KR20230082026A - 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 다중핵산 작제물의 조성물에 관한 것이다. 또한 본원은 암을 치료하고 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는데 있어서 조성물의 용도를 개시한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 10월 5일에 출원된 미국 가출원 제63/087,643호 및 2021년 6월 23일에 출원된 미국 가출원 제63/213,841호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다. 2021년 9월 30일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 57623_707_601_SL.txt이고 크기는 295,347 바이트이다.
많은 비정상적인 인간 상태는 그러한 비정상적인 인간 상태가 없는 대상체(subject)에서의 단백질 발현 수준에 비해, 유전자 발현 수준의 변동에 의해 유발되거나 이와 연관된다. 특히 암의 경우 더욱 그렇다. 예를 들어, 암 세포는 세포 증식 또는 혈관형성(angiogenesis)에 관여하는 단백질의 발현을 증가시키고 종양에 대한 면역 반응에 관여하는 단백질의 발현을 감소시키는 데 이득이 있는 것으로 공지되어 있다.
따라서, 세포 증식 또는 혈관형성에 관여하는 하나 이상의 표적 유전자 생성물의 생성을 감소시키고 동시에 대상체에서 암의 발생을 예방하거나 치료하는 데 필요한, 종양에 대한 면역 반응에 관여하는 단백질과 같은 다른 것의 생성을 증가시키는 요법에 대한 필요성이 존재한다.
본원은 하나의 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물(construct)을 사용하여 2개 이상의 단백질 또는 핵산 서열의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 사이토카인(cytokine)을 암호화(encoding)하고, 제2 RNA는 종양 증식과 연관된 유전자의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화한다. 일부 양태에서, 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 사이토카인을 암호화하고, 제2 RNA는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화한다. 일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용가능한 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본원은 혈관 내피 성장 인자 A(VEGFA), VEGFA의 동형(isoform), 태반 성장 인자(PIGF), 분화 클러스터 155(CD155), 세포예정사-리간드 1(programmed cell death-ligand 1; PD-L1), myc 원종양유전자(c-Myc), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체(functional variant)의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 인터류킨-2(IL-2), IL-15, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 MHC 부류 I 쇄-관련 서열 A(MICA), MHC 부류 I 쇄-관련 서열 B(MICB), 소포체 단백질(ERp5), 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAM), 매트릭스(matrix) 메탈로프로테이나제(MMP), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 인터류킨-2(IL-2), 이의 단편, 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM17이다. 일부 양태에서, 본원은 이소시트레이트 데하이드로게나제(IDH1), 사이클린-의존성 키나제 4(CDK4), CDK6, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 라파마이신의 기계론적 표적(mTOR), Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자(KRAS), 세포예정사-리간드 1(PD-L1), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 인터류킨-12(IL-12), IL-7, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본원은 암이 있는 대상체에게 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 암은 흑색종(melanoma)이다. 일부 구현예에서, 암은 신세포 암종(renal cell carcinoma)이다. 일부 구현예에서, 암은 두경부암(head and neck cancer)이다. 일부 구현예에서, 두경부암은 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma)이다. 일부 구현예에서, 두경부암은 후두암(laryngeal cancer), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 편도선암(tonsil cancer), 비강암(nasal cavity cancer), 부비동암(paranasal sinus cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 잠복 원발성 전이성 편평 목암(metastatic squamous neck cancer with occult primary), 입술암(lip cancer), 구강암(oral cancer), 구강인두암(oropharyngeal cancer), 침샘암(salivary gland cancer), 뇌종양(brain tumor), 식도암(esophageal cancer), 눈암, 부갑상선암(parathyroid cancer), 두경부의 육종 또는 갑상선암(thyroid cancer)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일부 양태에서, 본원은 서열번호 1-17 및 125-141로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 재조합체 다중핵산 작제물(recombinant polynucleic acid construct)을 포함하는 조성물을 제공한다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 특징은 특히 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 개시내용의 특징 및 장점에 대한 더 나은 이해는 본 개시내용의 원리가 활용되는 예시적인 구현예를 설명하는 하기의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조함으로써 획득될 것이다:
도 1은 작제물 설계의 개략도를 묘사한다. 다중핵산 작제물은 단일 전사물(transcript)에서 T7 RNA 폴리머라제 결합 및 목적 유전자 및 siRNA 모두의 성공적인 시험관내 전사를 위한 목적 유전자 서열(예로서 제공된 IL-2)의 상류에 T7 프로모터(promoter) 서열을 포함할 수 있다. IL-2의 신호 펩티드(signal peptide)는 회색 상자로 강조 표시된다. mRNA를 siRNA에, 또는 siRNA를 siRNA에 연결하는 링커(linker)는 각각 가로 줄무늬가 있는 상자 또는 체크 무늬가 있는 상자로 표시된다. T7: T7 프로모터, siRNA: 작은 간섭 RNA.
도 2A는 인간 배아 신장 세포(HEK-293)로부터의 IL-2 분비 유도에 대한 플롯이다. X축은 HEK-293 세포로의 형질감염에 사용되는 mRNA: 화합물(Cpd.) 1, Cpd.2, Cpd.3 또는 Cpd.4를 나타낸다. Y축은 ELISA를 사용하여 Cpd.1에 의한 IL-2 단백질 분비와 비교한 IL-2 단백질 분비 배수 변화의 측정치이다. 데이터는 Cpd당 3회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 유의수준(**, p<0.01)은 Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이은 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가되었다.
도 2B는 인간 성인 각질세포(HaCaT)로부터의 IL-2 분비 유도에 대한 플롯이다. X축은 HaCaT 세포로의 형질감염에 사용되는 mRNA: 화합물(Cpd.) 1, Cpd.2, Cpd.3 또는 Cpd.4를 나타낸다. Y축은 ELISA를 사용하여 Cpd.1에 의한 IL-2 단백질 분비와 비교한 IL-2 단백질 분비 배수 변화의 측정치이다. 데이터는 Cpd당 3회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 유의수준(**, p<0.01)은 Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이은 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가되었다.
도 2C는 인간 폐 상피 세포(A549)로부터의 IL-2 분비 유도에 대한 플롯이다. X축은 A549 세포로의 형질감염에 사용되는 mRNA: 화합물(Cpd.) 1, Cpd.2, Cpd.3 또는 Cpd.4를 나타낸다. Y축은 ELISA를 사용하여 Cpd.1에 의한 IL-2 단백질 분비와 비교한 IL-2 단백질 분비 배수 변화의 측정치이다. 데이터는 Cpd당 3회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 유의수준(**, p<0.01)은 Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이은 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가되었다.
도 3은 VEGFA(0.3 ㎍ VEGFA mRNA)를 과발현하는 폐 상피 세포(A549 세포)에서 화합물 5(Cpd.5)에 의한 VEGFA 발현의 동시 간섭 및 IL-2 단백질의 용량 의존적 분비에 대한 플롯이다. X축은 A549 세포로의 형질감염에 사용되는 Cpd.5(각각 0, 150, 300, 600, 900 또는 1200 ng/웰에 상응하는 4.4, 8.8, 17.6, 26.4, 35.2 및 44.02 nM)의 농도를 나타낸다. Y축은 Cpd.5로 형질감염 24시간 후 ELISA에 의해 동일한 세포 배양 상등액에서 VEGFA(왼쪽) 및 IL-2(오른쪽) 단백질 수준(ng/㎖)을 측정한 것이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 4A는 VEGFA를 과발현하는 VEGFA mRNA로 형질감염된 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 5(Cpd.5)에 의한 VEGFA 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 9.5 nM(300 ng)의 VEGFA mRNA 단독(VEGFA mRNA)으로 형질감염되거나 9.5 nM(300 ng)의 VEGFA mRNA와 26.4 nM(900 ng)의 Cpd.5(Cpd.5)로 동시 형질감염된 SCC-4 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 VEGFA 단백질 수준(ng/㎖)의 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 4B는 ELISA에 의해 측정된, 도 4A에서와 동일한 세포 배양 상등액에서의 IL-2 단백질 수준(ng/㎖)에 대한 플롯이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 5A는 VEGFA를 내인성으로 과발현하는 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 5(Cpd.5)에 의한 VEGFA 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 26.4 nM(900 ng)의 Cpd.5로 형질감염 전(내인성) 및 후(Cpd.5)의 SCC-4 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 VEGFA 단백질 수준(ng/㎖)에 대한 측정치이다. 데이터는 2회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 5B는 ELISA에 의해 측정된, 도 5A에서와 동일한 세포 배양 상등액에서의 IL-2 단백질 수준(ng/㎖)에 대한 플롯이다. 데이터는 2회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 6A는 VEGFA를 과발현하는 VEGFA mRNA(9.5 nM 또는 0.3 ㎍ VEGFA mRNA)로 형질감염된 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 5(Cpd.5) 및 상업적인 siRNA에 의한 VEGFA 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 증가하는 농도의 Cpd.5(4.4 nM에서 44.02 nM) 또는 상업적인 siRNA(0.05 mM에서 2.5 mM)로 형질감염된 SCC-4 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 VEGFA 단백질 수준(pg/㎖)의 측정치를 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 6B는 VEGFA를 과발현하는 VEGFA mRNA(9.5 nM 또는 0.3 ㎍ VEGFA mRNA)로 형질감염된 인간 폐 상피 세포(A549)에서 화합물 5(Cpd.5) 및 상업적인 siRNA에 의한 VEGFA 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 증가하는 농도의 Cpd.5(4.4 nM에서 44.02 nM) 또는 상업적인 siRNA(0.05 mM에서 2.5 mM)로 형질감염된 A549 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 VEGFA 단백질 수준(pg/㎖)의 측정치를 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 6C는 SCC-4 및 A549 세포에서 Cpd.5 및 상업적인 siRNA의 IC50 값을 비교하기 위한 표이다.
도 7A는 가용성 및 막 MICB를 구성적으로 발현하는 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 6(Cpd.6)에 의한 MICB 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 35.11 nM(900 ng)의 Cpd.6으로 형질감염 전(내인성) 및 후(Cpd.6)의 SCC-4 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 가용성 MICB 단백질 수준(pg/㎖)에 대한 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 7B는 가용성 및 막 MICB를 구성적으로 발현하는 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 6(Cpd.6)에 의한 MICB 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 35.11 nM(900 ng)의 Cpd.6으로 형질감염 전(내인성) 및 후(Cpd.6)의 SCC-4 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 막 MICB 단백질 수준(pg/㎖)에 대한 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 7C는 ELISA에 의해 측정된, 도 7A 및 도 7B에서와 동일한 세포 배양 상등액에서의 IL-2 단백질 수준(ng/㎖)에 대한 플롯이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 8A는 수용성 MICA를 구성적으로 발현하는 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 6(Cpd.6)에 의한 IL-2 단백질의 용량 의존적 분비 및 MICA 발현의 동시 간섭에 대한 플롯이다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.6(1.58, 2.93, 5.85, 11.7, 23.41, 35.11 및 46.81 nM)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 가용성 MICA 단백질 수준(pg/㎖)에 대한 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 8B는 도 8A에 기재된 동일한 SCC-4 세포 상등액에서의 화합물 6(Cpd.6)에 의한 IL-2 단백질의 용량-의존적 분비 및 MICB 발현의 동시 간섭에 대한 플롯이다. SCC-4 세포는 구성적으로 가용성 MICB를 발현한다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.6(1.58, 2.93, 5.85, 11.7, 23.41, 35.11 및 46.81 nM)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 가용성 MICB 단백질 수준(pg/㎖)에 대한 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 9A는 초-저 부착(ULA) 플레이트 내로 5000개 세포/웰로 시딩된 SK-OV-3-NLR 세포의 3차원(3D) 스페로이드 배양에서 Cpd.3(100 ng)으로 형질감염 후 12, 24 및 48시간에 측정된 IL-2 발현에 대한 플롯이다. IL-2 정량화는 TR-FRET 분석으로 수행되었다. 오차 막대는 3회 반복의 평균 ±SEM을 나타낸다.
도 9B-9D는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 존재 하에서 Cpd.3으로 형질감염 후 SK-OV-3 NLR 스페로이드의 전체 핵 국소화된 RFP(NLR) 통합 강도의 변화를 나타낸다. SK-OV-3 NLR을 ULA 플레이트(4중)에 5000개 세포/웰로 도말하고 리포펙타민 2000을 사용하여 상이한 용량의 Cpd.3(3 ng, 10 ng, 30 ng 및 100 ng)으로 형질감염시켰다. 이어서 세포를 원심분리시켜 스페로이드를 형성시키고 PBMC 추가 전 48시간 동안 배양하였다. 3명의 공여자로부터 단리된 PBMC(도 9B, 9C 및 9D)를 항-CD3와 함께 200,000개 세포/웰의 밀도로 첨가하였다. 공-배양물을 168시간(7일) 동안 3시간마다 이미지화하였다. 전체 NLR 통합 강도를 24시간 시점으로 정규화하고 IncuCyte 소프트웨어 내 스페로이드 모듈을 사용하여 분석하였다. rhIL2: 재조합 인간 IL-2
도 9E는 5일차에 SK-OV-3 NLR 조건에서 PBMC 단독 대조군, 재조합 인간 IL-2(rhIL2) 및 Cpd.3 처리(100 ng) 후 Cpd.3 매개된 NLR 온전성 감소를 나타내는 일련의 전형적인 IncuCyte 이미지를 나타낸다.
도 10A는 Cpd.5(0.3 ㎍/웰)로 형질감염되고 ELISA로 정량분석된 인간 배아 신장(HEK293) 세포의 상등액에서 유래한 rh-IL-2(0.001 ng 내지 300 ng) 또는 IL-2(0.001 ng 내지 45 ng)에 의해 유도된 HEK-Blue™ IL-2 리포터 세포에서 JAK3/STAT5 경로의 용량-의존적 활성화를 보여주는 플롯이다. X축은 상이한 농도의 Cpd.5 유래 IL-2 또는 rh-IL-2를 나타낸다. Y축은 rh-IL-2로 정규화된 IL-2 신호전달 활성화를 나타낸다(rh-IL-2의 가장 낮은 SEAP 값은 0으로 설정되고 rh-IL-2의 가장 높은 SEAP 값은 100%로 설정됨). 데이터는 용량당 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 10B는 Cpd.6(0.3 ㎍/웰)으로 형질감염되고 ELISA로 정량분석된 인간 배아 신장(HEK293) 세포의 상등액에서 유래한 rh-IL-2(0.001 ng 내지 300 ng) 또는 IL-2(0.001 ng 내지 45 ng)에 의해 유도된 HEK-Blue™ IL-2 리포터 세포에서 JAK3/STAT5 경로의 용량-의존적 활성화를 보여주는 플롯이다. X축은 상이한 농도의 Cpd.6 유래 IL-2 또는 rh-IL-2를 나타낸다. Y축은 rh-IL-2로 정규화된 IL-2 신호전달 활성화를 나타낸다. 데이터는 용량당 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 10C는 발광 세포 생육력(viability) 접근법(CellTiter-Glo)에 의해 측정된 NK 세포 매개된 사멸 분석을 나타내는 플롯이다. 상이한 용량의 Cpd.5, Cpd.6 및 2개의 모의 대조군 RNA(0.1 nM 내지 2.5 nM)로 형질감염된 SCC-4 세포. 형질감염 30분 후, NK-92 세포를 10:1 효과기 대 표적(E:T) 세포 비로 SCC-4 세포와 공-배양한 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 철저히 세척하여 NK-92 세포를 제거하고 생존한 SCC-4 세포를 CellTiter-Glo를 사용하여 세포 생육력 분석에 의해 분석하였다. 처리되지 않은 SCC-4 세포를 대조군으로 사용하고 0%로 설정하였다. 데이터는 용량당 4회 반복의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 11A는 SCC-4 세포에서 화합물 7(Cpd.7) 및 화합물 8(Cpd.8)에 의해 유도된 내인성 발현 VEGFA의 용량 의존적 하향조절을 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 VEGFA 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.7(1.1, 2.2, 4.4, 8.8, 17.6, 26.4, 35.2 및 44.04 nM/웰) 및 Cpd.8(0.47, 0.94, 1.89, 3.79, 7.58, 15.15, 22.73, 30.31 및 37.88 nM/웰)의 농도를 나타낸다. 형질감염되지 않은 세포의 VEGFA 수준은 100%로 설정되었다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 VEGFA 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 11B는 SCC-4 세포에서 Cpd.7(3x siRNA) 및 Cpd.8(5x siRNA)에 의해 유도된 IL-2 수준의 용량-의존적 분비를 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 IL-2 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.7(1.1, 2.2, 4.4, 8.8, 17.6, 26.4, 35.2 및 44.04 nM/웰) 및 Cpd.8(0.47, 0.94, 1.89, 3.79, 7.58, 15.15, 22.73, 30.31 및 37.88 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액에서의 IL-2 단백질 수준(nM)에 대한 측정치이며, 1 nM은 IL-2와 그의 수용체와의 해리 상수(Kd)에 상응한다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 11C는 최대 72시간까지 SCC-4 세포에서 화합물 9(Cpd.9) 및 화합물(Cpd.10)에 의해 유도된 IL-2 분비의 시간 경과를 보여주는 플롯이다. 세포 배양 상등액의 IL-2 수준을 형질감염(30 nM) 후 6 내지 72시간 사이에 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 형질감염 후 시간을 나타내고 Y축은 세포 배양 상등액에서의 IL-2 단백질 수준(nM)에 대한 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 11D는 최대 72시간 까지 SCC-4 세포에서 스크램블된 siRNA(scr. siRNA), 상업적인 VEGFA siRNA, Cpd.9 및 Cpd.10에 의한 구성적으로 발현된 VEGFA 수준의 시간-의존적 하향조절에 대한 플롯이다. 세포 배양 상등액의 VEGFA 수준은 형질감염(30 nM) 후 6 내지 72시간까지 ELISA에 의해 측정되었다. 형질감염되지 않은 세포의 VEGFA 수준을 100%로 설정하고 하향 조절을 이 값으로 정규화하였다. X축은 형질감염 후 시간을 나타내고 Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 VEGFA 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 12A 및 도 12C는 각각 SCC-4 세포 및 A549 세포에서 화합물 11(Cpd.11)에 의해 유도된 IL-12 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 세포 배양 상등액의 IL-12 수준을 형질감염 24시간 후 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용되는 Cpd.11(7(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-12 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 12B 및 도 12D는 각각 SCC-4 세포 및 A549 세포에서 Cpd.11 처리로 인한 IDH1, CDK4 및 CDK6 수준의 하향조절을 나타내는 플롯이다. IDH1, CDK4 및 CDK6의 RNA 수준은 형질감염 후 24시간에 기술적 반복으로 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 측정되었다. X축은 SCC-4 세포 및 A549 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.11(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 IDH1, CDK4 및 CDK6 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 12E 및 도 12G는 각각 SCC-4 세포 및 A549 세포에서 화합물 12(Cpd.12)에 의해 유도된 IL-12 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 세포 배양 상등액의 IL-12 수준을 형질감염 24시간 후 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 SCC-4 세포 및 A549 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.12(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-12 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 12F 및 도 12H는 각각 SCC-4 세포 및 A549 세포에서 Cpd.12 처리로 인한 EGFR, KRAS 및 mTOR 수준의 하향조절을 나타내는 플롯이다. EGFR, KRAS 및 mTOR의 RNA 수준은 형질감염 24시간 후 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 기술적 반복으로 측정되었다. X축은 SCC-4 세포 및 A549 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.12(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 EGFR, KRAS 및 mTOR 수준의 하향 조절을 나타낸다. BQL = 분석의 정량 한계 미만. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 13A 및 도 13B는 각각 A549 세포 및 SCC-4 세포에서 화합물 13(Cpd.13)에 의해 유도된 IL-12 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 세포 배양 상등액의 IL-12 수준을 형질감염 24시간 후 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 A549 세포 및 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.13(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-12 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 13C는 A549 세포에서 화합물 14(Cpd.14)에 의해 유도된 IL-12 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 세포 배양 상등액의 IL-12 수준을 형질감염 24시간 후 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 A549 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.14(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-12 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 13D 및 도 13E는 각각 A549 세포 및 SCC-4 세포에서 Cpd.13 처리로 인한 EGFR 발현의 하향조절을 나타내는 플롯이다. EGFR의 RNA 수준은 형질감염 24시간 후 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 기술적 반복으로 측정되었다. X축은 A549 세포 및 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.13(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 EGFR 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 13F는 A549 세포에서 Cpd.14 처리로 인한 mTOR 발현의 하향조절을 나타내는 플롯이다. mTOR의 RNA 수준은 형질감염 후 24시간에 기술적 반복으로 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 측정되었다. X축은 A549 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.14(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 mTOR 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14A 및 도 14C는 각각 A549 세포 및 SCC-4 세포에서 화합물 15(Cpd.15)에 의해 유도된 IL-15 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 IL-15 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 A549 세포 및 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.15(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-15 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14B 및 도 14D는 각각 A549 세포 및 SCC-4 세포에서 Cpd.15 처리로 인한 VEGFA 및 CD155 발현의 하향조절을 나타내는 플롯이다. VEGFA 및 CD155의 RNA 수준은 형질감염 24시간 후 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 기술적 반복으로 측정되었다. X축은 A549 세포 및 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.15(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 VEGFA 및 CD155 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14E는 인간 교모세포종 세포주(U251 MG) 세포에서 화합물 16(Cpd.16)에 의해 유도된 IL-15 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 IL-15 수준을 ELISA로 측정하였다. X축은 U251 MG 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.16(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-15 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14F는 U251 MG 세포에서 Cpd.16 처리로 인한 VEGFA, PD-L1 및 c-Myc 발현의 하향조절을 나타내는 플롯이다. VEGFA, PD-L1 및 c-Myc의 RNA 수준은 형질감염 24시간 후 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 기술적 반복으로 측정되었다. X축은 U251 MG 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.16(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 VEGFA, PD-L1 및 c-Myc 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14G는 U251 MG 세포에서 화합물 17(Cpd.17)에 의해 유도된 IL-7 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 IL-7 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 U251 MG 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.17(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-7 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14H는 U251 MG 세포에서 Cpd.17 처리로 인한 PD-L1 발현의 하향조절을 나타내는 플롯이다. PD-L1의 RNA 수준은 형질감염 24시간 후 기술적 반복으로 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 측정되었다. X축은 U251 MG 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.17(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 PD-L1 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 15A는 SCC-4 세포에서 화합물 5(Cpd.5) 및 화합물 10(Cpd.10)에 의해 유도된 내인성으로 발현된 VEGFA의 하향조절을 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 VEGFA 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용되는 Cpd.5 및 Cpd.10(20 및 30 nM)의 농도를 나타낸다. 형질감염되지 않은 세포의 VEGFA 수준은 SCC-4 세포의 내인성 VEGFA 분비 수준을 나타내며 '0'으로 표지되었다. Y축은 ELISA에 의해 측정된 VEGFA 수준을 나타낸다. 데이터는 2개의 독립적인 측정 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 15B는 HUVEC 시험관내 혈관형성 모델에서 도 15A의 상이한 배지 상등액으로부터의 VEGFA에 의해 유도된 분지점(branching point)의 수를 나타내는 플롯이다. 재조합 인간 VEGFA(VEGF)를 대조군으로 사용하였으며, 6시간 시점에서 현미경 사진으로부터 분지점의 수를 카운트하였다. 데이터는 6개의 독립적인 측정 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 1은 작제물 설계의 개략도를 묘사한다. 다중핵산 작제물은 단일 전사물(transcript)에서 T7 RNA 폴리머라제 결합 및 목적 유전자 및 siRNA 모두의 성공적인 시험관내 전사를 위한 목적 유전자 서열(예로서 제공된 IL-2)의 상류에 T7 프로모터(promoter) 서열을 포함할 수 있다. IL-2의 신호 펩티드(signal peptide)는 회색 상자로 강조 표시된다. mRNA를 siRNA에, 또는 siRNA를 siRNA에 연결하는 링커(linker)는 각각 가로 줄무늬가 있는 상자 또는 체크 무늬가 있는 상자로 표시된다. T7: T7 프로모터, siRNA: 작은 간섭 RNA.
도 2A는 인간 배아 신장 세포(HEK-293)로부터의 IL-2 분비 유도에 대한 플롯이다. X축은 HEK-293 세포로의 형질감염에 사용되는 mRNA: 화합물(Cpd.) 1, Cpd.2, Cpd.3 또는 Cpd.4를 나타낸다. Y축은 ELISA를 사용하여 Cpd.1에 의한 IL-2 단백질 분비와 비교한 IL-2 단백질 분비 배수 변화의 측정치이다. 데이터는 Cpd당 3회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 유의수준(**, p<0.01)은 Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이은 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가되었다.
도 2B는 인간 성인 각질세포(HaCaT)로부터의 IL-2 분비 유도에 대한 플롯이다. X축은 HaCaT 세포로의 형질감염에 사용되는 mRNA: 화합물(Cpd.) 1, Cpd.2, Cpd.3 또는 Cpd.4를 나타낸다. Y축은 ELISA를 사용하여 Cpd.1에 의한 IL-2 단백질 분비와 비교한 IL-2 단백질 분비 배수 변화의 측정치이다. 데이터는 Cpd당 3회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 유의수준(**, p<0.01)은 Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이은 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가되었다.
도 2C는 인간 폐 상피 세포(A549)로부터의 IL-2 분비 유도에 대한 플롯이다. X축은 A549 세포로의 형질감염에 사용되는 mRNA: 화합물(Cpd.) 1, Cpd.2, Cpd.3 또는 Cpd.4를 나타낸다. Y축은 ELISA를 사용하여 Cpd.1에 의한 IL-2 단백질 분비와 비교한 IL-2 단백질 분비 배수 변화의 측정치이다. 데이터는 Cpd당 3회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 유의수준(**, p<0.01)은 Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이은 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가되었다.
도 3은 VEGFA(0.3 ㎍ VEGFA mRNA)를 과발현하는 폐 상피 세포(A549 세포)에서 화합물 5(Cpd.5)에 의한 VEGFA 발현의 동시 간섭 및 IL-2 단백질의 용량 의존적 분비에 대한 플롯이다. X축은 A549 세포로의 형질감염에 사용되는 Cpd.5(각각 0, 150, 300, 600, 900 또는 1200 ng/웰에 상응하는 4.4, 8.8, 17.6, 26.4, 35.2 및 44.02 nM)의 농도를 나타낸다. Y축은 Cpd.5로 형질감염 24시간 후 ELISA에 의해 동일한 세포 배양 상등액에서 VEGFA(왼쪽) 및 IL-2(오른쪽) 단백질 수준(ng/㎖)을 측정한 것이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 4A는 VEGFA를 과발현하는 VEGFA mRNA로 형질감염된 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 5(Cpd.5)에 의한 VEGFA 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 9.5 nM(300 ng)의 VEGFA mRNA 단독(VEGFA mRNA)으로 형질감염되거나 9.5 nM(300 ng)의 VEGFA mRNA와 26.4 nM(900 ng)의 Cpd.5(Cpd.5)로 동시 형질감염된 SCC-4 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 VEGFA 단백질 수준(ng/㎖)의 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 4B는 ELISA에 의해 측정된, 도 4A에서와 동일한 세포 배양 상등액에서의 IL-2 단백질 수준(ng/㎖)에 대한 플롯이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 5A는 VEGFA를 내인성으로 과발현하는 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 5(Cpd.5)에 의한 VEGFA 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 26.4 nM(900 ng)의 Cpd.5로 형질감염 전(내인성) 및 후(Cpd.5)의 SCC-4 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 VEGFA 단백질 수준(ng/㎖)에 대한 측정치이다. 데이터는 2회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 5B는 ELISA에 의해 측정된, 도 5A에서와 동일한 세포 배양 상등액에서의 IL-2 단백질 수준(ng/㎖)에 대한 플롯이다. 데이터는 2회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 6A는 VEGFA를 과발현하는 VEGFA mRNA(9.5 nM 또는 0.3 ㎍ VEGFA mRNA)로 형질감염된 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 5(Cpd.5) 및 상업적인 siRNA에 의한 VEGFA 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 증가하는 농도의 Cpd.5(4.4 nM에서 44.02 nM) 또는 상업적인 siRNA(0.05 mM에서 2.5 mM)로 형질감염된 SCC-4 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 VEGFA 단백질 수준(pg/㎖)의 측정치를 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 6B는 VEGFA를 과발현하는 VEGFA mRNA(9.5 nM 또는 0.3 ㎍ VEGFA mRNA)로 형질감염된 인간 폐 상피 세포(A549)에서 화합물 5(Cpd.5) 및 상업적인 siRNA에 의한 VEGFA 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 증가하는 농도의 Cpd.5(4.4 nM에서 44.02 nM) 또는 상업적인 siRNA(0.05 mM에서 2.5 mM)로 형질감염된 A549 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 VEGFA 단백질 수준(pg/㎖)의 측정치를 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 6C는 SCC-4 및 A549 세포에서 Cpd.5 및 상업적인 siRNA의 IC50 값을 비교하기 위한 표이다.
도 7A는 가용성 및 막 MICB를 구성적으로 발현하는 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 6(Cpd.6)에 의한 MICB 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 35.11 nM(900 ng)의 Cpd.6으로 형질감염 전(내인성) 및 후(Cpd.6)의 SCC-4 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 가용성 MICB 단백질 수준(pg/㎖)에 대한 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 7B는 가용성 및 막 MICB를 구성적으로 발현하는 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 6(Cpd.6)에 의한 MICB 발현의 간섭에 대한 플롯이다. X축은 35.11 nM(900 ng)의 Cpd.6으로 형질감염 전(내인성) 및 후(Cpd.6)의 SCC-4 세포를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 막 MICB 단백질 수준(pg/㎖)에 대한 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 7C는 ELISA에 의해 측정된, 도 7A 및 도 7B에서와 동일한 세포 배양 상등액에서의 IL-2 단백질 수준(ng/㎖)에 대한 플롯이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 8A는 수용성 MICA를 구성적으로 발현하는 인간 혀 세포 암종 세포(SCC-4)에서 화합물 6(Cpd.6)에 의한 IL-2 단백질의 용량 의존적 분비 및 MICA 발현의 동시 간섭에 대한 플롯이다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.6(1.58, 2.93, 5.85, 11.7, 23.41, 35.11 및 46.81 nM)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 가용성 MICA 단백질 수준(pg/㎖)에 대한 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 8B는 도 8A에 기재된 동일한 SCC-4 세포 상등액에서의 화합물 6(Cpd.6)에 의한 IL-2 단백질의 용량-의존적 분비 및 MICB 발현의 동시 간섭에 대한 플롯이다. SCC-4 세포는 구성적으로 가용성 MICB를 발현한다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.6(1.58, 2.93, 5.85, 11.7, 23.41, 35.11 및 46.81 nM)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염 24시간 후 ELISA에 의한 세포 배양 상등액의 가용성 MICB 단백질 수준(pg/㎖)에 대한 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 9A는 초-저 부착(ULA) 플레이트 내로 5000개 세포/웰로 시딩된 SK-OV-3-NLR 세포의 3차원(3D) 스페로이드 배양에서 Cpd.3(100 ng)으로 형질감염 후 12, 24 및 48시간에 측정된 IL-2 발현에 대한 플롯이다. IL-2 정량화는 TR-FRET 분석으로 수행되었다. 오차 막대는 3회 반복의 평균 ±SEM을 나타낸다.
도 9B-9D는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 존재 하에서 Cpd.3으로 형질감염 후 SK-OV-3 NLR 스페로이드의 전체 핵 국소화된 RFP(NLR) 통합 강도의 변화를 나타낸다. SK-OV-3 NLR을 ULA 플레이트(4중)에 5000개 세포/웰로 도말하고 리포펙타민 2000을 사용하여 상이한 용량의 Cpd.3(3 ng, 10 ng, 30 ng 및 100 ng)으로 형질감염시켰다. 이어서 세포를 원심분리시켜 스페로이드를 형성시키고 PBMC 추가 전 48시간 동안 배양하였다. 3명의 공여자로부터 단리된 PBMC(도 9B, 9C 및 9D)를 항-CD3와 함께 200,000개 세포/웰의 밀도로 첨가하였다. 공-배양물을 168시간(7일) 동안 3시간마다 이미지화하였다. 전체 NLR 통합 강도를 24시간 시점으로 정규화하고 IncuCyte 소프트웨어 내 스페로이드 모듈을 사용하여 분석하였다. rhIL2: 재조합 인간 IL-2
도 9E는 5일차에 SK-OV-3 NLR 조건에서 PBMC 단독 대조군, 재조합 인간 IL-2(rhIL2) 및 Cpd.3 처리(100 ng) 후 Cpd.3 매개된 NLR 온전성 감소를 나타내는 일련의 전형적인 IncuCyte 이미지를 나타낸다.
도 10A는 Cpd.5(0.3 ㎍/웰)로 형질감염되고 ELISA로 정량분석된 인간 배아 신장(HEK293) 세포의 상등액에서 유래한 rh-IL-2(0.001 ng 내지 300 ng) 또는 IL-2(0.001 ng 내지 45 ng)에 의해 유도된 HEK-Blue™ IL-2 리포터 세포에서 JAK3/STAT5 경로의 용량-의존적 활성화를 보여주는 플롯이다. X축은 상이한 농도의 Cpd.5 유래 IL-2 또는 rh-IL-2를 나타낸다. Y축은 rh-IL-2로 정규화된 IL-2 신호전달 활성화를 나타낸다(rh-IL-2의 가장 낮은 SEAP 값은 0으로 설정되고 rh-IL-2의 가장 높은 SEAP 값은 100%로 설정됨). 데이터는 용량당 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 10B는 Cpd.6(0.3 ㎍/웰)으로 형질감염되고 ELISA로 정량분석된 인간 배아 신장(HEK293) 세포의 상등액에서 유래한 rh-IL-2(0.001 ng 내지 300 ng) 또는 IL-2(0.001 ng 내지 45 ng)에 의해 유도된 HEK-Blue™ IL-2 리포터 세포에서 JAK3/STAT5 경로의 용량-의존적 활성화를 보여주는 플롯이다. X축은 상이한 농도의 Cpd.6 유래 IL-2 또는 rh-IL-2를 나타낸다. Y축은 rh-IL-2로 정규화된 IL-2 신호전달 활성화를 나타낸다. 데이터는 용량당 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 10C는 발광 세포 생육력(viability) 접근법(CellTiter-Glo)에 의해 측정된 NK 세포 매개된 사멸 분석을 나타내는 플롯이다. 상이한 용량의 Cpd.5, Cpd.6 및 2개의 모의 대조군 RNA(0.1 nM 내지 2.5 nM)로 형질감염된 SCC-4 세포. 형질감염 30분 후, NK-92 세포를 10:1 효과기 대 표적(E:T) 세포 비로 SCC-4 세포와 공-배양한 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 철저히 세척하여 NK-92 세포를 제거하고 생존한 SCC-4 세포를 CellTiter-Glo를 사용하여 세포 생육력 분석에 의해 분석하였다. 처리되지 않은 SCC-4 세포를 대조군으로 사용하고 0%로 설정하였다. 데이터는 용량당 4회 반복의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 11A는 SCC-4 세포에서 화합물 7(Cpd.7) 및 화합물 8(Cpd.8)에 의해 유도된 내인성 발현 VEGFA의 용량 의존적 하향조절을 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 VEGFA 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.7(1.1, 2.2, 4.4, 8.8, 17.6, 26.4, 35.2 및 44.04 nM/웰) 및 Cpd.8(0.47, 0.94, 1.89, 3.79, 7.58, 15.15, 22.73, 30.31 및 37.88 nM/웰)의 농도를 나타낸다. 형질감염되지 않은 세포의 VEGFA 수준은 100%로 설정되었다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 VEGFA 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 11B는 SCC-4 세포에서 Cpd.7(3x siRNA) 및 Cpd.8(5x siRNA)에 의해 유도된 IL-2 수준의 용량-의존적 분비를 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 IL-2 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.7(1.1, 2.2, 4.4, 8.8, 17.6, 26.4, 35.2 및 44.04 nM/웰) 및 Cpd.8(0.47, 0.94, 1.89, 3.79, 7.58, 15.15, 22.73, 30.31 및 37.88 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액에서의 IL-2 단백질 수준(nM)에 대한 측정치이며, 1 nM은 IL-2와 그의 수용체와의 해리 상수(Kd)에 상응한다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 11C는 최대 72시간까지 SCC-4 세포에서 화합물 9(Cpd.9) 및 화합물(Cpd.10)에 의해 유도된 IL-2 분비의 시간 경과를 보여주는 플롯이다. 세포 배양 상등액의 IL-2 수준을 형질감염(30 nM) 후 6 내지 72시간 사이에 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 형질감염 후 시간을 나타내고 Y축은 세포 배양 상등액에서의 IL-2 단백질 수준(nM)에 대한 측정치이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 11D는 최대 72시간 까지 SCC-4 세포에서 스크램블된 siRNA(scr. siRNA), 상업적인 VEGFA siRNA, Cpd.9 및 Cpd.10에 의한 구성적으로 발현된 VEGFA 수준의 시간-의존적 하향조절에 대한 플롯이다. 세포 배양 상등액의 VEGFA 수준은 형질감염(30 nM) 후 6 내지 72시간까지 ELISA에 의해 측정되었다. 형질감염되지 않은 세포의 VEGFA 수준을 100%로 설정하고 하향 조절을 이 값으로 정규화하였다. X축은 형질감염 후 시간을 나타내고 Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 VEGFA 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 12A 및 도 12C는 각각 SCC-4 세포 및 A549 세포에서 화합물 11(Cpd.11)에 의해 유도된 IL-12 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 세포 배양 상등액의 IL-12 수준을 형질감염 24시간 후 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용되는 Cpd.11(7(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-12 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 12B 및 도 12D는 각각 SCC-4 세포 및 A549 세포에서 Cpd.11 처리로 인한 IDH1, CDK4 및 CDK6 수준의 하향조절을 나타내는 플롯이다. IDH1, CDK4 및 CDK6의 RNA 수준은 형질감염 후 24시간에 기술적 반복으로 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 측정되었다. X축은 SCC-4 세포 및 A549 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.11(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 IDH1, CDK4 및 CDK6 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 12E 및 도 12G는 각각 SCC-4 세포 및 A549 세포에서 화합물 12(Cpd.12)에 의해 유도된 IL-12 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 세포 배양 상등액의 IL-12 수준을 형질감염 24시간 후 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 SCC-4 세포 및 A549 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.12(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-12 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 12F 및 도 12H는 각각 SCC-4 세포 및 A549 세포에서 Cpd.12 처리로 인한 EGFR, KRAS 및 mTOR 수준의 하향조절을 나타내는 플롯이다. EGFR, KRAS 및 mTOR의 RNA 수준은 형질감염 24시간 후 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 기술적 반복으로 측정되었다. X축은 SCC-4 세포 및 A549 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.12(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 EGFR, KRAS 및 mTOR 수준의 하향 조절을 나타낸다. BQL = 분석의 정량 한계 미만. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 13A 및 도 13B는 각각 A549 세포 및 SCC-4 세포에서 화합물 13(Cpd.13)에 의해 유도된 IL-12 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 세포 배양 상등액의 IL-12 수준을 형질감염 24시간 후 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 A549 세포 및 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.13(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-12 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 13C는 A549 세포에서 화합물 14(Cpd.14)에 의해 유도된 IL-12 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 세포 배양 상등액의 IL-12 수준을 형질감염 24시간 후 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 A549 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.14(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-12 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 13D 및 도 13E는 각각 A549 세포 및 SCC-4 세포에서 Cpd.13 처리로 인한 EGFR 발현의 하향조절을 나타내는 플롯이다. EGFR의 RNA 수준은 형질감염 24시간 후 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 기술적 반복으로 측정되었다. X축은 A549 세포 및 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.13(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 EGFR 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 13F는 A549 세포에서 Cpd.14 처리로 인한 mTOR 발현의 하향조절을 나타내는 플롯이다. mTOR의 RNA 수준은 형질감염 후 24시간에 기술적 반복으로 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 측정되었다. X축은 A549 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.14(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 mTOR 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14A 및 도 14C는 각각 A549 세포 및 SCC-4 세포에서 화합물 15(Cpd.15)에 의해 유도된 IL-15 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 IL-15 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 A549 세포 및 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.15(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-15 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14B 및 도 14D는 각각 A549 세포 및 SCC-4 세포에서 Cpd.15 처리로 인한 VEGFA 및 CD155 발현의 하향조절을 나타내는 플롯이다. VEGFA 및 CD155의 RNA 수준은 형질감염 24시간 후 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 기술적 반복으로 측정되었다. X축은 A549 세포 및 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.15(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 VEGFA 및 CD155 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14E는 인간 교모세포종 세포주(U251 MG) 세포에서 화합물 16(Cpd.16)에 의해 유도된 IL-15 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 IL-15 수준을 ELISA로 측정하였다. X축은 U251 MG 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.16(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-15 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14F는 U251 MG 세포에서 Cpd.16 처리로 인한 VEGFA, PD-L1 및 c-Myc 발현의 하향조절을 나타내는 플롯이다. VEGFA, PD-L1 및 c-Myc의 RNA 수준은 형질감염 24시간 후 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 기술적 반복으로 측정되었다. X축은 U251 MG 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.16(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 VEGFA, PD-L1 및 c-Myc 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14G는 U251 MG 세포에서 화합물 17(Cpd.17)에 의해 유도된 IL-7 수준의 분비를 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 IL-7 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 U251 MG 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.17(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 세포 배양 상등액의 IL-7 단백질 수준(pg/㎖)이다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14H는 U251 MG 세포에서 Cpd.17 처리로 인한 PD-L1 발현의 하향조절을 나타내는 플롯이다. PD-L1의 RNA 수준은 형질감염 24시간 후 기술적 반복으로 qPCR에 의해 세포 용해물로부터 측정되었다. X축은 U251 MG 세포로의 형질감염에 사용된 Cpd.17(10 nM 및 30 nM/웰)의 농도를 나타낸다. Y축은 형질감염되지 않은 샘플(기본 수준)로 정규화된 PD-L1 수준의 하향 조절을 나타낸다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 15A는 SCC-4 세포에서 화합물 5(Cpd.5) 및 화합물 10(Cpd.10)에 의해 유도된 내인성으로 발현된 VEGFA의 하향조절을 나타내는 플롯이다. 형질감염 24시간 후에 세포 배양 상등액의 VEGFA 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. X축은 SCC-4 세포로의 형질감염에 사용되는 Cpd.5 및 Cpd.10(20 및 30 nM)의 농도를 나타낸다. 형질감염되지 않은 세포의 VEGFA 수준은 SCC-4 세포의 내인성 VEGFA 분비 수준을 나타내며 '0'으로 표지되었다. Y축은 ELISA에 의해 측정된 VEGFA 수준을 나타낸다. 데이터는 2개의 독립적인 측정 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 15B는 HUVEC 시험관내 혈관형성 모델에서 도 15A의 상이한 배지 상등액으로부터의 VEGFA에 의해 유도된 분지점(branching point)의 수를 나타내는 플롯이다. 재조합 인간 VEGFA(VEGF)를 대조군으로 사용하였으며, 6시간 시점에서 현미경 사진으로부터 분지점의 수를 카운트하였다. 데이터는 6개의 독립적인 측정 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
본원은 목적 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 표적 메신저(messenger) RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하거나 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한 본원은 단일 RNA 전사물로부터 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 감소시키는 유전 요소 및 사이토카인을 동시에 발현하기 위한 재조합 RNA 작제물을 포함하는, 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원은 추가로 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 사이토카인을 암호화하고, 제2 RNA는 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 감소시키는 유전 요소를 암호화한다. 하나의 예에서, 제1 RNA는 사이토카인을 암호화하는 메신저 RNA(mRNA)일 수 있으며 사이토카인의 단백질 수준을 증가시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 감소시키는 제2 RNA 또는 유전 요소는 표적 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함할 수 있고 표적 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 수준을 하향 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 mRNA를 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다.
정의
다양한 구현예에 대한 철저한 이해를 제공하기 위해 본 기재의 특정 세부 사항이 제시된다. 그러나, 당업자는 본 발명이 이러한 세부사항 없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 다른 경우에, 구현예의 기재를 불필요하게 모호하게 하는 것을 피하기 위해 공지된 구조를 상세하게 도시하거나 설명하지 않았다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 단어 및 이의 변형은 개방적이고 포괄적인 의미, 즉 "포함하지만, 이에 제한되지 않는"으로서 해석되어야 한다. 또한, 본원에 제공된 제목은 편의를 위한 것이며 청구된 개시 내용의 범위 또는 의미를 해석하지 않는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 달리 명시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 또한 "또는"이라는 용어는 일반적으로 내용이 달리 명시하지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용된다는 점에 유의해야 한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "및/또는" 및 "이의 임의의 조합"이라는 용어 및 이들의 문법적 등가물은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어는 임의의 조합이 구체적으로 고려된다는 것을 전달할 수 있다. 단지 예시 목적으로, 하기의 문구 "A, B, 및/또는 C" 또는 "A, B, C 또는 이의 조합"은 "개별적으로 A; 개별적으로 B; 개별적으로 C; A와 B; B와 C; A와 C; 및 A, B, 및 C"를 의미할 수 있다. "또는"이라는 용어는 문맥상 특별히 이접적 사용을 지칭하지 않는 한 접속적으로 또는 이접적으로 사용될 수 있다.
"약" 또는 "대략"이라는 용어는 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미할 수 있으며, 이는 부분적으로 값이 측정 또는 결정되는 방법에 따라, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 해당 분야의 관례에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 10배 이내, 5배 이내 또는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기술되어 있는 경우, 달리 명시되지 않는 한 "약"이라는 용어는 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
본 명세서 및 청구항(들)에 사용된 바와 같이, "포함하는"(및 "포함하다" 및 "포함하다"와 같은, 포함의 임의의 형태), "가지고 있는"(및 "가지다" 및 "가지다"와 같은, "갖는"의 임의의 형태), "포함하는"(및 "포함하다" 및 "포함하다"와 같은, 포함의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유하다" 및 "함유하다"와 같은, 함유의 임의의 형태)이란 단어는 포괄적이거나 제약을 두지 않으며, 추가적인, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 본 개시내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있고 그 반대도 가능하다는 것이 고려된다. 또한, 본 개시내용의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
명세서에서 "구현예", "특정 구현예", "바람직한 구현예", "특정 구현예", "일부 구현예", "하나의 구현예", "일 구현예" 또는 "다른 구현예"에 대한 언급은 구현예와 관련하여 기재된 특정한 특징, 구조, 또는 특성이 본 개시내용의 적어도 일부 구현예에 포함되나, 반드시 모든 구현예에 포함되는 것은 아님을 의미한다. 본 개시내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "RNA"라는 용어는 아미노산 서열(예를 들어, mRNA 등)을 암호화하는 RNA뿐만 아니라 아미노산 서열을 암호화하지 않는 RNA(예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA 등)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 RNA는 코딩 RNA, 즉 아미노산 서열을 암호화하는 RNA일 수 있다. 이러한 RNA 분자는 mRNA(메신저 RNA)라고도 하며 단일 가닥 RNA 분자이다. 본원에 사용되는 바와 같은 RNA라는 용어는 비-코딩(non-coding) RNA, 즉 아미노산 서열을 암호화하지 않거나 단백질로 번역되지 않는 RNA일 수 있다. 비-코딩 RNA는 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 피위(piwi)-상호작용 RNA(piRNA) 및 긴 비-코딩 RNA(IncRNA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같은 siRNA는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 영역, 헤어핀 구조(hairpin structure), 루프(loop) 구조 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 적어도 하나의 shRNA, 적어도 하나의 dsRNA 영역, 또는 적어도 하나의 루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 dsRNA 또는 shRNA로부터 가공될 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 shRNA로부터 DICER와 같은 내인성 단백질에 의해 가공되거나 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 구조 또는 루프 구조는 siRNA로부터 절단되거나 제거될 수 있다. 예를 들어, shRNA의 헤어핀 구조 또는 루프 구조가 절단되거나 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 RNA는 당업자에게 공지된 합성적, 화학적 또는 효소 방법론에 의해 제조되거나, 당업자에게 공지된 재조합 기법에 의해 제조되거나, 또는 천연 공급원으로부터 단리되거나, 또는 이의 임의의 조합에 의해 제조될 수 있다. RNA는 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오티드 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다, 예를 들어 RNA는 당업계에 공지된 화학적 및 자연 발생 뉴클레오시드 변형을 임의로 포함할 수 있다(예를 들어, N1-메틸슈도유리딘은 또한 본원에서 메틸슈도유리딘으로도 지칭됨).
"핵산 서열", "다중핵산 서열", "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 본원에서 동일한 의미를 갖고, DNA 또는 RNA를 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 당/포스페이트-주쇄의 포스포디에스테르-결합에 의해 서로 공유 결합된 뉴클레오티드 단량체를 포함하거나 이로 이루어지는 중합체이다. "핵산 서열", "다중핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 변형되지 않은 핵산 서열, 즉 변형되지 않은 뉴클레오티드 또는 천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "핵산 서열", "다중핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 또한 변형된 핵산 서열, 예를 들어 염기-변형, 당-변형 또는 주쇄-변형 등의 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다.
"천연 뉴클레오티드" 및 "표준 뉴클레오티드"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 본원에서 동일한 의미를 갖고, 자연 발생 뉴클레오티드 염기인 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 우라실(U), 티민(T)을 지칭한다.
"변형되지 않은 뉴클레오티드"라는 용어는 본원에서 자연적으로 변형되지 않은 천연 뉴클레오티드, 예를 들어 후생유전학적으로(epigenetically) 또는 생체내에서 전사-후 변형되지 않은 천연 뉴클레오티드를 지칭하기 위해 사용된다. 바람직하게는 "변형되지 않은 뉴클레오티드"라는 용어는 본원에서 자연적으로 변형되지 않은 천연 뉴클레오티드, 예를 들어 생체 내에서 후생유전학적으로 또는 전사-후 변형되지 않고 화학적으로 변형되지 않은, 예를 들어 시험관 내(in vitro)에서 화학적으로 변형되지 않은 천연 뉴클레오티드를 지칭하는 데 사용된다.
"변형된 뉴클레오티드"라는 용어는 본원에서 자연적으로 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 후생유전학적으로 또는 전사-후 변형된 뉴클레오티드 및 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 시험관 내에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 지칭하는 데 사용된다.
재조합 RNA 작제물
본원은 표적 RNA에 결합함으로써 또 다른 유전자의 발현을 감소시키는 유전 요소 및 목적 유전자를 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는, 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한 본원은 단일 RNA 전사물을 사용하여 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 다른 유전자의 발현을 감소시키는 유전 요소의 예는 표적 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함할 수 있다.
추가로 본원은 목적 유전자 및 siRNA와 같은 다른 유전자의 발현을 감소시키는 유전 요소를 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 제공하며, 여기서 도 1에 예시된 바와 같이 5'에서 3' 방향으로, 또는 3'에서 5' 방향으로 순차적인 방식으로 목적 유전자 및 siRNA와 같은 또 다른 유전자의 발현을 감소시키는 유전 요소가 존재할 수 있다. 하나의 예에서, 목적 유전자는 도 1에 예시된 바와 같이, siRNA와 같은 다른 유전자의 발현을 감소시키는 유전 요소의 5' 또는 상류에 존재할 수 있고, 목적 유전자는 링커(mRNA - siRNA/shRNA 링커(mRNA to siRNA/shRNA linker), 또한 "이격자(spacer)"로서 지칭될 수도 있다)에 의해 siRNA에 연결될 수 있다. 또 다른 예에서, 목적 유전자는 siRNA와 같은 다른 유전자의 발현을 감소시키는 유전 요소의 3' 또는 하류에 존재할 수 있고, siRNA는 링커(siRNA/shRNA - mRNA 링커, 또한 "이격자"로서 지칭될 수도 있다)에 의해 목적 유전자에 연결될 수 있다. 본원에서 제공되는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 하나 초과의 siRNA 종(species)을 포함할 수 있고 하나 초과의 siRNA 종 각각은 링커(siRNA - siRNA 또는 shRNA - shRNA 링커)에 의해 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA - siRNA(또는 siRNA - mRNA) 링커의 서열 및 siRNA - siRNA(또는 shRNA - shRNA) 링커의 서열은 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA - siRNA/shRNA(또는 siRNA/shRNA - mRNA) 링커의 서열 및 siRNA - siRNA(또는 shRNA - shRNA) 링커의 서열은 동일할 수 있다. 본원에서 제공되는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 하나 초과의 목적 유전자를 포함할 수 있고 하나 초과의 목적 유전자 각각은 링커(mRNA - mRNA 링커)에 의해 연결될 수 있다. 목적 유전자의 예로서, 인터류킨 2(IL-2)가 도 1에 도시되어 있다. IL-2는 N-말단에 신호 펩티드 서열을 포함한다. IL-2는 변형되지 않은(WT) 신호 펩티드 서열 또는 변형된 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 재조합 다중핵산 작제물은 또한 RNA 폴리머라제 결합을 위한 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 예로서, T7 RNA 폴리머라제 결합을 위한 T7 프로모터가 도 1에 도시되어 있다.
본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 목적 유전자의 다중 사본을 포함할 수 있으며, 여기서 목적 유전자의 다중 사본 각각은 동일한 단백질을 암호화한다. 또한, 본원은 다수의 목적 유전자를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 다수의 목적 유전자 각각은 상이한 단백질을 암호화한다. 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 다수의 siRNA 종(예를 들어, 적어도 2종의 siRNA)를 포함할 수 있으며, 여기서 다수의 siRNA 종 각각은 동일한 표적 RNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 다수의 siRNA 종 각각은 동일한 표적 RNA의 동일한 영역에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 다수의 siRNA 종 각각은 동일한 표적 RNA의 상이한 영역에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA의 다수 종 중 일부는 동일한 표적 RNA에 결합할 수 있고, 다수의 siRNA 종 중 일부는 동일한 표적 RNA의 상이한 영역에 결합할 수 있다. 또한 본원은 다수의 siRNA 종을 포함하는 재조합 RNA 작제물을 제공하며, 여기서 다수의 siRNA 종 각각은 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 메신저(mRNA)이다.
본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 사이토카인을 암호화하고, 제2 RNA는 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 감소시키는 유전 요소를 암호화한다. 하나의 예에서, 제1 RNA는 사이토카인을 암호화하는 mRNA일 수 있고 사이토카인 단백질 수준을 증가시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 조성물에서 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 감소시키는 제2 RNA 또는 유전 요소는 표적 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 mRNA일 수 있고, 표적 mRNA의 단백질 발현을 하향 조절할 수 있다.
재조합 다중핵산 또는 재조합 RNA는 자연 발생적이지 않고 시험관 내에서 합성 또는 조작되는 다중핵산 또는 RNA를 지칭할 수 있다. 재조합 다중핵산 또는 RNA는 실험실에서 합성될 수 있으며, 효소적 제한 절단, 결찰, 클로닝(cloning) 및/또는 시험관 내 전사와 같은 DNA 또는 RNA의 효소적 변형을 사용함으로써 재조합 DNA 또는 RNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 재조합 다중핵산은 메신저 RNA(mRNA)를 생성하기 위해 시험관 내에서 전사될 수 있고 재조합 mRNA는 분리, 정제 및 세포로의 형질감염에 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 재조합 다중핵산 또는 RNA는 단백질, 폴리펩티드, 표적 모티프(motif), 신호 펩티드 및/또는 작은 간섭 RNA(siRNA)와 같은 비-코딩 RNA를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 조건 하에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA는 세포 내로 통합되고 세포 내에서 발현될 수 있다.
본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 목적 유전자를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 RNA 작제물은 목적 유전자를 암호화하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적 유전자를 암호화할 수 있으며, 여기서 동일한 목적 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다. 일부 경우에, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적 유전자를 암호화할 수 있으며, 여기서 상이한 목적 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 동일한 RNA 작제물에서 암호화된 siRNA의 표적이 아니다. 일부 예에서, 재조합 RNA 작제물은 목적 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 3개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적 유전자 또는 상이한 목적 유전자를 암호화할 수 있고, 상기 동일하거나 상이한 목적 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 동일한 RNA 작제물에서 암호화된 siRNA의 표적이 아니다. 예를 들어, 재조합 RNA 작제물은 목적 유전자를 암호화하는 4개의 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 4개의 핵산 서열 중 3개는 동일한 목적 유전자를 암호화하고 4개의 핵산 서열 중 하나는 상이한 목적 유전자를 암호화하며, 여기서 상기 동일하거나 상이한 목적 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 동일한 RNA 작제물에서 암호화된 siRNA의 표적이 아니다.
본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 mRNA를 표적화(targeting) 하는 siRNA의 하나 초과의 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 동일한 mRNA 또는 상이한 mRNA를 표적화하는 1-10종의 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 동일한 mRNA를 표적화하는 siRNA의 1-10종 각각은 동일한 서열을 포함할 수 있다, 즉 상기 siRNA의 1-10종 각각은 표적 mRNA의 동일한 영역에 결합한다. 일부 예에서, 동일한 mRNA를 표적화하는 siRNA의 1-10종 각각은 상이한 서열을 포함할 수 있다, 즉 상기 siRNA의 1-10 종 각각은 표적 mRNA의 상이한 영역에 결합한다. 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 종양 증식, 혈관형성 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 mRNA를 표적화하는 적어도 2종의 siRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 하나의 mRNA를 표적화하는 3종의 siRNA를 포함할 수 있고, 상기 3종의 siRNA 각각은 mRNA의 동일한 영역을 표적화하기 위해 동일한 핵산 서열을 포함한다. 이 예에서, 상기 3종의 siRNA 각각은 엑손 1을 표적화하기 위해 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 3종의 siRNA 각각은 mRNA의 상이한 영역을 표적화하기 위해 상이한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 예에서, 상기 3종의 siRNA 중 하나는 엑손 1을 표적화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 상기 3종의 siRNA 중 또 다른 하나는 엑손 2를 표적화하는 핵산 서열을 포함할 수 있는 등이다. 더욱 또 다른 예에서, 상기 3종의 siRNA 각각은 상이한 mRNA를 표적화하기 위해 상이한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 모든 양태에서, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물 내의 siRNA는 동일한 RNA 작제물 조성물 중의 mRNA에 의해 발현되는, 사이토카인과 같은 목적 유전자의 발현에 영향을 미치지 않을 수 있다.
본원은 사이토카인을 암호화하는 제1 RNA 및 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 감소시키는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에 기재된 조성물 내의 제1 RNA 및 제2 RNA는 링커에 의해 연결될 수 있다. 일부의 경우에, 제1 RNA 및 제2 RNA를 포함하는 조성물은 링커를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 링커는 길이가 약 6 내지 약 50 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 링커는 길이가 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 적어도 약 40 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 링커는 길이가 최대 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 최대 약 50 뉴클레오티드일 수 있다. 경우에 따라 tRNA 링커를 사용할 수 있다. tRNA 시스템은 진화적으로 보존된 교차 생물체이며 내인성 RNase P 및 Z를 활용하여 다중시스트론 작제물을 가공한다(Dong et al., 2016). 일부 경우에, 본원에 기재된 tRNA 링커는 AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA(서열번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA(서열번호 21)를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 링커를 사용하여 제1 RNA와 제2 RNA를 연결할 수 있다.
본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 특히 번역을 개선시키기 위해 5' 캡, Kozak 서열 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및/또는 3' 단부의 폴리(A) 테일(tail)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 재조합 RNA 작제물은 임의의 숙련가에게 공지된 번역 촉진 영역을 추가로 포함할 수 있다. 5' 캡의 비제한적 예는 항-역 CAP 유사체, 클린 캡, 캡 0, 캡 1, 캡 2, 또는 잠금 핵산 캡(LNA-캡)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 5' 캡은 m2 7,3'-OG(5')ppp(5')G, m7G, m7G(5')G, m7GpppG, 또는 m7GpppGm을 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 폴리(A) 테일을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 폴리(A) 테일은 1 내지 220 염기쌍의 폴리(A)(서열번호 150)를 포함한다. 예를 들어, 폴리(A) 테일은 1, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 또는 220 염기쌍의 폴리(A)(서열번호 150)를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 1 내지 20, 1 내지 40, 1 내지 60, 1 내지 80, 1 내지 100, 1 내지 120, 1 내지 140, 1 내지 160, 1 내지 180, 1 내지 200, 1 내지 220, 20 내지 40, 20 내지 60, 20 내지 80, 20 내지 100, 20 내지 120, 20 내지 140, 20 내지 160, 20 내지 180, 20 내지 200, 20 내지 220, 40 내지 60, 40 내지 80, 40 내지 100, 40 내지 120, 40 내지 140, 40 내지 160, 40 내지 180, 40 내지 200, 40 내지 220, 60 내지 80, 60 내지 100, 60 내지 120, 60 내지 140, 60 내지 160, 60 내지 180, 60 내지 200, 60 내지 220, 80 내지 100, 80 내지 120, 80 내지 140, 80 내지 160, 80 내지 180, 80 내지 200, 80 내지 220, 100 내지 120, 100 내지 140, 100 내지 160, 100 내지 180, 100 내지 200, 100 내지 220, 120 내지 140, 120 내지 160, 120 내지 180, 120 내지 200, 120 내지 220, 140 내지 160, 140 내지 180, 140 내지 200, 140 내지 220, 160 내지 180, 160 내지 200, 160 내지 220, 180 내지 200, 180 내지 220, 또는 200 내지 220 염기쌍의 폴리(A)(서열번호 150)를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 1, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 또는 220 염기쌍의 폴리(A)(서열번호 150)를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 적어도 1, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 또는 적어도 200 염기쌍의 폴리(A)(서열번호 151)를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 최대 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 또는 최대 220 염기쌍의 폴리(A)(서열번호 152)를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 120 염기쌍의 폴리(A)(서열번호 153)를 포함한다.
본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 Kozak 서열을 추가로 포함할 수 있다. Kozak 서열은 단백질 번역 개시 부위로 기능하는 핵산 서열 동기를 지칭할 수 있다. Kozak 서열은 예를 들어 문헌[Kozak, M., Gene 299(1-2):1-34](내용 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 상세히 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 코작 서열은 GCCACC(서열번호 19)를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 핵 국소화 신호(NLS)를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 재조합 RNA 작제물은 비표준 뉴클레오티드(들), 비-천연 뉴클레오티드(들), 뉴클레오티드 유사체(들) 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함한, 하나 이상의 뉴클레오티드 변이체를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 예에는 디아미노퓨린, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록실메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오유리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, (acp3)w, 2,6-디아미노퓨린, N1-메틸슈도유리딘 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 뉴클레오티드는 트리포스페이트 모이어티(moiety)에 대한 변형을 포함하여, 포스페이트 부분의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 비제한적 예는 더 긴 길이의 포스페이트 쇄 및 티올 모이어티를 사용한 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 쇄는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 포스페이트 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 티올 모이어티는 알파-티오트리포스페이트 및 베타-티오트리포스페이트를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 RNA 작제물은 5-메틸시토신 및/또는 N6-메틸아데노신을 포함하지 않는다.
본원에 기재된 재조합 RNA 작제물은 염기 모이어티, 당 모이어티 또는 포스페이트 주쇄에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형은 전형적으로 상보적 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성하는 데 이용 가능한 하나 이상의 원자 및/또는 전형적으로 상보적 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 없는 하나 이상의 원자에서 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 주쇄 변형은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트, 포스포라미데이트, 및 포스포로디아미데이트 연결을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 포스포로티오에이트 연결은 포스페이트 주쇄 중의 비-가교 산소를 황 원자로 대체하고 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 분해를 지연시킨다. 포스포로디아미데이트 연결(N3'→P5')은 뉴클레아제 인식 및 분해를 방지한다. 일부 구현예에서, 주쇄 변형은 주쇄 구조에서 인 대신 펩티드 결합을 갖는 것, 또는 카바메이트, 아미드, 및 선형 및 환상 탄화수소 기를 포함하는 연결 기를 갖는 것을 포함한다. 예를 들어, N-(2-아미노에틸)-글리신 단위는 펩티드 핵산에서 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 변형된 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드는 하기의 문헌에서 검토된다: Micklefield, Backbone modification of nucleic acids: synthesis, structure and therapeutic applications, Curr. Med. Chem., 8 (10): 1157-79, 2001 및 Lyer et al., Modified oligonucleotides-synthesis, properties and applications, Curr. Opin. Mol. Ther., 1 (3): 344-358, 1999.
본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 변형된 뉴클레오티드와 변형되지 않은 뉴클레오티드의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 아데노신-, 구아노신- 및 시티딘-함유 뉴클레오티드는 변형되지 않거나 부분적으로 변형된다. 일부 예에서, 변형된 RNA 작제물의 경우, 유리딘 뉴클레오티드의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 유리딘 뉴클레오티드의 5% 내지 25%가 재조합 RNA 작제물에서 변형된다. 변형된 유리딘 뉴클레오티드의 비제한적 예는 슈도유리딘, N1-메틸슈도유리딘, 또는 N1-메틸슈도-UTP를 포함할 수 있고 당업계에 공지된 임의의 변형된 유리딘 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 변형된 뉴클레오티드와 변형되지 않은 뉴클레오티드의 조합을 함유할 수 있으며, 여기서 유리딘 뉴클레오티드의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%는 슈도유리딘, N1-메틸슈도유리딘, N1-메틸슈도-UTP, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 변형된 유리딘 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 변형된 뉴클레오티드와 변형되지 않은 뉴클레오티드의 조합을 함유할 수 있으며, 여기서 유리딘 뉴클레오티드의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%는 N1-메틸슈도유리딘을 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 코돈-최적화될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을, 고유 아미노산 서열을 유지하면서 해당 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에서의 발현에 대해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 예를 들어, "코돈 용법 데이터베이스"에서 코돈 용법 표를 쉽게 입수할 수 있으며, 이들 표를 여러 가지 방법으로 맞출 수 있다. Gene Forge® (Aptagen, PA) 및 GeneOptimizer® (ThermoFischer, MA)와 같은, 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 최적화하는 코돈을 위한 컴퓨터 알고리즘을 또한 입수할 수 있으며, 이것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 코돈-최적화되지 않을 수도 있다.
일부 예에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 1-17 및 125-141로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
RNA 간섭 및 작은 간섭 RNA(siRNA)
RNA 간섭(RNAi) 또는 RNA 침묵은 RNA 분자가 표적 mRNA 분자를 중화시킴으로써 유전자 발현 또는 번역을 억제하는 과정이다. RNAi 과정은 하기의 문헌에 기재되어 있다: Mello & Conte (2004) Nature 431, 338-342, Meister & Tuschl (2004) Nature 431, 343-349, Hannon & Rossi (2004) Nature 431, 371-378, 및 Fire (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6966-6984. 간단히 말해서, 자연적인 과정에서 상기 반응은 긴 이중 가닥 RNA(dsRNA)를, 작은 dsRNA 단편 또는 dsRNA 특이적 엔도뉴클레아제 다이서(Dicer)에 의해 헤어핀 구조를 가진 siRNA(즉, shRNA)로 절단하는 것으로 시작된다. 이어서 이러한 작은 dsRNA 단편 또는 siRNA는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)에 통합되어 상기 RISC를 표적 mRNA 서열로 안내한다. 간섭 동안, siRNA 듀플렉스는 풀리고, 안티센스(antisense) 가닥은 RISC와 복합체를 유지하여 RISC를 표적 mRNA 서열로 유도하여 분해 및 단백질 번역의 후속 억제를 유도한다. 시판되는 합성 siRNA와 달리, 본 발명의 siRNA는 본 발명의 재조합 RNA 작제물에서 siRNA가 헤어핀 루프 구조를 포함할 수 있기 때문에, 세포 흡수 후 세포의 세포질에서 내인성 다이서 및 RISC 경로를 활용하여 재조합 RNA 작제물(예를 들어 mRNA 및 하나 이상의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물)로부터 절단되고 상술한 자연적인 과정을 따른다. 또한, 나머지 재조합 RNA 작제물(즉, mRNA)은 다이서에 의한 siRNA 절단 후 온전하게 남아 있기 때문에, 본 발명의 재조합 RNA 작제물에서 목적 유전자로부터 목적하는 단백질 발현이 달성된다.
본원은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 경우에 표적 RNA는 mRNA이다. 일부 구현예에서, siRNA는 5' 번역되지 않은 영역에서 표적 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 3' 번역되지 않은 영역에서 표적 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 엑손에서 표적 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 표적 RNA는 비암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 센스 siRNA 가닥을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 안티센스 siRNA 가닥을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 센스 siRNA 가닥을 포함하는 핵산 서열 및 안티센스 siRNA 가닥을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 포함된 siRNA의 세부사항은 문헌[Cheng, et al. (2018) J. Mater. Chem. B., 6, 4638-4644](본원에 참고로 포함된다)에 기재되어 있다.
예를 들어, 일부 경우에, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1종의 siRNA, 즉 siRNA의 센스 가닥을 포함하는 핵산 서열 및 siRNA의 안티-가닥을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 1종의 siRNA는 1종의 센스 가닥 siRNA 및 1종의 안티센스 가닥 siRNA를 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 재조합 RNA 작제물은 1종 초과의 siRNA, 예를 들어 siRNA의 센스 가닥 및 siRNA의 안티-가닥을 포함하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 이상의 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 1 내지 20종의 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 적어도 10종의 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 최대 20종의 siRNA를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 RNA 작제물은 적어도 2종의 siRNA를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 RNA 작제물은 적어도 3종의 siRNA를 포함한다.
본원은 1-20개 이상의 siRNA 종을 포함하는 재조합 RNA 작제물의 조성물을 제공하며, 여기서 1-20개 이상의 siRNA 종 각각은 표적 RNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 mRNA 또는 비-코딩 RNA이다. 일부 경우에, 각각의 siRNA 종은 동일한 표적 RNA에 결합한다. 하나의 경우에, 각각의 siRNA 종은 동일한 서열을 포함할 수 있고 동일한 표적 RNA의 동일한 영역 또는 서열에 결합할 수 있다. 예를 들어, 재조합 RNA 작제물은 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함할 수 있고, siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종 각각은 표적 RNA의 동일한 영역을 표적화하는 동일한 서열을 포함한다, 즉 재조합 RNA 작제물은 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 반복된 종을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 각각의 siRNA 종은 상이한 서열을 포함할 수 있고 동일한 표적 RNA의 상이한 영역 또는 서열에 결합할 수 있다. 예를 들어, 재조합 RNA 작제물은 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함할 수 있고, siRNA의 각각의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종은 동일한 표적의 상이한 영역을 표적화하는 상이한 서열을 포함할 수 있다. 이 예에서, siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종 중 하나의 siRNA는 엑손 1을 표적화할 수 있고, siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종 중 다른 siRNA는 동일한 mRAN의 엑손 2를 표적화할 수 있는 등이다. 일부 예에서, 재조합 RNA 작제물은 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함할 수 있고 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종 중 2개는 동일한 서열을 포함할 수 있고 표적 RNA의 동일한 영역에 결합하며 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종 중 3개 이상은 상이한 서열을 포함할 수 있고 동일한 표적 RNA의 상이한 영역에 결합할 수 있다. 일부의 경우에 각각의 siRNA 종은 상이한 표적 RNA에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 mRNA 또는 비-코딩 RNA 등일 수 있다.
본원은 1-20개 이상의 siRNA 종을 포함하는 재조합 RNA 작제물의 조성물을 제공하며, 여기서 1-20개 이상의 siRNA 종 각각은 링커에 의해 연결된다. 일부 경우에, 링커는 절단 불가능한 링커일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 자체 절단 가능한 링커와 같은 절단 가능한 링커일 수 있다. 일부 경우에 링커는 tRNA 링커일 수 있다. tRNA 시스템은 살아있는 유기체 전반에 걸쳐 진화적으로 보존되며 내인성 RNase P 및 Z를 활용하여 다중시스트론 구조를 가공한다(Dong et al., 2016). 일부 구현예에서, tRNA 링커는 AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA(서열번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, TTTATCTTAGAGGCATATCCCTACGTACCAACAA(서열번호 22)를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 링커는 상이한 siRNA 종을 연결하는 데 사용될 수 있다.
일부 예에서, siRNA의 이의 mRNA 표적에 대한 특이적 결합은 표적 mRNA의 정상적인 기능을 간섭하여 기능 및/또는 활성의 조절, 예를 들어, 하향 조절을 일으키며, 여기서 특이적 결합이 요구되는 조건 하에서, 즉 생체내 분석 또는 치료학적 적 치료의 경우 생리학적 조건 하에서, 및 시험관내 분석의 경우에 분석이 수행되는 조건 하에서 비-표적 핵산 서열에 대한 siRNA의 비-특이적 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 존재한다.
본원에서 사용되는 단백질은 전형적으로 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 분자를 지칭할 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 전형적으로 펩티드 결합으로 연결된 아미노산 잔기의 쇄이다. 펩티드는 대개 2 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함한다. 폴리펩티드는 대개 50개 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. 단백질은 전형적으로 상기 단백질이 그의 생물학적 기능을 발휘하는 데 필요할 수 있는 3차원 형태로 폴딩되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 단백질은 단백질의 단편, 단백질의 변이체 및 융합 단백질을 포함할 수 있다. 단편은 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 핵산 분자의 전체 길이 서열의 더 짧은 부분일 수 있다. 따라서, 단편은 전형적으로 완전길이 서열 내의 상응하는 신장부와 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열의 상기 단편은 단편이 유래된 완전길이 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 적어도 5% 내지 적어도 80%를 차지할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 포유동물 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 인간 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 세포로부터 분비되는 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 세포막 상의 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 지칭되는 바와 같은 단백질은, 분비되고 종종 면역학적 반응에 관여하는 세포 표면 상의 수용체를 통한 표적 세포 신호전달의 조절제로서 국소적으로 또는 전신적으로 작용하는 단백질일 수 있다. 목적 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 바이러스 감염에 관여하는 다른 숙주 단백질을 포함하여, 본 발명의 맥락에서 유용한 단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고 문헌에서 입수할 수 있다. 예를 들어, 목적 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 포함하여, 본 발명의 맥락에서 유용한 단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 UniProt 데이터베이스에서 입수할 수 있다.
본원은 표적 mRNA의 발현을 조절하기 위해 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물의 조성물을 제공한다. 일부 예에서, 표적 mRNA의 발현(예를 들어, 표적 mRNA에 의해 암호화되는 단백질의 수준)은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향 조절된다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 억제된다. 본원에 기재된 바와 같은 표적 mRNA 발현의 억제 또는 하향조절은 비제한적으로, 표적 mRNA로부터 단백질의 번역을 방해하는 표적 mRNA의 방해를 지칭할 수 있으며; 따라서, 표적 mRNA 발현의 억제 또는 하향조절은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물의 부재 하에서 표적 mRNA로부터 발현된 단백질 수준과 비교하여 표적 mRNA로부터 발현된 단백질 수준의 감소를 의미할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 단백질 발현 수준은 당업계에 주지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있으며, 여기에는 웨스턴 블롯팅, 유식 세포측정법, ELISA, RIA 및 다양한 프로테오믹스 기법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드를 측정하거나 검출하는 예시적인 방법은 ELISA와 같은 면역분석법이다. 이러한 유형의 단백질 정량분석은 특정 항원을 포착할 수 있는 항체와 포착된 항원을 검출할 수 있는 제2 항체를 기반으로 할 수 있다. 폴리펩티드의 검출 및/또는 측정을 위한 예시적인 분석은 문헌[Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다.
본원은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 표적 mRNA는 목적 유전자에 의해 암호화되는 mRNA와 상이하다. 본원은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 siRNA는 목적 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는다. 일부 경우에, siRNA는 목적 유전자에 의해 암호화된 mRNA에 결합할 수 없다. 일부 경우에 siRNA는 목적 유전자의 발현을 억제하지 않는다. 일부 경우에 siRNA는 목적 유전자의 발현을 하향조절하지 않는다. 본원에 기재된 바와 같이, 목적 유전자의 발현을 억제 또는 하향조절하는 것은 비제한적으로, 재조합 RNA 작제물로부터 단백질의 번역을 방해하는 것을 지칭할 수 있으며; 따라서, 목적 유전자의 발현을 억제하거나 하향조절하는 것은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물의 부재 하에서 발현되는 단백질 수준과 비교하여 감소된 단백질 수준을 지칭할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 단백질 발현 수준은 당업계에 주지된 임의의 방법을 사용하여 측정할 수 있으며, 여기에는 웨스턴 블롯팅, 유식 세포측정법, ELISA, RIA 및 다양한 프로테오믹스 기법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드를 측정하거나 검출하는 예시적인 방법은 ELISA와 같은 면역분석법이다. 이러한 유형의 단백질 정량분석은 특정 항원을 포착할 수 있는 항체와 포착된 항원을 검출할 수 있는 제2 항체를 기반으로 할 수 있다. 폴리펩티드의 검출 및/또는 측정을 위한 예시적인 분석은 문헌[Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다.
본원은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. siRNA가 결합할 수 있는 표적 mRNA의 비제한적 예의 목록에는 종양 증식, 혈관형성 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 mRNA가 포함된다. 예를 들어, 표적 mRNA는 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGFA, VEGFA의 동형, 태반 성장 인자(PIGF), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 mRNA일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 기능적 변이체는 완전길이 분자, 이의 단편 또는 이의 변이체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자는 단백질 서열의 경우 하나 이상의 아미노산, 또는 핵산 서열의 경우 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자는 기능 획득 또는 기능 상실 돌연변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 돌연변이 단백질을 포함하거나 암호화할 수 있다. VEGFA 동형의 비제한적 예의 목록이 표 A에 제시되어 있다.
[표 A]
VEGFA 동형의 목록
일부 구현예에서, VEGFA는 서열번호 34에 나열된 서열을 포함한다. 예시적인 PIGF 서열이 하기에 제시된다:
PIGF NCBI 참조 서열: NM_001207012.1(서열번호 123)
예를 들어, 표적 mRNA는 MHC 부류 I 쇄-관련 서열 A(MICA), MHC 부류 I 쇄-관련 서열 B(MICB), 소포체 단백질(ERp5), 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAM), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 mRNA일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 기능적 변이체는 완전길이 분자, 이의 단편 또는 이의 변이체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자는 단백질 서열의 경우 하나 이상의 아미노산, 또는 핵산 서열의 경우 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자는 기능 획득 또는 기능 상실 돌연변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 돌연변이 단백질을 포함하거나 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM 17이다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 유인 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서 유인 단백질은 가용성 형태의 세포 수용체이다. 일부 구현예에서, 유인 단백질은 가용성 MICA, MICB, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 세포막으로부터 MICA 및/또는 MICB의 발산에 관여하는 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포막으로부터 MICA 및/또는 MICB의 발산에 관여하는 단백질은 ERp5, ADAM, MMP, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포막으로부터 MICA 및/또는 MICB의 발산에 관여하는 단백질은 ADAM17, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. ADAM17의 예시적인 서열을 하기에 나타낸다:
ADAM17 NCBI 참조 서열: NM_003183.6(서열번호 124)
예를 들어, 표적 mRNA는 이소시트레이트 데하이드로게나제(IDH1), 사이클린-의존성 키나제 4(CDK4), CDK6, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 라파마이신의 기계론적 표적(mTOR), Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자(KRAS), 분화 클러스터(CD155), 세포예정사-리간드 1(PD-L1), 또는 myc 원-종양유전자(myc proto-oncogene; c-Myc), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 mRNA일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 기능적 변이체는 완전길이 분자, 이의 단편 또는 이의 변이체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자는 단백질 서열의 경우 하나 이상의 아미노산, 또는 핵산 서열의 경우 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자는 기능 획득 또는 기능 상실 돌연변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 돌연변이 단백질을 포함하거나 암호화할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 mRNA는 VEGFA, VEGFA의 동형, PIGF, MICA, MICB, ERp5, ADAM17, MMP, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1, c-Myc, 이의 단편, 이의 기능적 변이체, 및 이의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, VEGFA mRNA는 서열번호 36을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, MICA mRNA는 서열번호 39를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, MICB mRNA는 서열번호 42를 포함하는 서열을 포함한다. 구현예에서, IDH1 mRNA는 서열번호 51을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CDK4 mRNA는 서열번호 54를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CDK6 mRNA는 서열번호 57을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR mRNA 는 서열번호 60을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR mRNA는 서열번호 63을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, KRAS mRNA는 서열번호 66을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD155 mRNA는 서열번호 72를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 PD-L1 mRNA는 서열번호 75를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 c-Myc mRNA는 서열번호 78을 포함하는 서열을 포함한다.
목적 유전자
본원은 목적 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 하나 이상의 사본을 포함하는 재조합 RNA 작제물을 제공한다. 예를 들어, 재조합 RNA 작제물은 목적 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 사본을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 목적 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 사본 각각은 동일한 목적 유전자를 암호화한다. 일부 예에서, 재조합 RNA 작제물은 사이토카인을 암호화하는 핵산 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 사본을 포함할 수 있다.
또한 본원은 목적 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 2개 이상의 사본을 포함하는 재조합 RNA 작제물을 제공하며, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적 유전자를 암호화할 수 있다. 일부 경우에, 상이한 목적 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 분비 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상이한 목적 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 사이토카인을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 목적 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 사이토카인을 암호화할 수 있다. 본원은 링커를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 링커는 목적 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결할 수 있다. 일부 경우에 링커는 절단 불가능한 링커일 수 있다. 일부 경우에 링커는 절단 가능한 링커일 수 있다. 경우에 따라 링커는 자체 절단 가능한 링커일 수 있다. 링커의 비제한적 예는 가요성 링커, T2A, P2A, E2A 또는 F2A와 같은 2A 펩티드 링커(또는 2A 자기-절단 펩티드) 및 tRNA 링커 등을 포함한다. tRNA 시스템은 살아있는 동안 진화적으로 보존되며, 내인성 RNase P 및 Z를 활용하여 다중시스트론 구조를 가공한다(Dong et al., 2016). 일부 구현예에서, tRNA 링커는 AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA(서열번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원은 목적 유전자의 발현을 조절하기 위해 목적 유전자를 암호화하는 RNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 제공한다. 예를 들어, 목적 유전자의 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 예를 들어, 목적 유전자의 발현은 재조합 RNA 작제물에서 목적 유전자의 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 발현함으로써 상향조절된다. 예를 들어, 목적 유전자의 발현은 재조합 RNA 작제물에서 목적 유전자의 mRNA에 의해 암호화되는 단백질의 수준을 증가시킴으로써 상향조절된다. 단백질 발현 수준은 당업계에 주지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있으며, 여기에는 웨스턴 블롯팅, 유식 세포측정법, ELISA, RIA 및 다양한 프로테오믹스 기법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드를 측정하거나 검출하는 예시적인 방법은 ELISA와 같은 면역분석법이다. 이러한 유형의 단백질 정량분석은 특정 항원을 포착할 수 있는 항체와 포착된 항원을 검출할 수 있는 두 번째 항체를 기반으로 할 수 있다. 폴리펩티드의 검출 및/또는 측정을 위한 예시적인 분석은 문헌[Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다.
본원은 목적 유전자를 암호화하는 RNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 제공하며, 여기서 목적 유전자는 관심 단백질을 암호화한다. 경우에 따라 관심 단백질은 치료학적 단백질이다. 일부 경우에, 관심 단백질은 인간 기원, 즉 인간 단백질이다. 일부 경우에 목적 유전자는 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 인터류킨을 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 인터류킨 2(IL-2), IL-12, IL-15, IL-7, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 기능적 변이체는 완전길이 분자, 이의 단편 또는 이의 변이체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 변이체 분자는 단백질 서열의 경우 하나 이상의 아미노산, 또는 핵산 서열의 경우 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 서열을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 사용된 바와 같은 인터류킨 2(IL-2) 또는 IL-2는 인간 IL-2의 천연 서열(Uniprot 데이터베이스: P60568 또는 Q0GK43 및 Genbank 데이터베이스: NM_000586.3), 이의 단편 또는 이의 기능적 변형을 지칭할 수 있다. 인간 IL-2를 암호화하는 천연 DNA 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 인간 IL-2의 천연 서열은 서열번호 23에 나타낸 바와 같이 20개의 아미노산을 갖는 신호 펩티드(뉴클레오티드 1-60) 및 133개의 아미노산을 갖는 성숙한 인간 IL-2(뉴클레오티드 61-459)로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 인터류킨 2(IL-2) 또는 IL-2는 성숙한 인간 IL-2를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 단백질은, 단백질을 발현하고 분비하는 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 IL-2는, IL-2를 발현하고 분비하는 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 IL-2 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 인간 IL-2는, 인간 IL-2를 발현하고 분비하는 인간 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 IL-2 단백질을 지칭할 수 있으며, 서열번호 24에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드에 의해 암호화된 아미노산을 통상적으로 함유한다. 일부 구현예에서, IL-2는 IL-2 단편, IL-2 변이체, IL-2 뮤테인(mutein) 또는 IL-2 돌연변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-2 단편은 적어도 부분적으로 기능적일 수 있다, 즉 야생형 또는 완전길이 IL-2와 비교하여 유사하거나 더 낮은 수준에서 IL-2 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-2 단편은 완전히 기능적일 수 있다, 즉 야생형 또는 완전길이 IL-2와 비교하여 동일한 수준에서 IL-2 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2 변이체, IL-2 뮤테인 또는 IL-2 돌연변이체는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-2 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2 변이체, IL-2 뮤테인 또는 IL-2 돌연변이체는 적어도 부분적으로 기능적일 수 있다, 즉 야생형 IL-2와 비교하여 유사하거나 동일한 수준에서 IL-2 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2 변이체, IL-2 뮤테인 또는 IL-2 돌연변이체는 완전히 기능적일 수 있다, 즉 야생형 IL-2와 비교하여 동일한 수준에서 IL-2 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2 변이체, IL-2 뮤테인 또는 IL-2 돌연변이체는 야생형 IL-2와 비교하여 더 높은 수준에서 IL-2 활성을 수행할 수 있다.
IL-2를 암호화하는 mRNA는 153개 아미노산을 갖는 인간 IL-2의 프로펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 133개 아미노산을 갖는 성숙한 인간 IL-2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 지칭할 수 있다. 인간 IL-2의 프로펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 성숙한 인간 IL-2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 IL-2 mRNA의 1개 사본을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 IL-2 mRNA의 2개 이상의 사본을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 인터류킨 12(IL-12) 또는 IL-12는 인간 IL-12 알파의 천연 서열(Genbank 데이터베이스: NM_000882.4), 인간 IL-12 베타의 천연 서열(Genbank 데이터베이스: NM_002187.2), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 지칭할 수 있다. 인간 IL-12를 암호화하는 천연 DNA 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 인간 IL-12 알파의 천연 서열은 서열번호 43에 나타낸 바와 같이 22개의 아미노산을 갖는 신호 펩티드 및 197개의 아미노산을 갖는 성숙한 인간 IL-12로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-12 알파 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-12 알파 신호 펩티드이다. 인간 IL-12 베타의 천연 서열은 서열번호 46에 나타낸 바와 같이 22개의 아미노산을 갖는 신호 펩티드 및 306개의 아미노산을 갖는 성숙한 인간 IL-12로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-12 베타 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-12 베타 신호 펩티드이다.
일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 인터류킨 12(IL-12) 또는 IL-12는 성숙한 인간 IL-12 알파를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 인터류킨 12(IL-12) 또는 IL-12는 성숙한 인간 IL-12 베타를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 단백질은, 단백질을 발현하고 분비하는 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 IL-12는, IL-12를 발현하고 분비하는 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 IL-12 알파 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 IL-12는, IL-12를 발현하고 분비하는 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 IL-12 베타 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 인간 IL-12는, 인간 IL-12를 발현하고 분비하는 인간 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 IL-12 알파 단백질을 지칭할 수 있으며, 통상적으로 서열번호 44에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산을 함유 한다. 일부 구현예에서, 성숙한 인간 IL-12는, 인간 IL-12를 발현하고 분비하는 인간 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 IL-12 베타 단백질을 지칭할 수 있으며, 통상적으로 서열번호 47에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드에 의해 암호화된 아미노산을 함유한다.
일부 구현예에서, IL-12 알파는 IL-12 알파 단편, IL-12 알파 변이체, IL-12 알파 뮤테인 또는 IL-12 알파 돌연변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-12 알파 단편은 적어도 부분적으로 기능적일 수 있다, 즉 야생형 또는 완전길이 IL-12 알파와 비교하여 유사하거나 더 낮은 수준에서 IL-12 알파 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-12 알파 단편은 완전히 기능적일 수 있다, 즉 야생형 또는 완전길이 IL-12 알파와 비교하여 동일한 수준에서 IL-12 알파 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12 알파 변이체, IL-12 알파 뮤테인 또는 IL-12 알파 돌연변이체는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-12 알파 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12 알파 변이체, IL-12 알파 뮤테인 또는 IL-12 알파 돌연변이체는 적어도 부분적으로 기능적일 수 있다, 즉 야생형 IL-12 알파와 비교하여 유사하거나 더 낮은 수준에서 IL-12 알파 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12 알파 변이체, IL-12 알파 뮤테인 또는 IL-12 알파 돌연변이체는 완전히 기능적일 수 있다, 즉 야생형 IL-12 알파와 비교하여 동일한 수준에서 IL-12 알파 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12 알파 변이체, IL-12 알파 뮤테인 또는 IL-12 알파 돌연변이체는 야생형 IL-12 알파와 비교하여 더 높은 수준에서 IL-12 알파 활성을 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-12 베타는 IL-12 베타 단편, IL-12 베타 변이체, IL-12 베타 뮤테인 또는 IL-12 베타 돌연변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-12 베타 단편은 적어도 부분적으로 기능적일 수 있다, 즉 야생형 또는 완전길이 IL-12 베타와 비교하여 유사하거나 더 낮은 수준에서 IL-12 베타 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-12 베타 단편은 완전히 기능적일 수 있다, 즉 야생형 또는 완전길이 IL-12 베타와 비교하여 동일한 수준에서 IL-12 베타 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12 베타 변이체, IL-12 베타 뮤테인 또는 IL-12 베타 돌연변이체는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-12 베타 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12 베타 변이체, IL-12 베타 뮤테인 또는 IL-12 베타 돌연변이체는 적어도 부분적으로 기능적일 수 있다, 즉 야생형 IL-12 베타와 비교하여 유사하거나 더 낮은 수준에서 IL-12 베타 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12 베타 변이체, IL-12 베타 뮤테인 또는 IL-12 베타 돌연변이체는 완전히 기능적일 수 있다, 즉 야생형 IL-12 베타와 비교하여 동일한 수준에서 IL-12 베타 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12 베타 변이체, IL-12 베타 뮤테인 또는 IL-12 베타 돌연변이체는 야생형 IL-12 베타와 비교하여 더 높은 수준에서 IL-12 베타 활성을 수행할 수 있다.
IL-12를 암호화하는 mRNA는 219개의 아미노산을 갖는 인간 IL-12 알파의 프로펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 197개의 아미노산을 갖는 성숙한 인간 IL-12 알파를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 지칭할 수 있다. 인간 IL-12 알파의 프로펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 성숙한 인간 IL-12를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화될 수 있다. IL-12를 암호화하는 mRNA는 328개 아미노산을 갖는 인간 IL-12 베타의 프로펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 306개 아미노산을 갖는 성숙한 인간 IL-12 베타를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 지칭할 수 있다. 인간 IL-12 베타의 프로펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 성숙한 인간 IL-12를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 1개 사본의 IL-12 mRNA를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 IL-12 mRNA의 2개 이상의 사본을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 인터류킨 15(IL-15) 또는 IL-15는 인간 IL-15(Genbank 데이터베이스: NM_000585.4)의 천연 서열, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 지칭할 수 있다. 인간 IL-15를 암호화하는 천연 DNA 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 인간 IL-15의 천연 서열은 서열번호 67에 나타낸 바와 같이 29개의 아미노산을 갖는 신호 펩티드 및 133개의 아미노산을 갖는 성숙한 인간 IL-15로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-15 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-15 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 인터류킨 15(IL-15) 또는 IL-15는 성숙한 인간 IL-15를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 단백질은, 단백질을 발현하고 분비하는 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 IL-15는, IL-15를 발현하고 분비하는 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 IL-15 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 인간 IL-15는, 인간 IL-15를 발현하고 분비하는 인간 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 IL-15 단백질을 지칭할 수 있으며, 통상적으로 서열번호 68에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산을 함유한다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15 단편, IL-15 변이체, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 돌연변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 단편은 적어도 부분적으로 기능적일 수 있다, 즉 야생형 또는 완전길이 IL-15와 비교하여 유사하거나 더 낮은 수준에서 IL-15 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-15 단편은 완전히 기능적일 수 있다, 즉 야생형 또는 완전길이 IL-15와 비교하여 동일한 수준에서 IL-15 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-15 변이체, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 돌연변이체는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-15 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-15 변이체, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 돌연변이체는 적어도 부분적으로 기능적일 수 있다, 즉 야생형 IL-15와 비교하여 유사하거나 동일한 수준에서 IL-15 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-15 변이체, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 돌연변이체는 완전히 기능적일 수 있다, 즉 야생형 IL-15와 비교하여 동일한 수준에서 IL-15 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-15 변이체, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 돌연변이체는 야생형 IL-15와 비교하여 더 높은 수준에서 IL-15 활성을 수행할 수 있다.
IL-15를 암호화하는 mRNA는 162개의 아미노산을 갖는 인간 IL-15의 프로펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 133개의 아미노산을 갖는 성숙한 인간 IL-15를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 지칭할 수 있다. 인간 IL-15의 프로펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 성숙한 인간 IL-15를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 IL-15 mRNA의 1개 사본을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 IL-15 mRNA의 2개 이상의 사본을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 인터류킨 7(IL-7) 또는 IL-7은 인간 IL-7(Genbank 데이터베이스: NM_000880.3)의 천연 서열, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 지칭할 수 있다. 인간 IL-7을 암호화하는 천연 DNA 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 인간 IL-7의 천연 서열은 서열번호 79에 나타낸 바와 같이 25개 아미노산을 갖는 신호 펩티드 및 152개 아미노산을 갖는 성숙한 인간 IL-7로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-7 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-7 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 인터류킨 7(IL-7) 또는 IL-7은 성숙한 인간 IL-7을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 단백질은, 단백질을 발현하고 분비하는 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 IL-7은, IL-7을 발현하고 분비하는 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 IL-7 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 인간 IL-7은, 인간 IL-7을 발현하고 분비하는 인간 세포에서 소포체에서 합성되고 골지체를 통해 분비되는 IL-7 단백질을 지칭할 수 있으며, 통상적으로 서열번호 80에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드에 의해 암호화된 아미노산을 함유한다. 일부 구현예에서, IL-7은 IL-7 단편, IL-7 변이체, IL-7 뮤테인 또는 IL-7 돌연변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-7 단편은 적어도 부분적으로 기능적일 수 있다, 즉 야생형 또는 완전길이 IL-7과 비교하여 유사하거나 더 낮은 수준에서 IL-7 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-7 단편은 완전히 기능적일 수 있다, 즉 야생형 또는 완전길이 IL-7과 비교하여 동일한 수준에서 IL-7 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-7 변이체, IL-7 뮤테인 또는 IL-7 돌연변이체는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-7 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-7 변이체, IL-7 뮤테인 또는 IL-7 돌연변이체는 적어도 부분적으로 기능적일 수 있다, 즉 야생형 IL-7과 비교하여 유사하거나 더 낮은 수준에서 IL-7 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-7 변이체, IL-7 뮤테인 또는 IL-7 돌연변이체는 완전히 기능적일 수 있다, 즉 야생형 IL-7과 비교하여 동일한 수준에서 IL-7 활성을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-7 변이체, IL-7 뮤테인 또는 IL-7 돌연변이체는 야생형 IL-7과 비교하여 더 높은 수준에서 IL-7 활성을 수행할 수 있다.
IL-7을 암호화하는 mRNA는 177개의 아미노산을 갖는 인간 IL-7의 프로펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 152개의 아미노산을 갖는 성숙한 인간 IL-7 을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 지칭할 수 있다. 인간 IL-7의 프로펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 성숙한 인간 IL-7을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 1개 사본의 IL-7 mRNA를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 재조합 RNA 작제물은 IL-7 mRNA의 2개 이상의 사본을 포함할 수 있다.
표적 모티프
본원은 표적 모티프를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 표적 모티프 또는 표적화 동기는 세포질 또는 시토솔(cytosol)을 제외한 세포막, 세포외 구획 또는 세포내 구획의 임의의 부분으로 향하는 새로 합성된 폴리펩티드 또는 단백질에 존재하는 임의의 짧은 펩티드를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드는 전형적으로 인접한 아미노산 잔기의 카복실기와 α-아미노 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 세포내 구획에는 핵, 핵소체, 엔도솜, 프로테아솜, 리보솜, 염색질, 핵 외막, 핵 기공, 엑소솜, 멜라노솜, 골지체, 페록시솜, 소포체(ER), 리소솜, 중심체, 미세소관, 미토콘드리아, 엽록체, 미세섬유, 중간 필라멘트 또는 원형질막과 같은 세포내 소기관이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 신호 서열, 표적화 신호, 국소화 신호, 국소화 서열, 전이 펩티드, 리더 서열 또는 리더 펩티드로서 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 모티프는 목적 유전자를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 핵산 서열 사이의 기능적 관계, 예를 들어 전사 조절 또는 신호 서열과 전사된 서열의 기능적 관계를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 표적 모티프 또는 표적화 동기를 암호화하는 핵산은 코딩(coding) 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드를 세포막, 세포내 또는 세포외 구획으로 표적화하는데 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 신호 펩티드 또는 신호 펩티드를 암호화하는 핵산은 코딩 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우 작동가능하게 연결된 것이다. 표적 모티프의 비제한적 예는 신호 펩티드, 핵 국소화 신호(NLS), 핵소체 국소화 신호(NoLS), 리소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 페록시솜 표적화 신호, 미세소관 팁 국소화 신호(MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지체 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테아솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막관통 표적화 신호, 중심체 국소화 신호(CLS), 또는 단백질을 세포막의 특정 부분, 세포외 구획 또는 세포내 구획으로 표적화하는 임의의 다른 신호를 포함한다.
신호 펩티드는 분비 경로로 향하는 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은 펩티드이다. 본 발명의 신호 펩티드는 10-40개의 아미노산 길이일 수 있다. 신호 펩티드는 관심 단백질의 N-말단 단부 또는 관심 단백질의 프로-단백질 형태의 N-말단 단부에 위치할 수 있다. 신호 펩티드는 진핵생물 기원일 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 포유동물 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 인간 단백질일 수 있다. 일부 경우에, 신호 펩티드는 동종 신호 펩티드(즉, 동일한 단백질로부터 유래) 또는 이종 신호 펩티드(즉, 상이한 단백질 또는 합성 신호 펩티드로부터 유래)일 수 있다. 일부 경우에, 신호 펩티드는 단백질의 자연 발생 신호 펩티드 또는 변형된 신호 펩티드일 수 있다.
본원은 표적 모티프를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 표적 모티프는 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택될 수 있다: (a) 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 이종인 표적 모티프; (b) 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 이종인 표적 모티프, 여기서 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 이종인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된다; (c) 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 표적 모티프; (d) 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 표적 모티프, 여기서 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된다; 및 (e) 자연에서 표적 모티프의 기능을 갖지 않는 자연 발생 아미노산 서열, 여기서 자연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 임의로 변형된다.
본원은 표적 모티프를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 표적 모티프는 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다: (a) 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종인 신호 펩티드; (b) 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 이종인 신호 펩티드, 여기서 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 이종인 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형되나, 단 상기 단백질은 산화환원효소가 아니다; (c) 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 신호 펩티드; (d) 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 신호 펩티드, 여기서 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된다; 및 (e) 자연에서 신호 펩티드의 기능을 갖지 않는 자연 발생 아미노산 서열, 여기서 자연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 임의로 변형된다. 일부 경우에, 신호 펩티드의 N-말단 단부의 아미노산 1-9는 2 이상의 평균 소수성 점수를 갖는다.
일부 예에서, 본원에 사용된 바와 같은 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 이종인 표적 모티프 또는 상기 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종인 신호 펩티드는 단백질의 자연적으로 발생하는 표적 모티프 또는 신호 펩티드와 상이한 자연적으로 발생하는 표적 모티프 또는 신호 펩티드를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 표적 모티프 또는 신호 펩티드는 목적 유전자로부터 유래되지 않는다. 대개 주어진 단백질에 이종인 표적 모티프 또는 신호 펩티드는 주어진 단백질과 관련이 없는 또 다른 단백질의 표적 모티프 또는 신호 펩티드이다. 예를 들어, 주어진 단백질에 이종인 표적 모티프 또는 신호 펩티드는 주어진 단백질의 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 아미노산 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 이종 서열이 동일한 유기체로부터 유래될 수 있지만, 이들은 자연적으로(자연에서), 동일한 mRNA에서와 같이 동일한 핵산 분자에서 발생하지 않는다. 단백질에 대해 이종인 표적 모티프 또는 신호 펩티드 및 상기 표적 모티프 또는 신호 펩티드가 이종인 단백질은 동일하거나 상이한 기원일 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 진핵생물 기원이다. 일부 구현예에서, 이들은 동일한 진핵생물 유기체의 것이다. 일부 구현예에서, 이들은 포유동물 기원이다. 일부 구현예에서, 이들은 동일한 포유동물 유기체의 것이다. 일부 구현예에서, 이들은 인간 기원이다. 예를 들어, RNA 작제물은 인간 IL-2 유전자를 암호화하는 핵산 서열 및 또 다른 인간 사이토카인의 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 작제물은 신호 펩티드와 단백질이 동일한 기원, 즉 인간 기원인 단백질에 대해 이종인 신호 펩티드를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 사용된 바와 같은 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 표적 모티프 또는 상기 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 신호 펩티드는 단백질의 자연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩티드를 지칭할 수 있다. 단백질에 상동성인 표적 모티프 또는 신호 펩티드는 자연에서 발생하는 단백질의 유전자에 의해 암호화된 표적 모티프 또는 신호 펩티드이다. 단백질에 상동성인 표적 모티프 또는 신호 펩티드는 일반적으로 진핵생물 기원이다. 일부 구현예에서, 단백질에 상동성인 표적 모티프 또는 신호 펩티드는 포유동물 기원이다. 일부 구현예에서, 단백질에 상동성인 표적 모티프 또는 신호 펩티드는 인간 기원이다.
경우에 따라, 자연에서 표적 모티프의 기능을 갖지 않는 자연 발생 아미노산 서열 또는 자연에서 신호 펩티드의 기능을 갖지 않는 자연 발생 아미노산 서열은, 자연에서 발생하고 자연에서 발생하는 임의의 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 아미노산 서열과 동일하지 않은 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 자연에서 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 기능을 갖지 않는 자연 발생 아미노산 서열은 10-50 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 자연에서 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 기능을 갖지 않는 자연 발생 아미노산 서열은 진핵생물 기원이고 진핵생물 기원의 임의의 표적 모티프 또는 신호 펩티드와 동일하지 않다. 일부 구현예에서, 자연에서 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 기능을 갖지 않는 자연 발생 아미노산 서열은 포유동물 기원이고 포유동물 기원의 임의의 표적 모티프 또는 신호 펩티드와 동일하지 않다. 일부 구현예에서, 자연에서 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 기능을 갖지 않는 자연 발생 아미노산 서열은 인간 기원이고 자연에서 발생하는 인간 기원의 임의의 표적 모티프 또는 신호 펩티드와 동일하지 않다. 자연에서 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 기능을 갖지 않는 자연 발생 아미노산 서열은 대개 단백질의 코딩 서열의 아미노산 서열이다. 본원에서 사용된 바와 같은 "자연 발생", "천연" 및 "자연에서"는 동등한 의미를 갖는다.
일부 예에서, 본원에 사용된 바와 같은 신호 펩티드의 N-말단 단부의 아미노산 1-9는 신호 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 단부의 처음 9개 아미노산을 지칭할 수 있다. 유사하게, 본원에서 사용된 바와 같은 신호 펩티드의 N-말단 단부의 아미노산 1-7은 신호 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 단부의 처음 7개 아미노산을 지칭할 수 있고, 신호 펩티드의 N-말단 단부의 아미노산 1-5는 신호 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 단부의 처음 5개 아미노산을 지칭할 수 있다.
일부 경우에, 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 아미노산 서열은 아미노산 서열 내에 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 이종인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형되거나, 또는 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 이종인 신호 펩티드는 본원에 사용된 바와 같은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된다는, 자연 발생 아미노산 서열 내 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 단백질에 이종인 자연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같은 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형되거나 또는 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질에 상동성인 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된다는, 자연 발생 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 단백질에 상동성인 자연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩티드를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 자연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있고, 자연 발생 아미노산 서열은 자연 발생 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 아미노산 치환 또는 치환은 아미노산 또는 폴리펩티드 서열의 특정 위치의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 치환 R34K는 34번 위치에서 아르기닌(Arg 또는 R)이 리신(Lys 또는 K)으로 대체된 폴리펩티드를 지칭한다. 앞의 예에서, 34K는 34번 위치의 아미노산이 리신(Lys 또는 K)으로 치환된 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 다중 치환은 전형적으로 슬래시로 구분된다. 예를 들어, R34K/L38V는 치환 R34K 및 L38V를 포함하는 변이체를 지칭한다. 아미노산 삽입 또는 삽입은 아미노산 또는 폴리펩티드 서열의 특정 위치에 아미노산을 첨가하는 것을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 삽입-34는 34번 위치에서의 삽입을 지정한다. 아미노산 결실 또는 결실은 아미노산 또는 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산의 제거를 지칭할 수 있다. 예를 들어, R34-는 34번 위치에서 아르기닌(Arg 또는 R)의 결실을 지정한다.
일부 경우에, 결실된 아미노산은 소수성 점수가 -0.8, -0.7, -0.6, -0.5, -0.4, -0.3, -0.2, -0.1, 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 미만 또는 1.9 미만인 아미노산이다. 일부 경우에, 교체 아미노산은 치환된 아미노산의 소수성 점수보다 더 높은 소수성 점수를 갖는 아미노산이다. 예를 들어, 교체 아미노산은 소수성 점수가 2.8 이상 또는 3.8 이상인 아미노산이다. 일부 경우에, 삽입된 아미노산은 소수성 점수가 2.8 이상 또는 3.8 이상인 아미노산이다.
일부 예에서, 본원에 기재된 아미노산 서열은 1 내지 15개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 아미노산 서열은 1 내지 7개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 아미노산 서열은 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함하지 않을 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 아미노산 서열은 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 단부의 아미노산 1-30 내에 1 내지 15개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 아미노산 서열은 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 단부의 아미노산 1-30 내에 1 내지 9개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 아미노산 서열은 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 단부의 아미노산 1-20 내에 1 내지 15개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 아미노산 서열은 표적 모티프 또는 신호 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 단부의 아미노산 1-20 내에 1 내지 9개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 아미노산 서열의 적어도 하나의 아미노산은 임의로 결실 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다.
일부 경우에, 변형된 신호 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 단부의 처음 9개 아미노산의 평균 소수성 점수는 변형되지 않은 신호 펩티드에 비해 1.0 단위 이상 증가된다. 일부 경우에, 소수성 점수 또는 소수성 점수는 본원에서 수치요법(hydropathy) 점수와 동의어로 사용될 수 있고 Kyte-Doolittle 스케일(Kyte J., Doolittle RF; J. Mol. Biol.157:105-132(1982))에 따라 계산된 바와 같은 아미노산의 소수성 정도를 지칭할 수 있다. Kyte-Doolittle 스케일에 따른 아미노산 소수성 점수는 하기와 같다:
[표 B]
아미노산 소수성 점수
일부 경우에, 아미노산 서열의 평균 소수성 점수는 아미노산 서열의 각 아미노산의 Kyte-Doolittle 스케일에 따른 소수성 점수를 더하고 아미노산의 수로 나눔으로써 계산될 수 있다. 예를 들어, 신호 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 단부의 아미노산 1-9의 평균 소수성 점수는 소수성 점수를 더하거나 9개 아미노산 각각을 9로 나눈 값으로 계산할 수 있다.
극성은 Zimmerman 극성 지수(Zimmerman JM, Eliezer N., Simha R.; J. Theor. Biol. 21:170-201(1968))에 따라 계산된다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열의 평균 극성은 아미노산 서열의 각 아미노산의 Zimmerman 극성 지수에 따라 계산된 극성 값을 더하고 아미노산의 수로 나눔으로써 계산될 수 있다. 예를 들어, 신호 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 단부의 아미노산 1-9의 평균 극성은 N-말단 단부의 아미노산 1-9의 9개 아미노산 각각의 평균 극성을 더하고 9로 나눔으로써 계산될 수 있다. Zimmerman 극성 지수에 따른 아미노산의 극성은 하기와 같다:
[표 C]
아미노산 극성
일부 예에서, 인터류킨 2(IL-2)의 자연 발생 신호 펩티드는 하나 이상의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 여기서 IL-2의 자연 발생 신호 펩티드는 Uniprot 데이터베이스에서 P60568 또는 Q0GK43으로서, 및 Genbank 데이터베이스에서 NM_000586.3으로서 IL-2 아미노산 서열의 아미노산 1-20을 지칭한다. 일부 경우에, IL-2 신호 펩티드의 아미노산 서열은 Y2L, R3K, R3-, M4L, Q5L, S8L, S8A, -13A, L14T, L16A, V17-, 및 V17A로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 변형될 수 있다. 일부 경우에, 야생형(WT) IL-2 신호 펩티드 아미노산 서열은 서열번호 26을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변형된 IL-2 신호 펩티드는 서열번호 27-29로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 경우에, 변형된 IL-2 신호 펩티드는 서열번호 31-33으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 DNA 서열에 의해 암호화된다.
발현 벡터(vector) 및 RNA 작제물의 생성
본원은 (i) 목적 유전자를 암호화하는 mRNA; 및 (ii) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 목적 유전자를 암호화하는 mRNA는 IL-2, IL-12, IL-15, IL-7, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 예를 들어, 표적 mRNA는 VEGF, VEGFA, VEGFA의 동형, PIGF, MICA, MICB, ERp5, ADAM, MMP, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1, 또는 c-Myc일 수 있다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM17이다. 추가로 본원은 본원에 기재된 RNA 작제물, 예를 들어 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 사이토카인을 암호화하는 제1 RNA를 포함하는 RNA 작제물을 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-7, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 예를 들어, 종양 증식 또는 혈관형성과 연관된 유전자는 VEGF, VEGFA, VEGFA의 동형, PIGF, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1, c-Myc, 이들의 단편, 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. VEGFA의 동형의 비제한적 예는 VEGF111, VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF165, VEGF165B, VEGF183, VEGF189, VEGF206, L-VEGF121, L-VEGF165, L-VEGF189, L-VEGF206, 동형 15, 동형 16, 동형 17, 및 동형 18을 포함한다. 예를 들어, 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자는 MICA, MICB, ERp5, ADAM, MMP, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM17이다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물을 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물은 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 암호화할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물을 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물은 표적 mRNA에 대한 1개의 siRNA 종을 암호화할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물을 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물은 각각 표적 mRNA에 대한 3개의 siRNA를 암호화할 수 있다. 관련 양태에서, 각각의 siRNA 종은 동일한 서열, 상이한 서열 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 RNA 작제물을 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물은 각각 표적 mRNA의 동일한 영역 또는 서열에 대한 3개의 siRNA를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 재조합 RNA 작제물을 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물은 각각 표적 mRNA의 상이한 영역 또는 서열에 대한 3개의 siRNA를 암호화할 수 있다. 일부 양태에서, 재조합 RNA 작제물을 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물은 3개의 siRNA 종을 암호화할 수 있으며, 여기서 3개의 siRNA 종 각각은 상이한 표적 mRNA에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 VEGF, VEGFA, VEGFA의 동형, PIGF, MICA, MICB, ERp5, ADAM17, MMP, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1, 또는 c-Myc의 mRNA일 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 작제물은 서열번호 82-98로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 다중핵산 작제물은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 DNA 쇄를 화학적으로 합성하는 방법, PCR 또는 Gibson Assembly 방법에 의해 수득될 수 있다. 화학적 합성 또는 PCR 방법 또는 Gibson Assembly 방법의 조합에 의해 다중핵산 작제물을 구성하는 이점은 코돈이 최적화되어 융합 단백질이 숙주 세포에서 높은 수준으로 발현되도록 보장할 수 있다는 것이다. 코돈 최적화는 고유 아미노산 서열을 유지하면서 상기 고유 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을 관심 숙주 세포의 유전자에 보다 빈번히 또는 가장 빈번히 사용되는 코돈으로 대체함으로써 해당 숙주 세포에서의 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 예를 들어, "코돈 용법 데이터베이스"에서 코돈 용법 표를 쉽게 사용할 수 있으며, 이들 표를 여러 가지 방법으로 맞출 수 있다. Gene Forge® (Aptagen, PA) 및 GeneOptimizer® (ThermoFischer, MA)와 같은, 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 최적화하는 코돈을 위한 컴퓨터 알고리즘을 또한 입수할 수 있다. 일단 수득된 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터에 통합시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 벡터는 생체내 또는 시험관내 핵산의 흡수, 증식, 발현 또는 전달을 위한 자연 발생 또는 합성적으로 생성된 작제물, 예를 들어 플라스미드, 미니서클, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체/미니염색체, 박테리오파지, 바이러스, 예를 들어 바큘로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 박테리오파지를 지칭할 수 있다. 벡터를 구성하는 데 사용되는 방법은 당업자에게 주지되어 있으며 다양한 간행물에 설명되어 있다. 특히 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 신호, 선택 마커, 복제 기원 및 스플라이싱 신호와 같은 기능 및 조절 성분의 설명을 포함하여, 적합한 벡터를 구성하기 위한 기법이 당업자에게 공지되어 있다. 다양한 벡터가 당업계에 주지되어 있으며 일부는 Agilent Technologies, Santa Clara, Calif.; Invitrogen, Carlsbad, Calif.; Promega, Madison, Wis.; Thermo Fisher Scientific; or Invivogen, San Diego, Calif와 같은 회사로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 시험관내 전사를 위한 벡터의 비제한적인 예는 pT7CFE1-CHis, pMX(예를 들어, pMA-T, pMA-RQ, pMC, pMK, pMS, pMZ), pEVL, pSP73, pSP72, pSP64, 및 pGEM(예를 들어, pGEM®-4Z, pGEM®-5Zf(+), pGEM®-11Zf(+), pGEM®-9Zf(-), pGEM®-3Zf(+/-), pGEM®-7Zf(+/-))를 포함한다. 일부 경우에, 재조합 다중핵산 작제물은 DNA일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 다중핵산 작제물은 원형 또는 선형일 수 있다. 예를 들어, 원형 다중핵산 작제물은 pMX, pMA-T, pMA-RQ 또는 pT7CFE1-CHis와 같은 벡터 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 선형 다중핵산 작제물은 pEVL 또는 선형화된 벡터와 같은 선형 벡터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 다중핵산 작제물은 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 프로모터는 제1 RNA를 암호화하는 서열 또는 제2 RNA를 암호화하는 서열의 상류에 존재할 수 있다. 프로모터의 비제한적 예는 T3, T7, SP6, P60, Syn5 및 KP34를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 제공된 재조합 다중핵산 작제물은 TAATACGACTCACTATA(서열번호 18)를 포함하는 서열을 포함하는 T7 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 다중핵산 작제물은 Kozak 서열을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. Kozak 서열은 단백질 번역 개시 부위로서 기능하는 핵산 서열 동기를 지칭할 수 있다. Kozak 서열은 예를 들어 문헌[Kozak, M., Gene 299(1-2):1-34](내용 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 상세히 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 재조합 다중핵산 작제물은 GCCACC(서열번호 19)를 포함하는 서열을 포함하는 Kozak 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 예에서, 본원에 기재된 재조합 다중핵산 작제물은 코돈-최적화될 수 있다.
본원은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열 및 목적 유전자를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 본원에 기재된 RNA 작제물을 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 목적 유전자에 의해 암호화된 인트론 서열의 일부가 아니다. 일부 경우에 목적 유전자는 RNA 스플라이싱 없이 발현된다. 일부 경우에, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 표적 mRNA의 엑손에 결합한다. 일부 경우에, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합한다. 일부 예에서, 재조합 다중핵산 작제물은 서열번호 82-98로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원은 본원에 기재된 RNA 작제물 조성물의 생성 방법을 제공한다. 예를 들어, 재조합 RNA 작제물을 RNA 폴리머라제용 프로모터, 목적 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 폴리(A) 테일을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 다중핵산 작제물로부터 시험관내 전사에 의해 생성시킬 수 있다. 시험관내 전사 반응은 RNA 폴리머라제, 뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP)의 혼합물 및/또는 캡핑 효소를 추가로 포함할 수 있다. 시험관내 전사를 사용하여 RNA를 생산하는 것 뿐만 아니라 전사된 RNA를 분리 및 정제하는 것에 대한 세부사항은 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들어 하기의 문헌에서 찾을 수 있다: Beckert & Masquida ((2011) Synthesis of RNA by In vitro Transcription. RNA. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 703. Humana Press). 시험관내 전사 키트의 비제한적 목록은 MEGAscript™ T3 전사 키트, MEGAscript T7 키트, MEGAscript™ SP6 전사 키트, MAXIscript™ T3 전사 키트, MAXIscript™ T7 전사 키트, MAXIscript™ SP6 전사 키트, MAXIscript™ T7/T3 전사 키트, MAXIscript™ SP6/T7 전사 키트, mMESSAGE mMACHINE™ T3 전사 키트, mMESSAGE mMACHINE™ T7 전사 키트, mMESSAGE mMACHINE™ SP6 전사 키트, MEGAshortscript™ T7 전사 키트, HiScribe™ T7 고수율 RNA 합성 키트, HiScribe™ T7 시험관내 전사 키트, AmpliScribe™ T7-Flash™ 전사 키트, AmpliScribe™ T7 고수율 전사 키트, AmpliScribe™ T7-Flash™ 비오틴-RNA 전사 키트, T7 전사 키트, HighYield T7 RNA 합성 키트, DuraScribe® T7 전사 키트 등을 포함한다.
시험관내 전사 반응은 전사 완충 시스템, 뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP) 및 RNase 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 완충 시스템은 디티오트레이톨(DTT) 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있다. NTP는 자연 발생 또는 비-자연 발생(변형된) NTP일 수 있다. 비-자연 발생(변형된) NTP의 비제한적 예는 N1-메틸슈도유리딘, 슈도유리딘, N1-에틸슈도유리딘, N1-메톡시메틸슈도유리딘, N1-프로필슈도유리딘, 2-티오유리딘, 4-티오유리딘, 5-메톡시유리딘, 5-메틸유르딘, 5-카복시메틸에스테르유리딘, 5-포르밀유리딘, 5-카복시유리딘, 5-하이드록시유리딘, 5-브로모유리딘, 5-요오도유리딘, 5,6-디하이드로유리딘, 6-아자유리딘, 티에노유리딘, 3-메틸유리딘, 1-카복시메틸-슈도유리딘, 4-티오-1-메틸-슈도유리딘, 2-티오-1-메틸-슈도유리딘, 디하이드로유리딘, 디하이드로슈도유리딘, 2-메톡시유리딘, 2-메톡시-4-티오-유리딘, 4-메톡시-슈도유리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도유리딘, 5-메틸시티딘, 5-메톡시시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 5-포르밀시티딘, 5-카복시시티딘, 5-하이드록시시티딘, 5-요오도시티딘, 5-브로모시티딘, 2-티오시티딘, 5-아자시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, N1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-메틸-2-아미노아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌 및 2-메톡시-아데닌을 포함할 수 있다. DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 비제한적 예는 T3, T7, SP6, P60, Syn5 및 KP34 RNA 폴리머라제를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, P60 RNA 폴리머라제, Syn5 RNA 폴리머라제 및 KP34 RNA 폴리머라제로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본원에 기재된 바와 같은, 전사된 RNA는 시험관내 전사 반응 혼합물로부터 단리 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 전사된 RNA는 컬럼 정제를 사용하여 분리되고 정제될 수 있다. 시험관내 전사 반응 혼합물로부터 전사된 RNA를 분리 및 정제하는 세부 사항은 당업계에 주지되어 있으며 임의의 상업적으로 입수가능한 키트가 사용될 수 있다. RNA 정제 키트의 비제한적 목록에는 MEGAclear 키트, Monarch® RNA Cleanup 키트, EasyPure® RNA 정제 키트, NucleoSpin® RNA Clean-up 등이 포함된다.
치료학적 적용
본원은 암 치료에 유용한 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 조성물은 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하기에 충분한 양으로 존재하거나 투여된다. 본원은 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 사이토카인을 암호화하는 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 증식 또는 혈관형성과 연관된 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전 요소는 VEGF, VEGFA, VEGFA의 동형, PIGF, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1, c-Myc, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 표적화하는 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전 요소는 MICA, MICB, ERp5, ADAM, MMP, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 표적화하는 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM17이다.
또한 본원은 본원에 기재된 임의의 RNA 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 활성 약학 성분을, 투여하고자 하는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 혼합물 또는 용액을 나타낼 수 있다. "약제학적으로 허용되는"이라는 용어는, 일반적으로 안전하고 비독성이며 생물학적으로나 달리 바람직하지 않지 않고 수의학 및 인간의 약제학적 용도에 허용되는 약제학적 조성물을 제조하는데 유용한 물질의 속성을 나타낸다. "약제학적으로 허용되는"이라는 용어는 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 저해하지 않고 상대적으로 독성이 없는 담체 또는 희석제와 같은 물질을 지칭할 수 있다, 즉 상기 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키거나 또는 상기가 함유된 조성물의 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 개인에게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 의약품 제형화에 사용되는 붕해제, 결합제, 충전제, 용매, 완충제, 등장화제, 안정제, 산화방지제, 계면활성제, 담체, 희석제, 부형제, 보존제 또는 윤활제와 같이, 치료 활성이 없고 투여되는 대상체에 비독성인 약제학적 조성물의 임의의 약제학적으로 허용되는 성분을 나타낼 수 있다. 약제학적 조성물은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 할 수 있고 활성 화합물을 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 불활성 성분을 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라지며 약제학적 조성물의 요약은 예를 들어 하기의 문헌에서 찾을 수 있다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)(본원에 참고로 포함된다). 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 활성 물질(예를 들어, 본원에 기재된 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물)을 병든 조직 또는 병든 세포에 주사하기 위한 수용액에 용해시켜 제형화할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 활성 물질(예를 들어, 본원에 기재된 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물)을 병든 조직 또는 병든 세포에 직접 주사하기 위한 수용액에 용해시켜 제형화할 수 있다. 일부 구현예에서, 병든 조직 또는 병든 세포는 종양 또는 종양 세포를 포함한다.
또한 본원은 암이 있는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "유효량" 또는 "치료 유효량"이란 용어는 치료되는 질병 또는 상태의 증상 증 하나 이상을 어느 정도 경감시키는; 예를 들어 하나 이상의 징후, 증상, 또는 질병의 원인의 감소 및/또는 완화, 또는 생물계의 임의의 다른 목적하는 변경에 충분한 투여되는 작용제 또는 화합물의 양을 지칭한다. 예를 들어, 치료학적 용도를 위한 "유효량"은 하나 이상의 질병 증상에서 임상적으로 상당한 감소를 제공하는 작용제의 양일 수 있다. 적절한 "유효"량은 개별 사례에서 용량 증량 연구와 같은 기법을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 질병 또는 상태의 적어도 하나의 증상을 완화, 경감 또는 개선시키는 것, 추가적인 증상을 예방하는 것, 질병 또는 상태를 억제하는 것, 예를 들어 질병 또는 상태의 발달의 정지, 질병 또는 상태의 완화, 질병 또는 상태의 퇴행 유발, 질병 또는 상태로 인한 상태의 완화, 또는 질병 또는 상태의 증상을 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 중지시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질병 또는 상태를 치료하는 것은 병에 걸린 조직 또는 병에 걸린 세포의 크기를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 질병 또는 상태를 치료하는 것은 대상체의 생존을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 질병 또는 상태의 치료는 질병의 중증도 감소 또는 개선, 질병의 개시 지연, 질병의 진행 억제, 대상체의 입원 또는 입원 기간 감소, 대상체의 삶의 질 개선, 질병 관련 증상의 수 감소, 질병 관련 증상의 중증도 감소 또는 개선, 질병 관련 증상의 기간 단축, 질병 관련 증상의 재발 방지, 질병 발병 또는 질병 증상의 개시 억제, 또는 질병 관련된 증상의 진행 억제를 포함한다. 일부 구현예에서, 암을 치료하는 것은 종양의 크기를 감소시키거나 암 환자의 생존율을 증가시키는 것을 포함한다.
일부 경우에, 대상체는 포유동물을 포함할 수 있다. 포유동물의 예는 인간, 침팬지와 같은 비인간 영장류 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 소, 말, 양, 염소, 돼지와 같은 농장 동물; 토끼, 개, 고양이 등의 가축; 래트(rat), 마우스 및 기니 피그 등과 같은 설치류를 포함하는 실험 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 포유동물은 인간이다. 경우에 따라, 피실험자는 동물일 수 있다. 경우에 따라, 동물은 인간 및 비-인간 동물을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 비-인간 동물은 포유동물, 예를 들어 래트 또는 마우스와 같은 설치류일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 비-인간 동물은 마우스일 수 있다. 일부 경우에 대상체는 포유동물이다. 일부 경우에 대상체는 인간이다. 경우에 따라 대상체는 성인, 아동 또는 유아이다. 경우에 따라 대상체는 반려동물이다. 일부 경우에 대상체는 고양이, 개 또는 설치류이다. 일부 경우에 대상체는 개 또는 고양이이다.
추가로 본원은 본원에 기재된 조성물 또는 약제학적 조성물을 암이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 일부 경우에 암은 고형 종양이다. 일부 예에서, 고형 종양은 유방암, 폐암, 간암, 교모세포종(glioblastoma), 흑색종(melanoma), 두경부 편평세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma), 신세포 암종(renal cell carcinoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 윌름 종양(Wilms tumor), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 골육종(osteosarcoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 방광암, 자궁경부암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 중피종(mesothelioma), 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 비흑색종 피부암(nonmelanoma skin cancer), 난소암, 췌장암, 전립선암, 소세포폐암, 결장직장암, 및 갑상선암을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 육종, 암종 또는 림프종을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다.
일부 경우에 암은 두경부암이다. 임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 두경부암은 전 세계적으로 6번째로 흔한 암이며 고형 종양의 6%를 차지한다. 매년 약 650,000명의 새로운 환자가 두경부암 진단을 받고 있으며, 진보된 치료 옵션이 있음에도 불구하고 매년 전 세계적으로 350,000명이 사망하고 미국에서 12,000명이 사망한다. 두경부암 발병 가능성을 높이는 위험 요인에는 담배 및/또는 알콜 사용, 장기간의 태양 노출(예를 들어, 입술 부위 또는 머리와 목의 피부), 인유두종바이러스(human papillomavirus; HPV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 성별(예를 들어, 남성 대 여성), 연령(예를 들어, 40세 이상의 사람이 위험이 더 높음), 불량한 구강 및 치아 위생, 환경 또는 직업적 흡입물(예를 들어, 석면, 나무 먼지, 페인트 연기, 및 기타 특정 화학 물질), 마리화나 사용, 영양 부족, 위식도 역류 질병(GERD) 및 후두인두 역류 질병(LPRD), 면역계 약화, 방사선 노출 또는 두경부암의 이전 병력을 포함한다. 담배 사용은 두경부암의 가장 큰 단일 위험 요소이며 담배, 시가 또는 파이프 흡연; 씹는 담배; 스너프 사용; 및 간접흡연을 포함한다. 두경부암의 약 85%는 흡연과 관련이 있으며 흡연량이 예후에 영향을 미칠 수 있다. 또한 두경부암의 약 25%가 HPV 양성이다.
두경부암은 부비동, 비강, 구강, 인두 및 후두를 포함하는 상부 호흡소화관(upper aerodigestice tract)의 상피 악성종양을 포함할 수 있다. 두경부암의 비제한적 예는 후두암(laryngeal cancer), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 편도선암(tonsil cancer), 비강암(nasal cavity cancer), 부비동암(paranasal sinus cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 잠복 원발 전이성 편평 목암(metastatic squamous neck cancer with occult primary), 입술암(lip cancer), 구강암(oral cancer), 구강인두암(oropharyngeal cancer), 침샘암(salivary gland cancer), 뇌종양(brain tumor), 식도암(esophageal cancer), 눈암(eye cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 두경부의 육종, 및 갑상선암을 포함한다. 본원에 기재된 두경부암은 상부 호흡소화관에 위치할 수 있다. 상부 호흡소화관의 비제한적 예는 부비동, 비강, 구강, 침샘, 혀, 비인두, 구인두, 하인두 및 후두를 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 두경부암, 흑색종 및 신세포 암종으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 두경부암이다. 일부 구현예에서, 두경부암은 두경부 편평 세포 암종이다. 일부 구현예에서, 두경부암은 후두암, 하인두암, 편도암, 비강암, 부비동암, 비인두암, 잠복 원발성 전이성 편평 목암, 입술암, 구강암, 구강인두암, 침샘암, 뇌종양, 식도암, 눈암, 부갑상선암, 두경부의 육종 또는 갑상선암이다. 일부 구현예에서, 암은 흑색종이다. 일부 구현예에서, 암은 신세포 암종이다.
본원에 기재된 암에 대한 조기 치료는 종양의 외과적 제거, 방사선 요법, 화학요법, 표적 요법, 면역요법 또는 이의 조합과 같은 약물을 사용한 요법을 포함할 수 있다. 표적 요법은 암의 성장과 생존에 기여할 수 있는 특정 유전자, 단백질 또는 조직 환경을 표적으로 삼는 치료법으로 건강한 세포의 손상을 제한하면서 암세포의 성장과 확산을 차단하도록 설계된 치료법이다. 두경부암의 경우, 세포 증식, 종양 증식 또는 성장을 억제하거나 종양 혈관형성을 억제하기 위해 항체를 사용하는 표적 요법이 사용될 수 있다. 면역 요법은 암과 싸우기 위해 면역계 기능을 개선, 표적 또는 복원할 수 있는 치료법이다. 항체의 비제한적 예는 항-표피 성장 인자 수용체(EGFR) 항체 및 항-혈관 내피 성장 인자(VEGF) 항체를 포함한다. 암 면역요법의 비제한적 예는 면역계 조절제, T-세포 전달 요법, 면역 관문 억제제 및 단클론 항체를 포함한다. 면역계 조절제는 암에 대한 면역 반응을 강화할 수 있으며 인터류킨 및 인터페론 알파(IFNα)와 같은 사이토카인을 포함한다. T-세포 전달 요법은 암 환자의 면역 세포를 생체외 조작을 위해 채취하여 동일한 환자에게 다시 주입하는 치료법을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 세포를 종양 인식 림프구의 특이적 확대(예를 들어, 종양 침윤 림프구 요법) 또는 종양 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체를 발현하기 위한 세포의 변형(예를 들어, CAR T-세포 요법)을 위해 암 환자로부터 채취한다. 면역 관문 억제제는 면역 관문을 차단하여 암세포에 대한 면역 반응을 복원하거나 허용할 수 있다. 면역 관문 억제제의 비제한적 예는 세포예정사 리간드 1(PD-L1) 억제제, 세포예정사 단백질 1(PD1) 억제제 및 세포독성 T-림프구 관련 단백질-4(CTLA-4) 억제제를 포함한다. 단클론 항체는 암 세포에서 표적 단백질의 활성을 차단하기 위해 특정 표적 단백질에 결합하도록 설계될 수 있다(예를 들어, 항-EGFR, 항-VEGF 등).
암에서, 면역 반응을 향상시키기 위해 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-7 등)의 발현을 증가시키면서 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식에 관여하는 유전자(예를 들어, VEGF, VEGFA, VEGFA의 동형, PIGF, MICA, MICB, ERp5, ADAM, MMP, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1 또는 c-Myc 등)의 발현을 감소시키는 것은 치료 효과를 가질 수 있다. 하나의 예에서, 두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 세포와 같은 암 세포의 증식률을 감소시킬 수 있는 IL-2의 발현을 증가시킬 수 있다. IL-2는 림프구 활성을 조절하는 사이토카인이며 강력한 T 세포 성장 인자이다. IL-2는 항원 자극된 CD4+ T 세포, 자연 살해 세포 또는 활성화된 수지상 세포에 의해 생성되며 CD4+ 조절 T 세포의 유지 및 분화에 중요하다. 임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 국소 IL-2 요법은 종양 내부 또는 근처의 혈류 및 림프 배액의 정체를 유발하여 종양 괴사 및 혈전증을 유발할 수 있다. 또 다른 예에서, 종양 주변의 혈관형성을 촉진할 수 있는 VEGF의 발현을 감소시켜 종양 성장에 필요한 혈액 공급을 차단할 수 있다. 본원에 기재된 VEGF는 VEGFA, VEGFA의 동형 또는 PIGF를 포함한, 임의의 VEGF 계열 구성원일 수 있다. VEGFA 동형의 비제한적 예는 VEGF111, VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF165, VEGF165B, VEGF183, VEGF189, VEGF206, L-VEGF121, L-VEGF165, L-VEGF189, L-VEGF206, 동형 15, 동형 16, 동형 17, 및 동형 18을 포함한다. 또 다른 예에서, 종양 세포에 의해 발현되는 세포 표면 당단백질인 MICA 및/또는 MICB(MICA/B)의 발현을 감소시켜 자연 살해(NK) 세포 및 T-세포의 면역 반응을 회복시켜 종양 퇴행을 향상시킬 수 있다. MICA/B는 NK 세포 및 림프구에서 발현된 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 수용체에 의해 인식되어 종양 세포의 인식 및 제거를 촉진한다. 암 세포는 세포 표면으로부터 MICA/B를 발산하여 NKG2D 인식을 손상시킴으로써 면역 감시를 회피할 수 있다. 암 세포는 또한 종양 성장 및 저산소증 동안 NKGD2 수용체에 결합할 수 있는 가용성 형태의 MICA/B를 방출할 수 있으며, 이는 NKG2D 내재화를 유도하여 면역 반응을 회피하고 NK 세포에 의한 면역 감시를 손상시킬 수 있다. 세포 표면으로부터 MICA/B의 발산 또는 방출은 막 단백질의 발산에 관여하는 단백질의 발현을 억제하거나 감소시킴으로써 차단될 수 있다. 발산에 관여하는 단백질의 예는 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 및 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAM)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. MMP의 비제한적 예는 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17 및 MMP19를 포함한다. 세포 표면으로부터 MICA/B의 발산 또는 방출은 또한 디설파이드 이소머라제 ERp5와 같은 발산에 관여하는 단백질을 조절하는 인자의 발현을 억제하거나 감소시킴으로써 차단될 수 있다.
일부 양태에서, 본원은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 목적 유전자를 암호화하는 mRNA 및 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는, 본원에 기재된 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본원은 암 치료 방법에 사용하기 위한 목적 유전자를 암호화하는 mRNA 및 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 암 치료용 약제(medicament)의 제조를 위한 목적 유전자를 암호화하는 mRNA 및 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 본원에 기재된 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 대상체에서 암을 치료하기 위한 목적 유전자를 암호화하는 mRNA 및 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는, 본원에 기재된 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, siRNA는 VEGF, VEGFA, VEGFA의 동형, PIGF, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1, c-Myc, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 MICA, MICB, MICA 및 MICB 모두(MICA/B), ERp5, ADAM, MMP, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM17이다. 일부 구현예에서, 목적 유전자를 암호화하는 mRNA는 사이토카인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-7, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체이다.
일부 양태에서, 본원은 VEGFA, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1 또는 c-Myc에 결합할 수 있는 siRNA 및 IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-7을 암호화하는 mRNA를 포함하는 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 암 치료 방법에 사용하기 위한 VEGFA, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1 또는 c-Myc에 결합할 수 있는 siRNA 및 IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-7을 암호화하는 mRNA를 포함하는, 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 암 치료용 약제의 제조를 위한 VEGFA, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1, 또는 c-Myc에 결합할 수 있는 siRNA 및 IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-7을 암호화하는 mRNA siRNA를 포함하는, 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 대상체에서 암을 치료하기 위한 VEGFA, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1, 또는 c-Myc에 결합할 수 있는 siRNA 및 IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-7을 암호화하는 mRNA를 포함하는, 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 VEGFA 동형의 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA 및 IL-2를 암호화하는 mRNA를 포함하는, 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본원은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 PIGF mRNA에 결합할 수 있는 siRNA 및 IL-2를 암호화하는 mRNA를 포함하는, 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본원은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 MICA 또는 MICB의 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA 및 IL-2를 암호화하는 mRNA를 포함하는, 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본원은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 ERp5, ADAM17, 또는 MMP의 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA 및 IL-2를 암호화하는 mRNA를 포함하는, 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본원은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 VEGFA, MICA, MICB, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1 또는 c-Myc의 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA 및 IL-2, IL-7, IL-12 또는 IL-15를 암호화하는 mRNA를 포함하는, 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물 또는 약제학적 조성물은 (i) IL-2 mRNA; 및 (ii) VEGFA mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함한다. 관련 양태에서, 다중핵산 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 VEGFA mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 VEGFA mRNA에 대한 적어도 3개 또는 적어도 5개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 각각의 상기 적어도 3개 또는 적어도 5개의 siRNA는 동일하거나 상이하거나 이들의 조합이다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 1-4 또는 125-128(Cpd.1-Cpd.4)에 제시된 서열을 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 5(Cpd.5), 서열번호 7(Cpd.7), 서열번호 8(Cpd.8), 서열번호 9(Cpd.9), 서열번호 10(Cpd.10), 서열번호 129(Cpd.5), 서열번호 131(Cpd.7), 서열번호 132(Cpd.8), 서열번호 133(Cpd.9), 또는 서열번호 134(Cpd.10)에 제시된 바와 같은 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물 또는 약제학적 조성물은 (i) IL-2 mRNA; 및 (ii) PIGF mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함한다. 관련 양태에서, 다중핵산 작제물은 적어도 1, 2 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 PIGF mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 PIGF mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합이다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물 또는 약제학적 조성물은 (i) IL-2 mRNA; 및 (ii) VEGFA 동형의 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함한다. 관련 양태에서, 다중핵산 작제물은 적어도 1, 2 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 VEGFA 동형의 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 VEGFA 동형의 mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합이다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물 또는 약제학적 조성물은 (i) IL-2 mRNA; 및 (ii) MICA 또는 MICB mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함한다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2 또는 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서 재조합 RNA 작제물은 MICA 또는 MICB mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 MICA 또는 MICB mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합이다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 1-4 또는 125-128(Cpd.1-Cpd.4)에 제시된 서열을 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 6 또는 서열번호 130(Cpd.6)에 제시된 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물 또는 약제학적 조성물은 (i) IL-2 mRNA; 및 (ii) ERp5, ADAM17 또는 MMP의 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함한다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2 또는 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서 재조합 RNA 작제물은 ERp5, ADAM17 또는 MMP의 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 ERp5, ADAM17 또는 MMP의 mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합이다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물 또는 약제학적 조성물은 (i) IL-12 mRNA; 및 (ii) IDH1, CDK4 및/또는 CDK6의 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함한다. 관련 양태에서, 다중핵산 작제물은 적어도 1, 2 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 IDH1 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 CDK4 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 CDK6 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 IDH1 mRNA에 대한 1개의 siRNA, CDK4 mRNA에 대한 1개의 siRNA 및 CDK6 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 IDH1 mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 CDK4 mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 CDK6 mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합이다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 11 또는 서열번호 135(Cpd.11)에 제시된 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물 또는 약제학적 조성물은 (i) IL-12 mRNA; 및 (ii) EGFR, mTOR 및/또는 KRAS의 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함한다. 관련 양태에서, 다중핵산 작제물은 적어도 1, 2 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 EGFR mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 mTOR mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 KRAS mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 EGFR mRNA에 대한 1개의 siRNA, mTOR mRNA에 대한 1개의 siRNA 및 KRAS mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 EGFR mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 mTOR mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 KRAS mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합이다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 12(Cpd.12), 서열번호 13(Cpd.13), 서열번호 14(Cpd.14), 서열번호 136(Cpd.12), 서열번호 137(Cpd.13), 또는 서열번호 138(Cpd.14)에 제시된 바와 같은 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물 또는 약제학적 조성물은 (i) IL-15 mRNA; 및 (ii) VEGFA 및/또는 CD155의 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함한다. 관련 양태에서, 다중핵산 작제물은 적어도 1, 2 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 VEGFA mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 CD155 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 VEGFA mRNA에 대한 1개의 siRNA 및 CD155 mRNA에 대한 2개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 VEGFA mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 CD155 mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합이다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 15 또는 139(Cpd.15)에 제시된 바와 같은 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물 또는 약제학적 조성물은 (i) IL-15 mRNA; 및 (ii) VEGFA, PD-L1 및/또는 c-Myc의 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함한다. 관련 양태에서, 다중핵산 작제물은 적어도 1, 2 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 VEGFA mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 PD-L1 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 c-Myc mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 VEGFA mRNA에 대한 1개의 siRNA, PD-L1 mRNA에 대한 1개의 siRNA 및 c-Myc mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 VEGFA mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 PD-L1 mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 c-Myc mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합이다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 16 또는 140(Cpd.16)에 제시된 바와 같은 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 필요로 하는 대상체에게 투여되는 조성물 또는 약제학적 조성물은 (i) IL-7 mRNA; 및 (ii) PD-L1의 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함한다. 관련 양태에서, 다중핵산 작제물은 적어도 1, 2 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 PD-L1 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 각각 PD-L1 mRNA에 대한 적어도 3개의 siRNA를 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합이다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 17 또는 141(Cpd.17)에 제시된 바와 같은 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 재조합 RNA 작제물 조성물은 병용 요법으로서 투여될 수 있다. 2개 이상의 치료제 또는 요법을 사용하는 병용 요법은 상이한 작용 기전으로 작동하는 제제(agent) 및 요법을 사용할 수 있다. 상이한 작용 기전을 갖는 제제 또는 요법을 사용하는 병용 요법은 추가적 또는 상승적 효과를 초래할 수 있다. 병용 요법은 단일 요법에서 사용되는 것보다 더 낮은 각 작용제의 용량을 가능하게 하여 독성 부작용을 감소시키고/시키거나 제제(들)의 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 병용 요법은 내성 암세포가 발생할 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 병용 요법은 면역 반응에 영향을 미치는(예를 들어, 반응을 향상시키거나 활성화시키는) 치료제 또는 요법 및 종양/암 세포에 영향을 미치는(예를 들어, 억제하거나 사멸시키는) 치료제를 포함한다. 일부 예에서, 병용 요법은 (i) 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물; 및 (ii) 종양의 외과적 제거, 방사선 요법, 화학 요법, 표적 요법 및 면역 요법 중에서 선택된 하나 이상의 추가 요법을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 RNA 조성물 또는 약제학적 조성물은 병용 요법을 위한 하나 이상의 추가 요법의 투여 전에, 상기 투여와 동시에 및/또는 상기 투여 후에 암이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 요법은 1, 2, 3개 이상의 추가 치료제 또는 요법을 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 제형 및 전달 방법은 일반적으로 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물은 비경구, 정맥내, 피내, 근육내, 결장, 직장 또는 복강내를 포함한 다양한 방식으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 대상체에게 주사에 의해 투여된다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물은 대상체의 복강내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 종양내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 대상체의 병든 기관 또는 병든 조직에 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 대상체의 종양 또는 암 세포에 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 비경구적으로, 정맥내로, 근육내로 또는 경구로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 약제학적 조성물 중 어느 하나를 사용 설명서와 함께 제공할 수 있다. 사용 설명서는 본 발명에 따라 본원에 기재된 바와 같은 질병 또는 장애(예를 들어, 두경부암과 같은 암)를 치료(또는 예방)하는 방법에 대한 숙련가 또는 주치의를 위한 지침을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 사용 설명서는 각각 본원에 기재된 전달/투여 방식 및 전달/투여 섭생에 관한 지침(예를 들어, 전달/투여 경로, 투여량 섭생, 전달/투여 시간, 전달/투여 빈도 등)에 대한 지침을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 사용 설명서는 본 발명의 조성물이 투여 또는 주사되는 방법 및/또는 투여 또는 주사를 위해 제조되는 방법에 대한 지침을 포함할 수 있다. 원칙적으로, 각각 전달/투여 방식 및 전달/투여 섭생에 관하여 본원의 다른 곳에 기재된 것을 사용 설명서에 각각의 지침으로 포함시킬 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 약제학적 조성물은 유전자 요법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 유전자 치료 벡터에서 세포로 전달될 수 있다. 유전자 요법 벡터 및 유전자 전달 방법은 당업계에 주지되어 있다. 이들 방법의 비제한적 예는 세포로 전달된 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하는 바이러스 벡터 전달 시스템, DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 전달 비히클(vehicle)과 복합체화된 핵산을 포함하는 비-바이러스 벡터 전달 시스템, 트랜스포손 시스템(숙주 게놈으로의 전달 및 통합용; Moriarity, et al. (2013) Nucleic Acids Res 41(8), e92, Aronovich, et al., (2011) Hum. Mol. Genet. 20(R1), R14-R20), 레트로바이러스-매개된 DNA 전달(예를 들어, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예를 들어 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스; 예를 들어, 문헌[Kay et al. (1993) Science 262, 117-119], [Anderson (1992) Science 256, 808-813]을 참조하시오), 및 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 파보 바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함한 DNA 바이러스-매개된 DNA 전달(예를 들어, Ali et al. (1994) Gene Therapy 1, 367-384)을 포함한다. 바이러스 벡터는 또한 아데노-관련 바이러스, 아데노바이러스 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 숙주 게놈에 통합될 수 있는 벡터에는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 직접적인 DNA 전달을 통해 세포로 전달될 수 있다(Wolff et al. (1990) Science 247, 1465-1468). 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 세포막의 약한 기계적 파괴 후 세포에 전달되어 일시적으로 세포를 투과할 수 있다. 상기 막의 이러한 약한 기계적 파괴는 작은 구멍을 통해 세포를 부드럽게 강제함으로써 달성될 수 있다(Sharei et al. PLOS ONE (2015) 10(4), e0118803). 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 리포솜- 매개된 DNA 전달을 통해 세포로 전달될 수 있다(예를 들어, Gao & Huang (1991) Biochem. Ciophys. Res. Comm. 179, 280-285, Crystal (1995) Nature Med. 1, 15-17, Caplen et al. (1995) Nature Med. 3, 39-46). 리포솜은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중 라멜라 지질 비히클을 포함할 수 있다. 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화될 수 있고, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되어 있으며, 리포솜 및 리포솜에 포획된 올리고뉴클레오티드 모두와 회합되는 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 또는 리포솜과 복합체를 형성한다.
유전자 발현의 조절
본원은 본원에 기재된 임의의 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포 내 단일 RNA 전사물로부터 siRNA 및 mRNA를 동시에 발현시키는 방법을 제공한다. 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 암호화하거나 포함하는 RNA 작제물 또는 재조합 다중핵산을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 목적 유전자를 암호화하고, 제2 RNA는 표적 메신저 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며, 표적 mRNA는 목적 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하고, 표적 mRNA 및 목적 유전자의 발현은 동시에 조절된다. 일부 예에서, 본원에서 사용되는 다중핵산, 유전자, DNA 또는 RNA의 발현은 다중핵산, 유전자, DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 다중핵산, 유전자, 예를 들어 목적 유전자, DNA 또는 RNA, 예를 들어 표적 mRNA의 발현을 조절, 증가, 상향 조절, 감소 또는 하향 조절하는 것은 다중핵산, 유전자, 예를 들어 목적 유전자, DNA 또는 RNA, 예를 들어 표적 mRNA의 전사 및/또는 번역에 영향을 미침으로써 상기 다중핵산, 유전자, 예를 들어 목적 유전자, DNA 또는 RNA, 예를 들어 표적 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 수준을 조절, 증가, 상향 조절, 감소, 하향조절하는 것을 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 다중핵산, 유전자, 예를 들어 목적 유전자, DNA 또는 RNA, 예를 들어 표적 mRNA의 발현을 억제하는 것은 상기 다중핵산, 유전자, 예를 들어 목적 유전자, DNA 또는 RNA, 예를 들어 표적 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 수준이 감소되거나 제거되도록 상기 다중핵산, 유전자, 예를 들어 목적 유전자, DNA 또는 RNA, 예를 들어 표적 mRNA의 전사 및/또는 번역에 영향을 미치는 것을 지칭할 수 있다.
예를 들어, 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 암호화하거나 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 사이토카인을 암호화하고, 제2 RNA는 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 단백질 산물이 종양 증식, 혈관형성, 또는 면역계에 의한 인식과 연관된 mRNA 및 사이토카인의 발현이 동시에 조절된다.
본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 IL-2를 암호화하고, 제2 RNA는 VEGFA mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 IL-2 및 VEGFA의 발현이 동시에 조절된다, 즉 IL-2의 발현은 상향조절되고 VEGFA의 발현은 동시에 하향조절된다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 VEGFA mRNA의 동일한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 VEGFA mRNA의 상이한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합에 대한 것이다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 작제물은 서열번호 86(Cpd.5), 서열번호 88(Cpd.7), 서열번호 89(Cpd.8), 서열번호 90(Cpd.7), 또는 서열번호 91(Cpd.10)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 5(Cpd.5), 서열번호 7(Cpd.7), 서열번호 8(Cpd.8), 서열번호 9(Cpd.9), 서열번호 10(Cpd.10), 서열번호 129(Cpd.5), 서열번호 131(Cpd.7), 서열번호 132(Cpd.8), 서열번호 133(Cpd.9), 또는 서열번호 134(Cpd.10)를 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
또한 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 암호화하거나 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 IL-2를 암호화하고, 제2 RNA는 VEGFA 동형의 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 IL-2 및 VEGFA의 동형의 발현이 동시에 조절된다, 즉 IL-2의 발현은 상향조절되고 VEGFA의 동형의 발현은 동시에 하향조절된다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 VEGFA 동형의 mRNA의 동일한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 VEGFA 동형의 mRNA의 상이한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합에 대한 것이다.
또한 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 암호화하거나 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 IL-2를 암호화하고, 제2 RNA는 PIGF mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 IL-2 및 PIGF의 발현이 동시에 조절된다, 즉 IL-2의 발현은 상향조절되고 PIGF의 발현은 동시에 하향조절된다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 PIGF mRNA의 동일한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 PIGF mRNA의 상이한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합에 대한 것이다.
본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 암호화하거나 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 IL-2를 암호화하고, 제2 RNA는 MICA 및/또는 MICB(MICA/B) mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 IL-2 및 MICA/B의 발현이 동시에 조절된다, 즉 IL-2의 발현은 상향조절되고 MICA/B의 발현은 동시에 하향조절된다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 MICA/B mRNA의 동일한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 MICA/B mRNA의 상이한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합에 대한 것이다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 작제물은 서열번호 87(Cpd.6)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 6 또는 130(Cpd.6)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
또한 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 암호화하거나 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 IL-2를 암호화하고, 제2 RNA는 ERp5, ADAM 또는 MMP의 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 IL-2 및 ERp5, ADAM 또는 MMP의 발현이 동시에 조절된다, 즉 IL-2의 발현은 상향조절되고 ERp5, ADAM 또는 MMP의 발현은 동시에 하향조절된다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM17이다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 ERp5, ADAM17 또는 MMP의 mRNA의 동일한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 ERp5, ADAM17 또는 MMP의 mRNA의 상이한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합에 대한 것이다.
본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 IL-12를 암호화하고, 제2 RNA는 IDH1, CDK4 및/또는 CDK6의 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 IL-12, IDH1, CDK4 및/또는 CDK6의 발현이 동시에 조절된다, 즉 IL-12의 발현은 상향조절되고 IDH1, CDK4 및/또는 CDK6의 발현은 동시에 하향조절된다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 IDH1, CDK4 및/또는 CDK6의 mRNA의 동일한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 IDH1, CDK4 및/또는 CDK6의 mRNA의 상이한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합에 대한 것이다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 IDH1의 mRNA에 대한 1개의 siRNA, CDK4의 mRNA에 대한 1개의 siRNA 및 CDK6의 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 작제물은 서열번호 92(Cpd.11)를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 11 또는 135(Cpd.11)를 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 IL-12를 암호화하고, 제2 RNA는 EGFR, mTOR 및/또는 KRAS의 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 IL-12, EGFR, mTOR 및/또는 KRAS의 발현이 동시에 조절된다, 즉 IL-12의 발현은 상향조절되고 EGFR, mTOR 및/또는 KRAS의 발현은 동시에 하향조절된다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 EGFR, mTOR, 및/또는 KRAS의 mRNA의 동일한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 EGFR, mTOR 및/또는 KRAS의 mRNA의 상이한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합에 대한 것이다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 EGFR의 mRNA에 대한 1개의 siRNA, mTOR의 mRNA에 대한 1개의 siRNA 및 KRAS의 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 작제물은 서열번호 93(Cpd.12), 서열번호 94(Cpd.13) 또는 서열번호 95(Cpd.14)를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 12(Cpd.12), 서열번호 13(Cpd.13), 서열번호 14(Cpd.14), 서열번호 136(Cpd.12), 서열번호 137(Cpd.13), 또는 서열번호 138(Cpd.14)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 IL-15를 암호화하고, 제2 RNA는 VEGFA 및/또는 CD155의 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 IL-15, VEGFA 및/또는 CD155의 발현이 동시에 조절된다, 즉 IL-15의 발현은 상향조절되고 VEGFA 및/또는 CD155의 발현은 동시에 하향조절된다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 VEGFA 및/또는 CD155의 mRNA의 동일한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 VEGFA 및/또는 CD155의 mRNA의 상이한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합에 대한 것이다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 VEGFA의 mRNA에 대한 1개의 siRNA 및 CD155의 mRNA에 대한 2개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 작제물은 서열번호 96(Cpd.15)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 15 또는 139(Cpd.15)를 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
또한 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 IL-15를 암호화하고, 제2 RNA는 VEGFA, PD-L1 및/또는 c-Myc의 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 IL-15, VEGFA, PD-L1 및/또는 c-Myc의 발현이 동시에 조절된다, 즉 IL-15의 발현은 상향조절되고 VEGFA, PD-L1 및/또는 c-Myc의 발현은 동시에 하향조절된다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 VEGFA, PD-L1 및/또는 c-Myc의 mRNA의 동일한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 VEGFA, PD-L1 및/또는 c-Myc의 mRNA의 상이한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합에 대한 것이다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 VEGFA의 mRNA에 대한 1개의 siRNA, PD-L1의 mRNA에 대한 1개의 siRNA, 및 c-Myc의 mRNA에 대한 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 작제물은 서열번호 97(Cpd.16)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 16 또는 140(Cpd.16)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 IL-7을 암호화하고, 제2 RNA는 PD-L1 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 IL-7 및 PD-L1의 발현이 동시에 조절된다, 즉 IL-7의 발현은 상향조절되고 PD-L1의 발현은 동시에 하향조절된다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 PD-L1 mRNA의 동일한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물은 각각 PD-L1 mRNA의 상이한 영역에 대한 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 이들의 조합에 대한 것이다. 관련 양태에서, 재조합 다중핵산 작제물은 서열번호 98(Cpd.17)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 관련 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열번호 17 또는 141(Cpd.17)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 암호화하거나 포함하는 재조합 다중핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 목적 유전자(예를 들어, IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-7)를 암호화하고, 제2 RNA는 표적 mRNA(예를 들어, VEGFA, VEGFA 동형, PIGF, MICA, MICB, ERp5, ADAM, MMP, IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS, CD155, PD-L1, 또는 c-Myc)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하며; 여기서 표적 mRNA는 목적 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하고, 표적 mRNA의 발현은 하향조절되며, 목적 유전자의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM17이다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, 목적 유전자의 발현은 mRNA 또는 목적 유전자에 의해 암호화된 단백질을 발현함으로써 상향조절된다.
예시적인 구현예
일부 양태에서, 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 사이토카인을 암호화하고, 제2 RNA는 종양 증식과 연관된 유전자의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 인터류킨-2(IL-2), IL-12, IL-15, IL-7, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 서열번호 24, 44, 47, 68 및 80으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 신호 펩티드 서열 또는 변형된 신호 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형되지 않은 신호 펩티드 서열은 서열번호 26 및 125-128로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2는 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열은 서열번호 26에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열은 서열번호 27-29로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 RNA는 메신저 RNA(mRNA)이다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 작은 간섭 RNA(siRNA)이다. 일부 구현예에서, siRNA는 종양 증식과 연관된 유전자의 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함하고, 여기서 siRNA의 각각의 종은 동일한 mRNA의 상이한 영역을 표적화하는 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 반복된 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종의 각 종은 서열번호 22에 나열된 서열을 포함하는 링커에 의해 연결된다.
일부 구현예에서, 종양 증식과 연관된 유전자는 혈관형성과 연관된 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 혈관형성과 연관된 유전자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화한다. 일부 구현예에서, VEGF는 VEGFA, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, VEGFA는 서열번호 35에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VEGF는 VEGFA의 동형, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, VEGF는 태반 성장 인자(PIGF), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 종양 증식과 연관된 유전자는 이소시트레이트 데하이드로게나제(IDH1), 사이클린-의존성 키나제 4(CDK4), CDK6, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 라파마이신의 기계론적 표적(mTOR), Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자(KRAS), 분화 클러스터(CD155), 세포예정사-리간드 1(PD-L1) 또는 myc 원-종양유전자(c-Myc)를 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 증식과 연관된 유전자는 서열번호 50, 53, 56, 59, 62, 65, 71, 74 및 77로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 RNA는 링커에 의해 제2 RNA에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커 또는 서열번호 21에 나열된 서열을 포함하는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 폴리(A) 테일, 5' 캡 또는 Kozak 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 모두 재조합체이다.
일부 양태에서, 본원은 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 제1 RNA는 사이토카인을 암호화하고, 제2 RNA는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 인터류킨-2(IL-2), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, IL-2는 서열번호 24에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2는 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열은 서열번호 26에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열은 서열번호 27-29로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 RNA는 메신저 RNA(mRNA)이다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 작은 간섭 RNA(siRNA)이다. 일부 구현예에서, siRNA는 세포 표면 국소화 단백질을 암호화하는 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자는 MHC 부류 I 쇄-관련 서열 A(MICA), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화한다. 일부 구현예에서, MICA는 서열번호 38에 나열된 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역계 감시와 연관된 유전자는 MHC 부류 I 쇄-관련 서열 B(MICB), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화한다. 일부 구현예에서, MICB는 서열번호 41에 나열된 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자는 소포체 단백질(ERp5), 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAM), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 이의 단편, 또는 이의 기능적 변이체를 암호화한다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM17이다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함하고, 여기서 siRNA의 각각의 종은 동일한 mRNA의 상이한 영역을 표적화하는 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 또는 이상의 반복된 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종의 각 종은 서열번호 22에 나열된 서열을 포함하는 링커에 의해 연결된다.
일부 구현예에서, 제1 RNA는 링커에 의해 제2 RNA에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커 또는 서열번호 21에 나열된 서열을 포함하는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 폴리(A) 테일, 5' 캡 또는 Kozak 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 모두 재조합체이다.
일부 양태에서, 본원은 혈관 내피 성장 인자 A(VEGFA), VEGFA의 동형, 태반 성장 인자(PIGF), 분화 클러스터 155(CD155), 세포예정사-리간드 1(PD-L1), myc 원-종양유전자(c-Myc), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 인터류킨-2(IL-2), IL-15, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 제1 RNA는 메신저 RNA(mRNA)이다. 일부 구현예에서, IL-2는 서열번호 24에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열은 서열번호 26에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열은 서열번호 27-29로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15는 서열번호 68을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15는 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-15 신호 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형되지 않은 IL-15 신호 펩티드 서열은 서열번호 144에 나열된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 RNA는 작은 간섭 RNA(siRNA)이다. 일부 구현예에서, siRNA는 VEGFA의 mRNA, VEGFA의 동형, PIGF, CD155, PD-L1 또는 c-Myc에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, VEGFA는 서열번호 35에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD155는 서열번호 71을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-L1은 서열번호 74를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, c-Myc는 서열번호 77을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함하며, 여기서 siRNA의 각 종은 동일한 mRNA의 상이한 영역을 표적화하는 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 반복된 종을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종의 각 종은 서열번호 22에 나열된 서열을 포함하는 링커에 의해 연결된다.
일부 구현예에서, 제1 RNA는 링커에 의해 제2 RNA에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커 또는 서열번호 21에 나열된 서열을 포함하는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 폴리(A) 테일, 5' 캡 또는 Kozak 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 모두 재조합체이다.
일부 양태에서, 본원은 MHC 부류 I 쇄-관련 서열 A(MICA), MHC 부류 I 쇄-관련 서열 B(MICB), 소포체 단백질(ERp5), 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAM), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 이의 단편 또는 이의 기능성 변이체의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 인터류킨-2(IL-2), 이의 단편, 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM17이다. 일부 구현예에서, 제1 RNA는 메신저 RNA(mRNA)이다. 일부 구현예에서, IL-2는 서열번호 24에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열은 서열번호 26에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열은 서열번호 27-29로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 작은 간섭 RNA(siRNA)이다. 일부 구현예에서, siRNA는 MICA, MICB, ERp5, ADAM 또는 MMP의 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, MICA는 서열번호 38에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, MICB는 서열번호 41에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ADAM은 ADAM17이다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함하고, 여기서 siRNA의 각각의 종은 동일한 mRNA의 상이한 영역을 표적화하는 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 반복된 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 siRNA의 각 종은 서열번호 22에 나열된 서열을 포함하는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 RNA는 링커에 의해 제2 RNA에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커 또는 서열번호 21에 나열된 서열을 포함하는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 폴리(A) 테일, 5' 캡 또는 Kozak 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 모두 재조합체이다.
일부 양태에서, 본원은 이소시트레이트 데하이드로게나제(IDH1), 사이클린 의존성 키나제 4(CDK4), CDK6, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 라파마이신의 기계론적 표적(mTOR), Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자(KRAS), 세포예정사-리간드 1(PD-L1), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 인터류킨-12(IL-12), IL-7, 이의 단편, 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 제1 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 제1 RNA는 메신저 RNA(mRNA)이다. 일부 구현예에서, IL-12는 서열번호 44 또는 서열번호 47을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12는 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-12 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형되지 않은 IL-12 신호 펩티드는 서열번호 142 또는 서열번호 143에 나열된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-7은 서열번호 80을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-7은 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 변형되지 않은 IL-7 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형되지 않은 IL-7 신호 펩티드는 서열번호 128에 나열된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 RNA는 작은 간섭 RNA(siRNA)이다. 일부 구현예에서, siRNA는 IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS 또는 PD-L1의 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, IDH1은 서열번호 50을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CDK4는 서열번호 53을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CDK6은 서열번호 56을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR은 서열번호 62를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, EGFR은 서열번호 59를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, KRAS는 서열번호 65를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PD-L1은 서열번호 74를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 RNA는 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함하고, 여기서 siRNA의 각각의 종은 동일한 mRNA의 상이한 영역을 표적화하는 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 RNA는 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 반복된 종을 포함한다. 제119항 또는 제120항의 조성물에서, siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종의 각 종은 서열번호 22에 나열된 서열을 포함하는 링커에 의해 연결된다.
일부 구현예에서, 제1 RNA는 링커에 의해 제2 RNA에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커 또는 서열번호 21을 포함하는 서열을 포함하는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 폴리(A) 테일, 5' 캡 또는 Kozak 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 RNA 및 제2 RNA는 모두 재조합체이다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 임의의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 암이 있는 대상체에게 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 암 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 암 치료용 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 대상체에서 암을 치료하기 위한 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 암은 흑색종이다. 일부 구현예에서, 암은 신세포 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 두경부암이다. 일부 구현예에서, 두경부암은 두경부 편평 세포 암종이다. 일부 구현예에서, 두경부암은 후두암, 하인두암, 편도선암, 비강암, 부비동암, 비인두암, 잠복 원발 전이성 편평 목암, 입술암, 구강암, 구강암, 구강인두암, 침샘암, 뇌종양, 식도암, 눈암, 부갑상선암, 두경부의 육종 또는 갑상선암이다. 일부 구현예에서, 암은 상부 호흡소화관에 위치한다. 일부 구현예에서, 상부 호흡소화관은 부비동, 비강, 구강, 침샘, 혀, 비인두, 구인두, 하인두 또는 후두를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 두경부암이 있다. 일부 구현예에서, 두경부암이 있는 대상체는 담배 사용 이력을 갖는다. 일부 구현예에서, 두경부암이 있는 대상체는 인유두종바이러스(HPV) DNA를 갖는다. 일부 실시예에서, 대상체는 인간이다.
일부 양태에서, 본원은 서열번호 1-17 및 125-141로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 재조합 다중핵산 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본원은 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 조절하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 중 임의의 하나를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 중 임의의 하나를 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물을 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 또는 본원에 기재된 벡터 중 임의의 하나를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 단일 RNA 전사물로부터 siRNA 및 mRNA를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 또는 본원에 기재된 벡터 중 임의의 하나를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 단백질 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제2 RNA에 의해 암호화된 단백질의 발현은 상기 조성물 또는 상기 벡터가 없는 세포와 비교하여 감소된다. 일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 또는 본원에 기재된 벡터 중 임의의 하나를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 단백질 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 RNA에 의해 암호화된 단백질의 발현은 상기 조성물 또는 상기 벡터가 없는 세포와 비교하여 증가된다. 일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 조성물 또는 본원에 기재된 벡터 중 임의의 하나를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 단백질 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 제2 RNA에 의해 암호화된 단백질의 발현은 상기 조성물 또는 상기 벡터가 없는 세포와 비교하여 감소되며, 여기서 제1 RNA에 의해 암호화된 단백질의 발현은 조성물 또는 벡터가 없는 세포와 비교하여 증가된다.
실시예
이들 실시예는 예시 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1: 작제물 설계, 서열 및 합성
작제물 설계
siRNA 및 목적 유전자는 모두 시험관내 전사에 의해 생성된 단일 전사물로부터 동시에 발현된다(서열번호 1-17 및 125-141). 폴리뉴클레오티드 또는 RNA 작제물을 문헌[Cheng, et al. (2018) J. Mater. Chem. B., 6, 4638-4644]에 기재되고 siRNA 서열의 하류 또는 상류에 하나 이상의 목적 유전자를 추가로 포함하는(하나의 배향의 예가 도 1에 도시되어 있다) siRNA 설계를 포함하도록 조작한다. 재조합 작제물은 동일하거나 상이한 표적 mRNA를 표적화하는 하나 초과의 siRNA 서열을 암호화하거나 포함할 수 있다. 마찬가지로, 작제물은 2개 이상의 목적 유전자의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 링커 서열은 작제물의 임의의 두 요소 사이에 존재할 수 있다(예를 들어, 문헌[Cheng, et al. 2018]에 의해 기재된 tRNA 링커 또는 적응된 서열).
다중핵산 작제물은 단일 전사물에서 RNA 폴리머라제 결합 및 목적 유전자 및 siRNA 모두의 성공적인 시험관내 전사를 위해 목적 유전자 서열의 상류에 T7 프로모터 서열(5' TAATACGACTCACTATA 3'; 서열번호 18)을 포함할 수 있다. SP6, T3, P60, Syn5 및 KP34와 같은 대체 프로모터가 사용될 수 있다. 전사 주형은 T7 프로모터, 목적 유전자 및 siRNA 서열에 측면 인접하도록 설계된 프라이머를 사용하여, mRNA를 생성시키기 위해 PCR에 의해 생성된다. 역방향 프라이머는 티미딘(T) 염기(120)(서열번호 154)의 신장부를 포함하여 120 bp 길이의 폴리(A) 테일(서열번호 153)를 mRNA에 추가한다.
작제물 합성
표 1에 나타낸 바와 같은 작제물(화합물 ID 번호 Cpd.1-Cpd.17)은 T7 RNA 폴리머라제 프로모터(pMX, 예를 들어 pMA-T, pMK-RQ 또는 pMA-RQ)를 함유하는 벡터로서, 코돈 최적화(GeneOptimizer 알고리즘)와 함께 독일 GeneArt(Thermo Fisher Scientific)에 의해 합성되었다. 표 1은 각각의 화합물(Cpd.)에 대해, 단백질 암호화, 신호 펩티드 성질, 작제물의 siRNA의 수 및 상응하는 mRNA의 siRNA 결합을 통해 하향 조절되는 단백질을 나타낸다. 각 작제물의 서열은 표 2에 제시되며 표 아래에 나타낸 대로 주석을 달았다(서열번호 1-17).
[표 1]
화합물 1-17의 요약
IL-2: 인터류킨-2, VEGFA: 혈관 내피 성장 인자, MICA: MHC 부류 I 쇄-관련 서열 A, MICB: MHC 부류 I 쇄-관련 서열 B, IL-12: 인터류킨-12, IDH1: 이소시트레이트 데하이드로게나제; CDK4: 사이클린 의존성 키나제 4, CDK6: 사이클린 의존성 키나제 6, EGFR: 표피 성장 인자 수용체, mTOR: 라파마이신의 기계론적 표적, KRAS: Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자, IL-15: 인터류킨-15, CD155: 클러스터 분화 155(폴리오바이러스 수용체), PD-L1: 세포예정사 - 리간드 1, c-Myc: Myc 원-종양유전자.
[표 2]
화합물 1-17의 서열
볼드체 = 센스 siRNA 가닥
볼드체 및 이탤릭체 = 안티-센스 siRNA 가닥
밑줄 = 신호 펩티드
이탤랙체 = Kozak 서열
*밑줄 친 서열 내의 볼드체는 변형된 신호 펩티드를 나타낸다.
[표 3]
나열된 서열 표
[표 4]
화합물 1-17에 대한 플라스미드 벡터 서열
볼드체 = 화합물 서열
볼드체 및 밑줄 = 화합물 서열
볼드 이탤릭체 = Kozak 서열
*볼드체는 변형된 신호 펩티드가 있는 작제물을 나타낸다.
실시예 2: RNA 작제물의 시험관내 전사 및 데이터 분석
PCR 기반 시험관내 전사를 Cpd.1-Cpd.17을 암호화하는 pMA-T(Cpd.1-Cpd.4), pMK-RQ(Cpd.5) 또는 pMA-RQ(Cpd.6-Cpd.17) 벡터를 사용하여 수행하여 mRNA를 생성시킨다. 전사 주형은 표 5의 순방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 생성되었다. 폴리(A) 테일은 120 bp 폴리(A) 테일(서열번호 153)를 생산하는 주형에서 암호화되었다. siRNA 측면인접 영역의 반복적인 서열이 주어지면 특정 증폭을 달성하기 위해 필요에 따라 최적화가 이루어졌다. 최적화에는 1) 벡터의 플라스미드 DNA 양 감소, 2) DNA 폴리머라제 변화(Q5 핫 스타트 폴리머라제, New England Biolabs), 3) 각 PCR 주기에 대해 변성 시간(30초에서 10초로) 및 연장 시간(45초/ kb에서 10초/kb)의 감소, 4) 각 PCR 주기에 대해 어닐링 증가(10초에서 30초), 및 5) 각 PCR 주기에 대해 최종 연장 시간 증가(최대 15분)가 포함된다. 또한, 비특이적 프라이머 결합을 피하기 위해서, PCR 반응 혼합물을 해동 시약을 포함한 얼음 상에서 제조하고 PCR 주기 수를 25회로 줄였다.
시험관내 전사를 위해서, T7 RNA 폴리머라제(MEGAscript 키트, Thermo Fisher Scientific)를 37℃에서 2시간 동안 사용하였다. 합성된 RNA를 100% N1-메틸슈도-UTP로 화학적으로 변형시키고 5' 단부에서 항-역방향 CAP 유사체(ARCA; [m2 7,3'-OG(5')ppp(5')G])로 동시-전사 캡핑하였다(Jena Bioscience). 시험관내 전사 후에, mRNA를 MEGAclear 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 컬럼 정제하고 Nanophotometer-N60(Implen)을 사용하여 정량화하였다.
[표 5]
주형 생성을 위한 프라이머
시험관내 전사를 사용하여, Cpd.1-Cpd.17을 mRNA로서 생성시키고 IL-2, IL-7, IL-12 및 IL-15 발현 및 표적 유전자 하향조절과 병행하여 각 단백질 과발현의 조합 효과에 대해 하기에 명시된 다양한 시험관내 모델에서 시험하였다.
작제물의 분자량 측정을 하기와 같이 수행하였다. 각 작제물의 분자량을, 각 서열에 존재하는 각 염기(A, C, G, T 또는 N1-UTP)의 총 수를 측정하고 그 수에 각각의 분자량을 곱함으로써 각 서열로부터 결정하였다(예를 들어, A: 347.2 g/mol, C 323.2 g/mol, G 363.2 g/mol, N1-UTP:338.2 g/mol). 분자량을, 각 염기에 대해 얻은 모든 중량과 ARCA 분자량 817.4 g/mol의 합에 의해 결정하였다. 각 작제물의 분자량을 사용하여, 각 웰에서 형질감염에 사용된 mRNA의 양을 나노몰(nM) 농도로계산하였다.
데이터를 GraphPad Prism 8(San Diego, USA)을 사용하여 분석하였다. 표준 또는 샘플에서 ELISA를 사용하여 단백질 수준을 추정하기 위해, 상기 표준 또는 샘플의 평균 흡광도에서 블랭크의 평균 흡광도 값을 제한다. 제조사의 프로토콜에 따라 4개의 매개변수 비선형 회귀를 사용하여 표준 곡선을 생성시키고 플롯팅하였다. 각 샘플의 단백질 농도를 결정하기 위해 다른 단백질의 농도를 표준 곡선에서 보간하였다. 샘플의 최종 단백질 농도는 희석 계수를 곱하여 계산하였다. 통계적 분석은 스튜던츠 t-검정 또는 일원 ANOVA에 이어서 Dunnet의 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다.
실시예 3: HEK-293 세포의 시험관내 형질감염
인간 배아 신장 세포 293(HEK-293; ATCC CRL-1573, Rockville, MD, USA)을, 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS, Thermofischer, Basel, Switzerland cat#10500-064)이 보충된 Dulbecco의 변형된 이글 배지(DMEM, Sigma-Aldrich)에서 유지시켰다. IL-2 발현을 평가하기 위해, HEK-293 세포를 96웰 배양 플레이트에 20,000개 세포/웰로 시딩하고 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 형질감염 전에 24시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 생육 배지에서 증식시켜 형질감염 전에 세포밀집도 <80%에 도달시켰다. 그 후, HEK-293 세포를 리포펙타민 2000(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 1:1 w/v의 mRNA 대 리포펙타민 비로 제조자의 지시에 따라 300 ng의 특정 mRNA 작제물로 형질감염시켰다. 100 ㎕의 DMEM을 제거하고 50 ㎕의 Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific)을 각 웰에 첨가한 다음 Opti-MEM 중의 mRNA와 리포펙타민 2000 복합체 50 ㎕를 첨가하였다. 5시간 배양 후, 배지를 새로운 생육 배지로 교체하고 플레이트를 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양 상등액을 수집하여 ELISA(ThermoFisher Cat. # 887025)를 사용하여 분비된 IL-2를 측정하였다. 유의수준(**, p<0.01)을, Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이어서 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가하였다.
HEK-293 세포에서 IL-2 분비
IL-2 단백질 코딩 서열을 포함하는 Cpd.1-Cpd.4를 HEK-293 세포로부터의 IL-2 발현 및 분비에 대해 시험하였다. 분비된 IL-2의 단백질 수준을 IL-2 ELISA를 사용하여 세포 배양 상등액에서 측정하였으며 도 2A에서 Cpd.1(WT IL-2 신호 펩티드 함유)을 참조하여 배수 변화로 나타낸다. Cpd.2-Cpd.4(변형된 IL-2 신호 펩티드 함유)로 형질감염된 세포에 의해 분비된 IL-2의 단백질 수준은 Cpd.1로 형질감염된 세포에 의해 분비된 IL-2의 단백질 수준보다 약 2배 더 높았다. 종합하면, 데이터는 상동성 변형된 신호 펩티드를 갖는 Cpd.2-Cpd.4가 내인성 신호 펩티드를 갖는 Cpd.1과 비교하여 HEK-293 세포에서 생성된 IL-2의 향상된 세포 방출을 촉진 할 수 있음을 시사한다. 데이터는 Cpd당 3회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 유의수준(**, p<0.01)을, Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이어서 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가하였다.
실시예 4: HaCaT 세포의 시험관내 형질감염
인간 각질세포(HaCaT; AddexBio Cat. # T0020001)를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS, Thermofischer, Basel, Switzerland cat#10500-064)이 보충된 Dulbecco의 변형된 이글 배지(DMEM, Sigma-Aldrich)에서 유지시켰다. IL-2 발현을 평가하기 위해, HaCaT 세포를 96웰 배양 플레이트에 15,000개 세포/웰로 시딩하고 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 형질감염 전에 24시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 생육 배지에서 증식시켜 형질감염 전에 세포밀집도 <70%에 도달시켰다. 그 후, HaCaT 세포를 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 1:1 w/v의 mRNA 대 리포펙타민 비로 제조자의 지시에 따라 300 ng의 특정 mRNA 작제물로 형질감염시켰다. 100 ㎕의 DMEM을 제거하고 50 ㎕의 Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific)을 각 웰에 첨가한 다음 Opti-MEM 중의 mRNA와 리포펙타민 2000 복합체 50 ㎕를 첨가하였다. 5시간 배양 후, 배지를 새로운 생육 배지로 교체하고 플레이트를 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양 상등액을 수집하여 ELISA(ThermoFisher Cat. # 887025)를 사용하여 분비된 IL-2를 측정하였다. 유의수준(**, p<0.01)은 Cpd.1을, 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이어서 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가하였다.
HaCaT 세포에서 IL-2 분비
IL-2 단백질 코딩 서열을 포함하는 Cpd.1-Cpd.4를 HaCaT 세포로부터의 IL-2 발현 및 분비에 대해 시험하였다. 분비된 IL-2의 단백질 수준을 IL-2 ELISA를 사용하여 세포 배양 상등액에서 측정하였으며 도 2B에서 Cpd.1(WT IL-2 신호 펩티드 함유)을 참조하여 배수 변화로 나타낸다. Cpd.2-Cpd.4(변형된 IL-2 신호 펩티드 함유)로 형질감염된 세포에 의해 분비된 IL-2의 단백질 수준은 Cpd.1로 형질감염된 세포에 의해 분비된 IL-2의 단백질 수준보다 약 2.7배 더 높았다. 종합하면, 데이터는 상동성 변형된 신호 펩티드를 갖는 Cpd.2-Cpd.4가 내인성 신호 펩티드를 갖는 Cpd.1과 비교하여 HaCaT 세포에서 생성된 IL-2의 향상된 세포 방출을 촉진 할 수 있음을 시사한다. 데이터는 Cpd당 3회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 유의수준(**, p<0.01)을, Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이어서 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가하였다.
실시예 5: A549 세포의 시험관내 형질감염
인간 폐 상피 암종 세포(A549; Sigma-Aldrich Cat. # 6012804)를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS, Thermofischer, Basel, Switzerland cat#10500-064)이 보충된 Dulbecco의 변형된 이글 배지(DMEM, Sigma-Aldrich)에서 유지시켰다. IL-2 발현을 평가하기 위해, A549 세포를 96웰 배양 플레이트에 10,000개 세포/웰로 시딩하고 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 형질감염 전에 24시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 생육 배지에서 증식시켜 형질감염 전에 세포밀집도 <70%에 도달시켰다. 그 후, A549 세포를 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 1:1 w/v의 mRNA 대 리포펙타민 비로 제조자의 지시에 따라 4.4 nM - 35.2 nM(0.15 - 1.2 ㎍)의 다양한 농도를 갖는 특정 mRNA 작제물로 형질감염시켰다. 100 ㎕의 DMEM을 제거하고 50 ㎕의 Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific)을 각 웰에 첨가한 다음 Opti-MEM 중 mRNA와 리포펙타민 2000 복합체 50 ㎕를 첨가하였다. 5시간 배양 후, 배지를 새로운 생육 배지로 교체하고 플레이트를 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양 상등액을 수집하여 ELISA(ThermoFisher Cat. # 887025)를 사용하여 분비된 IL-2를 측정하였다. 유의수준(**, p<0.01)을, Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이어서 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가하였다.
A549 세포에서 IL-2 분비
IL-2 단백질 코딩 서열을 포함하는 Cpd.1-Cpd.4를 A549 세포로부터의 IL-2 발현 및 분비에 대해 시험하였다. 분비된 IL-2의 단백질 수준을 IL-2 ELISA를 사용하여 세포 배양 상등액에서 측정하였으며 도 2C에서 Cpd.1(WT IL-2 신호 펩티드 함유)을 참조하여 배수 변화로 나타낸다. Cpd.2-Cpd.4(변형된 IL-2 신호 펩티드 함유)로 형질감염된 세포에 의해 분비된 IL-2의 단백질 수준은 Cpd.1로 형질감염된 세포에 의해 분비된 IL-2의 단백질 수준보다 약 1.6배 더 높았다. 종합하면, 데이터는 상동성 변형된 신호 펩티드를 갖는 Cpd.2-Cpd.4가 내인성 신호 펩티드를 갖는 Cpd.1과 비교하여 A549 세포에서 생성된 IL-2의 향상된 세포 방출을 촉진 할 수 있음을 시사한다. 데이터는 Cpd당 3회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 유의수준(**, p<0.01)을, Cpd.1을 대조군으로 사용하여 일원 ANOVA에 이어서 Dunnet의 다중 비교 검정에 의해 평가하였다.
실시예 6: A549 세포에서 IL-2 분비 및 VEGFA 하향 조절의 결합 효과: VEGFA 과발현 모델
A549 세포의 시험관내 형질감염
VEGFA 과발현 모델을 사용하여 A549 세포에서 Cpd.5에 의한 동시 VEGFA RNA 간섭(RNAi) 및 IL-2 발현을 평가하였다. VEGFA 과발현 모델은 0.3 ㎍의 VEGFA mRNA로 A549 세포를 형질감염시켜 확립하였다. VEGFA 간섭 및 IL-2 과발현에 대한 Cpd.5의 용량 의존적 반응을 평가하기 위해 A549 세포를, 증가하는 농도 4.4 nM에서 35.2 nM(0.15에서 1.2 ㎍)의 Cpd.5로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, FBS가 없는 생육 배지에서 세포를 24시간 동안 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37℃에서 배양한 다음 ELISA에 의해 동일한 세포 배양 상등액 중에 존재하는 VEGFA(하향 조절하기 위한 표적 mRNA; ThermoFisher Cat. #KHG0112) 및 IL-2(과발현시키기 위한 목적 유전자; ThermoFisher Cat. # 887025)를 정량분석하였다. 상업적으로 이용가능한 siRNA(ThermoFisher Cat. #284703)에 대한 Cpd.5의 효능을 평가하기 위해 상업적인 VEGFA siRNA 및 Cpd.5를 사용하여 용량-의존적 반응 연구를 수행하였다. A549 세포를 VEGFA mRNA(0.3 ㎍/웰; 9.5 nM) 및 상업적인 VEGFA siRNA(0.05, 0.125, 0.25, 1.25 및 2.5 mM) 또는 Cpd.5(4.4, 8.8, 17.6, 26.4, 35.2 및 44.02 nM은 각각 0.15, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 및 1.5 ㎍에 상응한다)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, FBS가 없는 생육 배지에서 세포를 24시간 동안 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37℃에서 배양 한 다음 ELISA에 의해 동일한 세포 배양 상등액 중에 존재하는 VEGFA(하향 조절하기 위한 표적 mRNA; ThermoFisher Cat. #KHG0112) 및 IL-2(과발현시키기 위한 목적 유전자; ThermoFisher Cat. # 887025)를 정량분석하였다.
결과
3종의 VEGFA-표적화 siRNA 및 IL-2 단백질 코딩 서열을 포함하는 Cpd.5를, 증가하는 용량의 Cpd.5(4.4 nM에서 35.2 nM) 및 일정한 용량의 VEGFA mRNA(9.5 nM 또는 300 ng/웰)로 A549 세포를 동시-형질감염시키고 ELISA에 의해 세포 배양 상등액 중의 단백질 수준을 측정함으로써 A549 세포에서 용량-의존적인 VEGFA 하향조절 및 동시적인 IL-2 발현에 대해 시험하였다. Cpd.5는 도 3에서 입증된 바와 같이, IL-2 단백질 수준을 용량-의존적인 방식으로 증가시키면서(최대 100 ng/㎖ 초과) VEGFA 단백질 수준을 감소시켰다(최대 70%). 종합하면, 데이터는 Cpd.5가 IL-2 발현에 영향을 미치지 않고 VEGFA를 하향 조절할 수 있음을 시사한다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
실시예 7: SCC-4 세포에서 IL-2 분비 및 VEGFA 하향조절의 결합 효과: VEGFA 과발현 모델
SCC-4 세포의 시험관내 형질감염
VEGFA 과발현 모델을 사용하여, SCC-4 세포에서 Cpd.5에 의한 동시적인 VEGFA RNA 간섭(RNAi) 및 IL-2 발현을 평가하였다. VEGFA 과발현 모델은 SCC-4 세포를 9.5 nM(0.3 ㎍)의 VEGFA mRNA로 형질감염시켜 확립하였다. SCC-4 세포를 VEGFA 간섭 및 IL-2 과발현에 대한 Cpd.5의 용량 의존적 반응을 평가하기 위해 증가하는 농도 4.4 nM에서 35.2 nM(0.15에서 1.2 ㎍)의 Cpd.5로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, FBS가 없는 생육 배지에서 세포를 24시간 동안 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37℃에서 배양한 다음 ELISA에 의해 동일한 세포 배양 상등액 중에 존재하는 VEGFA(하향조절하기 위한 표적 mRNA; ThermoFisher Cat. #KHG0112) 및 IL-2(과발현시키기 위한 목적 유전자; ThermoFisher Cat. # 887025)를 정량분석하였다. VEGFA 발현에 대한 Cpd.5의 효능을 평가하기 위해서, SCC-4 세포를 9.5 nM(0.3 ㎍) VEGFA mRNA 및 Cpd.5(4.4, 8.8, 17.6, 26.4, 35.2 및 44.02 nM은 0.15, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 및 1.5 ㎍/웰에 상응한다)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, FBS가 없는 생육 배지에서 세포를 24시간 동안 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37℃에서 배양 한 다음 ELISA에 의해 동일한 세포 배양 상등액 중에 존재하는 VEGFA(하향 조절하기 위한 표적 mRNA; ThermoFisher Cat. #KHG0112) 및 IL-2(과발현시키기 위한 목적 유전자; ThermoFisher Cat. # 887025)를 정량분석하였다.
결과
IL-2 코딩 서열 및 3종의 siRNA 표적화 VEGFA를 갖도록 설계된 Cpd.5를 시험하여, SCC-4 세포가 VEGFA mRNA로 형질감염된 VEGFA 과발현 모델에서 IL-2의 동시 발현 및 VEGFA 발현의 간섭을 평가하였다. Cpd.5는 도 4A 및 도 4B에 입증된 바와 같이, 외인성으로 과발현된 VEGFA의 수준을 최대 95%까지 감소시켰고 동시에 IL-2 발현(65 ng/㎖ 초과)을 유도하였다. 요약하면, Cpd.5는 외인성으로 과발현된 VEGFA를 감소시키면서 동시에 IL-2 발현 및 분비를 유도할 수 있다.
실시예 8: SCC-4 세포에서 IL-2 분비 및 VEGFA 하향 조절의 결합 효과: 내인성 VEGFA 발현 모델
SCC-4 세포의 생체내 형질감염
SSC-4 세포를, 상기 세포가 VEGFA를 시험관 내에서 최대 600 pg/㎖까지 내인성으로 과발현하므로(도 5A), 내인성 VEGFA 과발현 모델로 사용하여 Cpd.5에 의한 동시적인 VEGFA RNA 간섭(RNAi) 및 IL-2 발현을 평가하였다. SCC-4 세포를 26.4 nM(0.9 ㎍)의 Cpd.5로 형질감염시켰다. 세포를 24시간 동안 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37℃에서 배양한 다음, 특이적인 ELISA를 사용하여 동일한 세포 배양 상등액에 존재하는 VEGFA(ThermoFisher Cat. #KHG0112) 및 IL-2(ThermoFisher Cat. # 887025)를 정량분석하였다.
결과
IL-2 코딩 서열 및 VEGFA를 표적화하는 3종의 siRNA를 갖도록 설계된 Cpd.5를, VEGFA를 시험관내에서 최대 600 pg/㎖까지 구성적으로 발현하는 SCC-4 세포에서의 동시적인 IL-2의 발현 및 VEGFA 발현의 간섭을 평가하기 위해 시험하였다. Cpd.5는 도 5A 및 도 5B에서 입증된 바와 같이 내인성 VEGFA 발현 수준을 최대 90%까지 감소시켰고 동시에 IL-2 발현(최대 12 ng/㎖)을 유도하였다. 종합하면 Cpd.5는 내인성으로 발현되는 VEGFA의 수준을 감소시키는 동시에 IL-2의 발현 및 분비를 유도할 수 있다.
실시예 9: VEGFA 하향조절에서 Cpd.5 및 상업적인 siRNA의 비교 분석
SCC-4 세포의 시험관내 형질감염
인간 혀 편평 암종 세포주(SCC-4; Sigma-Aldrich, Buchs Switzerland, Cat. # 89062002 CRL-1573)를 HAM F12(1:1) + 2 mM 글루타민 + 10% 소 태아 혈청(FBS) + 0.4 ㎍/㎖ 하이드로코르티손이 보충된 Dulbecco의 변형된 이글 고 글루코스 배지(DMEM, Sigma Aldrich)에서 유지시켰다. 세포를 96웰 배양 플레이트에 15,000개 세포/웰로 시딩하고, 형질감염 전에 24시간 동안 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 배양하였다. 형질감염 전에 세포를 DMEM/HAM F-12 생육 배지에서 증식시켜 세포밀집도 <70%에 도달시켰다. 상업적으로 입수할 수 있는 siRNA(ThermoFisher Cat. #284703)에 대한 Cpd.5의 효능을 평가하기 위해서, 상업적인 VEGFA siRNA 및 Cpd.5를 사용하여 용량 반응 연구를 수행하였다. SCC-4 세포를 9.5 nM(0.3 ㎍) VEGFA mRNA 및 상업적인 VEGFA siRNA(0.05, 0.125, 0.25, 1.25 및 2.5 mM) 또는 Cpd.5(4.4, 8.8, 17.6, 26,4, 35.2 및 44.02 nM은 0.15, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 및 1.5 ㎍/웰에 상응한다)로 동시-형질감염시켰다. SCC-4 세포를 1:1 w/v의 mRNA 대 리포펙타민 비로 제조자의 지시에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 특정 농도에서 Cpd.5c mRNA 또는 siRNA 작제물로 형질감염시켰다. DMEM 100 ㎕를 제거하고 Opti-MEM 50 ㎕ 및 Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific) 중의 mRNA 및 리포펙타민 2000 복합체 50 ㎕로 교체하였다. 5시간 후, 배지를 FBS가 없는 새로운 생육 배지로 교체하고 플레이트를 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
결과
VEGFA 발현 하향조절에서 상업적으로 입수할 수 있는 siRNA에 대한 Cpd.5의 억제 농도를 계산하기 위해 SCC-4 세포 및 A549 세포 모두에서 확립된 VEGFA 과발현 모델에서 용량 반응 연구를 수행하였다. 두 세포 모두 증가하는 농도의 Cpd.5(4.4 nM에서 44.02nM) 또는 상업적인 siRNA(0.05 mM에서 2.5 mM)와 함께 9.5 nM(0.3 ㎍) VEGFA mRNA로 동시-형질감염시켰다. 상업적인 siRNA와 비교하여 Cpd.5는 VEGFA 발현의 감소에서 SCC-4 세포에서 19배 더 높은 효능 및 A549 세포에서 52배 더 높은 효능을 보였다(도 6A 및 도 6B). SCC-4 세포(8 nM) 및 A549 세포(11 nM)에서 Cpd.5의 IC50 값을 도 6C에 나타낸다.
실시예 10: SCC-4 세포에서 IL-2 분비 및 MICB 하향조절의 결합 효과 - 내인성 MICB 발현 모델
SCC-4 세포의 시험관내 형질감염
SCC-4 세포를, 상기 세포가 시험관내에서 가용성 MICB(최대 40 pg/㎖) 및 막 결합된 MICB(최대 80 pg/㎖)를 구성적으로 발현하므로 내인성 MICB 발현 모델로 사용하여 Cpd.6에 의한 동시적인 MICB RNA 간섭(RNAi) 및 IL-2 발현을 평가하였다. SCC-4 세포를 35.11 nM(0.9 ㎍)의 Cpd.6으로 형질감염시키고 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양 상등액 및 세포 용해물에 존재하는 MICB 수준을 ELISA(ThermoFisher Cat. #BMS2303)를 사용하여 정량분석하였다. 동일한 세포 배양 상등액에 존재하는 IL-2 수준을 ELISA(ThermoFisher Cat. # 887025)를 사용하여 측정하였다.
결과
IL-2 코딩 서열 및 MICB를 표적으로 하는 3종의 siRNA를 갖도록 설계된 Cpd.6을, 시험관내에서 가용성 MICB(최대 40 pg/㎖) 및 막 결합된 MICB(최대 80 pg/㎖)를 구성적으로 발현하는 SCC-4 세포에서 동시적인 IL-2의 발현 및 MICB 발현의 간섭을 평가하기 위해 시험하였다. Cpd.6은 가용성 및 막 결합된 MICB 둘 다의 내인성 발현 수준을 각각 최대 70% 및 90%까지 감소시켰고 동시에 도 7A 및 도 7C에서 입증된 바와 같이 IL-2 발현(최대 65 ng/㎖)을 유도하였다. 요약하면, Cpd.6은 IL-2의 발현과 분비를 동시에 유도하면서 내인성으로 발현된 MICB(가용성 및 막 결합 모두)를 하향조절할 수 있다. 데이터는 4회 반복 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
실시예 11: SCC-4 세포에서 MICA 및 MICB 하향 조절과 함께 IL-2 분비의 결합 효과 - 내인성 MICA 및 MICB 발현 모델
SCC-4 세포의 시험관내 형질감염
MICB 외에, SCC-4 세포는 MICB 기능적 유사체인 가용성 MICA(최대 200 pg/㎖)를 시험관내에서 구성적으로 발현한다. MICA와 MICB 사이의 높은 게놈 상동성(>90%)으로 인해 Cpd.6에서 siRNA를 MICA와 MICB 단백질의 발현을 동시에 간섭하도록 설계하였다. Cpd.6에 의한 IL-2 발현 및 분비와 동기화된 MICA 및 MICB RNA 간섭(RNAi)을 평가하기 위해, SCC-4 세포를 증가하는 용량의 Cpd.6 mRNA(1.58, 2.93, 5.85, 11.7, 23.41, 35.11 및 46.81 nM)로 형질감염시키고, 37℃, 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양 상등액에 존재하는 MICA 수준을 ELISA(RayBioech Cat. #ELH-MICA-1)를 사용하여 정량분석하였다. 동일한 세포 배양 상등액에 존재하는 MICB 수준을 ELISA(ThermoFisher Cat. #BMS2303)를 사용하여 정량분석하였다. 동일한 세포 배양 상등액에 존재하는 IL-2 수준을 ELISA(ThermoFisher Cat. # 887025)를 사용하여 측정하였다.
결과
IL-2 코딩 서열 및 MICA와 MICB를 모두 표적으로 하는 3종의 siRNA를 갖도록 설계된 Cpd.6을, 시험관내에서 가용성 MICA 및 MICB를 구성적으로 발현하는 SCC-4 세포에서 동시적인 IL-2의 발현 및 MICA/MICB 발현의 간섭을 평가하기 위해 시험하였다. Cpd.6은 도 8A 및 도 8C에서 입증된 바와 같이 가용성 MICA 및 가용성 MICB 둘 다의 내인성 발현 수준을 용량 의존적인 방식으로 최대 80%까지 감소시켰고 동시에 IL-2 발현(>150 ng/㎖)을 유도하였다. 요약하면, Cpd.6은 IL-2의 분비를 동시에 유도하면서 내인성으로 발현된 MICA 및 MICB를 하향조절할 수 있다. 데이터는 IL-2 수준의 4회 반복 및 MICA 및 MICB 각각의 2회 반복의 평균의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
실시예 12: SK-OV-3 스페로이드 모델에서 말초 혈액 단핵 세포 종양 사멸 분석에서 Cpd.3의 생물활성 평가
Cpd.3의 항종양 활성을 핵-RFP 형질도입된 SK-OV-3 종양 세포주를 사용하여 면역 세포 매개된 종양 세포 사멸에서 평가하였다. 스페로이드에서 Cpd.3에 의해 유도된 IL-2 발현 및 분비를 위해, 2차원(2D) 배양에서 수득된 SK-OV-3-NLR 세포를 단일 밀도(5000개 세포/웰)로 초-저 부착(ULA) 플레이트에 시딩하고 리포펙타민 2000을 사용하여 100 ng의 Cpd.3 작제물로 형질감염시킨 다음, 원심분리(10분 동안 200 x g)시켜 스페로이드를 생성시켰다. 조건은 4회 중복으로 설정되었다. TR-FRET(PerkinElmer, Cat.# TRF1221C)에 의한 IL-2 발현을 시험하기 위해 형질감염 후 12, 24 및 48시간째에 상등액을 수거하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용한 실험의 경우, 스페로이드를 생성시키고 상기에서 설명한 바와 같이 Cpd.3(3 ng, 10 ng, 30 ng 및 100 ng)으로 형질감염시키고 48시간 동안 배양하여 PBMC 첨가 전에 스페로이드의 직경이 200-500 ㎛에 도달하게 하였다. 48시간 배양 기간 후, 3명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 항-CD3 항체의 존재 하에서 웰에 첨가하였다(200,000개 세포/웰). 재조합 인간 IL-2(2000 IU/㎖) 및 PBMC를 양성 대조군으로서 적절한 웰에 첨가하였다. SK-OV-3-NLR 단독 조건은 PBMC를 수용하지 않았다. 웰을 IncuCyte(S3)를 사용하여 7일 동안 3시간마다 이미지화하였으며, 전체 핵 국소 RFP(NLR) 통합 강도의 변화를 PBMC-매개된 SK-OV-3 스페로이드 종양 사멸에 대한 판독값으로 측정하였다. 전체 NLR 통합 강도를 24시간 시점으로 정규화하고 IncuCyte 소프트웨어 내 스페로이드 모듈을 사용하여 분석하였다. 그래프는 GraphPad Prism을 사용하여 추가적인 평활화 함수로 분석된 5일차의 데이터를 보여준다(각 면에서 4개의 값을 평균하고 2차 평활화 다항식 사용).
결과
3D 현탁 배양에서 Cpd.3(100 ng)으로 형질감염된 세포로부터 형성된 스페로이드로부터 수집된 상등액의 TR-FRET 분석은 IL-2 발현 및 분비의 시간 의존적 증가를 입증하였다(도 9A). 리포펙타민 형질감염으로 인해 스페로이드 형성 및 성장 에 결함이 발견되지 않았다. 3명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 추가한 후 Cpd.3으로 형질감염된 스페로이드를 분석한 결과 명확한 용량 의존적 면역 매개된 사멸이 입증되었다. 모든 공여자에 걸쳐 30 ng 및 100 ng의 Cpd.3은 분석 기간 동안 측정된 전체 통합 NLR 강도의 감소에 의해 측정된 PBMC-구동된 종양 사멸을 촉진하였다(6일 데이터는 도 9B, 9C 및 9D에 제시된다). Cpd.3에 의해 유도된 사멸 효과는 시험된 3명의 공여자 모두에서 6 nM 농도로 첨가된 재조합 인간 IL-2(rhIL-2)보다 실질적으로 더 양호하였다. 도 9E는 5일차 대조군과 비교하여 SK-OV-3 NLR 조건에서 Cpd.3 처리(100 ng) 후 NLR 온전성 감소를 나타내는 일련의 전형적인 IncuCyte 이미지를 나타낸다. 요약하면, Cpd.3 mRNA 작제물에 의한 SK-OV-3 NLR 스페로이드의 형질감염은 용량 의존적 방식으로 PBMC-매개된 종양 사멸을 향상시켰다.
실시예 13: JAK3-STAT5 활성화에 대한 HEK-Blue™ hIL-2 리포터 분석
Cpd.5 및 Cpd.6의 기능적 활성을 HEK-Blue™ IL-2 리포터 세포(Invivogen, Cat. Code: hkb-il2)(JAK/STAT 경로의 활성화를 모니터링함으로써 인간 IL-2 리포터의 활성화를 연구하기 위해 설계됨)에서 시험하였다. 이들 세포는 인간 배아 신장 HEK293 세포주에서 유래되었으며 인간 JAK3 및 STAT5 유전자와 함께 인간 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ 유전자를 발현하도록 조작되어 완전히 기능적인 IL-2 신호전달 캐스케이드(cascade)를 달성하였다. 또한, STAT5-유도성 SEAP 리포터 유전자를 도입시켰다. IL-2에 이어서 STAT5 활성화 시, 생성된 SEAP를 세포 배양 상등액에서 HEK-Blue™ 검출 세포 배양 배지를 사용하여 실시간으로 측정할 수 있다. HEK-Blue™ IL-2 세포의 자극은 재조합 인간 IL-2(rhIL-2, 0.001 ng 내지 300 ng) 또는 하기의 세부사항으로 Cpd.5 또는 Cpd.6(0.3 ㎍/웰)으로 형질감염된 HEK293 세포의 세포 배양 상등액으로부터 유래된 IL-2(0.001 ng - 45 ng)에 의해 달성되었다.
HEK-Blue™ hIL-2 세포를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형된 이글 배지(DMEM, Sigma Aldrich)에서 유지시켰다. IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ, JAK3, STAT5 및 SEAP 트랜스유전자 플라스미드를 함유하는 세포를 선택하기 위해 항생제 블라스티시딘(10 ㎍/㎖) 및 제오신(100 ㎍/㎖)을 배지에 첨가하였다. 세포를 96웰 배양 플레이트에 40,000개 세포/웰로 시딩하고 자극 전에 24시간 동안 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 배양하였다. 세포를 자극 전에 <80%의 세포밀집도에 도달하도록 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 생육 배지에서 증식시켰다. HEK293 세포 배양 상등액에서 유래된 정의된 농도의 IL-2를 수집하고, 배지 20 ㎕에 희석하고, HEK-Blue™ IL-2 세포의 배양 배지에 첨가하여 IL-2 수용체 보충을 측정한 다음 JAK3-STAT5 경로 활성화를 측정하였다. rhIL-2(0.001 내지 300 ng) 또는 Cpd.5 및 Cpd.6(0.001 내지 45 ng)에서 유래된 IL-2를 병행 시험하였다. 2시간 배양 후 QUANTI-Blue™(20 ㎕ 세포 배양 상등액 + 180 ㎕ QUANTI-Blue™ 용액)를 사용하고 SpectraMax i3 다중 모드 플레이트 판독기(Molecular Device)에서 620 ㎚에서 광학 밀도(O.D.)를 판독하여 SEAP 활성을 평가하였다. 형질감염되지 않은 샘플을 배경 대조군으로 사용하고 시험 샘플에서 얻은 O.D. 값에서 제하였다.
결과
rhIL-2 또는 Cpd.5 또는 Cpd.6으로 형질감염된 HEK293 세포의 세포 배양 상등액에서 유래한 IL-2에 의한 HEK-Blue™ IL-2 세포 자극은, 3가지 시험 화합물 모두가 용량 의존적인 방식으로 SEAP 생성을 유도하므로 기능적이었다(도 10A 및 10B). 직접적인 비교에서, Cpd.5-유래된 IL-2는 rhIL-2(EC50: 11 ng/㎖)에 비해 ~5배 더 강력하였고(EC50: 0.02 ng/㎖), Cpd.6은 rhIL-2(EC50: 0.15 ng/㎖)에 비해 ~2배 더 강력하였다(EC50: 0.08 ng/㎖). 요약하면, Cpd.5 및 Cpd.6으로부터 유래된 IL-2는 기능적이며 적어도 rhIL-2만큼 강력한 IL-2 신호 캐스케이드를 유도한다.
실시예 14: Cpd.5 및 Cpd.6의 NK-세포 매개된 사멸 분석
자연 살해 세포(NK 세포)는 종양 세포를 표적으로 하고 제거할 수 있는 잠재성을 가지고 있으며 주로 IL-2 사이토카인에 의해 프라이밍된다. IL-2 기전을 통해 NK 세포를 활성화시키는 Cpd.5 및 Cpd.6의 능력을 측정하기 위해, SCC4 세포( Sigma-Aldrich, Buchs Switzerland, Cat. # 89062002 CRL-1573) 및 자연 살해 92 세포(NK-92, DSMZ, ACC488, Germany)를 사용하였다. SCC-4 세포를 Opti-MEM에서 리포펙타민 MessangerMax(ThermoFisher, Cat.# LMRNA015)를 사용하여 Cpd.5(IL-2 mRNA + 3x VEGFA siRNA), Cpd.6(IL-2 mRNA + 3x MICA/B siRNA), 모의 RNA-1(IL-4 mRNA + 3x TNF-α siRNA) 또는 모의 RNA-2(MetLuc mRNA, siRNA 없음)로 형질감염시킴으로써 SCC4 세포(10,000/웰)에서 용량 반응 연구(0.1 nM 내지 2.5 nM)를 수행하였다. 이어서 SCC-4 세포를 검은색 96 웰 배양 플레이트에서 5% CO2를 함유하는 가습 환경에서 37℃에서 배양하였다. Opti-MEM 중의 100,000개 세포/웰의 NK-92 효과기 세포를 10:1의 효과기 대 표적 비(E:T = 10:1)로 형질감염된 SCC-4 표적 세포에 첨가하였다. 24시간 후 검은색 96웰 플레이트의 바닥을 검은색 호일로 밀봉하고 Dulbecco의 포스페이트-완충된 염수(PBS++, BioConcept, Cat.#3-05F001)로 3회 세척하여 현탁액 중에 있는 NK-92 세포를 제거하였다. SCC-4 세포는 본질적으로 부착되어 있기 때문에 24시간 배양하면 세포가 플레이트 바닥에 강하게 부착되어 NK-92 세포만 세척되었다. NK 세포가 SCC-4 세포를 사멸시키면 세척 후 SCC-4 세포가 생존하여 플레이트 바닥에 부착하는 양이 적어질 것이지므로 이를 세포 생육력 분석에 의해 정량적으로 측정할 수 있다. 3X 세척 후, 50 ㎕의 PBS++ 및 50 ㎕의 CellTiter-Glo 2.0(CTG 2.0, Promega, Cat.# G924B) 시약을 각 웰에 첨가하고 96웰 플레이트를 실온의 암실에서 10분 동안 배양하였다. SpectraMax i3x(Molecular Devices)로 발광을 측정하여 표준 설정을 사용하여 세포 생육력을 계산하였다.
결과
NK 세포 매개된 사멸 분석은 Cpd.5 또는 Cpd.6으로 형질감염되고 NK-92 세포와 함께 배양된 SCC-4 세포의 용량 의존적인 세포 용해를 밝혀내었다. SCC-4 세포로부터 분비된 IL-2는 10:1의 E:T 비(Cpd.5에 대해 >50% 및 Cpd.6에 대해 >40%, 도 10C)에서 SCC-4 종양 세포의 표적 사멸을 촉진하였다. Cpd.5 및 Cp.6 모두로 형질감염된 SCC-4 세포에 대해 NK 세포 매개된 사멸이 관찰되었다. 요약하면, Cpd.5 및 Cpd.6은 용량 의존적인 방식으로 NK 세포를 활성화함으로써 예상되는 항종양 활성을 입증하였다.
실시예 15: SCC-4 세포에서 IL-2 발현 및 VEGFA 하향조절에서 Cpd.7 및 Cpd.8의 비교 분석
SCC-4 세포를 상술한 바와 같이 배양하고 형질감염시켰다. Cpd.8(IL-2 mRNA + 5x VEGFA siRNA)에 대한 Cpd.7(IL-2 mRNA + 3x VEGFA siRNA)의 효능을 평가하기 위해 두 화합물을 사용하여 용량 반응 연구를 수행하였다. SCC-4 세포를 Cpd.7( 1.1, 2.2, 4.4, 8.8, 17.6, 26.4, 35.2 및 44.04 nM/웰) 또는 Cpd.8(0.47, 0.94, 1.89, 3.79, 7.58, 15.15, 22.73, 30.31 및 37.88 nM/웰)로 형질감염시켰다. 5시간 후 배지를 FBS가 없는 새로운 생육 배지로 교체하고 플레이트를 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하고 상등액을 수집하였다. ELISA를 수행하여 동일한 세포 배양 상등액에 존재하는 VEGFA(ThermoFisher Cat. #KHG0112) 및 IL-2(ThermoFisher Cat. # 887025) 수준을 정량분석하였다. VEGFA의 80% 하향 조절은 GraphPad prism과 함께 비-선형 Hill 결합 곡선을 사용하여 계산되었다.
결과
VEGFA 발현의 하향조절에서 Cpd.8에 대한 Cpd.7의 억제 농도를 계산하기 위해, Cpd.7 또는 Cpd.8로 형질감염된 SCC-4 세포에서 용량 반응 연구를 수행하였다. 상술한 바와 같이 증가하는 농도의 Cpd.7 또는 Cpd.8로 세포를 형질감염시켰다. Cpd.7과 비교하여, Cpd.8은 SCC-4 세포에서 VEGFA 발현 감소에 있어서 2.5배 더 높은 효능을 나타내었다(도 11A). 80% VEGF 하향 조절이 8 nM에서 SCC-4 세포의 Cpd.8에 의해 달성된 반면 18 nM에서 Cpd.7에 의해 달성되었으며, 이는 siRNA의 사본수 증가가 VEGFA 하향 조절 수준을 높인다는 것을 입증한다. 그러나, Cpd.8로부터의 IL-2 발현은 Cpd.7로부터의 IL-2 발현보다 ~2배 더 낮았다(도 11B). 요약하면, 화합물에서 siRNA의 사본수를 증가시키면 RNA 간섭이 향상되지만 mRNA 표적의 발현은 손상된다.
실시예 16: IL-2 발현 및 VEGFA 하향조절에서 Cpd.9 및 Cpd.10의 시간-경과 연구
SCC-4 세포를 상술한 바와 같이 배양하고 형질감염시켰다. Cpd.10(IL-2 mRNA + 3x VEGFA siRNA, 길이가 30 bp인 3개의 상이한 siRNA)에 대한 Cpd.9(IL-2 mRNA + 3x VEGFA siRNA, 동일한 siRNA가 3회 반복됨)의 종방향 효능을 평가하기 위해, Cpd.9 또는 Cpd.10으로 형질감염된 SCC-4 세포를 사용하여 시간-경과 연구를 수행하였다. SCC-4 세포를 30 nM/웰 농도에서 Cpd.9 또는 Cpd.10으로 형질감염시켰다. 상업적으로 입수할 수 있는 VEGFA siRNA(ThermoFisher Cat. #284703)를 비교를 위해 실험에 추가 하고 스크램블된 siRNA(Sigma, Cat.# SIC002)를 대조군으로 사용하였다. 그런 다음 세포를 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃로 배양하였다. 상이한 웰로부터의 샘플을 형질감염 후 6시간 내지 72시간 사이에 수집하였다. ELISA를 수행하여 동일한 세포 배양 상등액에 존재하는 VEGFA(ThermoFisher Cat. #KHG0112) 및 IL-2(ThermoFisher Cat. # 887025) 수준을 정량분석하였다. 각 시점에서 형질감염되지 않은 세포의 VEGFA 수준을 100%로 설정하고 VEGFA 하향 조절 수준을 각각의 시점에서 해당 수준으로 정규화하였다.
결과
시간 경과 연구는 Cpd.9 및 Cpd.10 모두에 대해 유사한 방식으로 72시간에 걸친 IL-2의 축적을 보여주었다(도 11C). 그러나, Cpd.10은 95% 초과의 RNA 간섭 수준이 달성됨에 따라 72시간까지 더 강력한 VEGFA 하향 조절을 초래한 반면, Cpd.9는 48시간 후에 85% RNA 간섭 수준을 초래하였다(도 11D). 효과는 도 11D에서 입증된 바와 같이 6시간 시점에서도 가시적이었으며 Cpd.10(>30%)에 의한 VEGFA 하향 조절이 Cpd.9(20%)에 의한 VEGFA 하향 조절보다 높은 것을 나타내었다. 이전에 관찰한 바와 같이, 상업적인 VEGFA siRNA는 VEGFA를 최대 45%까지 하향 조절하였다. 보편적인 스크램블드 siRNA는 실험 단계 전체에서 VEGFA 발현을 변경하지 않았다. 요약하면, Cpd.10은 Cpd.9에 비해 효능이 약간 개선된, 오래 지속되는 VEGFA 하향 조절을 나타내었다.
실시예 17: 암에서 다중 신호전달 경로 표적화: 시험관내 종양 모델에서 다중 siRNA 표적 및 면역 자극 사이토카인의 조합
암은 감소된 아팝토시스(apoptosis)와 함께 세포의 통제되지 않은 증식을 촉진하는 여러 조절 장애 신호 경로를 가진 복잡한 질병이다. MHC 부류 I 쇄-관련 서열 A/B(MICA/B) 및 세포예정사 - 리간드 1(PD-L1)과 같은 면역 회피 단백질의 높은 발현과 함께 라파마이신의 포유동물 표적(mTOR), 사이클린-의존적인 키나제(CDK), 혈관 내피 성장 인자(VEGFA), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자(KRAS), c-Myc 원-종양유전자(c-Myc)를 포함한 종양 성장 신호의 상향조절이 종양 세포에서 관찰된다. 또한, 종양 미세 환경은 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-15(IL-15) 및 인터류킨-7(IL-7)과 같은 면역 자극 사이토카인의 감소된 수준을 나타낸다. 따라서 면역 자극 사이토카인의 상향조절과 함께 종양 성장에 관여하는 주요 단백질의 하향 조절은 암 치료를 위한 매력적인 접근법이 될 수 있다. RNA 간섭 및 면역 자극 사이토카인의 상향조절을 통한 다중 전종양 표적의 하향조절을 측정하기 위해 Cpd.11, Cpd.12, Cpd.15 및 Cpd.16을 항종양 인터류킨 mRNA와 함께 하나 초과의 siRNA 표적을 포함하도록 설계하였다. SCC-4 세포, A549 세포 및 인간 교모세포종 세포주(U251 MG) 세포에서 다중 신호 전달 경로를 표적화하는 이들 화합물의 효과를 평가하였다.
SCC-4 세포에서 두경부암 시험관내 모델
인간 혀 편평 암종 세포주(SCC-4)는 55세 남성의 혀에서 유래되었으며 본 실시예에서 두경부암 시험관내 모델을 시뮬레이션하는 데 사용되었다. SCC-4 세포를 상술한 바와 같이 배양하고 형질감염시켰다. Cpd.11(IL-12 mRNA + 1x IDH1 siRNA + 1x CDK4 siRNA + 1x CDK6 siRNA), Cpd.12(IL-12 mRNA + 1x EGFR siRNA + 1x mTOR siRNA + 1x KRAS siRNA) 및 Cpd.15(IL-15 mRNA + 1x VEGFA siRNA + 2x CD155 siRNA)를 사용하여 다중 암 관련 표적의 조절을 병행하여 평가하기 위해서, SCC-4 세포를 이들 화합물로 10 및 30 nM/웰 농도로 형질감염시켰다. 형질감염 5시간 후 배지를 FBS가 없는 신선한 생육 배지로 교체하고 플레이트를 37℃, 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 24시간 동안 배양하고 상등액을 수집하였다. ELISA를 수행하여 세포 배양 상등액에 존재하는 인간 IL-12p70(ThermoFisher Cat. #88-7126) 및 인간 IL-15(ThermoFisher Cat. #88-7620) 수준을 정량분석하였다. 각 세포 용해물을 또한, Cells-to-CTTM 1-Step Power SYBR Green 키트(ThermoFisher Cat. #A25599) 및 프라이머(프라이머 서열 세부사항은 표 6에 나열되어 있다)를 사용하여 RT-qPCR에 의한 형질감염되지 않은 샘플에 대한 상대적인 정량분석에 의해 siRNA 표적 유전자의 RNA 풍부도를 측정하기 위해 처리하였다. 인간 18s rRNA를 참조 대조군으로 사용하였다.
결과
IDH1, CDK4 및 CDK6의 1x siRNA 및 IL-12 mRNA를 포함하는 Cpd.11 및 EGFR, mTOR 및 KRAS 및 IL-12 mRNA의 1x siRNA를 포함하는 Cpd.12의 효과를, Cpd.11 또는 Cpd.12의 두 가지 상이한 용량(10 nM 및 30 nM)으로 형질감염된 SCC-4 세포에서 IL-12 발현 및 표적 유전자의 동시적인 하향조절에 대해 평가하였다. 데이터는 Cpd.11 및 Cpd.12 모두가 도 12A 및 도 12E에 도시된 바와 같이 상당한 IL-12 단백질 발현 및 분비(>7000 pg/㎖)를 야기함을 입증한다. 동일한 세포 용해물에서, IDH1, CDK4 및 CDK6 RNA 전사물에 대한 Cpd.11의 RNA 간섭을 평가하였다. 도 12B에서 입증된 바와 같이, Cpd.11은 내인성 IDH1(10 nM에 대해 75%, 30 nM에 대해 90%), CDK4(10 nM에 대해 93%, 30 nM에 대해 98%) 및 CDK6(10 nM에 대해 85%, 30 nM의 경우 96%) 수준을 용량 의존적 방식으로 하향조절하였다. EGFR, mTOR 및 KRAS RNA 전사물에 대한 Cpd.12의 RNA 간섭을 도 12E의 동일한 세포 용해물에서 평가하였다. 도 12F에 나타낸 바와 같이, Cpd.12는 내인성 EGFR(10 nM에 대해 80%, 30 nM에 대해 92%), KRAS(10 nM에 대해 92%, 30 nM에 대해 83%) 및 mTOR(10 nM에 대해 92%, 30 nM에 대해 98%) 수준을 KRAS에 대한 용량 의존적 방식으로 하향조절하였다.
또한, 1x VEGFA siRNA, 2x CD155 siRNA 및 IL-15 mRNA를 포함하는 Cpd.15의 효과를 Cpd.15의 두 가지 상이한 용량(10 nM 및 30 nM)으로 형질감염된 SCC-4 세포에서 IL-15 발현 및 표적 유전자의 동시적인 하향조절에 대해 평가하였다. 결과는 Cpd.15가 도 14C에 나타낸 바와 같이 IL-15 단백질(>790 pg/㎖)을 발현함을 보여주었다. 동일한 세포 용해물에서, VEGFA 및 CD155 RNA 전사물에 대한 Cpd.15의 RNA 간섭을 qPCR을 사용하여 평가하였다. 도 14D에서 입증된 바와 같이, Cpd.15는 내인성 VEGFA(10 nM에 대해 95%, 30 nM에 대해 98%) 및 CD155(10 nM에 대해 73%, 30 nM에 대해 71%) 수준을 하향조절하였다. 간단히, Cpd.11, Cpd.12 및 Cpd.15를 사용하여 여러 신호 경로를 표적화하여 siRNA를 통해 여러 종양 표적을 하향조절하고 동시에 면역세포의 침윤 또는 증식을 촉진함으로써 IL-12 또는 IL-15 사이토카인을 상향조절하여 항종양 활성을 제공할 수 있다.
A549 세포에서 폐암 시험관내
모델
A549 세포는 58세된 남성의 암성 폐로부터 유래된 선암종 인간 폐포 기저 상피세포이며 본 실시예에서 폐암 시험관내 모델을 시뮬레이션하는 데 사용되었다. A549 세포를 상술한 바와 같이 배양하고 형질감염시켰다. Cpd.11(IL-12 mRNA + 1x IDH1 siRNA + 1x CDK4 siRNA + 1x CDK6 siRNA), Cpd.12(IL-12 mRNA + 1x EGFR siRNA + 1x mTOR siRNA + 1x KRAS siRNA) 및 Cpd.15(IL-15 mRNA + 1x VEGFA siRNA + 2x CD155 siRNA)를 사용하여 다중 암 관련 표적의 조절을 병행 평가하기 위해서, A549 세포를 이들 화합물로 10 및 30 nM/웰 농도로 형질감염시켰다. 형질감염 5시간 후, 배지를 FBS가 없는 새로운 생육 배지로 교체하고 플레이트를 37℃, 5% CO2 가 함유된 가습 대기에서 24시간 동안 배양하고, 상등액을 수집하였다. ELISA를 수행하여 세포 배양 상등액에 존재하는 인간 IL-12p70(ThermoFisher Cat. #88-7126) 및 인간 IL-15(ThermoFisher Cat. #88-7620) 수준을 정량분석하였다. 각 세포 용해물을 또한 Cells-to-CTTM 1-Step Power SYBR Green 키트(ThermoFisher Cat. #A25599) 및 프라이머(프라이머 서열 세부사항은 표 6에 나열되어 있다)를 사용하여 RT-qPCR에 의한 형질감염되지 않은 샘플에 대한 상대적인 정량분석에 의해 siRNA 표적 유전자의 RNA 풍부도를 측정하기 위해 처리하였다. 인간 18s rRNA를 참조 대조군으로 사용하였다.
결과
IDH1, CDK4 및 CDK6 및 IL-12 mRNA의 1x siRNA를 포함하는 Cpd.11 및 EGFR, mTOR, KRAS 및 IL-12 mRNA의 1x siRNA를 포함하는 Cpd.12의 효과를, Cpd.11 또는 Cpd.12의 두 가지 상이한 용량(10 nM 및 30 nM)으로 형질감염된 A549 세포에서 IL-12 발현 및 표적 유전자의 동시적인 하향조절에 대해 평가하였다. 데이터는 Cpd.11 및 Cpd.12 모두가 도 12C 및 도 12G에 도시된 바와 같이 상당한 IL-12 단백질 발현 및 분비(>1925 pg/㎖)를 야기함을 입증한다. 동일한 세포 용해물에서, IDH1, CDK4 및 CDK6 RNA 전사물에 대한 Cpd.11의 RNA 간섭을 평가하였다. 도 12D에서 입증된 바와 같이, Cpd.11은 내인성 IDH1(10 nM에 대해 88%, 30 nM에 대해 92%), CDK4(10 nM에 대해 74%, 30 nM에 대해 80%) 및 CDK6(10 nM에 대해 58%, 30 nM에 대해 60%) 수준을 하향조절하였다. EGFR, mTOR 및 KRAS RNA 전사물에 대한 Cpd.12의 RNA 간섭을 도 12G의 동일한 세포 용해물에서 평가하였다. 도 12H에 나타낸 바와 같이, Cpd.12는 30 nM의 Cpd.12로 형질감염된 SCC-4 세포에서 내인성 EGFR 수준(최대 58%)을 하향조절하였다. 이 세포주에서, 내인성 KRAS mRNA 발현은 KRAS qPCR 분석에 의해 검출하기에 너무 낮았으며, 수준은 대조용 조건에서조차 정량분석 한계 아래(BQL)였다. 도 12H에 나타낸 바와 같이, Cpd.12는 내인성 mTOR 수준을 용량-의존적인 방식으로 하향조절하였다(10 nM에 대해 67% 및 30 nM에 대해 79%).
또한, 1x VEGFA siRNA, 2x CD155 siRNA 및 IL-15 mRNA를 포함하는 Cpd.15의 효과를 Cpd.15의 상이한 용량(10 nM 및 30 nM)으로 형질감염된 A549 세포에서 IL-15 발현 및 표적 유전자의 동시적인 하향조절에 대해 평가하였다. Cpd.15는 도 14A에 나타낸 바와 같이, 상당한 IL-15 단백질 발현 및 분비(>715 pg/㎖)를 초래하였다. 동일한 세포 용해물에서, VEGFA 및 CD155 RNA 전사물에 대한 Cpd.15의 RNA 간섭을 qPCR을 사용하여 평가하였다. 도 14B에서 입증된 바와 같이, Cpd.15는 내인성 VEGFA(10 nM에 대해 58%, 30 nM에 대해 51%) 및 CD155(10 nM에 대해 43%, 30 nM에 대해 42%) 수준을 하향조절하였다. 간단히, Cpd.11, Cpd.12 및 Cpd.15를 사용하여 여러 신호 경로를 표적화하여 siRNA를 통해 여러 종양 표적을 하향조절하고 동시에 면역세포의 침윤 또는 증식을 촉진함으로써 IL-12 또는 IL-15 사이토카인을 상향조절하여 항종양 활성을 제공할 수 있다.
U251 MG 세포에서 교모세포종 시험관내 모델
인간 교모세포종 세포주(U251 MG; DSMZ, Germany, Cat. # 09063001)는 인간 악성 교모세포종에서 유래되었다. U251 MG 세포를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형된 고 글루코스 이글 배지(DMEM, Sigma Aldrich, Cat # D0822)에서 유지시켰다. 세포를 96웰 배양 플레이트에 20,000개 세포/웰로 시딩하고, 형질감염 전에 24시간 동안 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 배양하였다. 형질감염 전에 세포를 DMEM 생육 배지에서 증식시켜 세포밀집도 <70%에 도달시켰다. 그 후, U251 MG 세포를 제조사의 지시에 따라 1:1 w/v의 화합물 대 리포펙타민 비로 리포펙타민 MessengerMax(Invitrogen)를 사용하여 10 nM 또는 30 nM 농도에서 Cpd.16(IL-15 mRNA + 1x VEGFA siRNA + 1x PD-L1 siRNA + 1x c-Myc siRNA)로 형질감염시켰다. 100 ㎕의 DMEM을 제거하고 90 ㎕의 Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific, Switzerland, Cat # 31985-070) 및 Opti-MEM 중의 화합물 및 리포펙타민 MessangerMax 복합체 10 ㎕로 교체하였다. 5시간 후, 배지를 FBS가 없는 새로운 생육 배지로 교체하고 플레이트를 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. ELISA를 수행하여 세포 배양 상등액에 존재하는 인간 IL-15(ThermoFisher Cat. #88-7620) 수준을 정량분석하였다. 각 세포 용해물을 또한 Cells-to-CT TM 1-Step Power SYBR Green 키트(ThermoFisher Cat. #A25599) 및 프라이머(프라이머 서열 세부사항은 표 6에 나열되어 있다)를 사용하여 RT-qPCR에 의한 형질감염되지 않은 샘플에 대한 상대적인 정량분석에 의해 siRNA 표적 유전자의 RNA 풍부도를 측정하기 위해 처리하였다. 인간 18s rRNA를 참조 대조군으로 사용하였다.
결과
VEGFA, PD-L1 및 c-Myc의 1x siRNA 및 IL-15 mRNA를 포함하는 Cpd.16의 효과를 두 가지 상이한 용량(10 nM 및 30 nM)의 Cpd.16로 형질감염된 U251 MG 세포에서 IL-15 발현 및 표적 유전자의 동시적인 하향조절에 대해 평가하였다. 데이터는 Cpd.16이 도 14E에 나타낸 바와 같이 IL-15 단백질(>300 pg/㎖)을 발현함을 입증한다. 동일한 세포 용해물에서 VEGFA, PD-L1 및 c-Myc RNA 전사물에 대한 Cpd.16의 RNA 간섭을 평가하였다. 도 14F에서 입증된 바와 같이, Cpd.16은 내인성 VEGFA를 10 및 30 nM에 대해 99%까지, PD-L1을 10 및 30 nM에 대해 >97%까지, c-Myc를 10 및 30 nM 수준에 대해 >99%까지 하향조절하였다. 요약하면, Cpd.16을 사용하여 다중 신호 경로를 표적화하여 siRNA를 통해 다중 종양 표적을 하향조절하고 동시에 IL-15 사이토카인을 상향조절하여 NK-세포 및 T-세포와 같은 항종양 면역 세포의 증식을 촉진하여 항종양 활성을 제공할 수 있다.
실시예 18: 시험관내 종양 모델에서 단일 siRNA 표적 및 면역 자극 사이토카인의 조합
본 실시예에서, 면역 자극 사이토카인의 과발현과 함께 하향 조절을 위한 단일 전-종양 유전자 표적화의 영향. SCC-4 세포, A549 세포 및 U251MG 세포에서 Cpd.13(IL-12 mRNA + 3x EGFR siRNA), Cpd.14(IL-12 mRNA + 3x mTOR siRNA) 및 Cpd.17(IL-7 mRNA + 3x PD-L1 siRNA)의 암 관련 표적 및 사이토카인 분비의 병렬 조절을 평가하였다. 3개의 세포 모두를 상기 화합물의 2가지 상이한 투여량(10 nM 및 30 nM)으로 상술한 바와 같이 배양하고 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 상등액을 수집하였다. ELISA를 수행하여 세포 배양 상등액에 존재하는 인간 IL-12p70(ThermoFisher Cat. #88-7126) 및 인간 IL-7(ThermoFisher Cat. # EHIL7) 수준을 정량분석하였다. 각 세포 용해물을 또한 Cells-to-CT TM 1-Step Power SYBR Green 키트(ThermoFisher Cat. #A25599) 및 프라이머(프라이머 서열 세부 사항은 표 6에 나열되어 있다)를 사용하여 RT-qPCR에 의한 형질감염되지 않은 샘플에 대한 상대적인 정량분석에 의해 siRNA 표적 유전자의 RNA 풍부도를 측정하기 위해 처리하였다. 인간 18s rRNA를 참조 대조군으로 사용하였다.
결과
3x EGFR siRNA 및 IL-12 mRNA를 포함하는 Cpd.13의 효과를, 2가지 상이한 용량(10 nM 및 30 nM) Cpd.13으로 형질감염된 A549 세포 및 SCC-4 세포 모두에서 IL-12 발현 및 동시적인 EGFR 유전자 하향조절에 대해 평가하였다. 도 13A 및 13B에 나타낸 바와 같이, Cpd.13은 A549 세포(최대 2030 pg/㎖) 및 SCC-4 세포(최대 7420 pg/㎖) 모두에서 IL-12 단백질을 발현하였다. 동일한 세포 용해물에서 EGFR RNA 전사물에 대한 Cpd.13의 RNA 간섭을 평가하였다. 도 13D 및 도 13E에서 입증된 바와 같이, Cpd.13은 내인성 EGFR 수준을 하향조절하였다(A549 세포에서 30-40% 및 SCC-4 세포에서 85-92%).
마찬가지로, 3x mTOR siRNA 및 IL-12 mRNA를 포함하는 Cpd.14를 2가지 상이한 용량(10 nM 및 30 nM)의 Cpd.14로 형질감염된 A549 세포에서 IL-12 발현 및 동시적인 mTOR 유전자 하향조절에 대해 평가하였다. 도 13C에 나타낸 바와 같이, Cpd.14는 IL-12 단백질을 발현하였다(10 nM의 Cpd.14로 형질감염된 세포에서 최대 2800 pg/㎖ 및 30 nM의 Cpd.14로 형질감염된 세포에서 365 pg/㎖(10 nM Cpd.14와 비교하여 >7배 더 낮다)). 30 nM의 Cpd.14로 형질감염된 세포에서, mTOR이 세포 생존 마커이기 때문에 높은 수준의 세포 사멸이 관찰되었다. 동일한 세포 용해물에서, mTOR RNA 전사물에 대한 Cpd.14의 RNA 간섭을 평가하였다. 도 13F에서 입증된 바와 같이, Cpd.14는 내인성 mTOR 수준을 하향조절하였다(A549 세포에서 50-73%).
U251 MG 세포에서, 3x PD-L1 siRNA 및 IL-17 mRNA를 포함하는 Cpd.17(10 nM 및 30 nM 농도)의 효과를 IL-7 발현 및 동시적인 PD-L1 유전자 하향조절에 대해 평가하였다. 도 14G에 나타낸 바와 같이, Cpd.17은 IL-7 단백질을 발현하였다(최대 1300 pg/㎖). 동일한 세포 용해물에서, PD-L1 RNA 전사물에 대한 Cpd.14의 RNA 간섭을 평가하였다. 도 14H에서 입증된 바와 같이, Cpd.14는 용량 관련 방식으로 내인성 PD-L1 수준(U251 MG 세포에서 60-87%)을 하향조절하였다.
[표 6]
qPCR 분석에 사용되는 프라이머
실시예 19: 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 관 형성 분석: 시험관내 혈관형성 모델
Cpd.5 및 Cpd.10의 VEGFA 하향조절 효능의 기능적 관련성을 평가하기 위해, SCC-4 세포를 배양하고 상술한 바와 같이 Cpd.5 및 Cpd.10(20 및 30 nM/웰)으로 형질감염시켰다. 5시간 후, 배지를 FBS가 없는 새로운 생육 배지로 교체하고 플레이트를 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 24시간 동안 37℃에서 배양하여 VEGFA를 배지내로 생성 및 분비시키고, 상등액을 수집하고 VEGFA 수준을 ELISA(ThermoFisher Cat. #KHG0112)에 의해 정량분석하였다. 동일한 세포 배양 상등액을 사용하여, 처리 없이 또는 Cpd.5 및 Cpd.10 처리 24시간 후에 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 혈관형성을 유도하는 상기 분비된 VEGF의 기능적 능력을 평가하였다. HUVEC는 적절한 세포외 기질 지원과 함께 합류이하 밀도로 도말시 3차원 모세관-유사 관형 구조(유사-튜브 형성이라고도 함)를 형성하는 능력을 갖는다. 상기 혈관형성 모델은 이 시험관내에서 Cpd.5 및 Cpd.10의 항-혈관형성 활성을 측정하기 위해 확립되었다. HUVEC 세포(ATCC, Cat. #CRL1730)를, Matrigel 코팅된 Ibidi 플레이트에 분배하기 전에 24시간 동안 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37℃에서 10% FBS(ATCC, #30-2020), 0.1 mg/㎖ 헤파린(Sigma, #H3393), 및 30 ㎍/㎖ ECGS(Corning, #354006)가 보충된 F-12K 배지(ATCC Cat. #30-2004)에서 유지시켰다. 실험 24시간 전에, 피펫 팁과 μ-슬라이드 혈관형성 Ibidi 플레이트(Ibidi, Cat. #81506)를 -20℃에 두었다. 성장 인자-감소된 BD Matrigel(BD Biosciences, Cat. #354230)을 냉장고에서 얼음상에서 밤새 해동시켰다. 실험 당일, Matrigel을 적용하는 동안, Matrigel, 피펫 팁 및 플레이트를 얼음상에서 층류 하에 보관하였다. 10 ㎕의 Matrigel을 Ibidi 플레이트의 각 내부 웰에 적용하여 상부 웰로 흐르지 않도록 하였다. Matrigel로 코팅된 플레이트를 가습 챔버에서 1시간 동안 37℃에 두었다. 표준 절차를 사용하여 HUVEC를 트립신 처리하고 카운트하였으며, 세포를 SCC-4 세포 상등액(처리 없음) 또는 Cpd.5 또는 Cpd.10(20 nM 또는 30 nM) 또는 재조합 VEGFA(0.5 또는 5 ng/㎖)가 포함된 배지로 처리된 SCC-4 세포 상등액으로부터 유래된 세포 배지에 5000개 세포/50 ㎕의 농도로 현탁하였다. 신선한 HUVEC 배양 배지를 기준선 대조군으로서 사용하였다. Matrigel 중합 후, 상술한 세포 현탁액 50㎕를 각 웰에 로딩하였다. Ibidi 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 배양하였다. 세포를 현미경으로 시각화하고 이미지를 촬영(0시간 및 6시간)하고 튜브 형성 및 분지점 수를 분석하였다.
결과
IL-2 코딩 서열 및 VEGFA를 표적화하는 3종의 siRNA를 갖도록 설계된 Cpd.5 및 Cpd.10을 SCC-4 세포에서 VEGFA 발현의 간섭을 평가하기 위해 시험하였다. 대조용 조건 하에서, SCC-4 세포는 대략 0.8 ng/㎖의 VEGFA를 배지내로 생성 및 분비하였다(도 15A). Cpd.5에 의한 형질감염은 VEGFA 수준을 20 및 30 nM에서 각각 76% 및 60%까지 감소시킨 반면, Cpd.10 처리는 VEGFA를 20 및 30 nM 모두에서 30%로 더욱 강력하게 감소시켰다(도 15A). 이들 세포 배양 상등액 50 ㎕를 HUVEC 세포에서 시험관내 혈관형성의 마커로서 분지점 형성을 유도하는 기능적 능력에 대해 분석하고 처리되지 않은 대조군 또는 정의된 rh-VEGFA 농도(0.5 및 5 ng/㎖)를 갖는 배지와 비교하였다. 도 15B는 튜브 형성에 대한 척도로서 분지점을 증가시키는 효능이 배지 VEGFA와 잘 연관되어 있음을 보여준다. 대조용 조건 하의 SCC-4 세포는 VEGFA를 생성하여 2개의 rh-VEGFA 대조군과 유사한 유의수준의 분지점 형성을 유도하였다. Cpd.5 및 Cpd.10 모두의 상등액은 감소된 VEGFA 수준의 결과로서 분지점을 크게 감소시켰으며, Cpd.10 상등액은 낮은 VEGFA 수준으로 인해 Cpd.5보다 분지점 형성을 감소시키는 데 약간 더 효능이 있었다.
본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시를 위한 것이며 당업자에게 제안된 다양한 수정 또는 변경은 본원의 진의 및 범주 및 첨부된 청구범위 내에 포함되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> VERSAMEB AG
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SIMULTANEOUSLY MODULATING EXPRESSION
OF GENES
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<213> Artificial Sequence
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gccacc 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60
gattcccggc tggtgca 77
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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oligonucleotide"
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atagtgagtc gtattaacgt accaacaa 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tttatcttag aggcatatcc ctacgtacca acaa 34
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
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<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 25
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
agttccctat cactctcttt aatcactact cacagtaacc tcaactcctg ccacaatgta 60
caggatgcaa ctcctgtctt gcattgcact aagtcttgca cttgtcacaa acagtgcacc 120
tacttcaagt tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca 180
gatgattttg aatggaatta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacatt 240
taagttttac atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga 300
actcaaacct ctggaggaag tgctaaattt agctcaaagc aaaaactttc acttaagacc 360
cagggactta atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat ctgaaacaac 420
attcatgtgt gaatatgctg atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat 480
taccttttgt caaagcatca tctcaacact gacttgataa ttaagtgctt cccacttaaa 540
acatatcagg ccttctattt atttaaatat ttaaatttta tatttattgt tgaatgtatg 600
gtttgctacc tattgtaact attattctta atcttaaaac tataaatatg gatcttttat 660
gattcttttt gtaagcccta ggggctctaa aatggtttca cttatttatc ccaaaatatt 720
tattattatg ttgaatgtta aatatagtat ctatgtagat tggttagtaa aactatttaa 780
taaatttgat aaatataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 822
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<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
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<212> PRT
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Met Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Ala
1 5 10 15
Thr Asn Ser
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Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala Leu Ala Ser Thr Ala Ala
1 5 10 15
Ala Thr Asn Ser
20
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Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala Leu Ala Ser Thr Ala Leu
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Val Thr Asn Ser
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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atgtacagaa tgcagctgct gagctgtatc gccctgtctc tggccctggt cacaaatagc 60
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<212> DNA
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atgctgaaac tgctgctgct cctgtgtatc gccctgtctc tggccgccac aaatagc 57
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<212> DNA
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atgttgttgc tgctgctcgc ctgtattgcc ctggcctcta cagccgccgc tacaaattct 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atgttgttgc tgctgctcgc ctgtattgcc ctggcctcta cagccctggt caccaattct 60
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<211> 232
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp
165 170 175
Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys
180 185 190
His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn
195 200 205
Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr
210 215 220
Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120
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atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240
atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420
aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat 480
aagtcctgga gcgtgtacgt tggtgcccgc tgctgtctaa tgccctggag cctccctggc 540
ccccatccct gtgggccttg ctcagagcgg agaaagcatt tgtttgtaca agatccgcag 600
acgtgtaaat gttcctgcaa aaacacagac tcgcgttgca aggcgaggca gcttgagtta 660
aacgaacgta cttgcagatg tgacaagccg aggcggtga 699
<210> 36
<211> 699
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
augaacuuuc ugcugucuug ggugcauugg agccuugccu ugcugcucua ccuccaccau 60
gccaaguggu cccaggcugc acccauggca gaaggaggag ggcagaauca ucacgaagug 120
gugaaguuca uggaugucua ucagcgcagc uacugccauc caaucgagac ccugguggac 180
aucuuccagg aguacccuga ugagaucgag uacaucuuca agccauccug ugugccccug 240
augcgaugcg ggggcugcug caaugacgag ggccuggagu gugugcccac ugaggagucc 300
aacaucacca ugcagauuau gcggaucaaa ccucaccaag gccagcacau aggagagaug 360
agcuuccuac agcacaacaa augugaaugc agaccaaaga aagauagagc aagacaagaa 420
aaaaaaucag uucgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa aucccgguau 480
aaguccugga gcguguacgu uggugcccgc ugcugucuaa ugcccuggag ccucccuggc 540
ccccaucccu gugggccuug cucagagcgg agaaagcauu uguuuguaca agauccgcag 600
acguguaaau guuccugcaa aaacacagac ucgcguugca aggcgaggca gcuugaguua 660
aacgaacgua cuugcagaug ugacaagccg aggcgguga 699
<210> 37
<211> 383
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Met Gly Leu Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Phe Pro Phe
1 5 10 15
Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu
20 25 30
Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Thr Glu
35 40 45
Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys
50 55 60
Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys
65 70 75 80
Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu
85 90 95
Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser
100 105 110
Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg
115 120 125
Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn
130 135 140
Leu Glu Thr Lys Glu Trp Thr Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr
165 170 175
Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg
180 185 190
Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met
195 200 205
Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr
210 215 220
Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg
225 230 235 240
Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val
245 250 255
Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile
260 265 270
Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly
275 280 285
Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln
290 295 300
Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala Ala Ala Ile
305 310 315 320
Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr Val Arg Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser
325 330 335
Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Gln His
340 345 350
Pro Val Gly Thr Ser Asp His Arg Asp Ala Thr Gln Leu Gly Phe Gln
355 360 365
Pro Leu Met Ser Asp Leu Gly Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Ala
370 375 380
<210> 38
<211> 1152
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60
gctgctgctg agccccacag tcttcgttat aacctcacgg tgctgtcctg ggatggatct 120
gtgcagtcag ggtttctcac tgaggtacat ctggatggtc agcccttcct gcgctgtgac 180
aggcagaaat gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aagatgtcct gggaaataag 240
acatgggaca gagagaccag agacttgaca gggaacggaa aggacctcag gatgaccctg 300
gctcatatca aggaccagaa agaaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360
atccatgaag acaacagcac caggagctcc cagcatttct actacgatgg ggagctcttc 420
ctctcccaaa acctggagac taaggaatgg acaatgcccc agtcctccag agctcagacc 480
ttggccatga acgtcaggaa tttcttgaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 540
cacgctatgc atgcagactg cctgcaggaa ctacggcgat atctaaaatc cggcgtagtc 600
ctgaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacccgca gcgaggcctc agagggcaac 660
attaccgtga catgcagggc ttctggcttc tatccctgga atatcacact gagctggcgt 720
caggatgggg tatctttgag ccacgacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780
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acctgctaca tggaacacag cgggaatcac agcactcacc ctgtgccctc tgggaaagtg 900
ctggtgcttc agagtcattg gcagacattc catgtttctg ctgttgctgc tgctgctatt 960
tttgttatta ttattttcta tgtccgttgt tgtaagaaga aaacatcagc tgcagagggt 1020
ccagagctcg tgagcctgca ggtcctggat caacacccag ttgggacgag tgaccacagg 1080
gatgccacac agctcggatt tcagcctctg atgtcagatc ttgggtccac tggctccact 1140
gagggcgcct ag 1152
<210> 39
<211> 1152
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
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aggcagaaau gcagggcaaa gccccaggga cagugggcag aagauguccu gggaaauaag 240
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auccaugaag acaacagcac caggagcucc cagcauuucu acuacgaugg ggagcucuuc 420
cucucccaaa accuggagac uaaggaaugg acaaugcccc aguccuccag agcucagacc 480
uuggccauga acgucaggaa uuucuugaag gaagaugcca ugaagaccaa gacacacuau 540
cacgcuaugc augcagacug ccugcaggaa cuacggcgau aucuaaaauc cggcguaguc 600
cugaggagaa cagugccccc cauggugaau gucacccgca gcgaggccuc agagggcaac 660
auuaccguga caugcagggc uucuggcuuc uaucccugga auaucacacu gagcuggcgu 720
caggaugggg uaucuuugag ccacgacacc cagcaguggg gggauguccu gccugauggg 780
aauggaaccu accagaccug gguggccacc aggauuugcc aaggagagga gcagagguuc 840
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cuggugcuuc agagucauug gcagacauuc cauguuucug cuguugcugc ugcugcuauu 960
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ccagagcucg ugagccugca gguccuggau caacacccag uugggacgag ugaccacagg 1080
gaugccacac agcucggauu ucagccucug augucagauc uuggguccac uggcuccacu 1140
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<210> 40
<211> 383
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Met Gly Leu Gly Arg Val Leu Leu Phe Leu Ala Val Ala Phe Pro Phe
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu
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Met Val Leu Ser Gln Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu
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Gly His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Arg
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Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asn Val Leu Gly Ala Lys
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Thr Trp Asp Thr Glu Thr Glu Asp Leu Thr Glu Asn Gly Gln Asp Leu
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Arg Arg Thr Leu Thr His Ile Lys Asp Gln Lys Gly Gly Leu His Ser
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Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Ser Ser Thr Arg
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Gly Ser Arg His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn
130 135 140
Leu Glu Thr Gln Glu Ser Thr Val Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Met Asn Val Thr Asn Phe Trp Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr
165 170 175
Lys Thr His Tyr Arg Ala Met Gln Ala Asp Cys Leu Gln Lys Leu Gln
180 185 190
Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Ala Ile Arg Arg Thr Val Pro Pro Met
195 200 205
Val Asn Val Thr Cys Ser Glu Val Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr
210 215 220
Cys Arg Ala Ser Ser Phe Tyr Pro Arg Asn Ile Thr Leu Thr Trp Arg
225 230 235 240
Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asn Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val
245 250 255
Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile
260 265 270
Arg Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly
275 280 285
Asn His Gly Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Ala Leu Val Leu Gln
290 295 300
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Val Ile Ile Ile Ile Leu Cys Val Pro Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser
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Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Gln His
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Pro Val Gly Thr Gly Asp His Arg Asp Ala Ala Gln Leu Gly Phe Gln
355 360 365
Pro Leu Met Ser Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Thr
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<210> 41
<211> 1152
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
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actcatatca aggaccagaa aggaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360
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<210> 42
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<213> Homo sapiens
<400> 42
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caggaugggg uaucuuugag ccacaacacc cagcaguggg gggauguccu gccugauggg 780
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gagggcaccu ag 1152
<210> 43
<211> 219
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro
20 25 30
Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val
35 40 45
Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys
50 55 60
Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser
65 70 75 80
Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys
85 90 95
Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala
100 105 110
Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr
115 120 125
Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys
130 135 140
Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu
145 150 155 160
Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr
165 170 175
Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys
180 185 190
Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr
195 200 205
Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
210 215
<210> 44
<211> 197
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 45
<211> 1230
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
atttcgcttt cattttgggc cgagctggag gcggcggggc cgtcccggaa cggctgcggc 60
cgggcacccc gggagttaat ccgaaagcgc cgcaagcccc gcgggccggc cgcaccgcac 120
gtgtcaccga gaagctgatg tagagagaga cacagaagga gacagaaagc aagagaccag 180
agtcccggga aagtcctgcc gcgcctcggg acaattataa aaatgtggcc ccctgggtca 240
gcctcccagc caccgccctc acctgccgcg gccacaggtc tgcatccagc ggctcgccct 300
gtgtccctgc agtgccggct cagcatgtgt ccagcgcgca gcctcctcct tgtggctacc 360
ctggtcctcc tggaccacct cagtttggcc agaaacctcc ccgtggccac tccagaccca 420
ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa aacctgctga gggccgtcag caacatgctc 480
cagaaggcca gacaaactct agaattttac ccttgcactt ctgaagagat tgatcatgaa 540
gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg gaggcctgtt taccattgga attaaccaag 600
aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc tctttcataa ctaatgggag ttgcctggcc 660
tccagaaaga cctcttttat gatggccctg tgccttagta gtatttatga agacttgaag 720
atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat gcaaagcttc tgatggatcc taagaggcag 780
atctttctag atcaaaacat gctggcagtt attgatgagc tgatgcaggc cctgaatttc 840
aacagtgaga ctgtgccaca aaaatcctcc cttgaagaac cggattttta taaaactaaa 900
atcaagctct gcatacttct tcatgctttc agaattcggg cagtgactat tgatagagtg 960
atgagctatc tgaatgcttc ctaaaaagcg aggtccctcc aaaccgttgt catttttata 1020
aaactttgaa atgaggaaac tttgatagga tgtggattaa gaactaggga gggggaaaga 1080
aggatgggac tattacatcc acatgatacc tctgatcaag tatttttgac atttactgtg 1140
gataaattgt ttttaagttt tcatgaatga attgctaaga agggaaaata tccatcctga 1200
aggtgttttt cattcacttt aatagaaggg 1230
<210> 46
<211> 328
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 47
<211> 306
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser
305
<210> 48
<211> 1410
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
ctgtttcagg gccattggac tctccgtcct gcccagagca agatgtgtca ccagcagttg 60
gtcatctctt ggttttccct ggtttttctg gcatctcccc tcgtggccat atgggaactg 120
aagaaagatg tttatgtcgt agaattggat tggtatccgg atgcccctgg agaaatggtg 180
gtcctcacct gtgacacccc tgaagaagat ggtatcacct ggaccttgga ccagagcagt 240
gaggtcttag gctctggcaa aaccctgacc atccaagtca aagagtttgg agatgctggc 300
cagtacacct gtcacaaagg aggcgaggtt ctaagccatt cgctcctgct gcttcacaaa 360
aaggaagatg gaatttggtc cactgatatt ttaaaggacc agaaagaacc caaaaataag 420
acctttctaa gatgcgaggc caagaattat tctggacgtt tcacctgctg gtggctgacg 480
acaatcagta ctgatttgac attcagtgtc aaaagcagca gaggctcttc tgacccccaa 540
ggggtgacgt gcggagctgc tacactctct gcagagagag tcagagggga caacaaggag 600
tatgagtact cagtggagtg ccaggaggac agtgcctgcc cagctgctga ggagagtctg 660
cccattgagg tcatggtgga tgccgttcac aagctcaagt atgaaaacta caccagcagc 720
ttcttcatca gggacatcat caaacctgac ccacccaaga acttgcagct gaagccatta 780
aagaattctc ggcaggtgga ggtcagctgg gagtaccctg acacctggag tactccacat 840
tcctacttct ccctgacatt ctgcgttcag gtccagggca agagcaagag agaaaagaaa 900
gatagagtct tcacggacaa gacctcagcc acggtcatct gccgcaaaaa tgccagcatt 960
agcgtgcggg cccaggaccg ctactatagc tcatcttgga gcgaatgggc atctgtgccc 1020
tgcagttagg ttctgatcca ggatgaaaat ttggaggaaa agtggaagat attaagcaaa 1080
atgtttaaag acacaacgga atagacccaa aaagataatt tctatctgat ttgctttaaa 1140
acgttttttt aggatcacaa tgatatcttt gctgtatttg tatagttaga tgctaaatgc 1200
tcattgaaac aatcagctaa tttatgtata gattttccag ctctcaagtt gccatgggcc 1260
ttcatgctat ttaaatattt aagtaattta tgtatttatt agtatattac tgttatttaa 1320
cgtttgtctg ccaggatgta tggaatgttt catactctta tgacctgatc catcaggatc 1380
agtccctatt atgcaaaatg tgaatttaat 1410
<210> 49
<211> 414
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Met Ser Lys Lys Ile Ser Gly Gly Ser Val Val Glu Met Gln Gly Asp
1 5 10 15
Glu Met Thr Arg Ile Ile Trp Glu Leu Ile Lys Glu Lys Leu Ile Phe
20 25 30
Pro Tyr Val Glu Leu Asp Leu His Ser Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Asn
35 40 45
Arg Asp Ala Thr Asn Asp Gln Val Thr Lys Asp Ala Ala Glu Ala Ile
50 55 60
Lys Lys His Asn Val Gly Val Lys Cys Ala Thr Ile Thr Pro Asp Glu
65 70 75 80
Lys Arg Val Glu Glu Phe Lys Leu Lys Gln Met Trp Lys Ser Pro Asn
85 90 95
Gly Thr Ile Arg Asn Ile Leu Gly Gly Thr Val Phe Arg Glu Ala Ile
100 105 110
Ile Cys Lys Asn Ile Pro Arg Leu Val Ser Gly Trp Val Lys Pro Ile
115 120 125
Ile Ile Gly Arg His Ala Tyr Gly Asp Gln Tyr Arg Ala Thr Asp Phe
130 135 140
Val Val Pro Gly Pro Gly Lys Val Glu Ile Thr Tyr Thr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Gly Thr Gln Lys Val Thr Tyr Leu Val His Asn Phe Glu Glu Gly Gly
165 170 175
Gly Val Ala Met Gly Met Tyr Asn Gln Asp Lys Ser Ile Glu Asp Phe
180 185 190
Ala His Ser Ser Phe Gln Met Ala Leu Ser Lys Gly Trp Pro Leu Tyr
195 200 205
Leu Ser Thr Lys Asn Thr Ile Leu Lys Lys Tyr Asp Gly Arg Phe Lys
210 215 220
Asp Ile Phe Gln Glu Ile Tyr Asp Lys Gln Tyr Lys Ser Gln Phe Glu
225 230 235 240
Ala Gln Lys Ile Trp Tyr Glu His Arg Leu Ile Asp Asp Met Val Ala
245 250 255
Gln Ala Met Lys Ser Glu Gly Gly Phe Ile Trp Ala Cys Lys Asn Tyr
260 265 270
Asp Gly Asp Val Gln Ser Asp Ser Val Ala Gln Gly Tyr Gly Ser Leu
275 280 285
Gly Met Met Thr Ser Val Leu Val Cys Pro Asp Gly Lys Thr Val Glu
290 295 300
Ala Glu Ala Ala His Gly Thr Val Thr Arg His Tyr Arg Met Tyr Gln
305 310 315 320
Lys Gly Gln Glu Thr Ser Thr Asn Pro Ile Ala Ser Ile Phe Ala Trp
325 330 335
Thr Arg Gly Leu Ala His Arg Ala Lys Leu Asp Asn Asn Lys Glu Leu
340 345 350
Ala Phe Phe Ala Asn Ala Leu Glu Glu Val Ser Ile Glu Thr Ile Glu
355 360 365
Ala Gly Phe Met Thr Lys Asp Leu Ala Ala Cys Ile Lys Gly Leu Pro
370 375 380
Asn Val Gln Arg Ser Asp Tyr Leu Asn Thr Phe Glu Phe Met Asp Lys
385 390 395 400
Leu Gly Glu Asn Leu Lys Ile Lys Leu Ala Gln Ala Lys Leu
405 410
<210> 50
<211> 1245
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
atgtccaaaa aaatcagtgg cggttctgtg gtagagatgc aaggagatga aatgacacga 60
atcatttggg aattgattaa agagaaactc atttttccct acgtggaatt ggatctacat 120
agctatgatt taggcataga gaatcgtgat gccaccaacg accaagtcac caaggatgct 180
gcagaagcta taaagaagca taatgttggc gtcaaatgtg ccactatcac tcctgatgag 240
aagagggttg aggagttcaa gttgaaacaa atgtggaaat caccaaatgg caccatacga 300
aatattctgg gtggcacggt cttcagagaa gccattatct gcaaaaatat cccccggctt 360
gtgagtggat gggtaaaacc tatcatcata ggtcgtcatg cttatgggga tcaatacaga 420
gcaactgatt ttgttgttcc tgggcctgga aaagtagaga taacctacac accaagtgac 480
ggaacccaaa aggtgacata cctggtacat aactttgaag aaggtggtgg tgttgccatg 540
gggatgtata atcaagataa gtcaattgaa gattttgcac acagttcctt ccaaatggct 600
ctgtctaagg gttggccttt gtatctgagc accaaaaaca ctattctgaa gaaatatgat 660
gggcgtttta aagacatctt tcaggagata tatgacaagc agtacaagtc ccagtttgaa 720
gctcaaaaga tctggtatga gcataggctc atcgacgaca tggtggccca agctatgaaa 780
tcagagggag gcttcatctg ggcctgtaaa aactatgatg gtgacgtgca gtcggactct 840
gtggcccaag ggtatggctc tctcggcatg atgaccagcg tgctggtttg tccagatggc 900
aagacagtag aagcagaggc tgcccacggg actgtaaccc gtcactaccg catgtaccag 960
aaaggacagg agacgtccac caatcccatt gcttccattt ttgcctggac cagagggtta 1020
gcccacagag caaagcttga taacaataaa gagcttgcct tctttgcaaa tgctttggaa 1080
gaagtctcta ttgagacaat tgaggctggc ttcatgacca aggacttggc tgcttgcatt 1140
aaaggtttac ccaatgtgca acgttctgac tacttgaata catttgagtt catggataaa 1200
cttggagaaa acttgaagat caaactagct caggccaaac tttaa 1245
<210> 51
<211> 1245
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 51
auguccaaaa aaaucagugg cgguucugug guagagaugc aaggagauga aaugacacga 60
aucauuuggg aauugauuaa agagaaacuc auuuuucccu acguggaauu ggaucuacau 120
agcuaugauu uaggcauaga gaaucgugau gccaccaacg accaagucac caaggaugcu 180
gcagaagcua uaaagaagca uaauguuggc gucaaaugug ccacuaucac uccugaugag 240
aagaggguug aggaguucaa guugaaacaa auguggaaau caccaaaugg caccauacga 300
aauauucugg guggcacggu cuucagagaa gccauuaucu gcaaaaauau cccccggcuu 360
gugaguggau ggguaaaacc uaucaucaua ggucgucaug cuuaugggga ucaauacaga 420
gcaacugauu uuguuguucc ugggccugga aaaguagaga uaaccuacac accaagugac 480
ggaacccaaa aggugacaua ccugguacau aacuuugaag aagguggugg uguugccaug 540
gggauguaua aucaagauaa gucaauugaa gauuuugcac acaguuccuu ccaaauggcu 600
cugucuaagg guuggccuuu guaucugagc accaaaaaca cuauucugaa gaaauaugau 660
gggcguuuua aagacaucuu ucaggagaua uaugacaagc aguacaaguc ccaguuugaa 720
gcucaaaaga ucugguauga gcauaggcuc aucgacgaca ugguggccca agcuaugaaa 780
ucagagggag gcuucaucug ggccuguaaa aacuaugaug gugacgugca gucggacucu 840
guggcccaag gguauggcuc ucucggcaug augaccagcg ugcugguuug uccagauggc 900
aagacaguag aagcagaggc ugcccacggg acuguaaccc gucacuaccg cauguaccag 960
aaaggacagg agacguccac caaucccauu gcuuccauuu uugccuggac cagaggguua 1020
gcccacagag caaagcuuga uaacaauaaa gagcuugccu ucuuugcaaa ugcuuuggaa 1080
gaagucucua uugagacaau ugaggcuggc uucaugacca aggacuuggc ugcuugcauu 1140
aaagguuuac ccaaugugca acguucugac uacuugaaua cauuugaguu cauggauaaa 1200
cuuggagaaa acuugaagau caaacuagcu caggccaaac uuuaa 1245
<210> 52
<211> 303
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Met Ala Thr Ser Arg Tyr Glu Pro Val Ala Glu Ile Gly Val Gly Ala
1 5 10 15
Tyr Gly Thr Val Tyr Lys Ala Arg Asp Pro His Ser Gly His Phe Val
20 25 30
Ala Leu Lys Ser Val Arg Val Pro Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Leu Pro Ile Ser Thr Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Arg Arg Leu Glu
50 55 60
Ala Phe Glu His Pro Asn Val Val Arg Leu Met Asp Val Cys Ala Thr
65 70 75 80
Ser Arg Thr Asp Arg Glu Ile Lys Val Thr Leu Val Phe Glu His Val
85 90 95
Asp Gln Asp Leu Arg Thr Tyr Leu Asp Lys Ala Pro Pro Pro Gly Leu
100 105 110
Pro Ala Glu Thr Ile Lys Asp Leu Met Arg Gln Phe Leu Arg Gly Leu
115 120 125
Asp Phe Leu His Ala Asn Cys Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu
130 135 140
Asn Ile Leu Val Thr Ser Gly Gly Thr Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly
145 150 155 160
Leu Ala Arg Ile Tyr Ser Tyr Gln Met Ala Leu Thr Pro Val Val Val
165 170 175
Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu Leu Gln Ser Thr Tyr Ala
180 185 190
Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Ala Glu Met Phe
195 200 205
Arg Arg Lys Pro Leu Phe Cys Gly Asn Ser Glu Ala Asp Gln Leu Gly
210 215 220
Lys Ile Phe Asp Leu Ile Gly Leu Pro Pro Glu Asp Asp Trp Pro Arg
225 230 235 240
Asp Val Ser Leu Pro Arg Gly Ala Phe Pro Pro Arg Gly Pro Arg Pro
245 250 255
Val Gln Ser Val Val Pro Glu Met Glu Glu Ser Gly Ala Gln Leu Leu
260 265 270
Leu Glu Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Ser Ala Phe Arg
275 280 285
Ala Leu Gln His Ser Tyr Leu His Lys Asp Glu Gly Asn Pro Glu
290 295 300
<210> 53
<211> 912
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
atggctacct ctcgatatga gccagtggct gaaattggtg tcggtgccta tgggacagtg 60
tacaaggccc gtgatcccca cagtggccac tttgtggccc tcaagagtgt gagagtcccc 120
aatggaggag gaggtggagg aggccttccc atcagcacag ttcgtgaggt ggctttactg 180
aggcgactgg aggcttttga gcatcccaat gttgtccggc tgatggacgt ctgtgccaca 240
tcccgaactg accgggagat caaggtaacc ctggtgtttg agcatgtaga ccaggaccta 300
aggacatatc tggacaaggc acccccacca ggcttgccag ccgaaacgat caaggatctg 360
atgcgccagt ttctaagagg cctagatttc cttcatgcca attgcatcgt tcaccgagat 420
ctgaagccag agaacattct ggtgacaagt ggtggaacag tcaagctggc tgactttggc 480
ctggccagaa tctacagcta ccagatggca cttacacccg tggttgttac actctggtac 540
cgagctcccg aagttcttct gcagtccaca tatgcaacac ctgtggacat gtggagtgtt 600
ggctgtatct ttgcagagat gtttcgtcga aagcctctct tctgtggaaa ctctgaagcc 660
gaccagttgg gcaaaatctt tgacctgatt gggctgcctc cagaggatga ctggcctcga 720
gatgtatccc tgccccgtgg agcctttccc cccagagggc cccgcccagt gcagtcggtg 780
gtacctgaga tggaggagtc gggagcacag ctgctgctgg aaatgctgac ttttaaccca 840
cacaagcgaa tctctgcctt tcgagctctg cagcactctt atctacataa ggatgaaggt 900
aatccggagt ga 912
<210> 54
<211> 912
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 54
auggcuaccu cucgauauga gccaguggcu gaaauuggug ucggugccua ugggacagug 60
uacaaggccc gugaucccca caguggccac uuuguggccc ucaagagugu gagagucccc 120
aauggaggag gagguggagg aggccuuccc aucagcacag uucgugaggu ggcuuuacug 180
aggcgacugg aggcuuuuga gcaucccaau guuguccggc ugauggacgu cugugccaca 240
ucccgaacug accgggagau caagguaacc cugguguuug agcauguaga ccaggaccua 300
aggacauauc uggacaaggc acccccacca ggcuugccag ccgaaacgau caaggaucug 360
augcgccagu uucuaagagg ccuagauuuc cuucaugcca auugcaucgu ucaccgagau 420
cugaagccag agaacauucu ggugacaagu gguggaacag ucaagcuggc ugacuuuggc 480
cuggccagaa ucuacagcua ccagauggca cuuacacccg ugguuguuac acucugguac 540
cgagcucccg aaguucuucu gcaguccaca uaugcaacac cuguggacau guggaguguu 600
ggcuguaucu uugcagagau guuucgucga aagccucucu ucuguggaaa cucugaagcc 660
gaccaguugg gcaaaaucuu ugaccugauu gggcugccuc cagaggauga cuggccucga 720
gauguauccc ugccccgugg agccuuuccc cccagagggc cccgcccagu gcagucggug 780
guaccugaga uggaggaguc gggagcacag cugcugcugg aaaugcugac uuuuaaccca 840
cacaagcgaa ucucugccuu ucgagcucug cagcacucuu aucuacauaa ggaugaaggu 900
aauccggagu ga 912
<210> 55
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Met Glu Lys Asp Gly Leu Cys Arg Ala Asp Gln Gln Tyr Glu Cys Val
1 5 10 15
Ala Glu Ile Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Lys Val Phe Lys Ala Arg Asp
20 25 30
Leu Lys Asn Gly Gly Arg Phe Val Ala Leu Lys Arg Val Arg Val Gln
35 40 45
Thr Gly Glu Glu Gly Met Pro Leu Ser Thr Ile Arg Glu Val Ala Val
50 55 60
Leu Arg His Leu Glu Thr Phe Glu His Pro Asn Val Val Arg Leu Phe
65 70 75 80
Asp Val Cys Thr Val Ser Arg Thr Asp Arg Glu Thr Lys Leu Thr Leu
85 90 95
Val Phe Glu His Val Asp Gln Asp Leu Thr Thr Tyr Leu Asp Lys Val
100 105 110
Pro Glu Pro Gly Val Pro Thr Glu Thr Ile Lys Asp Met Met Phe Gln
115 120 125
Leu Leu Arg Gly Leu Asp Phe Leu His Ser His Arg Val Val His Arg
130 135 140
Asp Leu Lys Pro Gln Asn Ile Leu Val Thr Ser Ser Gly Gln Ile Lys
145 150 155 160
Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ile Tyr Ser Phe Gln Met Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Val Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu Leu
180 185 190
Gln Ser Ser Tyr Ala Thr Pro Val Asp Leu Trp Ser Val Gly Cys Ile
195 200 205
Phe Ala Glu Met Phe Arg Arg Lys Pro Leu Phe Arg Gly Ser Ser Asp
210 215 220
Val Asp Gln Leu Gly Lys Ile Leu Asp Val Ile Gly Leu Pro Gly Glu
225 230 235 240
Glu Asp Trp Pro Arg Asp Val Ala Leu Pro Arg Gln Ala Phe His Ser
245 250 255
Lys Ser Ala Gln Pro Ile Glu Lys Phe Val Thr Asp Ile Asp Glu Leu
260 265 270
Gly Lys Asp Leu Leu Leu Lys Cys Leu Thr Phe Asn Pro Ala Lys Arg
275 280 285
Ile Ser Ala Tyr Ser Ala Leu Ser His Pro Tyr Phe Gln Asp Leu Glu
290 295 300
Arg Cys Lys Glu Asn Leu Asp Ser His Leu Pro Pro Ser Gln Asn Thr
305 310 315 320
Ser Glu Leu Asn Thr Ala
325
<210> 56
<211> 981
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
atggagaagg acggcctgtg ccgcgctgac cagcagtacg aatgcgtggc ggagatcggg 60
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gtcgatcaag acttgaccac ttacttggat aaagttccag agcctggagt gcccactgaa 360
accataaagg atatgatgtt tcagcttctc cgaggtctgg actttcttca ttcacaccga 420
gtagtgcatc gcgatctaaa accacagaac attctggtga ccagcagcgg acaaataaaa 480
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ccaattgaga agtttgtaac agatatcgat gaactaggca aagacctact tctgaagtgt 840
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tcggagctga atacagcctg a 981
<210> 57
<211> 981
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
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gucgaucaag acuugaccac uuacuuggau aaaguuccag agccuggagu gcccacugaa 360
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caggaccugg aaaggugcaa agaaaaccug gauucccacc ugccgcccag ccagaacacc 960
ucggagcuga auacagccug a 981
<210> 58
<211> 1210
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
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Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
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Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
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<210> 59
<211> 3633
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60
gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120
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gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240
accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300
ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360
gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta 420
caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag 480
agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540
cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg 600
ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc 660
gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc 720
acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc 780
aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac 840
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gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 960
gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagtgcgaa gggccttgcc gcaaagtgtg taacggaata 1020
ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 1080
aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc 1140
ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 1200
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gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 1320
gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380
gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440
tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500
gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 1560
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cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680
gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740
cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800
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cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 1980
gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg 2040
aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac 2100
caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160
ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt 2220
cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc 2280
gatgaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc 2340
tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac 2400
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<211> 3633
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 60
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guccuuggga auuuggaaau uaccuaugug cagaggaauu augaucuuuc cuucuuaaag 240
accauccagg agguggcugg uuauguccuc auugcccuca acacagugga gcgaauuccu 300
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gugacagauc acggcucgug cguccgagcc uguggggccg acagcuauga gauggaggaa 960
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caagcucucu ugaggaucuu gaaggaaacu gaauucaaaa agaucaaagu gcugggcucc 2160
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cccgucgcua ucaaggaauu aagagaagca acaucuccga aagccaacaa ggaaauccuc 2280
gaugaagccu acgugauggc cagcguggac aacccccacg ugugccgccu gcugggcauc 2340
ugccucaccu ccaccgugca gcucaucacg cagcucaugc ccuucggcug ccuccuggac 2400
uauguccggg aacacaaaga caauauuggc ucccaguacc ugcucaacug gugugugcag 2460
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aucgaugucu acaugaucau ggucaagugc uggaugauag acgcagauag ucgcccaaag 2880
uuccgugagu ugaucaucga auucuccaaa auggcccgag acccccagcg cuaccuuguc 2940
auucaggggg augaaagaau gcauuugcca aguccuacag acuccaacuu cuaccgugcc 3000
cugauggaug aagaagacau ggacgacgug guggaugccg acgaguaccu caucccacag 3060
cagggcuucu ucagcagccc cuccacguca cggacucccc uccugagcuc ucugagugca 3120
accagcaaca auuccaccgu ggcuugcauu gauagaaaug ggcugcaaag cugucccauc 3180
aaggaagaca gcuucuugca gcgauacagc ucagacccca caggcgccuu gacugaggac 3240
agcauagacg acaccuuccu cccagugccu gaauacauaa accaguccgu ucccaaaagg 3300
cccgcuggcu cugugcagaa uccugucuau cacaaucagc cucugaaccc cgcgcccagc 3360
agagacccac acuaccagga cccccacagc acugcagugg gcaaccccga guaucucaac 3420
acuguccagc ccaccugugu caacagcaca uucgacagcc cugcccacug ggcccagaaa 3480
ggcagccacc aaauuagccu ggacaacccu gacuaccagc aggacuucuu ucccaaggaa 3540
gccaagccaa auggcaucuu uaagggcucc acagcugaaa augcagaaua ccuaaggguc 3600
gcgccacaaa gcagugaauu uauuggagca uga 3633
<210> 61
<211> 2549
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser
1 5 10 15
Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Lys Ser Arg
20 25 30
Asn Glu Glu Thr Arg Ala Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gln His Tyr Val
35 40 45
Thr Met Glu Leu Arg Glu Met Ser Gln Glu Glu Ser Thr Arg Phe Tyr
50 55 60
Asp Gln Leu Asn His His Ile Phe Glu Leu Val Ser Ser Ser Asp Ala
65 70 75 80
Asn Glu Arg Lys Gly Gly Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Ile Gly Val
85 90 95
Glu Gly Gly Asn Ala Thr Arg Ile Gly Arg Phe Ala Asn Tyr Leu Arg
100 105 110
Asn Leu Leu Pro Ser Asn Asp Pro Val Val Met Glu Met Ala Ser Lys
115 120 125
Ala Ile Gly Arg Leu Ala Met Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu Tyr
130 135 140
Val Glu Phe Glu Val Lys Arg Ala Leu Glu Trp Leu Gly Ala Asp Arg
145 150 155 160
Asn Glu Gly Arg Arg His Ala Ala Val Leu Val Leu Arg Glu Leu Ala
165 170 175
Ile Ser Val Pro Thr Phe Phe Phe Gln Gln Val Gln Pro Phe Phe Asp
180 185 190
Asn Ile Phe Val Ala Val Trp Asp Pro Lys Gln Ala Ile Arg Glu Gly
195 200 205
Ala Val Ala Ala Leu Arg Ala Cys Leu Ile Leu Thr Thr Gln Arg Glu
210 215 220
Pro Lys Glu Met Gln Lys Pro Gln Trp Tyr Arg His Thr Phe Glu Glu
225 230 235 240
Ala Glu Lys Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Lys Glu Lys Gly Met Asn
245 250 255
Arg Asp Asp Arg Ile His Gly Ala Leu Leu Ile Leu Asn Glu Leu Val
260 265 270
Arg Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Glu Met Glu Glu
275 280 285
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Gly Phe Gly Thr Lys Pro Arg His Ile Thr Pro Phe Thr Ser Phe Gln
305 310 315 320
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325 330 335
Ser Ser His Gln Gly Leu Met Gly Phe Gly Thr Ser Pro Ser Pro Ala
340 345 350
Lys Ser Thr Leu Val Glu Ser Arg Cys Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu
355 360 365
Lys Phe Asp Gln Val Cys Gln Trp Val Leu Lys Cys Arg Asn Ser Lys
370 375 380
Asn Ser Leu Ile Gln Met Thr Ile Leu Asn Leu Leu Pro Arg Leu Ala
385 390 395 400
Ala Phe Arg Pro Ser Ala Phe Thr Asp Thr Gln Tyr Leu Gln Asp Thr
405 410 415
Met Asn His Val Leu Ser Cys Val Lys Lys Glu Lys Glu Arg Thr Ala
420 425 430
Ala Phe Gln Ala Leu Gly Leu Leu Ser Val Ala Val Arg Ser Glu Phe
435 440 445
Lys Val Tyr Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Lys Asp Phe Ala His Lys Arg Gln Lys Ala Met Gln Val Asp Ala
465 470 475 480
Thr Val Phe Thr Cys Ile Ser Met Leu Ala Arg Ala Met Gly Pro Gly
485 490 495
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500 505 510
Leu Ser Pro Ala Leu Thr Ala Val Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Ile
515 520 525
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Leu Val Leu Met His Lys Pro Leu Arg His Pro Gly Met Pro Lys Gly
545 550 555 560
Leu Ala His Gln Leu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Thr Leu Pro Glu Ala
565 570 575
Ser Asp Val Gly Ser Ile Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Phe
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Glu Phe Glu Gly His Ser Leu Thr Gln Phe Val Arg His Cys Ala Asp
595 600 605
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Thr Cys Ser Arg Leu Leu Thr Pro Ser Ile His Leu Ile Ser Gly His
625 630 635 640
Ala His Val Val Ser Gln Thr Ala Val Gln Val Val Ala Asp Val Leu
645 650 655
Ser Lys Leu Leu Val Val Gly Ile Thr Asp Pro Asp Pro Asp Ile Arg
660 665 670
Tyr Cys Val Leu Ala Ser Leu Asp Glu Arg Phe Asp Ala His Leu Ala
675 680 685
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Met Asn Pro Ala Phe Val Met Pro Phe Leu Arg Lys Met Leu Ile Gln
725 730 735
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Ser Ala Arg Met Leu Gly His Leu Val Ser Asn Ala Pro Arg Leu Ile
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Thr Ile Gly Glu Leu Ala Gln Val Ser Gly Leu Glu Met Arg Lys Trp
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Val Asp Glu Leu Phe Ile Ile Ile Met Asp Met Leu Gln Asp Ser Ser
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Leu Glu Val Leu Leu Asn Phe Leu Lys Thr Glu Gln Asn Gln Gly Thr
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Arg Arg Glu Ala Ile Arg Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Asp Pro
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Ala Leu Val Ala Tyr Asp Lys Lys Met Asp Thr Asn Lys Asp Asp
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Ala Ala Trp Gly Leu Gly Gln Trp Asp Ser Met Glu Glu Tyr Thr
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Cys Met Ile Pro Arg Asp Thr His Asp Gly Ala Phe Tyr Arg Ala
1535 1540 1545
Val Leu Ala Leu His Gln Asp Leu Phe Ser Leu Ala Gln Gln Cys
1550 1555 1560
Ile Asp Lys Ala Arg Asp Leu Leu Asp Ala Glu Leu Thr Ala Met
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Ala Gly Glu Ser Tyr Ser Arg Ala Tyr Gly Ala Met Val Ser Cys
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Ala Tyr Met Lys Asn Met Trp Lys Ser Ala Arg Lys Ile Asp Ala
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His Lys Leu Met Ala Arg Cys Phe Leu Lys Leu Gly Glu Trp Gln
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Ala Trp His Ala Trp Ala Val Met Asn Phe Glu Ala Val Leu His
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Tyr Lys His Gln Asn Gln Ala Arg Asp Glu Lys Lys Lys Leu Arg
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Pro Leu Gln Lys Lys Val Thr Glu Asp Leu Ser Lys Thr Leu Leu
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Met Tyr Thr Val Pro Ala Val Gln Gly Phe Phe Arg Ser Ile Ser
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Leu Ser Arg Gly Asn Asn Leu Gln Asp Thr Leu Arg Val Leu Thr
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Leu Trp Phe Asp Tyr Gly His Trp Pro Asp Val Asn Glu Ala Leu
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Val Glu Gly Val Lys Ala Ile Gln Ile Asp Thr Trp Leu Gln Val
1925 1930 1935
Ile Pro Gln Leu Ile Ala Arg Ile Asp Thr Pro Arg Pro Leu Val
1940 1945 1950
Gly Arg Leu Ile His Gln Leu Leu Thr Asp Ile Gly Arg Tyr His
1955 1960 1965
Pro Gln Ala Leu Ile Tyr Pro Leu Thr Val Ala Ser Lys Ser Thr
1970 1975 1980
Thr Thr Ala Arg His Asn Ala Ala Asn Lys Ile Leu Lys Asn Met
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Cys Glu His Ser Asn Thr Leu Val Gln Gln Ala Met Met Val Ser
2000 2005 2010
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2015 2020 2025
Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn
2030 2035 2040
Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met
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Cys Gln Cys Tyr Ile Gly Trp Cys Pro Phe Trp
2540 2545
<210> 62
<211> 7650
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 62
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gtcctgcagc agtttgccag tggcctaaag agccggaatg aggaaaccag ggccaaagcc 120
gccaaggagc tccagcacta tgtcaccatg gaactccgag agatgagtca agaggagtct 180
actcgcttct atgaccaact gaaccatcac atttttgaat tggtttccag ctcagatgcc 240
aatgagagga aaggtggcat cttggccata gctagcctca taggagtgga aggtgggaat 300
gccacccgaa ttggcagatt tgccaactat cttcggaacc tcctcccctc caatgaccca 360
gttgtcatgg aaatggcatc caaggccatt ggccgtcttg ccatggcagg ggacactttt 420
accgctgagt acgtggaatt tgaggtgaag cgagccctgg aatggctggg tgctgaccgc 480
aatgagggcc ggagacatgc agctgtcctg gttctccgtg agctggccat cagcgtccct 540
accttcttct tccagcaagt gcaacccttc tttgacaaca tttttgtggc cgtgtgggac 600
cccaaacagg ccatccgtga gggagctgta gccgcccttc gtgcctgtct gattctcaca 660
acccagcgtg agccgaagga gatgcagaag cctcagtggt acaggcacac atttgaagaa 720
gcagagaagg gatttgatga gaccttggcc aaagagaagg gcatgaatcg ggatgatcgg 780
atccatggag ccttgttgat ccttaacgag ctggtccgaa tcagcagcat ggagggagag 840
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caatttgttc gccactgtgc ggatcatttc ctgaacagtg agcacaagga gatccgcatg 1860
gaggctgccc gcacctgctc ccgcctgctc acaccctcca tccacctcat cagtggccat 1920
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gtagttggga taacagatcc tgaccctgac attcgctact gtgtcttggc gtccctggac 2040
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gtctccaatg ccccccgact catccgcccc tacatggagc ctattctgaa ggcattaatt 2340
ttgaaactga aagatccaga ccctgatcca aacccaggtg tgatcaataa tgtcctggca 2400
acaataggag aattggcaca ggttagtggc ctggaaatga ggaaatgggt tgatgaactt 2460
tttattatca tcatggacat gctccaggat tcctctttgt tggccaaaag gcaggtggct 2520
ctgtggaccc tgggacagtt ggtggccagc actggctatg tagtagagcc ctacaggaag 2580
taccctactt tgcttgaggt gctactgaat tttctgaaga ctgagcagaa ccagggtaca 2640
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cgaacactgg accagagccc agaactgcgc tccacagcca tggacacgct gtcttcactt 3540
gtttttcagc tggggaagaa gtaccaaatt ttcattccaa tggtgaataa agttctggtg 3600
cgacaccgaa tcaatcatca gcgctatgat gtgctcatct gcagaattgt caagggatac 3660
acacttgctg atgaagagga ggatcctttg atttaccagc atcggatgct taggagtggc 3720
caaggggatg cattggctag tggaccagtg gaaacaggac ccatgaagaa actgcacgtc 3780
agcaccatca acctccaaaa ggcctggggc gctgccagga gggtctccaa agatgactgg 3840
ctggaatggc tgagacggct gagcctggag ctgctgaagg actcatcatc gccctccctg 3900
cgctcctgct gggccctggc acaggcctac aacccgatgg ccagggatct cttcaatgct 3960
gcatttgtgt cctgctggtc tgaactgaat gaagatcaac aggatgagct catcagaagc 4020
atcgagttgg ccctcacctc acaagacatc gctgaagtca cacagaccct cttaaacttg 4080
gctgaattca tggaacacag tgacaagggc cccctgccac tgagagatga caatggcatt 4140
gttctgctgg gtgagagagc tgccaagtgc cgagcatatg ccaaagcact acactacaaa 4200
gaactggagt tccagaaagg ccccacccct gccattctag aatctctcat cagcattaat 4260
aataagctac agcagccgga ggcagcggcc ggagtgttag aatatgccat gaaacacttt 4320
ggagagctgg agatccaggc tacctggtat gagaaactgc acgagtggga ggatgccctt 4380
gtggcctatg acaagaaaat ggacaccaac aaggacgacc cagagctgat gctgggccgc 4440
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tggaccctgg ttaatgatga gacccaagcc aagatggccc ggatggctgc tgcagctgca 4560
tggggtttag gtcagtggga cagcatggaa gaatacacct gtatgatccc tcgggacacc 4620
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caacagtgca ttgacaaggc cagggacctg ctggatgctg aattaactgc gatggcagga 4740
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ggcaagagtg gcaggctggc tcttgctcat aaaactttag tgttgctcct gggagttgat 5040
ccgtctcggc aacttgacca tcctctgcca acagttcacc ctcaggtgac ctatgcctac 5100
atgaaaaaca tgtggaagag tgcccgcaag atcgatgcct tccagcacat gcagcatttt 5160
gtccagacca tgcagcaaca ggcccagcat gccatcgcta ctgaggacca gcagcataag 5220
caggaactgc acaagctcat ggcccgatgc ttcctgaaac ttggagagtg gcagctgaat 5280
ctacagggca tcaatgagag cacaatcccc aaagtgctgc agtactacag cgccgccaca 5340
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accccatcgc cgctgcagaa gaaggtcact gaggatctgt ccaaaaccct cctgatgtac 5640
acggtgcctg ccgtccaggg cttcttccgt tccatctcct tgtcacgagg caacaacctc 5700
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gaggccttag tggagggggt gaaagccatc cagattgata cctggctaca ggttatacct 5820
cagctcattg caagaattga tacgcccaga cccttggtgg gacgtctcat tcaccagctt 5880
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gttccaacgc aagttgagct gctcatcaaa caagcgacat cccatgaaaa cctctgccag 7620
tgctatattg gctggtgccc tttctggtaa 7650
<210> 63
<211> 7650
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 63
augcuuggaa ccggaccugc cgccgccacc accgcugcca ccacaucuag caaugugagc 60
guccugcagc aguuugccag uggccuaaag agccggaaug aggaaaccag ggccaaagcc 120
gccaaggagc uccagcacua ugucaccaug gaacuccgag agaugaguca agaggagucu 180
acucgcuucu augaccaacu gaaccaucac auuuuugaau ugguuuccag cucagaugcc 240
aaugagagga aagguggcau cuuggccaua gcuagccuca uaggagugga aggugggaau 300
gccacccgaa uuggcagauu ugccaacuau cuucggaacc uccuccccuc caaugaccca 360
guugucaugg aaauggcauc caaggccauu ggccgucuug ccauggcagg ggacacuuuu 420
accgcugagu acguggaauu ugaggugaag cgagcccugg aauggcuggg ugcugaccgc 480
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gcagagaagg gauuugauga gaccuuggcc aaagagaagg gcaugaaucg ggaugaucgg 780
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cgucugagag aagaaaugga agaaaucaca cagcagcagc ugguacacga caaguacugc 900
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ggccucaugg gauuugggac cucccccagu ccagcuaagu ccacccuggu ggagagccgg 1080
uguugcagag acuugaugga ggagaaauuu gaucaggugu gccagugggu gcugaaaugc 1140
aggaauagca agaacucgcu gauccaaaug acaauccuua auuuguugcc ccgcuuggcu 1200
gcauuccgac cuucugccuu cacagauacc caguaucucc aagauaccau gaaccauguc 1260
cuaagcugug ucaagaagga gaaggaacgu acagcggccu uccaagcccu ggggcuacuu 1320
ucuguggcug ugaggucuga guuuaagguc uauuugccuc gcgugcugga caucauccga 1380
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cucuacgacc ugagccguca gauuccacag cuaaagaagg acauucaaga ugggcuacug 1620
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caaggggaug cauuggcuag uggaccagug gaaacaggac ccaugaagaa acugcacguc 3780
agcaccauca accuccaaaa ggccuggggc gcugccagga gggucuccaa agaugacugg 3840
cuggaauggc ugagacggcu gagccuggag cugcugaagg acucaucauc gcccucccug 3900
cgcuccugcu gggcccuggc acaggccuac aacccgaugg ccagggaucu cuucaaugcu 3960
gcauuugugu ccugcugguc ugaacugaau gaagaucaac aggaugagcu caucagaagc 4020
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ggagagcugg agauccaggc uaccugguau gagaaacugc acgaguggga ggaugcccuu 4380
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aagcugcugu ggcugaaaag ccccagcucc gagguguggu uugaccgaag aaccaauuau 6960
acccguucuu uagcggucau gucaaugguu ggguauauuu uaggccuggg agauagacac 7020
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<210> 64
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 65
<211> 567
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 65
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cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540
tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567
<210> 66
<211> 567
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
augacugaau auaaacuugu gguaguugga gcugguggcg uaggcaagag ugccuugacg 60
auacagcuaa uucagaauca uuuuguggac gaauaugauc caacaauaga ggauuccuac 120
aggaagcaag uaguaauuga uggagaaacc ugucucuugg auauucucga cacagcaggu 180
caagaggagu acagugcaau gagggaccag uacaugagga cuggggaggg cuuucuuugu 240
guauuugcca uaaauaauac uaaaucauuu gaagauauuc accauuauag agaacaaauu 300
aaaagaguua aggacucuga agauguaccu augguccuag uaggaaauaa augugauuug 360
ccuucuagaa caguagacac aaaacaggcu caggacuuag caagaaguua uggaauuccu 420
uuuauugaaa caucagcaaa gacaagacag gguguugaug augccuucua uacauuaguu 480
cgagaaauuc gaaaacauaa agaaaagaug agcaaagaug guaaaaagaa gaaaaagaag 540
ucaaagacaa aguguguaau uauguaa 567
<210> 67
<211> 162
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 68
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys
1 5 10 15
Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
20 25 30
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
35 40 45
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
50 55 60
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
65 70 75 80
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
100 105 110
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
115 120 125
Phe Ile Asn Thr Ser
130
<210> 69
<211> 858
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 69
atgttccatc atgttccatg ctgctgacgt cacatggagc acagaaatca atgttagcag 60
atagccagcc catacaagat cgtattgtat tgtaggaggc attgtggatg gatggctgct 120
ggaaacccct tgccatagcc agctcttctt caatacttaa ggatttaccg tggctttgag 180
taatgagaat ttcgaaacca catttgagaa gtatttccat ccagtgctac ttgtgtttac 240
ttctaaacag tcattttcta actgaagctg gcattcatgt cttcattttg ggctgtttca 300
gtgcagggct tcctaaaaca gaagccaact gggtgaatgt aataagtgat ttgaaaaaaa 360
ttgaagatct tattcaatct atgcatattg atgctacttt atatacggaa agtgatgttc 420
accccagttg caaagtaaca gcaatgaagt gctttctctt ggagttacaa gttatttcac 480
ttgagtccgg agatgcaagt attcatgata cagtagaaaa tctgatcatc ctagcaaaca 540
acagtttgtc ttctaatggg aatgtaacag aatctggatg caaagaatgt gaggaactgg 600
aggaaaaaaa tattaaagaa tttttgcaga gttttgtaca tattgtccaa atgttcatca 660
acacttcttg attgcaattg attcttttta aagtgtttct gttattaaca aacatcactc 720
tgctgcttag acataacaaa acactcggca tttcaaatgt gctgtcaaaa caagtttttc 780
tgtcaagaag atgatcagac cttggatcag atgaactctt agaaatgaag gcagaaaaat 840
gtcattgagt aatatagt 858
<210> 70
<211> 417
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln
20 25 30
Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro
35 40 45
Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu
50 55 60
Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln
65 70 75 80
Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly
100 105 110
Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe
115 120 125
Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys
130 135 140
Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro
145 150 155 160
Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln
165 170 175
Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val
180 185 190
Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu
195 200 205
Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu
210 215 220
His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr
245 250 255
Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro
260 265 270
Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro
275 280 285
Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys
290 295 300
Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala
305 310 315 320
Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu
325 330 335
His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala Ile Ile Phe Leu Val Leu Gly Ile
340 345 350
Leu Val Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Ile Tyr Phe Tyr Trp Ser
355 360 365
Lys Cys Ser Arg Glu Val Leu Trp His Cys His Leu Cys Pro Ser Ser
370 375 380
Thr Glu His Ala Ser Ala Ser Ala Asn Gly His Val Ser Tyr Ser Ala
385 390 395 400
Val Ser Arg Glu Asn Ser Ser Ser Gln Asp Pro Gln Thr Glu Gly Thr
405 410 415
Arg
<210> 71
<211> 1254
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 71
atggcccgag ccatggccgc cgcgtggccg ctgctgctgg tggcgctact ggtgctgtcc 60
tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc 120
ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat 180
gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa 240
acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc 300
gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac 360
tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga 420
gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca 480
gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac 540
tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc 600
actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc 660
tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg 720
tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat 780
gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc 840
acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt 900
cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 960
cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020
tcccgtaacg ccatcatctt cctggttctg ggaatcctgg tttttctgat cctgctgggg 1080
atcgggattt atttctattg gtccaaatgt tcccgtgagg tcctttggca ctgtcatctg 1140
tgtccctcga gtacagagca tgccagcgcc tcagctaatg ggcatgtctc ctattcagct 1200
gtgagcagag agaacagctc ttcccaggat ccacagacag agggcacaag gtga 1254
<210> 72
<211> 1254
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 72
auggcccgag ccauggccgc cgcguggccg cugcugcugg uggcgcuacu ggugcugucc 60
uggccacccc caggaaccgg ggacgucguc gugcaggcgc ccacccaggu gcccggcuuc 120
uugggcgacu ccgugacgcu gcccugcuac cuacaggugc ccaacaugga ggugacgcau 180
gugucacagc ugacuugggc gcggcauggu gaaucuggca gcauggccgu cuuccaccaa 240
acgcagggcc ccagcuauuc ggaguccaaa cggcuggaau ucguggcagc cagacugggc 300
gcggagcugc ggaaugccuc gcugaggaug uucggguugc gcguagagga ugaaggcaac 360
uacaccugcc uguucgucac guucccgcag ggcagcagga gcguggauau cuggcuccga 420
gugcuugcca agccccagaa cacagcugag guucagaagg uccagcucac uggagagcca 480
gugcccaugg cccgcugcgu cuccacaggg ggucgcccgc cagcccaaau caccuggcac 540
ucagaccugg gcgggaugcc caauacgagc caggugccag gguuccuguc uggcacaguc 600
acugucacca gccucuggau auuggugccc ucaagccagg uggacggcaa gaaugugacc 660
ugcaaggugg agcacgagag cuuugagaag ccucagcugc ugacugugaa ccucaccgug 720
uacuaccccc cagagguauc caucucuggc uaugauaaca acugguaccu uggccagaau 780
gaggccaccc ugaccugcga ugcucgcagc aacccagagc ccacaggcua uaauuggagc 840
acgaccaugg guccccugcc acccuuugcu guggcccagg gcgcccagcu ccugauccgu 900
ccuguggaca aaccaaucaa cacaacuuua aucugcaacg ucaccaaugc ccuaggagcu 960
cgccaggcag aacugaccgu ccaggucaaa gagggaccuc ccagugagca cucaggcaug 1020
ucccguaacg ccaucaucuu ccugguucug ggaauccugg uuuuucugau ccugcugggg 1080
aucgggauuu auuucuauug guccaaaugu ucccgugagg uccuuuggca cugucaucug 1140
ugucccucga guacagagca ugccagcgcc ucagcuaaug ggcaugucuc cuauucagcu 1200
gugagcagag agaacagcuc uucccaggau ccacagacag agggcacaag guga 1254
<210> 73
<211> 290
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 74
<211> 873
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 74
atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60
gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120
aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180
gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240
tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300
atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360
gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420
attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480
cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540
accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600
acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660
acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720
ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780
ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840
aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taa 873
<210> 75
<211> 873
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 75
augaggauau uugcugucuu uauauucaug accuacuggc auuugcugaa cgcauuuacu 60
gucacgguuc ccaaggaccu auauguggua gaguauggua gcaauaugac aauugaaugc 120
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gauaagaaca uuauucaauu ugugcaugga gaggaagacc ugaagguuca gcauaguagc 240
uacagacaga gggcccggcu guugaaggac cagcucuccc ugggaaaugc ugcacuucag 300
aucacagaug ugaaauugca ggaugcaggg guguaccgcu gcaugaucag cuaugguggu 360
gccgacuaca agcgaauuac ugugaaaguc aaugccccau acaacaaaau caaccaaaga 420
auuuugguug uggauccagu caccucugaa caugaacuga caugucaggc ugagggcuac 480
cccaaggccg aagucaucug gacaagcagu gaccaucaag uccugagugg uaagaccacc 540
accaccaauu ccaagagaga ggagaagcuu uucaauguga ccagcacacu gagaaucaac 600
acaacaacua augagauuuu cuacugcacu uuuaggagau uagauccuga ggaaaaccau 660
acagcugaau uggucauccc agaacuaccu cuggcacauc cuccaaauga aaggacucac 720
uugguaauuc ugggagccau cuuauuaugc cuugguguag cacugacauu caucuuccgu 780
uuaagaaaag ggagaaugau ggaugugaaa aaauguggca uccaagauac aaacucaaag 840
aagcaaagug auacacauuu ggaggagacg uaa 873
<210> 76
<211> 454
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met
1 5 10 15
Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp
20 25 30
Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln
35 40 45
Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile
50 55 60
Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg
65 70 75 80
Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser
85 90 95
Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp
100 105 110
Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln
115 120 125
Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile
130 135 140
Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val
145 150 155 160
Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser
165 170 175
Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr
180 185 190
Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val
195 200 205
Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala
210 215 220
Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser
225 230 235 240
Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His
245 250 255
Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu
260 265 270
Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro
275 280 285
Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys
290 295 300
Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His
305 310 315 320
Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala
325 330 335
Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser
340 345 350
Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn
355 360 365
Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu
370 375 380
Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu
385 390 395 400
Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala
405 410 415
Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
420 425 430
Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln
435 440 445
Leu Arg Asn Ser Cys Ala
450
<210> 77
<211> 1365
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 77
atggattttt ttcgggtagt ggaaaaccag cagcctcccg cgacgatgcc cctcaacgtt 60
agcttcacca acaggaacta tgacctcgac tacgactcgg tgcagccgta tttctactgc 120
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ggccacagca aacctcctca cagcccactg gtcctcaaga ggtgccacgt ctccacacat 960
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<210> 78
<211> 1365
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 78
auggauuuuu uucggguagu ggaaaaccag cagccucccg cgacgaugcc ccucaacguu 60
agcuucacca acaggaacua ugaccucgac uacgacucgg ugcagccgua uuucuacugc 120
gacgaggagg agaacuucua ccagcagcag cagcagagcg agcugcagcc cccggcgccc 180
agcgaggaua ucuggaagaa auucgagcug cugcccaccc cgccccuguc cccuagccgc 240
cgcuccgggc ucugcucgcc cuccuacguu gcggucacac ccuucucccu ucggggagac 300
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ucagagaagc uggccuccua ccaggcugcg cgcaaagaca gcggcagccc gaaccccgcc 540
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ucagagugca ucgaccccuc gguggucuuc cccuacccuc ucaacgacag cagcucgccc 660
aaguccugcg ccucgcaaga cuccagcgcc uucucuccgu ccucggauuc ucugcucucc 720
ucgacggagu ccuccccgca gggcagcccc gagccccugg ugcuccauga ggagacaccg 780
cccaccacca gcagcgacuc ugaggaggaa caagaagaug aggaagaaau cgauguuguu 840
ucuguggaaa agaggcaggc uccuggcaaa aggucagagu cuggaucacc uucugcugga 900
ggccacagca aaccuccuca cagcccacug guccucaaga ggugccacgu cuccacacau 960
cagcacaacu acgcagcgcc ucccuccacu cggaaggacu auccugcugc caagaggguc 1020
aaguuggaca gugucagagu ccugagacag aucagcaaca accgaaaaug caccagcccc 1080
agguccucgg acaccgagga gaaugucaag aggcgaacac acaacgucuu ggagcgccag 1140
aggaggaacg agcuaaaacg gagcuuuuuu gcccugcgug accagauccc ggaguuggaa 1200
aacaaugaaa aggcccccaa gguaguuauc cuuaaaaaag ccacagcaua cauccugucc 1260
guccaagcag aggagcaaaa gcucauuucu gaagaggacu uguugcggaa acgacgagaa 1320
caguugaaac acaaacuuga acagcuacgg aacucuugug cguaa 1365
<210> 79
<211> 177
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His
<210> 80
<211> 152
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
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Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
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<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 98
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccgcatg ccaccatgtt ccacgtgtcc ttccggtaca tcttcggcct gcctccactg 420
atcctggtgc tgctgcctgt ggccagcagc gactgtgata tcgagggcaa agacggcaag 480
cagtacgaga gcgtgctgat ggtgtccatc gaccagctgc tggacagcat gaaggaaatc 540
ggcagcaact gcctgaacaa cgagttcaac ttcttcaagc ggcacatctg cgacgccaac 600
aaagaaggca tgttcctgtt cagagccgcc agaaagctgc ggcagttcct gaagatgaac 660
agcaccggcg acttcgacct gcatctgctg aaagtgtctg agggcaccac catcctgctg 720
aattgcaccg gccaagtgaa gggcagaaag cctgctgctc tgggagaagc ccagcctacc 780
aagagcctgg aagagaacaa gtccctgaaa gagcagaaga agctgaacga cctctgcttc 840
ctgaagcggc tgctgcaaga gatcaagacc tgctggaaca agatcctgat gggcaccaaa 900
gaacactgaa tagtgagtcg tattaacgta ccaacaagaa ggttcagcat agtagctaac 960
ttgtagctac tatgctgaac cttctttatc ttagaggcat atccctacgt accaacaagc 1020
gaattactgt gaaagtcaaa cttgttgact ttcacagtaa ttcgctttat cttagaggca 1080
tatccctacg taccaacaag accagcacac tgagaatcaa acttgttgat tctcagtgtg 1140
ctggtcttta tcttagaggc atatcccttt tatcttagag gcatatccct ctgggcctca 1200
tgggccttcc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 1260
catggtcata gctgtttcct tgcgtattgg gcgctctccg cttcctcgct cactgactcg 1320
ctgcgctcgg tcgttcgggt aaagcctggg gtgcctaatg agcaaaaggc cagcaaaagg 1380
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 1440
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 1500
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 1560
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 1620
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 1680
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 1740
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 1800
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 1860
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 1920
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 1980
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 2040
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 2100
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 2160
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 2220
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 2280
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaacc acgctcaccg gctccagatt 2340
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 2400
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 2460
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 2520
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 2580
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 2640
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 2700
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 2760
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 2820
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 2880
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 2940
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 3000
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 3060
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 3120
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 3162
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 99
gctgcaaggc gattaagttg 20
<210> 100
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
primer"
<400> 100
uuuttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
cagctatgac catgttaatg cag 143
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 101
gctctgtcta agggttggcc 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 102
ccatgtcgtc gatgagccta 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 103
gagtccccaa tggaggagga 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 104
tccatcagcc ggacaacatt 20
<210> 105
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 105
gcagaccggc gaggag 16
<210> 106
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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primer"
<400> 106
ctgttcgtga cactgtgca 19
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 107
tacctcatcc cacagcagg 19
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 108
gctgtcttcc ttgatgggac 20
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 109
gtacagtgca atgagggacc a 21
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 110
cacaaagaaa gccctcccca 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 111
catgcatgac aacagcccag 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 112
agcttcaggg gcatcaaaca 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 113
ttgccttgct gctctacctc 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 114
ggagggcaga atcatcacga 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 115
cccaaatcac ctggcactca 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 116
ctcaaagctc tcgtgctcca 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 117
gttgaaggac cagctctccc 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 118
cttgtagtcg gcaccaccat 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 119
actgtatgtg gagcggcttc 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 120
caggtacaag ctggaggtgg 20
<210> 121
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 121
acccgttgaa ccccattcgt ga 22
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 122
gcctcactaa accatccaat cgg 23
<210> 123
<211> 1848
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 123
cctcgcacgc actgcgggct ccggcgctgc gggctggccg ggcgctgcgg gctgaccggg 60
cgctccggga actcggctcg ggaacctcgt ctgcggtggg cggggccggc ccggagcccc 120
gccccggctc agtccctgaa acccaggcgc ggaccggctg cagtctcaga agggagctgc 180
tgtctgcgga ggaaactgca tcgacggacg gccgcccagc tacgggagga cctggagtgg 240
cactgggcgc ccgacggacc atccccggga cccgcctgcc cctcggcgcc ccgccccgcc 300
gggccgctcc ccgtcgggtt ccccagccac agccttacct acgggctcct gactccgcaa 360
ggcttccaga agatgctcga accaccggcc ggggcctcgg ggcagcagtg agggaggcgt 420
ccagcccccc actcagctct tctcctcctg tgccaggggc tccccggggg atgagcatgg 480
tggttttccc tcggagcccc ctggctcggg acgtctgaga agatgccggt catgaggctg 540
ttcccttgct tcctgcagct cctggccggg ctggcgctgc ctgctgtgcc cccccagcag 600
tgggccttgt ctgctgggaa cggctcgtca gaggtggaag tggtaccctt ccaggaagtg 660
tggggccgca gctactgccg ggcgctggag aggctggtgg acgtcgtgtc cgagtacccc 720
agcgaggtgg agcacatgtt cagcccatcc tgtgtctccc tgctgcgctg caccggctgc 780
tgcggcgatg agaatctgca ctgtgtgccg gtggagacgg ccaatgtcac catgcagctc 840
ctaaagatcc gttctgggga ccggccctcc tacgtggagc tgacgttctc tcagcacgtt 900
cgctgcgaat gccggcctct gcgggagaag atgaagccgg aaaggtgcgg cgatgctgtt 960
ccccggaggt aacccacccc ttggaggaga gagaccccgc acccggctcg tgtatttatt 1020
accgtcacac tcttcagtga ctcctgctgg tacctgccct ctatttatta gccaactgtt 1080
tccctgctga atgcctcgct cccttcaaga cgaggggcag ggaaggacag gaccctcagg 1140
aattcagtgc cttcaacaac gtgagagaaa gagagaagcc agccacagac ccctgggagc 1200
ttccgctttg aaagaagcaa gacacgtggc ctcgtgaggg gcaagctagg ccccagaggc 1260
cctggaggtc tccaggggcc tgcagaagga aagaaggggg ccctgctacc tgttcttggg 1320
cctcaggctc tgcacagaca agcagccctt gctttcggag ctcctgtcca aagtagggat 1380
gcggatcctg ctggggccgc cacggcctgg ctggtgggaa ggccggcagc gggcggaggg 1440
gatccagcca cttccccctc ttcttctgaa gatcagaaca ttcagctctg gagaacagtg 1500
gttgcctggg ggcttttgcc actccttgtc ccccgtgatc tcccctcaca ctttgccatt 1560
tgcttgtact gggacattgt tctttccggc caaggtgcca ccaccctgcc ccccctaaga 1620
gacacataca gagtgggccc cgggctggag aaagagctgc ctggatgaga aacagctcag 1680
ccagtgggga tgaggtcacc aggggaggag cctgtgcgtc ccagctgaag gcagtggcag 1740
gggagcaggt tccccaaggg ccctggcacc cccacaagct gtccctgcag ggccatctga 1800
ctgccaagcc agattctctt gaataaagta ttctagtgtg gaaacgct 1848
<210> 124
<211> 4391
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 124
agcggcggcc ggaagctggc tgagccggcc tttggtaacg ccacctgcac ttctgggggc 60
gtcgagcctg gcggtagaat cttcccagta ggcggcgcgg gagggaaaag aggattgagg 120
ggctaggccg ggcggatccc gtcctccccc gatgtgagca gttttccgaa accccgtcag 180
gcgaaggctg cccagagagg tggagtcggt agcggggccg ggaacatgag gcagtctctc 240
ctattcctga ccagcgtggt tcctttcgtg ctggcgccgc gacctccgga tgacccgggc 300
ttcggccccc accagagact cgagaagctt gattctttgc tctcagacta cgatattctc 360
tctttatcta atatccagca gcattcggta agaaaaagag atctacagac ttcaacacat 420
gtagaaacac tactaacttt ttcagctttg aaaaggcatt ttaaattata cctgacatca 480
agtactgaac gtttttcaca aaatttcaag gtcgtggtgg tggatggtaa aaacgaaagc 540
gagtacactg taaaatggca ggacttcttc actggacacg tggttggtga gcctgactct 600
agggttctag cccacataag agatgatgat gttataatca gaatcaacac agatggggcc 660
gaatataaca tagagccact ttggagattt gttaatgata ccaaagacaa aagaatgtta 720
gtttataaat ctgaagatat caagaatgtt tcacgtttgc agtctccaaa agtgtgtggt 780
tatttaaaag tggataatga agagttgctc ccaaaagggt tagtagacag agaaccacct 840
gaagagcttg ttcatcgagt gaaaagaaga gctgacccag atcccatgaa gaacacgtgt 900
aaattattgg tggtagcaga tcatcgcttc tacagataca tgggcagagg ggaagagagt 960
acaactacaa attacttaat agagctaatt gacagagttg atgacatcta tcggaacact 1020
tcatgggata atgcaggttt taaaggctat ggaatacaga tagagcagat tcgcattctc 1080
aagtctccac aagaggtaaa acctggtgaa aagcactaca acatggcaaa aagttaccca 1140
aatgaagaaa aggatgcttg ggatgtgaag atgttgctag agcaatttag ctttgatata 1200
gctgaggaag catctaaagt ttgcttggca caccttttca cataccaaga ttttgatatg 1260
ggaactcttg gattagctta tgttggctct cccagagcaa acagccatgg aggtgtttgt 1320
ccaaaggctt attatagccc agttgggaag aaaaatatct atttgaatag tggtttgacg 1380
agcacaaaga attatggtaa aaccatcctt acaaaggaag ctgacctggt tacaactcat 1440
gaattgggac ataattttgg agcagaacat gatccggatg gtctagcaga atgtgccccg 1500
aatgaggacc agggagggaa atatgtcatg tatcccatag ctgtgagtgg cgatcacgag 1560
aacaataaga tgttttcaaa ctgcagtaaa caatcaatct ataagaccat tgaaagtaag 1620
gcccaggagt gttttcaaga acgcagcaat aaagtttgtg ggaactcgag ggtggatgaa 1680
ggagaagagt gtgatcctgg catcatgtat ctgaacaacg acacctgctg caacagcgac 1740
tgcacgttga aggaaggtgt ccagtgcagt gacaggaaca gtccttgctg taaaaactgt 1800
cagtttgaga ctgcccagaa gaagtgccag gaggcgatta atgctacttg caaaggcgtg 1860
tcctactgca caggtaatag cagtgagtgc ccgcctccag gaaatgctga agatgacact 1920
gtttgcttgg atcttggcaa gtgtaaggat gggaaatgca tccctttctg cgagagggaa 1980
cagcagctgg agtcctgtgc atgtaatgaa actgacaact cctgcaaggt gtgctgcagg 2040
gacctttctg gccgctgtgt gccctatgtc gatgctgaac aaaagaactt atttttgagg 2100
aaaggaaagc cctgtacagt aggattttgt gacatgaatg gcaaatgtga gaaacgagta 2160
caggatgtaa ttgaacgatt ttgggatttc attgaccagc tgagcatcaa tacttttgga 2220
aagtttttag cagacaacat cgttgggtct gtcctggttt tctccttgat attttggatt 2280
cctttcagca ttcttgtcca ttgtgtggat aagaaattgg ataaacagta tgaatctctg 2340
tctctgtttc accccagtaa cgtcgaaatg ctgagcagca tggattctgc atcggttcgc 2400
attatcaaac cctttcctgc gccccagact ccaggccgcc tgcagcctgc ccctgtgatc 2460
ccttcggcgc cagcagctcc aaaactggac caccagagaa tggacaccat ccaggaagac 2520
cccagcacag actcacatat ggacgaggat gggtttgaga aggacccctt cccaaatagc 2580
agcacagctg ccaagtcatt tgaggatctc acggaccatc cggtcaccag aagtgaaaag 2640
gctgcctcct ttaaactgca gcgtcagaat cgtgttgaca gcaaagaaac agagtgctaa 2700
tttagttctc agctcttctg acttaagtgt gcaaaatatt tttatagatt tgacctacaa 2760
atcaatcaca gcttgtattt tgtgaagact gggaagtgac ttagcagatg ctggtcatgt 2820
gtttgaactt cctgcaggta aacagttctt gtgtggtttg gcccttctcc ttttgaaaag 2880
gtaaggtgaa ggtgaatcta gcttattttg aggctttcag gttttagttt ttaaaatatc 2940
ttttgacctg tggtgcaaaa gcagaaaata cagctggatt gggttatgaa tatttacgtt 3000
tttgtaaatt aatcttttat attgataaca gcactgacta gggaaatgat cagttttttt 3060
ttatacactg taatgaaccg ctgaatatga ggcatttggc atttatttgt gatgacaact 3120
ggaatagttt tttttttttt tttttttttt tgccttcaac taaaaacaaa ggagataaat 3180
ctagtataca ttgtctctaa attgtgggtc tatttctagt tattacccag agtttttatg 3240
tagcagggaa aatatatatc taaatttaga aatcatttgg gttaatatgg ctcttcataa 3300
ttctaagact aatgctctct agaaacctaa ccacctacct tacagtgagg gctatacatg 3360
gtagccagtt gaatttatgg aatctaccaa ctgtttaggg ccctgatttg ctgggcagtt 3420
tttctgtatt ttataagtat cttcatgtat ccctgttact gatagggata catgctctta 3480
gaaaattcac tattggctgg gagtggtggc tcatgcctgt aatcccagca cttggagagg 3540
ctgaggttgc gccactacac tccagcctgg gtgacagagt gagactctgc ctcaaaaaaa 3600
aaaaaaaaaa aaaaaaattc actatctaca aacctagaat atttaaaata caaagattgc 3660
ctgttttcaa acactattga ataagagggt gagatatttc ttaacaacaa caacaacaaa 3720
aaaaacaggt tgttttgaat gtgatgagcc agccaggaga tagaatacta cctgccctta 3780
gggttggggg ctgtccccac aagacttgat acttcagaaa ccctttttat tgacccacaa 3840
gcagatattt gaattacttc ttactttatt gctccaggat tctggatggg ctgcatttac 3900
tgtgtgaagg ataaaaatca ttagcctgga ttctgatttc tataaattgc cattaaaagc 3960
tttttttccc ctaagaactg aaatgtgctc accagccaaa acattttaac ttgtaaattt 4020
tgagggcagt taaccaaacc tgtgactaat catatctcct cctacccccc atttccaagg 4080
acatttgtta ctcagatact tgttatacta atacttgaac ttgtacctta tggtatttgc 4140
tatcttttaa ctagtcatga tattcttata ctttagttac acttttggaa tttgatacaa 4200
ggttgagtgg ggtgtgtggg tgtatgtatg agtgaaacag ttctcaaaag aatgtaagaa 4260
aaaccatttt tataaaattg tgacttttta aaaacatagt ctttgtcatt tatagaatta 4320
acaagctgct cagggtatat tttatagctg tagcactgat atctgcatta ataaatactg 4380
tcgaaacaca a 4391
<210> 125
<211> 468
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 125
gccaccaugu acagaaugca gcugcugagc uguaucgccc ugucucuggc ccuggucaca 60
aauagcgccc cuaccagcag cagcaccaag aaaacacagc ugcaacugga acaccuccug 120
cuggaccugc agaugauccu gaacggcauc aacaacuaca agaaccccaa gcugacccgg 180
augcugaccu ucaaguucua caugcccaag aaggccaccg agcugaagca ccuccagugc 240
cuggaagagg aacugaagcc ccuggaagaa gugcugaauc uggcccagag caagaacuuc 300
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cgguucacau guugguggcu gaccaccauc agcaccgacc ugaccuucag cgugaagucc 480
agcagaggca gcagugaucc ucagggcguu acauguggcg ccgcuacacu gucugccgaa 540
agagugcggg gcgacaacaa agaauacgag uacagcgugg aaugccaaga ggacagcgcc 600
uguccagccg ccgaagaguc ucugccuauc gaagugaugg uggacgccgu gcacaagcug 660
aaguacgaga acuacaccuc cagcuuuuuc auccgggaca ucaucaagcc cgauccucca 720
aagaaccugc agcugaagcc ucugaagaac agcagacagg uggaaguguc cugggaguac 780
cccgacaccu ggucuacacc ccacagcuac uucagccuga ccuuuugcgu gcaagugcag 840
ggcaagucca agcgcgagaa aaaggaccgg guguucaccg acaagaccag cgccaccgug 900
aucugcagaa agaacgccag caucagcguc agagcccagg accgguacua cagcagcucu 960
uggagcgaau gggccagcgu gccauguucu gguggcggag gaucuggcgg agguggaagc 1020
ggcggaggcg gaucuagaaa ucugccugug gccacuccug auccuggcau guucccuugu 1080
cugcaccaca gccagaaccu gcugagagcc guguccaaca ugcugcagaa ggccagacag 1140
acccuggaau ucuaccccug caccagcgag gaaaucgacc acgaggacau caccaaggau 1200
aagaccagca ccguggaagc cugccugccu cuggaacuga ccaagaacga gagcugccug 1260
aacagccggg aaaccagcuu caucaccaac ggcucuugcc uggccagcag aaagaccucc 1320
uucaugaugg cccugugccu gagcagcauc uacgaggacc ugaagaugua ccagguggaa 1380
uucaagacca ugaacgccaa gcugcugaug gaccccaagc ggcagaucuu ccuggaccag 1440
aauaugcugg ccgugaucga cgagcugaug caggcccuga acuucaacag cgagacagug 1500
ccccagaagu cuagccugga agaacccgac uucuacaaga ccaagaucaa gcugugcauc 1560
cugcugcacg ccuuccggau cagagccgug accaucgaca gagugaugag cuaccugaac 1620
gccuccugaa uagugagucg uauuaacgua ccaacaagac ccugacauuc gcuacuguac 1680
uugacaguag cgaaugucag ggucuuuauc uuagaggcau aucccuacgu accaacaaga 1740
gcugcugaag gacucaucaa cuugugauga guccuucagc agcucuuuau cuuagaggca 1800
uaucccuacg uaccaacaag gccaaugacc caacaucucu acuugagaga uguuggguca 1860
uuggccuuua ucuuagaggc auaucccuuu uaucuuagag gcauaucccu 1910
<210> 139
<211> 772
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 139
gccaccauga gaaucagcaa gccccaccug agauccauca gcauccagug cuaccugugc 60
cugcugcuga acagccacuu ucugacagag gccggcaucc acguguucau ccugggcugu 120
uuuucugccg gccugccuaa gaccgaggcc aacuggguua acgugaucag cgaccugaag 180
aagaucgagg accugaucca gagcaugcac aucgacgcca cacuguacac cgagagcgac 240
gugcacccua gcuguaaagu gaccgccaug aagugcuuuc ugcuggaacu gcaagugauc 300
agccuggaaa gcggcgacgc cagcauccac gacaccgugg aaaaccugau cauccuggcc 360
aacaacagcc ugagcagcaa cggcaaugug accgaguccg gcugcaaaga gugcgaggaa 420
cuggaagaga agaauaucaa agaguuccug cagagcuucg ugcacaucgu gcagauguuc 480
aucaacacca gcugaauagu gagucguauu aacguaccaa caaggaguac ccugaugaga 540
ucacuuggau cucaucaggg uacuccuuua ucuuagaggc auaucccuac guaccaacaa 600
gguauccauc ucuggcuaug aacuugucau agccagagau ggauaccuuu aucuuagagg 660
cauaucccua cguaccaaca agucccguaa cgccaucauc uuacuugaag augauggcgu 720
uacgggacuu uaucuuagag gcauaucccu uuuaucuuag aggcauaucc cu 772
<210> 140
<211> 772
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
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gccaccauga gaaucagcaa gccccaccug agauccauca gcauccagug cuaccugugc 60
cugcugcuga acagccacuu ucugacagag gccggcaucc acguguucau ccugggcugu 120
uuuucugccg gccugccuaa gaccgaggcc aacuggguua acgugaucag cgaccugaag 180
aagaucgagg accugaucca gagcaugcac aucgacgcca cacuguacac cgagagcgac 240
gugcacccua gcuguaaagu gaccgccaug aagugcuuuc ugcuggaacu gcaagugauc 300
agccuggaaa gcggcgacgc cagcauccac gacaccgugg aaaaccugau cauccuggcc 360
aacaacagcc ugagcagcaa cggcaaugug accgaguccg gcugcaaaga gugcgaggaa 420
cuggaagaga agaauaucaa agaguuccug cagagcuucg ugcacaucgu gcagauguuc 480
aucaacacca gcugaauagu gagucguauu aacguaccaa caaggaguac ccugaugaga 540
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cgucguccuu uaucuuagag gcauaucccu uuuaucuuag aggcauaucc cu 772
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<212> RNA
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gccaccaugu uccacguguc cuuccgguac aucuucggcc ugccuccacu gauccuggug 60
cugcugccug uggccagcag cgacugugau aucgagggca aagacggcaa gcaguacgag 120
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auguuccugu ucagagccgc cagaaagcug cggcaguucc ugaagaugaa cagcaccggc 300
gacuucgacc ugcaucugcu gaaagugucu gagggcacca ccauccugcu gaauugcacc 360
ggccaaguga agggcagaaa gccugcugcu cugggagaag cccagccuac caagagccug 420
gaagagaaca agucccugaa agagcagaag aagcugaacg accucugcuu ccugaagcgg 480
cugcugcaag agaucaagac cugcuggaac aagauccuga ugggcaccaa agaacacuga 540
auagugaguc guauuaacgu accaacaaga agguucagca uaguagcuaa cuuguagcua 600
cuaugcugaa ccuucuuuau cuuagaggca uaucccuacg uaccaacaag cgaauuacug 660
ugaaagucaa acuuguugac uuucacagua auucgcuuua ucuuagaggc auaucccuac 720
guaccaacaa gaccagcaca cugagaauca aacuuguuga uucucagugu gcuggucuuu 780
aucuuagagg cauaucccuu uuaucuuaga ggcauauccc u 821
<210> 142
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Asp His Leu Ser Leu Ala
20
<210> 143
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala
20
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<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala
20 25
<210> 145
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser
20 25
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<211> 66
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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ttggcc 66
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 147
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggcc 66
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 148
atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60
ctaaacagtc attttctaac tgaagct 87
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<211> 75
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 149
atgttccacg tgtccttccg gtacatcttc ggcctgcctc cactgatcct ggtgctgctg 60
cctgtggcca gcagc 75
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<212> RNA
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<220>
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substitutions and preferred embodiments"
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 220
<210> 151
<211> 200
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 151
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 200
<210> 152
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<212> RNA
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
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<222> (1)..(220)
<223> /note="This sequence may encompass 20-220 nucleotides"
<220>
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<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 152
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 220
<210> 153
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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polynucleotide"
<400> 153
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
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<211> 120
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polynucleotide"
<400> 154
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
Claims (147)
- 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 조성물로서, 여기서 제1 RNA가 사이토카인(cytokine)을 암호화(encoding)하고, 제2 RNA가 종양 증식과 연관된 유전자의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는, 조성물.
- 제1항에 있어서,
사이토카인이 인터류킨-2(IL-2), IL-12, IL-15, IL-7, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체(functional variant)인, 조성물. - 제1항에 있어서,
사이토카인이 서열번호 24, 44, 47, 68 및 80으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
사이토카인이 신호 펩티드(signal peptide)를 포함하는, 조성물. - 제4항에 있어서,
신호 펩티드가 변형되지 않은 신호 펩티드 서열 또는 변형된 신호 펩티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제5항에 있어서,
변형되지 않은 신호 펩티드 서열이 서열번호 26 및 125-128로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는, 조성물. - 제2항에 있어서,
IL-2가 신호 펩티드를 포함하는, 조성물. - 제7항에 있어서,
신호 펩티드가 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제8항에 있어서,
변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열이 서열번호 26에 나열된 서열을 포함하는, 조성물. - 제7항에 있어서,
신호 펩티드가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제10항에 있어서,
적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열이 서열번호 27-29로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
제1 RNA가 메신저(messenger) RNA(mRNA)인, 조성물. - 제1항에 있어서,
제2 RNA가 작은 간섭 RNA(siRNA)인, 조성물. - 제13항에 있어서,
siRNA가 종양 증식과 연관된 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는, 조성물. - 제13항에 있어서,
제2 RNA가 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종(species)을 포함하고, 여기서 siRNA의 각각의 종이 동일한 mRNA의 상이한 영역을 표적화(targeting)하는 상이한 서열을 포함하는, 조성물. - 제13항에 있어서,
제2 RNA가 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 반복된 종을 포함하는, 조성물. - 제15항 또는 제16항에 있어서,
siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종의 각각의 종이 서열번호 22에 나열된 서열을 포함하는 링커(linker)에 의해 연결되는, 조성물. - 제1항에 있어서,
종양 증식과 연관된 유전자가 혈관형성(angiogenesis)과 연관된 유전자를 포함하는, 조성물. - 제18항에 있어서,
혈관형성과 연관된 유전자가 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는, 조성물. - 제19항에 있어서,
VEGF가 VEGFA, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체인, 조성물. - 제20항에 있어서,
VEGFA가 서열번호 35에 나열된 서열을 포함하는, 조성물. - 제19항에 있어서,
VEGF가 VEGFA의 동형(isoform), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체인, 조성물. - 제19항에 있어서,
VEGF가 태반 성장 인자(PIGF), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체인, 조성물. - 제1항에 있어서,
종양 증식과 연관된 유전자가 이소시트레이트 데하이드로게나제(IDH1), 사이클린-의존성 키나제 4(CDK4), CDK6, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 라파마이신의 기계론적 표적(mTOR), Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자(KRAS), 분화 클러스터(CD155), 세포예정사-리간드 1(programmed cell death-ligand 1; PD-L1), 또는 myc 원-종양유전자(myc proto-oncogene; c-Myc)를 포함하는, 조성물. - 제24항에 있어서,
종양 증식과 연관된 유전자가 서열번호 50, 53, 56, 59, 62, 65, 71, 74 및 77로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
제1 RNA가 링커에 의해 제2 RNA에 연결되는, 조성물. - 제26항에 있어서,
링커가 tRNA 링커, 또는 서열번호 21에 나열된 서열을 포함하는 링커를 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
폴리(A) 테일(tail), 5' 캡(cap) 또는 Kozak 서열을 추가로 포함하는 조성물. - 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 RNA 및 제2 RNA가 둘 모두 재조합체인, 조성물. - 제2 RNA에 연결된 제1 RNA를 포함하는 조성물로서, 여기서 제1 RNA가 사이토카인을 암호화하고, 제2 RNA가 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는, 조성물.
- 제30항에 있어서,
사이토카인이 인터류킨-2(IL-2), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체인, 조성물. - 제31항에 있어서,
IL-2가 서열번호 24를 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제31항에 있어서,
IL-2가 신호 펩티드를 포함하는, 조성물. - 제33항에 있어서,
신호 펩티드가 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제34항에 있어서,
IL-2 신호 펩티드 서열이 서열번호 26에 나열된 서열을 포함하는, 조성물. - 제33항에 있어서,
신호 펩티드가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제36항에 있어서,
적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열이 서열번호 27-29로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는, 조성물. - 제30항에 있어서,
제1 RNA가 메신저 RNA(mRNA)인, 조성물. - 제30항에 있어서,
제2 RNA가 작은 간섭 RNA(siRNA)인, 조성물. - 제39항에 있어서,
siRNA가 면역계에 의한 인식과 연관된 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는, 조성물. - 제40항에 있어서,
면역계에 의한 인식과 연관된 유전자가 MHC 부류 I 쇄-관련 서열 A(MICA), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는, 조성물. - 제41항에 있어서,
MICA가 서열번호 38에 나열된 서열을 포함하는, 조성물. - 제40항에 있어서,
면역계에 의한 인식과 연관된 유전자가 MHC 부류 I 쇄-관련 서열 B(MICB), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는, 조성물. - 제43항에 있어서,
MICB가 서열번호 41에 나열된 서열을 포함하는, 조성물. - 제40항에 있어서,
면역계에 의한 인식과 연관된 유전자가 소포체 단백질(ERp5), 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAM), 매트릭스(matrix) 메탈로프로테이나제(MMP), 이의 단편 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는, 조성물. - 제45항에 있어서,
ADAM이 ADAM17인, 조성물. - 제39항에 있어서,
제2 RNA가 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함하고, 여기서 siRNA의 각각의 종이 동일한 mRNA의 상이한 영역을 표적화하는 상이한 서열을 포함하는, 조성물. - 제39항에 있어서,
제2 RNA가 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 반복된 종을 포함하는, 조성물. - 제47항 또는 제48항에 있어서,
siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종의 각각의 종이 서열번호 22에 나열된 서열을 포함하는 링커에 의해 연결되는, 조성물. - 제30항에 있어서,
제1 RNA가 링커에 의해 제2 RNA에 연결되는, 조성물. - 제50항에 있어서,
링커가 tRNA 링커, 또는 서열번호 21에 나열된 서열을 포함하는 링커를 포함하는, 조성물. - 제30항에 있어서,
폴리(A) 테일, 5' 캡 또는 Kozak 서열을 추가로 포함하는, 조성물. - 제30항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 RNA 및 제2 RNA가 둘 모두 재조합체인, 조성물. - 혈관 내피 성장 인자 A(VEGFA), VEGFA의 동형, 태반 성장 인자(PIGF), 분화 클러스터 155(CD155), 세포예정사-리간드 1(PD-L1), myc 원-종양유전자(c-Myc), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 인터류킨-2(IL-2), IL-15, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 제1 RNA
를 포함하는 조성물. - 제54항에 있어서,
제1 RNA가 메신저 RNA(mRNA)인, 조성물. - 제54항에 있어서,
IL-2가 서열번호 24를 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제54항에 있어서,
IL-2가 신호 펩티드를 포함하는, 조성물. - 제57항에 있어서,
신호 펩티드가 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제58항에 있어서,
IL-2 신호 펩티드 서열이 서열번호 26에 나열된 서열을 포함하는, 조성물. - 제57항에 있어서,
신호 펩티드가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제60항에 있어서,
적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열이 서열번호 27-29로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는, 조성물. - 제54항에 있어서,
IL-15가 서열번호 68을 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제54항에 있어서,
IL-15가 신호 펩티드를 포함하는, 조성물. - 제63항에 있어서,
신호 펩티드가 변형되지 않은 IL-15 신호 펩티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제64항에 있어서,
변형되지 않은 IL-15 신호 펩티드 서열이 서열번호 144에 나열된 서열을 포함하는, 조성물. - 제54항에 있어서,
제2 RNA가 작은 간섭 RNA(siRNA)인, 조성물. - 제66항에 있어서,
siRNA가 VEGFA, VEGFA의 동형, PIGF, CD155, PD-L1, 또는 c-Myc의 mRNA에 결합할 수 있는, 조성물. - 제67항에 있어서,
VEGFA가 서열번호 35를 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제67항에 있어서,
CD155가 서열번호 71을 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제67항에 있어서,
PD-L1이 서열번호 74를 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제67항에 있어서,
c-Myc가 서열번호 77을 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제66항에 있어서,
제2 RNA가 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함하고, 여기서 siRNA의 각각의 종이 동일한 mRNA의 상이한 영역을 표적화하는 상이한 서열을 포함하는, 조성물. - 제66항에 있어서,
제2 RNA가 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 반복된 종을 포함하는, 조성물. - 제72항 또는 제73항에 있어서,
siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종의 각각의 종이 서열번호 22에 나열된 서열을 포함하는 링커에 의해 연결되는, 조성물. - 제54항에 있어서,
제1 RNA가 링커에 의해 제2 RNA에 연결되는, 조성물. - 제75항에 있어서,
링커가 tRNA 링커, 또는 서열번호 21을 포함하는 서열을 포함하는 링커를 포함하는, 조성물. - 제54항에 있어서,
폴리(A) 테일, 5' 캡 또는 Kozak 서열을 추가로 포함하는, 조성물. - 제54항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 RNA 및 제2 RNA가 둘 모두 재조합체인, 조성물. - MHC 부류 I 쇄-관련 서열 A(MICA), MHC 부류 I 쇄-관련 서열 B(MICB), 소포체 단백질(ERp5), 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAM), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 인터류킨-2(IL-2), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 제1 RNA
를 포함하는 조성물. - 제79항에 있어서,
ADAM이 ADAM17인, 조성물. - 제79항에 있어서,
제1 RNA가 메신저 RNA(mRNA)인, 조성물. - 제79항에 있어서,
IL-2가 서열번호 24를 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제79항에 있어서,
IL-2가 신호 펩티드를 포함하는, 조성물. - 제83항에 있어서,
신호 펩티드가 변형되지 않은 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제84항에 있어서,
IL-2 신호 펩티드 서열이 서열번호 26에 나열된 서열을 포함하는, 조성물. - 제83항에 있어서,
신호 펩티드가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함하는, 조성물. - 제86항에 있어서,
적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 IL-2 신호 펩티드 서열이 서열번호 27-29로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는, 조성물. - 제79항에 있어서,
제2 RNA가 작은 간섭 RNA(siRNA)인, 조성물. - 제88항에 있어서,
siRNA가 MICA, MICB, ERp5, ADAM 또는 MMP의 mRNA에 결합할 수 있는, 조성물. - 제89항에 있어서,
MICA가 서열번호 38을 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제89항에 있어서,
MICB가 서열번호 41을 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제89항에 있어서,
ADAM이 ADAM17인, 조성물. - 제88항에 있어서,
제2 RNA가 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함하고, 여기서 siRNA의 각각의 종이 동일한 mRNA의 상이한 영역을 표적화하는 상이한 서열을 포함하는, 조성물. - 제88항에 있어서,
제2 RNA가 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 반복된 종을 포함하는, 조성물. - 제93항 또는 제94항에 있어서,
siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종의 각각의 종이 서열번호 22에 나열된 서열을 포함하는 링커에 의해 연결되는, 조성물. - 제79항에 있어서,
제1 RNA가 링커에 의해 제2 RNA에 연결되는, 조성물. - 제96항에 있어서,
링커가 tRNA 링커, 또는 서열번호 21에 나열된 서열을 포함하는 링커를 포함하는, 조성물. - 제79항에 있어서,
폴리(A) 테일, 5' 캡 또는 Kozak 서열을 추가로 포함하는, 조성물. - 제79항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 RNA 및 제2 RNA가 둘 모두 재조합체인, 조성물. - 이소시트레이트 데하이드로게나제(IDH1), 사이클린 의존성 키나제 4(CDK4), CDK6, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 라파마이신의 기계론적 표적(mTOR), Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자(KRAS), 세포예정사-리간드 1(PD-L1), 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 조절하는 유전 요소를 암호화하는 제2 RNA에 연결된 인터류킨-12(IL-12), IL-7, 이의 단편 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 제1 RNA
를 포함하는 조성물. - 제100항에 있어서,
제1 RNA가 메신저 RNA(mRNA)인, 조성물. - 제100항에 있어서,
IL-12가 서열번호 44 또는 서열번호 47을 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제100항에 있어서,
IL-12가 신호 펩티드를 포함하는, 조성물. - 제103항에 있어서,
신호 펩티드가 변형되지 않은 IL-12 신호 펩티드를 포함하는, 조성물. - 제104항에 있어서,
변형되지 않은 IL-12 신호 펩티드가 서열번호 142 또는 서열번호 143에 나열된 서열을 포함하는, 조성물. - 제100항에 있어서,
IL-7이 서열번호 80을 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제100항에 있어서,
IL-7이 신호 펩티드를 포함하는, 조성물. - 제107항에 있어서,
신호 펩티드가 변형되지 않은 IL-7 신호 펩티드를 포함하는, 조성물. - 제108항에 있어서,
변형되지 않은 IL-7 신호 펩티드가 서열번호 128에 나열된 서열을 포함하는, 조성물. - 제100항에 있어서,
제2 RNA가 작은 간섭 RNA(siRNA)인, 조성물. - 제110항에 있어서,
siRNA가 IDH1, CDK4, CDK6, EGFR, mTOR, KRAS 또는 PD-L1의 mRNA에 결합할 수 있는, 조성물. - 제111에 있어서,
IDH1이 서열번호 50을 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제111항에 있어서,
CDK4가 서열번호 53을 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제111항에 있어서,
CDK6이 서열번호 56을 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제111에 있어서,
mTOR이 서열번호 62를 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제111항에 있어서,
EGFR이 서열번호 59를 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제111항에 있어서,
KRAS가 서열번호 65를 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제111항에 있어서,
PD-L1이 서열번호 74를 포함하는 서열을 포함하는, 조성물. - 제110항에 있어서,
제2 RNA가 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종을 포함하고, 여기서 siRNA의 각각의 종이 동일한 mRNA의 상이한 영역을 표적화하는 상이한 서열을 포함하는, 조성물. - 제110항에 있어서,
제2 RNA가 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 반복된 종을 포함하는, 조성물. - 제119항 또는 제120항에 있어서,
siRNA의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 종의 각각의 종이 서열번호 22에 나열된 서열을 포함하는 링커에 의해 연결되는, 조성물. - 제100항에 있어서,
제1 RNA가 링커에 의해 제2 RNA에 연결되는, 조성물. - 제122항에 있어서,
링커가 tRNA 링커, 또는 서열번호 21을 포함하는 서열을 포함하는 링커를 포함하는, 조성물. - 제100항에 있어서,
폴리(A) 테일, 5' 캡 또는 Kozak 서열을 추가로 포함하는 조성물. - 제100항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 RNA 및 제2 RNA가 둘 모두 재조합체인, 조성물. - 치료 유효량의 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient)를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제126항의 약제학적 조성물을 암이 있는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
- 제127항에 있어서,
암이 고형 종양인, 방법. - 제127항에 있어서,
암이 흑색종(melanoma)인, 방법. - 제127항에 있어서,
암이 신세포 암종(renal cell carcinoma)인, 방법. - 제127항에 있어서,
암이 두경부암(head and neck cancer)인, 방법. - 제131항에 있어서,
두경부암이 두경부 편평 세포 암종인, 방법. - 제131항에 있어서,
두경부암이 후두암(laryngeal cancer), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 비강암(nasal cavity cancer), 부비동암(paranasal sinus cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 구강암(oral cancer), 구강인두암(oropharyngeal cancer), 침샘암(salivary gland cancer), 뇌종양, 식도암(esophageal cancer), 눈암, 부갑상선암(parathyroid cancer), 두경부의 육종 또는 갑상선암인, 방법. - 제127항에 있어서,
암이 상부 호흡소화관(upper aerodigestice tract)에 위치하는, 방법. - 제134항에 있어서,
상부 호흡소화관이 부비동, 비강, 구강, 침샘, 혀, 비인두, 구인두, 하인두 또는 후두를 포함하는, 방법. - 제127항에 있어서,
대상체가 두경부암이 있는, 방법. - 제136항에 있어서,
두경부암이 있는 대상체가 담배 사용 이력을 갖는, 방법. - 제136항에 있어서,
두경부암이 있는 대상체가 인유두종바이러스(human papillomavirus; HPV) DNA를 갖는, 방법. - 제127항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체가 인간인, 방법. - 서열번호 1-17 및 125-141로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 재조합 다중핵산 작제물(construct)을 포함하는 조성물.
- 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 조절하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
- 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포.
- 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물을 암호화하는 재조합 다중핵산 작제물을 포함하는 벡터(vector).
- 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제143항의 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 상기 세포에서 단일 RNA 전사물(transcript)로부터 siRNA 및 mRNA를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제143 항의 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 단백질 발현을 조절하는 방법으로서, 여기서 제2 RNA에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제143항의 벡터가 없는 세포와 비교하여 감소되는, 방법.
- 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제143 항의 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 단백질 발현을 조절하는 방법으로서, 여기서 제1 RNA에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제143항의 벡터가 없는 세포와 비교하여 증가되는, 방법.
- 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제143 항의 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 단백질 발현을 조절하는 방법으로서, 여기서 제2 RNA에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제143항의 벡터가 없는 세포와 비교하여 감소되고, 제1 RNA에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제143항의 벡터가 없는 세포와 비교하여 증가되는, 방법.
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