KR102511660B1

KR102511660B1 - 비멘틴 돌연변이체 또는 이를 발현하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102511660B1
Application number: KR1020200154791A
Authority: KR
Inventors: 임형신; 장해란
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2023-03-20
Also published as: KR20220067962A

Abstract

본 발명은 PLK1이 비멘틴 인산화를 통해 종양의 형성과 암의 전이를 유도하는 것을 확인하고, PLK1에 의해 인산화되는 영역이 변이된 비멘틴 돌연변이체 및 이를 발현하는 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 비멘틴 돌연변이체는 PLK1와의 결합력은 유지하고 있는바 암세포에서 야생형 비멘틴과 경쟁적으로 과발현된 PLK1과 결합하여 종양의 형성 및 암의 전이를 억제할 수 있으며, 암세포 내에서 상기 돌연변이체를 발현하는 벡터의 제공은 암의 이동성 및 침습성을 억제하고 종양의 형성을 저해할 수 있다. 본 발명의 돌연변이체는 정상세포에서 비멘틴의 고유 기능에는 영향을 주지 않아 안전한 바 세포의 비정상적인 성장에 의한 각종 질환, 특히 원발성 및 전이성 고형암과 백혈병 등의 같은 퇴행성 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비멘틴 돌연변이체 또는 이를 발현하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a vimentin mutant or a vector expressing the same as an active ingredient}

본 발명은 PLK1이 비멘틴 인산화를 통해 종양의 형성과 암의 전이를 유도하는 것을 확인하고, PLK1에 의해 인산화되는 영역이 변이된 비멘틴 돌연변이체 및 이를 발현하는 벡터를 제공하는 것이다. 구체적으로 본 발명의 비멘틴 돌연변이체는 야생형 비멘틴의 327 및/또는 339 위치에 아미노산이 치환된 돌연변이 단백질로서 종양의 형성과 암의 이동성 및 침습성을 감소시킬 수 있다.

Vimentin은 중간엽 세포에서 주로 발현되는 중간 필라멘트 단백질로서 미세소관 및 미세 필라멘트와 함께 세포 골격 네트워크를 형성하여 세포 항상성을 유지하는 역할을 한다(Goldman, R.D. et al., J Cell Biol 134 (1996) 971-983). 특히, 상피간엽이행(EMT) 과정에서는 세포의 이동성과 침습성을 조절하는 중요한 조절 인자로 알려져 있다(Eckes, B. et al., J Cell Sci 111 (Pt 13) (1998) 1897-1907; Liu, C.Y. et al., Oncotarget 6 (2015) 15966-15983). 이러한 vimentin은 유방암, 폐암, 위암 빛 기타 많은 고형암에서 과발현되어 있음이 보고되었으며, 암의 악성 단계가 높을수록 vimentin의 발현이 증가됨이 보고되었다(Yamashita, N. et al., J Cancer Res Clin Oncol 139 (2013) 739-746; Ye, Z. et al., PLoS One 11 (2016) e0163162; Yin, S. et al., Pathol Res Pract 214 (2018) 1376-1380). 고형암에서 vimentin은 상피간엽이행 동안 세포 골격 재구성에 관여하는데 이는 상피간엽이행에 관련 신호전달을 조절함으로써 암세포의 이동성과 침습성을 촉진하기 때문으로 알려져 있다. 또한 vimentin이 결여된 배아세포는 세포의 이동성이 감소되며, vimentin이 결핍된 마우스의 경우 상처 부위에서 근섬유 아세포의 이동성 손상으로 상처 부위의 회복이 잘 안됨이 보고되었다(Eckes, B. et al., J Cell Sci 111 (Pt 13) (1998) 1897-1907; Eckes, B. et al., J Cell Sci 113 (Pt 13) (2000) 2455-2462). 세포의 이동성에 vimentin의 인산화가 관여되어 있는 것으로 알려져 있는데, vimentin가 인산화되면 중간 필라멘트(IF)의 결합구조를 조절하여 세포의 이동을 증가시킨다고 알려져 있다(Eriksson, J.E. et al., J Cell Sci 117 (2004) 919-932; Zhu, Q.S. et al., Oncogene 30 (2001) 457-470). 이러한 vimentin은 상피간엽이행(EMT)에 대한 마커로 알려져 있지만, 이러한 과정을 매개하는데 있어서 그 역할은 정확하게 알려져 있지 않다.

Polo-like kinase 1(PLK1)은 최근 발암의 원인 및 전이의 원인이 되는 타겟분자로 연구되고 있으며, 이를 기반으로 PLK1에 대한 억제제 개발을 통한 항암제 개발 연구가 다국적기업을 중심으로 경쟁적으로 진행되고 있다(Yim, Anti-Cancer Drugs 24(2013) 999-1006; Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761 (2014) 31-39). PLK1은 구조적으로 인산화효소 활성을 지닌 효소활성 도메인과 기질과 결합하는 폴로박스 도메인을 지니고 있으며, T210위치에서의 인산화가 PLK1의 활성화를 유발시킨다. 기질의 폴로박스 도메인 결합에 의해 활성화된 PLK1의 인산화 효소는 기질의 Ser/Thr 잔기에 인산화를 유도하는 효소이다(Barr et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5 (2004) 429-440). 기능적으로는 성장 및 분열하는 세포에서 발현이 증가되는데 특히 세포주기 중 세포분열기에서의 발현과 활성이 정점을 이루고 있다. 따라서 빠르게 성장하는 암세포에서 또한 그 발현율이 높은 것으로 알려져 있으며(Yim, Anti-Cancer Drugs 24(2013) 999-1006; Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761 (2014) 31-39), 암세포의 단계별 악성화 과정에서 많은 경우 그 발현이 증가되는 것이 실험적으로 보고되었다. 특히 비소세포 폐암, 두부경부암, 후두암, 유방암, 간암, 자궁내막암, 대장암, 난소암, 췌장암, 전립선암 등에서 악성 단계가 높을수록 그 발현이 증가되어 있음이 보고되었다(Yim, Anti-Cancer Drugs 24(2013) 999-1006; Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761 (2014) 31-39). 최근 연구보고와 본 발명자들의 연구에 의하면 활성형의 PLK1이 암의 전이성을 증가시키는 데 관여하고 있음이 관찰되었고 이에 전이성 암을 치료하기 위한 분자 타겟으로써 PLK1에 대한 가치가 최근 부각되기 시작하였다(Cai et al., Am J Transl Res 8 (2016) 4172-4183; Wu et al., eLife 5 (2016) e10734; 개인 연구결과). 따라서 PLK1의 인산화기질의 기능 조절을 타겟으로 하는 항암제의 경우 원발성 암뿐만 아니라 전이성 암의 치료에도 효과가 뛰어날 것으로 기대하고 있다.

암전이는 암의 진행의 결과로 나타나는 현상이나, 실질적으로 원발소 암을 제거 또는 치료한다고 하더라도, 전이를 막을 수 없다면 암의 재발 등에 의해서 생존률이 매우 낮아진다. 전이암은 전체 암환자 사망의 90%를 차지하고 있어 그 위험도를 가늠할 수 있다 (Valastyan, S. and Weinberg, R.A., Cell 147 (2011) 275-292; Khan, I. and Steeg, P.S., Lab Invest 98 (2018) 198-210). 암의 크기가 커질수록 주변 림프절 및 다른 조직으로 전이하는 비율이 높은 것으로 여겨지나, 암의 크기가 작음에도 불구하고 전이가 되는 경우가 있어, 아직까지 암의 전이와 증식의 관계는 여전히 명확하게 규명되어 있지 않다 (Valastyan, S. and Weinberg, R.A., Cell 147 (2011) 275-292; Shibue, T. and Weinberg, Semin Cancer Biol 21 (2011) 99-106). 암의 치료에 있어, 암 세포의 증식 억제와 전이의 억제가 항상 같이 나타나는 효과가 아니고, 암의 전이를 억제할 수 있다면 많은 암의 치료 효율을 비약적으로 개선할 수 있다는 측면에서, 전이성 암의 치료를 위한 암의 전이 및 침윤을 효과적으로 억제하는 치료 타겟 또는 치료제의 개발이 필요하다.

비특허문헌 1: Valastyan, S. and Weinberg, R.A., Cell 147 (2011) 275-292; Khan, I. and Steeg, P.S., Lab Invest 98 (2018) 198-210

본 발명은 점 돌연변이된 vimentin 단백질을 포함하는 물질의 암세포 사멸효과 및 전이성 암세포의 이동성과 침습성 억제제 용도에 관한 것이다. 또한 일반 고형암뿐만 아니라, 전이성 암세포에서 민감하게 세포 사멸을 유도하는 작용을 이용한 세포 사멸 유도제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 각종 고형암, 전이성 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이에, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 327 또는 339 번째 아미노산이 치환된 비멘틴 돌연변이체와 이를 발현하는 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 돌연변이체 또는 벡터를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하하거나 이로 이루어진 비멘틴(Vimentin) 비인산화 점 돌연변이체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 비멘틴 비인산화 점 돌연변이체는 비멘틴 단백질에서 327번째 아미노산인 트레오닌(Threonine)이 글리신(Glycine, Gly), 알라닌(Alanine, Ala), 발린(Valine, Val), 루신(Leucine, Leu), 아이소루신(Isoleucine, Ile), 프롤린(Proline, Pro), 페닐알라닌(Phenylalanine, Phe), 메티오닌(Methionine, Met) 또는 트립토판(Tryptophan, Trp)으로 치환된 것(서열번호 1)일 수 있으며, 바람직하게는 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 비멘틴 비인산화 점 돌연변이체는 비멘틴 단백질에서 339번째 아미노산인 세린(Serine)이 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 아이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환된 것(서열번호 2)일 수 있으며, 바람직하게는 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 비멘틴 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 비멘틴 돌연변이체를 암호화하는 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 재조합 벡터는 바이러스 벡터(viral vector)일 수 있으며, 바람직하게는 렌티 바이러스 벡터일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 비멘틴 돌연변이체 또는 재조합 벡터를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 비멘틴 돌연변이체 또는 재조합 벡터를 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 암세포의 이동성 및 침습성을 감소시켜 암의 전이(Metastasis)를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 암은 고형암일 수 있고, 상기 고형암은 비소세포폐암일 수 있으며, 상기 비소세포폐암은 특히 선암일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 비멘틴 돌연변이체 또는 재조합 벡터를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 개체는 암의 예방 또는 치료가 필요한 인간일 수 있으며, 이미 암이 발생되어 치료 중에 있는 환자, 또는 암의 완치 후 전이를 예방하기 위한 환자일 수 있다.

또한, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 비멘틴 돌연변이체 또는 재조합 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명의 비멘틴 돌연변이체는 PLK1와의 결합력은 유지하고 있는 바 암세포에서 야생형 비멘틴과 경쟁적으로 과발현된 PLK1과 결합하여 종양의 형성 및 암의 전이를 억제할 수 있으며, 암세포 내에서 상기 돌연변이체를 발현하는 벡터의 제공은 암의 이동성 및 침습성을 억제하고 종양의 형성을 저해할 수 있다. 본 발명의 비인산화 점 돌연변이체는 정상세포에서 비멘틴의 고유 기능에는 영향을 주지 않아 안전한 바, 세포의 비정상적인 성장에 의한 각종 질환, 특히 원발성 및 전이성 고형암과 백혈병 등의 같은 퇴행성 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 TGF-β에 의한 간엽이행과정에서 vimentin의 인산화를 관찰한 결과이다.
A: A549 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 후 탈인산화 효소 phosphatase (CIP) 처리에 의해서 vimentin과 PLK1의 인산화의 감소를 관찰한 결과이다.
B: H460 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 후 탈인산화 효소 phosphatase (CIP) 처리에 의해서 vimentin과 PLK1의 인산화의 감소를 관찰한 결과이다.
도 2은 PLK1과 vimentin의 상호작용과 PLK1 활성형에 의한 vimentin의 인산화 및 인산화 부위를 분석한 결과이다.
A : A549 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 조건에서 PLK1 항체를 이용하여 면역침강법을 진행하여 vimentin과 PLK1이 상호작용함을 관찰한 결과이다.
B : H460 세포에 2.5 ng/ml TGF-β를 처리한 조건에서 PLK1 항체를 이용하여 면역침강법을 진행하여 vimentin과 PLK1이 상호작용함을 관찰한 결과이다.
C: GST가 표지된 vimentin을 이용하여 활성형 PLK1(PLK1 TD)와 함께 인산화 효소 반응법을 수행하여 활성형 PLK1이 vimentin을 인산화 시킴을 관찰한 결과이다.
D: 액체크로마토그래피 질양분석법을 통해서 PLK1에 의한 인산화된 vimentin 인산화 가능 후보 부위를 확인한 결과이다.
E: 부분 특이적 돌연변이 치환법을 이용하여 vimentin의 인산화 후보 부위를 알라닌으로 치환한 비인산화 점 돌연변이체 단백질과 활성형 PLK1을 이용하여 인산화 효소 반응법을 수행한 결과이다.
도 3(3a 및 3b)는 폐암세포 H460에서 vimentim의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체의 과발현이 암세포의 이동성과 침습성에 미치는 영향을 측정한 실험이다.
A : 폐암세포 H460에 vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 후 vimentin 단백질 과발현 유무와 중간엽이행 마커(N-cadherin) 변화를 면역블롯으로 관찰한 결과이다.
B : 폐암세포 H460에 vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 후 vimentin mRNA 과발현 유무와 중간엽이행 마커(N-cadherin) mRNA 변화를 연쇄반응(Real-time PCR)을 통해 관찰한 결과이다.
C : 폐암세포 H460에 vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 후 각각의 점 돌연변이체를 발현하는 세포의 세포증식 정도를 시간별로 관찰한 결과이다.
D : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포 H460에서 인서트(inset)를 이용한 이동성 실험(migration assay)을 통해서 세포의 이동성 양상을 현미경으로 관찰한 결과이다.
E : 인서트(inset)를 이용한 이동성 실험(migration assay)에서 인서트를 이동한 crystal violet 염색된 암세포의 정도(intensity)를 Odyssey infrared imaging system 분석장치를 이용하여 암세포 이동성 양상을 보여주는 그래프이다.
F : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포 H460에서 matrigel과 인서트(inset)를 이용한 침습성 실험(invasion assay)을 통해서 세포의 침습성 양상을 관찰한 결과이다.
도 4(4a 및 4b)는 Xenograft 동물모델에서 vimentim의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현하는 암세포의 전이성과 종양 형성능을 측정한 실험이다.
A : Vimentin 인산화 점 돌연변이체를 발현하는 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스의 폐로의 전이성 암 생성 효과 및 vimentin 비인산화 점 돌연변이체 발현에 의한 전이 억제효과를 관찰한 결과이다.
B : Vimentin 인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서의 전이성 암 발생효과 및 vimentin 비인산화 점 돌연변이체 발현 페암 모델에서의 전이성 암 발생 억제효과를 각 실험군의 전이성 암 생성 빈도를 수치로 나타낸 그래프이다.
C : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 각 실험군의 생존율을 그래프로 보여준 결과이다.
D : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스의 폐에 전이되어 생성한 암조직을 H&E 염색과 Ki-67 염색하여 각 실험군의 암생성 및 억제효과를 관찰한 결과이다.
E : 마우스의 폐에 전이되어 생성한 암조직을 H&E 염색하여 각 실험군의 암생성 및 억제효과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
F : 마우스의 폐에 전이되어 생성한 암조직을 Ki-67 염색하여 각 실험군의 암생성 및 억제효과를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
G : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서 얻은 폐조직을 분쇄하여 상피간엽이행 단백질 마커 N-cadherin와 면연회피 인자 PD-L1 단백질의 변화를 관찰한 결과이다.
H : Vimentin 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체를 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서 얻은 폐조직을 분쇄하여 면연회피 인자 단백질인 PD-L1의 발현의 변화를 각 실험군별로 수치화하여 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 PLK1(Polo-like kinase 1)에 관하여 연구하던 중 PLK1에 의한 비멘틴(vimentin)의 인산화가 암의 전이에 기여함을 확인하고, PLK1에 의한 비멘틴의 인산화 영역을 탐색하여 이에 돌연변이를 유도한 결과 암의 이동성과 침습성이 현저하게 감소함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

PLK1은 proto-oncogene으로서 암 세포에서 과발현이 알려져 있으며, 암의 치료를 위한 타겟으로서 PLK1 분자에 관한 연구는 활발하게 진행되고 있다. 그러나, PLK1은 세포 주기(cell cycle) 등 다양한 신호전달계에 관여하는 인산화효소로서 PLK1의 억제는 종양의 성장 등을 억제하는 효과 이외에 다른 작용의 가능성을 배제하기 어려우며, 정상세포에서의 작용에 PLK1의 원래 기능을 수행이 원활하지 못하다는 문제가 있다.

PLK1은 비멘틴의 83번, 459번 위치의 serin(S) 부위에 인산화가 보고되어 있으나(Eriksson, J.E. et al., Cancer Res 67 (2007) 11106-11110; Keisuke Ikawa et al., Cell cycle 13 (2014) 126-137), 이러한 부위의 점 돌연변이체들이 암세포의 전이성이나 침습성, 종양형성을 차단하는 지에 대한 연구내용은 보고되지 않았다.

본 발명자들은 PLK1이 암의 증식과 전이에 관여하는 기작에서 하위 분자를 표적으로 하고자 하였으며, 구체적으로, PLK1과 비멘틴간의 상호작용을 확인하기 위하여 TGF-β로 전이성 폐암을 유도한 후 면역침강법을 수행하여 PLK1과 비멘틴의 증가된 결합을 관찰할 수 있었다(실시예 1).

한편, 비멘틴은 세포 골격 네트워크를 형성하여 세포 항상성을 유지하는 역할을수행하는 필라멘트 단백질로서, 본 발명자들은 정상세포에서 비멘틴의 본래 기능은 유지하되 암의 전이 단계에서 작용만을 차단할 수 있는 방법을 강구하고자 하였다. 본 발명자들은 비소세포폐암, 특히 전이단계가 높을수록 PLK1과 비멘틴이 과발현되고, PLK1이 비멘틴과 결합하여 비멘틴의 인산화를 유도함을 확인하였다. 즉, 암의 전이에 PLK1에 의한 비멘틴의 인산화가 필요조건으로 가정한다면 PLK1에 의한 비멘틴의 인산화만을 방지한다면 암의 전이를 억제할 수 있으므로, 본 발명자들은 PLK1에 의한 비멘틴의 인산화 영역을 탐색하여 인산화 후보 영역으로서 Thr-327, Thr-336, 및 Ser-339을 선정하였다. 이어서, 상기 위치에 아미노산을 치환한 돌연변이체를 제작하고 인산화효소 반응법을 진행하여 최종 Thr-327 및 Ser-339을 PLK1에 의한 인산화 영역으로 특정하였다(실시예 1).

이어서, 본 발명자들은 327 또는 339 위치에 세린 또는 트레오닌을 알라닌으로 치환한 돌연변이체와 상기 위치 이외에 PLK1에 의한 인산화 영역으로 보고된 83번 또는 459번 위치에 세린을 알라닌으로 치환한 돌연변이체를 발현하는 렌티바이러스를 제작하고 상기 렌티바이러스를 이용하여 암세포를 형질전환(transformation)하여 암세포의 이동성, 침습성, 및 종양형성능을 확인하였다. 그 결과, 327 또는 339 번째 아미노산이 알라닌으로 치환된 돌연변이가 형질감염된 암세포에서 특히 낮은 이동성, 침습성, 및 종양형성능을 확인할 수 있었는바, PLK1에 의한 인산화 차단을 위한 타겟으로서 비멘틴의 327 번째 및 339 번째 아미노산이 효과적임을 알 수 있었다(실시예 4 내지 7).

보다 구체적으로, 본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 각 단백질이 발현되는 H460 세포에서 암세포의 전이성을 관찰하기 위하여 암세포 이동성 실험(migration assay)을 진행하였다(도 3D-E). 연구결과 vimentin의 인산화 점 돌연변이체(S339E, T327E, S83E)가 발현되는 실험군에서는 양성대조군인 TGF-β(2.5ng/ml)처리에 의한 경우보다도 더 많이 암세포의 이동성이 증가되는 것을 관찰하였다. 이와 상반되게 비인산화 점 돌연변이체(S339A, T327A, S83A) 단백질을 발현하는 암세포의 이동성은 감소되었다(실시예 4).

또한, 본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 Vimentin의 인산화 점 돌연변이체와 비인산화 점 돌연변이체을 이용하여 암세포에서의 침습성 촉진 및 억제 효과에 대한 실험을 진행하였다. Matrigel을 이용한 침습성 분석(invasion assay)를 이용하여 암세포의 침습성을 관찰하고자 하였다(도 3F). 먼저, 침습능을 평가하기 위하여 matrigel insert에 각각의 vimentin의 점 돌연변이체를 발현하는 세포를 혈청이 없는 배지와 함께 분주하고 실험플레이트에 혈청이 포함된 배지를 분주하여 5일 동안 배양한다. 침습된 암세포를 crystal violet으로 염색하여 관찰하고 DMSO로 녹인 후 590nm의 파장에서 흡광도를 측정한다. 연구결과, vimentin의 인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현하는 폐암세포군에서 대조군과 vimentin의 원형 대비 침습성이 증가됨을 관찰하였다. 특히 vimentin의 S339 인산화 점 돌연변이체에서 가장 높은 암세포의 침습성을 관찰할 수 있었다. 반면에 vimentin의 비인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현하는 폐암세포군에서는 침습성이 감소됨을 관찰하였다. 따라서 폐암세포에서 vimentin의 인산화 점 돌연변이체에 의한 암세포에서의 침습성 촉진 효과 및 vimentin의 비인산화 점 돌연변이체에 의한 암세포의 침습성 억제 효과를 관찰할 수 있었다(실시예 5).

또한, 본 발명은 구체적인 실험을 통해 동물모델에서 PLK1에 의한 vimentin의 인산화와 비인산화 점 돌연변이체를 발현하는 단백질이 암전이와 종양형성에 관여하는 알아보고자 BALB/c nude 마우스에 각각의 vimentin 돌연변이체 단백질을 과발현하고 있는 H460 세포를 꼬리 정맥 주사하여 8주 동안 사육하고 개복하여 장기에 암세포가 전이와 종양형성을 관찰하였다(도 4). Vimentin의 인산화 점 돌연변이체를 발현하는 세포를 주입한 동물군의 폐에서 대조군, 원형, 그리고 비인산화 점 돌연변이체를 발현하는 세포에 비해 암전이 및 종양형성이 많이 관찰되었다. 반면, vimentin의 비인산화 점 돌연변이체를 발현하는 세포를 주입한 동물군의 폐에서는 종양형성 능력이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 vimentin의 PLK1에 의한 신규 인산화부위에서의 인산화 점 돌연변이체 단백질에 의한 암세포의 종양형성을 촉진하는 효과를 관찰할 수 있었으며, vimentin의 비인산화 점 돌연변이체 단백질에 의한 암세포의 종양형성능 억제 효과를 관찰하였다(실시예 6).

따라서, 본 발명은 PLK1에 의한 비멘틴의 인산화 차단 영역으로서 비멘틴의 327 번째 및 339 번째 아미노산을 타겟으로 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 S339 및/또는 T327 아미노산이 치환된 비멘틴 돌연변이체를 암의 예방 및 치료 용도에 제공할 수 있다.

한편, PLK1은 구조적으로 인산화효소 활성을 지닌 효소활성 도메인과 기질과 결합하는 폴로박스 도메인을 포함하고 있는바, 327 또는 339 위치에 아미노산이 치환된 비멘틴 돌연변이체는 PLK1과 결합력은 그대로 유지한다. 따라서, 상기 인산화 영역 아미노산(327번 또는 339번 아미노산)이 치환된 돌연변이체는 야생형 비멘틴과 경쟁적으로 PLK1과 결합하게 되고, 따라서 돌연변이체 농도 의존적으로 야생형 비멘틴의 인산화가 감소할 수 있다.

본 발명의 비멘틴 돌연변이체는 야생형 비멘틴 단백질에 S339 및/또는 T327이글리신, 알라닌, 발린, 루신, 아이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환된 것일 수 있으며, 구체적인 실험으로는 알라닌으로 치환한 돌연변이체를 이용하여 그 효과를 확인하였다.

본 발명의 비멘틴 돌연변이체는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비-바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 운반 메카니즘은 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비-바이러스성 운반 메카니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포좀, 면역리포좀, 리포펙틴, 양이온성 표면 양친매물질 및 이의 조합물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 비멘틴 shRNA 및 돌연변이체 전달을 위한 바이러스 벡터(viral vector)로서 이용한 렌티바이러스는 레트로바이러스의 일종으로 핵공(nucleopore)이나 완전한 핵막으로의 능동 도입을 가능하게 하는 사전-통합 복합체(바이러스"쉘(shell)")의 친핵성으로 인해 분열 세포뿐만 아니라 미분열 세포도 감염시킬 수 있는 특징이 있다.

이에, 본 발명은 상기 비멘틴 돌연변이를 암호화한 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 바이러스 벡터로 제공되어 유전자 치료 기반의 항암제로 이용될 수 있다.

본 발명에서 돌연변이체는 비멘틴 단백질을 구성하는 하나 이상의 아미노산이 치환(substitution)된 것을 의미하고, 다른 말이 없다면, 본 명세서에서 암 세포의 이동성 및 침습성과 종양형성을 감소시켜 항암 효과를 갖는 돌연변이체는 비멘틴의 T327 및/또는 S339 아미노산이 치환된 것을 의미하고, '점 돌연변이체' 용어와 혼용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '항암'은 암세포의 증식을 억제하거나 사멸하는 작용 및 암세포의 전이를 억제하거나 차단하는 작용을 의미하는 것으로, 암의 예방 및 치료 모두를 의미하고 이와 혼용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 '예방'은 조성물의 투여로 암 형성을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, '치료'란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.

본 발명의 항암제는 상술한 비멘틴 돌연변이체 이외에 비멘틴의 인산화를 억제하거나 이의 발현을 감소시키는 것으로 알려진 여타의 물질, 예를 들어 화합물, 천연물, 신규 단백질 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 비멘틴 돌연변이체 및 이를 발현하는 벡터를 포함하는 항암제는 특히, vimentin의 발현이 과다한 다양한 대장암, 전립선암, 유방암 및 위암 등의 각종 고형암 및 백혈병 등의 예방 및 치료에 이용될 수 있으며, 또한 일차암에서 전이되어 유발된 전이성 고형암의 예방 및 치료에도 이용될 수 있다.

본 발명의 비멘틴 돌연변이체 및 이를 발현하는 벡터를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제 또는 향미제 등을 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제 및 기타 액제로 제제화될 있다. 구체적으로, 본 발명의 세포사멸 활성화제는 경구 투여를 위해서, 예를 들면 알약(troches), 정제(lozenge), 수용성 또는 유성 현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 (elixirs)로 제제화될 수 있다. 이때, 정제 및 캡슐로 제제화하기 위해서는 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 첨가할 수 있다. 또한, 캡슐제로 제제화할 경우, 상기에서 언급된 물질 이외에도 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나의 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있으며, 표적 세포에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 세포에 특이적인 항체 또는 기타 리간드를 상기의 담체와 함께 결합시켜 사용할 수 있다. 덧붙여, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구로 투여할 경우, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용으로 제제화하기 위해서는 상기 세포사멸 촉진 항암제를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.

투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 선택하는 것이 바람직하며, 본 발명의 암세포사멸 촉진 항암제는 성인의 체중 1㎏ 당 1 내지 100 ㎎, 바람직하게는 1 내지 10 ㎎의 투여양으로 매일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> TGF-β에 의해 유도한 전이성 폐암세포에서 활성형 PLK1에 의한 vimentin의 인산화 및 신규 인산화 부위 확인

TGF-β처리하여 암전이를 유도한 폐암세포주 A549와 H460에서 vimentin과 PLK1이 인산화 감소를 관찰하기 위해서 탈인산화효소(phosphatase) 처리 후 면역블롯법을 통하여 인산화된 vimentin과 PLK1이 탈인산화효소에 의해 인산화된 양이 감소한 것을 관찰하였다(도 1A-B). 상기 결과로부터 TGF-β처리로 유도된 상피간엽이행 동안 vimentin과 PLK1이 인산화됨을 알 수 있다.

TGF-β처리에 의해서 유도된 상피간엽이행 조건에서 PLK1과 vimentin의 상호작용을 탐구하기 위하여 면역침강법을 수행하였다. Agarose beads와 PLK1 항체로 PLK1 단백질을 침강하였으며 면역블롯법을 통해서 분석하였다. Vimentin은 대조군에서도 PLK1과 결합하였고, TGF-β에 의해 암전이를 유도한 실험군에서는 PLK1과 vimentin의 결합이 증가되었다(도 2A-B). 상기 결과는 전이 과정에 암세포에서 PLK1과 vimentin의 상호작용이 보다 활발함을 시사한다.

다음으로 두 단백질의 상호작용 방법을 분석하기 위하여 인산화효소 반응법을 수행하였다. 세린/트레오닌 인산화효소인 PLK1이 vimentin을 기질로서 인산화 시키는지 증명하는 방법으로 정제된 vimentin 원형(wild)과 활성형 PLK1-T210D을 방사선이 표지된 η-³²P-ATP을 함께 처리하여 반응시키고 분석하였다. Vimentin은 양성대조군인 TCTP과 유사한 수준으로 강하게 활성형 PLK1-TD에 의해 인산화되었다(도 2C).

PLK1에 의한 vimentin의 인산화 부위를 찾기 위하여 액체크로마토그래피 질량분석법을 진행하였다. 본 분석법으로 vimentin의 Thr-327, Thr-336, Ser-339가 PLK1에 의해 인산화되는 부분으로 예측되었다(도 2D). 예측된 vimentin의 인산화 부분 3곳과 PLK1에 의한 vimentin을 인산화 시킨다고 보고된 2곳을 부분 특이적 돌연변이 치환법을 이용하여 알라닌으로 치환된 비인산화 돌연변이체로 제작하였다.

상기 제작된 돌연변이체를 GST가 표지된 단백질로 생산하였고 정제하여 인산화효소 반응법을 진행하였다. Vimentin의 인산화 예측 부위 3가지 중에서 Thr-327과 Ser-339의 알라닌 돌연변이가 원형과 비교했을 때 인산화 정도가 두드러지게 감소하였다(도 2E). 이러한 연구 결과는 PLK1이 vimentin Thr-327과 Ser-339의 인산화반응을 통하여 상호작용한다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 2> Vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이형 발현을 위한 렌티바이러스 시스템 구축

본 발명자들은 vimentin의 인산화 및 비인산화 유전자 발현을 위한 lentivirus system 구축을 위하여 pLVX-TRE3G-eRFP 에, Mlu1과 Apa1으로 cutting후, vimentin 원형(WT) 플라스미드를 5' -ACGGGGCCCATGTCCACCAGGTCCGTGTC-3'(forward primer)와 5' -ACGACGCGTTTATTCAAGGTCATCGTGA-3'(reverse primer)의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시킨 후 이를 Mlu1과 Apa1으로 cutting후, 벡터 pLVX-TRE3G-eRFP에 서브클로닝하였다. 렌티 바이러스 시스템을 구축하기 위해서 pCMV-VSV.G와 pCMV-ΔpLVX-TRE3G-eRFP-Target 또는 pLVX-Tet3G DNA를 HEK293 cells에서 발현시키고자 transfection 하여 렌티 바이러스를 발현시켜 바이러스를 모은 후 이를 암세포에 사용하고자 하였다. Transfection 후 바이러스 배양액은 12시간 간격으로 72시간까지 모았으며, 0.2 μm 필터로 배양액을 필터하고 17000 rpm, 4℃90분 동안 원심분리하였다. 상등액은 버리고 TNE Buffer로 모아진 바이러스를 모은 후 4℃에 보관하여 다음날부터 암세포 감염에 사용하였다.

<실시예 3> 렌티바이러스를 이용한 vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 유전자 발현 세포 선별 후 상피간엽이행 효과 평가

점 돌연변이를 포함하는 vimentin 단백질의 암세포 상피간엽이행 조절효과를 검토하기 위하여, 폐암세포에 vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체가 발현시키는 렌티바이러스를 감염시키고자 다음과 같이 암세포를 배양하였다.

폐암 세포인 H460에 vimentin의 원형 및 인산화와 비인산화 점 돌연변이체를 발현시키는 안정화된 세포주를 구축하기 위해서 먼저 pLVX-Tet3G 발현성 렌티바이러스를 감염시키고 G418을 5일 동안 처리하여 감염된 세포를 선별하였다. 이렇게 선별된 H460Tet3G 세포에 vimentin의 원형 및 인산화 점 돌연변이체(S339E, T327E, S83E, S459E)와 비인산화 점 돌연변이체(S339A, T327A, S83A, S459A)을 발현시키는 렌티바이러스를 감염시킨 후 puromycin을 48시간동안 처리하여 안정화된 세포주를 구축하였다. 구축된 세포에 1ug/ml doxycycline 처리하여 vimentin의 원형 및 인산화와 비인산화 점 돌연변이체의 발현을 유도 후 각각의 vimentin의 점 돌연변이체가 잘 발현되었는지 mRNA 발현량과 단백질 발현량을 확인하였다. 도 3A-B에서와 같이, vimentin의 원형 및 각각의 점 돌연변이형이 잘 발현되고 있는 것을 mRNA 발현량과 단백질 발현량을 통해서 확인하였다. 인산화 부위 S459를 제외하고, 인산화 점 돌연변이체의 vimentin이 발현되는 폐암세포에서 비인산화 점 돌연변이체 vimentin를 발현하고 있는 세포에서 보다 N-cadherin의 발현이 높은 것을 관찰하였다. 또한 이러한 vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 발현이 세포의 증식에 영향을 주는지 확인해 본 결과, 세포의 증식에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다(도 3C).

이상의 결과로, 폐암세포에서 vimentin의 인산화가 상피간엽이행을 촉진하는 효과를 시사하며 비인산화 점 돌연변이체에 의해 억제됨을 시사하였다.

<실시예 4> vimentin의 인산화 및 비인산화 점 돌연변이를 포함하는 단백질에 의한 전이성 촉진 및 억제 효과 평가

Vimentin 원형, 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시키는 폐암세포 H460에서 이들 점 돌연변이체가 암세포의 이동성에 미치는 효과를 관찰하기 위해 세포 이동성 실험(migration assay)을 실시하였다.

구체적으로, 각각의 viemtnin 원형, 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시키는 폐암세포 H460을 5 x 10⁴ 개의 세포를 8.0 μm, 24 well insert에 분주하고 24 well plate에 10% 혈청(FBS)이 포함된 배지를 분주한 뒤 inset를 넣어 주었다. 양성 대조군의 경우, 2.5 ng/ml TGF-β가 포함된 RPMI 1640(10% FBS)를 0.5 ml 분주하여 사용하였다. 세포분주 72시간 후, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ㎕를 분주하고 1XPBS로 3회 세척하여 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도(intensity)를 Odyssey infrared imaging system을 이용하여 측정하였다. 대조군의 염색된 정도(intensity)를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 염색된 정도를 산출하여 그래프를 표시하였다.

연구 결과, vimentin 인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시킨 실험군에서 양성대조군인 TGF-β처리군과 유사하거나 더 높게 염색강도(intensity) 수치가 대조군 대비 5배까지 증가하였으며, 상대적으로 vimentin 인산화 돌연변이체에 비해 비인산화 점 돌연변이체 실험군은 염색강도가 낮은 것을 관찰할 수 있었다(도 3D-E). 하지만 vimentin의 S459번 인산화 돌연변이체는 암세포 이동성에 영향을 주지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 vimentin 인산화 점 돌연변이체는 폐암세포의 이동성을 촉진하며, 반면에 vimentin 비인산화 점 돌연변이체는 폐암세포의 이동성을 억제하는 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

<실시예 5> vimentin의 인산화부위 및 비인산화 점 돌연변이를 포함하는 단백질에 의한 침습성 촉진 및 억제 효과 평가

Vimentin 원형, 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시키는 폐암세포 H460에서 이들 점 돌연변이체가 암세포의 침습성에 미치는 효과를 관찰하기 위해 matrigel을 이용한 침습성 실험(invasion assay)을 실시하였다.

구체적으로, 4℃에서 16~20시간동안 matrigel을 완전히 녹인 후 matrigel을 1 mg/ml이 되도록 차가운 serum free RPMI 1640(4℃으로 희석하였다. 이를 8.0 μm 24 well 인서트(insert)에 100 μl 의 matrigel mixture(1 mg/ml)를 넣고 37℃배양기에서 12-20시간 동안 굳혀주었다. 굳은 matrigel insert에 각각의 vimentin 원형, 인산화 및 비인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시키는 폐암세포 H460들을 1X10 cells/well의 세포수로 serum free RPMI 1640 (36℃에 희석하여 insert에 분주하였다. 여기에 36℃의 따뜻한 RPMI 1640 (10% FBS)을 0.5 ml/well씩 분주하였다. 양성 대조군의 경우 2.5 ng/ml TGF-β가 포함된 36℃RPMI 1640(10% FBS)를 0.5 ml 분주하여 사용하였다. 이 후 3일에 한 번씩 배지를 교환해주고 침습되는 정도를 관찰하였으며, 암세포의 침습이 충분히 일어난 것으로 관찰된 5일 차에 배지를 제거하고 1XPBS로 세척한 후, insert 안쪽의 cell들을 면봉으로 긁어 내었고, 1XPBS로 세척하여 insert 내부에 cell과 matrigel의 잔여물이 남지 않도록 제거하였다. Insert 바깥 면이 있는 24 well에 4% paraformaldehyde 500ul를 분주하고 5분간 실온에서 incubation한 후 1XPBS로 3회 세척하여, 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 DMSO로 녹인 후 590nm에서 파장을 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.

연구 결과, vimentin 인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시킨 실험군에서 양성대조군인 TGF-β 처리군과 유사하거나 더 높게 흡광도 수치가 대조군 대비 4배에서 6배까지 증가하였으며 상대적으로 vimentin 비인산화 점 돌연변이체 실험군은 상대적 흡광도가 더 낮아진 것을 관찰할 수 있었다(도 3F). 따라서 vimentin 비인산화 점 돌연변이체는 폐암세포의 이동성과 침습성을 억제하는 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

<실시예 6> 동물모델에서 vimentin의 인산화부위 및 비인산화 점 돌연변이를 포함하는 단백질에 의한 암세포의 전이성 및 종양형성능 평가

본 발명자들은 동물모델에서 암세포의 종양 형성능을 관찰하기 위해 vimentin의 인산화 및 비인산화 점 유전자가 발현되는 암세포를 이용하여 암세포의 종양형성 촉진 및 억제 효과를 평가하고자 하였다.

구체적으로, 점 돌연변이를 포함하는 vimentin 단백질이 안정적으로 발현되는 H460 폐암세포(2X10⁶ 세포수)를 PBS에 넣어 마우스의 꼬리 정맥에 주사하여, 8주 동안 사육하고, 개복하여 장기에 암세포가 전이 및 종양형성능을 관찰하였다. 비교를 위해 대조군(Mock; 목적유전자가 발현되지 않는 렌티바이러스 처리군), vimentin 단백질 발현되는 H460 폐암세포주 투여군(WT), 인산화 점 돌연변이체 vimentin 단백질 발현되는 H460 폐암세포주 투여군(S339E, T327E, S83E), 비인산화 점 돌연변이체 vimentin 단백질 발현되는 H460 폐암세포주 투여군(S339A, T327A, S83A)에 대해서 암세포 전이 및 종양형성 여부를 관찰하였다. 각 실험군 마다 5마리의 마우스에 대하여 실험을 실시하고, 폐에서의 전이성 암인 종양형성 빈도수를 측정하여 그래프로 표시하였다(도 4).

도 4에 나타낸 바와 같이, 대부분의 종양은 폐에 생성되었고, 따라서 본 실험도 폐를 중심으로 분석하였다. 대조군(Mock)과 vimentin 원형 대비 인산화 점 돌연변이를 포함하는 vimentin 단백질이 발현되는 H460 세포를 투여한 실험군에서는 종양형성능이 비교적 높은 것을 관찰하였다. 특히 vimentin 인산화 점 돌연변이체 중 S339E 실험군에서는 생성된 종양의 수나 크기를 관찰했을 때 가장 높은 종양형성능을 확인할 수 있었다. 반대로 비인산화 점 돌연변이를 포함하는 vimentin 단백질이 발현되는 H460 세포를 투여한 실험군에서는 종양형성능이 비교적 낮은 것을 관찰하였다(도 4A-B). 추가적으로 각 동물실험군들의 생존율을 관찰한 결과, vimentin 비인산화 점 돌연변이체 실험군에 비해서 인산화 돌연변이체 실험군 (S339E, S83E)에서 동물의 생존율이 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 4C). 또한, H&E(Haematoxylin and eosin)과 Ki67 염색을 통해서 vimentin 인산화 점 돌연변이체 실험군에서 암세포 증식정도가 높은 것을 알 수 있었다(도 4D-F). 이는 동물모델에서 vimentin의 인산화 점 돌연변이체를 발현하는 암세포는 암전이성과 종양형성능을 촉진시키며, 반대로 비인산화 점 돌연변이체는 암전이성과 종양형성능을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로 폐의 일부를 용해하여 상피간엽이행 마커의 단백질 수준을 관찰한 결과, vimentin 인산화 점 돌연변이체의 실험군에서 중간엽 마커인 N-cadherin의 단백질 수준이 증가하였으며, E-cadherin의 수준은 감소하였다. 또한 면역회피에 관여하여 암세포의 종양형성능을 증가시킨다고 알려진 PD-L1과 PD-L2의 발현도 각 실험군에서 확인한 결과, vimentin 인산화 점 돌연변이체 실험군에서 특히 PD-L1의 발현이 높게 관찰되었다(도 4G). 종양형성능이 가장 크게 관찰되었던 vimentin 인산화 점 돌연변이체 중 S339E 실험군에서 역시 PD-L1 단백질 발현도 가장 높게 관찰되었다(도 4H). 따라서 vimentin의 인산화가 상피간엽이행과 전이성과 종양형성능을 증진시킴을 시사한다. 반면, 본 발명의 비인산화 점 돌연변이체 특히, S339A 실험군은 원형의 vimentin 발현 실험군보다 낮은 전이성과 암세포의 종양형성능을 억제하는 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a vimentin mutant or a vector expressing the same as an active ingredient <130> DHP20-570 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (327) <223> X is one of Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, and Trp <400> 1 Met Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Arg Met Phe Gly 1 5 10 15 Gly Pro Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr 20 25 30 Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Gly Ser Ala Leu Arg Pro Ser Thr 35 40 45 Ser Arg Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Pro Gly Gly Val Tyr Ala Thr Arg 50 55 60 Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Leu Leu 65 70 75 80 Gln Asp Ser Val Asp Phe Ser Leu Ala Asp Ala Ile Asn Thr Glu Phe 85 90 95 Lys Asn Thr Arg Thr Asn Glu Lys Val Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp 100 105 110 Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn 115 120 125 Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu Glu Gln Leu Lys Gly Gln Gly Lys Ser 130 135 140 Arg Leu Gly Asp Leu Tyr Glu Glu Glu Met Arg Glu Leu Arg Arg Gln 145 150 155 160 Val Asp Gln Leu Thr Asn Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp 165 170 175 Asn Leu Ala Glu Asp Ile Met Arg Leu Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu 180 185 190 Met Leu Gln Arg Glu Glu Ala Glu Asn Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln 195 200 205 Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Val 210 215 220 Glu Ser Leu Gln Glu Glu Ile Ala Phe Leu Lys Lys Leu His Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile 245 250 255 Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val 260 265 270 Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu 275 280 285 Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg 290 295 300 Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg 305 310 315 320 Arg Gln Val Gln Ser Leu Xaa Cys Glu Val Asp Ala Leu 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Pro Ser Thr 35 40 45 Ser Arg Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Pro Gly Gly Val Tyr Ala Thr Arg 50 55 60 Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Leu Leu 65 70 75 80 Gln Asp Ser Val Asp Phe Ser Leu Ala Asp Ala Ile Asn Thr Glu Phe 85 90 95 Lys Asn Thr Arg Thr Asn Glu Lys Val Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp 100 105 110 Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn 115 120 125 Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu Glu Gln Leu Lys Gly Gln Gly Lys Ser 130 135 140 Arg Leu Gly Asp Leu Tyr Glu Glu Glu Met Arg Glu Leu Arg Arg Gln 145 150 155 160 Val Asp Gln Leu Thr Asn Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp 165 170 175 Asn Leu Ala Glu Asp Ile Met Arg Leu Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu 180 185 190 Met Leu Gln Arg Glu Glu Ala Glu Asn Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln 195 200 205 Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Val 210 215 220 Glu Ser Leu Gln Glu Glu Ile Ala Phe Leu Lys Lys Leu His Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile 245 250 255 Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val 260 265 270 Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu 275 280 285 Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg 290 295 300 Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg 305 310 315 320 Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr 325 330 335 Asn Glu Xaa Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala 340 345 350 Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp Glu 355 360 365 Ile Gln Asn Met Lys Glu Glu Met Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln 370 375 380 Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr 385 390 395 400 Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ile Ser Leu Pro Leu Pro 405 410 415 Asn Phe Ser Ser Leu Asn Leu Arg Glu Thr Asn Leu Asp Ser Leu Pro 420 425 430 Leu Val Asp Thr His Ser Lys Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Val Glu 435 440 445 Thr Arg Asp Gly Gln Val Ile Asn Glu Thr Ser Gln His His Asp Asp 450 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acctcacggc tgccctgcgt gacgtacgtc agcaatatga aagtgtggct 840 gccaagaacc tgcaggaggc agaagaatgg tacaaatcca agtttgctga cctctctgag 900 gctgccaacc ggaacaatga cgccctgcgc caggcaaagc aggagtccac tgagtaccgg 960 agacaggtgc agtccctcgc ctgtgaagtg gatgccctta aaggaaccaa tgagtccctg 1020 gaacgccaga tgcgtgaaat ggaagagaac tttgccgttg aagctgctaa ctaccaagac 1080 actattggcc gcctgcagga tgagattcag aatatgaagg aggaaatggc tcgtcacctt 1140 cgtgaatacc aagacctgct caatgttaag atggcccttg acattgagat tgccacctac 1200 aggaagctgc tggaaggcga ggagagcagg atttctctgc ctcttccaaa cttttcctcc 1260 ctgaacctga gggaaactaa tctggattca ctccctctgg ttgataccca ctcaaaaagg 1320 acacttctga ttaagacggt tgaaactaga gatggacagg ttatcaacga aacttctcag 1380 catcacgatg accttgaata a 1401 <210> 4 <211> 1401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgtccacca ggtccgtgtc ctcgtcctcc taccgcagga tgttcggcgg cccgggcacc 60 gcgagccggc cgagctccag ccggagctac gtgactacgt ccacccgcac ctacagcctg 120 ggcagcgcgc tgcgccccag caccagccgc agcctctacg cctcgtcccc gggcggcgtg 180 tatgccacgc 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Claims

서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 비멘틴(Vimentin) 돌연변이 단백질로서,
상기 서열번호 1의 327 번째 아미노산이 알라닌(Alanine)이고,
상기 서열번호 2의 339 번째 아미노산이 알라닌(Alanine)인 것을 특징으로 하는, 비멘틴 돌연변이 단백질.
삭제
삭제
제1항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항에 있어서,
상기 유전자는 서열번호 3 또는 4인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제4항에 있어서,
상기 벡터는 렌티 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제1항의 비멘틴 돌연변이 단백질 또는 제4항의 벡터를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 암은 고형암이고,
상기 고형암은 폐암, 유방암, 신장암, 췌장암, 난소암, 갑상선암, 고환생식세포암, 자궁경부암, 직장암, 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 암세포의 이동성 및 침습성을 감소시켜 암의 전이(Metastasis)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제7항에 있어서,
상기 고형암은 비소세포폐암인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 비소세포폐암은 선암인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.