLK1이 발현되는 침습성 세포들의 관련 pathway를 분석한 그래프이다.
B : GeneMANIA database 분석을 통해서 폐암세포 A549의 암전이 조건에서 활성형 PLK1이 발현되는 침습성 세포에 발현되는 유전들과 ECM 관련 유전자들의 연관성을 보여주는 모식도이다.
C: KM PLOTTER 분석을 통해서 서로 다른 종의 폐암환자들의 생존율을 PLK1과 vimentin 발현에 따라 분석한 그래프이다.
D: KM PLOTTER 분석을 통해서 전이성 폐암 진행단계에 따른 폐암환자들의 생존율을 PLK1과 vimentin 발현에 따라 분석한 그래프이다.
E: TGF-β를 처리하여 암전이를 유도한 여러 종류의 폐암세포들에서 상피간엽이행 마커들의 발현을 heatmap 분석을 통해서 보여준 그래프이다.
F: TGF-β를 처리한 폐암세포 A549와 NCI-H460에서 vimentin, 활성형 PLK1 그리고 상피간엽이행 마커들의 mRNA 발현을 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 보여준 그래프이다.
G: TGF-β를 처리한 폐암세포 A549와 NCI-H460에서 vimentin, 활성형 PLK1 그리고 상피간엽이행 마커들의 단백질 발현을 면역블롯법으로 관찰한 결과이다.
H: G의 vimentin과 활성형 PLK1의 단백질 발현을 보여준 그래프이다.
도 2(2a 및 2b)은 PLK1 활성형에 의한 vimentin의 인산화 및 인산화 부위를 분석한 결과이다.
A : A549 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 조건에서 PLK1 항체를 이용하여 면역침강법을 진행하여 vimentin과 PLK1이 상호작용함을 관찰한 결과이다.
B : NCI-H460 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 조건에서 PLK1 항체를 이용하여 면역침강법을 진행하여 vimentin과 PLK1이 상호작용함을 관찰한 결과이다.
C: GST가 표지된 vimentin을 이용하여 활성형 PLK1(PLK1 TD)와 함께 인산화 효소 반응법을 수행하여 활성형 PLK1이 vimentin을 인산화 시킴을 관찰한 결과이다.
D: 액체크로마토그래피 질양분석법을 통해서 PLK1에 의한 인산화된 vimentin 인산화 가능 후보 부위를 확인한 결과이다.
E: 부분 특이적 돌연변이 치환법을 이용하여 vimentin의 인산화 후보 부위를 알라닌으로 치환한 비인산화 점 돌연변이체 단백질과 활성형 PLK1을 이용하여 인산화 효소 반응법을 수행한 결과이다.
F: A549 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 후 phosphatase (CIP) 처리에 의해서 vimentin과 PLK1의 인산화의 감소를 관찰한 결과이다.
G: NCI-H460 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 후 phosphatase (CIP) 처리에 의해서 vimentin과 PLK1의 인산화의 감소를 관찰한 결과이다.
도 3(3a 및 3b)는 폐암세포 NCI-H460에서 vimentim의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체의 과발현이 암세포의 이동성과 침습성에 미치는 영향을 측정한 실험이다.
A : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 후 vimentin 단백질 과발현 유무와 중간엽이행 마커(N-cadherin) 변화를 면역블롯으로 관찰한 결과이다.
B : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 후 vimentin mRNA 과발현 유무와 중간엽이행 마커(N-cadherin) mRNA 변화를 연쇄반응(Real-time PCR)을 통해 관찰한 결과이다.
C : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 후 각각의 점 돌연변이체를 발현하는 세포의 세포증식 정도를 시간별로 관찰한 결과이다.
D : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포 NCI-H460에서 인서트(inset)를 이용한 이동성 실험(migration assay)을 통해서 세포의 이동성 양상을 현미경으로 관찰한 결과이다.
E : 인서트(inset)를 이용한 이동성 실험(migration assay)에서 인서트를 이동한 crystal violet 염색된 암세포의 정도(intensity)를 Odyssey infrared imaging system 분석장치를 이용하여 암세포 이동성 양상을 보여주는 그래프이다.
F : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포 NCI-H460에서 matrigel과 인서트(inset)를 이용한 침습성 실험(migration assay)을 통해서 세포의 침습성 양상을 관찰한 결과이다.
도 4(4a 및 4b)는 동물모델에서 vimentim의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 과발현하는 암세포의 전이성과 종양 형성능을 측정한 실험이다.
A : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스의 폐에 전이성 암생성 및 억제효과를 관찰한 결과이다.
B : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서의 전이성 암생성 및 억제효과를 각 실험군의 전이성 암 생성 빈도를 수치로 나타낸 그래프이다.
C : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 각 실험군의 생존율을 그래프로 보여준 결과이다.
D : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스의 폐에 전이되어 생성한 암조직을 H&E 염색과 Ki-67 염색하여 각 실험군의 암생성 및 억제효과를 관찰한 결과이다.
E : 마우스의 폐에 전이되어 생성한 암조직을 H&E 염색하여 각 실험군의 암생성 및 억제효과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
F : 마우스의 폐에 전이되어 생성한 암조직을 Ki-67 염색하여 각 실험군의 암생성 및 억제효과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
G : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서 얻은 폐조직을 분쇄하여 상피간엽이행 단백질 마커와 면연회피 인자 단백질의 변화를 관찰한 결과이다.
H : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서 얻은 폐조직을 분쇄하여 면연회피 인자 단백질인 PD-L1의 발현의 변화를 각 실험군별로 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 폐암세포에서 vimentin mRNA 발현 억제을 위해 제작한 각각의 vimentin shRNA 처리하였을 때의 vimentin 발현억제 효과를 관찰한 결과이다.
A : 폐암세포 NCI-H460에 각각의 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제 정도를 단백질 발현 양상으로 보여주는 결과이다.
B : 폐암세포 NCI-H460에 각각의 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제 정도를 mRNA 발현 양상으로 보여주는 그래프이다.
도 6(6a 및 6b)는 폐암세포에서 vimentin mRNA 발현 억제 물질인 vimentin shRNA 처리하였을 때의 상피간염이행 마커와 면역회피 인자의 변화 및 암의 이동성, 침습성의 변화를 관찰한 결과이다.
A : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 전이 환경에서 상피간엽이행 마커(N-cadherin, E-cadherin) 및 면역회피 인자(PD-L1)의 단백질 발현 양상을 보여주는 결과이다.
B : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 전이 환경에서 상피간엽이행 마커(N-cadherin, E-cadherin) 및 면역회피 인자(PD-L1)의 mRNA 발현 양상을 보여주는 그래프이다.
C : 폐암세포 A549에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 전이 환경에서 상피간엽이행 마커(N-cadherin, E-cadherin) 및 면역회피 인자(PD-L1)의 단백질 발현 양상을 보여주는 결과이다.
D : 폐암세포 A549에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 전이 환경에서 상피간엽이행 마커(N-cadherin, E-cadherin) 및 면역회피 인자(PD-L1)의 mRNA 발현 양상을 보여주는 그래프이다.
E : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 전이 환경에서 72시간 후 세포의 상대적 거리에 대해 대조군을 0%라고 할 때, vimentin shRNA 처리에 의한 암세포의 이동성을 상대적 백분율로 변환한 그래프이다.
F : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 침습성이 감소되는 양상을 보여주는 결과이다.
G : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포의 종양형성 억제 양상을 보여주는 결과이다.
H : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현을 억제 시킨 후 다시 vimentin의 원형(WT), 인산화(S339E) 및 비인산화(S339A) 점 돌연변이체를 과발현시킨 것을 면역블롯으로 관찰한 결과이다.
I: 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현을 억제 조건에서 다시 vimentin의 원형(WT), 인산화(S339E) 및 비인산화(S339A) 점 돌연변이체의 과발현이 암세포의 이동성에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
J: 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현을 억제 조건에서 다시 vimentin의 원형(WT), 인산화(S339E) 및 비인산화(S339A) 점 돌연변이체의 과발현이 암세포의 침습성에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
A : KEGG 2019 pathway 분석을 통해서 폐암세포 A549의 암전이 조건에서 활성형 PLK1이 발현되는 침습성 세포들의 관련 pathway를 분석한 그래프이다.
B : GeneMANIA database 분석을 통해서 폐암세포 A549의 암전이 조건에서 활성형 PLK1이 발현되는 침습성 세포에 발현되는 유전들과 ECM 관련 유전자들의 연관성을 보여주는 모식도이다.
C: KM PLOTTER 분석을 통해서 서로 다른 종의 폐암환자들의 생존율을 PLK1과 vimentin 발현에 따라 분석한 그래프이다.
D: KM PLOTTER 분석을 통해서 전이성 폐암 진행단계에 따른 폐암환자들의 생존율을 PLK1과 vimentin 발현에 따라 분석한 그래프이다.
E: TGF-β를 처리하여 암전이를 유도한 여러 종류의 폐암세포들에서 상피간엽이행 마커들의 발현을 heatmap 분석을 통해서 보여준 그래프이다.
F: TGF-β를 처리한 폐암세포 A549와 NCI-H460에서 vimentin, 활성형 PLK1 그리고 상피간엽이행 마커들의 mRNA 발현을 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 보여준 그래프이다.
G: TGF-β를 처리한 폐암세포 A549와 NCI-H460에서 vimentin, 활성형 PLK1 그리고 상피간엽이행 마커들의 단백질 발현을 면역블롯법으로 관찰한 결과이다.
H: G의 vimentin과 활성형 PLK1의 단백질 발현을 보여준 그래프이다.
도 2(2a 및 2b)은 PLK1 활성형에 의한 vimentin의 인산화 및 인산화 부위를 분석한 결과이다.
A : A549 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 조건에서 PLK1 항체를 이용하여 면역침강법을 진행하여 vimentin과 PLK1이 상호작용함을 관찰한 결과이다.
B : NCI-H460 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 조건에서 PLK1 항체를 이용하여 면역침강법을 진행하여 vimentin과 PLK1이 상호작용함을 관찰한 결과이다.
C: GST가 표지된 vimentin을 이용하여 활성형 PLK1(PLK1 TD)와 함께 인산화 효소 반응법을 수행하여 활성형 PLK1이 vimentin을 인산화 시킴을 관찰한 결과이다.
D: 액체크로마토그래피 질양분석법을 통해서 PLK1에 의한 인산화된 vimentin 인산화 가능 후보 부위를 확인한 결과이다.
E: 부분 특이적 돌연변이 치환법을 이용하여 vimentin의 인산화 후보 부위를 알라닌으로 치환한 비인산화 점 돌연변이체 단백질과 활성형 PLK1을 이용하여 인산화 효소 반응법을 수행한 결과이다.
F: A549 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 후 phosphatase (CIP) 처리에 의해서 vimentin과 PLK1의 인산화의 감소를 관찰한 결과이다.
G: NCI-H460 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 후 phosphatase (CIP) 처리에 의해서 vimentin과 PLK1의 인산화의 감소를 관찰한 결과이다.
도 3(3a 및 3b)는 폐암세포 NCI-H460에서 vimentim의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체의 과발현이 암세포의 이동성과 침습성에 미치는 영향을 측정한 실험이다.
A : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 후 vimentin 단백질 과발현 유무와 중간엽이행 마커(N-cadherin) 변화를 면역블롯으로 관찰한 결과이다.
B : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 후 vimentin mRNA 과발현 유무와 중간엽이행 마커(N-cadherin) mRNA 변화를 연쇄반응(Real-time PCR)을 통해 관찰한 결과이다.
C : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 후 각각의 점 돌연변이체를 발현하는 세포의 세포증식 정도를 시간별로 관찰한 결과이다.
D : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포 NCI-H460에서 인서트(inset)를 이용한 이동성 실험(migration assay)을 통해서 세포의 이동성 양상을 현미경으로 관찰한 결과이다.
E : 인서트(inset)를 이용한 이동성 실험(migration assay)에서 인서트를 이동한 crystal violet 염색된 암세포의 정도(intensity)를 Odyssey infrared imaging system 분석장치를 이용하여 암세포 이동성 양상을 보여주는 그래프이다.
F : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포 NCI-H460에서 matrigel과 인서트(inset)를 이용한 침습성 실험(migration assay)을 통해서 세포의 침습성 양상을 관찰한 결과이다.
도 4(4a 및 4b)는 동물모델에서 vimentim의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 과발현하는 암세포의 전이성과 종양 형성능을 측정한 실험이다.
A : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스의 폐에 전이성 암생성 및 억제효과를 관찰한 결과이다.
B : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서의 전이성 암생성 및 억제효과를 각 실험군의 전이성 암 생성 빈도를 수치로 나타낸 그래프이다.
C : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 각 실험군의 생존율을 그래프로 보여준 결과이다.
D : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스의 폐에 전이되어 생성한 암조직을 H&E 염색과 Ki-67 염색하여 각 실험군의 암생성 및 억제효과를 관찰한 결과이다.
E : 마우스의 폐에 전이되어 생성한 암조직을 H&E 염색하여 각 실험군의 암생성 및 억제효과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
F : 마우스의 폐에 전이되어 생성한 암조직을 Ki-67 염색하여 각 실험군의 암생성 및 억제효과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
G : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서 얻은 폐조직을 분쇄하여 상피간엽이행 단백질 마커와 면연회피 인자 단백질의 변화를 관찰한 결과이다.
H : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서 얻은 폐조직을 분쇄하여 면연회피 인자 단백질인 PD-L1의 발현의 변화를 각 실험군별로 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 폐암세포에서 vimentin mRNA 발현 억제을 위해 제작한 각각의 vimentin shRNA 처리하였을 때의 vimentin 발현억제 효과를 관찰한 결과이다.
A : 폐암세포 NCI-H460에 각각의 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제 정도를 단백질 발현 양상으로 보여주는 결과이다.
B : 폐암세포 NCI-H460에 각각의 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제 정도를 mRNA 발현 양상으로 보여주는 그래프이다.
도 6(6a 및 6b)는 폐암세포에서 vimentin mRNA 발현 억제 물질인 vimentin shRNA 처리하였을 때의 상피간염이행 마커와 면역회피 인자의 변화 및 암의 이동성, 침습성의 변화를 관찰한 결과이다.
A : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 전이 환경에서 상피간엽이행 마커(N-cadherin, E-cadherin) 및 면역회피 인자(PD-L1)의 단백질 발현 양상을 보여주는 결과이다.
B : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 전이 환경에서 상피간엽이행 마커(N-cadherin, E-cadherin) 및 면역회피 인자(PD-L1)의 mRNA 발현 양상을 보여주는 그래프이다.
C : 폐암세포 A549에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 전이 환경에서 상피간엽이행 마커(N-cadherin, E-cadherin) 및 면역회피 인자(PD-L1)의 단백질 발현 양상을 보여주는 결과이다.
D : 폐암세포 A549에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 전이 환경에서 상피간엽이행 마커(N-cadherin, E-cadherin) 및 면역회피 인자(PD-L1)의 mRNA 발현 양상을 보여주는 그래프이다.
E : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 전이 환경에서 72시간 후 세포의 상대적 거리에 대해 대조군을 0%라고 할 때, vimentin shRNA 처리에 의한 암세포의 이동성을 상대적 백분율로 변환한 그래프이다.
F : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포 침습성이 감소되는 양상을 보여주는 결과이다.
G : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현억제가 TGF-β 처리에 의해서 유도되는 암세포의 종양형성 억제 양상을 보여주는 결과이다.
H : 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현을 억제 시킨 후 다시 vimentin의 원형(WT), 인산화(S339E) 및 비인산화(S339A) 점 돌연변이체를 과발현시킨 것을 면역블롯으로 관찰한 결과이다.
I: 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현을 억제 조건에서 다시 vimentin의 원형(WT), 인산화(S339E) 및 비인산화(S339A) 점 돌연변이체의 과발현이 암세포의 이동성에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
J: 폐암세포 NCI-H460에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현을 억제 조건에서 다시 vimentin의 원형(WT), 인산화(S339E) 및 비인산화(S339A) 점 돌연변이체의 과발현이 암세포의 침습성에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
본 발명자들은 PLK1(Polo-like kinase 1)에 관하여 연구하던 중 PLK1에 의한 비멘틴(vimentin)의 인산화가 암의 전이에 기여함을 확인하고, 비멘틴 발현을 knock down시키는 경우 암의 이동성과 침습성이 현저하게 감소함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
PLK1은 proto-oncogene으로서 암 세포에서 과발현이 알려져 있으며, 암의 치료를 위한 타겟으로서 PLK1 분자에 관한 연구는 활발하게 진행되고 있다. 그러나, PLK1은 세포 주기(cell cycle) 등 다양한 신호전달계에 관여하는 인산화효소로서 PLK1의 억제는 종양의 성장 등을 억제하는 효과 이외에 다른 작용의 가능성을 배제하기 어려우며, 정상세포에서의 작용에 PLK1의 원래 기능을 수행이 원활하지 못하다는 문제가 있다.
PLK1은 비멘틴의 83번, 459번 위치의 serin(S) 부위에 인산화가 보고되어 있으나(Eriksson, J.E. et al., Cancer Res 67 (2007) 11106-11110; Keisuke Ikawa et al., Cell cycle 13 (2014) 126-137), 이러한 부위의 점 돌연변이체들이 암세포의 전이성이나 침습성, 종양형성을 차단하는 지에 대한 연구내용은 보고되지 않았다.
본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 암세포, 특히 비소세포폐암에서 암의 전이단계(TMN)이 높을수록 활성형 PLK1과 비멘틴의 발현이 증가됨을 확인하고, 비멘틴이 PLK1의 암 전이 촉진 신호전달계에 포함된 인자임을 예측할 수 있었다(실시예 1).
본 발명자들은 PLK1이 암의 증식과 전이에 관여하는 기작에서 하위 분자를 표적으로 하고자 하였으며, 구체적으로, PLK1과 비멘틴간의 상호작용을 확인하기 위하여 TGF-β로 전이성 폐암을 유도한 후 면역침강법을 수행하여 PLK1과 비멘틴의 증가된 결합을 관찰할 수 있었다(실시예 2).
한편, 비멘틴은 세포 골격 네트워크를 형성하여 세포 항상성을 유지하는 역할을수행하는 필라멘트 단백질로서, 본 발명자들은 정상세포에서 비멘틴의 본래 기능은 유지하되 암의 전이 단계에서 작용만을 차단할 수 있는 방법을 강구하고자 하였다. 본 발명자들은 비소세포폐암, 특히 전이단계가 높을수록 PLK1과 비멘틴이 과발현되고, PLK1이 비멘틴과 결합하여 비멘틴의 인산화를 유도함을 확인하였다. 즉, 암의 전이에 PLK1에 의한 비멘틴의 인산화가 필요조건으로 가정한다면 PLK1에 의한 비멘틴의 인산화만을 방지한다면 암의 전이를 억제할 수 있으므로, 본 발명자들은 PLK1에 의한 비멘틴의 인산화 영역을 탐색하여 인산화 후보 영역으로서 Thr-327, Thr-336, 및 Ser-339을 선정하였다. 이어서, 상기 위치에 아미노산을 치환한 돌연변이체를 제작하고 인산화효소 반응법을 진행하여 최종 Thr-327 및 Ser-339을 PLK1에 의한 인산화 영역으로 특정하였다(실시예 2).
이어서, 본 발명자들은 327 또는 339 위치에 세린 또는 트레오닌을 알라닌으로 치환한 돌연변이체와 상기 위치 이외에 PLK1에 의한 인산화 영역으로 보고된 83번 또는 459번 위치에 세린을 알라닌으로 치환한 돌연변이체를 발현하는 렌티바이러스를 제작하고 상기 렌티바이러스를 이용하여 암세포를 형질전환(transformation)하여 암세포의 이동성, 침습성, 및 종양형성능을 확인하였다. 그 결과, 327 또는 339 번째 아미노산이 알라닌으로 치환된 돌연변이가 형질감염된 암세포에서 특히 낮은 이동성, 침습성, 및 종양형성능을 확인할 수 있었는 바, PLK1에 의한 인산화 차단을 위한 타겟으로서 비멘틴의 327 번째 및 339 번째 아미노산이 효과적임을 알 수 있었다(실시예 3 내지 7).
보다 구체적으로, 본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 각 단백질이 발현되는 NCI-H460 세포에서 암세포의 전이성을 관찰하기 위하여 암세포 이동성 실험(migration assay)을 진행하였다(도 3D-E). 연구결과 vimentin의 인산화 점 돌연변이체(S339E, T327E, S83E)가 발현되는 실험군에서는 양성대조군인 TGF-β(2.5ng/ml)처리에 의한 경우보다도 더 많이 암세포의 이동성이 증가되는 것을 관찰하였다. 이와 상반되게 비인산화 점 돌연변이체(S339A, T327A, S83A) 단백질을 발현하는 암세포의 이동성은 감소되었다(실시예 5).
또한, 본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 vimentin의 인산화 점 돌연변이체와 비인산화 점 돌연변이체을 이용하여 암세포에서의 침습성 촉진 및 억제 효과에 대한 실험을 진행하였다. Matrigel을 이용한 침습성 분석(invasion assay)를 이용하여 암세포의 침습성을 관찰하고자 하였다(도 3F). 먼저, 침습능을 평가하기 위하여 matrigel insert에 각각의 vimentin의 점 돌연변이체를 발현하는 세포를 혈청이 없는 배지와 함께 분주하고 실험플레이트에 혈청이 포함된 배지를 분주하여 5일 동안 배양한다. 침습된 암세포를 crystal violet으로 염색하여 관찰하고 DMSO로 녹인 후 590nm의 파장에서 흡광도를 측정한다. 연구결과, vimentin의 인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현하는 폐암세포군에서 대조군과 vimentin의 원형 대비 침습성이 증가됨을 관찰하였다. 특히 vimentin의 S339 인산화 점 돌연변이체에서 가장 높은 암세포의 침습성을 관찰할 수 있었다. 반면에 vimentin의 비인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현하는 폐암세포군에서는 침습성이 감소됨을 관찰하였다. 따라서 폐암세포에서 vimentin의 인산화 점 돌연변이체에 의한 암세포에서의 침습성 촉진 효과 및 vimentin의 비인산화 점 돌연변이체에 의한 암세포의 침습성 억제 효과를 관찰할 수 있었다(실시예 6).
또한, 본 발명은 구체적인 실험을 통해 동물모델에서 PLK1에 의한 vimentin의 인산화와 비인산화 점 돌연변이체를 발현하는 단백질이 암전이와 종양형성에 관여하는 알아보고자 BALB/c nude 마우스에 각각의 vimentin 돌연변이체 단백질을 과발현하고 있는 NCI-H460 세포를 꼬리 정맥 주사하여 8주 동안 사육하고 개복하여 장기에 암세포가 전이와 종양형성을 관찰하였다(도 4). Vimentin의 인산화 점 돌연변이체를 발현하는 세포를 주입한 동물군의 폐에서 대조군, 원형, 그리고 비인산화 점 돌연변이체를 발현하는 세포에 비해 암전이 및 종양형성이 많이 관찰되었다. 반면, vimentin의 비인산화 점 돌연변이체를 발현하는 세포를 주입한 동물군의 폐에서는 종양형성 능력이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 vimentin의 PLK1에 의한 신규 인산화부위에서의 인산화 점 돌연변이체 단백질에 의한 암세포의 종양형성을 촉진하는 효과를 관찰할 수 있었으며, vimentin의 비인산화 점 돌연변이체 단백질에 의한 암세포의 종양형성능 억제 효과를 관찰하였다(실시예 7).
따라서, 본 발명은 PLK1에 의한 비멘틴의 인산화 차단 영역으로서 비멘틴의 327 번째 및 339 번째 아미노산을 타겟으로 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 S339 및/또는 T327 아미노산이 치환된 비멘틴 돌연변이체를 암의 예방 및 치료 용도에 제공할 수 있다.
한편, PLK1은 구조적으로 인산화효소 활성을 지닌 효소활성 도메인과 기질과 결합하는 폴로박스 도메인을 포함하고 있는바, 327 또는 339 위치에 아미노산이 치환된 비멘틴 돌연변이체는 PLK1과 결합력은 그대로 유지한다. 따라서, 상기 인산화 영역 아미노산(327번 또는 339번 아미노산)이 치환된 돌연변이체는 야생형 비멘틴과 경쟁적으로 PLK1과 결합하게 되고, 따라서 돌연변이체 농도 의존적으로 야생형 비멘틴의 인산화가 감소할 수 있다.
본 발명의 비멘틴 돌연변이체는 야생형 비멘틴 단백질에 S339 및/또는 T327이글리신, 알라닌, 발린, 루신, 아이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환된 것일 수 있으며, 구체적인 실험으로는 알라닌으로 치환한 돌연변이체를 이용하여 그 효과를 확인하였다.
이어서, 본 발명자들은 암세포에서 과발현된 비멘틴 유전자의 단백질 수준에서 발현 증가를 억제하여 암의 치료가 가능한지 확인하고자 하였다. 이에, 비멘틴 발현 억제를 위한 vimentin mRNA(Human vimentin mRNA [NM_003380])서열 중 1447-1467(타겟 #1), 1290-1310(타겟 #2), 1132-1152(타겟 #3) 위치의 뉴클레오티드 서열을 각각 타겟으로 하는 3종 shRNA를 설계하고 비멘틴 발현 억제효과를 확인하였으며, TGF-β에 의해 전이가 유도된 암세포에 처리하여 상피간엽이행 관련 인자들인 CDH1, CDH2 발현을 및 면역회피 관련 인자인 PD-L1 발현 수준을 확인하였다. 그 결과, vimetnin shRNA #1이 가장 비멘틴 발현 억제가 효과적이었으며, 이러한 shRNA #1 의한 vimentin 발현 억제를 유도한 폐암세포에서 CDH1, CDH2 및 PD-L1 발현이 현저하게 감소됨을 관찰하였다. 또한 vimentin shRNA이 의한 vimentin 발현 억제는 TGF-β 처리에 의한 암전이 환경에서 상피간엽이행 관련 인자들의 발현을 억제하는 것을 발견하였다(실시예 8).
이에, shRNA #1을 비멘틴 발현 감소용 shRNA로 선정하고, 이를 발현하는 렌티바이러스로 폐암세포(NCI-H460)를 감염시켜 migration assay를 72시간 동안 진행하였다(도 6E). 그 결과 폐암세포에 vimentin shRNA를 발현시킨 경우 72시간에 약 -10% 이하로 세포의 상대적 전이성이 감소됨을 관찰하였다. 또한 같은 시간에 TGF-β 처리한 암전이 유도 조건에서도 vimentin shRNA 발현군에서 약 -8% 이하로 암세포의 전이성이 감소됨을 관찰하였다. Vimentin의 mRNA 발현을 억제하는 shRNA을 발현시킨 경우, 암세포 자체의 전이성과 함께 TGF-β 처리한 암전이 유도 조건에서도 현저한 암전이 억제 효과를 나타냄을 발견하였다(실시예 9)
또한, 본 발명은 구체적인 실험을 통해 상기 선정된 shRNA이 암세포의 침습성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 matrigel로 만든 3차원 transwell 배양시스템을 이용하여 암세포의 침습성을 관찰하였다. 침습된 세포의 경우 crystal violet staining 후에 염색된 세포수를 직접 세어서 침습된 세포의 정도를 관찰할 수 있었다. 양성 대조군인 TGF-β을 처리한 폐암세포의 경우 대조군에 비해 약 15배정도의 세포가 침습함을 관찰하였다. Vimentin shRNA를 발현시킨 세포의 경우는 대조군 보다 침습성이 감소됨을 관찰하였다. 또한 TGF-β을 처리한 암전이 조건에서 vimentin shRNA를 발현시킨 세포의 경우 양성 대조군인 TGF-β을 처리한 폐암세포보다 약 30배 정도 침습성이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. Vimentin의 mRNA 발현을 억제하는 shRNA을 발현시킨 경우, 암세포 자체의 침습성과 함께 TGF-β 처리한 암전이 유도 조건에서도 암세포의 침습성을 효과적으로 억제함을 발견하였다(실시예 10).
또한, 본 발명은 구체적인 실험을 통해 선정된 vimentin shRNA 발현용 렌티바이러스로 폐암세포의 종양형성 억제효과에 vimentin shRNA가 미치는 영향을 확인하고자 콜로니형성 에세이(colony formation assay)를 진행하였다(도 6G). 연구 결과, 암세포 덩어리인 종양이 대조군 대비 양성 대조군인 TGF-β 처리에 의해 약 2배 더 많이 형성되었고, vimentin shRNA를 발현시킨 경우 대조군 대비 종양형성이 감소됨을 관찰하였다. 또한 TGF-β 처리한 암전이 유도 조건에서도 vimentin shRNA 발현군에서 대조군 또는 양성대조군 대비 종양형성이 감소됨을 관찰하였다. Vimentin의 mRNA 발현을 억제하는 shRNA을 발현시킨 경우, 암세포 자체의 종양형성과 함께 TGF-β 처리한 암전이 유도 조건에서도 현저한 종양형성 억제 효과를 나타냄을 발견하였다(실시예 11).
이에, 본 발명은 상기 비멘틴 발현 억제용 shRNA 및/또는 이를 발현하는 벡터를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이어서, 본 발명자들은 암의 이동성 및 침습성을 감소시킬 수 있는 상기 shRNA와 상술한 비멘틴 돌연변이체를 동시에 암세포에서 발현시켜 암 세포의 이동성 및 침습성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 한편, shRNA에 의한 비멘틴 발현 억제 조건에서 비멘틴의 인산화가 세포의 이동성 및 침습성에 미치는 영향을 동시에 확인하고자 shRNA와 비멘틴 인산화 돌연변이체를 동시에 암세포의 발현시켜 이동성과 침습성을 확인하였다. 그 결과, shRNA에 의해 vimentin 발현이 억제되는 조건에서 각각의 비멘틴 돌연변이체는 잘 발현되고, vimentin 발현 억제 조건에서 인산화 비멘틴은 세포의 이동성과 침습성을 증가시키는바, 비멘틴의 인산화가 암세포의 침습성에 강력한 촉진 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 비멘틴의 발현억제가 비멘틴 돌연변이체에 의한 비멘틴 인산화 억제가 동시에 수행되는 경우 각각 독립적으로 수행되는 경우보다 현저하게 암세포의 침습성 및 이동성을 감소시켜 전이암의 발생을 예방할 수 있음을 알 수 있다(실시예 12).
이에, 본 발명은 비멘틴 발현 억제용 shRNA 및 비멘틴 비인산화 돌연변이체를 항암제로 제공할 수 있다.
본 발명의 항암용 조성물내 상기 비멘틴 shRNA와 비멘틴 돌연변이체는 세포 내 발현을 위한 벡터에 포함되어 제공될 수 있으며, 벡터는 하나의 또는 별개 벡터에 로딩되어 제공될 수 있고, 별개의 벡터로 제공되는 경우 동시에 또는 순차로 개체에 투여하여 암의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 비멘틴 shRNA 및 비멘틴 돌연변이체는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비-바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 운반 메카니즘은 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비-바이러스성 운반 메카니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포좀, 면역리포좀, 리포펙틴, 양이온성 표면 양친매물질 및 이의 조합물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 비멘틴 shRNA 및 돌연변이체 전달을 위한 바이러스 벡터(viral vector)로서 이용한 렌티바이러스는 레트로바이러스의 일종으로 핵공(nucleopore)이나 완전한 핵막으로의 능동 도입을 가능하게 하는 사전-통합 복합체(바이러스"쉘(shell)")의 친핵성으로 인해 분열 세포뿐만 아니라 미분열 세포도 감염시킬 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 비멘틴 shRNA는 비멘틴 유전자의 특정 타겟(#1~3) 영역과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로서 비멘틴 발현 억제용 shRNA를 의미한다. 본 발명의 shRNA는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나 시판되는 것을 사용할 수 있으며, 유전공학적 방법을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 돌연변이체는 비멘틴 단백질을 구성하는 하나 이상의 아미노산이 치환(substitution)된 것을 의미하고, 다른 말이 없다면, 본 명세서에서 암 세포의 이동성 및 침습성과 종양형성을 감소시켜 항암 효과를 갖는 돌연변이체는 비멘틴의 T327 및/또는 S339 아미노산이 치환된 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '항암'은 암세포의 증식을 억제하거나 사멸하는 작용 및 암세포의 전이를 억제하거나 차단하는 작용을 의미하는 것으로, 암의 예방 및 치료 모두를 의미하고 이와 혼용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 '예방'은 조성물의 투여로 암 형성을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, '치료'란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.
본 발명의 항암제는 상술한 shRNA와 돌연변이체 이외에 비멘틴의 인산화를 억제하거나 이의 발현을 감소시키는 것으로 알려진 여타의 물질, 예를 들어 화합물, 천연물, 신규 단백질 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 항암제는 vimentin의 발현이 과다한 다양한 대장암, 전립선암, 유방암 및 위암 등의 각종 고형암 및 백혈병 등의 예방 및 치료에 이용될 수 있으며, 또한 일차암에서 전이되어 유발된 전이성 고형암의 예방 및 치료에도 이용될 수 있다.
본 발명의 비멘틴 돌연변이체 및 이를 발현하는 벡터를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제 또는 향미제 등을 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제 및 기타 액제로 제제화될 있다. 구체적으로, 본 발명의 세포사멸 활성화제는 경구 투여를 위해서, 예를 들면 알약(troches), 정제(lozenge), 수용성 또는 유성 현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 (elixirs)로 제제화될 수 있다. 이때, 정제 및 캡슐로 제제화하기 위해서는 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 첨가할 수 있다. 또한, 캡슐제로 제제화할 경우, 상기에서 언급된 물질 이외에도 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나의 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있으며, 표적 세포에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 세포에 특이적인 항체 또는 기타 리간드를 상기의 담체와 함께 결합시켜 사용할 수 있다. 덧붙여, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구로 투여할 경우, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용으로 제제화하기 위해서는 상기 세포사멸 촉진 항암제를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.
투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 선택하는 것이 바람직하며, 본 발명의 암세포사멸 촉진 항암제는 성인의 체중 1㎏ 당 1 내지 100 ㎎, 바람직하게는 1 내지 10 ㎎의 투여양으로 매일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 전이성 폐암세포에서 vimentin과 활성형 PLK1의 임상적 연관성 및 TGF-β에 의해 유도된 암전이 조건에서 vimentin과 활성형 PLK1의 발현 분석
최근 연구(Shin S.B. et al., Oncogene 39 (2020) 767-785)에서 비소세포폐암 세포에서 PLK1에 의해서 유도된 암전이 과정동안 ECM-adhesion 관련 유전자들의 변화를 관찰하였다(도 1A). Vimentin은 TGF-β에 의해 유도된 암전이에 관련된 주요한 ECM 조절인자이며(Liu C.U. et al., Oncotarget 6 (2015) 15966-15983; Mendez M.G. et al., FASEB J 24 (2010) 1838-1851) 암세포의 침윤과정동안 PLK1에 의해서 인산화 되는 기질 단백질이다(Rizki A. et al., Cancer Res 67 (2007) 11106-11110). 그러나 GeneMANIA 데이터베이스의 분석을 통해서 나온 결과에서는 PLK1과 vimentin의 상호작용 네트워크는 확인할 수 없었다(도1 B). 따라서 PLK1과 vimentin의 관련성을 규명하고자 연구를 진행하였다.
먼저 vimentin과 PLK1이 임상적 연관성을 확인하기 위해서 비소세포폐암 환자에서 vimentin과 PLK1의 단백질 발현량에 따른 환자의 전체 생존율을 빅데이터를 분석을 통해서 확인하였다(도1 C). 먼저 비소세포폐암 중 선암(adenocarcinoma)에서는 PLK1과 vimentin 발현이 높은 환자의 생존율은 PLK1과 vimentin의 발현이 낮은 환자의 생존율에 비해 현저히 낮은 것을 확인할 수 있었다. 하지만 편평상피세포암(Squamouse cell carcinoma)에서는 PLK1과 vimentin 발현과 환자의 생존율과는 연관성이 관찰되지 않았다. 또한 전이성 폐선암 환자 중 전이단계인 TMN 단계가 높을수록 PLK1과 vimentin 발현이 높은 환자의 생존율은 PLK1과 vimentin의 발현이 낮은 환자의 생존율에 비해 점점 현저하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도1 D). 이상의 결과로 비소세포폐암 중 선암에서 PLK1과 vimentin 발현양과 환자의 생존율의 연관성을 확인할 수 있었으며, 특히 암전이가 많이 진행된 환자에서 PLK1과 vimentin 발현양이 높으며, 그 생존율에도 큰 영향을 주는 것으로 확인할 수 있었다.
본 발명자는 전이성 폐암에서 vimentin과 PLK1의 발현을 알아보기 위해서 폐암세포에 TGF-β을 처리하여 암전이를 유도한 조건에서 microarray을 진행한 데이터(GSE 114761)를 분석하여 히트맵을 구성하였다(도 1E). 히트맵 분석을 통하여 간엽이행 마커인 CDH2, SNAIl 및 SMAI2은 높고, 상피형질 마커인 CDH1과 OCLN은 낮은 암전이 조건에서 vimentin과 PLK1 mRNA 발현이 TGF-β를 처리한 폐암세포에서 높은 것을 알 수 있었다.
폐암의 상피간엽이행 과정에서 PLK1과 vimentin의 발현 변화와 PLK1의 활성화여부를 알아보고자 비소세포폐암 세포주 A549와 NCI-H460에 TGF-β를 처리하여 암전이를 유도한 후 mRNA 발현량과 단백질 발현량을 분석하였다. 먼저 TGF-β를 처리한 군에서 간엽이행 마커인 CDH2, SNAl1 SNAI2의 mRNA 발현량 증가와 상피형질 마커인 CDH1의 mRNA 발현량이 감소하는 것을 관찰하였다. 이 조건에서 대조군에 비하여 PLK1과 vimentin의 mRNA 발현량의 증가를 관찰할 수 있었다(도 1F). 또한 vimentin, PLK1, E-cadherin과 N-cadherin의 단백질량도 mRNA 발현량과 같은 결과를 관찰하였다(도 1G). 추가적으로 활성화형인 인산화된 PLK1의 단백질 발현량이 대조군에 비해 TGF-β처리군에서 높게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다(도 1G-H).
이러한 결과는 폐암에서 특히 폐선암에서 PLK1과 vimentin의 발현이 높을 뿐만 아니라 발현 패턴도 유사하며, 임상적으로도 상호연관성을 가지는 것을 시사하였다.
<실시예 2> TGF-β에 의해 유도한 전이성 폐암세포에서 활성형 PLK1에 의한 vimentin의 인산화 및 신규 인산화 부위 확인
TGF-β처리에 의해서 유도된 암전이 조건에서 PLK1과 vimentin의 상호작용을 탐구하기 위하여 면역침강법을 수행하였다. Agarose beads와 PLK1 항체로 PLK1 단백질을 침강하였으며 면역블롯법을 통해서 분석하였다. Vimentin은 대조군에서도 PLK1과 결합하였고, TGF-β에 의해 암전이를 유도한 실험군에서는 PLK1과 vimentin의 결합이 증가되었다(도 2A-B). 상기 결과는 전이 과정에 암세포에서 PLK1과 vimentin의 상호작용이 보다 활발함을 시사한다.
다음으로 두 단백질의 상호작용 방법을 분석하기 위하여 인산화효소 반응법을 수행하였다. 세린/트레오닌 인산화효소인 PLK1이 vimentin을 기질로서 인산화 시키는지 증명하는 방법으로 정제된 vimentin 원형(wild)과 활성형 PLK1-T210D을 방사선이 표지된 r32-P-ATP을 함께 처리하여 반응시키고 분석하였다. Vimentin은 양성대조군인 TCTP과 유사한 수준으로 강하게 활성형 PLK1-TD에 의해 인산화되었다(도 2C).
PLK1에 의한 vimentin의 인산화 부위를 찾기 위하여 액체크로마토그래피 질량분석법을 진행하였다. 본 분석법으로 vimentin의 Thr-327, Thr-336, Ser-339가 PLK1에 의해 인산화되는 부분으로 예측되었다(도 2D). 예측된 vimentin의 인산화 부분 3곳과 PLK1에 의한 vimentin을 인산화 시킨다고 보고된 2곳을 부분 특이적 돌연변이 치환법을 이용하여 알라닌으로 치환된 탈인산화 돌연변이체로 제작하였다.
상기 제작된 돌연변이체를 GST가 표지된 단백질로 생산하였고 정제하여 인산화효소 반응법을 진행하였다. Vimentin의 인산화 예측 부위 3가지 중에서 Thr-327과 Ser-339의 알라닌 돌연변이가 원형과 비교했을 때 인산화 정도가 두드러지게 감소하였다(도 1E). 이러한 연구 결과는 PLK1이 vimentin Thr-327과 Ser-339의 인산화반응을 통하여 상호작용한다는 것을 알 수 있었다.
또한 TGF-β처리하여 암전이를 유도한 폐암세포주 A549와 NCI-H460에서 인산화효소(phosphatase) 처리 후 인산화된 vimentin과 PLK1의 발현량이 감소한 것을 관찰하였다(도 2F-G). 상기 결과로부터 TGF-β처리로 유도된 암전이 동안 vimentin과 PLK1이 인산화됨을 알 수 있다.
<실시예 3> Vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이형 발현을 위한 렌티바이러스 시스템 구축
본 발명자들은 vimentin의 인산화 및 비인산화 유전자 발현을 위한 lentivirus system 구축을 위하여 pLVX-TRE3G-eRFP 에, Mlu1과 Apa1으로 cutting후, vimentin 원형(WT) 플라스미드를 5' -ACGGGGCCCATGTCCACCAGGTCCGTGTC-3'(forward primer)와 5' -ACGACGCGTTTATTCAAGGTCATCGTGA-3'(reverse primer)의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시킨 후 이를 Mlu1과 Apa1으로 cutting후, 벡터 pLVX-TRE3G-eRFP에 서브클로닝하였다. 렌티 바이러스 시스템을 구축하기 위해서 pCMV-VSV.G와 pCMV-ΔpLVX-TRE3G-eRFP-Target 또는 pLVX-Tet3G DNA를 HEK293 cells에서 발현시키고자 transfection 하여 렌티 바이러스를 발현시켜 바이러스를 모은 후 이를 암세포에 사용하고자 하였다. Transfection 후 바이러스 배양액은 12시간 간격으로 72시간까지 모았으며, 0.2 mm 필터로 배양액을 필터하고 17000 rpm, 4℃90분 동안 원심분리하였다. 상등액은 버리고 TNE Buffer로 모아진 바이러스를 모은 후 4℃에 보관하여 다음날부터 암세포 감염에 사용하였다.
<실시예 4> 렌티바이러스를 이용한 vimentin의 활성형 및 비활성형 유전자 발현 세포 선별 후 상피간엽이행 효과 평가
점 돌연변이를 포함하는 vimentin 단백질의 암세포 상피간엽이행 조절효과를 검토하기 위하여, 폐암세포에 vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체가 발현시키는 렌티바이러스를 감염시키고자 다음과 같이 암세포를 배양하였다.
폐암 세포인 NCI-H460에 vimentin의 원형 및 인산화와 비인산화된 점 돌연변이체를 발현시키는 안정화된 세포주를 구축하기 위해서 먼저 pLVX-Tet3G 발현성 렌티바이러스를 감염시키고 G418을 5일 동안 처리하여 감염된 세포를 선별하였다. 이렇게 선별된 NCI-H460Tet3G 세포에 vimentin의 원형 및 인산화된 점 돌연변이형(S339E, T327E, S83E, S459E)와 비인산화된 점 돌연변이형(S339A, T327A, S83A, S459A)을 발현시키는 렌티바이러스를 감염시킨 후 puromycin을 48시간동안 처리하여 안정화된 세포주를 구축하였다. 구축된 세포에 1ug/ml doxycycline 처리하여 vimentin의 원형 및 인산화와 비인산화형의 점 돌연변이형을 발현을 유도 후 각각의 vimentin의 점 돌연변이체가 잘 발현되었는지 mRNA 발현량과 단백질 발현량을 확인하였다. 도 3A-B에서와 같이, vimentin의 원형 및 각각의 점 돌연변이형이 잘 발현되고 있는 것을 mRNA 발현량과 단백질 발현량을 통해서 확인하였다. 인산화 부위 S459를 제외하고, 인산화형의 vimentin이 발현되는 폐암세포에서 비인산화형 vimentin를 발현하고 있는 세포에서 보다 N-cadherin의 발현이 높은 것을 관찰하였다. 또한 이러한 vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 발현이 세포의 증식에 영향을 주는지 확인해 본 결과, 세포의 증식에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다(도 3C).
이상의 결과로, 폐암세포에서 vimentin의 인산화가 상피간엽이행을 촉진하는 효과를 시사하였다.
<실시예 5> Vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이를 포함하는 단백질에 의한 전이성 촉진 및 억제 효과 평가
Vimentin 원형, 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시키는 폐암세포 NCI-H460에서 이들 점 돌연변이체가 암세포의 이동성에 미치는 효과를 관찰하기 위해 세포이동성 실험(migration assay)을 실시하였다.
구체적으로, 각각의 vimetnin 원형, 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시키는 폐암세포 NCI-H460을 5 x 104 개의 세포를 8.0 μm, 24 well insert에 분주하고 24 well plate에 10% 혈청(FBS)이 포함된 배지를 분주한 뒤 inset를 넣어 주었다. 양성 대조군의 경우, 2.5 ng/ml TGF-β가 포함된 RPMI 1640(10% FBS)를 0.5 ml 분주하여 사용하였다. 세포분주 72시간 후, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ㎕를 분주하고 1XPBS로 3회 세척하여 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도(intensity)를 Odyssey infrared imaging system을 이용하여 측정하였다. 대조군의 염색된 정도(intensity)를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 염색된 정도를 산출하여 그래프를 표시하였다.
연구 결과, vimentin 인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시킨 실험군에서 양성대조군인 TGF-β처리군과 유사하거나 더 높게 염색강도(intensity) 수치가 대조군 대비 5배까지 증가하였으며, 상대적으로 vimentin 인산화 돌연변이체에 비해 비인산화 점 돌연변이체 실험군은 염색강도가 낮은 것을 관찰할 수 있었다(도 3D-E). 하지만 vimentin의 S459번 인산화 돌연변이체는 암세포 이동성에 영향을 주지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 vimentin 인산화 점 돌연변이체는 폐암세포의 이동성을 촉진하며, 반면에 vimentin 비인산화 점 돌연변이체는 폐암세포의 이동성을 억제하는 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.
<실시예 6> Vimentin의 인산화부위 및 비인산화 점 돌연변이를 포함하는 단백질에 의한 침습성 촉진 및 억제 효과 평가
Vimentin 원형, 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시키는 폐암세포 NCI-H460에서 이들 점 돌연변이체가 암세포의 침습성에 미치는 효과를 관찰하기 위해 matrigel을 이용한 침습성 실험(invasion assay)을 실시하였다.
구체적으로, 4℃에서 16~20시간동안 matrigel을 완전히 녹인 후 matrigel을 1 mg/ml이 되도록 차가운 serum free RPMI 1640(4℃으로 희석하였다. 이를 8.0 μm 24 well 인서트(insert)에 100 μl 의 matrigel mixture(1 mg/ml)를 넣고 37℃배양기에서 12-20시간 동안 굳혀주었다. 굳은 matrigel insert에 각각의 vimentin 원형, 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시키는 폐암세포 NCI-H460들을 1X10 cells/well의 세포수로 serum free RPMI 1640 (36℃에 희석하여 insert에 분주하였다. 여기에 36℃의 따뜻한 RPMI 1640 (10% FBS)을 0.5 ml/well씩 분주하였다. 양성 대조군의 경우 2.5 ng/ml TGF-β가 포함된 36℃RPMI 1640(10% FBS)를 0.5 ml 분주하여 사용하였다. 이 후 3일에 한 번씩 배지를 교환해주고 침습되는 정도를 관찰하였으며, 암세포의 침습이 충분히 일어난 것으로 관찰된 5일 차에 배지를 제거하고 1XPBS로 세척한 후, insert 안쪽의 cell들을 면봉으로 긁어 내었고, 1XPBS로 세척하여 insert 내부에 cell과 matrigel의 잔여물이 남지 않도록 제거하였다. Insert 바깥 면이 있는 24 well에 4% paraformaldehyde 500ul를 분주하고 5분간 실온에서 incubation한 후 1XPBS로 3회 세척하여, 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 DMSO로 녹인 후 590nm에서 파장을 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.
연구 결과, vimentin 인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시킨 실험군에서 양성대조군인 TGF-β 처리군과 유사하거나 더 높게 흡광도 수치가 대조군 대비 4배에서 6배까지 증가하였으며 상대적으로 vimentin 비인산화 점 돌연변이체 실험군은 상대적 흡광도가 더 낮아진 것을 관찰할 수 있었다(도 3F). 따라서 vimentin 비인산화 점 돌연변이체는 폐암세포의 이동성과 침습성을 억제하는 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.
<실시예 7> 동물모델에서 vimentin의 인산화부위 및 비인산화 점 돌연변이를 포함하는 단백질에 의한 암세포의 전이성 및 종양형성능 평가
본 발명자들은 동물모델에서 암세포의 종양 형성능을 관찰하기 위해 vimentin의 인산화 및 비인산화 점 유전자가 발현되는 암세포를 이용하여 암세포의 종양형성 촉진 및 억제 효과를 평가하고자 하였다.
구체적으로, 점 돌연변이를 포함하는 vimentin 단백질이 안정적으로 발현되는 NCI-H460 폐암세포(2X106 세포수)를 PBS에 넣어 마우스의 꼬리 정맥에 주사하여, 8주 동안 사육하고, 개복하여 장기에 암세포가 전이 및 종양형성능을 관찰하였다. 비교를 위해 대조군(Mock; 목적유전자가 발현되지 않는 렌티바이러스 처리군), vimentin 단백질 발현되는 NCI-H460 폐암세포주 투여군(WT), 인산화 점 돌연변이체 vimentin 단백질 발현되는 NCI-H460 폐암세포주 투여군(S339E, T327E, S83E), 비인산화 점 돌연변이체 vimentin 단백질 발현되는 NCI-H460 폐암세포주 투여군(S339A, T327A, S83A)에 대해서 암세포 전이 및 종양형성 여부를 관찰하였다. 각 실험군 마다 5마리의 마우스에 대하여 실험을 실시하고, 폐에서의 전이성 암인 종양형성 빈도수를 측정하여 그래프로 표시하였다(도 4).
도 4에 나타낸 바와 같이, 대부분의 종양은 폐에 생성되었고, 따라서 본 실험도 폐를 중심으로 분석하였다. 대조군(Mock)과 vimentin 원형 대비 인산화 점 돌연변이를 포함하는 vimentin 단백질이 발현되는 NCI-H460 세포를 투여한 실험군에서는 종양형성능이 비교적 높은 것을 관찰하였다. 특히 vimentin 인산화 점 돌연변이체 중 S339E 실험군에서는 생성된 종양의 수나 크기를 관찰했을 때 가장 높은 종양형성능을 확인할 수 있었다. 반대로 비인산화 점 돌연변이를 포함하는 vimentin 단백질이 발현되는 NCI-H460 세포를 투여한 실험군에서는 종양형성능이 비교적 낮은 것을 관찰하였다(도 4A-B). 추가적으로 각 동물실험군들의 생존율을 관찰한 결과, vimentin 비인산화 점 돌연변이체 실험군에 비해서 인산화 돌연변이체 실험군 (S339E, S83E)에서 동물의 생존율이 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 4C). 또한, H&E(Haematoxylin and eosin)과 Ki67 염색을 통해서 vimentin 인산화 점 돌연변이체 실험군에서 암세포 증식정도가 높은 것을 알 수 있었다(도 4D-F). 이는 동물모델에서 vimentin의 인산화 점 돌연변이체를 발현하는 암세포는 암전이성과 종양형성능을 촉진시키며, 반대로 비인산화 점 돌연변이체는 암전이성과 종양형성능을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로 폐의 일부를 용해하여 상피간엽이행 마커의 단백질 수준을 관찰한 결과, vimentin 인산화 점 돌연변이체의 실험군에서 중간엽 마커인 N-cadherin의 단백질 수준이 증가하였으며, E-cadherin의 수준은 감소하였다. 또한 면역회피에 관여하여 암세포의 종양형성능을 증가시킨다고 알려진 PD-L1과 PD-L2의 발현도 각 실험군에서 확인한 결과, vimentin 인산화 점 돌연변이체 실험군에서 특히 PD-L1의 발현이 높게 관찰되었다(도 4G). 종양형성능이 가장 크게 관찰되었던 vimentin 인산화 점 돌연변이체 중 S339E 실험군에서 역시 PD-L1 단백질 발현도 가장 높게 관찰되었다(도 4H). 따라서 vimentin의 인산화가 상피간엽이행과 전이성과 종양형성능을 증진시킴을 시사한다. 반면, 본 발명의 비인산화 점 돌연변이체 특히, S339A 실험군은 원형의 vimentin 실험군보다 낮은 전이성과 암세포의 종양형성능을 억제하는 효과가 뛰어남을 알 수 있다.
<실시예 8> TGF-β 처리에 의한 전이환경에서 vimentin shRNA의 상피간엽이행 억제 효과 평가
Vimentin의 mRNA 발현 억제 효과를 확인하기 위해서, shRNA 및 이를 포함하는 렌티바이러스를 제작하였다.
구체적으로 vimentin의 mRNA 발현을 억제하기 위하여 사람의 vimentin mRNA(Human vimentin mRNA [NM_003380])서열 중 1447-1467(타겟 #1), 1290-1310(타겟 #2), 1132-1152(타겟 #3) 위치의 뉴클레오티드 서열을 각각 타겟으로 하는 shRNA를 만들고자 하기 표 1의 프라이머를 제작하였다.
| 타겟 #no | 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| 타겟 #1 | Forword | 5'- CCGGGTGAAATGGAAGAGAACTTTGCTCGAGCAAAGT TCTCTTCCATTTCACTTTTTG -3' | 5 |
| Reverse | 5'-AATTCAAAAAGTGAAATGGAAGAGAACTTTGCTCGAGCAAAGTTCTCTTCCATTTCAC -3 | 6 | |
| 타겟 #2 | Forword | 5'-CCGGGCAGAAGAATGGTACAAATCCCTCGAGTTATTTGTACCATTCTTCTGCTTTTTG-3 | 7 |
| Reverse | 5'-AATTCAAAAAGCAGAAGAATGGTACAAATCCCTCGAGTTATTTGTACCATTCTTCTGC-3 | 8 | |
| 타겟 #3 | Forword | 5'-CCGGTGAAGAAACTCCACGAAGAGGCTCGAGCCTCTTCGTGGAGTTTCTTCATTTTTG-3' | 9 |
| Reverse | 5'-AATTCAAAAATGAAGAAACTCCACGAAGAGGCTCGAGCCTCTTCGTGGAGTTTCTTCA-3' | 10 |
제작된 shRNA는 하기 표 2와 같다.
| shRNA #no | 서열 | 서열번호 |
| shRNA #1 | GTGAAATGGAAGAGAACTTTG | 11 |
| shRNA #2 | GCAGAAGAATGGTACAAATCC | 12 |
| shRNA #3 | TGAAGAAACTCCACGAAGAGG | 13 |
이를 기반으로 pLKO-puro.1 벡터를 이용한 pLKO-puro.1-vimentin shRNA 플라스미드를 제작하였다. 이를 pHR'-CMV-VSVG, pHR'-CMV-deltaR8.2와 함께 HEK293 세포 형질감염을 통해 발현시킨 후, 세포의 배양배지를 모아 렌티바이러스를 생산하였다. 원심분리기를 이용하여 상기 렌티바이러스를 농축시켰다. 바이러스 발현 확인을 위하여 NCI-H460, A549 세포를 5X104 개/ml으로 배양한 후, 다음 날 감염 버퍼(Infection Buffer; 10mM HEPES, 1 mg/ml 폴리브렌에 렌티바이러스를 20 μ/well로 첨가하여 암세포를 감염시켰다. 24시간이 지난 후 puromycine를 48시간 동안 처리하여 vimentin shRNA 감염된 세포를 선별하였다.
먼저 본 발명자는 제작한 vimentin shRNA에 의한 vimentin 발현억제 효과를 확인하고자 puromycine 처리를 통하여 선별된 각각의 vimentin shRNA에 감염된 세포에서 vimentin의 mRNA 발현과 단백질 발현정도를 확인하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이 각각의 vimentin shRNA (shvimentin)에 감염된 폐암세포 NCI-H460는 대조군 shRNA(shCtrl)에 감염된 세포에 비하여 vimentin의 mRNA의 발현이 감소하였고, 이는 vimentin의 발현이 억제되었음을 관찰하였다. 특히 vimentin mRNA 서열에서 1447-1467(타겟 #1) 위치의 뉴클레오티드 서열을 타겟으로 하는 shRNA가 vimentin의 발현억제 효과가 가장 좋은 것으로 관찰되었다. 따라서 본 발명자는 하기에 vimentin 발현억제 연구 시에 vimentin mRNA 서열에서 1447-1467(타겟 #1) 위치의 뉴클레오티드 서열을 타겟하는 shRNA를 사용하였다.
본 발명자는 TGF-β를 처리에 의해 유도된 암전이가 vimentin shRNA 처리로 vimentin mRNA 발현 억제가 상피간엽이행 마커 및 관련 인자들의 mRNA 발현 및 단백질 발현 변화 관찰하였다.
구축된 vimentin를 억제하는 세포주에 2.5ng/ml TGF-β를 48시간 동안 처리하여 암전이를 유도한 조건에서 시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)과 면역화학적 분석(Immunoblot anaylsis)을 통해 상피간엽이행 관련 인자들인 CDH1, CDH2 발현을 및 면역회피 관련 인자인 PD-L1 발현을 관찰하였다(도 6A-D).
도 6에 나타낸 바와 같이 vimentin shRNA (shvimentin)에 감염된 폐암세포 NCI-H460, A549는 대조군 shRNA (shCtrl)에 감염된 세포에 비하여 vimentin의 mRNA의 발현이 감소하였고, 이는 vimentin의 발현이 억제되었으며, 암전이 환경을 유도하는 TGF-β를 처리한 조건에서도 vimentin의 발현이 억제되었음을 관찰하였다(도6 A, C). TGF-β처리에 의한 상피 마커인 CDH1 발현의 감소가 shvimentin 처리에 의한 vimentin의 발현 억제로 CDH1 발현의 감소가 억제되었으며, 또한 TGF-β처리에 의한 중간엽 마커인 CDH2을 비롯한 PD-L1 발현의 증가도 vimentin의 발현 억제를 의해 억제되었음을 관찰하였다(도 6B, D).
<실시예 9> Vimentin shRNA의 전이성 억제 효과 평가
본 발명자는 vimentin shRNA 처리로 vimentin의 발현 억제가 TGF-β가 처리된 전이환경에서 세포 이동성 실험(migration assay)을 통해서 세포의 이동성을 억제하는 효과를 증명하였다.
구체적으로 폐암세포 NCI-H460에 대조군 shRNA (shCtrl) 또는 vimentin shRNA (shvimentin) 바이러스를 감염시켰다. 다음날, 2μg/ml 퓨로마이신(puromycin)을 48시간동안 처리 후 선별된 vimentin shRNA이 발현되는 세포를 6 well plate에 2x105 cells/ml로 분주하였으며 24시간 후 pipette tip를 사용하여 일정한 간격으로 스크래치를 내었다. 이동성 실험에서 2.5 ng/ml의 TGF-β를 사용하여 암전이를 유도하였다. 스크래치를 낸 후 24시간 간격으로 세포의 간격과 이동성을 현미경으로 관찰하고 현미경에서의 세포 촬영을 통하여 간격이 복구되는 정도를 세포사이의 거리로 측정하였다. 측정된 수치를 대조군의 거리를 100%라고 할 때 상대적 이동 거리를 산출한 후(식 1 참조), %로 그래프를 표시하였다 (도 6E).
[식 1]
상대적 이동 거리 (%) = 실험군에서의 측정수치 x 100 / 대조군의 측정수치
연구결과, vimentin shRNA 처리에 의한 vimentin 발현억제로 폐암세포 자체의 전이성을 감소시켰는데 특히 72시간에는 대조군의 이동성이 0%라고 설정할 때 약 -10% 이상 이동성을 감소시켰다. 72시간에서 TGF-β처리에 의해 대조군 대비 약 30%의 이동성이 증가되는데, 이러한 폐암세포의 전이성을 vimentin shRNA에 의해 약 -8%까지 감소시켰다. 따라서 vimentin shRNA에 의한 vimentin 발현 억제는 암세포 자체의 전이성뿐만 아니라 TGF-β처리에 의해 유도되는 전이성에 대한 강력한 억제효과가 있음을 알 수 있었다.
<실시예 10> Vimentin shRNA의 침습성 억제 효과 평가
다음으로 본 발명자는 vimentin의 발현 억제가 TGF-β가 처리된 전이환경에서 세포 침습성 실험(invasion assay)을 통해서 세포의 침습성을 억제하는 효과를 증명하였다.
본 발명을 위하여 4℃에서 16~20시간동안 마트리겔(matrigel)을 완전히 녹인 후 마트리겔(matrigel)을 1 mg/ml이 되도록 혈청이 포함되지 않은 차가운 RPMI 1640 (4℃으로 희석하였다. 이를 8.0 μm 24칸용 인서트(insert)에 100μl 마트리겔(matrigel) 혼합물을 분주하고 37℃배양기에서 12-20시간 동안 굳혀주었다. 굳은 마트리겔 위에 vimentin shRNA 처리로 vimentin 발현이 억제된 폐암세포 NCI-H460를 1X105 cells/well의 세포수로 혈청이 없는 배지에 희석하여 분주하였다. 여기에 혈청이 포함된 36℃의 따뜻한 RPMI 1640(10% FBS)을 0.5 ml/well씩 분주하였다. TGF-β처리에 의해서 암전이를 유도하였다. 3일에 한 번씩 배지를 교환해주고 침습되는 정도를 관찰하였으며, 암세포의 침습이 충분히 일어난 것으로 관찰된 5일 정도에 배지를 제거하고 1XPBS로 세척한 후, 인서트 안쪽의 세포들을 면봉으로 긁어 내었고, 1XPBS로 세척하여 인서트 내부에 세포와 마트리겔(matrigel)의 잔여물이 남지 않도록 제거하였다. 인서트(inset) 바깥 면이 있는 24칸 플레이트에 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ㎕를 분주하고 마트리겔을 침습한 세포를 5분간 실온에서 인큐베이션한 후 5분에 1XPBS로 3회 세척하여, 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 염색된 세포를 현미경으로 관찰하고 그 수를 세어서 침습된 세포수를 그래프로 표시하였다.
그 결과, 도 6F에 나타낸 바와 같이, vimentin shRNA을 감염시켜 vimentin의 발현을 억제한 세포는 대조군 바이러스(shCtrl)을 처리한 세포보다 세포의 침습성을 억제되었고, TGF-β처리에 의한 전이 환경에서도 vimentin에 의한 vimentin 발현 억제가 세포의 침습성을 억제하는 것을 관찰하였다.
이상의 결과를 종합하였을 때, vimentin shRNA 의한 vimentin 발현 억제가 세포의 상피간엽이행에 관여하는 인자들의 발현을 억제시킬 뿐만 아니라 세포의 이동성과 침습성을 감소시키며, TGF-β처리에 의한 전이 환경에서도 vimentin shRNA에 의한 vimentin 발현 억제가 상피간엽이행 관련 인자들의 발현을 억제시키며, 세포의 이동성과 침습성도 감소하는 것을 증명하였다.
<실시예 11> Vimentin shRNA의 종양형성능 억제 효과 평가
본 발명자는 vimentin의 발현 억제가 TGF-β가 처리된 전이환경에서 암세포의 종양형성을 억제하는 효과를 확인하고자 soft agar를 이용한 콜로니 형성 실험(colony formation assay, soft agar assay)를 진행하였다. 구체적으로, 하단에는 0.6%의 agar 층을 만들기 위해 4% stock agar 150 ml, FBS 100 ml, Free RPMI 1640 750 ml을 섞어 총 1 ml의 agar 배지를 지름 12 well 플레이트에 넣고 1시간 굳혔다. 상단에는 0.4%의 agar 층을 만들기 위해 4% stock agar 100 ml, FBS 100 ml 에 1X103 cells의 세포를 섞은 RPMI1640 배지 800 ml를 섞어 1시간 굳인 후 10%의 FBS를 분주하였다. 이를 5일 간격으로 배지를 바꾸어 주었으며 2주 후 현미경 상으로 종양 덩어리인 콜로니가 형성된 것을 관찰하였으며, 0.005% cryal violet-methanol 용액을 이용하여 15분 동안 염색한 후 이를 20% methanol-PBS 용액을 이용하여 세척한 후 현미경 상으로 전체 콜로니의 수를 측정하였다.
연구 결과, 양성 대조군인 2.5 ng/ml TGF-β처리군의 경우 대조군 대비 약 2배 colony 형성이 증가되는 것을 관찰할 수 있었으며, vimentin 발현 억제군 세포는 대조군에 대비하여 colony의 수가 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 또한 TGF-β처리에 의해서 유도한 암전이 환경에서도 vimentin 발현 억제는 colony의 수를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 vimentin shRNA에 의한 vimentin의 발현억제는 암세포의 종양 형성 (colony 형성)을 억제하는 중요한 인자임을 알 수 있었다(도 6G).
<실시예 12> Vimentin shRNA에 의한 발현억제 후 vimentin 인산화 점 돌연변이체 단백질의 발현에 의한 전이성 및 침습성 촉진 효과 평과
본 발명자는 앞선 실험을 통해서 vimentin shRNA에 의한 vimentin의 발현억제는 암전이 및 암종양형성능을 억제함을 확인할 수 있었다. 이러한 조건에서 vimentin의 인산화 점 돌연변이체의 단백질의 재발현이 암 전이성 및 침습성에 미치는 효과를 분석하였다.
구체적으로, 폐암세포 NCI-H460에 vimentin mRNA의 발현 억제를 위하여 제작한 pLKO-puro.1-vimentin을 이용하여 발현시킨 바이러스성(viral) vimentin shRNA를 20μl 취하여 감염 버퍼(Infection Buffer; 10mM HEPES, 1㎍/ml Polybrene)와 섞어 세포에 처리하였다. 24시간 후 2㎍/ml puromycin를 48시간 동안 처리하여 vimentin shRNA에 감염된 세포만 선별하여 vimentin 발현을 억제하는 세포주를 구축하였다. 구축된 vimentin 발현억제 세포주에 다시 vimentin의 원형 및 인산화된 점 돌연변이형(S339E)와 비인산화된 점 돌연변이형(S339A)을 발현시키는 렌티바이러스를 감염시킨 후 puromycin과 G418으로 선별하였다. 선별 후, 1ug/ml doxycycline 처리하여 vimentin의 원형 및 인산화와 비인산화형의 점 돌연변이형을 발현을 다시 유도하여 각각의 vimentin의 점 돌연변이체가 잘 발현되었는지 단백질 발현량을 확인하였다. 도 6H에서와 같이, vimentin 발현이 억제되는 조건에서 vimentin의 원형 및 각각의 점 돌연변이형이 잘 발현되고 있는 것을 확인하였다.
다음으로 본 발명자는 vimentin의 발현 억제된 조건에서 vimentin의 인산화 점 돌연변이체의 단백질의 재발현이 암 세포의 이동성 및 침습성에 미치는 효과를 증명하였다.
먼저 암세포의 이동성에 미치는 효과를 보기 위해서 구체적으로 앞선 실험에서 구축된 vimentin 원형(WT) 및 인산화(S339E)와 비인산화(S339A) 점 돌연변이체를 재발현 시킨 NCI-H460 세포를 혈청이 없는 배지에 희석하여 5 x 104 개의 세포를 8.0 μm, 24칸용 인서트(inset)에 분주하고 24칸 플레이트에 10% 혈청이 포함된 배지를 분주한 뒤 인서트를 넣어 주었다. 세포 분주 후 48시간 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ㎕를 분주하여 이동한 세포를 고정시키고, 1XPBS로 3회 세척하여 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도(intensity)를 Odyssey infrared imaging system을 이용하여 측정하였다. 대조군의 염색된 정도(intensity)를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 염색된 정도를 산출하여 그래프를 표시하였다.
그 결과, 도 6I에 나타낸 바와 같이, vimentin 발현이 억제된 세포에 다시 vimentin 원형(WT)이 발현되어지는 세포는 대조군 세포(Mock)보다 세포의 이동성이 증가하였고, vimentin 인산화 점 돌이변이체인 S339E를 발현시킨 세포에서는 TGF-β처리한 양성대조군보다 세포의 이동성이 증가하였다. 따라서 vimentin의 인산화는 암세포 전이성에 대한 강력한 촉진 효과가 있음을 알 수 있었다.
다음으로, 본 발명자는 vimentin의 발현 억제된 조건에서 vimentin의 인산화 점 돌연변이체의 단백질의 재발현이 침습성에 미치는 효과를 증명하였다.
본 발명을 위하여 굳은 마트리겔 위에 앞선 실험에서 구축된 vimentin 원형(WT) 및 인산화(S339E)와 비인산화(S339A) 점 돌연변이체를 재발현시킨 NCI-H460 세포를 1X105 cells/well의 세포수로 혈청이 없는 배지에 희석하여 분주하였다. 여기에 혈청이 포함된 36℃의 따뜻한 RPMI1640(10% FBS)을 0.5 ml/well씩 분주하였다. 세포분주 5일 후 배지를 제거하고 1XPBS로 세척한 후, 인서트 안쪽의 세포들을 면봉으로 긁어 내었고, 1XPBS로 세척하여 인서트 내부에 세포와 마트리겔(matrigel)의 잔여물이 남지 않도록 제거하였다. 인서트 바깥 면이 있는 24칸 플레이트에 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ㎕를 분주하고 마트리겔을 침습한 세포를 5분간 실온에서 인큐베이션한 후 5분에 1XPBS로 3회 세척하여, 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 590nm에서 파장을 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.
그 결과, 도 6J에 나타낸 바와 같이, vimentin shRNA을 감염시켜 vimentin의 발현을 억제한 세포는 대조군 바이러스(shCtrl)을 처리한 세포보다 세포의 침습성을 억제되었고, 이러한 조건에서 다시 vimentin 원형(WT)이 발현시킨 세포는 대조군 세포(Mock)보다 세포의 침습성이 증가하였고, vimentin 인산화 점 돌이변이체인 S339E를 발현시킨 세포에서는 TGF-β처리한 양성대조군보다 세포의 침습성이 더 크게 증가하였다. 따라서 vimentin의 인산화는 암세포 침습성에 대한 강력한 촉진 효과가 있음을 알 수 있었다.
위의 결과를 종합하였을 때, vimentin의 인산화는 vimentin shRNA에 의한 vimentin 발현 억제 조건에서도 세포의 이동성과 침습성을 증가시키는 것을 증명하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (6)
- 비멘틴 단백질 발현 억제용 shRNA 또는 상기 shRNA를 발현하는 벡터를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 조성물은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 비멘틴 돌연변이체 또는 서열번호 3 또는 4의 염기서열로 이루어진 유전자를 로딩한 벡터를 추가로 포함하고,
상기 서열번호 1의 327 번째 아미노산이 알라닌(Alanine)이고,
상기 서열번호 2의 339 번째 아미노산이 알라닌인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 shRNA는 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 것인 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 암세포의 이동성 및 침습성을 감소시켜 암의 전이를 억제하는 것인, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 종양형성능을 억제하는 것인, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 암은 비소세포폐암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 비소세포폐암은 선암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230068084A KR102585460B1 (ko) | 2020-11-30 | 2023-05-26 | 비멘틴 발현 억제용 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200164854A KR20220076068A (ko) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | 비멘틴 발현 억제용 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
| KR1020230068084A KR102585460B1 (ko) | 2020-11-30 | 2023-05-26 | 비멘틴 발현 억제용 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200164854A Division KR20220076068A (ko) | 2020-11-18 | 2020-11-30 | 비멘틴 발현 억제용 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230082009A true KR20230082009A (ko) | 2023-06-08 |
| KR102585460B1 KR102585460B1 (ko) | 2023-10-10 |
Family
ID=81981071
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200164854A KR20220076068A (ko) | 2020-11-18 | 2020-11-30 | 비멘틴 발현 억제용 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
| KR1020230068084A KR102585460B1 (ko) | 2020-11-30 | 2023-05-26 | 비멘틴 발현 억제용 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200164854A KR20220076068A (ko) | 2020-11-18 | 2020-11-30 | 비멘틴 발현 억제용 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (2) | KR20220076068A (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070202112A1 (en) * | 2005-11-18 | 2007-08-30 | Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for detecting cancer and for inhibiting metastatis |
| KR102511660B1 (ko) * | 2020-11-18 | 2023-03-20 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 비멘틴 돌연변이체 또는 이를 발현하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
-
2020
- 2020-11-30 KR KR1020200164854A patent/KR20220076068A/ko not_active IP Right Cessation
-
2023
- 2023-05-26 KR KR1020230068084A patent/KR102585460B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070202112A1 (en) * | 2005-11-18 | 2007-08-30 | Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for detecting cancer and for inhibiting metastatis |
| KR102511660B1 (ko) * | 2020-11-18 | 2023-03-20 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 비멘틴 돌연변이체 또는 이를 발현하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220076068A (ko) | 2022-06-08 |
| KR102585460B1 (ko) | 2023-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20020048566A1 (en) | Modulation of cellular apoptosis and methods for treating cancer | |
| US20060134068A1 (en) | Treatment of cancer by simultaneous inhibiton of BRAF and restoration or mimicry of p16INK4A activity | |
| US20090186839A1 (en) | Model for studying the role of genes in chemoresistance | |
| US20230227823A1 (en) | Fmrp and cancer treatment | |
| US20080274993A1 (en) | Methods and compositions for modulating vascular integrity | |
| US10093716B2 (en) | Methods for treating cancer | |
| KR102511660B1 (ko) | 비멘틴 돌연변이체 또는 이를 발현하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| US9623109B2 (en) | Methods of killing cells and use of same in prevention and treatment of cancer | |
| JP5762103B2 (ja) | 頭頸部癌及び食道癌用抗癌剤及び増強剤 | |
| KR102585460B1 (ko) | 비멘틴 발현 억제용 shRNA를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| US7297779B2 (en) | Colon cancer metastasis inhibitor | |
| JPH11514884A (ja) | 腫瘍にあるサイクリンｇ１の発現 | |
| KR102125005B1 (ko) | 53bp1의 신규한 용도 | |
| KR20190062149A (ko) | 전이성 암 치료용 조성물 | |
| US20090239932A1 (en) | Antisense oligonucleotides against protein kinase isoforms alpha, beta and gamma | |
| WO2022108309A1 (ko) | 인산화된 비멘틴의 과도한 생성을 차단하여 암을 예방 또는 치료하는 방법 | |
| US10413564B2 (en) | Compositions and methods for combating drug-resistant cancers | |
| Joglekar et al. | PKC-alpha regulates the phosphorylation of KRAS that suppresses its oncogenic properties | |
| Crosley | Preclinical evaluation of TRAIL combined with PAC-1 to control granulosa cell tumour | |
| Greuber | Role of the Abelson Tyrosine Kinases in Regulating Macrophage Functions in Immunity | |
| Banik | Molecular mechanisms by which interferon regulatory factor-8 (IRF-8), a member of the IRF family of transcription factors, suppresses tumor progression of both hematopoietic and nonhematopoietic malignancies | |
| Kline | Potential of Prostate Apoptosis Response protein-4 (Par-4) in colon cancer therapy | |
| Furuta | IL-25 Causes Apoptosis of IL-25R | |
| Cilensek | Characterization of the antiapoptotic activity of a tumor antigen | |
| KR20180027927A (ko) | Pten 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |