JP2023543915A - 遺伝子の発現を同時に調節するための組成物及び方法 - Google Patents

遺伝子の発現を同時に調節するための組成物及び方法 Download PDF

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クラース ピーテル ザイデベェルド，
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ペトラ ヒルマン－ヴュルナー，
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Abstract

本発明は、標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡをコードする少なくとも一つの核酸配列と、目的の遺伝子をコードする少なくとも一つの核酸配列とを含む組換えポリ核酸コンストラクトの組成物に関する。ここにまた開示されるのは、がんの治療と二つ以上の遺伝子の発現の同時調節における組成物の使用である。【選択図】図１

Description

［関連出願との相互参照］
この出願は、２０２０年１０月５日に出願された米国仮出願第６３／０８７６４３号と２０２１年６月２３日に出願された米国仮出願第６３／２１３８４１号の利益を主張し、これらのそれぞれは、出典明示によりその全体がここに援用される。
［配列表］
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が出典明示によりここに援用される配列表を含む。２０２１年９月３０日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、５７６２３＿７０７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、２９５３４７バイトのサイズである。
多くのヒトの異常な状態は、ヒトの異常な状態がない対象におけるタンパク質発現レベルに対する、遺伝子発現レベルのシフトによって引き起こされるか又はシフトに関連している。がんの場合は特にしかりである。例えば、がん細胞は、細胞増殖又は血管新生に関与するタンパク質の発現を増加させ、腫瘍に対する免疫応答に関与するタンパク質の発現を低下させることから恩恵を被ることが知られている。従って、細胞増殖又は血管新生に関与する一つ又は複数の標的遺伝子産物の産生を減少させ、対象におけるがんの発生を予防又は治療するために必要な、腫瘍に対する免疫応答に関与するタンパク質などの他の産物の産生を同時に増加させる治療法が必要とされている。
ここに提供されるのは、一つの組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを使用して、二つ以上のタンパク質又は核酸配列の発現を同時に調節するための組成物及び方法である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組成物であり、第一のＲＮＡがサイトカインをコードし、第二のＲＮＡが、腫瘍増殖に関連する遺伝子の発現を調節する遺伝要素をコードする。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組成物であり、第一のＲＮＡがサイトカインをコードし、第二のＲＮＡが、免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を調節する遺伝要素をコードする。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ここに記載される組成物の何れかと薬学的に許容される添加物とを含む薬学的組成物である。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、分化抗原群１５５（ＣＤ１５５）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ｍｙｃ癌原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントの発現を調節する遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結された、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントをコードする第一のＲＮＡを含む組成物である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、小胞体タンパク質（ＥＲｐ５）、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントの発現を調節する遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結された、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、その断片、又はその機能的バリアントをコードする第一のＲＮＡを含む組成物である。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ＣＤＫ６、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子（ＫＲＡＳ）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントの発現を調節する遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結された、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、ＩＬ－７、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントをコードする第一のＲＮＡを含む組成物である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ここに記載される組成物の何れかと薬学的に許容される添加物とを含む薬学的組成物である。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、がんを有する対象にここに記載の組成物又は薬学的組成物の何れかを投与することを含む、がんを治療する方法である。幾つかの実施態様では、がんは固形腫瘍である。幾つかの実施態様では、がんはメラノーマである。幾つかの実施態様では、がんは腎細胞癌である。幾つかの実施態様では、がんは頭頸部がんである。幾つかの実施態様では、頭頸部がんは頭頸部扁平上皮癌である。幾つかの実施態様では、頭頸部がんは、喉頭がん、下咽頭がん、扁桃腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻咽頭がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、口唇がん、口腔がん、口腔がん、中咽頭がん、唾液腺がん、脳腫瘍、食道がん、眼がん、副甲状腺がん、頭頸部の肉腫、又は甲状腺がんである。幾つかの実施態様では、対象はヒトである。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、配列番号：１～１７及び１２５～１４１からなる群から選択される核酸配列を含む組換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物である。
［出典明示による援用］
この明細書で言及された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個別の刊行物、特許、又は特許出願が、出典明示により援用されることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度まで、出典明示によりここに援用される。
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲に特定をして記載されている。本開示の特徴及び利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例証的な実施態様を記載している次の詳細な説明と、以下の添付図面とを参照することによって得られるであろう。
図１は、コンストラクトのデザインの概略図を示す。ポリ核酸コンストラクトは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合と、単一転写物における目的遺伝子及びｓｉＲＮＡの両方のインビトロ転写の成功のために、目的遺伝子配列（例として与えられたＩＬ－２）の上流にＴ７プロモーター配列を含みうる。ＩＬ－２のシグナルペプチドは、灰色のボックスで強調表示される。ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡに、又はｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡに連結するリンカーは、それぞれ横縞のボックス又は格子縞のボックスで示される。Ｔ７：Ｔ７プロモーター、ｓｉＲＮＡ：低分子干渉ＲＮＡ。
図２Ａは、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ－２９３）からのＩＬ－２分泌の誘導についてのプロットである。Ｘ軸は、ＨＥＫ－２９３細胞へのトランスフェクションに使用されるｍＲＮＡを示す：化合物（Ｃｐｄ．）１、Ｃｐｄ．２、Ｃｐｄ．３、又はＣｐｄ．４。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡを使用したＣｐｄ．１によるＩＬ－２タンパク質分泌と比較したＩＬ－２タンパク質分泌倍率変化の測定値である。データは、Ｃｐｄ当たり３回の反復の平均±平均標準誤差を表す。有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）は、一元配置ＡＮＯＶＡと、続いてＣｐｄ．１を対照として使用したＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって評価した。
図２Ｂは、ヒト成体ケラチノサイト（ＨａＣａＴ）からのＩＬ－２分泌の誘導についてのプロットである。Ｘ軸は、ＨａＣａＴ細胞へのトランスフェクションに使用されるｍＲＮＡを示す：化合物（Ｃｐｄ．）１、Ｃｐｄ．２、Ｃｐｄ．３、又はＣｐｄ．４。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡを使用したＣｐｄ．１によるＩＬ－２タンパク質分泌と比較したＩＬ－２タンパク質分泌倍率変化の測定値である。データは、Ｃｐｄ当たり３回の反復の平均±平均標準誤差を表す。有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）は、一元配置ＡＮＯＶＡと、続いてＣｐｄ．１を対照として使用したＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって評価した。
図２Ｃは、ヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）からのＩＬ－２分泌の誘導についてのプロットである。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞へのトランスフェクションに使用されるｍＲＮＡを示す：化合物（Ｃｐｄ．）１、Ｃｐｄ．２、Ｃｐｄ．３、又はＣｐｄ．４。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡを使用したＣｐｄ．１によるＩＬ－２タンパク質分泌と比較したＩＬ－２タンパク質分泌倍率変化の測定値である。データは、Ｃｐｄ当たり３回の反復の平均±平均標準誤差を表す。有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）は、一元配置ＡＮＯＶＡと、続いてＣｐｄ．１を対照として使用したＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって評価した。
図３は、ＶＥＧＦＡ（０．３μｇのＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ）を過剰発現する肺上皮細胞（Ａ５４９細胞）における化合物５（Ｃｐｄ．５）によるＩＬ－２タンパク質の用量依存的分泌及びＶＥＧＦＡ発現の同時干渉についてのプロットである。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．５の濃度（それぞれ０、１５０、３００、６００、９００、又は１２００ｎｇ／ウェルに対応する４．４、８．８、１７．６、２６．４、３５．２、及び４４．０２ｎＭ）を示す。Ｙ軸は、Ｃｐｄ．５によるトランスフェクションの２４時間後の、ＥＬＩＳＡによる同じ細胞培養上清中のＶＥＧＦＡ（左）及びＩＬ－２（右）タンパク質レベル（ｎｇ／ｍｌ）の測定値である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図４Ａは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡでトランスフェクトしてＶＥＧＦＡを過剰発現させたヒト舌細胞癌細胞（ＳＣＣ－４）における、化合物５（Ｃｐｄ．５）によるＶＥＧＦＡ発現の干渉についてのプロットである。Ｘ軸は、９．５ｎＭ（３００ｎｇ）のＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡのみ（ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ）でトランスフェクトされたＳＣＣ－４細胞、又は９．５ｎＭ（３００ｎｇ）のＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡと２６．４ｎＭ（９００ｎｇ）のＣｐｄ．５（Ｃｐｄ．５）で同時トランスフェクトされたＳＣＣ－４細胞を示す。Ｙ軸は、トランスフェクションの２４時間後の、ＥＬＩＳＡによる細胞培養上清中のＶＥＧＦＡタンパク質レベル（ｎｇ／ｍｌ）の測定値である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図４Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定された、図４Ａと同じ細胞培養上清中のＩＬ－２タンパク質レベル（ｎｇ／ｍｌ）についてのプロットである。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図５Ａは、ＶＥＧＦＡを内因的に過剰発現するヒト舌細胞癌細胞（ＳＣＣ－４）における化合物５（Ｃｐｄ．５）によるＶＥＧＦＡ発現の干渉についてのプロットである。Ｘ軸は、２６．４ｎＭ（９００ｎｇ）のＣｐｄ．５によるトランスフェクション前（内在性）及びトランスフェクション（Ｃｐｄ．５）後のＳＣＣ－４細胞を示す。Ｙ軸は、トランスフェクションの２４時間後の、ＥＬＩＳＡによる細胞培養上清中のＶＥＧＦＡタンパク質レベル（ｎｇ／ｍｌ）の測定値である。データは、２回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図５Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定された、図５Ａと同じ細胞培養上清中のＩＬ－２タンパク質レベル（ｎｇ／ｍｌ）についてのプロットである。データは、２回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図６Ａは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡでトランスフェクトしてＶＥＧＦＡ（９．５ｎＭ又は０．３μｇのＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ）を過剰発現させたヒト舌細胞癌細胞（ＳＣＣ－４）における、化合物５（Ｃｐｄ．５）及び市販のｓｉＲＮＡによるＶＥＧＦＡ発現の干渉についてのプロットである。Ｘ軸は、Ｃｐｄ．５（４．４ｎＭから４４．０２ｎＭ）又は市販のｓｉＲＮＡ（０．０５ｍＭから２．５ｍＭ）の濃度を増加させてトランスフェクトされたＳＣＣ－４細胞を示す。Ｙ軸は、トランスフェクションの２４時間後の、ＥＬＩＳＡによる細胞培養上清中のＶＥＧＦＡタンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）の測定値を示す。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図６Ｂは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡでトランスフェクトしてＶＥＧＦＡ（９．５ｎＭ又は０．３μｇのＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ）を過剰発現させたヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）における、化合物５（Ｃｐｄ．５）及び市販のｓｉＲＮＡによるＶＥＧＦＡ発現の干渉についてのプロットである。Ｘ軸は、Ｃｐｄ．５（４．４ｎＭから４４．０２ｎＭ）又は市販のｓｉＲＮＡ（０．０５ｍＭから２．５ｍＭ）の濃度を増加させてトランスフェクトしたＡ５４９細胞を示す。Ｙ軸は、トランスフェクションの２４時間後の、ＥＬＩＳＡによる細胞培養上清中のＶＥＧＦＡタンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）の測定値を示す。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図６Ｃは、ＳＣＣ－４及びＡ５４９細胞におけるＣｐｄ５及び市販のｓｉＲＮＡのＩＣ５０値の比較のための表である。
図７Ａは、可溶性及び膜ＭＩＣＢを構成的に発現するヒト舌細胞癌細胞（ＳＣＣ－４）における化合物６（Ｃｐｄ．６）によるＭＩＣＢ発現の干渉についてのプロットである。Ｘ軸は、３５．１１ｎＭ（９００ｎｇ）のＣｐｄ．６によるトランスフェクション前（内在性）及びトランスフェクション後（Ｃｐｄ．６）のＳＣＣ－４細胞を示す。Ｙ軸は、トランスフェクションの２４時間後の、ＥＬＩＳＡによる細胞培養上清中の可溶性ＭＩＣＢタンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）の測定値である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図７Ｂは、可溶性及び膜ＭＩＣＢを構成的に発現するヒト舌細胞癌細胞（ＳＣＣ－４）における化合物６（Ｃｐｄ．６）によるＭＩＣＢ発現の干渉についてのプロットである。Ｘ軸は、３５．１１ｎＭ（９００ｎｇ）のＣｐｄ．６によるトランスフェクション前（内在性）及びトランスフェクション後（Ｃｐｄ．６）のＳＣＣ－４細胞を示す。Ｙ軸は、トランスフェクションの２４時間後の、ＥＬＩＳＡによる細胞培養上清中の膜ＭＩＣＢタンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）の測定値である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図７Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定された、図７Ａ及び図７Ｂと同じ細胞培養上清中のＩＬ－２タンパク質レベル（ｎｇ／ｍｌ）についてのプロットである。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図８Ａは、可溶性ＭＩＣＡを構成的に発現するヒト舌細胞癌細胞（ＳＣＣ－４）における、化合物６（Ｃｐｄ．６）によるＩＬ－２タンパク質の用量依存的分泌及びＭＩＣＡ発現の同時干渉についてのプロットである。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．６の濃度（１．５８、２．９３、５．８５、１１．７、２３．４１、３５．１１、及び４６．８１ｎＭ）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクションの２４時間後の、ＥＬＩＳＡによる細胞培養上清中の可溶性ＭＩＣＡタンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）の測定値である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図８Ｂは、図８Ａに記載された同じＳＣＣ－４細胞上清における、化合物６（Ｃｐｄ．６）によるＩＬ－２タンパク質の用量依存的分泌及びＭＩＣＢ発現の同時干渉についてのプロットである。ＳＣＣ－４細胞は、可溶性ＭＩＣＢを構成的に発現する。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．６の濃度（１．５８、２．９３、５．８５、１１．７、２３．４１、３５．１１、及び４６．８１ｎＭ）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクションの２４時間後の、ＥＬＩＳＡによる細胞培養上清中の可溶性ＭＩＣＢタンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）の測定値である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図９Ａは、超低接着（ＵＬＡ）プレートに５０００細胞／ウェルで播種したＳＫ－ＯＶ－３－ＮＬＲ細胞の三次元（３Ｄ）スフェロイド培養におけるＣｐｄ．３（１００ｎｇ）によるトランスフェクションの１２、２４及び４８時間後に測定したＩＬ－２発現についてのプロットである。ＩＬ－２の定量は、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイで実施した。エラーバーは、３回の反復の平均±ＳＥＭを表す。
図９Ｂ～９Ｄは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下におけるＣｐｄ．３でのトランスフェクション後のＳＫ－ＯＶ－３ ＮＬＲの全核局在化ＲＦＰ（ＮＬＲ）積分強度の変化を示す。ＳＫ－ＯＶ－３ ＮＬＲをＵＬＡプレート（４連）に５０００細胞／ウェルで播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して異なる用量のＣｐｄ．３（３ｎｇ、１０ｎｇ、３０ｎｇ及び１００ｎｇ）でトランスフェクトした。ついで細胞を遠心分離してスフェロイドを形成し、ＰＢＭＣ添加前に４８時間培養した。３人のドナーから単離されたＰＢＭＣ（図９Ｂ、９Ｃ及び９Ｄ）を、抗ＣＤ３と共に２０００００細胞／ウェルの密度で添加した。共培養物を、１６８時間（７日間）３時間毎に画像化した。全ＮＬＲ積分強度を２４時間の時点に正規化し、ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェア内のスフェロイドモジュールを使用して解析した。ｒｈＩＬ２：組換えヒトＩＬ－２
図９Ｅは、５日目におけるＳＫ－ＯＶ－３ ＮＬＲ状態のＰＢＭＣ単独対照、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ２）及びＣｐｄ．３処置（１００ｎｇ）後の、Ｃｐｄ．３媒介ＮＬＲ積分量低下を示す代表的なＩｎｃｕＣｙｔｅ画像のセットを示す。
図１０Ａは、Ｃｐｄ．５（０．３μｇ／ウェル）でトランスフェクトされ、ＥＬＩＳＡによって定量された、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞の上清に由来するｒｈ－ＩＬ－２（０．００１ｎｇから３００ｎｇ）又はＩＬ－２（０．００１ｎｇ～４５ｎｇ）によって誘導されたＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭＩＬ－２レポーター細胞におけるＪＡＫ３／ＳＴＡＴ５経路の用量依存的活性化を示すプロットである。Ｘ軸は、Ｃｐｄ．５由来のＩＬ－２又はｒｈ－ＩＬ－２の異なる濃度を示す。Ｙ軸は、ｒｈ－ＩＬ－２に対して正規化されたＩＬ－２シグナル伝達活性化を示す（ｒｈ－ＩＬ－２の最低ＳＥＡＰ値を０に設定し、ｒｈ－ＩＬ－２の最高ＳＥＡＰ値を１００％に設定）。データは、用量当たり４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１０Ｂは、Ｃｐｄ．６（０．３μｇ／ウェル）でトランスフェクトされ、ＥＬＩＳＡによって定量された、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞の上清に由来するｒｈ－ＩＬ－２（０．００１ｎｇから３００ｎｇ）又はＩＬ－２（０．００１ｎｇ～４５ｎｇ）によって誘導されたＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭＩＬ－２レポーター細胞におけるＪＡＫ３／ＳＴＡＴ５経路の用量依存的活性化を示すプロットである。Ｘ軸は、Ｃｐｄ．６由来のＩＬ－２又はｒｈ－ＩＬ－２の異なる濃度を示す。Ｙ軸は、ｒｈ－ＩＬ－２に対して正規化されたＩＬ－２シグナル伝達の活性化を示す。データは、用量当たり４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１０Ｃは、発光細胞生存率アプローチ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ）によって測定されたＮＫ細胞媒介死滅アッセイを示すプロットである。ＳＣＣ－４細胞は異なる用量のＣｐｄ．５、Ｃｐｄ．６、及び二種のモック対照ＲＮＡ（０．１ｎＭから２．５ｎＭ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの３０分後、ＮＫ－９２細胞をＳＣＣ－４細胞と１０：１のエフェクター対ターゲット（Ｅ：Ｔ）細胞比で共培養し、３７℃において２４時間インキュベートした。次に、細胞を十分に洗浄してＮＫ－９２細胞を除去し、生き残ったＳＣＣ－４細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを使用した細胞生存率アッセイによって分析した。未処理のＳＣＣ－４細胞を対照として使用し、０％に設定した。データは、用量当たり４回の反復からの平均±ＳＥＭを表す。
図１１Ａは、ＳＣＣ－４細胞において化合物７（Ｃｐｄ．７）及び化合物８（Ｃｐｄ．８）によって誘導された内因的に発現されたＶＥＧＦＡの用量依存的ダウンレギュレーションを示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清中のＶＥＧＦＡレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用したＣｐｄ．７（１．１、２．２、４．４、８．８、１７．６、２６．４、３５．２、及び４４．０４ｎＭ／ウェル）及びＣｐｄ．８（０．４７、０．９４、１．８９、３．７９、７．５８、１５．１５、２２．７３、３０．３１及び３７．８８ｎＭ／ウェル）の濃度を示す。トランスフェクトされていない細胞のＶＥＧＦＡレベルを１００％に設定した。Ｙ軸は、トランスフェクトされていないサンプル（基底レベル）に対して正規化されたＶＥＧＦＡレベルのダウンレギュレーションを示す。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１１Ｂは、ＳＣＣ－４細胞においてＣｐｄ．７（３×ｓｉＲＮＡ）及びＣｐｄ．８（５×ｓｉＲＮＡ）によって誘導されたＩＬ－２レベルの用量依存的分泌を示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清中のＩＬ－２レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用したＣｐｄ．７（１．１、２．２、４．４、８．８、１７．６、２６．４、３５．２、及び４４．０４ｎＭ／ウェル）及びＣｐｄ．８（０．４７、０．９４、１．８９、３．７９、７．５８、１５．１５、２２．７３、３０．３１及び３７．８８ｎＭ／ウェル）の濃度を示す。Ｙ軸は、細胞培養上清中のＩＬ－２タンパク質レベル（ｎＭ）の測定値であり、１ｎＭはＩＬ－２とその受容体との解離定数（Ｋｄ）に対応する。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１１Ｃは、ＳＣＣ－４細胞における７２時間までの、化合物９（Ｃｐｄ．９）及び化合物（Ｃｐｄ．１０）によって誘導されたＩＬ－２分泌の経時変化を示すプロットである。細胞培養上清中のＩＬ－２レベルを、トランスフェクション（３０ｎＭ）の６から７２時間後にＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸はトランスフェクション後の時間を示し、Ｙ軸は細胞培養上清中のＩＬ－２タンパク質レベル（ｎＭ）の測定値である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１１Ｄは、ＳＣＣ－４細胞における７２時間までの、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ．ｓｉＲＮＡ）、市販ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ、Ｃｐｄ．９及びＣｐｄ．１０により構成的に発現されたＶＥＧＦＡレベルの時間依存的ダウンレギュレーションについてのプロットである。細胞培養上清中のＶＥＧＦＡレベルを、トランスフェクション（３０ｎＭ）後６時間から７２時間までＥＬＩＳＡによって測定した。トランスフェクトされていない細胞のＶＥＧＦＡレベルを１００％に設定し、ダウンレギュレーションをこの値に対して正規化した。Ｘ軸はトランスフェクション後の時間を示し、Ｙ軸はトランスフェクトされていないサンプル（基底レベル）に対して正規化されたＶＥＧＦＡレベルのダウンレギュレーションを示す。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１２Ａ及び図１２Ｃは、それぞれＳＣＣ－４細胞及びＡ５４９細胞において化合物１１（Ｃｐｄ．１１）によって誘導されるＩＬ－１２レベルの分泌を示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清中のＩＬ－１２レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１１（７（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル））の濃度を示す。Ｙ軸は、細胞培養上清中のＩＬ－１２タンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１２Ｂ及び図１２Ｄは、それぞれＳＣＣ－４細胞及びＡ５４９細胞におけるＣｐｄ．１１処理から生じるＩＤＨ１、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ６レベルのダウンレギュレーションを示すプロットである。ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ６のＲＮＡレベルは、トランスフェクションの２４時間後に、技術的反復下でｑＰＣＲによって細胞可溶化物から測定した。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞及びＡ５４９細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１１の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクトされていないサンプル（基底レベル）に対して正規化されたＩＤＨ１、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ６レベルのダウンレギュレーションを示す。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１２Ｅ及び図１２Ｇは、それぞれＳＣＣ－４細胞及びＡ５４９細胞において化合物１２（Ｃｐｄ．１２）によって誘導されたＩＬ－１２レベルの分泌を示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清中のＩＬ－１２レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞及びＡ５４９細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１２の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、細胞培養上清中のＩＬ－１２タンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１２Ｆ及び図１２Ｈは、それぞれＳＣＣ－４細胞及びＡ５４９細胞におけるＣｐｄ．１２処理から生じるＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、及びｍＴＯＲレベルのダウンレギュレーションを示すプロットである。ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、及びｍＴＯＲのＲＮＡレベルは、トランスフェクションの２４時間後に、技術的反復下でｑＰＣＲによって細胞可溶化物から測定した。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞及びＡ５４９細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１２の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクトされていないサンプル（基底レベル）に対して正規化されたＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、及びｍＴＯＲレベルのダウンレギュレーションを示す。ＢＱＬ＝アッセイの定量限界未満。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１３Ａ及び図１３Ｂは、それぞれＡ５４９細胞及びＳＣＣ－４細胞において化合物１３（Ｃｐｄ．１３）によって誘導されたＩＬ－１２レベルの分泌を示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清中のＩＬ－１２レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞及びＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１３の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、細胞培養上清中のＩＬ－１２タンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１３Ｃは、Ａ５４９細胞において化合物１４（Ｃｐｄ．１４）によって誘導されたＩＬ－１２レベルの分泌を示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清中のＩＬ－１２レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１４の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、細胞培養上清中のＩＬ－１２タンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１３Ｄ及び図１３Ｅは、それぞれＡ５４９細胞及びＳＣＣ－４細胞におけるＣｐｄ．１３処理から生じるＥＧＦＲ発現のダウンレギュレーションを示すプロットである。ＥＧＦＲのＲＮＡレベルは、トランスフェクションの２４時間後に、ｑＰＣＲによって細胞可溶化物から測定した。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞及びＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１３の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクトされていないサンプル（基底レベル）に対して正規化されたＥＧＦＲレベルのダウンレギュレーションを示す。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１３Ｆは、Ａ５４９細胞におけるＣｐｄ．１４処理から生じるｍＴＯＲ発現のダウンレギュレーションを示すプロットである。ｍＴＯＲのＲＮＡレベルは、トランスフェクションの２４時間後に、ｑＰＣＲにより細胞可溶化物から測定した。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１４の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクトされていないサンプル（基底レベル）に対して正規化されたｍＴＯＲレベルのダウンレギュレーションを示す。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１４Ａ及び図１４Ｃは、それぞれＡ５４９細胞及びＳＣＣ－４細胞において化合物１５（Ｃｐｄ．１５）によって誘導されたＩＬ－１５レベルの分泌を示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清中のＩＬ－１５レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞及びＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１５の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、細胞培養上清中のＩＬ－１５タンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１４Ｂ及び図１４Ｄは、それぞれＡ５４９細胞及びＳＣＣ－４細胞におけるＣｐｄ．１５処理から生じるＶＥＧＦＡ及びＣＤ１５５発現のダウンレギュレーションを示すプロットである。ＶＥＧＦＡ及びＣＤ１５５のＲＮＡレベルは、トランスフェクションの２４時間後に、ｑＰＣＲによって細胞可溶化物から測定した。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞及びＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１５の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクトされていないサンプル（基底レベル）に対して正規化されたＶＥＧＦＡ及びＣＤ１５５レベルのダウンレギュレーションを示す。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１４Ｅは、ヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ２５１ＭＧ）細胞において化合物１６（Ｃｐｄ．１６）によって誘導されたＩＬ－１５レベルの分泌を示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清中のＩＬ－１５レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、Ｕ２５１ＭＧ細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１６の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、細胞培養上清中のＩＬ－１５タンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１４Ｆは、Ｕ２５１ＭＧ細胞におけるＣｐｄ．１６処理から生じるＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１及びｃ－Ｍｙｃ発現のダウンレギュレーションを示すプロットである。ＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１、及びｃ－ＭｙｃのＲＮＡレベルは、トランスフェクションの２４時間後に、ｑＰＣＲによって細胞可溶化物から測定した。Ｘ軸は、Ｕ２５１ＭＧ細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１６の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクトされていないサンプル（基底レベル）に対して正規化されたＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１、及びｃ－Ｍｙｃレベルのダウンレギュレーションを示す。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１４Ｇは、Ｕ２５１ＭＧ細胞において化合物１７（Ｃｐｄ．１７）によって誘導されたＩＬ－７レベルの分泌を示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清中のＩＬ－７レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、Ｕ２５１ＭＧ細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１７の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、細胞培養上清中のＩＬ－７タンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）である。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１４Ｈは、Ｕ２５１ＭＧ細胞におけるＣｐｄ．１７処理から生じるＰＤ－Ｌ１発現のダウンレギュレーションを示すプロットである。ＰＤ－Ｌ１のＲＮＡレベルは、トランスフェクションの２４時間後に、ｑＰＣＲによって細胞可溶化物から測定した。Ｘ軸は、Ｕ２５１ＭＧ細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．１７の濃度（１０ｎＭ及び３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクトされていないサンプル（基底レベル）に対して正規化されたＰＤ－Ｌ１レベルのダウンレギュレーションを示す。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
図１５Ａは、ＳＣＣ－４細胞において化合物５（Ｃｐｄ．５）及び化合物１０（Ｃｐｄ．１０）によって誘導された内因的に発現されたＶＥＧＦＡのダウンレギュレーションを示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後に、細胞培養上清中のＶＥＧＦＡレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用されるＣｐｄ．５及びＣｐｄ．１０の濃度（２０及び３０ｎＭ）を示す。トランスフェクトされていない細胞からのＶＥＧＦＡレベルは、ＳＣＣ－４細胞の内因性ＶＥＧＦＡ分泌レベルを表し、「０」とラベル付けした。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡによって測定されたＶＥＧＦＡレベルを示す。データは、２回の独立した測定の平均±平均標準誤差を表す。
図１５Ｂは、ＨＵＶＥＣインビトロ血管新生モデルにおいて、図１５Ａの異なる培地上清からＶＥＧＦＡによって誘導された枝分かれ部位の数を示すプロットである。組換えヒトＶＥＧＦＡ（ＶＥＧＦ）を対照として使用し、枝分かれ部位の数を６時間の時点での顕微鏡写真から計数した。データは、６回の独立した測定の平均±平均標準誤差を表す。
ここに提供されるのは、目的の遺伝子をコードする少なくとも一つの核酸配列と、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードするか又は含む少なくとも一つの核酸配列とを含む、二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節するための組成物及び方法である。また、ここに提供されるのは、単一のＲＮＡ転写物からサイトカインと、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を低下させる遺伝要素とを同時に発現する組換えＲＮＡコンストラクトを含む、がんを治療するための組成物及び方法である。ここに更に提供されるのは、二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する組成物及び方法である。ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組成物であって、第一のＲＮＡがサイトカインをコードし、第二のＲＮＡが、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を低下させる遺伝要素をコードする、組成物である。一例では、第一のＲＮＡは、サイトカインをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得、サイトカインのタンパク質レベルを上昇させることができる。別の例では、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を低下させる第二のＲＮＡ或いは遺伝要素は、標的ｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを減少させることができる。幾つかの実施態様では、標的ｍＲＮＡは、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子のｍＲＮＡを含みうる。
別段の定義がない限り、ここで使用される全ての技術用語及び科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。ここに記載のものと同様な又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。
［定義］
この明細書の所定の特定の詳細は、様々な実施態様の完全な理解をもたらすために記載される。しかしながら、当業者には、本開示をこれらの詳細なしで実施できることが理解されるであろう。他の例では、周知の構造は、実施態様の説明を不必要に不明瞭にすることを避けるために、詳細には図示又は説明されていない。文脈上別段の要求がない限り、明細書及び特許請求の範囲全体を通じて、「含む（comprise）」という語と「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などのその変形語は、オープンで包括的な意味で、つまり「限定されないが、含む」と解釈されるべきである。更に、ここに提供される見出しは便宜上のものに過ぎず、請求項記載の開示の範囲又は意味を解釈するものではない。
この明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。「又は（ｏｒ）」という用語は、内容が明確に別段の指示をしない限り、「及び／又は」を含むその意味で一般に用いられることにもまた留意されたい。ここで使用される「及び／又は」及び「それらの任意の組み合わせ」という用語及びそれらの文法上の均等語は、交換可能に使用されうる。これらの用語は、任意の組み合わせが具体的に企図されていることを伝えうる。例証のみを目的として、次の語句「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」又は「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの任意の組み合わせ」は、「Ａを個別に；Ｂを個別に；Ｃを個別に；ＡとＢ；ＢとＣ；ＡとＣ；並びにＡ、Ｂ、及びＣ」を意味しうる。「又は」という用語は、文脈が特に選言的使用に言及しない限り、連言的又は選言的に使用されうる。
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し得、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣例により、１以内又は１を超える標準偏差を意味しうる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味しうる。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、該用語は、値の１桁以内、５倍以内、又は２倍以内を意味しうる。出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明記しない限り、その特定の値に対して許容誤差範囲内を意味する「約」という用語が想定されるべきである。
この明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「含む（comprising）」（及び「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの任意の形態の含む（comprising））、「有する（having）」（及び「有する（have）」及び「有する（has）」などの任意の形態の有する（having））、「含む（including）」（及び「含む（includes）」及び「含む（include）」などの任意の形態の含む（including）又は「含む（containing）」（及び「含む（contains）」及び「含む（contain）」などの任意の形態の含む（containing））という語は、包括的又はオープンエンドであり、追加の非列挙の要素又は方法工程を排除しない。この明細書において検討される任意の実施態様は、本開示の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。更に、本開示の組成物は、本開示の方法を達成するために使用されうる。
明細書における「実施態様」、「所定の実施態様」、「好ましい実施態様」、「特定の実施態様」、「幾つかの実施態様」、「実施態様」、「一実施態様」、又は「他の実施態様」への言及は、実施態様に関連して記載される特定の特徴、構造、又は特性が、本開示の必ずしも全ての実施態様ではないが少なくとも幾つかの実施態様に含まれることを意味する。本開示の理解を容易にするために、幾らかの用語及び語句を以下に定義する。
ここで使用される「ＲＮＡ」という用語は、アミノ酸配列をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡなど）、並びにアミノ酸配列をコードしないＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）を含む。ここで使用されるＲＮＡは、コードＲＮＡ、すなわちアミノ酸配列をコードするＲＮＡでありうる。そのようなＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）とも呼ばれ、一本鎖ＲＮＡ分子である。ここで使用されるＲＮＡは、ノンコーディングＲＮＡ、すなわち、アミノ酸配列をコードしないか又はタンパク質に翻訳されないＲＮＡでありうる。ノンコーディングＲＮＡには、限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短又は小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）が含まれうる。ここで使用されるｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域、ヘアピン構造、ループ構造、又はそれらの任意の組み合わせを含みうる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも一つのｓｈＲＮＡ、少なくとも一つのｄｓＲＮＡ領域、又は少なくとも一つのループ構造を含みうる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡからプロセシングされうる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ｓｈＲＮＡから、ＤＩＣＥＲなどの内因性タンパク質によってプロセシング又は切断されうる。幾つかの実施態様では、ヘアピン構造又はループ構造は、ｓｉＲＮＡから切断又は除去されうる。例えば、ｓｈＲＮＡのヘアピン構造又はループ構造は切断又は除去されうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＲＮＡは、当業者に知られた合成、化学的、又は酵素的方法によって作製され、当業者に知られた組換え技術によって作製され、又は天然源から単離され、又はそれらの任意の組み合わせによって作製されうる。ＲＮＡは、修飾された又は修飾されていないヌクレオチド又はそれらの混合物を含んでもよく、例えば、ＲＮＡは、当該技術分野で知られている化学的及び天然に存在するヌクレオシド修飾を任意選択的に含みうる（例えば、Ｎ１－メチルプソイドウリジンは、ここではメチルプソイドウリジンとも呼ばれる）。
「核酸配列」、「ポリ核酸配列」、「ヌクレオチド配列」という用語は、ここでは交換可能に使用され、ここでは同一の意味を有し、ＤＮＡ又はＲＮＡを指す。幾つかの実施態様では、核酸配列は、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合されたヌクレオチドモノマーを含むか、又はそれらからなるポリマーである。「核酸配列」、「ポリ核酸配列」、及び「ヌクレオチド配列」という用語は、未修飾核酸配列を包含しうる、すなわち、未修飾ヌクレオチド又は天然ヌクレオチドを含みうる。「核酸配列」、「ポリ核酸配列」、及び「ヌクレオチド配列」という用語は、修飾核酸配列、例えば塩基修飾され、糖修飾され、又は骨格修飾等されたＤＮＡ又はＲＮＡをまた包含しうる。
「天然ヌクレオチド」及び「カノニカルヌクレオチド」という用語は、ここでは交換可能に使用され、ここでは同一の意味を有し、天然に存在するヌクレオチド塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、チミン（Ｔ）を指す。
「未修飾ヌクレオチド」という用語は、ここでは、天然には修飾されていない天然ヌクレオチド、例えばインビボで後成的に又は転写後に修飾されていない天然ヌクレオチドを指すために使用される。好ましくは、「未修飾ヌクレオチド」という用語は、ここでは、天然には修飾されておらず、例えばインビボで後成的に又は転写後に修飾されておらず、化学的に修飾されておらず、例えばインビトロで化学的に修飾されていない、天然ヌクレオチドを指すために使用される。
「修飾ヌクレオチド」という用語は、ここでは、後成的に又は転写後に修飾されたヌクレオチドなどの天然に修飾されたヌクレオチド、及び化学的に修飾されたヌクレオチド、例えばインビトロで化学的に修飾されたヌクレオチドを指すために使用される。
［組換えＲＮＡコンストラクト］
ここに提供されるのは、目的の遺伝子と、標的ＲＮＡに結合することによって別の遺伝子の発現を低下させる遺伝要素とを含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む、がんを治療するための組成物及び方法である。またここに提供されるのは、単一のＲＮＡ転写物を使用して二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する組成物及び方法である。別の遺伝子の発現を低下させる遺伝要素の例には、標的ｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれうる。
ここに更に提供されるのは、目的の遺伝子とｓｉＲＮＡなどの別の遺伝子の発現を低下させる遺伝要素とを含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトであり、目的の遺伝子とｓｉＲＮＡなどの別の遺伝子の発現を低下させる遺伝要素とは、図１に示されるように５’から３’方向、又は３’から５’方向に連続して存在しうる。一例では、目的の遺伝子は、図１に示されるように、ｓｉＲＮＡなどの別の遺伝子の発現を低下させる遺伝要素の５’側又はその上流に存在し得、目的の遺伝子は、リンカー（ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへのリンカーは「スペーサー」とも呼ばれる）によってｓｉＲＮＡに連結されうる。別の例では、目的の遺伝子は、ｓｉＲＮＡなどの別の遺伝子の発現を低下させる遺伝要素の下流又は３’に存在し得、ｓｉＲＮＡはリンカー（ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへのリンカー、「スペーサー」とも呼ばれる）によって目的の遺伝子に連結されうる。ここに提供される組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、一を超える種のｓｉＲＮＡを含み得、一を超える種のｓｉＲＮＡのそれぞれはリンカー（ｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへ、又はｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへのリンカー）によって連結されうる。幾つかの実施態様では、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡからｍＲＮＡ）へのリンカーの配列とｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡ（又はｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡ）へのリンカーの配列は異なりうる。幾つかの実施態様では、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡ）へのリンカーの配列とｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡ（又はｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡ）へのリンカーの配列は同じでありうる。ここに提供される組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、一つを超える目的の遺伝子を含み得、一つを超える目的の遺伝子のそれぞれがリンカー（ｍＲＮＡからｍＲＮＡへのリンカー）によって連結されうる。目的の遺伝子の例として、インターロイキン２（ＩＬ－２）を図１に示す。ＩＬ－２は、Ｎ末端にシグナルペプチド配列を含む。ＩＬ－２は、未修飾（ＷＴ）シグナルペプチド配列又は修飾シグナルペプチド配列を含みうる。ここに提供される組換えポリ核酸コンストラクトはＲＮＡポリメラーゼ結合のためのプロモーター配列をまた含みうる。例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合のためのＴ７プロモーターを図１に示す。
ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、目的の遺伝子の複数のコピーを含み得、目的の遺伝子の複数のコピーのそれぞれが同じタンパク質をコードする。また、ここに提供されるのは、複数の目的の遺伝子を含む組換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であり、ここで、複数の目的の遺伝子のそれぞれは、異なるタンパク質をコードする。ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、複数の種のｓｉＲＮＡ（例えば、少なくとも二種のｓｉＲＮＡ）を含み得、複数の種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ標的ＲＮＡに結合することができる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡの複数の種のそれぞれが、同じ標的ＲＮＡの同じ領域に結合しうる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡの複数の種のそれぞれが、同じ標的ＲＮＡの異なる領域に結合しうる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡの複数の種の幾つかが、同じ標的ＲＮＡに結合し得、ｓｉＲＮＡの複数の種の幾つかが、同じ標的ＲＮＡの異なる領域に結合しうる。またここに提供されるのは、複数の種のｓｉＲＮＡを含む組換えＲＮＡコンストラクトであり、ここで、複数の種のｓｉＲＮＡのそれぞれが、異なる標的ＲＮＡに結合することができる。幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡはメッセンジャー（ｍＲＮＡ）である。
ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であり、第一のＲＮＡがサイトカインをコードし、第二のＲＮＡが、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を低下させる遺伝要素をコードする。一例では、第一のＲＮＡは、サイトカインをコードするｍＲＮＡであり得、サイトカインタンパク質レベルを増加させうる。別の例では、ここに記載の組成物中の腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を低下させる第二のＲＮＡ又は遺伝要素は、標的ｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含みうる。幾つかの実施態様では、標的ｍＲＮＡは、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子のｍＲＮＡであり得、標的ｍＲＮＡのタンパク質発現をダウンレギュレートしうる。
組換えポリ核酸又は組換えＲＮＡは、天然には存在せず、インビトロで合成又は操作されるポリ核酸又はＲＮＡを指しうる。組換えポリ核酸又はＲＮＡは実験室で合成することができ、ＤＮＡ又はＲＮＡの酵素修飾、例えば酵素制限消化、ライゲーション、クローニング、及び／又はインビトロ転写を使用することにより、組換えＤＮＡ又はＲＮＡ技術を使用して調製することができる。組換えポリ核酸はインビトロで転写されてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成し得、組換えｍＲＮＡは単離され、精製され、細胞へのトランスフェクションに使用されうる。ここで使用される組換えポリ核酸又はＲＮＡは、タンパク質、ポリペプチド、標的モチーフ、シグナルペプチド、及び／又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのノンコーディングＲＮＡをコードしうる。幾つかの実施態様では、適切な条件下で、組換えポリ核酸又はＲＮＡを細胞に取り込み、細胞内で発現させることができる。
ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、目的の遺伝子をコードする一つを超える核酸配列を含みうる。例えば、組換えＲＮＡコンストラクトは、目的の遺伝子をコードする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上の核酸配列を含みうる。場合によっては、二つ以上の核酸配列のそれぞれが同じ目的の遺伝子をコードし、同じ目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡがｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡとは異なる。場合によっては、二つ以上の核酸配列のそれぞれが、異なる目的の遺伝子をコードし得、異なる目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクトにおいてコードされるｓｉＲＮＡの標的ではない。場合によっては、組換えＲＮＡコンストラクトは、目的の遺伝子をコードする三以上の核酸配列を含み得、三以上の核酸配列のそれぞれは、同じ目的の遺伝子又は異なる目的の遺伝子をコードし得、目的の同じ又は異なる遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクトにおいてコードされたｓｉＲＮＡの標的ではない。例えば、組換えＲＮＡコンストラクトは、目的の遺伝子をコードする４つの核酸配列を含み得、４つの核酸配列のうちの３つが同じ目的の遺伝子をコードし、４つの核酸配列のうちの一つが異なる目的の遺伝子をコードし、目的の同じ又は異なる遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは同じＲＮＡコンストラクトにおいてコードされるｓｉＲＮＡの標的ではない。
ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡの一を超える種を含みうる。例えば、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、同じｍＲＮＡ又は異なるｍＲＮＡを標的とする１～１０種のｓｉＲＮＡを含みうる。場合によっては、同じｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡの１～１０種のそれぞれが同じ配列を含みうる、すなわち、ｓｉＲＮＡの１～１０種のそれぞれが標的ｍＲＮＡの同じ領域に結合する。場合によっては、同じｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡの１～１０種のそれぞれが、異なる配列を含みうる、すなわち、ｓｉＲＮＡの１～１０種のそれぞれが標的ｍＲＮＡの異なる領域に結合する。ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡの少なくとも二つの種を含みうる。例えば、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、一つのｍＲＮＡを標的とする３種のｓｉＲＮＡを含み得、３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、ｍＲＮＡの同じ領域を標的とする同じ核酸配列を含む。この例では、ｓｉＲＮＡの３つの種のそれぞれは、エキソン１を標的とする同じ核酸配列を含みうる。別の例では、ｓｉＲＮＡの３つの種のそれぞれは、ｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる核酸配列を含みうる。この例では、ｓｉＲＮＡの３つの種のうちの一つが、エクソン１を標的とする核酸配列を含み得、ｓｉＲＮＡの３つの種のうちの別の一つが、エクソン２を標的とする核酸配列を含みうる等々である。更に別の例では、ｓｉＲＮＡの３つの種のそれぞれが、異なるｍＲＮＡを標的とする異なる核酸配列を含みうる。全ての態様において、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクト中のｓｉＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクト組成物中のｍＲＮＡによって発現される、サイトカインなどの目的の遺伝子の発現に影響を与えない場合がある。
ここに提供されるのは、サイトカインをコードする第一のＲＮＡと、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を低下させる遺伝要素をコードする第二のＲＮＡとを含む組換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物である。ここに記載の組成物中の第一のＲＮＡ及び第二のＲＮＡは、リンカーによって連結されうる。場合によっては、第一のＲＮＡ及び第二のＲＮＡを含む組成物は、リンカーをコードする核酸配列を更に含む。リンカーは、約６から約５０ヌクレオチド長でありうる。例えば、リンカーは、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は少なくとも約４０ヌクレオチド長でありうる。例えば、リンカーは、最大で約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は最大で約５０ヌクレオチド長でありうる。場合によっては、ｔＲＮＡリンカーが使用されうる。ｔＲＮＡ系は、生物間で進化的に保存されており、内在性ＲＮａｓｅＰ及びＺを利用してマルチシストロンコンストラクトをプロセシングする（Ｄｏｎｇ等，２０１６）。場合によっては、ここに記載のｔＲＮＡリンカーは、ＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号：２０）を含む核酸配列を含みうる。場合によっては、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号：２１）を含む核酸配列を含むリンカーを使用して、第一のＲＮＡと第二のＲＮＡを連結することができる。
ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、５’キャップ、コザック配列、及び／又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び／又はポリ（Ａ）テールを３’末端に翻訳を改善する特定の順序で更に含みうる。場合によっては、組換えＲＮＡコンストラクトは、当業者に知られている翻訳を促進する領域を更に含みうる。５’キャップの非限定的な例には、アンチリバースＣＡＰアナログ、クリーンＣａｐ、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、Ｃａｐ２、又はロックド核酸ｃａｐ（ＬＮＡ－ｃａｐ）が含まれうる。場合によっては、５’キャップは、ｍ２ ７，３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）Ｇ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、又はｍ７ＧｐｐｐＧｍを含みうる。
ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、ポリ（Ａ）テールを更に含みうる。場合によっては、ポリ（Ａ）テールは、ポリ（Ａ）の１から２２０塩基対（配列番号：１５０）を含む。例えば、ポリ（Ａ）テールは、ポリ（Ａ）の１、３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、又は２２０塩基対（配列番号：１５０）を含む。幾つかの実施態様では、ポリ（Ａ）テールは、ポリ（Ａ）の１から２０、１から４０、１から６０、１から８０、１から１００、１から１２０、１から１４０、１から１６０、１から１８０、１から２００、１から２２０、２０から４０、２０から６０、２０から８０、２０から１００、２０から１２０、２０から１４０、２０から１６０、２０から１８０、２０から２００、２０から２２０、４０から６０、４０から８０、４０から１００、４０から１２０、４０から１４０、４０から１６０、４０から１８０、４０から２００、４０から２２０、６０から８０、６０から１００、６０から１２０、６０から１４０、６０から１６０、６０から１８０、６０から２００、６０から２２０、８０から１００、８０から１２０、８０から１４０、８０から１６０、８０から１８０、８０から２００、８０から２２０、１００から１２０、１００から１４０、１００から１６０、１００から１８０、１００から２００、１００から２２０、１２０から１４０、１２０から１６０、１２０から１８０、１２０から２００、１２０から２２０、１４０から１６０、１４０から１８０、１４０から２００、１４０から２２０、１６０から１８０、１６０から２００、１６０から２２０、１８０から２００、１８０から２２０、又は２００から２２０塩基対（配列番号：１５０）を含む。幾つかの実施態様では、ポリ（Ａ）テールは、ポリ（Ａ）の１、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、又は２２０塩基対（配列番号：１５０）を含む。幾つかの実施態様では、ポリ（Ａ）テールは、ポリ（Ａ）の少なくとも１、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、又は少なくとも２２０塩基対（配列番号：１５１）を含む。幾つかの実施態様では、ポリ（Ａ）テールは、ポリ（Ａ）の最大２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、又は最大２２０塩基対（配列番号：１５２）を含む。幾つかの実施態様では、ポリ（Ａ）テールは、ポリ（Ａ）の１２０塩基対（配列番号：１５３）を含む。
ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、コザック配列を更に含みうる。コザック配列は、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸配列モチーフを指しうる。コザック配列は、例えば、出典明示によりその全体がここに援用される、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ ２９９（１－２）：１－３４による文献に詳細に記載されている。幾つかの実施態様では、ここに記載のコザック配列は、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号：１９）を含む配列を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、核移行シグナル（ＮＬＳ）を更に含みうる。
ここに記載の組換えＲＮＡコンストラクトは、非標準ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及び／又は修飾ヌクレオチドを含む、一つ又は複数のヌクレオチドバリアントを含みうる。修飾ヌクレオチドの例には、限定されないが、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリン、Ｎ１－メチルプソイドウリジンなどが含まれる。場合によっては、ヌクレオチドには、三リン酸部分への修飾を含む、それらのリン酸部分の修飾を含みうる。そのような修飾の非限定的な例には、より長いリン酸鎖及びチオール部分による修飾が含まれる。幾つかの実施態様では、リン酸鎖は、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のリン酸部分を含みうる。幾つかの実施態様では、チオール部分は、限定されないが、α－チオ三リン酸及びβ－チオ三リン酸を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに記載の組換えＲＮＡコンストラクトは、５－メチルシトシン及び／又はＮ６－メチルアデノシンを含まない。
ここに記載の組換えＲＮＡコンストラクトは、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾されうる。例えば、修飾は、典型的には相補的ヌクレオチドと水素結合を形成するために利用できる一又は複数の原子、及び／又は典型的には相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することができない一又は複数の原子においてでありうる。幾つかの実施態様では、骨格修飾には、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデート、及びホスホロジアミデート結合が含まれる。ホスホロチオエート結合は、リン酸骨格の非架橋酸素を硫黄原子に置き換え、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解を遅らせる。ホスホロジアミデート結合（Ｎ３’→Ｐ５’）により、ヌクレアーゼ認識及び分解を防ぐことができる。幾つかの実施態様では、骨格修飾は、骨格構造中のリンの代わりにペプチド結合を有すること、又はカルバメート、アミド、並びに直鎖及び環状炭化水素基を含む基を連結することを含む。例えば、Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位は、ペプチド核酸中のペプチド結合によって連結されうる。修飾された骨格を持つオリゴヌクレオチドは、Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ，Ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８（１０）：１１５７－７９，２００１及びＬｙｅｒ等，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１（３）：３４４－３５８，１９９９に概説されている。
ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、修飾及び未修飾ヌクレオチドの組み合わせを含みうる。場合によっては、アデノシン、グアノシン、及びシチジン含有ヌクレオチドは、修飾されていないか、又は部分的に修飾されている。場合によっては、修飾ＲＮＡコンストラクトの場合、ウリジンヌクレオチドの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が修飾されうる。幾つかの実施態様では、ウリジンヌクレオチドの５％から２５％が組換えＲＮＡコンストラクトにおいて修飾される。修飾ウリジンヌクレオチドの非限定的な例には、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、又はＮ１－メチルプソイド－ＵＴＰが含まれ得、当該技術分野で知られている任意の修飾ウリジンヌクレオチドが利用されうる。幾つかの実施態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、修飾及び未修飾ヌクレオチドの組み合わせを含み得、ここで、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のウリジンヌクレオチドが、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイド－ＵＴＰ、又は当該技術分野で知られている任意の他の修飾ウリジンヌクレオチドを含みうる。幾つかの実施態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、修飾及び未修飾ヌクレオチドの組み合わせを含み得、ここで、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のウリジンヌクレオチドがＮ１－メチルプソイドウリジンを含みうる。
ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、コドン最適化されうる。一般に、コドン最適化とは、天然配列の少なくとも一つのコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、又はそれ以上のコドン）を、天然アミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって目的の宿主細胞中での発現のために核酸配列を修飾するプロセスを意味する。コドン使用表は、例えば「コドン使用データベース」で容易に入手でき、これらの表を様々な方法で適合化させることができる。Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）（Ａｐｔａｇｅｎ，ＰＡ）及び好ましいＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｒ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ）など、特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムもまた利用可能である。幾つかの実施態様では、組換えＲＮＡコンストラクトはコドン最適化されなくてもよい。
場合によっては、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１～１７及び１２５～１４１からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含みうる。
［ＲＮＡ干渉と低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）］
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又はＲＮＡサイレンシングは、ＲＮＡ分子が標的ｍＲＮＡ分子を中和することによって遺伝子発現又は翻訳を阻害するプロセスである。ＲＮＡｉプロセスは、Ｍｅｌｌｏ及びＣｏｎｔｅ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１，３３８－３４２，Ｍｅｉｓｔｅｒ及びＴｕｓｃｈｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１，３４３－３４９、Ｈａｎｎｏｎ及びＲｏｓｓｉ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１，３７１－３７８、及びＦｉｒｅ（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４６，６９６６－６９８４に記載されている。簡潔に言えば、自然過程において、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼのダイサーによって長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が小ｄｓＲＮＡ断片又はヘアピン構造を持つｓｉＲＮＡ（すなわち、ｓｈＲＮＡ）に切断されることで反応が開始される。次に、これらの小ｄｓＲＮＡ断片又はｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡ配列に導く。干渉中、ｓｉＲＮＡ二本鎖がほどけ、アンチセンス鎖がＲＩＳＣと複合体を形成したままで、ＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡ配列に導き、分解とその後のタンパク質翻訳の抑制を誘導する。市販の合成ｓｉＲＮＡとは異なり、本発明におけるｓｉＲＮＡは、本発明の組換えＲＮＡコンストラクト中のｓｉＲＮＡはヘアピンループ構造を含みうるので、細胞の細胞質内において内因性ダイサーとＲＩＳＣ経路を利用して、細胞取り込み後に組換えＲＮＡコンストラクト（例えば、ｍＲＮＡと一又は複数のｓｉＲＮＡを含む組換えＲＮＡコンストラクト）から切断され得、上で詳述した自然のプロセスに従う。加えて、組換えＲＮＡコンストラクトの残り（すなわち、ｍＲＮＡ）が、ダイサーによるｓｉＲＮＡの切断後にインタクトなまま残されるので、本発明の組み換えＲＮＡコンストラクトにおける目的の遺伝子からの所望のタンパク質発現が達成される。
ここに提供されるのは、標的ＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡを含む少なくとも一つの核酸配列を含む組換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物である。場合によっては、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、５’非翻訳領域で標的ｍＲＮＡに結合することができる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、３’非翻訳領域で標的ｍＲＮＡに結合することができる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、エキソン中で標的ｍＲＮＡに結合することができる。場合によっては、標的ＲＮＡはノンコーディングＲＮＡである。幾つかの実施態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、センスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含みうる。幾つかの実施態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含みうる。幾つかの実施態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、センスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列とアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含みうる。本発明に含まれるｓｉＲＮＡの詳細は、出典明示によりここに援用されるＣｈｅｎｇ等（２０１８）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．，６，４６３８－４６４４に記載されている。
例えば、場合によっては、組換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１種のｓｉＲＮＡ、すなわち、ｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む核酸配列とｓｉＲＮＡのアンチ鎖を含む核酸配列を含みうる。ここに記載のｓｉＲＮＡの１種は、センス鎖ｓｉＲＮＡの１種とアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡの１種を指しうる。場合によっては、組換えＲＮＡコンストラクトは、１を超える種のｓｉＲＮＡ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の種の、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とｓｉＲＮＡのアンチ鎖を含むｓｉＲＮＡを含みうる。幾つかの実施態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、１から２０種のｓｉＲＮＡを含みうる。幾つかの実施態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０種のｓｉＲＮＡを含みうる。幾つかの実施態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、最大で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は最大で２０種のｓｉＲＮＡを含みうる。好ましい実施態様では、ここに記載の組換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含む。別の好ましい実施態様では、ここに記載の組換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも３種のｓｉＲＮＡを含む。
ここに提供されるのは、１～２０以上のｓｉＲＮＡ種を含む組換えＲＮＡコンストラクトの組成物であり、ここで、１～２０以上のｓｉＲＮＡ種のそれぞれが、標的ＲＮＡに結合することができる。幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ又はノンコーディングＲＮＡである。場合によっては、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれが同じ標的ＲＮＡに結合する。一例では、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれが、同じ配列を含み、同じ標的ＲＮＡの同じ領域又は配列に結合しうる。例えば、組換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡ種を含み得、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、標的ＲＮＡの同じ領域を標的とする同じ配列を含み、すなわち、組換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含みうる。別の例では、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれが、異なる配列を含み、同じ標的ＲＮＡの異なる領域又は配列に結合しうる。例えば、組換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡ種を含み得、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、同じ標的ＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含みうる。この例では、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡ種の一つのｓｉＲＮＡがエクソン１を標的とし得、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡ種の別のｓｉＲＮＡが同じｍＲＮＡのエクソン２を標的としうる等々である。場合によっては、組換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡ種を含み得、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡ種のうちの２つが同じ配列を含み、標的ＲＮＡの同じ領域に結合し得、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡ種のうちの３つ以上が異なる配列を含み、同じ標的ＲＮＡの異なる領域に結合しうる。場合によっては、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれが異なる標的ＲＮＡに結合する。幾つかの実施態様では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ又はノンコーディングＲＮＡなどでありうる。
ここに提供されるのは、１～２０以上のｓｉＲＮＡ種を含む組換えＲＮＡコンストラクトの組成物であり、１～２０以上のｓｉＲＮＡ種のそれぞれがリンカーによって連結される。場合によっては、リンカーは非切断可能リンカーでありうる。場合によっては、リンカーは、自己切断可能リンカーなどの切断可能リンカーでありうる。場合によっては、リンカーはｔＲＮＡリンカーでありうる。ｔＲＮＡ系は生物全体にわたって進化的に保存されており、内因性ＲＮａｓｅ Ｐ及びＺを利用してマルチシストロン構造をプロセシングする（Ｄｏｎｇ等，２０１６）。幾つかの実施態様では、ｔＲＮＡリンカーは、ＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号：２０）を含む核酸配列を含みうる。幾つかの実施態様では、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号：２２）を含む核酸配列を含むリンカーを使用して、異なるｓｉＲＮＡ種を結合することができる。
場合によっては、ｓｉＲＮＡのそのｍＲＮＡ標的への特異的結合は、標的ｍＲＮＡの正常な機能との干渉をもたらし、機能及び／又は活性の調節、例えばダウンレギュレーションを引き起こし、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイ又は治療的処置の場合の生理学的条件下、及びアッセイがインビトロアッセイの場合に実施される条件下で、ｓｉＲＮＡの非標的核酸配列への非特異的結合を回避する十分な度合いの相補性がある。
ここで使用されるタンパク質は、典型的には一又は複数のペプチド又はポリペプチドを含む分子を指しうる。ペプチド又はポリペプチドは、典型的には、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖である。ペプチドは、通常、２から５０のアミノ酸残基を含む。ポリペプチドは、通常、５０を超えるアミノ酸残基を含む。タンパク質は典型的には３次元形態に折り畳まれるが、これはタンパク質がその生物学的機能を発揮するために必要とされうる。ここで使用されるタンパク質は、タンパク質の断片、タンパク質のバリアント、及び融合タンパク質を含みうる。断片は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸分子、又はタンパク質の全長配列の短い部分でありうる。従って、断片は、典型的には、全長配列内の対応するストレッチと同一の配列を含む。幾つかの実施態様では、配列の断片は、断片が由来する全長ヌクレオチド又はアミノ酸配列の少なくとも５％から少なくとも８０％を含みうる。幾つかの実施態様では、タンパク質は哺乳動物タンパク質でありうる。幾つかの実施態様では、タンパク質はヒトタンパク質でありうる。幾つかの実施態様では、タンパク質は、細胞から分泌されるタンパク質でありうる。幾つかの実施態様では、タンパク質は細胞膜上のタンパク質でありうる。幾つかの実施態様では、ここで言及されるタンパク質は、分泌され、細胞表面上の受容体を介した標的細胞シグナル伝達のモジュレーターとして局所的又は全身的に作用し、しばしば免疫反応に関与するタンパク質又はウイルス感染に関与する他の宿主タンパク質でありうる。目的の遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、本発明の文脈において有用なタンパク質のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、当該技術分野で知られており、文献で入手可能である。例えば、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質を含む、本発明の文脈において有用なタンパク質のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースで入手可能である。
ここに提供されるのは、標的ｍＲＮＡに結合して標的ｍＲＮＡの発現を調節することができるｓｉＲＮＡを含む組換えＲＮＡコンストラクトの組成物である。場合によっては、標的ｍＲＮＡの発現（例えば、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベル）は、標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡによってダウンレギュレートされる。幾つかの実施態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡによって阻害される。ここに記載される、標的ｍＲＮＡの発現の阻害又はダウンレギュレーションは、限定されないが、標的ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を妨害するための標的ｍＲＮＡとの干渉を指し得；従って、標的ｍＲＮＡの発現の阻害又はダウンレギュレーションは、限定されないが、標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡを含む組換えＲＮＡコンストラクトの非存在下で標的ｍＲＮＡから発現されるタンパク質のレベルと比較して、標的ｍＲＮＡから発現されるタンパク質のレベルが低下することを指しうる。タンパク質発現のレベルは、当該技術分野で周知の任意の方法を使用して測定することができ、これらには、限定されないが、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び様々なプロテオミクス技術が含まれる。ポリペプチドを測定し又は検出する例示的な方法は、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイである。このタイプのタンパク質定量法は、特定の抗原を捕捉することができる抗体と、捕捉された抗原を検出することができる二次抗体に基づきうる。ポリペプチドの検出及び／又は測定のための例示的なアッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．及びＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
ここに提供されるのは、標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡを含む少なくとも一つの核酸配列と、目的の遺伝子をコードする少なくとも一つの核酸配列とを含む組換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であり、ここで、標的ｍＲＮＡは、目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとは異なる。ここに提供されるのは、標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡを含む少なくとも一つの核酸配列と、目的の遺伝子をコードする少なくとも一つの核酸配列とを含む組換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であり、ここで、ｓｉＲＮＡは目的の遺伝子の発現に影響を及ぼさない。場合によっては、ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに結合することができない。場合によっては、ｓｉＲＮＡは目的の遺伝子の発現を阻害しない。場合によっては、ｓｉＲＮＡは目的の遺伝子の発現をダウンレギュレートしない。ここに記載される、目的の遺伝子の発現を阻害又はダウンレギュレートするとは、限定されないが、組換えＲＮＡコンストラクトからのタンパク質の翻訳を妨害することを指し得；従って、目的の遺伝子の発現を阻害又はダウンレギュレートするとは、限定されないが、標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡを含む組換えＲＮＡコンストラクトの非存在下で発現されるタンパク質のレベルと比較して減少したタンパク質のレベルを指しうる。タンパク質発現のレベルは、当該技術分野で周知の任意の方法を使用して測定することができ、これらには、限定されないが、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び様々なプロテオミクス技術が含まれる。ポリペプチドを測定し又は検出する例示的な方法は、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイである。このタイプのタンパク質定量法は、特定の抗原を捕捉することができる抗体と捕捉された抗原を検出することができる二次抗体に基づきうる。ポリペプチドの検出及び／又は測定のための例示的なアッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．及びＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
ここに提供されるのは、標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡを含む少なくとも一つの核酸配列を含む組換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物である。ｓｉＲＮＡが結合することができる標的ｍＲＮＡの非限定的な例のリストには、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子のｍＲＮＡが含まれる。例えば、標的ｍＲＮＡは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、その断片、又はその機能的バリアントをコードするｍＲＮＡでありうる。ここで使用される機能的バリアントは、全長分子、その断片、又はそのバリアントを指しうる。例えば、バリアント分子は、タンパク質配列の場合は一又は複数のアミノ酸、又は核酸配列の場合は一又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾された配列を含みうる。例えば、バリアント分子は、限定されないが、機能獲得変異体又は機能喪失変異体を含む変異タンパク質を含むか又はコードしうる。ＶＥＧＦＡアイソフォームの非限定的な例のリストを表Ａに示す。
幾つかの実施態様では、ＶＥＧＦＡは、配列番号：３４に列挙される配列を含む。例示的なＰＩＧＦ配列を以下に示す：
ＰＩＧＦ ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１２０７０１２．１（配列番号：１２３）
例えば、標的ｍＲＮＡは、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、小胞体タンパク質（ＥＲｐ５）、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントをコードするｍＲＮＡでありうる。ここで使用される機能的バリアントは、全長分子、その断片、又はそのバリアントを指しうる。例えば、バリアント分子は、タンパク質配列の場合は一又は複数のアミノ酸、又は核酸配列の場合は一又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾された配列を含みうる。例えば、バリアント分子は、限定されないが、機能獲得変異体又は機能喪失変異体を含む変異タンパク質を含むか又はコードしうる。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。幾つかの実施態様では、標的ｍＲＮＡはデコイタンパク質をコードしうる。幾つかの実施態様では、デコイタンパク質は細胞受容体の可溶型である。幾つかの実施態様では、デコイタンパク質は、可溶性ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントである。幾つかの実施態様では、標的ｍＲＮＡは、細胞膜からのＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢの脱落に関与するタンパク質をコードしうる。幾つかの実施態様では、細胞膜からのＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢの脱落に関与するタンパク質は、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、ＭＭＰ、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントを含む。幾つかの実施態様では、細胞膜からのＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢの脱落に関与するタンパク質は、ＡＤＡＭ１７、その断片、又はその機能的バリアントを含む。ＡＤＡＭ１７の例示的配列を以下に示す：
ＡＤＡＭ１７ ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００３１８３．６（配列番号：１２４）
例えば、標的ｍＲＮＡは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ＣＤＫ６、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子（ＫＲＡＳ）、分化抗原群１５５（ＣＤ１５５）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、又はｍｙｃ癌原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントをコードするｍＲＮＡでありうる。ここで使用される機能的バリアントは、全長分子、その断片、又はそのバリアントを指しうる。例えば、バリアント分子は、タンパク質配列の場合は一又は複数のアミノ酸、又は核酸配列の場合は一又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾された配列を含みうる。例えば、バリアント分子は、限定されないが、機能獲得変異体又は機能喪失変異体を含む変異タンパク質を含むか又はコードしうる。
幾つかの実施態様では、標的ｍＲＮＡは、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＰＩＧＦ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ１７、ＭＭＰ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、ｃ－Ｍｙｃ、それらの断片、それらの機能的バリアント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードしうる。幾つかの実施態様では、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡは、配列番号：３６を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＭＩＣＡ ｍＲＮＡは、配列番号：３９を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＭＩＣＢ ｍＲＮＡは、配列番号：４２を含む配列を含む。実施態様では、ＩＤＨ１ ｍＲＮＡは、配列番号：５１を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＣＤＫ４ ｍＲＮＡは、配列番号：５４を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＣＤＫ６ ｍＲＮＡは、配列番号：５７を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡは、配列番号：６０を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡは、配列番号：６３を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡは、配列番号：６６を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＣＤ１５５ ｍＲＮＡは、配列番号：７２を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡは、配列番号：７５を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡは、配列番号：７８を含む配列を含む。
［目的の遺伝子］
ここに提供されるのは、目的の遺伝子をコードする核酸配列の一又は複数のコピーを含む組換えＲＮＡコンストラクトである。例えば、組換えＲＮＡコンストラクトは、目的の遺伝子をコードする核酸配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のコピーを含みうる。場合によっては、目的の遺伝子をコードする核酸配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のコピーのそれぞれが、同じ目的の遺伝子をコードする。場合によっては、組換えＲＮＡコンストラクトは、サイトカインをコードする核酸配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のコピーを含みうる。
またここに提供されるのは、目的の遺伝子をコードする核酸配列の２つ以上のコピーを含む組換えＲＮＡコンストラクトであり、ここで、２つ以上の核酸配列のそれぞれが、異なる目的の遺伝子をコードしうる。場合によっては、異なる目的の遺伝子をコードする２つ以上の核酸配列のそれぞれは、分泌タンパク質をコードする核酸配列を含みうる。場合によっては、異なる目的の遺伝子をコードする２つ以上の核酸配列のそれぞれは、サイトカインをコードする核酸配列を含みうる。幾つかの実施態様では、異なる目的の遺伝子をコードする２つ以上の核酸配列のそれぞれが、異なるサイトカインをコードしうる。更にここに提供されるのは、リンカーを含む組換えＲＮＡコンストラクトである。幾つかの実施態様では、リンカーは、目的の遺伝子をコードする２つ以上の核酸配列のそれぞれを連結しうる。場合によっては、リンカーは非切断可能リンカーでありうる。場合によっては、リンカーは切断可能リンカーでありうる。場合によっては、リンカーは自己切断可能リンカーでありうる。リンカーの非限定的な例には、可動性リンカー、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、又はＦ２Ａなどの２Ａペプチドリンカー（又は２Ａ自己切断ペプチド）、及びｔＲＮＡリンカーなどが含まれる。ｔＲＮＡ系は生物にわたって進化的に保存されており、内因性ＲＮａｓｅ Ｐ及びＺを利用してマルチシストロン構造をプロセシングする（Ｄｏｎｇ等，２０１６）。幾つかの実施態様では、ｔＲＮＡリンカーは、ＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号：２０）を含む核酸配列を含みうる。
ここに提供されるのは、目的の遺伝子の発現を調節するための、目的の遺伝子をコードするＲＮＡを含む組換えＲＮＡコンストラクトである。例えば、目的の遺伝子のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現を調節することができる。例えば、目的の遺伝子の発現は、組換えＲＮＡコンストラクトにおいて目的の遺伝子のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を発現させることによってアップレギュレートされる。例えば、目的の遺伝子の発現は、組換えＲＮＡコンストラクト中の目的の遺伝子のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを増加させることによってアップレギュレートされる。タンパク質発現のレベルは、当該技術分野で周知の任意の方法を使用して測定することができ、これらには、限定されないが、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び様々なプロテオミクス技術が含まれる。ポリペプチドを測定し又は検出する例示的な方法は、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイである。このタイプのタンパク質定量法は、特定の抗原を捕捉することができる抗体と、捕捉された抗原を検出することができる二次抗体に基づきうる。ポリペプチドの検出及び／又は測定のための例示的なアッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．及びＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
ここに提供されるのは、目的の遺伝子をコードするＲＮＡを含む組換えＲＮＡコンストラクトであり、目的の遺伝子は目的のタンパク質をコードする。場合によっては、目的のタンパク質は治療用タンパク質である。場合によっては、目的のタンパク質はヒト起源のもの、すなわちヒトタンパク質である。場合によっては、目的の遺伝子はサイトカインをコードする。幾つかの実施態様では、サイトカインはインターロイキンを含む。幾つかの実施態様では、目的のタンパク質は、インターロイキン２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントである。ここで使用される機能的バリアントは、全長分子、その断片、又はそのバリアントを指しうる。例えば、バリアント分子は、タンパク質配列の場合は一又は複数のアミノ酸、又は核酸配列の場合は一又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾された配列を含みうる。
場合によっては、ここで使用されるインターロイキン２（ＩＬ－２）又はＩＬ－２は、ヒトＩＬ－２の天然配列（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ６０５６８又はＱ０ＧＫ４３及びＧｅｎｂａｎｋデータベース：ＮＭ＿０００５８６．３）、その断片、又はその機能的バリアントを指しうる。ヒトＩＬ－２をコードする天然ＤＮＡ配列は、コドン最適化されうる。ヒトＩＬ－２の天然配列は、配列番号：２３に示されるように、２０のアミノ酸（ヌクレオチド１～６０）を有するシグナルペプチドと１３３のアミノ酸（ヌクレオチド６１～４５９）を有する成熟ヒトＩＬ－２からなりうる。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは未修飾ＩＬ－２シグナルペプチドである。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチドである。幾つかの実施態様では、ここで使用されるインターロイキン２（ＩＬ－２）又はＩＬ－２は、成熟ヒトＩＬ－２を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟タンパク質は、小胞体で合成され、タンパク質を発現し分泌する細胞においてゴルジ体を介して分泌されるタンパク質を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟ＩＬ－２は、小胞体で合成され、ＩＬ－２を発現し分泌する細胞においてゴルジ体を介して分泌されるＩＬ－２タンパク質を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟ヒトＩＬ－２は、小胞体で合成され、ヒトＩＬ－２を発現し分泌するヒト細胞においてゴルジ体を介して分泌されるＩＬ－２タンパク質を指し得、通常、配列番号：２４に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ－２は、ＩＬ－２断片、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２ムテイン、又はＩＬ－２変異体を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＩＬ－２断片は、少なくとも部分的に機能的であり得、すなわち、野生型又は全長ＩＬ－２と比較して、同様の又はより低いレベルでＩＬ－２活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＩＬ－２断片は、完全に機能的であり得、すなわち、野生型又は全長ＩＬ－２と比較して同じレベルでＩＬ－２活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２ムテイン、又はＩＬ－２変異体は、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－２アミノ酸配列を含みうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２ムテイン、又はＩＬ－２変異体は、少なくとも部分的に機能的であり得、すなわち、野生型ＩＬ－２と比較して同様の又はより低いレベルでＩＬ－２活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２ムテイン、又はＩＬ－２変異体は、完全に機能的であり得、すなわち、野生型ＩＬ－２と比較して同じレベルでＩＬ－２活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２ムテイン、又はＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と比較してより高いレベルでＩＬ－２活性を発揮しうる。
ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡは、１５３のアミノ酸を有するヒトＩＬ－２のプロペプチドをコードするヌクレオチド配列又は１３３のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－２をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指しうる。ヒトＩＬ－２のプロペプチドをコードするヌクレオチド配列と成熟ヒトＩＬ－２をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されうる。場合によっては、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、１コピーのＩＬ－２ ｍＲＮＡを含みうる。場合によっては、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、２コピー以上のＩＬ－２ ｍＲＮＡを含みうる。
場合によっては、ここで使用されるインターロイキン１２（ＩＬ－１２）又はＩＬ－１２は、ヒトＩＬ－１２アルファの天然配列（Ｇｅｎｂａｎｋデータベース：ＮＭ＿０００８８２．４）、ヒトＩＬ－１２ベータの天然配列（Ｇｅｎｂａｎｋデータベース：ＮＭ＿００２１８７．２）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントを指しうる。ヒトＩＬ－１２をコードする天然ＤＮＡ配列は、コドン最適化されうる。ヒトＩＬ－１２アルファの天然配列は、配列番号：４３に示されるように、２２のアミノ酸を有するシグナルペプチドと１９７のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－１２とからなりうる。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは未修飾ＩＬ－１２アルファシグナルペプチドである。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－１２アルファシグナルペプチドである。ヒトＩＬ－１２ベータの天然配列は、配列番号：４６に示されるように、２２のアミノ酸を有するシグナルペプチドと３０６のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－１２とからなりうる。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは未修飾ＩＬ－１２ベータシグナルペプチドである。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－１２ベータシグナルペプチドである。
幾つかの実施態様では、ここで使用されるインターロイキン１２（ＩＬ－１２）又はＩＬ－１２は、成熟ヒトＩＬ－１２アルファを指しうる。幾つかの実施態様では、ここで使用されるインターロイキン１２（ＩＬ－１２）又はＩＬ－１２は、成熟ヒトＩＬ－１２ベータを指しうる。幾つかの実施態様では、成熟タンパク質は、小胞体で合成され、タンパク質を発現し分泌する細胞においてゴルジ体を介して分泌されるタンパク質を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟ＩＬ－１２は、小胞体で合成され、ＩＬ－１２を発現し分泌する細胞においてゴルジ体を介して分泌されるＩＬ－１２アルファタンパク質を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟ＩＬ－１２は、小胞体で合成され、ＩＬ－１２を発現し分泌する細胞においてゴルジ体を介して分泌されるＩＬ－１２ベータタンパク質を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟ヒトＩＬ－１２は、小胞体で合成され、ヒトＩＬ－１２を発現し分泌するヒト細胞内のゴルジ体を介して分泌されるＩＬ－１２アルファタンパク質を指し得、通常、配列番号：４４に示されるようなヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含む。幾つかの実施態様では、成熟ヒトＩＬ－１２は、小胞体で合成され、ヒトＩＬ－１２を発現し分泌するヒト細胞においてゴルジ体を介して分泌されるＩＬ－１２ベータタンパク質を指し得、通常、配列番号：４７に示されるようなヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含む。
幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２アルファは、ＩＬ－１２アルファ断片、ＩＬ－１２アルファバリアント、ＩＬ－１２アルファムテイン、又はＩＬ－１２アルファ変異体を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＩＬ－１２アルファ断片は、少なくとも部分的に機能的であり得、すなわち、野生型又は全長ＩＬ－１２アルファと比較して、同様の又はより低いレベルでＩＬ－１２アルファ活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＩＬ－１２アルファ断片は、完全に機能的であり得、すなわち、野生型又は全長ＩＬ－１２アルファと比較して同じレベルでＩＬ－１２アルファ活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２アルファバリアント、ＩＬ－１２アルファムテイン、又はＩＬ－１２アルファ変異体は、少なくとも一つのアミノの挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－１２アルファアミノ酸配列を含みうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２アルファバリアント、ＩＬ－１２アルファムテイン、又はＩＬ－１２アルファ変異体は、少なくとも部分的に機能的であり得、すなわち、野生型ＩＬ－１２アルファと比較して同様の又はより低いレベルでＩＬ－１２アルファ活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２アルファバリアント、ＩＬ－１２アルファムテイン、又はＩＬ－１２アルファ変異体は、完全に機能的であり得、すなわち、野生型ＩＬ－１２アルファと比較して同じレベルでＩＬ－１２アルファ活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２アルファバリアント、ＩＬ－１２アルファムテイン、又はＩＬ－１２アルファ変異体は、野生型ＩＬ－１２アルファと比較してより高いレベルでＩＬ－１２アルファ活性を発揮しうる。
幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２ベータは、ＩＬ－１２ベータ断片、ＩＬ－１２ベータバリアント、ＩＬ－１２ベータムテイン、又はＩＬ－１２ベータ変異体を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＩＬ－１２ベータ断片は、少なくとも部分的に機能的であり得、すなわち、野生型又は完全長ＩＬ－１２ベータと比較して、同様の又はより低いレベルでＩＬ－１２ベータ活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＩＬ－１２ベータ断片は、完全に機能的であり得、すなわち、野生型又は完全長ＩＬ－１２ベータと比較して同じレベルでＩＬ－１２ベータ活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２ベータバリアント、ＩＬ－１２ベータムテイン、又はＩＬ－１２ベータ変異体は、少なくとも一つのアミノの挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－１２ベータアミノ酸配列を含みうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２ベータバリアント、ＩＬ－１２ベータムテイン、又はＩＬ－１２ベータ変異体は、少なくとも部分的に機能的であり得、すなわち、野生型ＩＬ－１２ベータと比較して同様の又はより低いレベルでＩＬ－１２ベータ活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２ベータバリアント、ＩＬ－１２ベータムテイン、又はＩＬ－１２ベータ変異体は、完全に機能的であり得、すなわち、野生型ＩＬ－１２ベータと比較して同じレベルでＩＬ－１２ベータ活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２ベータバリアント、ＩＬ－１２ベータムテイン、又はＩＬ－１２ベータ変異体は、野生型ＩＬ－１２ベータと比較してより高いレベルでＩＬ－１２ベータ活性を発揮しうる。
ＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡは、２１９のアミノ酸を有するヒトＩＬ－１２アルファのプロペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は１９７のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－１２アルファをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指しうる。ヒトＩＬ－１２アルファのプロペプチドをコードするヌクレオチド配列と成熟ヒトＩＬ－１２をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されうる。ＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡは、３２８のアミノ酸を有するヒトＩＬ－１２ベータのプロペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は３０６のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－１２ベータをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指しうる。ヒトＩＬ－１２ベータのプロペプチドをコードするヌクレオチド配列と成熟ヒトＩＬ－１２をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されうる。場合によっては、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、１コピーのＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含みうる。場合によっては、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、２以上のコピーのＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含みうる。
場合によっては、ここで使用されるインターロイキン１５（ＩＬ－１５）又はＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－１５の天然配列（Ｇｅｎｂａｎｋデータベース：ＮＭ＿０００５８５．４）、その断片、又はその機能的バリアントを指しうる。ヒトＩＬ－１５をコードする天然ＤＮＡ配列は、コドン最適化されうる。ヒトＩＬ－１５の天然配列は、配列番号：６７に示されるように、２９のアミノ酸を有するシグナルペプチドと１３３のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－１５とからなりうる。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは未修飾ＩＬ－１５シグナルペプチドである。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－１５シグナルペプチドである。幾つかの実施態様では、ここで使用されるインターロイキン１５（ＩＬ－１５）又はＩＬ－１５は、成熟ヒトＩＬ－１５を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟タンパク質は、小胞体で合成され、タンパク質を発現し分泌する細胞においてゴルジ体を介して分泌されるタンパク質を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟ＩＬ－１５は、小胞体で合成され、ＩＬ－１５を発現し分泌する細胞においてゴルジ体を介して分泌されるＩＬ－１５タンパク質を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟ヒトＩＬ－１５は、小胞体で合成され、ヒトＩＬ－１５を発現し分泌するヒト細胞においてゴルジ体を介して分泌されるＩＬ－１５タンパク質を指し得、通常、配列番号：６８に示されるようなヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５断片、ＩＬ－１５バリアント、ＩＬ－１５ムテイン、又はＩＬ－１５変異体を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＩＬ－１５断片は、少なくとも部分的に機能的であり得、すなわち、野生型又は全長ＩＬ－１５と比較して、同様の又はより低いレベルでＩＬ－１５活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＩＬ－１５断片は、完全に機能的であり得、すなわち、野生型又は全長ＩＬ－１５と比較して同じレベルでＩＬ－１５活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１５バリアント、ＩＬ－１５ムテイン、又はＩＬ－１５変異体は、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－１５アミノ酸配列を含みうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１５バリアント、ＩＬ－１５ムテイン、又はＩＬ－１５変異体は、少なくとも部分的に機能的であり得、すなわち、野生型ＩＬ－１５と比較して同等又はより低いレベルでＩＬ－１５活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１５バリアント、ＩＬ－１５ムテイン、又はＩＬ－１５変異体は、完全に機能的であり得、すなわち、野生型ＩＬ－１５と比較して同じレベルでＩＬ－１５活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１５バリアント、ＩＬ－１５ムテイン、又はＩＬ－１５変異体は、野生型ＩＬ－１５と比較してより高いレベルでＩＬ－１５活性を発揮しうる。
ＩＬ－１５をコードするｍＲＮＡは、１６２のアミノ酸を有するヒトＩＬ－１５のプロペプチドをコードするヌクレオチド配列又は１３３のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－１５をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指しうる。ヒトＩＬ－１５のプロペプチドをコードするヌクレオチド配列と成熟ヒトＩＬ－１５をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されうる。場合によっては、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、１コピーのＩＬ－１５ ｍＲＮＡを含みうる。場合によっては、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、２以上のコピーのＩＬ－１５ ｍＲＮＡを含みうる。
場合によっては、ここで使用されるインターロイキン７（ＩＬ－７）又はＩＬ－７は、ヒトＩＬ－７の天然配列（Ｇｅｎｂａｎｋデータベース：ＮＭ＿０００８８０．３）、その断片、又はその機能的バリアントを指しうる。ヒトＩＬ－７をコードする天然ＤＮＡ配列は、コドン最適化されうる。ヒトＩＬ－７の天然配列は、配列番号：７９に示されるように、２５のアミノ酸を有するシグナルペプチドと１５２のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－７とからなりうる。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは未修飾ＩＬ－７シグナルペプチドである。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－７シグナルペプチドである。幾つかの実施態様では、ここで使用されるインターロイキン７（ＩＬ－７）又はＩＬ－７は、成熟ヒトＩＬ－７を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟タンパク質は、小胞体で合成され、タンパク質を発現し分泌する細胞においてゴルジ体を介して分泌されるタンパク質を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟ＩＬ－７は、小胞体で合成され、ＩＬ－７を発現し分泌する細胞においてゴルジ体を介して分泌されるＩＬ－７タンパク質を指しうる。幾つかの実施態様では、成熟ヒトＩＬ－７は、小胞体で合成され、ヒトＩＬ－７を発現し分泌するヒト細胞内のゴルジ体を介して分泌されるＩＬ－７タンパク質を指し得、通常、配列番号：８０に示されるようなヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ－７は、ＩＬ－７断片、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－７ムテイン、又はＩＬ－７変異体を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＩＬ－７断片は、少なくとも部分的に機能的であり得、すなわち、野生型又は全長ＩＬ－７と比較して同様の又はより低いレベルでＩＬ－７活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のＩＬ－７断片は、完全に機能的であり得、すなわち、野生型又は完全長ＩＬ－７と比較して同じレベルでＩＬ－７活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－７ムテイン、又はＩＬ－７変異体は、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－７アミノ酸配列を含みうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－７ムテイン、又はＩＬ－７変異体は、少なくとも部分的に機能的であり得、すなわち、野生型ＩＬ－７と比較して同様の又はより低いレベルでＩＬ－７活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－７ムテイン、又はＩＬ－７変異体は、完全に機能的であり得、すなわち、野生型ＩＬ－７と比較して同じレベルでＩＬ－７活性を発揮しうる。幾つかの実施態様では、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－７ムテイン、又はＩＬ－７変異体は、野生型ＩＬ－７と比較してより高いレベルでＩＬ－７活性を発揮しうる。
ＩＬ－７をコードするｍＲＮＡは、１７７のアミノ酸を有するヒトＩＬ－７のプロペプチドをコードするヌクレオチド配列又は１５２のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－７をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指しうる。ヒトＩＬ－７のプロペプチドをコードするヌクレオチド配列と成熟ヒトＩＬ－７をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されうる。場合によっては、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、１コピーのＩＬ－７ ｍＲＮＡを含みうる。場合によっては、ここに提供される組換えＲＮＡコンストラクトは、２以上のコピーのＩＬ－７ ｍＲＮＡを含みうる。
［標的モチーフ］
ここに提供されるのは、標的モチーフを含む組換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物である。ここで使用される標的モチーフ又はターゲティングモチーフは、細胞質又はサイトゾルを除く、細胞膜、細胞外区画、又は細胞内区画の任意の部分に運命づけられた、新たに合成されたポリペプチド又はタンパク質中に存在する任意の短ペプチドを指しうる。幾つかの実施態様では、ペプチドは、典型的には、隣接するアミノ酸残基のα－アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって、互いに連結された一連のアミノ酸残基を指しうる。細胞内区画には、限定されないが、細胞内小器官、例えば核、核小体、エンドソーム、プロテアソーム、リボソーム、クロマチン、核膜、核膜孔、エキソソーム、メラノソーム、ゴルジ体、ペルオキシソーム、小胞体（ＥＲ）、リソソーム、中心体、微小管、ミトコンドリア、葉緑体、マイクロフィラメント、中間径フィラメント、又は細胞膜が含まれる。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、シグナル配列、輸送シグナル、移行シグナル、局在配列、輸送ペプチド、リーダー配列、又はリーダーペプチドと呼ばれうる。幾つかの実施態様では、標的モチーフは、目的の遺伝子をコードする核酸配列に作用可能に連結される。幾つかの実施態様では、「作用可能に連結される」という用語は、二つ以上の核酸配列間の機能的関係、例えば、転写調節配列又はシグナル配列と転写配列との機能的関係を指しうる。例えば、標的モチーフ又は標的モチーフをコードする核酸は、それがコード配列によってコードされるポリペプチドを細胞膜、細胞内、又は細胞外区画にターゲティングすることに関与するプレタンパク質として発現される場合、コード配列に作用可能に連結される。例えば、シグナルペプチド又はシグナルペプチドをコードする核酸は、それがコード配列によってコードされるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、コード配列に作用可能に連結される。例えば、プロモーターは、それがコード配列の転写を刺激し又は調節する場合、作用可能に連結される。標的モチーフの非限定的な例は、シグナルペプチド、核移行シグナル（ＮＬＳ）、核小体移行シグナル（ＮｏＬＳ）、リソソーム輸送シグナル、ミトコンドリア輸送シグナル、ペルオキシソーム輸送シグナル、微小管先端移行シグナル（ＭｔＬＳ）、エンドソーム輸送シグナル、葉緑体輸送シグナル、ゴルジ輸送シグナル、小胞体（ＥＲ）輸送シグナル、プロテアソーム輸送シグナル、膜輸送シグナル、膜貫通輸送シグナル、中心体移行シグナル（ＣＬＳ）、或いはタンパク質を細胞膜、細胞外区画、又は細胞内区画の所定部分にターゲティングする任意の他のシグナルを含む。
シグナルペプチドは、分泌経路へ運命づけられた、新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在する短ペプチドである。本発明のシグナルペプチドは、１０～４０アミノ酸長でありうる。シグナルペプチドは、目的のタンパク質のＮ末端に、又は目的のタンパク質のプロタンパク質形態のＮ末端に位置されうる。シグナルペプチドは、真核生物起源のものでありうる。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは哺乳動物タンパク質でありうる。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドはヒトタンパク質でありうる。場合によっては、シグナルペプチドは、相同シグナルペプチド（すなわち、同じタンパク質由来）又は異種シグナルペプチド（すなわち、異なるタンパク質又は合成シグナルペプチド由来）でありうる。場合によっては、シグナルペプチドは、タンパク質の天然に存在するシグナルペプチド又は改変シグナルペプチドでありうる。
ここに提供されるのは、標的モチーフを含む組換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であり、ここで、標的モチーフは、（ａ）目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に対して異種の標的モチーフ；（ｂ）目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に対して異種の標的モチーフであって、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されている、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に対して異種の標的モチーフ；（ｃ）目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に相同の標的モチーフ；（ｄ）目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に相同の標的モチーフであって、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されている、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に相同の標的モチーフ；及び（ｅ）天然には標的モチーフの機能を有していない天然に存在するアミノ酸配列であって、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって任意選択的に修飾されている天然に存在するアミノ酸配列からなる群から選択されうる。
ここに提供されるのは、標的モチーフを含む組換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であり、標的モチーフはシグナルペプチドである。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、（ａ）目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に対して異種のシグナルペプチド；（ｂ）目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に対して異種のシグナルペプチドであって、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾され、但し、タンパク質が酸化還元酵素ではない、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に対して異種のシグナルペプチド；（ｃ）目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に相同のシグナルペプチド；（ｄ）目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に相同のシグナルペプチドであって、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されている、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に相同のシグナルペプチド；及び（ｅ）天然にはシグナルペプチドの機能を有していない天然に存在するアミノ酸配列であって、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって任意選択的に修飾されている天然に存在するアミノ酸配列からなる群から選択されうる。場合によっては、シグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～９は、２を超える平均疎水性スコアを有する。
場合によっては、ここで使用される、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に対して異種の標的モチーフ又は目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に対して異種のシグナルペプチドは、タンパク質の天然に存在する標的モチーフ又はシグナルペプチドとは異なる天然に存在する標的モチーフ又はシグナルペプチドを指しうる。例えば、標的モチーフ又はシグナルペプチドは、目的の遺伝子に由来しない。通常、所与のタンパク質に異種の標的モチーフ又はシグナルペプチドは、所与のタンパク質に関連しない別のタンパク質からの標的モチーフ又はシグナルペプチドである。例えば、所与のタンパク質に対して異種の標的モチーフ又はシグナルペプチドは、所与のタンパク質の標的モチーフ又はシグナルペプチドのアミノ酸配列とは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を超えて異なるアミノ酸配列を有する。異種配列は同じ生物に由来する場合があるが、それらは天然では（自然界では）同じ核酸分子、例えば同じｍＲＮＡ内には存在しない。タンパク質に対して異種の標的モチーフ又はシグナルペプチド、及び標的モチーフ又はシグナルペプチドが異種であるタンパク質は、同じ又は異なる起源のものでありうる。幾つかの実施態様では、それらは真核生物起源のものである。幾つかの実施態様では、それらは同じ真核生物のものである。幾つかの実施態様では、それらは哺乳動物起源のものである。幾つかの実施態様では、それらは同じ哺乳動物のものである。幾つかの実施態様では、それらはヒト由来である。例えば、ＲＮＡコンストラクトは、ヒトＩＬ－２遺伝子及び別のヒトサイトカインのシグナルペプチドをコードする核酸配列を含みうる。幾つかの実施態様では、ＲＮＡコンストラクトは、シグナルペプチドとタンパク質とが同じ起源、すなわちヒト由来である、タンパク質に対して異種のシグナルペプチドを含みうる。
場合によっては、ここで使用される、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に相同の標的モチーフ又は目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に相同のシグナルペプチドは、タンパク質の天然に存在する標的モチーフ又はシグナルペプチドを指しうる。タンパク質に相同の標的モチーフ又はシグナルペプチドは、それが天然に存在するタンパク質の遺伝子によってコードされる標的モチーフ又はシグナルペプチドである。タンパク質に相同の標的モチーフ又はシグナルペプチドは、通常、真核生物由来である。幾つかの実施態様では、タンパク質に相同の標的モチーフ又はシグナルペプチドは、哺乳動物起源のものである。幾つかの実施態様では、タンパク質に相同の標的モチーフ又はシグナルペプチドはヒト由来のものである。
場合によっては、ここで使用される、天然において標的モチーフの機能を有していない天然に存在するアミノ酸配列、又は天然においてシグナルペプチドの機能を有していない天然に存在するアミノ酸配列は、天然に存在し、天然に存在する標的モチーフ又はシグナルペプチドのアミノ酸配列と同一ではないアミノ酸配列を指しうる。天然において標的モチーフ又はシグナルペプチドの機能を有していない天然に存在するアミノ酸配列は、１０～５０アミノ酸長でありうる。幾つかの実施態様では、天然において標的モチーフ又はシグナルペプチドの機能を有していない天然に存在するアミノ酸配列は、真核生物起源のものであり、真核生物起源の何れの標的モチーフ又はシグナルペプチドとも同一ではない。幾つかの実施態様では、天然において標的モチーフ又はシグナルペプチドの機能を有していない天然に存在するアミノ酸配列は、哺乳動物起源であり、哺乳動物起源の何れの標的モチーフ又はシグナルペプチドとも同一ではない。幾つかの実施態様では、天然において標的モチーフ又はシグナルペプチドの機能を有していない天然に存在するアミノ酸配列は、ヒト由来であり、天然に存在する何れのヒト由来の標的モチーフ又はシグナルペプチドとも同一ではない。天然において標的モチーフ又はシグナルペプチドの機能を有していない天然に存在するアミノ酸配列は、通常、タンパク質のコード配列のアミノ酸配列である。ここで使用される「天然に存在する」、「天然の」、及び「天然において」という用語は、同等の意味を有している。
場合によっては、ここで使用されるシグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～９は、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の９アミノ酸を指しうる。同様に、ここで使用されるシグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～７は、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の７アミノ酸を指し、シグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～５は、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の５アミノ酸を指しうる。
場合によっては、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されたアミノ酸配列とは、アミノ酸配列内に少なくとも一つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含むアミノ酸配列を指しうる。例えば、ここで使用される、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフが少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾され、又は目的の遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種であるシグナルペプチドが少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されるとは、その天然に存在するアミノ酸配列内に少なくとも一つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含むタンパク質とは異種の天然に存在する標的モチーフ又はシグナルペプチドのアミノ酸配列を指しうる。例えば、ここで使用される、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に相同の標的モチーフが少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾される、又は目的の遺伝子によってコードされるタンパク質に相同のシグナルペプチドが少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾されるとは、その天然に存在するアミノ酸配列内に少なくとも一つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含むタンパク質と相同の天然に存在する標的モチーフ又はシグナルペプチドを指しうる。幾つかの実施態様では、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換によって修飾され得、天然に存在するアミノ酸配列は、その天然に存在するアミノ酸配列内に少なくとも一つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含みうる。アミノ酸置換又は置換とは、アミノ酸又はポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の別のアミノ酸による置換を指しうる。例えば、置換Ｒ３４Ｋは、３４位のアルギニン（Ａｒｇ又はＲ）がリジン（Ｌｙｓ又はＫ）で置換されているポリペプチドを指す。前の例では、３４Ｋは３４位のアミノ酸がリジン（Ｌｙｓ又はＫ）に置換されていることを示す。幾つかの実施態様では、複数の置換は典型的にはスラッシュで区切られる。例えば、Ｒ３４Ｋ／Ｌ３８Ｖは、置換Ｒ３４Ｋ及びＬ３８Ｖを含むバリアントを指す。アミノ酸挿入又は挿入は、アミノ酸又はポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を指しうる。例えば、インサート－３４は、３４位での挿入を示す。アミノ酸欠失又は欠失は、アミノ酸又はポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を指しうる。例えば、Ｒ３４－は３４位のアルギニン（Ａｒｇ又はＲ）の欠失を示す。
場合によっては、欠失アミノ酸は、疎水性スコアが－０．８、－０．７、－０．６、－０．５、－０．４、－０．３、－０．２、－０．１、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８未満、又は１．９未満のアミノ酸である。場合によっては、置換アミノ酸は、置換アミノ酸の疎水性スコアよりも高い疎水性スコアを有するアミノ酸である。例えば、置換アミノ酸は、疎水性スコアが２．８以上、又は３．８以上のアミノ酸である。場合によっては、挿入されたアミノ酸は、疎水性スコアが２．８以上又は３．８以上のアミノ酸である。
場合によっては、ここに記載のアミノ酸配列は、１から１５のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のアミノ酸配列は、１から７のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含みうる。場合によっては、ここに記載のアミノ酸配列は、アミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含まない場合がある。場合によっては、ここに記載のアミノ酸配列は、標的モチーフ又はシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～３０内に１から１５のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のアミノ酸配列は、標的モチーフ又はシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～３０内に１から９のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含みうる。場合によっては、ここに記載のアミノ酸配列は、標的モチーフ又はシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～２０内に１から１５のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに記載のアミノ酸配列は、標的モチーフ又はシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～２０内に１から９のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含みうる。場合によっては、ここに記載のアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸は、欠失及び／又は置換によって任意選択的に修飾されうる。
場合によっては、修飾シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の９アミノ酸の平均疎水性スコアは、修飾のないシグナルペプチドと比較して１．０単位以上増加する。場合によっては、疎水性スコア（hydrophobic score）又は疎水性スコア（hydrophobicity score）は、ここではハイドロパシースコアと同義的に使用することができ、Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅスケール（Ｋｙｔｅ Ｊ．，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ．Ｆ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２））に従って計算されるアミノ酸の疎水性の度合いを指しうる。Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅスケールによるアミノ酸疎水性スコアは次の通りである：
幾つかの例では、アミノ酸配列の平均疎水性スコアは、アミノ酸数で割ったアミノ酸配列のアミノ酸のそれぞれのＫｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅスケールに従って疎水性スコアを加算することによって計算することができる。例えば、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９の平均疎水性スコアは、９のアミノ酸のそれぞれの疎水性スコアを加算して９で割ることによって計算することができる。
極性は、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ極性指数（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ Ｊ．Ｍ．、Ｅｌｉｅｚｅｒ Ｎ．，Ｓｉｍｈａ Ｒ．；Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２１：１７０－２０１（１９６８））に従って計算される。幾つかの実施態様では、アミノ酸配列の平均極性は、アミノ酸配列のアミノ酸のそれぞれのＺｉｍｍｅｒｍａｎ極性指数に従って計算された極性値を加算してアミノ酸の数で割ることによって計算することができる。例えば、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９の平均極性は、Ｎ末端のアミノ酸１～９の９のアミノ酸のそれぞれの平均極性を加算して９で割ることによって計算することができる。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ極性指数によるアミノ酸の極性は次の通りである：
場合によっては、インターロイキン２（ＩＬ－２）の天然に存在するシグナルペプチドは、一又は複数の置換、欠失、及び／又は挿入によって修飾され得、ここで、ＩＬ－２の天然に存在するシグナルペプチドは、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースではＰ６０５６８又はＱ０ＧＫ４３、またＧｅｎｂａｎｋデータベースではＮＭ＿０００５８６．３のＩＬ－２アミノ酸配列のアミノ酸１～２０と称される。場合によっては、ＩＬ－２シグナルペプチドのアミノ酸配列は、Ｙ２Ｌ、Ｒ３Ｋ、Ｒ３－、Ｍ４Ｌ、Ｑ５Ｌ、Ｓ８Ｌ、Ｓ８Ａ、－１３Ａ、Ｌ１４Ｔ、Ｌ１６Ａ、Ｖ１７－、及びＶ１７Ａからなる群から選択される一又は複数の置換、欠失、及び／又は挿入によって修飾されうる。場合によっては、野生型（ＷＴ）ＩＬ－２シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：２６を含む配列を含む。場合によっては、修飾ＩＬ－２シグナルペプチドは、配列番号：２７～２９からなる群から選択される配列を含むアミノ酸配列を有する。場合によっては、修飾ＩＬ－２シグナルペプチドは、配列番号：３１～３３からなる群から選択されるＤＮＡ配列によってコードされる。
［発現ベクターとＲＮＡコンストラクトの産生］
ここに提供されるのは、（ｉ）目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡと（ｉｉ）標的ｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む組換えＲＮＡコンストラクトをコードする組換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物である。例えば、目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントでありうる。例えば、標的ｍＲＮＡは、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＰＩＧＦ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、ＭＭＰ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－Ｍｙｃでありうる。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。更にここに提供されるのは、ここに記載のＲＮＡコンストラクト、例えば、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を低下させることができる遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結されたサイトカインをコードする第一のＲＮＡを含むＲＮＡコンストラクトをコードする組換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物である。例えば、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントでありうる。例えば、腫瘍増殖又は血管新生に関連する遺伝子は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＰＩＧＦ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、ｃ－Ｍｙｃ、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントでありうる。ＶＥＧＦＡのアイソフォームの非限定的な例には、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１４８、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５Ｂ、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、Ｌ－ＶＥＧＦ１２１、Ｌ－ＶＥＧＦ１６５、Ｌ－ＶＥＧＦ１８９、Ｌ－ＶＥＧＦ２０６、アイソフォーム１５、アイソフォーム１６、アイソフォーム１７、及びアイソフォーム１８が含まれる。例えば、免疫系による認識に関連する遺伝子は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、ＭＭＰ、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントでありうる。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトをコードする組換えポリ核酸コンストラクトは、１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡ種をコードしうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトをコードする組換えポリ核酸コンストラクトは、標的ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ種をコードしうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトをコードする組換えポリ核酸コンストラクトは、それぞれ標的ｍＲＮＡに向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードしうる。関連する態様では、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、同じ配列、異なる配列、又はそれらの組み合わせを含みうる。例えば、組換えＲＮＡコンストラクトをコードする組換えポリ核酸コンストラクトは、それぞれ標的ｍＲＮＡの同じ領域又は配列に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードしうる。例えば、組換えＲＮＡコンストラクトをコードする組換えポリ核酸コンストラクトは、それぞれ標的ｍＲＮＡの異なる領域又は配列に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードしうる。幾つかの態様では、組換えＲＮＡコンストラクトをコードする組換えポリ核酸コンストラクトは、３つのｓｉＲＮＡ種のそれぞれが異なる標的ｍＲＮＡに向けられた３つのｓｉＲＮＡ種をコードしうる。幾つかの実施態様では、標的ｍＲＮＡは、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＰＩＧＦ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ１７、ＭＭＰ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡでありうる。関連する態様では、組換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号：８２～９８からなる群から選択される配列を含みうる。
ここに記載のポリ核酸コンストラクトは、ＤＮＡ鎖の化学合成、ＰＣＲ、又はギブソンアセンブリー法など、当該技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。化学合成又はＰＣＲ法若しくはギブソンアセンブリー法の組み合わせによってポリ核酸コンストラクトを構築する利点は、融合タンパク質が宿主細胞において高レベルで発現されることを確実にするためにコドンを最適化できることである。コドン最適化とは、天然配列の少なくとも一つのコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、又はそれ以上のコドン）を、天然アミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞における発現のために核酸配列を改変するプロセスを指しうる。コドン使用表は、例えば「コドン使用データベース」で容易に入手でき、これらの表は多くの方法で適合させることができる。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズム、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）（Ａｐｔａｇｅｎ，ＰＡ）及びＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｒ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ，ＭＡ）なども利用可能である。ひとたび得られたポリヌクレオチドは、適切なベクターに組み込むことができる。ここで使用されるベクターは、インビボ又はインビトロでの核酸の取り込み、増殖、発現又は伝達のための天然に存在するか又は合成的に生成されたコンストラクト、例えば、プラスミド、ミニサークル、ファージミド、コスミド、人工染色体／ミニ染色体、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどのウイルス、バクテリオファージを指しうる。ベクターを構築するために使用される方法は、当業者に周知であり、様々な刊行物に記載されている。特に、プロモーター、エンハンサー、終結及びポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点、及びスプライシングシグナルなどの機能的及び調節性成分の記述を含む、適切なベクターを構築するための技術は、当業者に知られている。様々なベクターが当該技術分野でよく知られており、幾つかは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）；Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；又はＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）などの会社から市販されている。インビトロ転写のためのベクターの非限定的な例には、ｐＴ７ＣＦＥ１－ＣＨｉｓ、ｐＭＸ（ｐＭＡ－Ｔ、ｐＭＡ－ＲＱ、ｐＭＣ、ｐＭＫ、ｐＭＳ、ｐＭＺなど）、ｐＥＶＬ、ｐＳＰ７３、ｐＳＰ７２、ｐＳＰ６４、及びｐＧＥＭ（ｐＧＥＭ（登録商標）－４Ｚ、ｐＧＥＭ（登録商標）－５Ｚｆ（＋）、ｐＧＥＭ（登録商標）－１１Ｚｆ（＋）、ｐＧＥＭ（登録商標）－９Ｚｆ（－）、ｐＧＥＭ（登録商標）－３Ｚｆ（＋／－）、ｐＧＥＭ（登録商標）－７Ｚｆ（＋／－）など）が含まれる。場合によっては、組換えポリ核酸コンストラクトはＤＮＡでありうる。
ここに記載のポリ核酸コンストラクトは、環状又は線状でありうる。例えば、環状ポリ核酸コンストラクトは、ｐＭＸ、ｐＭＡ－Ｔ、ｐＭＡ－ＲＱ、又はｐＴ７ＣＦＥ１－ＣＨｉｓなどのベクター系を含みうる。例えば、線状ポリ核酸コンストラクトは、ｐＥＶＬなどの線状ベクター又は線状化されたベクターを含みうる。場合によっては、組換えポリ核酸コンストラクトは、プロモーターを更に含みうる。場合によっては、プロモーターは、第一のＲＮＡをコードする配列又は第二のＲＮＡをコードする配列の上流に存在しうる。プロモーターの非限定的な例には、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｐ６０、Ｓｙｎ５、及びＫＰ３４が含まれうる。場合によっては、ここに提供される組換えポリ核酸コンストラクトは、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号：１８）を含む配列を含むＴ７プロモーターを含みうる。場合によっては、組換えポリ核酸コンストラクトは、コザック配列をコードする配列を更に含む。コザック配列とは、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸配列モチーフを指しうる。コザック配列は、例えば、出典明示によりその全体がここに援用される、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ ２９９（１－２）：１－３４による文献に詳細に記載されている。幾つかの実施態様では、組換えポリ核酸コンストラクトは、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号：１９）を含む配列を含むコザック配列をコードする配列を含む。場合によっては、ここに記載の組換えポリ核酸コンストラクトは、コドン最適化されうる。
ここに提供されるのは、標的ＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡをコードする一又は複数の核酸配列と、目的の遺伝子をコードする一又は複数の核酸配列とを含む、ここに記載のＲＮＡコンストラクトをコードする組換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物であり、ここで、標的ＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子によってコードされるイントロン配列の一部ではない。場合によっては、目的の遺伝子は、ＲＮＡスプライシングなしで発現される。場合によっては、標的ＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡのエクソンに結合する。場合によっては、標的ＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡは、一つの標的ＲＮＡに特異的に結合する。場合によっては、組換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号：８２～９８からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含みうる。
ここに提供されるのは、ここに記載のＲＮＡコンストラクト組成物を産生する方法である。例えば、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、目的の遺伝子をコードする少なくとも一つの核酸配列、標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡをコードする少なくとも一つの核酸配列、及びポリ（Ａ）テールをコードする核酸配列を含むポリ核酸コンストラクトからのインビトロ転写によって産生されうる。インビトロ転写反応は、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）の混合物、及び／又はキャッピング酵素を更に含みうる。インビトロ転写を使用するＲＮＡの産生並びに転写されたＲＮＡの単離及び精製の詳細は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｂｅｃｋｅｒｔ及びＭａｓｑｕｉｄａ（（２０１１）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｂｙ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＲＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），ｖｏｌ７０３．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に見出すことができる。インビトロ転写キットの非限定的なリストには、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴＭＴ３転写キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴＭＳＰ６転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔＴＭＴ３転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔＴＭＴ７転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔＴＭＳＰ６転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔＴＭＴ７／Ｔ３転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔＴＭＳＰ６／Ｔ７転写キット、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥＴＭＴ３転写キット、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥＴＭＴ７転写キット、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥＴＭＳＰ６転写キット、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴＭＴ７転写キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７高収率ＲＮＡ合成キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７インビトロ転写キット、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７－ＦｌａｓｈＴＭ転写キット、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７高収率転写キット、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７－ＦｌａｓｈＴＭビオチン－ＲＮＡ転写キット、Ｔ７転写キット、高収率Ｔ７ ＲＮＡ合成キット、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット等々が含まれる。
インビトロ転写反応は、転写緩衝系、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、及びＲＮａｓｅ阻害剤を更に含みうる。幾つかの実施態様では、転写緩衝系は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びマグネシウムイオンを含みうる。ＮＴＰは、天然に存在するか又は非天然の（改変された）ＮＴＰでありうる。非天然の（改変された）ＮＴＰの非限定的な例には、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、プソイドウリジン、Ｎ１－エチルプソイドウリジン、Ｎ１－メトキシメチルプソイドウリジン、Ｎ１－プロピルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－メトキシウリジン、５－メチルウリジン、５－カルボキシメチルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、６－アザウリジン、チエノウリジン、３－メチルウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、５－メチルシチジン、５－メトキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－ヨードシチジン、５－ブロモシチジン、２－チオシチジン、５－アザシチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、Ｎ１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－メチル－２－アミノアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンが含まれる。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例には、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｐ６０、Ｓｙｎ５、及びＫＰ３４ ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。幾つかの実施態様では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｐ６０ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼ、及びＫＰ３４ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。
ここに記載の転写されたＲＮＡは、インビトロ転写反応混合物から単離され精製されうる。例えば、転写されたＲＮＡは、カラム精製を使用して単離され精製されうる。インビトロ転写反応混合物からの転写されたＲＮＡの単離及び精製の詳細は、当該技術分野で周知であり、任意の市販のキットを使用することができる。ＲＮＡ精製キットの非限定的なリストには、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐキット、ＥａｓｙＰｕｒｅ（登録商標）ＲＮＡ精製キット、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ等々が含まれる。
［治療への応用］
ここに提供されるのは、がんの治療に有用な組成物である。幾つかの態様では、組成物は、疾患又は状態を治療し又は予防するのに十分な量で存在し又は投与される。ここに提供されるのは、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を低下させることができる遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結されたサイトカインをコードする第一のＲＮＡを含む組成物である。幾つかの実施態様では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントを含みうる。幾つかの実施態様では、腫瘍増殖又は血管新生に関連する遺伝子の発現を低下させることができる遺伝要素は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＰＩＧＦ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、ｃ－Ｍｙｃ、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントを標的とするｓｉＲＮＡを含みうる。幾つかの実施態様では、免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を低下させることができる遺伝要素は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、ＭＭＰ、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントを標的とするｓｉＲＮＡを含みうる。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。
またここに提供されるのは、ここに記載の任意のＲＮＡ組成物と薬学的に許容される添加物とを含む薬学的組成物である。薬学的組成物は、治療有効量の活性薬学的成分を、それを必要とする対象に投与される一又は複数種の薬学的に許容される添加物と共に含む混合物又は溶液を意味しうる。「薬学的に許容される」という用語は、一般に安全で非毒性であり、生物学的にも他の形でも望ましくないものではなく、動物用並びにヒトの薬学的使用に許容される薬学的組成物の調製に有用な物質の属性を意味する。「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性又は特性を無効にせず、比較的非毒性である、担体又は希釈剤などの物質を指し得、すなわち、該物質は、それが含まれている組成物の成分の何れかと有害な方法で相互作用するか又は望ましくない生物学的影響を生じさせることなく個体に投与されうる。薬学的に許容される添加物は、医薬製品の製剤化に使用される崩壊剤、結合剤、増量剤、溶媒、緩衝剤、等張化剤、安定剤、抗酸化剤、界面活性剤、担体、希釈剤、添加物、保存料又は潤滑剤など、治療活性を有しておらず、投与対象に対して非毒性である薬学的組成物中の任意の薬学的に許容される成分を意味しうる。薬学的組成物は、生物への化合物の投与を容易にし得、薬学的に使用できる製剤への活性化合物のプロセシングを容易にする一又は複数の薬学的に許容される不活性成分を使用して、常套的な方法で製剤化されうる。適切な製剤は、選択した投与経路に依存し、薬学的組成物の要約は、例えば、出典明示によりここに援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９版（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．及びＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，７版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｌｋｉｎｓ １９９９）に見出されうる。幾つかの実施態様では、薬学的組成物は、患部組織又は患部細胞への注射のために、活性物質（例えば、ここに記載の組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクト）を水溶液に溶解することによって製剤化することができる。幾つかの実施態様では、薬学的組成物は、患部組織又は患部細胞への直接注射のために、活性物質（例えば、ここに記載の組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクト）を水溶液に溶解することによって製剤化することができる。幾つかの実施態様では、患部組織又は患部細胞は、腫瘍又は腫瘍細胞を含む。
またここに提供されるのは、がんを有する対象に治療有効量のここに記載の組成物又は薬学的組成物を投与することを含む、治療を必要とする対象においてがんを治療する方法である。ここで使用される「有効量」又は「治療有効量」という用語は、治療される疾患又は状態の症状の一又は複数をある程度軽減し；例えば、疾患の一又は複数の徴候、症状、又は原因を減少及び／又は軽減し、又は生物系の他の任意の所望される変化を生じさせる、投与される薬剤又は化合物の十分な量を指す。例えば、治療用途の「有効量」は、一又は複数の疾患症状を臨床的に有意に減少させる薬剤の量でありうる。適切な「有効」量は、個々の例で、用量漸増試験などの技術を使用して決定することができる。
ここで使用される「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」又は「治療（treatment）」という用語は、疾患又は状態の少なくとも一つの症状を緩和させ、軽減させ又は寛解させること、例えば疾患又は状態の発症を停止させること、疾患又は状態を軽減させること、疾患又は状態の退行を生じさせること、疾患又は状態によって引き起こされる状態を軽減させること、又は疾患又は状態の症状を予防的及び／又は治療的に停止させることを含む。幾つかの実施態様では、疾患又は状態を治療することは、患部組織又は患部細胞のサイズを縮小させることを含む。幾つかの実施態様では、対象の疾患又は状態を治療することは、対象の生存期間を増加させることを含む。幾つかの実施態様では、疾患又は状態を治療することは、疾患の重症度を低減させ又は改善すること、疾患の発症を遅らせること、疾患の進行を阻害すること、対象の入院又は入院期間を短縮させること、対象の生活の質を改善すること、疾患に関連する症状の数を減らすこと、疾患に関連する症状の重症度を軽減し又は改善すること、疾患に関連する症状の期間を短縮させること、疾患に関連する症状の再発を防止すること、疾患の発症又は症状の発症を阻害すること、又は疾患に関連する症状の進行の阻害することを含む。幾つかの実施態様では、がんを治療することは、腫瘍のサイズを縮小させること、又はがんを有する患者の生存期間を増加させることを含む。
場合によっては、対象は哺乳動物を包含しうる。哺乳動物の例には、限定されないが、哺乳動物クラスの任意のメンバー：ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー及び他の類人猿及びサル種；家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；飼育動物、例えばウサギ、イヌ、及びネコ；齧歯類を含む実験動物、例えばラット、マウス、及びモルモット等々が含まれる。場合によっては、哺乳動物はヒトである。場合によっては、対象は動物でありうる。場合によっては、動物はヒト及び非ヒト動物を含みうる。一実施態様では、非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、ラット又はマウスなどの齧歯類でありうる。別の実施態様では、非ヒト動物はマウスでありうる。場合によっては、対象は哺乳動物である。場合によっては、対象はヒトである。場合によっては、対象は成人、子供、又は幼児である。場合によっては、対象はコンパニオンアニマルである。場合によっては、対象はネコ、イヌ、又は齧歯類である。場合によっては、対象はイヌ又はネコである。
ここに更に提供されるのは、がんを有する対象にここに記載の組成物又は薬学的組成物を投与することを含む、がんを治療する方法である。場合によっては、がんは固形腫瘍である。場合によっては、固形腫瘍には、限定されないが、乳がん、肺がん、肝臓がん、神経膠芽腫、メラノーマ、頭頸部扁平上皮癌、腎細胞癌、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、膀胱がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、中皮腫、非小細胞肺がん、非メラノーマ皮膚がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、小細胞肺がん、結腸直腸がん、及び甲状腺がんが含まれうる。幾つかの実施態様では、固形腫瘍には、肉腫、癌腫、又はリンパ腫が含まれうる。幾つかの実施態様では、固形腫瘍は良性又は悪性でありうる。
場合によっては、がんは頭頸部がんである。如何なる理論にも拘束されることを望まないが、頭頸部がんは、世界で６番目に多いがんであり、固形腫瘍の６％を占める。毎年約６５００００人の新規患者が頭頸部がんと診断されており、先進治療オプションが利用できるにも拘わらず、世界中で毎年３５００００人が死亡し、米国では１２０００人が死亡している。頭頸部がんを発症する可能性を高める危険因子には、喫煙及び／又はアルコール摂取、長時間の日光曝露（例えば、唇の領域又は頭頸部の皮膚）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、性別（例えば、男性対女性）、年齢（例えば、４０歳を超える人々は高リスク）、口腔と歯の衛生状態の悪さ、及び環境又は職業上の吸入物質（例えば、アスベスト、木材粉塵、塗料煙、及び他のある種の化学物質）、マリファナの使用、栄養不良、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）及び喉頭咽頭逆流症（ＬＰＲＤ）、弱体化した免疫系、放射線被曝、頭頸部がんの既往歴が含まれる。喫煙は、頭頸部がんの第一位の危険因子であり、紙巻煙草、葉巻、又はパイプ喫煙；噛み煙草；嗅ぎ煙草；及び副流煙を含む。頭頸部がんの約８５％は喫煙に関連しており、喫煙の量が予後に影響を与える場合がある。加えて、頭頸部がんのほぼ２５％がＨＰＶ陽性である。
頭頸部がんは、副鼻腔、鼻腔、口腔、咽頭、及び喉頭を含む上部気道消化管の上皮性悪性腫瘍を含みうる。頭頸部がんの非限定的な例には、喉頭がん、下咽頭がん、扁桃腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻咽頭癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、口唇がん、口腔がん、口腔がん、中咽頭がん、唾液腺がん、脳腫瘍、食道がん、眼がん、副甲状腺がん、頭頸部の肉腫、及び甲状腺がんが含まれる。ここに記載の頭頸部がんは、上部気道消化管に位置しうる。上部気道消化管の非限定的な例には、副鼻腔、鼻腔、口腔、唾液腺、舌、鼻咽頭、中咽頭、下咽頭、及び喉頭が含まれる。
幾つかの実施態様では、がんは、頭頸部がん、メラノーマ、及び腎細胞癌からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、がんは頭頸部がんである。幾つかの実施態様では、頭頸部がんは頭頸部扁平上皮癌である。幾つかの実施態様では、頭頸部がんは、喉頭がん、下咽頭がん、扁桃腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻咽頭がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、口唇がん、口腔がん、中咽頭がん、唾液腺がん、脳腫瘍、食道がん、眼がん、副甲状腺がん、頭頸部の肉腫、又は甲状腺がんである。幾つかの実施態様では、がんはメラノーマである。幾つかの実施態様では、がんは腎細胞癌である。
ここに記載のがんの早期治療には、腫瘍の外科的切除、放射線療法、薬剤を使用する療法、例えば化学療法、標的療法、免疫療法、又はそれらの組み合わせが含まれうる。標的療法は、がんの増殖と生存に寄与する可能性のある特定の遺伝子、タンパク質、又は組織環境を標的とする治療法であり、該治療法は、健康な細胞への損傷を制限しながら、がん細胞の増殖と広がりを阻止するようにデザインされている。頭頸部がんの場合、抗体を使用する標的療法を使用して、細胞増殖、腫瘍増殖又は成長を阻害し、又は腫瘍の血管新生を抑制することができる。免疫療法は、がんと闘う免疫系機能を改善させ、標的化し、又は回復させることができる治療法である。抗体の非限定的な例には、抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体及び抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）抗体が含まれる。がん免疫療法の非限定的な例には、免疫系モジュレーター、Ｔ細胞移入療法、免疫チェックポイント阻害剤、及びモノクローナル抗体が含まれる。免疫系モジュレーターは、がんに対する免疫応答を高めることができ、インターロイキン及びインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）などのサイトカインが含まれる。Ｔ細胞移入療法は、エクスビボ操作のためにがん患者から免疫細胞を採取し、同じ患者に注入して戻す治療法を指しうる。例えば、免疫細胞は、腫瘍認識リンパ球を特異的に増殖させるため（例えば、腫瘍浸潤リンパ球療法）、又は腫瘍抗原を特異的に認識するキメラ抗原受容体を発現するように細胞を改変するために（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法）、がん患者から採取される。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントをブロックして、がん細胞に対する免疫応答を回復させ又は許容しうる。免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例には、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）阻害剤、プログラム死タンパク質１（ＰＤ１）阻害剤、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質－４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤が含まれる。モノクローナル抗体は、特定の標的タンパク質に結合して、がん細胞内の標的タンパク質の活性をブロックするようにデザインできる（例えば、抗ＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦなど）。
がんにおいて、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、又はＩＬ－７など）の発現を増加させて免疫応答を増強しながら、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関与する遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＰＩＧＦ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、ＭＭＰ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－Ｍｙｃなど）の発現を低下させることは、治療効果をもたらしうる。一例では、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）細胞などのがん細胞の増殖速度を低下させることができるＩＬ－２の発現を増加させることができる。ＩＬ－２は、リンパ球の活動を調節するサイトカインであり、強力なＴ細胞増殖因子である。ＩＬ－２は、抗原で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、又は活性化された樹状細胞によって産生され、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の維持と分化にとって重要である。如何なる理論にも拘束されることを望むものではないが、局所ＩＬ－２療法は、腫瘍内又は腫瘍付近の血流及びリンパドレナージュの停滞を引き起こし得、腫瘍壊死及び血栓症を引き起こす。別の例では、腫瘍周囲の血管新生を促進しうるＶＥＧＦの発現を低下させて、腫瘍の増殖に必要とされる血液の供給を遮断することができる。ここに記載のＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、又はＰＩＧＦを含む任意のＶＥＧＦファミリーメンバーでありうる。ＶＥＧＦＡアイソフォームの非限定的な例には、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１４８、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５Ｂ、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、Ｌ－ＶＥＧＦ１２１、Ｌ－ＶＥＧＦ１６５、Ｌ－ＶＥＧＦ１８９、Ｌ－ＶＥＧＦ２０６、アイソフォーム１５、アイソフォーム１６、アイソフォーム１７、及びアイソフォーム１８が含まれる。更に別の例では、腫瘍細胞によって発現される細胞表面糖タンパク質であるＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ（ＭＩＣＡ／Ｂ）の発現を減少させて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞の免疫応答を回復させ、腫瘍退縮を促進することができる。ＭＩＣＡ／Ｂは、ＮＫ細胞とリンパ球上に発現されるナチュラルキラー群２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体によって認識され、腫瘍細胞の認識と除去を促進する。がん細胞は、細胞表面からＭＩＣＡ／Ｂを脱落させてＮＫＧ２Ｄ認識を損なわせることにより、免疫監視を回避しうる。がん細胞は、腫瘍増殖及び低酸素（ＮＫＧ２Ｄ内部移行を誘導しうる）の間にＮＫＧＤ２受容体に結合することができ、免疫応答を回避し、ＮＫ細胞による免疫監視を損なうＭＩＣＡ／Ｂの可溶型をまた放出しうる。細胞表面からのＭＩＣＡ／Ｂの脱落又は放出は、膜タンパク質の脱落に関与するタンパク質の発現を阻害又は減少させることによってブロックされうる。脱落に関与するタンパク質の例には、限定されないが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）が含まれる。ＭＭＰの非限定的な例には、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、及びＭＭＰ１９が含まれる。細胞表面からのＭＩＣＡ／Ｂの脱落又は放出は、ジスルフィドイソメラーゼＥＲｐ５などの脱落に関与するタンパク質を調節する因子の発現を阻害し又は低減させることによってもまたブロックされうる。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、対象におけるがんを治療する方法であって、該方法は、目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡと標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡとを含む、ここに記載のＲＮＡ組成物又は薬学的組成物を対象に投与することを含む。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、がんの治療のための方法において使用するための、目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡと標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡとを含む、ここに記載の任意のＲＮＡ組成物又は薬学的組成物である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、がんを治療するための医薬の製造における、目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡと標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡとを含む、ここに記載のＲＮＡ組成物又は薬学的組成物の使用である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、対象におけるがんを治療するための、目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡと標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡとを含む、ここに記載のＲＮＡ組成物又は薬学的組成物の使用である。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＰＩＧＦ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、ｃ－Ｍｙｃ、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントに結合することができる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＩＣＡとＭＩＣＢの両方（ＭＩＣＡ／Ｂ）、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、ＭＭＰ、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントに結合することができる。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。幾つかの実施態様では、目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡは、サイトカインをコードする。幾つかの実施態様では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントである。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、対象におけるがんを治療する方法であって、該方法は、ＶＥＧＦＡ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－Ｍｙｃに結合することができるｓｉＲＮＡと、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、又はＩＬ－７をコードするｍＲＮＡとを含む、ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物を対象に投与することを含む。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、がんの治療のための方法において使用するための、ＶＥＧＦＡ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－Ｍｙｃに結合することができるｓｉＲＮＡと、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、又はＩＬ－７をコードするｍＲＮＡとを含む、ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、がんを治療するための医薬の製造における、ＶＥＧＦＡ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－Ｍｙｃに結合することができるｓｉＲＮＡと、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、又はＩＬ－７をコードするｍＲＮＡとを含む、ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物の使用である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、対象におけるがんを治療するための、ＶＥＧＦＡ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－Ｍｙｃに結合することができるｓｉＲＮＡと、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、又はＩＬ－７をコードするｍＲＮＡとを含む、ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物の使用である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、対象におけるがんを治療する方法であり、該方法は、ＶＥＧＦＡアイソフォームのｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡと、ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡとを含む、ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物を対象に投与することを含む。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、対象におけるがんを治療する方法であって、該方法は、ＰＩＧＦ ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡと、ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡとを含む、ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物を対象に投与することを含む。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、対象におけるがんを治療する方法であり、該方法は、ＭＩＣＡ又はＭＩＣＢのｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡと、ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡとを含む、ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物を対象に投与することを含む。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、対象におけるがんを治療する方法であり、該方法は、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ１７、又はＭＭＰのｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡと、ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡとを含む、ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物を対象に投与することを含む。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、対象におけるがんを治療する方法であり、該方法は、ＶＥＧＦＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡと、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、又はＩＬ－１５をコードするｍＲＮＡとを含む、ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物を対象に投与することを含む。
幾つかの態様では、それを必要とする対象に投与される組成物又は薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－２ ｍＲＮＡと（ｉｉ）ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む、組換えＲＮＡコンストラクトを含む。関連する態様では、ポリ核酸コンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、又は５つのｓｉＲＮＡをコードするか又はそれを含む。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに向けられた一つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに向けられた、少なくとも３つ又は少なくとも５つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、少なくとも３つ又は少なくとも５つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じか、異なるか、又はそれらの組み合わせである。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１～４又は１２５～１２８（Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．４）に示される配列を含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：５（Ｃｐｄ．５）、配列番号：７（Ｃｐｄ．７）、配列番号：８（Ｃｐｄ．８）、配列番号：９（Ｃｐｄ．９）、配列番号：１０（Ｃｐｄ．１０）、配列番号：１２９（Ｃｐｄ．５）、配列番号：１３１（Ｃｐｄ．７）、配列番号：１３２（Ｃｐｄ．８）、配列番号：１３３（Ｃｐｄ．９）、又は配列番号：１３４（Ｃｐｄ．１０）に示される配列を含みうる。
幾つかの態様では、それを必要とする対象に投与される組成物又は薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－２ ｍＲＮＡと（ｉｉ）ＰＩＧＦ ｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む、組換えＲＮＡコンストラクトを含む。関連する態様では、ポリ核酸コンストラクトは、少なくとも１つ、２つ、又は３つのｓｉＲＮＡをコードするか又はそれを含む。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＰＩＧＦ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＰＩＧＦ ｍＲＮＡに向けられた、少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じか、異なるか、又はそれらの組み合わせである。
幾つかの態様では、それを必要とする対象に投与される組成物又は薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－２ ｍＲＮＡと（ｉｉ）ＶＥＧＦＡアイソフォームのｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む、組換えＲＮＡコンストラクトを含む。関連する態様では、ポリ核酸コンストラクトは、少なくとも１つ、２つ、又は３つのｓｉＲＮＡをコードするか又はそれを含む。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＶＥＧＦＡアイソフォームのｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡアイソフォームのｍＲＮＡに向けられた、少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じか、異なるか、又はそれらの組み合わせである。
幾つかの態様では、それを必要とする対象に投与される組成物又は薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－２ ｍＲＮＡと（ｉｉ）ＭＩＣＡ又はＭＩＣＢ ｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む、組換えＲＮＡコンストラクトを含む。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１つ、２つ、又は３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＭＩＣＡ又はＭＩＣＢ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＭＩＣＡ又はＭＩＣＢ ｍＲＮＡに向けられた、少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じか、異なるか、又はそれらの組み合わせである。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１～４又は１２５～１２８（Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．４）に示される配列を含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：６又は配列番号：１３０（Ｃｐｄ．６）に示される配列を含みうる。
幾つかの態様では、それを必要とする対象に投与される組成物又は薬学的組成物は、（ｉｉ）ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ１７、又はＭＭＰのｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む、組換えＲＮＡコンストラクトを含む。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１つ、２つ、又は３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ１７、又はＭＭＰのｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＥＲｐ５、ＡＤＡＭ１７、又はＭＭＰのｍＲＮＡに向けられた、少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じか、異なるか、又はそれらの組み合わせである。
幾つかの態様では、それを必要とする対象に投与される組成物又は薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－２ ｍＲＮＡと（ｉｉ）ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、及び／又はＣＤＫ６のｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む、組換えＲＮＡコンストラクトを含む。関連する態様では、ポリ核酸コンストラクトは、少なくとも１つ、２つ、又は３つのｓｉＲＮＡをコードするか又はそれを含む。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＤＨ１ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＣＤＫ４ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＣＤＫ６ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＤＨ１ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、ＣＤＫ４ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、及びＣＤＫ６ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＤＨ１ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＣＤＫ４ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＣＤＫ６ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じか、異なるか、又はそれらの組み合わせである。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１１又は配列番号：１３５（Ｃｐｄ．１１）に示される配列を含みうる。
幾つかの態様では、それを必要とする対象に投与される組成物又は薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－２ ｍＲＮＡと（ｉｉ）ＧＦＲ、ｍＴＯＲ、及び／又はＫＲＡＳのｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む、組換えＲＮＡコンストラクトを含む。関連する態様では、ポリ核酸コンストラクトは、少なくとも１つ、２つ、又は３つのｓｉＲＮＡをコードするか又はそれを含む。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、及びＫＲＡＳ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＥＧＦＲ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがｍＴＯＲ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＫＲＡＳ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じか、異なるか、又はそれらの組み合わせである。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１２（Ｃｐｄ．１２）、配列番号：１３（Ｃｐｄ．１３）、配列番号：１４（Ｃｐｄ．１４）、配列番号：１３６（Ｃｐｄ．１２）、配列番号：１３７（Ｃｐｄ．１３）、又は配列番号：１３８（Ｃｐｄ．１４）に示される配列を含みうる。
幾つかの態様では、それを必要とする対象に投与される組成物又は薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－１５ ｍＲＮＡと（ｉｉ）ＶＥＧＦＡ及び／又はＣＤ１５５のｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む、組換えＲＮＡコンストラクトを含む。関連する態様では、ポリ核酸コンストラクトは、少なくとも１つ、２つ、又は３つのｓｉＲＮＡをコードするか又はそれを含む。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＣＤ１５５ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡとＣＤ１５５ ｍＲＮＡに向けられた２つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＣＤ１５５ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じか、異なるか、又はそれらの組み合わせである。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１５又は１３９（Ｃｐｄ．１５）に示される配列を含みうる。
幾つかの態様では、それを必要とする対象に投与される組成物又は薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－１５ ｍＲＮＡと（ｉｉ）ＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む、組換えＲＮＡコンストラクトを含む。関連する態様では、ポリ核酸コンストラクトは、少なくとも１つ、２つ、又は３つのｓｉＲＮＡをコードするか又はそれを含む。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、及びｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じか、異なるか、又はそれらの組み合わせである。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１６又は１４０（Ｃｐｄ．１６）に示される配列を含みうる。
幾つかの態様では、それを必要とする対象に投与される組成物又は薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－７ ｍＲＮＡと（ｉｉ）ＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡに結合することができる少なくとも一つのｓｉＲＮＡとを含む、組換えＲＮＡコンストラクトを含む。関連する態様では、ポリ核酸コンストラクトは、少なくとも１つ、２つ、又は３つのｓｉＲＮＡをコードするか又はそれを含む。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡに向けられた少なくとも３つのｓｉＲＮＡを含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じか、異なるか、又はそれらの組み合わせである。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１７又は１４１（Ｃｐｄ．１７）に示される配列を含みうる。
ここに記載の組換えＲＮＡコンストラクト組成物は、併用療法として投与されうる。二種以上の治療剤又は治療法との併用療法では、異なる作用機序によって作用する薬剤及び治療法が使用されうる。異なる作用機序を持つ薬剤又は治療法を使用する併用療法は、相加効果又は相乗効果をもたらす可能性がある。併用療法は、単剤療法で使用されるよりも各薬剤の低用量を可能にし、それによって毒性の副作用を低減し、及び／又は薬剤の治療指数を増加させる。併用療法は、耐性がん細胞が発生する可能性を減らすことができる。場合によっては、併用療法は、免疫応答に影響を与える（例えば、応答を増強し又は活性化する）治療剤又は治療法と、腫瘍／がん細胞に影響を与える（例えば、阻害し又は死滅させる）治療薬とを含む。場合によっては、併用療法は、（ｉ）ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物と；（ｉｉ）腫瘍の外科的切除、放射線療法、化学療法、標的療法、及び免疫療法から選択される一又は複数種の追加療法を含みうる。幾つかの実施態様では、ここに記載の組換えＲＮＡ組成物又は薬学的組成物は、併用療法のための一又は複数種の追加の療法の投与前、投与と同時に、及び／又は投与に続いて、がんを有する対象に投与されうる。幾つかの実施態様では、一又は複数種の追加の療法は、１、２、３、又はそれ以上の追加の治療剤又は療法を含む。
ここに記載の組成物及び薬学的組成物は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して対象に投与することができる。本発明での使用に適した製剤及び送達方法は、一般に当該技術分野でよく知られている。例えば、ここに記載の組成物は、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、結腸性、直腸性、又は腹腔内を含む様々な方法で対象に投与されうる。幾つかの実施態様では、ここに記載の組成物は、対象へ注射によって投与される。例えば、ここに記載の組成物は、対象の腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、腫瘍内注射、又は静脈内注射によって投与されうる。幾つかの実施態様では、ここに記載の組成物は、対象の患部臓器又は患部組織への注射によって投与されうる。幾つかの実施態様では、ここに記載の組成物は、対象の腫瘍又はがん細胞への注射によって投与されうる。幾つかの実施態様では、ここに記載の組成物は、非経口、静脈内、筋肉内又は経口で投与されうる。
ここに記載の組成物及び薬学的組成物の何れも、使用説明書と共に提供されうる。使用説明書は、本発明に従ってここに記載の疾患又は障害（例えば、頭頸部がんなどのがん）をどのように治療（又は予防）するかについての、当業者又は主治医のためのガイダンスを含みうる。幾つかの実施態様では、使用説明書は、ここに記載の送達／投与様式及び送達／投与レジメンそれぞれに関するガイダンス（例えば、送達／投与の経路、投与計画、送達／投与の時間、送達／投与の頻度など）を含みうる。幾つかの実施態様では、使用説明書は、本発明の組成物がどのように投与又は注射されるべきか、及び／又は投与又は注射のためにどのように調製されるかについての説明を含みうる。原理上、それぞれ送達／投与様式及び送達／投与レジメンに関して本明細書の他の場所に記載されていることは、使用説明書におけるそれぞれの説明として含まれうる。
ここに記載の組成物及び薬学的組成物は、遺伝子治療に使用することができる。所定の実施態様では、ここに記載の組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物は、遺伝子治療ベクターで細胞に送達することができる。遺伝子治療ベクター及び遺伝子送達の方法は、当該技術分野で周知である。これらの方法の非限定的な例には、細胞への送達後にエピソーム又は組み込みゲノムの何れかを有する、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含むウイルスベクター送達系、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクルと複合化した核酸、トランスポゾン系（宿主ゲノムへの送達及び組込み用；Ｍｏｒｉａｒｉｔｙ等（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１（８），ｅ９２、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ等，（２０１１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０（Ｒ１），Ｒ１４－Ｒ２０）を含む非ウイルスベクター送達系、レトロウイルス媒介ＤＮＡ導入（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳房腫瘍ウイルス；例えば、Ｋａｙ等（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２，１１７－１１９，Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，８０８－８１３を参照）、及びアデノウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス及びアデノ随伴ウイルスを含むＤＮＡウイルス媒介ＤＮＡ導入（例えば、Ａｌｉ等（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １，３６７－３８４）が含まれる。ウイルスベクターには、限定されないが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、及び単純ヘルペスウイルスベクターがまた含まれる。宿主ゲノムに組み込むことができるベクターには、限定されないが、レトロウイルス又はレンチウイルスが含まれる。
幾つかの実施態様では、ここに記載の組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物は、直接のＤＮＡ導入を介して細胞に送達することができる（Ｗｏｌｆｆ等（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１４６５－１４６８）。組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、細胞を一時的に透過性にする細胞膜の穏やかな機械的破壊に続いて細胞に送達されうる。このような膜の穏やかな機械的破壊は、小さな開口部から細胞を静かに押し出すことで達成されうる（Ｓｈａｒｅｉ等 ＰＬＯＳ ＯＮＥ（２０１５）１０（４），ｅ０１１８８０３）。別の実施態様では、ここに記載の組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物は、リポソーム媒介ＤＮＡ導入を介して細胞に送達されうる（例えば、Ｇａｏ及びＨｕａｎｇ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０－２８５，Ｃｒｙｓｔａｌｌ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１，１５－１７、Ｃａｐｌｅｎ等（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３，３９－４６）。リポソームは、封入された脂質二重層又は凝集体の生成によって形成される、様々な単層及び多層の脂質ビヒクルを包含しうる。組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、リポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に関連する連結分子を介してリポソームに結合され、リポソームに捕捉され、又はリポソームと複合体が形成される。
［遺伝子発現の調節］
ここに提供されるのは、ここに記載の任意の組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞内の単一のＲＮＡ転写物からｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡを同時に発現させる方法である。ここに更に提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡをコードするか又は含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡが目的の遺伝子をコードし、第二のＲＮＡが、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；標的ｍＲＮＡは、目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとは異なり、標的ｍＲＮＡと目的の遺伝子の発現が同時に調節される。場合によっては、ここで使用されるポリ核酸、遺伝子、ＤＮＡ、又はＲＮＡの発現とは、ポリ核酸、遺伝子、ＤＮＡ、又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳を指しうる。場合によっては、ポリ核酸、目的の遺伝子などの遺伝子、ＤＮＡ、又は標的ｍＲＮＡなどのＲＮＡの発現を調節、増加、アップレギュレート、減少又はダウンレギュレートすることは、ここで使用される場合、ポリ核酸、目的の遺伝子などの遺伝子、ＤＮＡ、又は標的ｍＲＮＡなどのＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを、ポリ核酸、目的の遺伝子などの遺伝子、ＤＮＡ、又は標的ｍＲＮＡなどのＲＮＡの転写及び／又は翻訳に影響を与えることによって、調節、増加、アップレギュレート、減少、ダウンレギュレートすることを指しうる。場合によっては、ポリ核酸、目的の遺伝子などの遺伝子、ＤＮＡ、又は標的ｍＲＮＡなどのＲＮＡの発現を阻害することは、ポリ核酸、目的の遺伝子などの遺伝子、ＤＮＡ、又は標的ｍＲＮＡなどのＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルが低下又は消失するように、ポリ核酸、目的の遺伝子などの遺伝子、ＤＮＡ、又は標的ｍＲＮＡなどのＲＮＡの転写及び／又は翻訳に影響を与えることを指しうる。
例えば、ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡをコードするか又は含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはサイトカインをコードし、第二のＲＮＡは、腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識に関連するｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；そのタンパク質産物が腫瘍増殖、血管新生、又は免疫系による認識と関連しているｍＲＮＡとサイトカインの発現が同時に調節される。
ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはＩＬ－２をコードし、第二のＲＮＡは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＬ－２とＶＥＧＦＡの発現が同時に調節される、すなわち、ＩＬ－２の発現がアップレギュレートされ、ＶＥＧＦＡの発現が同時にダウンレギュレートされる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ、異なる、又はそれらの組み合わせに向けられる。関連する態様では、組換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号：８６（Ｃｐｄ．５）、配列番号：８８（Ｃｐｄ．７）、配列番号：８９（Ｃｐｄ．８）、配列番号：９０（Ｃｐｄ．７）、又は配列番号：９１（Ｃｐｄ．１０）を含む配列を含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：５（Ｃｐｄ．５）、配列番号：７（Ｃｐｄ．７）、配列番号：８（Ｃｐｄ．８）、配列番号：９（Ｃｐｄ．９）、配列番号：１０（Ｃｐｄ．１０）、配列番号：１２９（Ｃｐｄ．５）、配列番号：１３１（Ｃｐｄ．７）、配列番号：１３２（Ｃｐｄ．８）、配列番号：１３３（Ｃｐｄ．９）、又は配列番号：１３４（Ｃｐｄ．１０）を含む配列を含みうる。
またここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡをコードするか又は含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはＩＬ－２をコードし、第二のＲＮＡは、ＶＥＧＦＡアイソフォームのｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ここで、ＩＬ－２とＶＥＧＦＡのアイソフォームの発現が同時に調節される、すなわち、ＩＬ－２の発現がアップレギュレートされ、ＶＥＧＦＡのアイソフォームの発現が同時にダウンレギュレートされる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡアイソフォームのｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡアイソフォームのｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ、異なる、又はそれらの組み合わせに向けられる。
更にここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡをコードするか又は含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはＩＬ－２をコードし、第二のＲＮＡは、ＰＩＧＦ ｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ここで、ＩＬ－２とＰＩＧＦのアイソフォームの発現が同時に調節される、すなわち、ＩＬ－２の発現がアップレギュレートされ、ＰＩＧＦの発現が同時にダウンレギュレートされる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＰＩＧＦ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＰＩＧＦ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか、又は含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ、異なる、又はそれらの組み合わせに向けられる。
ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡをコードするか又は含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはＩＬ－２をコードし、第二のＲＮＡは、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ（ＭＩＣＡ／Ｂ）ｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＬ－２とＭＩＣＡ／Ｂの発現が同時に調節される、すなわち、ＩＬ－２の発現がアップレギュレートされ、ＭＩＣＡ／Ｂの発現が同時にダウンレギュレートされる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＭＩＣＡ／Ｂ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＭＩＣＡ／Ｂ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ、異なる、又はそれらの組み合わせに向けられる。関連する態様では、組換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号：８７（Ｃｐｄ．６）を含む配列を含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：６又は１３０（Ｃｐｄ．６）を含む配列を含みうる。
ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡをコードするか又は含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはＩＬ－２をコードし、第二のＲＮＡは、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、又はＭＭＰのｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ここで、ＩＬ－２とＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、又はＭＭＰの発現が同時に調節される、すなわち、ＩＬ－２の発現がアップレギュレートされ、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、又はＭＭＰの発現が同時にダウンレギュレートされる。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＥＲｐ５、ＡＤＡＭ１７、又はＭＭＰのｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＥＲｐ５、ＡＤＡＭ１７、又はＭＭＰのｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ、異なる、又はそれらの組み合わせに向けられる。
ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡをコードするか又は含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはＩＬ－１２をコードし、第二のＲＮＡは、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、及び／又はＣＤＫ６のｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＬ－１２、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、及び／又はＣＤＫ６の発現が同時に調節される、すなわち、ＩＬ－１２の発現がアップレギュレートされ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、及び／又はＣＤＫ６の発現が同時にダウンレギュレートされる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＤＨ１、ＣＤＫ４、及び／又はＣＤＫ６のｍＲＮＡの同じ領域に向けられる３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＤＨ１、ＣＤＫ４、及び／又はＣＤＫ６のｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ、異なる、又はそれらの組み合わせに向けられる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、ＩＤＨ１のｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、ＣＤＫ４のｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、及びＣＤＫ６のｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号：９２（Ｃｐｄ．１１）に含まれる配列を含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１１又は１３５（Ｃｐｄ．１１）に含まれる配列を含みうる。
ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはＩＬ－１２をコードし、第二のＲＮＡは、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、及び／又はＫＲＡＳのｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＬ－１２、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、及び／又はＫＲＡＳの発現が同時に調節される、すなわち、ＩＬ－１２の発現がアップレギュレートされ、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、及び／又はＫＲＡＳの発現が同時にダウンレギュレートされる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、及び／又はＫＲＡＳのｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、及び／又はＫＲＡＳのｍＲＮＡの異なる領域に向けられる３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ、異なる、又はそれらの組み合わせに向けられる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、ＥＧＦＲのｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲのｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、及びＫＲＡＳのｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号：９３（Ｃｐｄ．１２）、配列番号：９４（Ｃｐｄ．１３）、又は配列番号：９５（Ｃｐｄ．１４）に含まれる配列を含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１２（Ｃｐｄ．１２）、配列番号：１３（Ｃｐｄ．１３）、配列番号：１４（Ｃｐｄ．１４）、配列番号：１３６（Ｃｐｄ．１２）、配列番号：１３７（Ｃｐｄ．１３）、又は配列番号：１３８（Ｃｐｄ．１４）に含まれる配列を含みうる。
ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはＩＬ－１５をコードし、第二のＲＮＡは、ＶＥＧＦＡ及び／又はＣＤ１５５のｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＬ－１５、ＶＥＧＦＡ、及び／又はＣＤ１５５の発現が同時に調節される、すなわち、ＩＬ－１５の発現がアップレギュレートされ、ＶＥＧＦＡ及び／又はＣＤ１５５の発現が同時にダウンレギュレートされる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ及び／又はＣＤ１５５のｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ及び／又はＣＤ１５５のｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ、異なる、又はそれらの組み合わせに向けられる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、ＶＥＧＦＡのｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ及びＣＤ１５５のｍＲＮＡに向けられた２つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号：９６（Ｃｐｄ．１５）に含まれる配列を含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１５又は１３９（Ｃｐｄ．１５）に含まれる配列を含みうる。
ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはＩＬ－１５をコードし、第二のＲＮＡは、ＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＬ－１５、ＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はｃ－Ｍｙｃの発現が同時に調節される、すなわち、ＩＬ－１５の発現がアップレギュレートされ、ＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はｃ－Ｍｙｃの発現が同時にダウンレギュレートされる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ、異なる、又はそれらの組み合わせに向けられる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、ＶＥＧＦＡのｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、ＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡ、及びｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡに向けられた１つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号：９７（Ｃｐｄ．１６）に含まれる配列を含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１６又は１４０（Ｃｐｄ．１６）に含まれる配列を含みうる。
ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時に調節する方法であり、第一のＲＮＡはＩＬ－７をコードし、第二のＲＮＡは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡに結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、ここで、ＩＬ－７及びＰＤ－Ｌ１の発現は同時に調節される、すなわち、ＩＬ－７の発現がアップレギュレートされ、ＰＤ－Ｌ１の発現が同時にダウンレギュレートされる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３つのｓｉＲＮＡをコードするか又は含みうる。関連する態様では、少なくとも３つのｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ、異なる、又はそれらの組み合わせに向けられる。関連する態様では、組換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号：９８（Ｃｐｄ．１７）に含まれる配列を含みうる。関連する態様では、組換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号：１７又は１４１（Ｃｐｄ．１７）に含まれる配列を含みうる。
ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡをコードするか又は含む組換えポリ核酸又はＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞内に導入することを含む、細胞内の二つ以上の遺伝子の発現を同時にアップレギュレート及びダウンレギュレートする方法であり、第一のＲＮＡは目的の遺伝子（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、又はＩＬ－７）をコードし、第二のＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡアイソフォーム、ＰＩＧＦ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、ＭＭＰ、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－Ｍｙｃ）に結合することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ここで、標的ｍＲＮＡは、目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとは異なり、標的ｍＲＮＡの発現がダウンレギュレートされ、目的の遺伝子の発現が同時にアップレギュレートされる。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。幾つかの実施態様では、標的ｍＲＮＡの発現は、標的ｍＲＮＡに結合することができるｓｉＲＮＡによってダウンレギュレートされる。幾つかの実施態様では、目的の遺伝子の発現は、目的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ又はタンパク質を発現させることによってアップレギュレートされる。
［例示的な実施態様］
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組成物であり、第一のＲＮＡはサイトカインをコードし、第二のＲＮＡは、腫瘍増殖に関連する遺伝子の発現を調節する遺伝要素をコードする。幾つかの実施態様では、サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントである。幾つかの実施態様では、サイトカインは配列番号：２４、４４、４７、６８、及び８０からなる群から選択される配列を含む。幾つかの実施態様では、サイトカインはシグナルペプチドを含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、未修飾シグナルペプチド配列又は修飾シグナルペプチド配列を含む。幾つかの実施態様では、未修飾シグナルペプチド配列は、配列番号：２６及び１２５～１２８からなる群から選択される配列を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ－２はシグナルペプチドを含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む。幾つかの実施態様では、未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列は、配列番号：２６に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列は、配列番号：２７～２９からなる群から選択される配列を含む。
幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、腫瘍増殖に関連する遺伝子のｍＲＮＡに結合することができる。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡを含み、ｓｉＲＮＡの各種は、同じｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含む。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含む。幾つかの実施態様では、１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡの各種は、配列番号：２２に列挙される配列を含むリンカーによって連結される。
幾つかの実施態様では、腫瘍増殖に関連する遺伝子は、血管新生に関連する遺伝子を含む。幾つかの実施態様では、血管新生に関連する遺伝子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、その断片、又はその機能的バリアントをコードする。幾つかの実施態様では、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＡ、その断片、又はその機能的バリアントである。幾つかの実施態様では、ＶＥＧＦＡは、配列番号：３５に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、その断片、又はその機能的バリアントである。幾つかの実施態様では、ＶＥＧＦは、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、その断片、又はその機能的バリアントである。幾つかの実施態様では、腫瘍増殖に関連する遺伝子は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ＣＤＫ６、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子（ＫＲＡＳ）、分化抗原群１５５（ＣＤ１５５）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、又はｍｙｃ癌原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ）を含む。幾つかの実施態様では、腫瘍増殖に関連する遺伝子は、配列番号：５０、５３、５６、５９、６２、６５、７１、７４、及び７７からなる群から選択される配列を含む。
幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡは、リンカーによって第二のＲＮＡに連結される。幾つかの実施態様では、リンカーは、ｔＲＮＡリンカー又は配列番号：２１に列挙される配列を含むリンカーを含む。幾つかの実施態様では、ここに記載の組成物は、ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、又はコザック配列を更に含む。幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡ及び第二のＲＮＡは共に組換え体である。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組成物であり、第一のＲＮＡはサイトカインをコードし、第二のＲＮＡは免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を調節する遺伝要素をコードする。幾つかの実施態様では、サイトカインはインターロイキン－２（ＩＬ－２）、その断片、又はその機能的バリアントである。幾つかの実施態様では、ＩＬ－２は配列番号：２４に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ－２はシグナルペプチドを含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む。幾つかの実施態様では、未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列は、配列番号：２６に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列は、配列番号：２７～２９からなる群から選択される配列を含む。
幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、細胞表面局在化タンパク質をコードする免疫系による認識に関連する遺伝子のｍＲＮＡに結合することができる。幾つかの実施態様では、免疫系による認識に関連する遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、その断片、又はその機能的バリアントをコードする。幾つかの実施態様では、ＭＩＣＡは、配列番号：３８に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、免疫系監視に関連する遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、その断片、又はその機能的バリアントをコードする。幾つかの実施態様では、ＭＩＣＢは、配列番号：４１に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、免疫系による認識に関連する遺伝子は、小胞体タンパク質（ＥＲｐ５）、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントをコードする。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡを含み、ｓｉＲＮＡの各種は、同じｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含む。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含む。幾つかの実施態様では、１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡの各種は、配列番号：２２に列挙される配列を含むリンカーによって連結される。
幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡは、リンカーによって第二のＲＮＡに連結される。幾つかの実施態様では、リンカーは、ｔＲＮＡリンカー又は配列番号：２１に列挙される配列を含むリンカーを含む。幾つかの実施態様では、ここに記載の組成物は、ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、又はコザック配列を更に含む。幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡ及び第二のＲＮＡは共に組換え体である。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、分化抗原群１５５（ＣＤ１５５）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ｍｙｃ癌原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントの発現を調節する遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結された、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントをコードする第一のＲＮＡを含む組成物である。幾つかの態様では、第一のＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。幾つかの実施態様では、ＩＬ－２は、配列番号：２４に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む。幾つかの実施態様では、未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列は、配列番号：２６に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列は、配列番号：２７～２９からなる群から選択される配列を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１５は配列番号：６８を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１５はシグナルペプチドを含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、未修飾ＩＬ－１５シグナルペプチド配列を含む。幾つかの実施態様では、未修飾ＩＬ－１５シグナルペプチド配列は、配列番号：１４４に列挙される配列を含む。
幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＰＩＧＦ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡに結合することができる。幾つかの実施態様では、ＶＥＧＦＡは、配列番号：３５に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、ＣＤ１５５は、配列番号：７１を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ１は、配列番号：７４を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ｃ－Ｍｙｃは配列番号：７７を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含み、ｓｉＲＮＡの各種は同じｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含む。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含む。幾つかの実施態様では、１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡの各種は、配列番号：２２に列挙される配列を含むリンカーによって連結される。
幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡは、リンカーによって第二のＲＮＡに連結される。幾つかの実施態様では、リンカーは、ｔＲＮＡリンカー又は配列番号：２１に列挙される配列を含むリンカーを含む。幾つかの実施態様では、ここに記載の組成物は、ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、又はコザック配列を更に含む。幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡ及び第二のＲＮＡは共に組換え体である。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、小胞体タンパク質（ＥＲｐ５）、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントの発現を調節する遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結された、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、その断片、又はその機能的バリアントをコードする第一のＲＮＡを含む組成物である。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。幾つかの実施態様では、ＩＬ－２は、配列番号：２４に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む。幾つかの実施態様では、未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列は、配列番号：２６に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む。幾つかの実施態様では、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列は、配列番号：２７～２９からなる群から選択される配列を含む。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、又はＭＭＰのｍＲＮＡに結合することができる。幾つかの実施態様では、ＭＩＣＡは、配列番号：３８に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、ＭＩＣＢは、配列番号：４１に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、ＡＤＡＭはＡＤＡＭ１７である。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡを含み、ｓｉＲＮＡの各種は、同じｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含む。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含む。幾つかの実施態様では、１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡの各種は、配列番号：２２に列挙される配列を含むリンカーによって連結される。幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡは、リンカーによって第二のＲＮＡに連結される。幾つかの実施態様では、リンカーは、ｔＲＮＡリンカー又は配列番号：２１に列挙される配列を含むリンカーを含む。幾つかの実施態様では、ここに記載の組成物は、ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、又はコザック配列を更に含む。幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡ及び第二のＲＮＡは共に組換え体である。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ＣＤＫ６、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子（ＫＲＡＳ）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントの発現を調節する遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結された、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、ＩＬ－７、その断片、又はその機能的バリアントをコードする第一のＲＮＡを含む組成物である。
幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２は配列番号：４４又は配列番号：４７を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ－１２はシグナルペプチドを含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、未修飾ＩＬ－１２シグナルペプチドを含む。幾つかの実施態様では、未修飾ＩＬ－１２シグナルペプチドは、配列番号：１４２又は配列番号：１４３に列挙される配列を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ－７は、配列番号：８０を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＩＬ－７はシグナルペプチドを含む。幾つかの実施態様では、シグナルペプチドは、未修飾ＩＬ－７シグナルペプチドを含む。幾つかの実施態様では、未修飾ＩＬ－７シグナルペプチドは、配列番号：１２８に列挙される配列を含む。
幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、又はＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡに結合することができる。幾つかの実施態様では、ＩＤＨ１は、配列番号：５０を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＣＤＫ４は、配列番号：５３を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＣＤＫ６は、配列番号：５６を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ｍＴＯＲは、配列番号：６２を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＥＧＦＲは、配列番号：５９を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＫＲＡＳは、配列番号：６５を含む配列を含む。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ１は、配列番号：７４を含む配列を含む。
幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡを含み、ｓｉＲＮＡの各種は、同じｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含む。幾つかの実施態様では、第二のＲＮＡは、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含む。１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡの各種が、配列番号：２２に列挙される配列を含むリンカーによって連結される、請求項１１９又は１２０に記載の組成物。
幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡは、リンカーによって第二のＲＮＡに連結される。幾つかの実施態様では、リンカーは、ｔＲＮＡリンカー又は配列番号：２１を含む配列を含むリンカーを含む。幾つかの実施態様では、組成物は、ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、又はコザック配列を更に含む。幾つかの実施態様では、第一のＲＮＡ及び第二のＲＮＡは共に組換え体である。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ここに記載の組成物の何れかと薬学的に許容される添加物とを含む薬学的組成物である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、がんを有する対象にここに記載の組成物又は薬学的組成物の何れかを投与することを含む、がんを治療する方法である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、がんの治療方法で使用するためのここに記載の組成物又は薬学的組成物の何れかである。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、がんを治療するための医薬の製造における、ここに記載の組成物又は薬学的組成物の何れかの使用である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、対象におけるがんを治療するための、ここに記載の組成物又は薬学的組成物の何れかの使用である。幾つかの実施態様では、がんは固形腫瘍である。幾つかの実施態様では、がんはメラノーマである。幾つかの実施態様では、がんは腎細胞癌である。幾つかの実施態様では、がんは頭頸部がんである。幾つかの実施態様では、頭頸部がんは頭頸部扁平上皮癌である。幾つかの実施態様では、頭頸部がんは、喉頭がん、下咽頭がん、扁桃腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻咽頭癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、口唇がん、口腔がん、口腔がん、中咽頭がん、唾液腺がん、脳腫瘍、食道がん、眼がん、副甲状腺がん、頭頸部の肉腫、及び甲状腺がんである。幾つかの実施態様では、がんは上部気道消化管に位置する。幾つかの実施態様では、上部気道消化管は、副鼻腔、鼻腔、口腔、唾液腺、舌、鼻咽頭、中咽頭、下咽頭、又は喉頭を含む。幾つかの実施態様では、対象は頭頸部がんを有する。幾つかの実施態様では、頭頸部がんを有する対象は、喫煙歴を有する。幾つかの実施態様では、頭頸部がんを有する対象は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＤＮＡを有する。幾つかの実施態様では、対象はヒトである。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、配列番号：１～１７及び１２５～１４１からなる群から選択される核酸配列を含む組換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物である。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、細胞における二つ以上の遺伝子の発現を調節する際に使用される組成物である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ここに記載の組成物の何れか一を含む細胞である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ここに記載の組成物の何れか一をコードする組換えポリ核酸コンストラクトを含むベクターである。
幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ここに記載の組成物又はここに記載のベクターの何れか一つを細胞に導入することを含む、細胞内の単一ＲＮＡ転写物からｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡを産生する方法である。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ここに記載の組成物又はここに記載のベクターの何れか一つを細胞に導入することを含むタンパク質発現を調節する方法であり、第二のＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、組成物又はベクターを含まない細胞と比較して減少する。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ここに記載の組成物又はここに記載のベクターの何れか一つを細胞に導入することを含むタンパク質発現を調節する方法であり、第一のＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、組成物又はベクターを含まない細胞と比較して増加する。幾つかの態様において、ここに提供されるのは、ここに記載の組成物又はここに記載のベクターの何れか一つを細胞に導入することを含むタンパク質発現を調節する方法であり、第二のＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、組成物又はベクターを含まない細胞と比較して減少し、第一のＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、組成物又はベクターを含まない細胞と比較して増加する。
これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、ここに提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
実施例１：コンストラクトのデザイン、配列、及び合成
［コンストラクトのデザイン］
ｓｉＲＮＡと目的の遺伝子の両方が、インビトロ転写によって産生された単一転写物から同時に発現される（配列番号：１～１７及び１２５～１４１）。ポリヌクレオチド又はＲＮＡコンストラクトは、Ｃｈｅｎｇ等（２０１８）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．，６，４６３８－４６４４に記載されたｓｉＲＮＡデザインを含み、ｓｉＲＮＡ配列の下流又は上流に一又は複数の目的の遺伝子を更に含む（一配向の例を図１に示す）ｓｉＲＮＡを含むように改変される。組換えコンストラクトは、同じ又は異なる標的ｍＲＮＡを標的とする一つを超えるｓｉＲＮＡ配列をコードするか又は含みうる。同様に、コンストラクトは、二種以上の目的の遺伝子の核酸配列を含みうる。リンカー配列は、コンストラクトの任意の２つのエレメント間に存在しうる（例えば、ｔＲＮＡリンカー又はＣｈｅｎｇ等，２０１８によって記載された適応配列）。
ポリ核酸コンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼ結合並びに単一転写物中における目的の遺伝子とｓｉＲＮＡの両方の成功裏のインビトロ転写のために、目的の遺伝子配列の上流にＴ７プロモーター配列（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ３’；配列番号：１８）を含みうる。選択的プロモーター、例えば、ＳＰ６、Ｔ３、Ｐ６０、Ｓｙｎ５、及びＫＰ３４が使用されうる。転写鋳型が、Ｔ７プロモーターに隣接するようにデザインされたプライマー、目的の遺伝子、及びｓｉＲＮＡ配列を使用して、ｍＲＮＡを生成するためにＰＣＲによって作製される。逆方向プライマーは、チミジン（Ｔ）塩基（１２０）（配列番号；１５４）のストレッチを含み、１２０ｂｐ長のポリ（Ａ）テール（配列番号：１５３）をｍＲＮＡに付加する。
［コンストラクトの合成］
表１に示されるコンストラクト（化合物ＩＤ番号Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１７）は、コドン最適化（ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒアルゴリズム）と共にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ｐＭＸ、例えば、ｐＭＡ－Ｔ、ｐＭＫ－ＲＱ又はｐＭＡ－ＲＱ）を含むベクターとして、ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成された。表１は、各化合物（Ｃｐｄ．）について、コードするタンパク質、シグナルペプチドの性質、コンストラクトのｓｉＲＮＡの数、及び対応するｍＲＮＡへのｓｉＲＮＡ結合によってダウンレギュレートされるタンパク質を示している。各コンストラクトの配列を表２に示し、表の下に示すように注釈を付けた（配列番号：１～１７）。
実施例２：ＲＮＡコンストラクトのインビトロ転写及びデータ解析
Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１７をコードするｐＭＡ－Ｔ（Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．４）、ｐＭＫ－ＲＱ（Ｃｐｄ．５）又はｐＭＡ－ＲＱ（Ｃｐｄ．６～Ｃｐｄ．１７）ベクターを使用して、ＰＣＲに基づくインビトロ転写を実施し、ｍＲＮＡを産生する。転写鋳型は、表５の順方向及び逆方向プライマーを使用してＰＣＲによって作製した。ポリ（Ａ）テールが鋳型にコードされ、１２０ｂｐのポリ（Ａ）テール（配列番号：１５３）をもたらした。ｓｉＲＮＡ隣接領域の反復配列を考慮して、特異的増幅を達成するために必要に応じて最適化を行った。最適化には、１）ベクターのプラスミドＤＮＡの量の低減、２）ＤＮＡポリメラーゼの変更（Ｑ５ホットスタートポリメラーゼ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、３）ＰＣＲの各サイクルに対する変性時間（３０秒から１０秒）と伸長時間（４５秒／ｋｂから１０秒／ｋｂ）の低減、４）ＰＣＲの各サイクルに対するアニーリングの増加（１０秒から３０秒）、及び５）ＰＣＲの各サイクルに対する最終伸長時間の増加（最大１５分）が含まれる。加えて、非特異的なプライマー結合を避けるために、解凍試薬を含む氷上でＰＣＲ反応混合物を調製し、ＰＣＲサイクル数を２５に減らした。
インビトロ転写では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３７℃において２時間使用した。合成されたＲＮＡを、１００％のＮ１－メチルプソイド－ＵＴＰで化学的に修飾し、５’末端において抗リバースＣＡＰアナログ（ＡＲＣＡ；［ｍ２ ７，３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］）で同時転写的にキャップした（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。インビトロ転写後、ｍＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してカラム精製し、Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ－Ｎ６０（Ｉｍｐｌｅｎ）を使用して定量した。
インビトロ転写を使用して、Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１７をｍＲＮＡとして作製し、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５発現並びに標的遺伝子のダウンレギュレーションと並行してそれぞれのタンパク質の過剰発現の組合せ効果について以下に特定する様々なインビトロモデルで試験した。
コンストラクトの分子量の決定は、以下のように実施した。各コンストラクトの分子量は、各配列中に存在する各塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＮ１－ＵＴＰ）の全数を決定し、その数にそれぞれの分子量（例えば、Ａ：３４７．２ｇ／ｍｏｌ；Ｃ ３２３．２ｇ／ｍｏｌ；Ｇ ３６３．２ｇ／ｍｏｌ；Ｎ１－ＵＴＰ：３３８．２ｇ／ｍｏｌ）を掛けることによって、各配列から決定した。分子量は、各塩基について得られた全ての重量の合計と、８１７．４ｇ／ｍｏｌのＡＲＣＡ分子量によって決定した。各コンストラクトの分子量を使用して、各ウェルでのトランスフェクションに使用されるｍＲＮＡの量をナノモル（ｎＭ）濃度まで計算した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を使用してデータを解析した。標準又はサンプルでＥＬＩＳＡを使用したタンパク質レベルの推定では、標準又はサンプルの平均吸光度からブランクの平均吸光度値を引いた。標準曲線は、製造元のプロトコルに従って４パラメーターの非線形回帰を使用して作成しプロットした。各サンプル中のタンパク質の濃度を決定するために、異なるタンパク質の濃度を標準曲線から内挿した。サンプルの最終タンパク質濃度は、希釈係数を掛けることによって計算した。統計解析は、スチューデントｔ検定又は一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定を使用して実施した。
実施例３：ＨＥＫ－２９３細胞のインビトロトランスフェクション
ヒト胎児由来腎臓細胞２９３（ＨＥＫ－２９３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ カタログ番号１０５００－０６４）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。ＩＬ－２発現を評価するために、ＨＥＫ－２９３細胞を９６ウェル培養プレートに２００００細胞／ウェルで播種し、トランスフェクションの前に５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃において２４時間インキュベートした。ついで、トランスフェクション前に、細胞を１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ増殖培地中で増殖させ、コンフルエンシー＜８０％に到達させた。その後、ＨＥＫ－２９３細胞に、ｍＲＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの比率が１：１ｗ／ｖで製造元の説明に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、３００ｎｇの特異的ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加した後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中の５０μｌのｍＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００複合体を添加した。５時間のインキュベーション後、培地を新鮮な増殖培地と交換し、プレートを５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃において２４時間インキュベートした。細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号８８７０２５）を使用して分泌されたＩＬ－２を測定した。有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）は、Ｃｐｄ．１を対照として使用して、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定によって評価した。
［ＨＥＫ－２９３細胞におけるＩＬ－２分泌］
ＩＬ－２タンパク質コード配列を含むＣｐｄ．１～Ｃｐｄ．４を、ＩＬ－２発現及びＨＥＫ－２９３細胞からの分泌について試験した。分泌されたＩＬ－２のタンパク質レベルは、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡを使用して細胞培養上清において測定され、図２ＡにおいてＣｐｄ．１（ＷＴ ＩＬ－２シグナルペプチドを含む）を参照した倍率変化として表される。Ｃｐｄ．２～Ｃｐｄ．４（修飾ＩＬ－２シグナルペプチドを含む）でトランスフェクトされた細胞により分泌されたＩＬ－２のタンパク質レベルは、Ｃｐｄ．１でトランスフェクトされた細胞により分泌されたＩＬ－２のタンパク質レベルよりも約２倍高かった。まとめると、データは、相同の修飾シグナルペプチドを含むＣｐｄ．２～Ｃｐｄ．４が、内因性シグナルペプチドを含むＣｐｄ．１と比較して、ＨＥＫ－２９３細胞で産生されたＩＬ－２の細胞外への排出を促進できることを示唆している。データは、Ｃｐｄ当たり３回の反復の平均±平均標準誤差を表す。有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）は、Ｃｐｄ．１を対照として使用して、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定によって評価した。
実施例４：ＨａＣａＴ細胞のインビトロトランスフェクション
ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ；ＡｄｄｅｘＢｉｏ カタログ番号Ｔ００２０００１）を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ カタログ番号１０５００－０６４）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。ＩＬ－２発現を評価するために、ＨａＣａＴ細胞を１５０００細胞／ウェルで９６ウェル培養プレートに播種し、トランスフェクションの前に５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃において２４時間インキュベートした。ついで、トランスフェクション前に、細胞を１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ増殖培地中で増殖させ、コンフルエンシー＜７０％に到達させた。その後、ＨａＣａＴ細胞に、ｍＲＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの比率が１：１ｗ／ｖで製造元の説明に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、３００ｎｇの特異的ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加した後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中の５０μｌのｍＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００複合体を添加した。５時間のインキュベーション後、培地を新鮮な増殖培地と交換し、プレートを５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃において２４時間インキュベートした。細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号８８７０２５）を使用して分泌されたＩＬ－２を測定した。有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）は、Ｃｐｄ．１を対照として使用して、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定によって評価した。
［ＨａＣａＴ細胞におけるＩＬ－２分泌］
ＩＬ－２タンパク質コード配列を含むＣｐｄ．１～Ｃｐｄ．４を、ＩＬ－２発現及びＨａＣａＴ細胞からの分泌について試験した。分泌されたＩＬ－２のタンパク質レベルは、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡを使用して細胞培養上清において測定され、図２ＢにおいてＣｐｄ．１（ＷＴ ＩＬ－２シグナルペプチドを含む）を参照した倍率変化として表される。Ｃｐｄ．２～Ｃｐｄ．４（修飾ＩＬ－２シグナルペプチドを含む）でトランスフェクトされた細胞により分泌されたＩＬ－２のタンパク質レベルは、Ｃｐｄ．１でトランスフェクトされた細胞により分泌されたＩＬ－２のタンパク質レベルよりも約２．７倍高かった。まとめると、データは、相同の修飾シグナルペプチドを含むＣｐｄ．２～Ｃｐｄ．４が、内因性シグナルペプチドを含むＣｐｄ．１と比較して、ＨａＣａＴ細胞におけるＩＬ－２の増強された分泌を促進できることを示唆している。データは、Ｃｐｄ当たり３回の反復の平均±平均標準誤差を表す。有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）は、Ｃｐｄ．１を対照として使用して、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定によって評価した。
実施例５：Ａ５４９細胞のインビトロトランスフェクション
ヒト肺上皮癌細胞（Ａ５４９；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号６０１２８０４）を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ カタログ番号１０５００－０６４）を補充したダルベッコ変法イーグル高グルコース培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。ＩＬ－２発現を評価するために、Ａ５４９細胞を１００００細胞／ウェルで９６ウェル培養プレートに播種し、トランスフェクションの前に５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃において２４時間インキュベートした。ついで、トランスフェクション前に、細胞を１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ増殖培地中で増殖させ、コンフルエンシー＜７０％に到達させた。その後、Ａ５４９細胞に、ｍＲＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの比率が１：１ｗ／ｖで製造元の説明に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、様々な濃度４．４ｎＭ～３５．２ｎＭ（０．１５～１．２μｇ）の特異的ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加した後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中の５０μｌのｍＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００複合体を添加した。５時間のインキュベーション後、培地を新鮮な増殖培地と交換し、プレートを５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃において２４時間インキュベートした。細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号８８７０２５）を使用して分泌されたＩＬ－２を測定した。有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）は、Ｃｐｄ．１を対照として使用して、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定によって評価した。
［Ａ５４９細胞におけるＩＬ－２分泌］
ＩＬ－２タンパク質コード配列を含むＣｐｄ．１～Ｃｐｄ．４を、ＩＬ－２発現及びＡ５４９細胞からの分泌について試験した。分泌されたＩＬ－２のタンパク質レベルは、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡを使用して細胞培養上清において測定され、図２ＣにおいてＣｐｄ．１（ＷＴ ＩＬ－２シグナルペプチドを含む）を参照した倍率変化として表される。Ｃｐｄ．２～Ｃｐｄ．４（修飾ＩＬ－２シグナルペプチドを含む）でトランスフェクトされた細胞により分泌されたＩＬ－２のタンパク質レベルは、Ｃｐｄ．１でトランスフェクトされた細胞により分泌されたＩＬ－２のタンパク質レベルよりも約１．６倍高かった。まとめると、データは、相同の修飾シグナルペプチドを含むＣｐｄ．２～Ｃｐｄ．４が、内因性シグナルペプチドを含むＣｐｄ．１と比較して、Ａ５４９細胞におけるＩＬ－２の分泌増強を促進できることを示唆している。データは、Ｃｐｄ当たり３回の反復の平均±平均標準誤差を表す。有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）は、Ｃｐｄ．１を対照として使用して、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定によって評価した。
実施例６：Ａ５４９細胞におけるＩＬ－２分泌及びＶＥＧＦＡダウンレギュレーションの組合せ効果：ＶＥＧＦＡ過剰発現モデル
［Ａ５４９細胞のインビトロトランスフェクション］
ＶＥＧＦＡ過剰発現モデルを使用して、Ａ５４９細胞におけるＣｐｄ．５による同時のＶＥＧＦＡ ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）及びＩＬ－２発現を評価した。ＶＥＧＦＡ過剰発現モデルを、Ａ５４９細胞に０．３μｇのＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡをトランスフェクトすることによって樹立した。Ａ５４９細胞を、４．４ｎＭから３５．２ｎＭ（０．１５から１．２μｇ）に増加する濃度のＣｐｄ．５で同時トランスフェクトし、ＶＥＧＦＡ干渉及びＩＬ－２過剰発現に対するＣｐｄ．５の用量依存性応答を評価した。トランスフェクション後、ＦＢＳを含まない増殖培地中の細胞を、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートし、続いて、ＥＬＩＳＡによって同じ細胞培養上清中に存在するＶＥＧＦＡ（ダウンレギュレートする標的ｍＲＮＡ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＫＨＧ０１１２）及びＩＬ－２（過剰発現する目的の遺伝子；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８７０２５）を定量した。市販のｓｉＲＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２８４７０３）に対するＣｐｄ．５の効力を評価するために、市販のＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡとＣｐｄ．５を使用して用量依存性反応研究を実施した。Ａ５４９細胞に、ＶＥＧＦＡｍＲＮＡ（０．３μｇ／ウェル；９．５ｎＭ）と市販のＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ（０．０５、０．１２５、０．２５、１．２５、及び２．５ｍＭ）又はＣｐｄ．５（４．４、８．８、１７．６、２６．４、３５．２及び４４．０２ｎＭは、それぞれ０．１５、０．３、０．６、０．９、１．２及び１．５μｇに相当する）で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、ＦＢＳを含まない増殖培地中の細胞を、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートし、続いて、ＥＬＩＳＡによって同じ細胞培養上清中に存在するＶＥＧＦＡ（ダウンレギュレートする標的ｍＲＮＡ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＫＨＧ０１１２）及びＩＬ－２（過剰発現する目的の遺伝子；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８７０２５）を定量した。
［結果］
３種のＶＥＧＦＡターゲティングｓｉＲＮＡ及びＩＬ－２タンパク質コード配列を含むＣｐｄ．５を、増加用量のＣｐｄ．５（４．４ｎＭから３５．２ｎＭ）と一定用量のＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ（９．５ｎＭ又は３００ｎｇ／ウェル）をＡ５４９細胞に同時トランスフェクトし、ＥＬＩＳＡによって細胞培養上清中のタンパク質レベルを測定することにより、Ａ５４９細胞における用量依存的ＶＥＧＦＡダウンレギュレーション及び同時ＩＬ－２発現について試験した。Ｃｐｄ．５は、図３に示されるように、用量依存的に（１００ｎｇ／ｍｌを超えるまで）ＩＬ－２タンパク質レベルを増加させながら、ＶＥＧＦＡタンパク質レベルを（最大７０％）低下させた。総合すると、データは、Ｃｐｄ．５がＩＬ－２の発現に影響を与えることなくＶＥＧＦＡをダウンレギュレートできることを示唆している。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
実施例７：ＳＣＣ－４細胞におけるＩＬ－２分泌及びＶＥＧＦＡダウンレギュレーションの組み合わせ効果：ＶＥＧＦＡ過剰発現モデル
ＳＣＣ－４細胞のインビトロトランスフェクション
ＶＥＧＦＡ過剰発現モデルを使用して、ＳＣＣ－４細胞におけるＣｐｄ．５による同時のＶＥＧＦＡ ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）及びＩＬ－２発現を評価した。ＶＥＧＦＡ過剰発現モデルを、ＳＣＣ－４細胞に９．５ｎＭ（０．３μｇ）のＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡをトランスフェクトすることによって樹立した。ＳＣＣ－４細胞に、４．４ｎＭから３５．２ｎＭ（０．１５から１．２μｇ）の増加濃度のＣｐｄ．５を同時トランスフェクトして、ＶＥＧＦＡ干渉及びＩＬ－２過剰発現に対するＣｐｄ．５の用量依存性応答を評価した。トランスフェクション後、ＦＢＳを含まない増殖培地中の細胞を、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートし、続いて、ＥＬＩＳＡによって同じ細胞培養上清中に存在するＶＥＧＦＡ（ダウンレギュレートする標的ｍＲＮＡ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＫＨＧ０１１２）及びＩＬ－２（過剰発現する目的の遺伝子；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８７０２５）を定量した。ＶＥＧＦＡ発現に対するＣｐｄ．５の効力を評価するために、ＳＣＣ－４細胞に９．５ｎＭ（０．３μｇ）のＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡとＣｐｄ．５（４．４、８．８、１７．６、２６．４、３５．２、及び４４．０２ｎＭは０．１５、０．３、０．６、０．９、１．２、及び１．５μｇ／ウェルに相当）を同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、ＦＢＳを含まない増殖培地中の細胞を、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートし、続いて、ＥＬＩＳＡによって同じ細胞培養上清中に存在するＶＥＧＦＡ（ダウンレギュレートする標的ｍＲＮＡ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＫＨＧ０１１２）及びＩＬ－２（過剰発現する目的の遺伝子；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８７０２５）を定量した。
［結果］
ＩＬ－２コード配列及びＶＥＧＦＡを標的とする３種のｓｉＲＮＡを有するようにデザインされたＣｐｄ．５を試験して、ＳＣＣ－４細胞にＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＶＥＧＦＡ過剰発現モデルにおけるＩＬ－２の同時発現及びＶＥＧＦＡ発現の干渉を評価した。Ｃｐｄ．５は、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、外因的に過剰発現したＶＥＧＦＡのレベルを最大９５％低下させ、同時にＩＬ－２発現（６５ｎｇ／ｍｌ以上）を誘導した。要約すると、Ｃｐｄ．５は、ＩＬ－２の発現と分泌を同時に誘導しながら、外因的に過剰発現したＶＥＧＦＡを減少させることができる。
実施例８：ＳＣＣ－４細胞におけるＩＬ－２分泌及びＶＥＧＦＡダウンレギュレーションの組み合わせ効果：内因性ＶＥＧＦＡ発現モデル
［ＳＣＣ－４細胞のインビトロトランスフェクション］
ＳＣＣ－４細胞はインビトロで最大６００ｐｇ／ｍＬまでＶＥＧＦＡを内因的に過剰発現する（図５Ａ）ので、Ｃｐｄ．５による同時のＶＥＧＦＡ ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）及びＩＬ－１発現を評価するために、ＳＣＣ－４細胞を内因性ＶＥＧＦＡ過剰発現モデルとして使用した。ＳＣＣ－４細胞に２６．４ｎＭ（０．９μｇ）のＣｐｄ．５をトランスフェクトした。細胞を５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートした後、特定のＥＬＩＳＡを使用することによって同じ細胞培養上清に存在するＶＥＧＦＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＫＨＧ０１１２）及びＩＬ－２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８７０２５）を定量した。
［結果］
ＩＬ－２コード配列及びＶＥＧＦＡを標的とする３種のｓｉＲＮＡを有するようにデザインされたＣｐｄ．５を、インビトロで最大６００ｐｇ／ｍＬまでＶＥＧＦＡを構成的に発現するＳＣＣ－４細胞における同時のＩＬ－２発現及びＶＥＧＦＡ発現の干渉を評価するために試験した。図５Ａ及び図５Ｂに示されるように、Ｃｐｄ．５は、内因性ＶＥＧＦＡ発現のレベルを最大９０％減少させ、同時にＩＬ－２発現（最大１２ｎｇ／ｍｌ）を誘導した。総合すると、Ｃｐｄ．５は、ＩＬ－２の発現と分泌を同時に誘導しながら、内因的に発現されるＶＥＧＦＡのレベルを低下させることができる。
実施例９：ＶＥＧＦＡダウンレギュレーションにおけるＣｐｄ．５と市販のｓｉＲＮＡの比較分析
［ＳＣＣ－４細胞のインビトロトランスフェクション］
ヒト舌扁平上皮癌細胞株（ＳＣＣ－４；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｕｃｈｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，カタログ番号８９０６２００２ＣＲＬ－１５７３）を、ＨＡＭ Ｆ１２（１：１）＋２ｍＭのグルタミン＋１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを補充したダルベッコ変法イーグル高グルコース培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。細胞を１５０００細胞／ウェルで９６ウェル培養プレートに播種し、トランスフェクションの前に５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃において２４時間インキュベートした。トランスフェクション前に、細胞をＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ－１２増殖培地中で増殖させ、コンフルエンシー＜７０％に到達させた。市販のｓｉＲＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２８４７０３）に対するＣｐｄ．５の効力を評価するために、市販のＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡとＣｐｄ．５を使用して用量反応研究を実施した。ＳＣＣ－４細胞に、９．５ｎＭ（０．３μｇ）のＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡと市販のＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ（０．０５、０．１２５、０．２５、１．２５及び２．５ｍＭ）又はＣｐｄ．５（４．４、８．８、１７．６、２６．４、３５．２及び４４．０２ｎＭは０．１５、０．３、０．６、０．９、１．２及び１．５μｇ／ウェルに相当）を同時トランスフェクトした。ＳＣＣ－４細胞に、ｍＲＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの比率を１：１ｗ／ｖとして製造元の説明に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、特定の濃度のＣｐｄ．５ｃ ｍＲＮＡ又はｓｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ及び５０μｌのｍＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００複合体で置き換えた。５時間後、培地をＦＢＳを含まない新鮮な増殖培地と交換し、プレートを、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃において２４時間インキュベートした。
［結果］
ＶＥＧＦＡ発現のダウンレギュレーションにおける市販のｓｉＲＮＡに対するＣｐｄ．５の阻害濃度を計算するために、ＳＣＣ－４細胞とＡ５４９細胞の両方で樹立されたＶＥＧＦＡ過剰発現モデルにおいて用量反応研究を実施した。両細胞に、増加濃度のＣｐｄ．５（４．４ｎＭから４４．０２ｎＭ）又は市販のｓｉＲＮＡ（０．０５ｍＭから２．５ｍＭ）の何れかと共に９．５ｎＭ（０．３μｇ）のＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡを同時トランスフェクトした。市販のｓｉＲＮＡと比較して、Ｃｐｄ．５は、ＶＥＧＦＡ発現の低下において、ＳＣＣ－４細胞では１９倍以上の効力、Ａ５４９細胞では５２倍以上の効力を示した（図６Ａ及び図６Ｂ）。ＳＣＣ－４細胞（８ｎＭ）及びＡ５４９細胞（１１ｎＭ）におけるＣｐｄ．５のＩＣ５０値を図６Ｃに示す。
実施例１０：ＳＣＣ－４細胞におけるＩＬ－２分泌及びＭＩＣＢダウンレギュレーションの組み合わせ効果－内因性ＭＩＣＢ発現モデル
［ＳＣＣ－４細胞のインビトロトランスフェクション］
ＳＣＣ－４細胞はインビトロで可溶性ＭＩＣＢ（最大４０ｐｇ／ｍＬ）及び膜結合ＭＩＣＢ（最大８０ｐｇ／ｍＬ）を構成的に発現するので、Ｃｐｄ．６による同時のＭＩＣＢ ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）及びＩＬ－２発現を評価するために、ＳＣＣ－４細胞を内因性ＭＩＣＢ発現モデルとして使用した。ＳＣＣ－４細胞に３５．１１ｎＭ（０．９μｇ）のＣｐｄ．６をトランスフェクトし、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートした。細胞培養上清及び細胞可溶化物中に存在するＭＩＣＢレベルを、ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＢＭＳ２３０３）を使用して定量した。同じ細胞培養上清中に存在するＩＬ－２レベルをＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８７０２５）を使用して測定した。
［結果］
ＩＬ－２コード配列及びＭＩＣＢを標的とする３種のｓｉＲＮＡを有するようにデザインされたＣｐｄ．６を試験して、インビトロで可溶性ＭＩＣＢ（最大４０ｐｇ／ｍＬ）及び膜結合ＭＩＣＢ（最大８０ｐｇ／ｍＬ）を構成的に発現するＳＣＣ－４細胞におけるＩＬ－２の同時発現及びＭＩＣＢ発現の干渉を評価した。Ｃｐｄ．６は、図７Ａ～７Ｃに示されるように、可溶性ＭＩＣＢ及び膜結合ＭＩＣＢの両方の内因性発現レベルをそれぞれ最大７０％及び９０％低下させ、同時にＩＬ－２発現を誘導した（最大６５ｎｇ／ｍｌ）。簡潔に言えば、Ｃｐｄ．６は、同時にＩＬ－２の発現及び分泌を誘導しながら、内因的に発現したＭＩＣＢ（可溶性及び膜結合型の両方）をダウンレギュレートすることができる。データは、４回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
実施例１１：ＳＣＣ－４細胞におけるＩＬ－２分泌とＭＩＣＡ及びＭＩＣＢダウンレギュレーションとの組み合わせ効果－内因性ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ発現モデル
［ＳＣＣ－４細胞のインビトロトランスフェクション］
ＭＩＣＢに加えて、ＳＣＣ－４細胞は、インビトロで、ＭＩＣＢの機能的類似体である可溶性ＭＩＣＡ（最大２００ｐｇ／ｍＬ）を構成的に発現する。ＭＩＣＡとＭＩＣＢの間の高いゲノム相同性（＞９０％）により、Ｃｐｄ．６内のｓｉＲＮＡは、ＭＩＣＡタンパク質とＭＩＣＢタンパク質の両方の発現を同時に干渉するようにデザインされた。Ｃｐｄ．６によるＩＬ－２発現及び分泌と同調したＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を評価するために、ＳＣＣ－４細胞に増加用量（１．５８、２．９３、５．８５、１１．７、２３．４１、３５．１１及び４６．８１ｎＭ）のＣｐｄ．６ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートした。細胞培養上清中に存在するＭＩＣＡレベルを、ＥＬＩＳＡ（ＲａｙＢｉｏｅｃｈカタログ番号ＥＬＨ－ＭＩＣＡ－１）を使用して定量した。同じ細胞培養上清中に存在するＭＩＣＢレベルを、ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＢＭＳ２３０３）を使用して定量した。同じ細胞培養上清中に存在するＩＬ－２レベルを、ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８７０２５）を使用して測定した。
［結果］
ＩＬ－２コード配列及びＭＩＣＡとＭＩＣＢの両方を標的とする３種のｓｉＲＮＡを有するようにデザインされたＣｐｄ．６を試験して、インビトロで可溶性ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢを構成的に発現するＳＣＣ－４細胞におけるＩＬ－２の同時発現及びＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ発現の干渉を評価した。Ｃｐｄ．６は、図８Ａ及び８Ｂに示されるように、可溶性ＭＩＣＡと可溶性ＭＩＣＢの両方の内因性発現レベルを用量依存的に最大８０％低下させ、同時にＩＬ－２発現を誘導した（＞１５０ｎｇ／ｍｌ）。簡潔に言えば、Ｃｐｄ．６は、ＩＬ－２の分泌を同時に誘導しながら、内因的に発現したＭＩＣＡとＭＩＣＢをダウンレギュレートすることができる。データは、ＩＬ－２レベルについて４回の反復と、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢそれぞれについて２回の反復の平均±平均標準誤差を表す。
実施例１２：ＳＫ－ＯＶ－３スフェロイドモデルでの末梢血単核細胞腫瘍死滅アッセイにおけるＣｐｄ．３の生物活性評価
Ｃｐｄ．３の抗腫瘍活性を、核ＲＦＰ形質導入ＳＫ－ＯＶ－３腫瘍細胞株を使用することにより、免疫細胞媒介性腫瘍細胞死滅において評価した。スフェロイドのＣｐｄ．３によって誘導されるＩＬ－２発現及び分泌について、二次元（２Ｄ）培養からのＳＫ－ＯＶ－３－ＮＬＲ細胞を単一密度（５０００細胞／ウェル）で超低接着（ＵＬＡ）プレートに播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して１００ｎｇのＣｐｄ．３コンストラクトをトランスフェクトし、ついで遠心分離（２００×ｇで１０分間）してスフェロイドを作製した。条件は４連で設定した。トランスフェクションの１２、２４及び４８時間後に上清を収集し、ＴＲ－ＦＲＥＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，カタログ番号ＴＲＦ１２２１Ｃ）によってＩＬ－２発現を試験した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いた実験では、上記のようにスフェロイドを作製し、Ｃｐｄ．３（３ｎｇ、１０ｎｇ、３０ｎｇ及び１００ｎｇ）でトランスフェクトし、４８時間培養して、ＰＢＭＣ添加前にスフェロイドを２００～５００μｍの径に到達させた。４８時間の培養期間の後、３人の健康なドナーからのＰＢＭＣを、抗ＣＤ３抗体の存在下でウェルに添加した（２０００００細胞／ウェル）。陽性対照として、組換えヒトＩＬ－２（２０００ＩＵ／ｍｌ）及びＰＢＭＣを適切なウェルに添加した。ＳＫ－ＯＶ－３－ＮＬＲのみの条件では、ＰＢＭＣは含めなかった。ウェルは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｓ３）を使用して３時間ごとに７日間画像化され、全核局在化ＲＦＰ（ＮＬＲ）積分強度の変化が、ＰＢＭＣを介したＳＫ－ＯＶ－３スフェロイド腫瘍死滅の読み取り値として測定された。全ＮＬＲ積分強度を２４時間の時点で正規化し、ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェア内のスフェロイドモジュールを使用して解析した。グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（両側で４つの値を平均し、二次平滑化式を使用）を使用して追加の平滑化関数で解析した５日目のデータを示している。
［結果］
３Ｄ浮遊培養においてＣｐｄ．３（１００ｎｇ）をトランスフェクトした細胞から形成されたスフェロイドから収集された上清のＴＲ－ＦＲＥＴ分析は、ＩＬ－２発現及び分泌の時間依存的増加を示した（図９Ａ）。リポフェクタミントランスフェクションのため、スフェロイドの形成と成長に欠陥は見られなかった。３人の健康なドナーからのＰＢＭＣを添加した後、Ｃｐｄ．３でトランスフェクトされたスフェロイドを分析すると、明確な用量依存性の免疫介在性死滅が示された。全てのドナーにわたって、３０ｎｇ及び１００ｎｇのＣｐｄ．３は、アッセイ期間にわたって測定された全積分ＮＬＲ強度の減少によって決定されるＰＢＭＣ駆動の腫瘍死滅を促進した（６日目のデータが図９Ｂ、９Ｃ、及び９Ｄに示される）。Ｃｐｄ．３によって誘導された死滅効果は、試験した３人のドナー全てにおいて、６ｎＭ濃度で添加された組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）の死滅効果よりも大幅に優れていた。図９Ｅは、５日目の対照と比較したＳＫ－ＯＶ－３ ＮＬＲ条件でのＣｐｄ．３処理（１００ｎｇ）後のＮＬＲ積分低下を示す代表的なＩｎｃｕＣｙｔｅ画像のセットを示している。まとめると、Ｃｐｄ．３ ｍＲＮＡコンストラクトを含むＳＫ－ＯＶ－３ ＮＬＲスフェロイドのトランスフェクションは、ＰＢＭＣ媒介性腫瘍死滅を用量依存的に増強した。
実施例１３：ＪＡＫ３－ＳＴＡＴ５活性化のためのＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭｈＩＬ－２レポーターアッセイ
Ｃｐｄ．５及びＣｐｄ．６の機能活性を、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化をモニタリングすることにより、ヒトＩＬ－２受容体の活性化を研究するためにデザインされたＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭＩＬ－２レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，カタログコード：ｈｋｂ－ｉｌ２）で試験した。これらの細胞は、ヒト胎児由来腎臓ＨＥＫ２９３細胞株に由来し、完全に機能的なＩＬ－２シグナル伝達カスケードを達成するために、ヒトＪＡＫ３及びＳＴＡＴ５遺伝子と共に、ヒトＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、及びＩＬ－２Ｒγ遺伝子を発現するように改変した。加えて、ＳＴＡＴ５誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子を導入した。ＩＬ－２活性化にＳＴＡＴ５が続くと、生成されたＳＥＡＰを、細胞培養上清中のＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ検出細胞培養培地を用いてリアルタイムで決定することができる。ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭＩＬ－２細胞の刺激は、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２、０．００１ｎｇから３００ｎｇ）或いは以下の詳細でＣｐｄ．５又はＣｐｄ．６（０．３μｇ／ウェル）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清由来のＩＬ－２（０．００１ｎｇ～４５ｎｇ）によって達成した。
ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭｈＩＬ－２細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγ、ＪＡＫ３、ＳＴＡＴ５、及びＳＥＡＰ導入遺伝子プラスミドを含む細胞を選択するために、抗生物質ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）及びゼオシン（１００μｇ／ｍＬ）を培地に添加した。細胞を４００００細胞／ウェルで９６ウェル培養プレートに播種し、刺激前に５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートした。刺激前に、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ増殖培地で細胞を増殖させ、＜８０％のコンフルエンシーに到達させた。ＨＥＫ２９３細胞培養上清に由来する定まった濃度のＩＬ－２を収集し、２０μｌの培地で希釈し、ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭＩＬ－２細胞の培地に添加して、ＩＬ－２受容体の動員とそれに続くＪＡＫ３－ＳＴＡＴ５経路の活性化を測定した。ｒｈＩＬ－２（０．００１～３００ｎｇ）又はＣｐｄ．５及びＣｐｄ．６由来のＩＬ－２（０．００１～４５ｎｇ）を並行して試験した。２時間のインキュベーション後、ＳＥＡＰ活性を、ＱＵＡＮＴＩ－ＢｌｕｅＴＭ（２０μｌの細胞培養上清＋１８０μｌのＱＵＡＮＴＩ－ＢｌｕｅＴＭ溶液）を使用し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３マルチモードプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）で６２０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を読み取って評価した。トランスフェクトされていないサンプルをバックグラウンド対照として使用し、試験したサンプル中の得られたＯ．Ｄ．値から差し引いた。
［結果］
ｒｈＩＬ－２又はＣｐｄ．５又はＣｐｄ．６をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清に由来するＩＬ－２によるＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭＩＬ－２細胞の刺激は、三種の試験化合物全てがＳＥＡＰ産生を用量依存的な形で誘導したので、機能的であった（図１０Ａ及び１０Ｂ）。直接比較では、Ｃｐｄ．５由来のＩＬ－２は、ｒｈＩＬ－２（ＥＣ５０：１１ｎｇ／ｍｌ）と比較して約５倍強力（ＥＣ５０：０．０２ｎｇ／ｍｌ）であり、Ｃｐｄ．６はｒｈＩＬ－２（ＥＣ５０：０．１５ｎｇ／ｍｌ）と比較して約２倍強力（ＥＣ５０：０．０８ｎｇ／ｍｌ）であった。要約すると、Ｃｐｄ．５及びＣｐｄ．６由来のＩＬ－２は機能的であり、少なくともｒｈＩＬ－２と同程度に強力なＩＬ－２シグナル伝達カスケードを誘導する。
実施例１４：Ｃｐｄ．５及びＣｐｄ．６のＮＫ細胞媒介死滅アッセイ
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、腫瘍細胞を標的にして排除する能力を有し、主にＩＬ－２サイトカインによって刺激される。ＩＬ－２メカニズムを介したＮＫ細胞の活性化におけるＣｐｄ．５及びＣｐｄ．６の能力を測定するために、ＳＣＣ４細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｕｃｈｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，カタログ番号８９０６２００２ＣＲＬ－１５７３）及びナチュラルキラー９２細胞（ＮＫ－９２，ＤＳＭＺ，ＡＣＣ４８８，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓａｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＬＭＲＮＡ０１５）を使用してＳＣＣ－４細胞にＣｐｄ．５（ＩＬ－２ ｍＲＮＡ＋３×ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ）、Ｃｐｄ．６（ＩＬ－２ ｍＲＮＡ＋３×ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｉＲＮＡ）、モックＲＮＡ－１（ＩＬ－４ ｍＲＮＡ＋３×ＴＮＦ－α ｓｉＲＮＡ）、又はモックＲＮＡ－２（ＭｅｔＬｕｃ ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなし）をトランスフェクトすることによって、用量反応研究（０．１ｎＭから２．５ｎＭ）をＳＣＣ４細胞で実施した。次に、ＳＣＣ－４細胞を、黒色の９６ウェル培養プレート内で、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃で３０分間インキュベートした。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中の１０００００細胞／ウェルのＮＫ－９２エフェクター細胞を、トランスフェクトしたＳＣＣ－４標的細胞にエフェクター対標的比１０：１（Ｅ：Ｔ＝１０：１）で加えた。２４時間後、黒色の９６ウェルプレートの底を黒いホイルで密封し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＋＋、ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ、カタログ番号３－０５Ｆ００１）で３回洗浄して、懸濁状態にあったＮＫ－９２細胞を除去した。ＳＣＣ－４細胞は性質が接着性であるため、２４時間のインキュベーションにより細胞がプレートの底に強く接着し、ＮＫ－９２細胞のみが洗い流された。合理的であるのは、ＮＫ細胞がＳＣＣ－４細胞の死滅をもたらす場合、生存し洗浄後にプレートの底に付着するＳＣＣ－４細胞が少なくなり、これを、細胞生存率アッセイによって定量的に測定することができる。３Ｘ洗浄後、５０μｌのＰＢＳ＋＋と５０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０（ＣＴＧ２．０，Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｇ９２４Ｂ）試薬を各ウェルに加え、９６ウェルプレートを室温において暗所で１０分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でルミネセンスを測定し、標準設定を使用して細胞生存率を計算した。
［結果］
ＮＫ細胞媒介死滅アッセイは、Ｃｐｄ．５又はＣｐｄ．６をトランスフェクトし、ＮＫ－９２細胞と共インキュベートしたＳＣＣ－４細胞の用量依存的な細胞溶解を明らかにした。ＳＣＣ－４細胞から分泌されたＩＬ－２は、１０：１のＥ：Ｔ比でＳＣＣ－４腫瘍細胞の標的死滅を促進した（Ｃｐｄ．５で＞５０％、Ｃｐｄ．６で＞４０％、図１０Ｃ）。Ｃｐｄ．５及びＣｐ．６の両方をトランスフェクトしたＳＣＣ－４細胞について、ＮＫ細胞媒介性死滅が観察された。簡潔に言えば、Ｃｐｄ．５及びＣｐｄ．６は、用量依存的な形でＮＫ細胞を活性化することにより、期待された抗腫瘍活性を示した。
実施例１５：ＳＣＣ－４細胞でのＩＬ－２発現及びＶＥＧＦＡダウンレギュレーションにおけるＣｐｄ．７及びＣｐｄ．８の比較分析
上記のようにＳＣＣ－４細胞を培養し、トランスフェクトした。Ｃｐｄ．８（ＩＬ－２ ｍＲＮＡ＋５×ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ）に対するＣｐｄ．７（ＩＬ－２ ｍＲＮＡ＋３×ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ）の効力を評価するために、両方の化合物を使用して用量反応研究を実施した。ＳＣＣ－４細胞にＣｐｄ．７（１．１、２．２、４．４、８．８、１７．６、２６．４、３５．２、及び４４．０４ｎＭ／ウェル）又はＣｐｄ．８（０．４７、０．９４、１．８９、３．７９、７．５８、１５．１５、２２．７３、３０．３１及び３７．８８ｎＭ／ウェル）をトランスフェクトした。５時間後、培地を、ＦＢＳを含まない新鮮な増殖培地に交換し、プレートを５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートし、上清を収集した。同じ細胞培養上清中に存在するＶＥＧＦＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＫＨＧ０１１２）及びＩＬ－２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８７０２５）レベルを定量するためにＥＬＩＳＡを実施した。ＧｒａｐｈＰａｄプリズムを用いた非線形Ｈｉｌｌ結合曲線を使用して、ＶＥＧＦＡの８０％ダウンレギュレーションを計算した。
［結果］
ＶＥＧＦＡ発現のダウンレギュレーションにおけるＣｐｄ．８に対するＣｐｄ．７の阻害濃度を計算するために、Ｃｐｄ．７又はＣｐｄ．８をトランスフェクトしたＳＣＣ－４細胞において用量反応研究を実施した。細胞に、上記のように増加濃度のＣｐｄ．７又はＣｐｄ．８の何れかをトランスフェクトした。Ｃｐｄ．７と比較して、Ｃｐｄ．８は、ＳＣＣ－４細胞でのＶＥＧＦＡ発現の低下において２．５倍高い効力を示した（図１１Ａ）。８０％のＶＥＧＦダウンレギュレーションは、ＳＣＣ－４細胞において８ｎＭのＣｐｄ．８によって達成されたが、Ｃｐｄ．７では１８ｎＭで達成され、ｓｉＲＮＡのコピー数の増加は、より高レベルのＶＥＧＦダウンレギュレーションに至ることを証明している。しかし、Ｃｐｄ．８からのＩＬ－２発現は、Ｃｐｄ．７からのＩＬ－２発現よりも約２倍低かった（図１１Ｂ）。要約すると、化合物中のｓｉＲＮＡのコピー数を増やすと、ＲＮＡ干渉が増強されるが、ｍＲＮＡ標的の発現が損なわれる。
実施例１６：ＩＬ－２発現及びＶＥＧＦＡダウンレギュレーションにおけるＣｐｄ．９及びＣｐｄ．１０の経時的研究
ＳＣＣ－４細胞を、上記のように培養し、トランスフェクトした。Ｃｐｄ．１０（ＩＬ－２ ｍＲＮＡ＋３×ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ、３０ｂｐ長の３つの異なるｓｉＲＮＡ）に対するＣｐｄ．９（ＩＬ－２ ｍＲＮＡ＋３×ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ、同じｓｉＲＮＡが３回反復）の長期的効力を評価するために、Ｃｐｄ．９又はＣｐｄ．１０をトランスフェクトしたＳＣＣ－４細胞を使用して経時的研究を実施した。ＳＣＣ－４細胞にＣｐｄ．９又はＣｐｄ．１０を３０ｎＭ／ウェル濃度でトランスフェクトした。市販のＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２８４７０３）を比較のために実験に追加し、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号ＳＩＣ００２）を対照として使用した。ついで細胞を、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃においてインキュベートした。異なるウェルからのサンプルを、トランスフェクション後６時間から７２時間の間に収集した。同じ細胞培養上清中に存在するＶＥＧＦＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＫＨＧ０１１２）及びＩＬ－２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８７０２５）レベルを定量するためにＥＬＩＳＡを実施した。各時点でのトランスフェクトされていない細胞のＶＥＧＦＡレベルを１００％に設定し、ＶＥＧＦＡダウンレギュレーションのレベルをそれぞれの時点でのレベルに正規化した。
［結果］
経時的研究は、Ｃｐｄ．９及びＣｐｄ．１０の両方について同様に７２時間にわたってＩＬ－２の蓄積を示した（図１１Ｃ）。しかし、Ｃｐｄ．１０は７２時間までより強いＶＥＧＦＡダウンレギュレーションをもたらし、９５％を超えるＲＮＡ干渉レベルが達成されたが、Ｃｐｄ．９は４８時間後に８５％のＲＮＡ干渉レベルをもたらした（図１１Ｄ）。図１１Ｄに示されるように、効果は６時間の時点でさえ目に見えており、その時点でのＣｐｄ．１０によるＶＥＧＦＡダウンレギュレーション（＞３０％）はＣｐｄ．９によるＶＥＧＦＡダウンレギュレーション（２０％）より高かった。以前に観察されたように、市販のＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡは最大４５％のＶＥＧＦＡのダウンレギュレーションをもたらした。ユニバーサルなスクランブルｓｉＲＮＡは、実験段階を通してＶＥＧＦＡ発現を変化させなかった。要約すると、Ｃｐｄ．１０は、Ｃｐｄ．９と比較して効力が僅かに改善された、長期にわたるＶＥＧＦＡダウンレギュレーションを示した。
実施例１７：がんにおける複数のシグナル伝達経路の標的化：インビトロ腫瘍モデルにおける複数のｓｉＲＮＡ標的と免疫刺激性サイトカインの組み合わせ
がんは、アポトーシスが減少した細胞の制御されない増殖を促進する複数の調節不全のシグナル伝達経路を伴う複雑な疾患である。ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ａ／Ｂ（ＭＩＣＡ／Ｂ）及びプログラム細胞死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）などの免疫回避タンパク質の高発現と共に哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦＡ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子（ＫＲＡＳ）、ｃ－Ｍｙｃ癌原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ）を含む腫瘍増殖シグナルのアップレギュレーションが腫瘍細胞において観察される。更に、腫瘍微小環境は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）などの免疫刺激性サイトカインの低下したレベルを示す。従って、免疫刺激性サイトカインのアップレギュレーションと共に、腫瘍増殖に関与する重要なタンパク質のダウンレギュレーションは、がん治療の魅力的なアプローチとなりうる。ＲＮＡ干渉及び免疫刺激性サイトカインのアップレギュレーションによる複数の腫瘍促進標的のダウンレギュレーションを測定するために、Ｃｐｄ．１１、Ｃｐｄ．１２、Ｃｐｄ．１５、及びＣｐｄ．１６を、抗腫瘍インターロイキンｍＲＮＡと共に一つを超えるｓｉＲＮＡ標的を含むようにデザインした。複数のシグナル伝達経路の標的化におけるこれらの化合物の効果を、ＳＣＣ－４細胞、Ａ５４９細胞及びヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ２５１ＭＧ）細胞で評価した。
［ＳＣＣ－４細胞における頭頸部がんインビトロモデル］
ヒト舌扁平上皮癌細胞株（ＳＣＣ－４）は、５５歳の男性の舌に由来し、この実施例において頭頸部がんインビトロモデルをシミュレートするために使用した。ＳＣＣ－４細胞を培養し、上記のようにトランスフェクトした。Ｃｐｄ．１１（ＩＬ－１２ ｍＲＮＡ＋１×ＩＤＨ１ ｓｉＲＮＡ＋１×ＣＤＫ４ ｓｉＲＮＡ＋１×ＣＤＫ６ ｓｉＲＮＡ）、Ｃｐｄ．１２（ＩＬ－１２ ｍＲＮＡ＋１×ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ＋１×ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ＋１×ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ）及びＣｐｄ．１５（ＩＬ－１５ ｍＲＮＡ＋１×ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ＋２×ＣＤ１５５ ｓｉＲＮＡ）を使用して並行して複数のがん関連標的の調節を評価するために、ＳＣＣ－４細胞にこれらの化合物を１０及び３０ｎＭ／ウェル濃度でトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後、培地を、ＦＢＳを含まない新鮮な増殖培地に交換し、プレートを５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートし、上清を収集した。ＥＬＩＳＡを実施して、細胞培養上清中に存在するヒトＩＬ－１２ｐ７０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８－７１２６）及びヒトＩＬ－１５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８－７６２０）レベルを定量した。各細胞可溶化物をまたプロセシングして、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴＴＭ１－Ｓｔｅｐ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ２５５９９）とプライマー（プライマー配列の詳細は表６に列挙）を使用してＲＴ－ｑＰＣＲによるトランスフェクトされていないサンプルに対する相対定量により、ｓｉＲＮＡ標的遺伝子のＲＮＡ量を測定した。参照対照としてヒト１８ｓ ｒＲＮＡを使用した。
［結果］
ＩＤＨ１、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６の１×ｓｉＲＮＡとＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１１並びにＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ ＫＲＡＳの１×ｓｉＲＮＡとＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１２の効果を、Ｃｐｄ．１１又はＣｐｄ．１２の二通りの異なる用量（１０ｎＭ及び３０ｎＭ）をトランスフェクトしたＳＣＣ－４細胞におけるＩＬ－１２発現及び標的遺伝子の同時ダウンレギュレーションについて評価した。データは、Ｃｐｄ．１１及びＣｐｄ．１２の両方が、図１２Ａ及び１２Ｅに示されるように、有意なＩＬ－１２タンパク質の発現及び分泌（＞７０００ｐｇ／ｍｌ）をもたらすことを実証している。同じ細胞可溶化物で、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６ ＲＮＡ転写物に対するＣｐｄ．１１のＲＮＡ干渉を評価した。図１２Ｂに示されるように、Ｃｐｄ．１１は、内因性ＩＤＨ１（１０ｎＭで７５％、３０ｎＭで９０％）、ＣＤＫ４（１０ｎＭで９３％、３０ｎＭで９８％）及びＣＤＫ６（１０ｎＭで８５％、３０ｎＭで９６％）レベルを用量依存的な形でダウンレギュレートした。ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ及びＫＲＡＳ ＲＮＡ転写物に対するＣｐｄ．１２のＲＮＡ干渉を、図１２Ｅの同じ細胞可溶化物で評価した。図１２Ｆに示されるように、Ｃｐｄ．１２は、内因性ＥＧＦＲ（１０ｎＭで８０％、３０ｎＭで９２％）、ＫＲＡＳ（１０ｎＭで９２％、３０ｎＭで８３％）及びｍＴＯＲ（１０ｎＭで９２％、３０ｎＭで９８％）レベルを、ＫＲＡＳについては用量依存的な形で、ダウンレギュレートした。
加えて、１×ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ、２×ＣＤ１５５ ｓｉＲＮＡ及びＩＬ－１５ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１５の効果を、Ｃｐｄ．１５の二通りの異なる用量（１０ｎＭ及び３０ｎＭ）をトランスフェクトしたＳＣＣ－４細胞におけるＩＬ－１５発現及び標的遺伝子の同時ダウンレギュレーションについて評価した。結果は、図１４Ｃに示されるように、Ｃｐｄ．１５がＩＬ－１５タンパク質（＞７９０ｐｇ／ｍｌ）を発現することを示した。同じ細胞可溶化物で、ＶＥＧＦＡ及びＣＤ１５５ ＲＮＡ転写物に対するＣｐｄ．１５のＲＮＡ干渉を、ｑＰＣＲを使用して評価した。図１４Ｄに示すように、Ｃｐｄ．１５は、内因性ＶＥＧＦＡ（１０ｎＭで９５％、３０ｎＭで９８％）及びＣＤ１５５（１０ｎＭで７３％、３０ｎＭで７１％）レベルをダウンレギュレートした。要するに、Ｃｐｄ．１１、Ｃｐｄ．１２、及びＣｐｄ．１５を使用して複数のシグナル伝達経路を標的とし、ｓｉＲＮＡを介して複数の腫瘍標的をダウンレギュレートし、同時にＩＬ－１２又はＩＬ－１５サイトカインをアップレギュレートして、免疫細胞の浸潤又は増殖を促進することにより抗腫瘍活性をもたらすことができる。
［Ａ５４９細胞における肺がんインビトロモデル］
Ａ５４９細胞は、５８歳男性の癌性肺に由来する腺癌性ヒト肺胞基底上皮細胞であり、この実施例において肺がんインビトロモデルをシミュレートするために使用した。Ａ５４９細胞を培養し、上記のようにトランスフェクトした。Ｃｐｄ．１１（ＩＬ－１２ ｍＲＮＡ＋１×ＩＤＨ１ ｓｉＲＮＡ＋１×ＣＤＫ４ ｓｉＲＮＡ＋１×ＣＤＫ６ ｓｉＲＮＡ）、Ｃｐｄ．１２（ＩＬ－１２ ｍＲＮＡ＋１×ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ＋１×ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ＋１×ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ）及びＣｐｄ．１５（ＩＬ－１５ ｍＲＮＡ＋１×ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ＋２×ＣＤ１５５ ｓｉＲＮＡ）を使用して並行して複数のがん関連標的の調節を評価するために、Ａ５４９細胞にこれらの化合物を１０及び３０ｎＭ／ウェル濃度でトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後、培地を、ＦＢＳを含まない新鮮な増殖培地に交換し、プレートを５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートし、上清を収集した。ＥＬＩＳＡを実施して、細胞培養上清中に存在するヒトＩＬ－１２ｐ７０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８－７１２６）及びヒトＩＬ－１５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８－７６２０）レベルを定量した。各細胞可溶化物をまたプロセシングして、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴＴＭ１－Ｓｔｅｐ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ２５５９９）とプライマー（プライマー配列の詳細は表６に列挙）を使用してＲＴ－ｑＰＣＲによるトランスフェクトされていないサンプルに対する相対定量により、ｓｉＲＮＡ標的遺伝子のＲＮＡ量を測定した。参照対照としてヒト１８ｓ ｒＲＮＡを使用した。
［結果］
ＩＤＨ１、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６の１×ｓｉＲＮＡとＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１１並びにＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ ＫＲＡＳの１×ｓｉＲＮＡとＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１２の効果を、Ｃｐｄ．１１又はＣｐｄ．１２の二通りの異なる用量（１０ｎＭ及び３０ｎＭ）をトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＩＬ－１２発現及び標的遺伝子の同時のダウンレギュレーションについて評価した。データは、Ｃｐｄ．１１及びＣｐｄ．１２の両方が、図１２Ｃ及び１２Ｇに示されるように、有意なＩＬ－１２タンパク質の発現及び分泌（＞１９２５ｐｇ／ｍｌ）をもたらすことを実証している。同じ細胞可溶化物で、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６ ＲＮＡ転写物に対するＣｐｄ．１１のＲＮＡ干渉を評価した。図１２Ｄに示されるように、Ｃｐｄ．１１は、内因性ＩＤＨ１（１０ｎＭで８８％、３０ｎＭで９２％）、ＣＤＫ４（１０ｎＭで７４％、３０ｎＭで８０％）及びＣＤＫ６（１０ｎＭで５８％、３０ｎＭで６０％）レベルをダウンレギュレートした。ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ及びＫＲＡＳ ＲＮＡ転写物に対するＣｐｄ．１２のＲＮＡ干渉を、図１２Ｇの同じ細胞可溶化物で評価した。図１２Ｈに示されるように、Ｃｐｄ．１２は、３０ｎＭのＣｐｄ．１２をトランスフェクトしたＳＣＣ－４細胞において内因性ＥＧＦＲレベルをダウンレギュレートした（最大５８％）。この細胞株では、内因性ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現は低すぎてＫＲＡＳ ｑＰＣＲアッセイで検出できず、レベルは対照条件下（ＢＱＬ）でも定量限界を下回った。図１２Ｈに示すように、Ｃｐｄ．１２は内因性ｍＴＯＲレベルを用量依存的な形でダウンレギュレートした（１０ｎＭで６７％、３０ｎＭで７９％）。
加えて、１×ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ、２×ＣＤ１５５ ｓｉＲＮＡ、及びＩＬ－１５ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１５の効果を、Ｃｐｄ．１５の異なる用量（１０ｎＭ及び３０ｎＭ）をトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＩＬ－１５発現及び標的遺伝子の同時ダウンレギュレーションについて評価した。図１４Ａに示されるように、Ｃｐｄ．１５は、有意なＩＬ－１５タンパク質の発現及び分泌をもたらす（＞７１５ｐｇ／ｍｌ）。同じ細胞可溶化物で、ＶＥＧＦＡ及びＣＤ１５５ ＲＮＡ転写物に対するＣｐｄ．１５のＲＮＡ干渉を、ｑＰＣＲを使用して評価した。図１４Ｂに示すように、Ｃｐｄ．１５は、内因性ＶＥＧＦＡ（１０ｎＭで５８％、３０ｎＭで５１％）及びＣＤ１５５（１０ｎＭで４３％、３０ｎＭで４２％）レベルをダウンレギュレートした。要するに、Ｃｐｄ．１１、Ｃｐｄ．１２、及びＣｐｄ．１５を使用して複数のシグナル伝達経路を標的とし、ｓｉＲＮＡを介して複数の腫瘍標的をダウンレギュレートし、同時にＩＬ－１２又はＩＬ－１５サイトカインをアップレギュレートして、免疫細胞の浸潤又は増殖を促進することにより抗腫瘍活性をもたらすことができる。
［Ｕ２５１ＭＧ細胞における神経膠芽腫がんインビトロモデル］
ヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ２５１ＭＧ；ＤＳＭＺ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号０９０６３００１）はヒト悪性神経膠芽腫に由来した。Ｕ２５１ＭＧ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル高グルコース培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ｄ０８２２）中に維持した。細胞を２００００細胞／ウェルで９６ウェル培養プレートに播種し、トランスフェクション前に５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートした。トランスフェクション前に細胞をコンフルエンシー＜７０％に達するようにＤＭＥＭ増殖培地中で増殖させた。その後、Ｕ２５１ＭＧ細胞に、１：１ｗ／ｖの化合物対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの比率で製造元の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣｐｄ．１６（ＩＬ－１５ ｍＲＮＡ＋１×ＶＥＧＦＡ ｓｉＲＮＡ＋１×ＰＤ－Ｌ１ ｓｉＲＮＡ＋１×ｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ）を１０ｎＭ又は３０ｎＭの濃度でトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中の９０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，カタログ番号３１９８５－０７０）及び１０μｌの化合物及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓａｎｇｅｒＭａｘ複合体と交換した。５時間後、培地をＦＢＳを含まない新鮮な増殖培地に交換し、プレートを５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で３７℃において２４時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡを実施して、細胞培養上清中に存在するヒトＩＬ－１２ｐ７０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８－７１２６）及びヒトＩＬ－７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＥＨＩＬ７）レベルを定量した。各細胞可溶化物をまたプロセシングして、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴＴＭ１－Ｓｔｅｐ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ２５５９９）とプライマー（プライマー配列の詳細は表６に列挙）を使用してＲＴ－ｑＰＣＲによるトランスフェクトされていないサンプルに対する相対定量により、ｓｉＲＮＡ標的遺伝子のＲＮＡ量を測定した。参照対照としてヒト１８ｓ ｒＲＮＡを使用した。
［結果］
ＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１及びｃ－Ｍｙｃの１×ｓｉＲＮＡとＩＬ－１５ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１６の効果を、２つの異なる用量（１０ｎＭ及び３０ｎＭ）のＣｐｄ．１６をトランスフェクトしたＵ２５１ ＭＧ細胞においてＩＬ－１５発現及び標的遺伝子の同時ダウンレギュレーションについて評価した。データは、図１４Ｅに示されるように、Ｃｐｄ．１６がＩＬ－１５タンパク質（＞３００ｐｇ／ｍｌ）を発現することを示している。同じ細胞可溶化物で、ＶＥＧＦＡ、ＰＤ－Ｌ１、及びｃ－Ｍｙｃ ＲＮＡ転写物に対するＣｐｄ．１６のＲＮＡ干渉を評価した。図１４Ｆに示されるように、Ｃｐｄ．１６は、内因性ＶＥＧＦＡを１０及び３０ｎＭレベルで９９％ダウンレギュレートし、ＰＤ－Ｌ１を１０及び３０ｎＭレベルで＞９７％、ｃ－Ｍｙｃを１０及び３０ｎＭレベルで＞９９％ダウンレギュレートした。要約すると、Ｃｐｄ．１６を使用して複数のシグナル伝達経路を標的とし、ｓｉＲＮＡを介して複数の腫瘍学標的をダウンレギュレートし、同時にＩＬ－１５サイトカインをアップレギュレートして、ＮＫ細胞及びＴ細胞などの抗腫瘍免疫細胞の増殖を促進することにより抗腫瘍活性をもたらすことができる。
実施例１８：インビトロ腫瘍モデルにおける単一ｓｉＲＮＡ標的と免疫刺激性サイトカインの組み合わせ
この実施例は、免疫刺激性サイトカインの過剰発現と共にダウンレギュレーションのために単一腫瘍促進遺伝子を標的とすることの影響である。ＳＣＣ－４細胞、Ａ５４９細胞、及びＵ２５１ＭＧ細胞におけるＣｐｄ．１３（ＩＬ－１２ ｍＲＮＡ＋３×ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡ）、Ｃｐｄ．１４（ＩＬ－１２ ｍＲＮＡ＋３×ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ）及びＣｐｄ．１７（ＩＬ－７ ｍＲＮＡ＋３×ＰＤ－Ｌ１ ｓｉＲＮＡ）のがん関連標的及びサイトカイン分泌の並行調節を評価した。三種の細胞全てを培養し、上記化合物の二つの異なる用量（１０ｎＭ及び３０ｎＭ）で上記のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、上清を回収した。ＥＬＩＳＡを実施して、細胞培養上清中に存在するヒトＩＬ－１２ｐ７０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８－７１２６）及びヒトＩＬ－７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＥＨＩＬ７）レベルを定量した。各細胞可溶化物をまたプロセシングして、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴＴＭ１－Ｓｔｅｐ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ２５５９９）とプライマー（プライマー配列の詳細は表６に列挙）を使用してＲＴ－ｑＰＣＲによるトランスフェクトされていないサンプルに対する相対定量により、ｓｉＲＮＡ標的遺伝子のＲＮＡ量を測定した。参照対照としてヒト１８ｓ ｒＲＮＡを使用した。
［結果］
３×ＥＧＦＲ ｓｉＲＮＡとＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１３の効果を、２つの異なる用量（１０ｎＭ及び３０ｎＭ）のＣｐｄ．１３をトランスフェクトしたＡ５４９細胞及びＳＣＣ－４細胞においてＩＬ－１２発現と同時のＥＧＦＲ遺伝子ダウンレギュレーションについて評価した。図１３Ａ及び１３Ｂに示されるように、Ｃｐｄ．１３は、Ａ５４９細胞（最大２０３０ｐｇ／ｍｌ）及びＳＣＣ－４細胞（最大７４２０ｐｇ／ｍｌ）の両方でＩＬ－１２タンパク質を発現した。同じ細胞可溶化物で、ＥＧＦＲ ＲＮＡ転写物に対するＣｐｄ．１３のＲＮＡ干渉を評価した。図１３Ｄ及び図１３Ｅに示されるように、Ｃｐｄ．１３は内因性ＥＧＦＲレベルをダウンレギュレートした（Ａ５４９細胞で３０～４０％、ＳＣＣ－４細胞で８５～９２％）。
同様に、３×ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ及びＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１４を、２つの異なる用量（１０ｎＭ及び３０ｎＭ）のＣｐｄ．１４でトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＩＬ－１２発現及び同時のｍＴＯＲ遺伝子ダウンレギュレーションについて評価した。図１３Ｃに示すように、Ｃｐｄ．１４はＩＬ－１２タンパク質を発現した（１０ｎＭのＣｐｄ．１４をトランスフェクトした細胞では２８００ｐｇ／ｍｌまで、３０ｎＭのＣｐｄ．１４をトランスフェクトした細胞では３６５ｐｇ／ｍｌまで（１０ｎＭのＣｐｄ．１４と比較して＞７倍低い））。３０ｎＭのＣｐｄ．１４をトランスフェクトした細胞では、ｍＴＯＲが細胞生存マーカーであるため、高いレベルの細胞死が観察された。同じ細胞可溶化物で、ｍＴＯＲ ＲＮＡ転写物に対するＣｐｄ．１４のＲＮＡ干渉を評価した。図１３Ｆに示されるように、Ｃｐｄ．１４は内因性ｍＴＯＲレベルをダウンレギュレートした（Ａ５４９細胞において５０～７３％）。
Ｕ２５１ ＭＧ細胞において、３×ＰＤ－Ｌ１ ｓｉＲＮＡ及びＩＬ－７ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１７（１０ｎＭ及び３０ｎＭ濃度）の効果を、ＩＬ－７発現及び同時のＰＤ－Ｌ１遺伝子ダウンレギュレーションについて評価した。図１４Ｇに示すように、Ｃｐｄ．１７はＩＬ－７タンパク質を発現した（１３００ｐｇ／ｍｌまで）。同じ細胞可溶化物で、ＰＤ－Ｌ１ ＲＮＡ転写物に対するＣｐｄ．１４のＲＮＡ干渉を評価した。図１４Ｈに示されるように、Ｃｐｄ．１４は内因性ＰＤ－Ｌ１レベル（Ｕ２５１ ＭＧ細胞において６０～８７％）を用量に関連する形でダウンレギュレートした。
実施例１９：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）管形成アッセイ：インビトロ血管新生モデル
Ｃｐｄ．５及びＣｐｄ．１０のＶＥＧＦＡダウンレギュレーション効力の機能的関連性を評価するために、ＳＣＣ－４細胞を培養し、上記のようにＣｐｄ．５及びＣｐｄ．１０（２０及び３０ｎＭ／ウェル）をトランスフェクトした。５時間後、培地を、ＦＢＳを含まない新鮮な増殖培地に交換し、プレートを３７℃において５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気下で２４時間インキュベートして、ＶＥＧＦＡを産生させて培地中に分泌させ、上清を回収し、ＶＥＧＦＡレベルをＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＫＨＧ０１１２）によって定量した。同じ細胞培養上清を使用して、Ｃｐｄ．５及びＣｐｄ．１０での処理がない場合又はこれらでの処理の２４時間後に分泌されたＶＥＧＦがヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の血管新生を誘導する機能的能力を評価した。ＨＵＶＥＣは、適切な細胞外マトリックスサポートと共にサブコンフルエントな密度で蒔かれると、三次元の毛管様管状構造を形成（疑似管形成とも呼ばれる）する能力がある。血管新生モデルを、このインビトロでのＣｐｄ．５及びＣｐｄ．１０の抗血管新生活性を測定するために樹立した。ＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ，カタログ番号ＣＲＬ１７３０）を、マトリゲル被覆Ｉｂｉｄｉプレートへの分注前に、３７℃において５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で２４時間、１０％のＦＢＳ（ＡＴＣＣ，番号３０－２０２０）、０．１ｍｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ，番号Ｈ３３９３）、及び３０μｇ／ｍＬのＥＣＧＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５４００６）を補充したＦ－１２Ｋ培地（ＡＴＣＣカタログ番号３０－２００４）で維持した。実験の２４時間前に、ピペット先端とμ－スライド血管新生Ｉｂｉｄｉプレート（Ｉｂｉｄｉ，カタログ番号８１５０６）を－２０℃に置いた。成長因子を減らしたＢＤマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号３５４２３０）を冷蔵庫で氷上で一晩解凍した。実験当日、マトリゲル適用中、マトリゲル、ピペット先端、及びプレートを層流で氷上に保った。１０μｌのマトリゲルをＩｂｉｄｉプレートの各内側ウェルに塗布し、それが上部ウェルに流れ込まないようにした。マトリゲルでコーティングしたプレートを、加湿チャンバー内に３７℃で１時間置いた。ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、標準的な手順を使用してカウントし、細胞をＳＣＣ－４細胞上清（未処理）又はＣｐｄ．５又はＣｐｄ．１０（２０ｎＭ又は３０ｎＭ）或いは組換えＶＥＧＦＡ（０．５又は５ｎｇ／ｍＬ）を含む培地で処理したＳＣＣ－４細胞上清に由来する細胞培地に５０００細胞／５０μＬの濃度で懸濁させた。新鮮なＨＵＶＥＣ培地をベースライン対照として使用した。マトリゲル重合後、５０μＬの上記の細胞懸濁液を各ウェル中にロードした。Ｉｂｉｄｉプレートを３７℃、５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞を顕微鏡で可視化し、画像を撮影し（０時間と６時間）、管形成と枝分かれ部位の数を解析した。
［結果］
ＩＬ－２コード配列とＶＥＧＦＡを標的とする３種のｓｉＲＮＡを有するようにデザインされたＣｐｄ．５及びＣｐｄ．１０を試験して、ＳＣＣ－４細胞におけるＶＥＧＦＡ発現の干渉を評価した。対照条件下で、ＳＣＣ－４細胞は約０．８ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡを産生し、培地中に分泌した（図１５Ａ）。Ｃｐｄ．５でのトランスフェクションは、ＶＥＧＦＡレベルを２０及び３０ｎＭでそれぞれ７６％及び６０％まで低下させたのに対し、Ｃｐｄ．１０処理は、２０及び３０ｎＭの両方でＶＥＧＦＡをより強力に３０％まで低下させた（図１５Ａ）。これらの細胞培養上清の５０μｌを、ＨＵＶＥＣ細胞のインビトロ血管新生のマーカーとして枝分かれ部位形成を誘導するその機能的能力について分析し、未処理の対照又は規定のｒｈ－ＶＥＧＦＡ濃度（０．５及び５ｎｇ／ｍＬ）の培地と比較した。図１５Ｂは、管形成の尺度としての枝分かれ部位を増加させる効力が培地ＶＥＧＦＡとよく相関したことを示している。対照条件下のＳＣＣ－４細胞は、二つのｒｈ－ＶＥＧＦＡ対照と同様に、有意な枝分かれ部位形成を誘導するＶＥＧＦＡを産生した。Ｃｐｄ．５とＣｐｄ．１０の両方の上清は、ＶＥＧＦＡレベルの低下の結果として枝分かれ部位を強く低下させ、Ｃｐｄ．１０の上清は、ＶＥＧＦＡレベルが低いため、Ｃｐｄ．５よりも枝分かれ部位形成を低下させる効力が僅かに強かった。
ここに記載の実施例及び実施態様は、例証のみを目的としており、当業者に示唆される様々な変形又は変更は、この出願の精神及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきである。

Claims (147)

  1. 第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組成物であって、第一のＲＮＡがサイトカインをコードし、第二のＲＮＡが、腫瘍増殖に関連する遺伝子の発現を調節する遺伝要素をコードする、組成物。
  2. サイトカインが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントである、請求項１に記載の組成物。
  3. サイトカインが、配列番号：２４、４４、４７、６８、及び８０からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  4. サイトカインがシグナルペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  5. シグナルペプチドが、未修飾シグナルペプチド配列又は修飾シグナルペプチド配列を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 未修飾シグナルペプチド配列が、配列番号：２６及び１２５～１２８からなる群から選択される配列を含む、請求項５に記載の組成物。
  7. ＩＬ－２がシグナルペプチドを含む、請求項２に記載の組成物。
  8. シグナルペプチドが未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む、請求項７に記載の組成物。
  9. 未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列が、配列番号：２６に列挙される配列を含む、請求項８に記載の組成物。
  10. シグナルペプチドが、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む、請求項７に記載の組成物。
  11. 少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列が、配列番号：２７～２９からなる群から選択される配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
  12. 第一のＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１に記載の組成物。
  13. 第二のＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の組成物。
  14. ｓｉＲＮＡが、腫瘍増殖に関連する遺伝子のｍＲＮＡに結合することができる、請求項１３に記載の組成物。
  15. 第二のＲＮＡが１、２、３、４、５又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡを含み、ｓｉＲＮＡの各種が、同じｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
  16. 第二のＲＮＡが、１、２、３、４、５又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含む、請求項１３に記載の組成物。
  17. １、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡの各種が、配列番号：２２に列挙される配列を含むリンカーによって連結される、請求項１５又は１６に記載の組成物。
  18. 腫瘍増殖に関連する遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子を含む、請求項１に記載の組成物。
  19. 血管新生に関連する遺伝子が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、その断片、又はその機能的バリアントをコードする、請求項１８に記載の組成物。
  20. ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦＡ、その断片、又はその機能的バリアントである、請求項１９に記載の組成物。
  21. ＶＥＧＦＡが、配列番号：３５に列挙される配列を含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、その断片、又はその機能的バリアントである、請求項１９に記載の組成物。
  23. ＶＥＧＦが、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、その断片、又はその機能的バリアントである、請求項１９に記載の組成物。
  24. 腫瘍増殖に関連する遺伝子が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ＣＤＫ６、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子（ＫＲＡＳ）、分化抗原群（ＣＤ１５５）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、又はｍｙｃ癌原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ）を含む、請求項１に記載の組成物。
  25. 腫瘍増殖に関連する遺伝子が、配列番号：５０、５３、５６、５９、６２、６５、７１、７４、及び７７からなる群から選択される配列を含む、請求項２４に記載の組成物。
  26. 第一のＲＮＡがリンカーによって第二のＲＮＡに連結される、請求項１に記載の組成物。
  27. リンカーが、ｔＲＮＡリンカー又は配列番号：２１に列挙される配列を含むリンカーを含む、請求項２６に記載の組成物。
  28. ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、又はコザック配列を更に含む、請求項１に記載の組成物。
  29. 第一のＲＮＡと第二のＲＮＡが共に組換え体である、請求項１から２８の何れか一項に記載の組成物。
  30. 第二のＲＮＡに連結された第一のＲＮＡを含む組成物であって、第一のＲＮＡがサイトカインをコードし、第二のＲＮＡが、免疫系による認識に関連する遺伝子の発現を調節する遺伝要素をコードする、組成物。
  31. サイトカインが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、その断片、又はその機能的バリアントである、請求項３０に記載の組成物。
  32. ＩＬ－２が、配列番号：２４を含む配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
  33. ＩＬ－２がシグナルペプチドを含む、請求項３１に記載の組成物。
  34. シグナルペプチドが、未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. ＩＬ－２シグナルペプチド配列が、配列番号：２６に列挙される配列を含む、請求項３４に記載の組成物。
  36. シグナルペプチドが、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
  37. 少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列が、配列番号：２７～２９からなる群から選択される配列を含む、請求項３６に記載の組成物。
  38. 第一のＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項３０に記載の組成物。
  39. 第二のＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項３０に記載の組成物。
  40. ｓｉＲＮＡが、免疫系による認識に関連する遺伝子のｍＲＮＡに結合することができる、請求項３９に記載の組成物。
  41. 免疫系による認識に関連する遺伝子が、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、その断片、又はその機能的バリアントをコードする、請求項４０に記載の組成物。
  42. ＭＩＣＡが配列番号：３８に列挙される配列を含む、請求項４１に記載の組成物。
  43. 免疫系による認識に関連する遺伝子が、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、その断片、又はその機能的バリアントをコードする、請求項４０に記載の組成物。
  44. ＭＩＣＢが、配列番号：４１に列挙される配列を含む、請求項４３に記載の組成物。
  45. 免疫系による認識に関連する遺伝子が、小胞体タンパク質（ＥＲｐ５）、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントをコードする、請求項４０に記載の組成物。
  46. ＡＤＡＭがＡＤＡＭ１７である、請求項４５に記載の組成物。
  47. 第二のＲＮＡが、１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡを含み、ｓｉＲＮＡの各種が、同じｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含む、請求項３９に記載の組成物。
  48. 第二のＲＮＡが、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含む、請求項３９に記載の組成物。
  49. １、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡの各種が、配列番号：２２に列挙される配列を含むリンカーによって連結される、請求項４７又は４８に記載の組成物。
  50. 第一のＲＮＡがリンカーによって第二のＲＮＡに連結される、請求項３０に記載の組成物。
  51. リンカーが、ｔＲＮＡリンカー又は配列番号：２１に列挙される配列を含むリンカーを含む、請求項５０に記載の組成物。
  52. ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、又はコザック配列を更に含む、請求項３０に記載の組成物。
  53. 第一のＲＮＡと第二のＲＮＡが共に組換え体である、請求項３０から５２の何れか一項に記載の組成物。
  54. 血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、分化抗原群１５５（ＣＤ１５５）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ｍｙｃ癌原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントの発現を調節する遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結された、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントをコードする第一のＲＮＡを含む、組成物。
  55. 第一のＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項５４に記載の組成物。
  56. ＩＬ－２が、配列番号：２４を含む配列を含む、請求項５４に記載の組成物。
  57. ＩＬ－２がシグナルペプチドを含む、請求項５４に記載の組成物。
  58. シグナルペプチドが未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む、請求項５７に記載の組成物。
  59. ＩＬ－２シグナルペプチド配列が、配列番号：２６に列挙される配列を含む、請求項５８に記載の組成物。
  60. シグナルペプチドが、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む、請求項５７に記載の組成物。
  61. 少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列が、配列番号：２７～２９からなる群から選択される配列を含む、請求項６０に記載の組成物。
  62. ＩＬ－１５が、配列番号：６８を含む配列を含む、請求項５４に記載の組成物。
  63. ＩＬ－１５がシグナルペプチドを含む、請求項５４に記載の組成物。
  64. シグナルペプチドが未修飾ＩＬ－１５シグナルペプチド配列を含む、請求項６３に記載の組成物。
  65. 未修飾ＩＬ－１５シグナルペプチド配列が、配列番号：１４４に列挙される配列を含む、請求項６４に記載の組成物。
  66. 第二のＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項５４に記載の組成物。
  67. ｓｉＲＮＡが、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＰＩＧＦ、ＣＤ１５５、ＰＤ－Ｌ１、又はｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡに結合することができる、請求項６６に記載の組成物。
  68. ＶＥＧＦＡが、配列番号：３５を含む配列を含む、請求項６７に記載の組成物。
  69. ＣＤ１５５が、配列番号：７１を含む配列を含む、請求項６７に記載の組成物。
  70. ＰＤ－Ｌ１が、配列番号：７４を含む配列を含む、請求項６７に記載の組成物。
  71. ｃ－Ｍｙｃが、配列番号：７７を含む配列を含む、請求項６７に記載の組成物。
  72. 第二のＲＮＡが１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡを含み、ｓｉＲＮＡの各種が、同じｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含む、請求項６６に記載の組成物。
  73. 第二のＲＮＡが、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含む、請求項６６に記載の組成物。
  74. １、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡの各種が、配列番号：２２に列挙される配列を含むリンカーによって連結される、請求項７２又は７３に記載の組成物。
  75. 第一のＲＮＡがリンカーによって第二のＲＮＡに連結される、請求項５４に記載の組成物。
  76. リンカーが、ｔＲＮＡリンカー又は配列番号：２１を含む配列を含むリンカーを含む、請求項７５に記載の組成物。
  77. ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、又はコザック配列を更に含む、請求項５４に記載の組成物。
  78. 第一のＲＮＡと第二のＲＮＡが共に組換え体である、請求項５４から７７の何れか一項に記載の組成物。
  79. ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、小胞体タンパク質（ＥＲｐ５）、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントの発現を調節する遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結された、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、その断片、又はその機能的バリアントをコードする第一のＲＮＡを含む、組成物。
  80. ＡＤＡＭがＡＤＡＭ１７である、請求項７９に記載の組成物。
  81. 第一のＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項７９に記載の組成物。
  82. ＩＬ－２が、配列番号：２４を含む配列を含む、請求項７９に記載の組成物。
  83. ＩＬ－２がシグナルペプチドを含む、請求項７９に記載の組成物。
  84. シグナルペプチドが未修飾ＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む、請求項８３に記載の組成物。
  85. ＩＬ－２シグナルペプチド配列が、配列番号：２６に列挙される配列を含む、請求項８４に記載の組成物。
  86. シグナルペプチドが、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列を含む、請求項８３に記載の組成物。
  87. 少なくとも一つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって修飾されたＩＬ－２シグナルペプチド配列が、配列番号：２７～２９からなる群から選択される配列を含む、請求項８６に記載の組成物。
  88. 第二のＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項７９に記載の組成物。
  89. ｓｉＲＮＡが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＥＲｐ５、ＡＤＡＭ、又はＭＭＰのｍＲＮＡに結合することができる、請求項８８に記載の組成物。
  90. ＭＩＣＡが、配列番号：３８を含む配列を含む、請求項８９に記載の組成物。
  91. ＭＩＣＢが、配列番号：４１を含む配列を含む、請求項８９に記載の組成物。
  92. ＡＤＡＭがＡＤＡＭ１７である、請求項８９に記載の組成物。
  93. 第二のＲＮＡが１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡを含み、ｓｉＲＮＡの各種が、同じｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含む、請求項８８に記載の組成物。
  94. 第二のＲＮＡが、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含む、請求項８８に記載の組成物。
  95. １、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡの各種が、配列番号：２２に列挙される配列を含むリンカーによって連結される、請求項９３又は９４に記載の組成物。
  96. 第一のＲＮＡがリンカーによって第二のＲＮＡに連結される、請求項７９に記載の組成物。
  97. リンカーが、ｔＲＮＡリンカー又は配列番号：２１に列挙される配列を含むリンカーを含む、請求項９６に記載の組成物。
  98. ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、又はコザック配列を更に含む、請求項７９に記載の組成物。
  99. 第一のＲＮＡと第二のＲＮＡが共に組換え体である、請求項７９から９８の何れか一項に記載の組成物。
  100. イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ＣＤＫ６、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子（ＫＲＡＳ）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントの発現を調節する遺伝要素をコードする第二のＲＮＡに連結された、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、ＩＬ－７、それらの断片、又はそれらの機能的バリアントをコードする第一のＲＮＡを含む、組成物。
  101. 第一のＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１００に記載の組成物。
  102. ＩＬ－１２が、配列番号：４４又は配列番号：４７を含む配列を含む、請求項１００に記載の組成物。
  103. ＩＬ－１２がシグナルペプチドを含む、請求項１００に記載の組成物。
  104. シグナルペプチドが未修飾ＩＬ－１２シグナルペプチドを含む、請求項１０３に記載の組成物。
  105. 未修飾ＩＬ－１２シグナルペプチドが、配列番号：１４２又は配列番号：１４３に列挙される配列を含む、請求項１０４に記載の組成物。
  106. ＩＬ－７が、配列番号：８０を含む配列を含む、請求項１００に記載の組成物。
  107. ＩＬ－７がシグナルペプチドを含む、請求項１００に記載の組成物。
  108. シグナルペプチドが未修飾ＩＬ－７シグナルペプチドを含む、請求項１０７に記載の組成物。
  109. 未修飾ＩＬ－７シグナルペプチドが、配列番号：１２８に列挙される配列を含む、請求項１０８に記載の組成物。
  110. 第二のＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１００に記載の組成物。
  111. ｓｉＲＮＡが、ＩＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ｍＴＯＲ、ＫＲＡＳ、又はＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡに結合することができる、請求項１１０に記載の組成物。
  112. ＩＤＨ１が、配列番号：５０を含む配列を含む、請求項１１１に記載の組成物。
  113. ＣＤＫ４が、配列番号：５３を含む配列を含む、請求項１１１に記載の組成物。
  114. ＣＤＫ６が、配列番号：５６を含む配列を含む、請求項１１１に記載の組成物。
  115. ｍＴＯＲが、配列番号：６２を含む配列を含む、請求項１１１に記載の組成物。
  116. ＥＧＦＲが、配列番号：５９を含む配列を含む、請求項１１１に記載の組成物。
  117. ＫＲＡＳが、配列番号：６５を含む配列を含む、請求項１１１に記載の組成物。
  118. ＰＤ－Ｌ１が、配列番号：７４を含む配列を含む、請求項１１１に記載の組成物。
  119. 第二のＲＮＡが１、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡを含み、ｓｉＲＮＡの各種が、同じｍＲＮＡの異なる領域を標的とする異なる配列を含む、請求項１１０に記載の組成物。
  120. 第二のＲＮＡが、１、２、３、４、５、又はそれ以上の重複種のｓｉＲＮＡを含む、請求項１１０に記載の組成物。
  121. １、２、３、４、５、又はそれ以上の種のｓｉＲＮＡの各種が、配列番号：２２に列挙される配列を含むリンカーによって連結される、請求項１１９又は１２０に記載の組成物。
  122. 第一のＲＮＡがリンカーによって第二のＲＮＡに連結される、請求項１００に記載の組成物。
  123. リンカーが、ｔＲＮＡリンカー又は配列番号：２１を含む配列を含むリンカーを含む、請求項１２２に記載の組成物。
  124. ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、又はコザック配列を更に含む、請求項１００に記載の組成物。
  125. 第一のＲＮＡと第二のＲＮＡが共に組換え体である、請求項１００から１２４の何れか一項に記載の組成物。
  126. 治療有効量の請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物と薬学的に許容される添加物とを含む薬学的組成物。
  127. 請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物又は請求項１２６に記載の薬学的組成物を、がんを有する対象に投与することを含む、がんを治療する方法。
  128. がんが固形腫瘍である、請求項１２７に記載の方法。
  129. がんがメラノーマである、請求項１２７に記載の方法。
  130. がんが腎細胞癌である、請求項１２７に記載の方法。
  131. がんが頭頸部がんである、請求項１２７に記載の方法。
  132. 頭頸部がんが頭頸部扁平上皮癌である、請求項１３１に記載の方法。
  133. 頭頸部がんが、喉頭がん、下咽頭がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻咽頭がん、口腔がん、中咽頭がん、唾液腺がん、脳腫瘍、食道がん、眼がん、副甲状腺がん、頭頸部の肉腫、又は甲状腺がんである、請求項１３１に記載の方法。
  134. がんが上気道消化管に位置する、請求項１２７に記載の方法。
  135. 上気道消化管が、副鼻腔、鼻腔、口腔、唾液腺、舌、鼻咽頭、中咽頭、下咽頭、又は喉頭を含む、請求項１３４に記載の方法。
  136. 対象が頭頸部がんを有する、請求項１２７に記載の方法。
  137. 頭頸部がんを有する対象が喫煙歴を有する、請求項１３６に記載の方法。
  138. 頭頸部がんを有する対象が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＤＮＡを有する、請求項１３６に記載の方法。
  139. 対象がヒトである、請求項１２７から１３８の何れか一項に記載の方法。
  140. 配列番号：１～１７及び１２５～１４１からなる群から選択される核酸配列を含む組換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物。
  141. 細胞における二つ以上の遺伝子の発現を調節する際に使用するための、請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物。
  142. 請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物を含む細胞。
  143. 請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物をコードする組換えポリ核酸コンストラクトを含むベクター。
  144. 請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物又は請求項１４３に記載のベクターを細胞に導入することを含む、細胞内において単一ＲＮＡ転写物からｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡを生成する方法。
  145. 請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物又は請求項１４３に記載のベクターを細胞に導入することを含む、タンパク質発現を調節する方法であって、第二のＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現が、請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物又は請求項１４３に記載のベクターを含まない細胞と比較して減少する、方法。
  146. 請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物又は請求項１４３に記載のベクターを細胞に導入することを含む、タンパク質発現を調節する方法であって、第一のＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現が、請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物又は請求項１４３に記載のベクターを含まない細胞と比較して増加する、方法。
  147. 請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物又は請求項１４３に記載のベクターを細胞に導入することを含む、タンパク質発現を調節する方法であって、第二のＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現が、請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物又は請求項１４３に記載のベクターを含まない細胞と比較して減少し、且つ第一のＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現が、請求項１から１２５の何れか一項に記載の組成物又は請求項１４３に記載のベクターを含まない細胞と比較して増加する、方法。
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