CN116769011A - 一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物免疫治疗技术领域，尤其是涉及一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体及其制备方法和应用。一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体，包括CDK磷酸化位点突变的视网膜母细胞瘤蛋白1突变体多肽、CDK磷酸化位点突变的视网膜母细胞瘤蛋白1突变体蛋白或CDK磷酸化位点突变的视网膜母细胞瘤蛋白1突变体类似物。提高RB1对E2F家族转录因子的长时效结合，迟滞细胞周期，显著抑制E2F靶基因的表达，并显著抑制癌细胞的增殖和生长。
Description
技术领域
本发明属于生物免疫治疗技术领域，尤其是涉及一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体及其制备方法和应用。
背景技术
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是一种在儿童中最常见的原发性眼内恶性肿瘤，发病率约为1/20000-1/15000。在我国，每年新增RB患者约为1100例，且84％为晚期高风险患者。遗传学研究发现，视网膜母细胞瘤的发生通常是由于RB1基因(RBtranscriptional corepressor 1，RB1)存在纯合突变、复合型杂合突变或基因缺失，发育中的视网膜细胞中RB1蛋白丢失，导致细胞发生不受控制的增殖。视网膜母细胞瘤可累及单眼或双眼，有时也可累及颅内肿瘤，即三侧视网膜母细胞瘤。如果没有得到及时有效的治疗，视网膜母细胞瘤可能会通过视神经扩散到大脑，或通过血液扩散到骨髓，并导致死亡。RB一般在6岁前发病，但有家族史或双眼发病者多在1岁以前发病。
RB1基因是首个被克隆的抑癌基因，编码的RB1蛋白为细胞周期负调控因子，含有N端结构域(DUF3452)、口袋结构域(pocket domain，Rb-A和Rb-B)和C端结构域(Rb-C)。由Rb-A和Rb-B两部分组成的口袋结构域可以与E2F家族转录因子(E2F transcription factors)结合，阻碍E2F调节的细胞周期相关蛋白的表达，阻止细胞通过G1-S检查点，阻滞细胞周期，对抑制多种肿瘤的发生发挥着不可或缺的作用。通过DEEP预测及研究发现，RB1蛋白存在16个周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)磷酸化位点(图1A,1B)，当RB1蛋白被CDKs磷酸化后，E2F离开RB1蛋白复合物，与含有E2F转录因子的靶基因结合，启动细胞周期相关基因的表达，促进细胞分裂和增殖(图1C)。
目前，已发现RB1存在1000多种突变，包括错义突变、无义突变、剪接位点突变、移码突变、微缺失、大片段缺失及启动子超甲基化。这些变异导致RB蛋白功能失活或无功能性蛋白表达，失去对细胞周期的控制，细胞异常增殖。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体及其制备方法和应用。提高RB1对E2F家族转录因子的长时效结合，迟滞细胞周期，显著抑制E2F靶基因的表达，并显著抑制癌细胞的增殖和生长。
为此，本发明第一方面提供了一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体，包括CDK磷酸化位点突变的视网膜母细胞瘤蛋白1突变体多肽、CDK磷酸化位点突变的视网膜母细胞瘤蛋白1突变体蛋白或CDK磷酸化位点突变的视网膜母细胞瘤蛋白1突变体类似物。
在本发明的一些实施方式中，所述CDK磷酸化位点突变包括以下至少一个CDK磷酸化位点的突变：T5、S230、S249、T252、T356、T373、S567、S608、S612、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826。
在本发明的一些实施方式中，所述CDK磷酸化位点突变包括以下CDK磷酸化位点的突变：T5、S230、S249、T252、T356、T373、S608、S612、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826。
根据本发明，视网膜母细胞瘤蛋白突变体为CDK磷酸化位点全突变型视网膜母细胞瘤蛋白1(RBdel15)。
在本发明的一些实施方式中，所述视网膜母细胞瘤蛋白突变体包括如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述视网膜母细胞瘤蛋白突变体包括如SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述视网膜母细胞瘤蛋白突变体包括如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.3所示的核酸序列编码得到的视网膜母细胞瘤蛋白突变体。
在本发明的一些实施方式中，所述视网膜母细胞瘤蛋白突变体包括如SEQ IDNO.3所示的核酸序列编码得到的视网膜母细胞瘤蛋白突变体。
在本发明的一些实施方式中，所述CDK磷酸化位点均突变为丙氨酸。
本发明第二方面提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体。
本发明第三方面提供了一种载体，包括本发明第二方面所述的核酸分子。
在本发明的一些实施方式中，所述载体包括表达载体或克隆载体。
在本发明的另一些实施方式中，所述载体包括病毒载体。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体或单纯疱疹病毒载体及其衍生物。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，包括转导或转染本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体的宿主细胞。
本发明第五方面提供了一种药物组合物，包括本发明第一方面所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体、本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包括细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、生长抑制剂以及待治疗的具体适应症所需的活性药剂中的至少一种添加剂。
本发明第六方面提供了一种本发明第一方面所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体的制备方法，包括培养本发明第四方面所述的宿主细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述制备方法中宿主细胞的培养条件足以使宿主细胞能够表达视网膜母细胞瘤蛋白突变体。
本发明第七方面提供了一种本发明第一方面所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体或本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体或本发明第五方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗癌症或肿瘤药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用包括应用于制备增强或提高视网膜母细胞瘤蛋白突变体与E2F转录因子结合的预防和/或治疗癌症或肿瘤药物。
在本发明的一些实施方式中，所述应用还包括视网膜母细胞瘤蛋白突变体、核酸分子、载体或药物组合物与其它药物联合施用。
在本发明的一些实施方式中，所述其它药物包括诊断剂、预防剂和/或治疗剂。
本发明的有益效果：
本发明通过全基因合成的方式，对RB1蛋白的15个CDK磷酸化位点进行定点突变，形成CDK磷酸化位点全突变型视网膜母细胞瘤蛋白1(RBdel15)，能够显著抑制E2F靶基因的表达，并显著抑制癌细胞的增殖和生长。同时，本发明高表达的RBdel15的细胞显示出高效的细胞周期抑制功能。此外，本发明的RBdel15还可显著抑制表观遗传相关基因的表达，上调免疫相关基因的表达，提高T细胞的肿瘤浸润，从而促进机体的抗肿瘤免疫反应。
附图说明
图1为RB1蛋白结构及作用机制示意图；其中，A-RB1蛋白的磷酸化位点分析，B-15个CDK磷酸化位点，C-野生型RB1和全突变型RBdel15的作用机制；
图2为本发明实施例2中RBdel15高表达Miapaca2细胞株的建立结果图；其中，A-不同细胞株中RBdel15蛋白的表达，B-不同细胞株中RBdel15的间接免疫荧光检测，C-不同细胞株中RBdel15 mRNA的表达；
图3为本发明实施例3中RBdel15调节免疫和细胞周期蛋白表达的结果图；A-RBdel15的表达，B-细胞增殖，C-细胞周期，D-差异表达基因的热图分析，E-差异基因的功能分析，F-部分E2F靶基因表达，G-部分E2F靶基因表达量；
图4为本发明实施例4中RBdel15对表观遗传学的影响结果图；A-表观遗传学相关基因表达，B-表观遗传学相关基因mRNA表达，C-表观遗传学相关基因蛋白表达，D-部分表观及免疫相关基因的时序表达，E-EZH2抑制剂TAZ对基因表达的影响，F-siEZH2对基因表达的影响，G-5-Aza处理对DNMT1蛋白表达的影响，H-5-Aza处理对部分基因mRNA的影响；
图5为RBdel15的抗肿瘤功能；A-肿瘤细胞增殖，B-细胞体积，C-细胞的β-半乳糖苷酶活性，D-肿瘤细胞集落形成；
图6为RBdel15高表达小鼠KPC胰腺癌细胞系的建立；A-不同细胞株中RBdel15的间接免疫荧光检测，B-不同细胞株中RBdel15蛋白的表达，C-治疗时间GFP数量，D-细胞增殖，E-细胞周期分布；
图7为RBdel15对小鼠胰腺癌浸润细胞的影响；A-肿瘤体积，B-肿瘤组织的单细胞测序，C-髓样细胞数量，D-T细胞数量，E-抗肿瘤功能CAF的数量。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
本发明中术语“视网膜母细胞瘤蛋白突变体”涵盖各种形式的视网膜母细胞瘤蛋白1的任何突变体形式，包括全长视网膜母细胞瘤蛋白1、视网膜母细胞瘤蛋白1的截短形式和视网膜母细胞瘤蛋白1与另一分子连接(如通过融合或化学缀合)的形式。在涉及视网膜母细胞瘤蛋白1时使用的“全长”是指成熟的、天然长度的视网膜母细胞瘤蛋白1。例如，全长视网膜母细胞瘤蛋白1由SEQ ID No.1所示核酸序列编码得到，或其包含SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本发明中术语“CDK磷酸化位点突变”是指具有以下至少一个影响视网膜母细胞瘤蛋白1与E2F转录因子相互作用的CDK磷酸化位点的氨基酸突变：T5、S230、S249、T252、T356、T373、S567、S608、S612、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826。“全突变型”指优选T5、S230、S249、T252、T356、T373、S608、S612、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826的影响视网膜母细胞瘤蛋白1与E2F转录因子相互作用的CDK磷酸化位点的氨基酸突变。其中，所述突变可能涉及通常位于该位置的野生型氨基酸残基的取代或替换。优选通过氨基酸取代获得的突变体。除非另外说明，本发明中视网膜母细胞瘤蛋白突变体可以指视网膜母细胞瘤蛋白1突变体多肽、视网膜母细胞瘤蛋白1突变体蛋白或视网膜母细胞瘤蛋白1突变体类似物。
本发明中可使用各种命名来指示同一突变。例如，在位置5将苏氨酸突变为丙氨酸可表示为5A、A5、T5A或Thr5Ala。
本发明可以使用本领域中已知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR或全基因合成等。
本发明中术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指具有两个或更多个氨基酸的任意链，并且不指特定长度的产物。因此，肽、寡肽、蛋白质、氨基酸链或任何其它用于指具有两个或更多个氨基酸的链的术语均包括在“多肽”的定义中。多肽可以自天然的生物学来源衍生或通过重组技术制备。可以以任何方式，包括通过化学合成来制备多肽。
本发明的多肽大小可以是包括3个以上、5个以上、10个以上、20个以上、25个以上、50个以上、75个以上、100个以上、200个以上、500个以上、1000个以上或2000个以上的氨基酸。
“分离的”多肽或其变体或衍生物是指不处于其天然环境的多肽。在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质可以被视为“分离的”，通过任何合适的技术纯化的天然的或重组的多肽也可以被视为“分离的”。
本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明如前所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体。
本发明提供了一种载体，其包括本发明如前所述的分离的核酸分子。载体可以为表达载体或克隆载体。在一些实施方案中，载体为病毒载体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。
本发明提供了一种宿主细胞，其包括转导或转染核酸分子或载体的宿主细胞。用于克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
本发明提供了一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体的制备方法，其包括培养上述的宿主细胞。优选地，所述制备方法中宿主细胞的培养条件足以使宿主细胞能够表达视网膜母细胞瘤蛋白突变体。
需要说明的是，转导或转染核酸分子或载体时将核酸分子或载体引入宿主细胞(例如哺乳动物细胞)的方法是本领域已知的，所述核酸分子或载体可以通过物理、化学或生物方法转入宿主细胞。用于将核酸分子或载体引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等等。用于将核酸分子或载体引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散体系，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的体系(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外递送媒介物的示例性胶体体系是脂质体(例如人工膜囊泡)。用于将核酸分子或载体引入宿主细胞的生物方法包括使用DNA和RNA载体。在一些实施方案中，转导或转染的宿主细胞在引入核酸分子或载体之后离体繁殖。
本发明进一步提供了一种药物组合物，其包括本发明如前所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体、核酸分子或载体。在一些实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
药物组合物可以通过使具有所需纯度的视网膜母细胞瘤蛋白突变体、核酸分子或载体与任选的药学上可接受的载体混合以冻干制剂或水溶液的形式制备。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，其可包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、等渗剂、稳定剂和表面活性剂中的至少一种。此外，为了使药物组合物可用于体内施用，它们必须是无菌的。可以通过无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。
在一些实施方案中，药物组合物还可以含有：细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、生长抑制剂以及待治疗的具体适应症所需的活性药剂中的至少一种添加剂。添加剂的具体添加量可根据实际需要进行调整。
本发明还提供了本发明如前所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体、核酸分子、载体或药物组合物在制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物中的应用。
优选地，所述预防和/或治疗癌症或肿瘤包括以下至少一种情形：
(1)抑制E2F下游靶基因(如CCNA2)的表达；
(2)抑制细胞恶性增殖和生长；
(3)抑制细胞周期，特别是将恶性增殖细胞阻滞于G1期，和/或降低位于S期的细胞数量；
(4)上调免疫相关基因的表达，其中，免疫相关基因优选包括：CCL28、OAS2、HLA-B、HLA-F、IFI6、ICM1、IFIM10和MX2；
(5)抑制表观遗传相关基因的表达，其中，表观遗传相关基因包括表达以下的基因：DNA甲基转移酶1(DNMT1)、Zeste基因增强子同源物2(EZH2)、组蛋白赖氨酸甲基转移酶SUV39H1/2(SUV39H1/2)、染色质组装因子1A(CHAF1A)、染色质组装因子1B(CHAF1B)和DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)等；
(6)诱导肿瘤细胞分化；
(7)增强或提高视网膜母细胞瘤蛋白1与E2F转录因子的结合。
本发明中，所述癌症或肿瘤包括但不限于：胰腺癌、髓性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、乳腺癌、宫颈癌、透明细胞肾细胞癌、皮肤纤维肉瘤、胃肉瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤、平滑肌肉瘤、侵袭性导管乳腺癌、恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、卵巢浆液性表面乳头状癌、前列腺癌、T-细胞急性淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌或T-细胞淋巴瘤。
本发明还提供了本发明如前所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体、核酸分子、载体或药物组合物在制备增强或提高视网膜母细胞瘤蛋白突变体与E2F转录因子结合的预防和/或治疗癌症或肿瘤药物中的应用。
在制备药物的应用中，包括使用治疗有效量的视网膜母细胞瘤蛋白突变体、核酸分子、载体或药物组合物。
术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。通常，本发明中的有效量根据各种因素而变化，所述因素例如给定的药物组合物、药学制剂、给药途径、疾病或病症的类型、被治疗的受试者等等，但仍然可以由本领域技术人员常规地确定。本发明的视网膜母细胞瘤蛋白突变体、核酸分子、载体或药物组合物的有效量可以由本领域技术人员通过本领域已知的常规方法容易地确定。术语“受试者”或“患者”互换地用于指可能需要本发明所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体、核酸分子、载体或药物组合物或相关制剂或药物治疗的任何动物。受试者或患者因此包括但不限于：灵长类动物(包括人类)、犬科动物、猫科动物、鼠和其它哺乳动物。优选地，所述受试者或患者是人类。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如细胞恶性增殖的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。
除非另外说明，本发明中使用的术语“E2F转录因子”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然E2F家族转录因子。
本发明还提供本发明如前所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体、核酸分子、载体或药物组合物与其它药物联合施用。优选地，所述其它药物包括诊断剂、预防剂和/或治疗剂。
实施例1
本实施例提供一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体，对视网膜母细胞瘤蛋白1(RB1)的15个CDK激酶磷酸化位点进行突变，其中，这15个CDK激酶磷酸化位点分别被CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6和CDK9磷酸化，如表1所示。
表1 15个CDK激酶磷酸化位点突变
通过全基因合成的方式把携带Flag标签的RB1蛋白编码序列克隆入pDONOR载体(命名为pDONOR-Flag-RB1)；为了避免RB1蛋白被CDK激酶磷酸化修饰，通过定点诱变方式把15个磷酸化修饰位点全部突变为丙氨酸(Alanine，A)，把全突变型RB1基因命名为RBdel15；进而利用Gateway LR系统把Flag-RBdel15的蛋白编码序列克隆入强力霉素(Doxycycline，DOX)诱导表达载体plenti-DEST-Tre-3G中，命名为pDEST-Tre-Flag-RBdel15。(注：强力霉素是一种常用的广谱抗生素，为四环素的类似物，在生物学实验中常用于tet-on或tet-off诱导性表达或抑制目的基因时的诱导剂或抑制剂，不仅广泛用于人细胞中tet-on或tet-off tet系统的诱导表达，也常用于小鼠中tet-on或tet-off tet系统的诱导表达)。
实施例2
本实施例提供一种宿主细胞，通过Lipofectamine 2000把实施例1制备的p DEST-Tre-Flag-RBdel15及慢病毒包装质粒(psPAX2及pMD2.G)转染入HEK293FT细胞，以制备表达Flag-RBdel15蛋白的慢病毒颗粒；进而把病毒颗粒感染胰腺癌细胞株MIA PaCa-2，通过单细胞克隆筛选，挑选到3个阳性克隆C1、C2和C6细胞株；分别加入二甲亚砜(DMSO，对照组)和强力霉素(DOX，实验组)进行处理。结果如图2所示。
由图2结果可知，发现本发明制备的宿主细胞在DOX的诱导下具有较高的F lag-RBdel15表达，其中以C2克隆的表达效果最好，其中E2F靶基因CCNA2的表达被显著抑制。
实施例3
向实施例2中挑选到的C2细胞株和磷酸化RB1蛋白(phosphorylated RB1，pRB1)中分别加入终浓度为1μg/mL的DOX诱导和DMSO，用不同的抗体进行蛋白免疫印迹(Westernblot)检测，发现Flag-RBdel15(抗Flag抗体或抗RB抗体)显著高表达，而磷酸化RB1蛋白(phosphorylated RB1，pRB1)显著低表达，其中E2F下游靶基因Cyclin A的表达被显著抑制(图3A)。
进行BrdU掺入实验，显示RBdel15高表达显著抑制细胞增殖(图3B)；进行流式细胞术检测，发现RBdel15高表达细胞显著阻滞细胞于G1期，位于S期的细胞显著降低(图3C)。这表明，RBdel15具有极为高效的细胞周期抑制功能。
对两组细胞进行高通量转录组测序(RNA-seq)，结果发现了1,193个差异显著基因(图3D)；功能分析(GO)发现，高表达基因显著富集于1型干扰素信号通路(GO:0060337，p＝9.375E-10)、γ-干扰素相关信号通路(GO:0060333，p＝2.449E-08)及抗原加工呈递(GO:0002480，p＝1.005E-04)；低表达基因显著富集于姊妹染色体分离(GO:0000070，p＝7.533E-17)、DNA代谢(GO:0006259，p＝6.747E-16)和有丝分裂细胞周期相变(GO:0044772，p＝9.911E-15)(图3E)。
检测E2F靶基因表达，部分RBdel15上调的免疫相关基因有CCL28、OAS2、HLA-B、HLA-F、IFI6、ICM1、IFIM10和MX2；下调的细胞周期相关基因有MYC、SNAI2、RRM2、MKI67、PTTG1、CDT1、PLK1、CDC7和TK1等(图3F)；随后挑选了部分E2F靶基因(CCNA2、STAT2、IRF9、CD74和HLA-A)进行荧光定量PCR验证(图3G)。
实施例4
向实施例2中挑选到的C2细胞株中分别加入终浓度为1μg/mL的DOX诱导和DMSO，对表观遗传相关基因的表达情况进行检测，结果如图4所示。
由图4结果可知，RNA-seq测序显示，RBdel15显著抑制表观遗传相关基因的表达，如DNA甲基转移酶1(DNMT1)、Zeste基因增强子同源物2(EZH2)、组蛋白赖氨酸甲基转移酶SUV39H1/2、染色质组装因子1A(CHAF1A)、染色质组装因子1B(CHAF1B)和DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)等(图4A)。
荧光定量PCR及蛋白免疫印迹实验发现RBdel15几乎完全抑制了表观遗传基因DNMT1和EZH1的表达(图4B,4C)。用DOX诱导RBdel15表达后，发现DNMT1和EZH2被持续抑制；而免疫相关基因(如CD74和HLA-A)的表达则随着时间延长而持续增加(图4D)。
加入EZH2抑制剂他泽司他(Tazemetostat，TAZ)或EZH2的siRNA(siEZH2)，改变了EZH2的活性或基因表达，但对RBdel15的功能并没有造成太大的影响(图4E,4F)。
5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza)是DNMT1的抑制剂，用0.25M的5-Aza长时间(192h)处理Miapaca2细胞后，DNMT1和CCNA2的表达水平持续降低，而免疫相关基因STAT2和HLA-A表达水平显著增高(图4G,4H)。这表明，RBdel15具有与5-Aza类似的抑制DNMT1表达水平的作用。
实施例6
向实施例2中挑选到携带pDEST-Tre-Flag-RBdel15的Miapaca2细胞系中，分别加入DMSO、DOX、100nM Palbociclib+50nM Trametinib(P100T50)进行处理，注：Palbociclib(帕博西尼，我国首款CDK4/6抑制剂)；Trametinib(曲美替尼，MEK1/2抑制剂)，对细胞抗肿瘤功能情况进行检测，结果如图5所示。
由图5结果可知，DOX诱导RBdel15高表达的细胞增殖速度极慢，其水平与CDK4/6抑制剂(Palbociclib)和MEK1/2抑制剂(Trametinib)联用的效果相当(图5A)。
利用鬼笔环肽(phalloidin)显示细胞内的丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)，发现RBdel15高表达细胞的体积显著增大(图5B)；β-半乳糖苷酶细胞衰老检测发现，RBdel15高表达细胞的β-半乳糖苷酶活性显著增加，呈现衰老形态(senescence)(图5C)。
集落形成实验显示，RBdel15高表达显著抑制细胞增殖(图5D)。以上结果表明，本发明的RBdel15可以从抑制细胞周期、提高肿瘤免疫、促进细胞衰老等多个方面发挥抗肿瘤功能。
实施例7
为了进一步研究RBdel15与体内(in vivo)免疫及肿瘤微环境的关系，以C57Bl/6小鼠KPC(Kras G12D/+p53 R172H/+Pdx-1-Cre)衍生的胰腺导管腺癌(p ancreatic ductaladenocarcinoma，PDAC)细胞系4662为研究对象，用携带RBd el15基因的慢病毒颗粒感染4662细胞，通过单细胞克隆筛选，挑选RBdel15表达阳性细胞克隆，分别加入二甲亚砜(DMSO，对照组)和强力霉素(DOX，实验组)进行处理，构建了DOX诱导表达RBdel15的小鼠胰腺癌模型4662-RBdel15；结果如图6所示。
由图6结果可知，以针对小鼠RB蛋白的单克隆抗体(Rb-4H1)进行免疫荧光检查和蛋白免疫印迹分析，发现DOX可显著诱导Rbdel15蛋白的表达(图6A,6B)，其中E2F靶基因(如Cyclin A、DNMT1和EZH2)的表达被显著抑制(图6B)。RBdel15高表达显著抑制4662-RBdel15细胞的增殖(图6C,6D)；流式细胞术检测发现，RBdel15高表达细胞显著阻滞细胞于G1期(图6E)。
实施例8
将4662-RBdel15细胞通过皮下方式注射C57/BL6小鼠，待肿瘤生长至150mm3左右时，将小鼠随机分为两组，分别饮食DMSO或Dox(2mg/ml Dox+1％Sucrose)，结果如图7所示。
由图7结果可知，随着时间的推移，发现DOX喂养组小鼠的瘤体几乎没有变化，而DMSO喂养组小鼠的瘤体显著增加(图7A)。
对肿瘤组织进行单细胞测序，利用ggplot2绘制单细胞等高线图(UMAP)，这些细胞被聚集为6个细胞群：肿瘤细胞群(tumors)、T细胞群(T cells)、髓系细胞群(myeloids)、癌症相关成纤维细胞群(cancer-associated fibroblast，CAF)、内皮细胞群(endothelial)和嗜中性粒细胞群(neutrophil)(图7B)。
在变化显著的细胞群中，DOX饲喂组小鼠的髓样细胞显著降低(图7C)，T细胞数量升高了约4倍(图7D)，这表明，本发明的RBdel15能显著调节肿瘤细胞的免疫应答。
同时，RBdel15还可显著提高具有抗肿瘤功能的CAF的数量(图7E)，诱导肿瘤细胞分化，通过改变免疫微环境实现抑制肿瘤的生长。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体，其特征在于，包括CDK磷酸化位点突变的视网膜母细胞瘤蛋白1突变体多肽、CDK磷酸化位点突变的视网膜母细胞瘤蛋白1突变体蛋白或CDK磷酸化位点突变的视网膜母细胞瘤蛋白1突变体类似物。
2.根据权利要求1所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体，其特征在于，所述CDK磷酸化位点突变包括以下至少一个CDK磷酸化位点的突变：T5、S230、S249、T252、T356、T373、S567、S608、S612、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826。
3.根据权利要求1所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体，其特征在于，包括如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体，其特征在于，包括如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.3所示的核酸序列编码得到的视网膜母细胞瘤蛋白突变体。
5.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-4中任意一项所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体。
6.一种载体，其特征在于，包括权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，包括转导或转染权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体的宿主细胞。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-4中任意一项所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体、权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体。
9.一种权利要求1-4中任意一项所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体的制备方法，其特征在于，包括培养权利要求7所述的宿主细胞。
10.一种如权利要求1-4任一项所述的视网膜母细胞瘤蛋白突变体或权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体或权利要求8所述的药物组合物在制备预防和/或治疗癌症或肿瘤药物中的应用；
优选地，应用于制备增强或提高视网膜母细胞瘤蛋白突变体与E2F转录因子结合的预防和/或治疗癌症或肿瘤药物。
Priority Applications (1)
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| CN202310853082.3A CN116769011A (zh) | 2023-07-12 | 2023-07-12 | 一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体及其制备方法和应用 |
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2023
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