KR20070114761A - Sivpedf 벡터를 사용한 안조직 세포에 있어서의아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 색소상피 유래 인자(PEDF)의 효과적 투여에 의한 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 신규 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 녹내장의 최종 병태인 신경절세포사를 방지하는 수단으로서 PEDF에 착안하였다. 또한 PEDF의 효과적인 딜리버리 방법으로서 SIV 벡터에 착안하고, SIV-PEDF 벡터를 구축하였다. SIV-PEDF 벡터를 허혈성 재관류 모델 및 NMDA-induced 모델에 망막하 투여한 바, 신경절세포사의 현저한 억제효과를 관찰하고, SIV-PEDF 벡터가 녹내장 등의 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환치료용 의약품으로서 유효한 것을 발견하였다.
Description
본 발명은 신경영양인자를 탑재한 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)에 의한 녹내장의 치료방법에 관한 것이다.
녹내장은 시신경유두, 시야의 특징적 변화의 적어도 하나를 가지고, 통상 안압을 충분히 하강시킴으로써 시신경장애의 개선 또는 진행을 저지할 수 있는 눈의 기능적 구조적 이상을 특징으로 하는 질환이다. 녹내장에 대해서 적절한 치료가 행해지지 않는 경우는 실명에 이르는 경우도 많아, 녹내장에 의한 실명은 일본의 중도 실명 원인의 제2위를 차지한다.
녹내장은 원발 녹내장(primary glaucoma), 속발 녹내장, 발달 녹내장으로 분류할 수 있고, 원발 녹내장은 또한 원발 개방우각 녹내장(광의), 원발 폐색우각 녹내장, 혼합형 녹내장으로 분류된다. 광의의 원발 개방우각 녹내장에는 원발 개방우각 녹내장(협의)과 정상 안압 녹내장이 포함되고, 정상 안압 녹내장은 안압이 정상범위 내(21 ㎜Hg 이하, 평균 15.5 ㎜Hg)에도 불구하고 시신경이 손상되는 질환이다. 40세 이상의 약 5.8% 전후가 녹내장을 앓고 있는 것으로 조사되어, 2000년의 통계에서는 일본의 40세 이상의 인구가 약 6,500만명인 점에서 40세 이상의 녹내장 환자는 370만명을 넘는 것으로 생각된다.
녹내장에 있어서의 시신경장애의 발생과 진행에 있어서 「안압」은 중요한 위험 인자(Risk Factor)로서, 종래 안압 하강은 유일한 확실한 치료법이라고 인식되고 있다. 안압을 하강시키는 치료법으로서는 점안제(β차단제, 프로스타글란딘 관련제, 탄산탈수효소 저해제 등), 내복·주사제(탄산탈수효소 저해제, 고장삼투압제), 수술(레이저 수술, 관혈적 수술)의 수단이 일반적이다.
그러나 그 한편으로, 녹내장에 대해서 시신경의 미소순환장애나 취약성 등이라고 하는 「안압」 이외의 인자의 관여도 시사되고 있어, 안압 하강요법의 한계가 지적되고 있다. 따라서 안압 하강요법과는 다른 녹내장 치료법의 개발이 요구되고 있다. 그 하나로서, 녹내장의 최종적인 병태인 망막 신경절세포사(아포토시스)를 억제하는 방법, 즉 망막 신경절세포 보호요법이 주목되고 있다.
한편, 신경영양인자는 미분화 신경아세포의 증식 및 분화, 또는 성숙한 신경세포의 생존 및 기능의 유지를 촉진하는 인자이다. 색소상피 유래 인자(Pigment epithelium derived factor:PEDF)는 신경영양인자의 하나이다. PEDF의 생물활성으로서 지금까지 신경분화·보호작용, 혈관신생 억제작용의 2종류가 보고되어 있다. PEDF는 당초 1989년에 인간 망막아세포종 Y-79세포의 신경분화를 촉진하는 인자로서, 인간태아 망막색소 상피세포의 배양상청으로부터 정제되었다(비특허문헌 1). 지금까지 각종 신경세포에 대해 분화유도 및 손상에 의한 신경 아포토시스사를 억제하는 작용을 갖는 것이 in vitro, in vivo의 계에서 보고되어 있다. 그 메커니즘 에 관해서는 배양 미숙 소뇌 과립세포를 사용한 검토가 행해져 있으며, 전사인자 NFκB의 활성화가 관여하고, 또한 항아포토시스 유전자인 Bcl-2, Bcl-x나 신경영양인자인 NGF, BDNF의 발현을 유도하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 한편 동일하게 배양 미숙 소뇌 과립세포를 대상으로 한 마이크로어레이에 의한 검토에서는, PEDF 첨가에 의해 각종 신경영양인자(NGF, Neurotrophin-3, GDNF)의 발현을 유도하지만, 중화항체를 사용한 해석으로 유도된 신경영양인자는 PEDF의 신경보호 효과에 영향을 주지 않는 것이 보고되어(비특허문헌 3), 보호효과는 PEDF의 직접 작용인 것이 시사되어 있다. 또한 1999년에는 PEDF는 in vitro의 계에서 FGF-2에 유도되는 혈관내피세포의 마이그레이션(migration)을 농도 의존적으로 억제하고, 그 효과가 안지오스타틴(angiostatin)이나 엔도스타틴(endostatin) 보다도 높은 것, 또한 in vivo에 있어서 FGF2에 유도되는 각막혈관신생을 유의하게 억제하는 것이 보고되었다(비특허문헌 4). 이후, 각종 혈관신생 모델, 종양 혈관신생을 억제하는 현상이 다수 보고되고 있다. 그 메커니즘은 상세하게 해명되어 있지는 않지만, (1) PEDF가 혈관내피세포에 있어서의 FasL의 발현을 유도하고, 또한 신생과정에 있는 혈관내피세포에서는 Fas가 고발현하고 있는 점에서, Fas/FasL을 매개로 한 내피세포의 아포토시스가 혈관신생을 억제할 가능성(비특허문헌 5), (2) 세포 외에서의 인산화가 관여할 가능성(비특허문헌 6), 또는 (3) 세포 외 기질과의 결합이 관여할 가능성 등이 고려되어 있다.
전술한 아포토시스 억제작용으로부터 신경영양인자에 의한 신경절세포의 보호방법이 검토되어 있다. 지금까지 망막 허혈 재관류 모델을 사용한 PEDF에 의한 유전자 치료의 검토예가 2예 알려져 있다. 이들 검토예에 있어서는 녹내장과 동일하게 신경절세포가 손상되어 아포토시스사를 발생하는 「망막 허혈 재관류 모델」랫트를 사용하여 PEDF에 의한 세포장애 억제효과가 검토되었다. 상기 검토예는, 하나는 PEDF 단백(비특허문헌 7), 다른 하나는 PEDF를 탑재한 아데노바이러스 벡터(비특허문헌 8)를 동물의 유리체 내에 투여하여 허혈 재관류에 의한 망막 신경절세포 손상을 조직학적으로 억제하였다고 하는 것이다.
그러나, 신경영양인자는 분자량이 크다. 분자량이 큰 단백질을 지속적으로 망막에 도달시키는 것은 현재 상황의 약물 전달 시스템(drug delivery system)에서는 곤란하다. 또한, 아데노바이러스 벡터는 도입한 유전자가 핵 내에 에피솜으로서 존재하여 염색체 DNA에 삽입되지 않기 때문에, 세포증식에 동반하여 자율적인 복제능을 갖지 않는 도입 유전자는 희석되어 도입 유전자의 발현은 일과성이 되어 버린다. 녹내장이 지속적인 질환인 것을 고려하면, 일과성의 효과밖에 기대할 수 없는 투여방법은 녹내장 치료법으로서 적당한 방법이라고는 할 수 없다. 한편, 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 분열하는 세포의 염색체에 안정적으로 삽입됨으로써 장기적으로 유전자의 발현이 가능한 것으로 생각되지만, 지금까지 PEDF를 삽입한 레트로바이러스 벡터에 의한 녹내장 치료의 검토예는 알려져 있지 않다.
특허문헌 1 : 국제출원번호 PCT/JP2002/005225 국제공개번호 WO2002/101057
특허문헌 2 : 국제출원번호 PCT/JP00/03955 국제공개번호 WO00/078987
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 이와 같은 상황에 비추어 이루어진 것으로서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 PEDF의 효과적인 딜리버리에 의한 녹내장 등의 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료용 의약품을 구축하는 것이다.
과제를 해결하기 위한 수단
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 예의 연구를 행하여 PEDF 투여수단으로서 레트로바이러스 벡터인 원숭이 유래 렌티바이러스, 특히 원숭이 면역부전 바이러스(simian immunodeficiency virus:SIV) 벡터에 착안하였다. 본 발명자들은 원숭이 면역부전 바이러스(SIV) 벡터의 망막하 투여라고 하는 유전자 도입법에 의해 치료 유전자를 망막 내에 장기간 안정하게 발현시키는 것이 가능하여, 현재 상황의 약물 전달 시스템(drug delivery system)의 한계를 넘을 수 있다고 생각하였다. 즉, SIV 벡터에 의한 유전자 도입은 (ⅰ) 혈액망막 장벽(blood-retinal barrier, BRB)의 영향을 받지 않고, (ⅱ) 치료유효농도의 유지가 가능하여 부작용을 경감할 수 있으며, (ⅲ) 치료제제의 빈번한 투여에 의해 발생하는 비용을 경감할 수 있다고 하는 점을 기대할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 PEDF를 삽입한 SIV 벡터를 망막색소 변성 모델 동물에 투여하고, 시세포사(아포토시스)에 대한 유의한 억제효과를 명백하게 한 경험이 있다(비특허문헌 9). 이상의 사실로부터, 신경영양인자를 탑재한 SIV 벡터 투여는 유효한 녹내장의 망막 신경절세포사에 대한 신경 보호요법이 될 수 있을 것으로 생각된다.
본 발명자들은 PEDF를 삽입한 SIV 벡터(이하, 「SIV-PEDF 벡터」라고 기재한다.)에 의한 녹내장 치료로의 적용 가능성을 검토함에 있어서, 개량형 SIV 벡터를 사용하였다. 개량형 SIV 벡터는 종래의 SIV 벡터의 안전성 및 성능을 높이는 개량이 실시된 벡터이다. 개량점은 첫째로는 SIV 벡터의 제조에 사용하는 유전자 트랜스퍼 벡터에 cPPT(central polypurine tract) 서열 및 WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) 서열을 도입하여 유전자 도입효율 및 발현효율의 상승을 도모한 점이다. 또한 둘째로는 패키징 벡터에 대해서는 보조인자(vif, vpr, tat)를 제거하고, 추가로 rev 서열을 다른 벡터로 옮김으로써 안전성의 향상을 도모한 점이다.
본 발명자들은 상기의 개량형 SIV-PEDF 벡터의 녹내장으로의 적용을 허혈성 재관류 모델 동물 및 NMDA-induced 모델 동물을 사용하여 검토하였다. 소동물에 녹내장을 엄밀한 의미로 발병시키는 것은 곤란하기 때문에, 통상은 녹내장으로 손상되는 신경절세포를 인위적으로 손상시킨 상기 모델이 녹내장의 검토에 사용된다. 허혈성 재관류 모델은 안압을 올려서 허혈상태로 한 후 재관류시킴으로써 신경절을 급격하게 손상시키는 모델이다. NMDA-induced 모델은 NMDA 투여에 의해 신경절세포만이 선택적으로 손상되는 모델이다. 검토는 이하와 같이 행하였다. SIV-PEDF 벡터를 동물(랫트)의 망막하에 투여한 후, 허혈 재관류 또는 NMDA에 의해 신경절세포를 손상시켰다. 그 후, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 양쪽 상구(上丘)에 주입하고, 신경절세포를 표지하여 표지 신경절세포수를 계측한 바, 어떠한 모델에 있어서도 SIV-PEDF 벡터 투여군에서는 신경절세포수의 감소가 현저하게 억제되고 있는 것이 관찰되었다. 이들의 결과로부터 SIV-PEDF 벡터는 신경절세포를 유효하게 보호할 수 있어, 녹내장 치료제로서 유효하다는 것이 처음으로 실증되었다. 또한 본 발명의 SIV-PEDF는 녹내장과 동일하게 아포토시스 변성을 동반하는 다른 안과 질환에도 유효할 것으로 생각된다. 즉, 본 발명은 SIV-PEDF 벡터에 의한 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 이하의 발명을 제공하는 것이다.
(1) 색소상피 유래 인자(Pigment epithelium derived factor:PEDF) 유전자를 보유하는 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터 및 약학적으로 허용되는 매체를 포함하는 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료용 의약품,
(2) (1)에 있어서, 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 cPPT 서열 및/또는 WPRE 서열을 포함하는 의약품,
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 VSV-G로 슈도타입화되어 있는 의약품,
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 agm주 유래인 의약품,
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환이 녹내장, 망막색소 변성, 망막 박리, 망막 허혈성 질환 중 어느 하나인 의약품,
(6) PEDF 유전자를 보유하는 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를 투여하는 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료방법,
(7) (6)에 있어서, PEDF 유전자를 보유하는 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를 망막하 투여, 유리체 내 투여, 또는 전방 내 투여하는 공정을 포함하는 방법,
(8) 서열번호 : 1에 기재된 염기서열에 PEDF 유전자가 삽입된 염기서열을 포함하는 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용하는 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 의약품의 제조방법,
(9) (8)에 있어서, 서열번호 : 2에 기재된 염기서열을 포함하는 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용하는 의약품의 제조방법,
(10) (8) 또는 (9)에 있어서, 서열번호 : 3에 기재된 염기서열을 포함하는 패키징 벡터가 도입된 패키징 세포에 상기 유전자 트랜스퍼 벡터를 도입하는 공정을 포함하는 방법,
(11) 서열번호 : 1에 기재된 염기서열 또는 상기 서열 중에 외래 유전자 서열이 삽입된 서열을 포함하는 원숭이 면역부전 바이러스의 게놈 RNA를 코드하는 벡터,
(12) (11)에 있어서, 외래 유전자가 PEDF인 벡터,
(13) (11) 또는 (12)의 벡터로부터 전사된 게놈 RNA를 포함하는 원숭이 면역부전 바이러스,
(14) (13)에 있어서, VSV-G로 슈도타입화되어 있는 원숭이 면역부전 바이러스.
도면의 간단한 설명
도 1은 개량형 유전자 트랜스퍼 벡터, 개량형 패키징 벡터, rev 발현 벡터, VSV-G 발현 벡터의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2A는 종래형 유전자 트랜스퍼 벡터로부터 개량형 유전자 트랜스퍼 벡터를 구축하는 공정을 설명하는 도면이다. (α)는 도 2B 공정으로의 계속을 나타낸다.
도 2B는 도 2A의 계속을 나타내는 도면이다. (α)는 도 2A 공정으로부터의 연결을 나타낸다.
도 3은 종래형 패키징 벡터로부터 개량형 패키징 벡터를 구축하는 공정을 설명하는 도면이다.
도 4A는 rev 발현 벡터의 구축공정을 설명하는 도면이다. (β)는 도 4B 공정으로의 계속을 나타낸다.
도 4B는 도 4A의 계속을 나타내는 도면이다. (β)는 도 4A 공정으로부터의 계속을 나타낸다.
도 5는 (a) 종래형 유전자 트랜스퍼 벡터에 cPPT 단독, WPRE 단독, cPPT 및 WPRE를 동시 탑재시킨 벡터의 구조를 설명하는 도면이다. (b) MOI : 15로 감염에 있어서, cPPT 단독, WPRE 단독, cPPT 및 WPRE 동시 탑재의 각 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용했을 때의 SIV 벡터의 생산성을 관찰한 사진이다. 왼쪽 위 : 종래형 cPPT, WPRE가 없는 벡터(대조)(-cPPT, -WPRE), 오른쪽 위 : cPPT 단독 탑재(+cPPT, -WPRE), 왼쪽 아래 : WPRE 단독 탑재(-cPPT, +WPRE), 오른쪽 아래 : cPPT, WPRE 동시 탑재(+cPPT, +WPRE).
도 6은 cPPT 단독, WPRE 단독, cPPT 및 WPRE 동시 탑재의 각 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용했을 때의 SIV 벡터의 생산성을 외래 유전자(EGFP) 양성세포수의 비율로 검토한 결과이다. (a) 표 중의 MOI란 1개의 세포에 감염시킨 벡터 입자수를 나타내고, 0.3, 1.5, 7.5, 15는 실제로 행한 감염실험의 MOI(벡터 입자수/세포수)의 수치를 나타낸다. cPPT 또는 WPRE의 뒤에 기재된 (+)는 벡터에 cPPT 또는 WPRE가 포함되는 것을 나타내고, (-)는 벡터에 cPPT 또는 WPRE가 포함되지 않는 것을 나타낸다. 표의 숫자는 EGFP 양성세포의 비율(백분율 : %). (b) 그래프는 (a)의 표의 수치를 그래프화한 것. 그래프의 세로축은 EGFP 양성세포의 비율(백분율 : %)을 나타낸다.
도 7은 MOI : 15로의 감염에 있어서, cPPT 단독, WPRE 단독, cPPT 및 WPRE 동시 탑재의 각 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용했을 때의 유전자 도입세포에서의 세포당 단백 발현량을 비교한 결과이다. 수치는 형광강도의 상대치(단백 발현량의 비교기준)를 나타낸다.
도 8은 허혈 재관류 모델에 SIV-PEDF 벡터를 투여했을 때의 표지 신경절세포를 관찰한 결과를 나타내는 사진이다. 벡터 비투여/비허혈 재관류 손상군(허혈 재관류 손상처치도 벡터 투여도 하고 있지 않은 랫트), 벡터 비투여/허혈 재관류 손상군(벡터 투여를 받고 있지 않은 허혈 재관류 손상 랫트), SIV-empty 투여군(벡터 대조군, 허혈 재관류 손상 모델에 공벡터를 투여한 랫트), SIV-hPEDF 투여군(치료군, 허혈 재관류 손상 모델에 SIV-hPEDF 벡터를 투여한 랫트).
도 9는 허혈 재관류 모델에 SIV-PEDF 벡터를 투여했을 때의 표지 신경절세포수를 나타내는 도면이다. 벡터 비투여/허혈 재관류 손상군(벡터 투여를 받고 있지 않은 허혈 재관류 손상 랫트), SIV-empty 투여군(벡터 대조군, 허혈 재관류 손상 모델에 공벡터를 투여한 랫트), SIV-hPEDF 투여군(치료군, 허혈 재관류 손상 모델에 SIV-hPEDF 벡터를 투여한 랫트).
도 10은 NMDA-induced 모델에 SIV-PEDF 벡터를 투여했을 때의 표지 신경절세포를 관찰한 결과를 나타내는 사진이다. (a) SIV-empty 벡터 망막하 투여군, (b) SIV-hPEDF 벡터 망막하 투여군.
도 11은 NMDA-induced 모델에 SIV-PEDF 벡터를 투여했을 때의 표지 신경절세포수를 나타내는 도면이다. 벡터 비투여/비NMDA-induced군(NMDA 처치도 벡터 투여도 하고 있지 않은 랫트), 벡터 비투여/NMDA-induced군(벡터 투여를 받고 있지 않은 NMDA-induced 랫트), SIV-empty 투여군(벡터 대조군, NMDA-induced 모델에 공벡터를 투여한 랫트), SIV-hPEDF 투여군(치료군, NMDA-induced 모델에 SIV-hPEDF 벡터를 투여한 랫트).
발명을 실시하기
위한 최선의 형태
본 발명은 색소상피 유래 인자(Pigment epithelium derived factor:PEDF) 유전자를 보유하는 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터 및 약학적으로 허용되는 매체를 포함하는 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료용 의약품에 관한 것이다.
바이러스의 라이프 사이클은 크게 감염과 증식의 단계로 나누어진다. 일반적으로 바이러스 벡터는 바이러스의 감염 시스템을 이용하여 유전자를 효율적으로 숙주의 세포 내에 도입할 수 있는 것이 특징이다. 많은 바이러스 벡터는 안전성 확보를 위해 증식 시스템을 배제하여 자기복제능을 결여시키고, 도입된 세포 내에서의 증식을 방지하는 조치가 취해지고 있다.
벡터 입자의 구조를 간단하게 설명하면, 벡터 입자에는 캡시드라고 불리우는 단백질의 외각(outer shell)이 있다. 캡시드는 gag 유전자 산물의 구조 단백질로 구성되어 있다. 그 캡시드의 바깥쪽에 엔벨로프라고 불리우는 막구조가 있다. 엔벨로프는 감염하는 세포의 종류를 결정하는 기능을 갖는다. 캡시드 중에는 2 카피의 벡터 게놈 RNA, pol 유전자 산물인 역전사효소가 존재하고 있다. 바이러스 벡터는 숙주세포를 감염시키면 벡터 게놈 RNA는 스스로 상기 역전사효소에 의해 역전사된 후, 숙주염색체에 삽입되어 프로바이러스 DNA가 되어, 감염을 성립시킨다.
일반적으로 바이러스 벡터는 패키징 벡터와 유전자 트랜스퍼 벡터에 의해서 조제할 수 있다. 패키징 벡터는 패키징 시그널이 제거된 바이러스 DNA를 탑재하고 있다. 바이러스 DNA에는 바이러스 단백질 서열이 포함되어 있다. 패키징 벡터를 숙주에 도입하면, 숙주세포(패키징 세포)에서는 패키징 시그널이 없기 때문에 공 바이러스 입자가 만들어진다. 한편 유전자 트랜스퍼 벡터는 숙주 염색체 DNA에 삽입되기 위해 필요한 바이러스 유래의 유전자 서열과 도입하는 외래 유전자를 탑재하고 있다. 이 유전자 트랜스퍼 벡터를 패키징 세포에 도입하면, 유전자 트랜스퍼 벡터로부터 공급되는 벡터 게놈 DNA가 숙주 염색체에 삽입된 후, 전사에 의해서 벡터 게놈 RNA가 만들어진다. 이 벡터 게놈 RNA가 패키징 세포에 의해서 만들어지는 바이러스 입자에 들어가, 숙주 내에 핵산분자를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자가 생성된다.
본 발명에 있어서 「바이러스 벡터」란, 자기복제능을 결여하고, 숙주 내에 핵산분자를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자를 가리킨다. 「재조합」 바이러스 벡터란, 유전자 재조합 기술에 의해 구축된 바이러스 벡터를 말한다. 바이러스 게놈을 코드하는 DNA와 패키징 세포를 사용하여 구축한 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 벡터에 포함된다.
본 발명에 있어서 「원숭이 면역부전 바이러스(SIV) 벡터」란, 바이러스 입자 중의 핵산분자 중 바이러스 벡터로서의 기능에 필수인 서열이 SIV 게놈을 토대로 하는 서열인 벡터를 가리킨다. 본 발명에 있어서 「바이러스 벡터로서의 기능에 필수인 서열」이란, 5'측으로부터 차례로 5' LTR의 R 영역, U5 영역, 패키징 시그널(Ø), RRE, 3' LTR의 프로모터 영역 이외의 U3 영역, R 영역의 서열이다. 5' LTR 영역으로부터 패키징 시그널까지의 염기서열을 서열번호 : 4에, RRE 서열을 서열번호 : 5에, 3' LTR의 프로모터 영역을 결여한 U3 영역으로부터 R 영역까지의 염기서열을 서열번호 : 6에 나타낸다. 본 발명의 SIV 벡터는 전술한 정의에 적합한 한 개변되어 있어도 되고, 예를 들면 「바이러스 벡터로서의 기능에 필수인 서열」이 SIV 유래인 한, 그 외에 SIV 유래의 서열 또는 SIV 이외의 유래의 서열을 포함하고 있어도 된다. 적합하게 포함될 수 있는 서열로서는, 예를 들면 후술하는 cPPT, 내부 프로모터(CMV), WPRE를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 원숭이 면역부전 바이러스(simian immunodeficiency virus;SIV)에는 SIV 전체 주 및 서브타입이 포함된다. 단리된 SIV 주로서는 SIVagm, SIVcpz, SIVmac, SIVmnd, SIVsm, SIVsnm, SIVsyk 등을 예시할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
원숭이 면역부전 바이러스(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)는 원숭이에 있어서의 HIV 유사 바이러스로서 발견되어, HIV와 함께 Primates Lentivirus 그룹을 형성하고 있다(이도 에이지, 하야미 마사노리, 원숭이 면역부전 바이러스의 유전자와 감염·병원성. 단백질 핵산 효소: Vol.39, No.8. 1994). 이 그룹은 또한 크게 4개의 그룹으로 분류되어, 1) 인간에 있어서 후천성 면역부전 증후군(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)의 원인이 되는 HIV-1과 침팬지로부터 분리된 SIVcpz를 포함하는 HIV-1 그룹, 2) 수티 망가베이(sooty mangabey) Cercocebus atys로부터 분리된 SIVsmm과 붉은털 원숭이 Macaca mulatta로부터 분리된 SIVmac 및 인간에 대해 저빈도이지만 병원성을 나타내는 HIV-2(Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 16(5), 327-32, 1997)로 되는 HIV-2 그룹, 3) 아프리카 녹색 원숭이 Cercopithecus aethiops로부터 분리된 SIVagm으로 대표되는 SIVagm 그룹, 4) 맨드릴(mandrill) Papio sphinx로부터 분리된 SIVmnd로 대표되는 SIVmnd 그룹으로 되어 있다.
이 중, SIVagm 및 SIVmnd에서는 자연 숙주에 있어서의 병원성의 보고는 없고(Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115-22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol., 18(3-4), 255-9, 1989; 하야미 마사노리, 닛폰 린쇼, 47, 1, 1989), 특히 본 실시예에서 사용한 SIVagm의 일종인 TYO-1주는 자연 숙주에서도, 게잡이 원숭이 Macaca facicularis, 붉은털 원숭이 Macaca mulatta에 대한 실험감염에서도 병원성을 나타내지 않는 것이 보고되어 있다(Ali, M. et al, Gene Therapy, 1(6), : 367-84, 1994; Honjo, S. et al., J. Med. Primatol., 19(1), 9-20, 1990). SIVagm의 인간에 대한 감염, 발증에 대해서는 보고가 없어, 인간에 대한 병원성은 알려져 있지 않지만, 일반적으로 영장류에 있어서의 렌티바이러스는 종특이성이 높고, 자연 숙주로부터 다른 종으로 감염, 발증된 예는 적고, 그 발증도 저빈도 또는 진행이 느린 경향이 있다(Novembre, F. J. et al., J. Virol., 71(5), 4086-91, 1997). 따라서, SIVagm, 특히 SIVagm TYO-1주를 베이스로 하여 제작한 바이러스 벡터는 HIV-1이나 다른 렌티바이러스를 베이스로 한 벡터와 비교하여 안전성이 높다고 생각되어, 본 발명에 있어서 적합하게 사용될 수 있다. SIVagm TYO-1주의 게놈 염기서열을 서열번호 : 7에 나타낸다.
본 발명의 원숭이 면역부전 바이러스 벡터는 다른 레트로바이러스의 게놈 RNA 서열의 일부를 가지고 있어도 된다. 예를 들면, 인간 면역부전 바이러스(Human Immunodeficiency Virus; HIV), 고양이 면역부전 바이러스(Feline Immunodeficiency Virus:FIV)(Poeschla, E. M. et al., Nature Medicine, 4(3), 354-7, 1998), 염소 관절염 뇌염 바이러스(Caprine Arthritis Encephalitis Virus:CAEV)(Mselli-Lakhal, L. et al., Arch. Virol., 143(4), 681-95, 1998) 등의 다른 렌티바이러스의 게놈 서열의 일부를 원숭이 면역부전 바이러스의 게놈의 일부로 치환한 키메라 서열을 갖는 벡터도, 본 발명의 원숭이 면역부전 바이러스 벡터에 포함된다.
본 발명의 색소상피 유래 인자(Pigment epithelium derived factor:PEDF) 유전자를 보유하는 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터(SIV-PEDF 벡터)란, PEDF 유전자를 탑재하고 있는 재조합 SIV 벡터를 가리킨다. 인간 PEDF(hPEDF)의 cDNA 서열을 서열번호 : 8에 나타낸다. 본 발명의 SIV-PEDF 벡터는 전술한 정의에 해당하는 한 종류·구조를 불문하지만, 바람직한 예로서는 서열번호 : 1에 기재된 염기서열에 PEDF 유전자가 삽입된 염기서열을 포함하는 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용하여 제조되는 SIV 벡터이고, 보다 바람직한 예로서는 서열번호 : 2에 기재된 염기서열을 포함하는 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용하여 제조되는 SIV 벡터이다.
본 발명의 SIV-PEDF 벡터는 VSV-G 슈도타입화되어 있어도 된다. VSV-G 슈도타입화란 벡터의 엔벨로프에 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV)의 표면 당단백질인 VSV-G 단백질을 포함시키는 것을 말한다. VSV-G 단백질은 임의의 VSV주에 유래하는 것이어도 된다. 예를 들면, 인디아나(Indiana) 혈청형주(J. Virology 39: 519-528 (1981)) 유래의 VSV-G 단백을 사용할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, VSV-G 단백질은 천연 유래의 단백질로부터 하나 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가 등에 의해 개변되어 있어도 된다. VSV-G 슈도타입화 벡터는 바이러스 생산시에 VSV-G 단백질을 공존시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, VSV-G 발현 벡터의 트랜스펙션이나 숙주 염색체 DNA에 삽입한 VSV-G 유전자로부터의 발현 유도에 의해, 패키징 세포 내에서 VSV-G를 발현시킴으로써 이 세포로부터 생산되는 바이러스 입자가 VSV-G로 슈도타입화된다. VSV-G 단백질은 한 종류의 당단백이 안정한 3량체를 형성하여 막 상에 존재하기 때문에, 정제과정에서의 벡터 입자의 파괴가 일어나기 어려워 원심에 의한 고농도 농축이 가능해진다(Yang, Y. et al., Hum Gene Ther: Sep, 6(9), 1203-13, 1995).
본 발명의 SIV-PEDF 벡터는 다른 바이러스 유래의 엔벨로프 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 단백질로서 인간세포에 감염하는 바이러스에 유래하는 엔벨로프 단백질이 적합하다. 이와 같은 단백질로서는 특별히 제한은 없지만, 레트로바이러스의 암포트로픽 엔벨로프 단백질 등을 들 수 있다. 레트로바이러스의 암포트로픽 엔벨로프 단백질로서는, 예를 들면 마우스 백혈병 바이러스(MuLV) 4070A주 유래의 엔벨로프 단백질을 사용할 수 있다. 또한, MuMLV 10A1 유래의 엔벨로프 단백질을 사용하는 것도 가능하다(예를 들면, pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996)). 또한, 헤르페스 바이러스과의 단백질로서는, 예를 들면 단순 헤르페스 바이러스의 gB, gD, gH, gp85 단백질, EB 바이러스의 gp350, gp220 단백질 등을 들 수 있다. 헤파드나 바이러스과의 단백질로서는 B형 간염 바이러스의 S 단백질 등을 들 수 있다.
본 발명의 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터로서는 LTR(long terminal repeat)에 개변을 가하는 것도 가능하다. LTR은 레트로바이러스에 특징적인 서열로서, 바이러스 게놈의 양 끝에 존재하고 있다. 5' LTR은 프로모터로서 작용하여, 프로바이러스로부터의 mRNA의 전사를 촉진시킨다. 따라서, 바이러스 입자 내에 패키징되는 바이러스 RNA 게놈을 코드하는 유전자 트랜스퍼 벡터의 5' LTR 프로모터 활성을 갖는 부분을 다른 강력한 프로모터로 치환하면, 유전자 트랜스퍼 벡터의 mRNA 전사량이 증대하고, 패키징 효율이 상승하며, 벡터 역가를 상승시킬 가능성이 있다. 더욱이, 예를 들면 렌티바이러스의 경우, 5' LTR은 바이러스 단백질 tat에 의한 전사활성의 증강을 받는 것이 알려져 있어, 5' LTR을 tat 단백질에 의존하지 않는 프로모터로 치환함으로써 패키징 벡터로부터 tat를 삭제하는 것이 가능해진다. 또한, 세포에 감염하여 세포 내에 침입한 바이러스 RNA는 역전사된 후, 양 끝의 LTR을 결합시킨 고리형상 구조가 되고, 결합부위와 바이러스의 인테그라제가 공역하여 세포의 염색체 내에 삽입된다. 프로바이러스로부터 전사되는 mRNA는 5' LTR 내의 전사 개시점으로부터 하류, 3' LTR의 polyA 서열까지이고, 5' LTR 프로모터 부분은 바이러스 내에 패키징되지 않는다. 따라서, 프로모터를 치환했다고 해도 표적세포의 염색체에 삽입되는 부분에는 변화가 없다. 이상의 사실로부터, 5' LTR 프로모터의 치환은 보다 역가가 높고 안전성이 높은 벡터를 제작하는 것으로 이어진다고 생각된다. 따라서, 유전자 트랜스퍼 벡터의 5'측 프로모터의 치환을 행하여 패키징되는 벡터의 역가를 상승시킬 수 있다.
또한, 3' LTR의 서열을 부분적으로 삭제하고, 표적세포로부터 전장의 벡터 mRNA가 전사되는 것을 방지하는 자기 불활성화형 벡터(Self Inactivating Vector: SIN 벡터)의 제작에 의해 안전성을 상승시키는 것도 가능하다. 표적세포의 염색체에 침입한 렌티바이러스의 프로바이러스는 3' LTR의 U3 부분을 5'말단에 결합시킨 형태가 된다. 따라서, 유전자 트랜스퍼 벡터의 전사산물은 역전사 후, 표적세포의 염색체에 삽입된 상태에서는 5'말단에 U3가 배치되고, 거기서부터 유전자 트랜스퍼 벡터로부터의 전사산물과 동일한 구조를 갖는 RNA가 전사되게 된다. 만약, 표적세포 내에 렌티바이러스 또는 그와 유사한 단백질이 존재한 경우, 전사된 RNA가 다시 패키징되어 다른 세포로 재감염될 가능성이 있다. 또한, 3' LTR의 프로모터에 의해 바이러스 게놈의 3'측에 위치하는 숙주 유래의 유전자가 발현되어 버릴 가능성이 있다(Rosenberg, N., Jolicoeur, P., Retoroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997). 이 현상은 레트로바이러스벡터에 있어서 이미 문제가 되어 회피방법으로서 SIN 벡터가 개발되었다(Yu, S. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(10), 3194-8, 1986). 유전자 트랜스퍼 벡터 상의 3' LTR의 U3 부분을 결실시킴으로써 표적세포 내에서는 5' LTR이나 3' LTR의 프로모터가 없어지기 때문에, 전장의 RNA나 숙주 유전자의 전사가 일어나지 않는다. 따라서, 내부 프로모터로부터의 목적 유전자의 전사만 행해지게 되어 안전성이 높고 고발현의 벡터로 되는 것이 기대된다. 이와 같은 벡터는 본 발명에 있어서 적합하다. SIN 벡터의 구축은 공지의 방법 또는 본 발명자들에 의한 특허출원 : 국제공개번호 WO2002/101057(특허문헌 1)의 실시예 1~4에 기재된 방법 등에 따르면 된다.
레트로바이러스 벡터 등 그 게놈에 LTR 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용한 유전자치료의 문제점 중 하나로 도입 유전자의 발현이 점점 저하되는 경우가 있다. 이들 벡터는 숙주 게놈에 삽입되면 숙주측의 메커니즘에 의해 그 LTR이 메틸화되고, 도입 유전자의 발현이 억제되어 버리는 것이 원인의 하나로 생각되고 있다(Challita, P. M. and Kohn, D. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2567, 1994). 자기 불활성화(SIN)형 벡터에서는, 숙주 게놈에 삽입되면 LTR 서열의 대부분을 잃기 때문에 LTR의 메틸화에 의한 유전자 발현의 감소를 받기 어려운 이점이 있다. 본 발명자들에 의해서 유전자 트랜스퍼 벡터의 3' LTR의 U3 영역을 다른 프로모터 서열로 치환하여 제조한 자기 불활성화형 벡터는 영장류 ES세포에 도입 후, 2개월 이상에 걸쳐서 안정한 발현을 유지하는 것이 판명되어 있다(특허문헌 1). 이와 같이, LTR U3 영역의 개변에 의해 자기 불활성화하도록 설계된 SIN 벡터는 본 발명에 있어서 특히 적합하다. 구체적으로는, 3' LTR U3 영역의 하나 또는 복수의 염기가 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 개변된 벡터는 본 발명에 포함된다. 이 U3 영역은 단순히 결실시켜도 되고, 또는 이 영역에 다른 프로모터를 삽입해도 된다. 이와 같은 프로모터로서는 예를 들면 CMV 프로모터, EF1 프로모터 또는 CAG 프로모터 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 코드되는 PEDF 유전자는 LTR 이외의 프로모터에 의해 전사되도록 설계하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기와 같이 LTR U3 영역을 비LTR 프로모터로 치환한 경우에는, 이 개변 LTR에 의해 PEDF 유전자의 발현을 구동하는 것이 바람직하다. 또는 실시예에 나타내는 바와 같이, LTR 영역과는 별개의 위치에 비LTR 프로모터를 배치하고 그 하류에 PEDF 유전자를 연결함으로써, LTR에 의존하지 않고 PEDF 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 본 발명자들에 의해서 외래 유전자의 발현을 비LTR 프로모터에 의해 구동하도록 구축된 SIV 벡터는 ES세포에 있어서 그 외래 유전자를 장기간 안정하게 발현하는 것이 나타내어졌다(특허문헌 1). 마찬가지로 PEDF 유전자의 상류에 비LTR 프로모터가 연결되어 있어, 이 프로모터로부터 상기 PEDF 유전자가 전사되는 벡터는 본 발명에 있어서 특히 적합하다고 할 수 있다. 비LTR 프로모터로서는, 예를 들면 CMV 프로모터, EF1 프로모터 또는 CAG 프로모터를 들 수 있고, 특히 CMV 프로모터가 적합하다. 본 실시예에서 사용한 CMV 프로모터의 염기서열을 서열번호 : 9에 나타낸다. 이와 같은 벡터는 특히 상기의 자기 불활성화(SIN)형 벡터에 있어서 구축함으로써 높은 효과를 발휘한다.
HIV 벡터를 비롯한 렌티바이러스 벡터는 숙주 게놈이 HIV 프로바이러스를 이미 보유하고 있는 경우, 외래 벡터와 내인성 프로바이러스 사이에서 재조합이 일어나 복제 가능 바이러스가 발생하지 않을까 하는 우려가 지적되고 있다. 이는 장래 실제로 HIV 감염환자에게 HIV 벡터를 사용할 때에는 분명히 큰 문제가 될 것이다. 이번에 사용한 SIV 벡터는 HIV와의 상동서열은 거의 없는 데다가 바이러스 유래의 서열을 80% 이상 제거한 복제불능 바이러스로서, 이러한 위험성은 매우 작아, 다른 렌티바이러스 벡터에 비해 안전성이 높다. 본 발명의 SIV-PEDF 벡터는 전술한 「바이러스 벡터로서의 기능에 필수인 서열」 이외의 SIV 게놈 서열이 일정 이상 제거된 벡터로서, 바람직하게는 이 벡터가 유래하는 SIV 게놈 서열의 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 80% 이상이 제거된 복제불능 바이러스이다.
레트로바이러스 생산에는 숙주세포에서 패키징 시그널을 갖는 유전자 트랜스퍼 벡터 DNA를 전사시켜, gag, pol 단백질 및 엔벨로프 단백질의 존재하에서 바이러스 입자를 형성시킨다. 패키징 세포 내의 gag, pol 단백질은 패키징 벡터를 사용하여 공급할 수 있다. 엔벨로프 단백질은 패키징 벡터에 의해서 공급되어도 되지만, 다른 벡터에 의해서 공급되어도 된다. 예를 들면 실시예와 같이 VSV-G 발현 벡터에 의해서 공급되어도 된다.
본 발명의 유전자 트랜스퍼 벡터는 가장 기본적으로는 5' LTR, 패키징 시그널 서열, PEDF 유전자 또는 FGF2 유전자, 3' LTR 서열을 갖는다. LTR 서열은 SIV 벡터의 개변으로서 전술한 LTR의 개변이 실시되어 있어도 된다. 또한, 전술한 cPPT 서열, CMV 서열, RRE 서열 등이 삽입되어 있어도 된다. 유전자 트랜스퍼 벡터 DNA에 코드되는 패키징 시그널 서열은 이 서열에 의해 형성되는 구조를 유지할 수 있도록 가능한 길게 삽입하는 것이 바람직한 한편, 상기 벡터 DNA 상의 패키징 시그널과 gag, pol 단백질을 공급하는 패키징 벡터 사이에서 일어나는 재조합에 의한 야생형 바이러스의 출현빈도를 억제하기 위해서는 이들 벡터 사이의 서열의 중복을 최소한으로 할 필요가 있다. 따라서, 유전자 트랜스퍼 벡터 DNA의 구축에 있어서는 패키징 효율 및 안전성의 양자를 만족시키기 위해, 패키징에 필요한 서열을 포함할 수 있는 한 짧은 서열을 사용하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 패키징 벡터를 SIVagm 유래인 것으로 한 경우에 HIV 유래의 유전자 트랜스퍼 벡터는 패키징되지 않기 때문에, 유전자 트랜스퍼 벡터 DNA에 사용되는 패키징 시그널 유래로서는 SIV만으로 제한된다고 생각할 수 있다. 단, HIV 유래의 패키징 벡터를 사용한 경우, SIV 유래의 유전자 트랜스퍼 벡터도 패키징되기 때문에, 재조합 바이러스의 출현빈도를 저하시키기 위해 다른 렌티바이러스 유래의 유전자 트랜스퍼 벡터와 패키징 벡터를 조합한 벡터 입자를 형성시키는 것이 가능하다고 생각할 수 있다. 이와 같이 하여 제조된 SIV 벡터도 본 발명의 벡터에 포함된다. 이 경우, 영장류의 렌티바이러스 사이의 조합(예를 들면, HIV와 SIV)인 것이 바람직하다.
유전자 트랜스퍼 벡터 DNA에서는 gag 단백질이 발현되지 않도록 개변되어 있는 것이 바람직하다. 바이러스 gag 단백질은 생체에 있어서 이물질로서 인식되어 항원성이 나타날 가능성이 있다. 또한, 세포의 기능에 영향을 미칠 가능성도 있다. gag 단백질을 발현하지 않도록 하기 위해서는 gag 개시코돈의 하류에 염기의 부가나 결실 등에 의해 격자 이동(frame shift)되도록 개변할 수 있다. 또한, gag 단백질의 코드 영역 일부를 결실시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 바이러스의 패키징에는 gag 단백질의 코드 영역의 5'측이 필요하다고 되어 있다. 따라서, 유전자 트랜스퍼 벡터에 있어서는 gag 단백질의 C 말단측의 코드 영역을 결실하고 있는 것이 바람직하다. 패키징 효율에 크게 영향을 미치지 않는 범위에서 가능한 한 넓은 gag 코드 영역을 결실시키는 것이 바람직하다. 또한, gag 단백질의 개시코돈(ATG)을 ATG 이외의 코돈으로 치환하는 것도 바람직하다. 치환하는 코돈은 패키징 효율에 대한 영향이 적은 것을 적절히 선택한다. 이것으로 구축된 패키징 시그널을 갖는 유전자 트랜스퍼 벡터 DNA를 적당한 패키징 세포에 도입함으로써 바이러스 벡터를 생산시킬 수 있다. 생산시킨 바이러스 벡터는 예를 들면 패키징 세포의 배양상청으로부터 회수할 수 있다.
또한, 유전자 트랜스퍼 벡터 DNA에서는 PEDF 유전자의 도입효율 및 발현효율을 높이는 개변이 실시되어 있는 것이 바람직하다. 도입효율을 상승시키는 개변의 예로서, cPPT(central polypurine tract) 서열의 도입을 들 수 있다. cPPT는 원래 SIV 게놈에 존재하는 서열이다. HIV 바이러스에 있어서는 매우 이전부터 보고가 있고(P.Charneau et al.:J.Virol 65:2415-2431, 1991), HIV 벡터에 있어서는 cPPT를 도입하면 벡터 게놈의 핵으로의 이행이 좋아져, 유전자 도입효율이 상승하는 것이 보고되어 있다(A.Sirven et al.:Blood 96:4103-4110, 2000). 본 실시예에서 사용한 cPPT의 염기서열을 서열번호 : 10에 나타낸다. 또한 발현효율을 높이는 개변의 예로서는 WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) 서열의 도입을 들 수 있다. WPRE는 유전자 발현효율을 높이는 기능을 갖는 인자이다(US Patent 6284469 : RNA export element and methods of use). 다른 렌티바이러스 벡터에서는 cPPT와 WPRE의 2개 인자의 동시도입은 각각의 효과를 더욱 높이는 결과가 보고되어 있다(SC. Barry et al.:Hum. Gene Ther. 12 : 1103-1108, 2001). 본 실시예에서 사용한 WPRE의 염기서열을 서열번호 : 11에 나타낸다. 본 발명의 SIV-PEDF 벡터에 있어서 cPPT는 일반적인 렌티바이러스 벡터에 있어서의 배치와 동일한 배치를 취할 수 있다. 예를 들면, cPPT를 프로모터와 외부 유전자 사이에 배치해도 되고, 또는 RRE 서열의 상류에 배치하는 것도 가능하지만, 바람직하게는 PEDF의 전사를 구동하는 전술의 비LTR 프로모터의 상류에 배치한다. WPRE는 PEDF 유전자의 하류에 배치할 수 있다. 이와 같은 유전자 트랜스퍼 벡터의 바람직한 구체예로서 서열번호 : 1에 기재된 염기서열에 PEDF 유전자가 삽입된 염기서열을 포함하는 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용하여 제조되는 SIV 벡터를 들 수 있고, 보다 바람직한 예로서는 서열번호 : 2에 기재된 염기서열을 포함하는 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용하여 제조되는 SIV 벡터를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 패키징 벡터는 PEDF 유전자 도입에 필요하지 않은 서열을 제거한 것을 사용할 수 있다. 필요하지 않은 서열로서 수식 유전자라고 불리우는 vif, vpr과 제어 유전자인 tat, rev를 예시할 수 있다. 수식 유전자 산물은 벡터에 있어서 필요하지 않은 것이 보고되어 있고(V. Kim et al.:J.Virol 72:811-816, 1998), 최근에는 안전성을 높이기 위해 수식 유전자가 삭제된 벡터가 사용되고 있다. 또한, tat도 삭제되고, rev는 다른 플라스미드에 옮김으로써 더욱 안전성이 높아진 제3 세대라고 불리우는 벡터가 개발되어 있다. 패키징 벡터로부터 rev를 제거한 경우는 별도로 rev 발현 벡터를 구축하고, 상기 rev 발현 벡터를 본 발명의 SIV-PEDF 벡터의 제조에 있어서 사용할 수 있다. SIVagm TYO-1주의 rev의 염기서열을 서열번호 : 12에 나타낸다. 상기한 바와 같이 하여 구축된 패키징 벡터는 예를 들면 프로모터 서열, 바이러스 코어 단백질 서열(gag), 역전사효소 서열(pol), polyA 서열을 포함하는 구성으로 할 수 있으며, 실시예에 나타내는 바와 같이 상기 구성에 추가로 RRE 서열이 포함되어 있어도 된다. 또한 rev 발현 벡터는 rev 서열의 상류에 상기 서열을 제어하기 위한 프로모터, rev 서열의 하류에 polyA 서열을 배치한 구성으로 할 수 있다.
패키징 세포에 사용되는 세포로서는 일반적으로 바이러스의 생산에 사용되는 세포주이면 제한은 없다. 인간의 유전자 치료용으로 사용하는 것을 고려하면 세포의 유래로서는 인간 또는 원숭이가 적당하다고 생각된다. 패키징 세포로서 사용될 수 있는 인간 세포주로서는 예를 들면, 293세포, 293T세포, 293EBNA세포, SW480세포, u87MG세포, HOS세포, C8166세포, MT-4세포, Molt-4세포, HeLa세포, HT1080세포, TE671세포 등을 들 수 있다. 원숭이 유래 세포주로서는 예를 들면, COS1세포, COS7세포, CV-1세포, BMT10세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 SIV-PEDF 벡터는 실질적으로 순수해지도록 정제할 수 있다. 정제방법은 필터여과, 원심분리 및 칼럼정제 등을 포함하는 공지의 정제·분리방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 벡터용액을 0.45 ㎛의 필터로 여과한 후, 42500×g, 90분, 4℃에서 원심을 행함으로써 벡터를 침전·농축할 수 있다.
본 발명의 SIV-PEDF 벡터는 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료 및 예방으로 사용할 수 있다. 실시예에 있는 바와 같이, 본 발명자들은 SIV-PEDF 벡터가 망막 신경절세포 보호에 매우 유효한 것을 질환 모델 동물로 확인하고 있다. 녹내장의 최종적 병태는 망막 신경절세포의 아포토시스이다. 즉, 본 발명의 SIV-PEDF 벡터는 망막 신경절세포의 아포토시스를 억제함으로써, 녹내장의 진행억제, 예방, 치료에 효과를 갖는다. 또한, 녹내장 이외에도 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료용으로 널리 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 본 발명의 SIV-PEDF 벡터는 필요에 따라서 약학적으로 허용되는 목적하는 담체 또는 매체와 적절히 조합하여 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료용 의약품으로 할 수 있다. 「약학적으로 허용되는 담체」란, 벡터와 함께 투여하는 것이 가능하고, 벡터에 의한 유전자 도입을 유의하게 저해하지 않는 재료이다. 구체적으로는 예를 들면, 멸균수, 생리식염수, 배양액, 혈청, 인산 완충 생리식염수(PBS) 등과 적절히 조합하는 것을 생각할 수 있다. 더욱이, 그 외에도 안정제, 살생물제 등이 함유되어 있어도 된다. 본 발명의 SIV-PEDF를 포함하는 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환치료용 의약품을 투여하는 경우는, 망막 신경절세포 보호효과를 얻을 수 있는 한 특별히 투여경로를 불문하지만, 바람직하게는 망막하 투여, 유리체 내 투여, 전방 내 투여, 보다 바람직하게는 망막하 투여, 유리체 내 투여이다. 본 발명의 SIV-PEDF를 포함하는 의약품의 투여량(인간 1안구당)은 예를 들면 2.5×105 TU~2.5×108 TU, 바람직하게는 5.0×105 TU~5.0×107 TU를 기준으로 할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
이하, 본 발명을 실시예를 토대로 보다 구체적으로 설명한다. 물론 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] VSV-G 슈도타입 SIV 벡터의 구축
벡터의 구축에는 도 1에 나타내는 4종류의 플라스미드(유전자 트랜스퍼 벡터, 패키징 벡터, rev 발현 벡터, VSV-G 발현 벡터)를 사용하였다. 3종류의 유전자 트랜스퍼 벡터, 패키징 벡터, rev 발현 벡터에 대해서는 종래형 벡터 플라스미드(PCT/JP00/03955)를 개량하여 제작하였다. VSV-G 발현 벡터에 대해서는 종래의 것을 그대로 사용하였다.
플라스미드 제작에 있어서는 시판의 각종 키트를 사용하였다. 제한효소는 뉴잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)사 제품을 사용하고, 플라스미드 DNA의 추출, 정제, 회수에는 퀴아젠의 키트(QIAquick PCR purification kit, QIAquick Nucleotide Removal kit, QIAquick Gel extraction kit, Plasmid Maxi kit)를 사용하였다. PCR에는 TaKaRa의 EX Taq 효소를 사용하고, 사용하는 프라이머는 외부의 메이커(시그마제노시스·재팬)에 합성을 의뢰하였다. DNA 말단의 탈인산화는 TaKaRa의 알칼리 포스파타아제(Alkalline Phosphatase)(E.coli C75)를 사용하였다. 라이게이션에는 TaKaRa의 DNA Ligation kit ver.2를 사용하고, 트랜스포메이션에는 TOYOBO의 DH5α COMPETENT high를 이용하였다.
1-1. 유전자 트랜스퍼 벡터의 개량
종래형 유전자 트랜스퍼 벡터에 cPTT(central polypurine tract) 및 WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)의 도입을 행하여, 유전자 트랜스퍼 벡터의 성능개량을 도모하였다(도 2A, B). 사용한 종래형 유전자 트랜스퍼 벡터는 비병원성 아프리카 녹색 원숭이 면역부전 바이러스의 클론인 SIVagm을 기본으로 하고, 5' LTR 영역, RRE, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, EGFP(enhanced green fluorescent protein) 유전자, 3' LTR을 차례로 갖는 벡터이다. 상기 종래형 유전자 트랜스퍼 벡터는 본 발명자들에 의해서 구축된 것으로서, 구축방법 등에 대해서는 이미 보고되어 있다(특허문헌 2). 상기 종래형 유전자 트랜스퍼 벡터의 염기서열을 서열번호 : 13에 나타낸다.
구체적인 벡터의 개량방법은 이하와 같다. 먼저, 종래형 유전자 트랜스퍼 벡터를 제한효소 SacⅡ로 절단하고, 샘플을 영동하여 CMV 프로모터와 EGFP 유전자를 제거하여 셀프 라이게이션을 행하였다. 이어서, 플라스미드의 NotⅠ 부위를 없애기 위해 상기 벡터를 NotⅠ으로 절단하고, 절단 말단을 T4 DNA 폴리머라아제로 평활하하여 셀프 라이게이션을 행하였다.
계속해서, 상기 벡터를 제한효소 SacⅡ로 절단하고, BAP 처리를 사용하여 절단 말단을 탈인산화 하였다. 종래형 유전자 트랜스퍼 벡터를 템플레이트로 하고, 프라이머 1F(서열번호 : 14)와 1R(서열번호 : 15)로 PCR을 행하여 PCR 산물을 SacⅡ로 절단하고, CMV 프로모터(서열번호 : 9)의 말단에 SacⅡ 부위를 부가한 단편을 제작하였다. 상기 CMV 프로모터 단편을 BAP 처리한 상기 벡터의 SacⅡ 부위에 삽입하였다.
벡터를 NotⅠ, BamHⅠ으로 순서대로 절단하고, 그 절단부위에 2종류의 합성 올리고 DNA 2F(서열번호 : 16)와 2R(서열번호 : 17)을 어닐링하여 제작한 어댑터를 라이게이션하고 제한효소 부위를 개변하였다. 벡터를 제한효소 SacⅡ로 절단하고, BAP 처리를 사용하여 절단 말단을 탈인산화하였다.
도입용 cPTT 단편(서열번호 : 10)을 얻기 위해, SIVagmTYO1 게놈(서열번호 : 7)을 삽입한 플라스미드 pSA212를 템플레이트로 하고, 프라이머 3F(서열번호 : 18)와 3R(서열번호 : 19)로 PCR을 행하였다. 상기 PCR 증폭단편의 말단을 SACⅡ로 절단하고, cPPT의 양 끝에 SACⅡ 부위를 부가한 단편을 제작하였다. cPPT 단편을 BAP 처리한 상기 벡터의 SacⅡ 부위에 라이게이션하였다.
벡터를 BamHⅠ으로 절단하고, BAP 처리를 행하여 절단 말단을 탈인산화하였다. 도입하는 WPRE 단편을 얻기 위해, WPRE cDNA(서열번호 : 11)가 든 플라스미드를 템플레이트로 하고, 프라이머 4F(서열번호 : 20)와 4R(서열번호 : 21)로 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 증폭산물의 말단을 BamHⅠ과 BglⅡ로 절단하고, WPRE의 말단에 제한효소 부위를 부가한 단편을 제작하였다. 벡터의 BamHⅠ 부위에 상기 WPRE 단편을 라이게이션하고, 탑재 유전자가 없는 개량형 유전자 트랜스퍼 벡터(서열번호 : 1)를 완성시켰다.
탑재 유전자 단편을 제작하고, 상기의 개량형 유전자 트랜스퍼 벡터 NotⅠ 부위에 삽입하였다. EGFP 단편은 EGFP cDNA(서열번호 : 22)가 든 플라스미드를 템플레이트로 하고, 프라이머 5F(서열번호 : 23)와 5R(서열번호 : 24)로 PCR을 행하여 NotⅠ으로 절단하여 제작하였다. PEDF 단편은 hPEDF cDNA(서열번호 : 8)가 든 플라스미드를 템플레이트로 하고, 프라이머 7F(서열번호 : 25)와 7R(서열번호 : 26)로 PCR을 행하여 pGEM-T Easy vector(프로메가사)로 TA 클로닝하고, NotⅠ으로 잘라내어 제작하였다.
또한, cPPT, WPRE를 삽입한 플라스미드의 구축과 동시에 cPPT, WPRE의 효과 를 확인하기 위해, cPPT만 또는 WPRE만을 삽입한 유전자 트랜스퍼 벡터도 각각 제작하였다.
1-2. 패키징 벡터의 개량
종래형 패키징 벡터에는 gag, pol 외에 수식 유전자라고 불리우는 vif, vpr과 제어 유전자인 tat, rev가 포함되어 있다. 그러나, 수식 유전자 산물은 벡터에 있어서 필요 없는 것을 알 수 있고(V. Kim et al.:J. Virol 72:811-816, 1998), 최근에는 안전성을 높이기 위해 수식 유전자가 삭제된 벡터가 사용되고 있다. 또한, tat도 삭제되고, rev는 다른 플라스미드에 옮김으로써 더욱 안전성이 높아진 제3 세대라고 불리우는 벡터가 개발되어 있어, 현재로서는 벡터의 제3 세대화는 필수가 되어 있다. 따라서 본 발명에 있어서도 종래형 패키징 벡터(서열번호 : 27)로부터 보조 유전자(vif, vpr, tat)를 제거하고, rev를 다른 플라스미드로 옮겨서 안전성을 높이는 것으로 하였다(도 3). 방법은 기본적으로는 HIV 벡터에서 이전에 보고되어 있다(T. Dull. et al.:J. Virol 72:8463-8471, 1998).
구체적으로는, 먼저 패키징 벡터의 플라스미드를 제한효소 NotⅠ으로 절단하고, 계속해서 Ecot22Ⅰ으로 절단하였다. 샘플을 영동하고, EcoT22Ⅰ-NotⅠ 단편을 제거하여 사이즈가 큰 벡터 단편과 pol 유전자 일부의 EcoT22Ⅰ-EcoT22Ⅰ 단편을 회수하였다.
2종류의 합성 올리고 DNA 1F(서열번호 : 28)와 1R(서열번호 : 29)을 어닐링시켜서 제작한 어댑터를 상기 벡터의 EcoT22Ⅰ-NotⅠ 부위에 라이게이션하였다. 계속해서 벡터를 EcoT22Ⅰ으로 절단하고, BAP 처리를 행하여 절단 말단을 탈인산화하 며, BAP 처리한 EcoT22Ⅰ 부위에 회수하여 둔 pol 유전자의 EcoT22Ⅰ 단편을 삽입하였다.
상기 벡터를 NotⅠ으로 절단하고, BAP 처리를 행하여 절단 말단을 탈인산화하였다. RRE 단편을 얻기 위해 종래형 패키징 벡터(서열번호 : 27)를 템플레이트로 하고, 프라이머 8F(서열번호 : 30)와 8R(서열번호 : 31)로 PCR을 행하여 pGEM-T Easy vector(프로메가사)로 TA 클로닝하였다. NotⅠ으로 RRE 단편을 잘라내었다. 탈인산화한 벡터의 NotⅠ 부위로 RRE 단편을 라이게이션하고, 개량형 패키징 벡터(서열번호 : 3)를 완성시켰다.
1-3. rev 발현 벡터의 구축
rev 단백은 지금까지 종래형 패키징 벡터로부터 공급되고 있었지만, 패키징 벡터의 상기 개량에 동반하여, rev 단백을 다른 발현 플라스미드의 형태로 공급하는 것으로 하여, 새롭게 발현 벡터를 구축하였다. rev는 게놈 상에서는 인트론으로 2개로 나뉘어져 있지만, 하나로 결합하여 발현 플라스미드에 삽입하는 것으로 하였다(도 4A, B).
먼저, 종래의 패키징 벡터를 템플레이트로 하고, 2개의 단편을 PCR에 의해 제작하였다. 5'측 단편은 프라이머 1F(서열번호 : 32)와 1R(서열번호 : 33)을 사용하고, 3'측 단편은 프라이머 2F(서열번호 : 34)와 2R(서열번호 : 35)을 사용하여 증폭하였다. 2종류의 PCR 단편을 회수하고, 혼합하여 PCR의 템플레이트로 하며, 프라이머 1F와 2R을 사용하여 증폭하고, 2개의 단편을 연결한 목적의 rev 유전자 단편(서열번호 : 12)을 얻었다. PCR로 증폭한 rev 단편을 pGEM-T Easy vector로 TA 클로닝하였다. 계속해서 상기 벡터를 EcoRⅠ으로 절단하고, EcoRⅠ 부위가 부가된 rev 단편을 회수하였다. 한편, 단백 발현용 pCI 벡터(프로메가사)를 EcoRⅠ으로 절단하고, 절단 부위를 BAP 처리하였다. 회수한 rev 단편과 pCI 발현 벡터를 라이게이션하고, rev 발현 벡터로 하였다.
[실시예 2] cPPT, WPRE를 탑재한 SIV 벡터의 기능평가
cPPT, WPRE의 도입 효과를 조사하기 위해, cPPT, WPRE 동시 탑재 외에 cPPT 단독 탑재, WPRE 단독 탑재 벡터를 생산하여 종래형 대조와 비교하였다. 모든 유전자 트랜스퍼 벡터는 EGFP를 탑재하고 있는 것을 사용하였다. 패키징 벡터는 종래형(서열번호 : 27)을 사용하였다.
2-1. SIV 벡터의 조제
인간태아 신장세포 유래 세포주 293T 세포를 15 ㎝ 플라스틱 샬레 1개당 약 1×107(다음날 70-80% 밀도)이 되도록 파종하고, 10% 소태아 혈청을 포함하는 D-MEM 배지(Gibco BRL) 20 ㎖에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양한 후, 배지를 10 ㎖의 OPTI-MEM 배지(Gibco BRL)에 치환하여 세포를 트랜스펙트에 사용하였다.
샬레 1개당 유전자 트랜스터 벡터 6 ㎍, 패키징 벡터 3 ㎍, VSV-G 발현 벡터 1 ㎍을 1.5 ㎖의 OPTI-MEM 배지에 용해한 후, 40 ㎕의 PLUS Reagent(인비트로젠사)를 첨가하여 교반하고, 15분간 실온에서 정치하였다. 유전자 트랜스퍼 벡터는 cPPT, WPRE 동시 탑재, cPPT 단독 탑재, WPRE 단독 탑재, 또는 종래형(cPPT, WPRE 모두 탑재하고 있지 않은) 것을 사용하였다. 여기에 1.5 ㎖의 OPTI-MEM 배지에서 희석한 60 ㎕의 LIPOFECTAMINE Reagent(인비트로젠사)를 첨가하여 교반하고, 15분간 실온에서 정치하였다.
상기 DNA 복합체를 15 ㎝ 샬레의 세포에 적하하고, 부드럽게 진탕시켜서 섞어 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3시간 인큐베이트하였다. 인큐베이트한 후, 샬레에 13 ㎖의 20% 소태아 혈청을 포함하는 D-MEM 배지를 첨가하여 배양하였다. 트랜스펙트 다음날에 새로운 10% 소태아 혈청을 포함하는 D-MEM 배지 30 ㎖와 교환하여 배양하였다. 트랜스펙트 2일 후 상청을 회수하고, 0.45 ㎛의 필터로 여과하여 벡터액으로 하였다.
2-2. SIV 벡터의 역가 측정
SIV 벡터의 역가에는 탑재 유전자 단백의 발현 세포수로부터 산출하는 기능 역가(Functional titer : TU/㎖)와 벡터 입자수로부터 산출하는 값(Particle titer : particles/㎖)이 있다. cPPT, WPRE의 성능평가는 Partilce titer를 동일하게 세포에 감염시켜서 평가하기 때문에, 이하와 같이 도트 블로팅에 의한 방법으로 Particle titer를 측정하였다.
먼저, 상기한 바와 같이 생산한 벡터액으로부터 시판의 키트(퀴아젠사의 QIAamp Viral RNA mini kit)를 사용하여 RNA 추출을 행하였다. 다음으로, 슬롯 블로터를 사용하여 HybondN+멤브레인(아마샴사)에 RNA를 블로팅하였다. 동시에 검량선용 몰수를 계산한 플라스미드 DNA도 블로팅하였다. 또한, RNA의 처리방법은 멤브레인 부속 프로토콜에 따랐다. DNA는 가열 급냉하였다. 멤브레인을 알칼리 고정한 후, 하이브리다이제이션을 행하였다. 하이브리다이즈에 관해서는 로체의 DIG 라벨로의 검출 시스템을 사용하였다. 프로브는 DIG 라벨 NTP를 사용하여 제작하고, 하이브리다이제이션 이후의 조작은 DIG Easy Hyb, DIG Wash and Block Buffer Set(로체)를 사용하였다. anti-DIG AP conjugate antibody(로체) 및 CSPD(로체)를 사용하고, 화학 발광시켜서 루미노 이미지 애널라이저(후지사진필름 : LAS-1000)를 사용하여 시그널을 검출·정량하였다.
2-3. SIV 벡터의 세포로의 유전자 도입, 평가
Particle titer를 측정한 4종류의 벡터는 이하와 같이 MOI(multiplicity of infection)를 바꾸어 세포에 감염시키고, FACS 해석을 행하였다. 293T 세포를 6 웰의 플라스틱 컬처 플레이트에 1 웰당 1×106개로 파종하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 플레이트 1 웰의 세포수를 혈구 계수판으로 계산하고, 플레이트의 배지를 제거하여 새로운 10% 소태아 혈청을 포함하는 D-MEM 배지 2 ㎖로 희석한 벡터를 MOI(Particles/cell)가 0.3, 1.5, 7.5, 15가 되도록 첨가하였다. 감염 1일 후, 세포의 배지를 2 ㎖의 새로운 것으로 교환하였다. 감염 2일 후, 벡터에 의해 유전자 도입된 EGFP를 형광 현미경으로 관찰하고, EGFP 양성세포의 비율을 측정하여 추가로 형광강도(EGFP 단백량의 기준이 되는 값)도 측정하였다.
2-4. 벡터 기능평가의 결과
종래형 유전자 트랜스퍼 벡터를 대조로 하고, cPPT 단독 탑재, WPRE 단독 탑재, cPPT, WPRE 동시 탑재의 4종류의 벡터를 생산하였다. 벡터 디자인의 모식도를 도 5-(a)에 나타낸다.
생산한 벡터의 Particle titer를 측정한 바, 4종류 모두 벡터 입자의 생산성에는 차이가 보이지 않았다. 벡터 입자수로 MOI(1개의 세포에 감염시킨 벡터 입자수)를 통일하여 293T 세포에 유전자를 도입하고, 형광 현미경으로 관찰한 바, MOI:15에서는 도 5-(b)에 나타내는 바와 같이, cPPT와 WPRE가 없는 종래형 대조(-cPPT, -WPRE)에서는 EGFP 양성세포의 수가 적고 형광도 약했다. cPPT 단독 탑재(+cPPT, -WPRE)에서는 EGFP 양성세포의 수가 증가하였다. WPRE 단독 탑재(-cPPT, +WPRE)에서는 EGFP 양성세포의 수는 대조에 비해 근소한 증가밖에 인정되지 않았지만, EGFP 단백의 형광은 증강되었다. cPPT, WPRE 동시 탑재(+cPPT, +WPRE)에서는 2개의 인자가 상승적으로 효과를 발휘하고, 세포수, 형광강도의 양쪽 모두 cPPT, WPRE 단독 탑재인 것 보다 큰폭으로 증가하여 기대 이상의 결과가 되었다.
EGFP 양성세포의 비율을 FACS로 조사한 바(도 6), 모두 MOI 의존적으로 유전자 삽입 비율이 증가하였지만, cPPT, WPRE 동시 탑재인 것은 대조에 비해 약 10배나 도입효율이 상승하였다. 즉 실질적인 기능 역가(생산성)가 10배 상승하였다.
또한, EGFP 양성세포의 평균 형광강도를 조사한 바(도 7), cPPT, WPRE 동시 탑재인 것은 WPRE 단독 탑재인 것보다 매우 높아져 있고, 세포당 단백 발현량도 대폭 증가하고 있는 것이 명백해졌다.
[실시예 3] 치료용 유전자 탑재 SIV 벡터의 대량 조제 및 농축
도 1에 나타내는 개량형 유전자 트랜스퍼 벡터, 패키징 벡터, rev 발현 벡터 및 VSV-G 발현 벡터의 4종류의 플라스미드를 토대로 이하와 같이 SIV 벡터를 조제 하였다. PEDF의 치료 유전자를 탑재한 벡터는 15 ㎝ 샬레 20개 단위로 생산을 행하였다.
293T 세포를 15 ㎝ 플라스틱 샬레 1개당 약 1×107(다음날 70-80% 밀도)이 되도록 파종하고, 10% 소태아 혈청을 포함하는 D-MEM 배지 20 ㎖에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양한 후, 배지를 10 ㎖의 OPTI-MEM 배지에 치환하여 트랜스펙트에 사용하였다. 샬레 1개당 유전자 트랜스터 벡터 10 ㎍, 패키징 벡터 5 ㎍, rev 발현 벡터 2 ㎍, VSV-G 발현 벡터 2 ㎍을 1.5 ㎖의 OPTI-MEM 배지에 용해한 후, 40 ㎕의 PLUS Reagent(인비트로젠사)를 첨가하여 교반하고, 15분간 실온에서 정치하였다. 여기에 1.5 ㎖의 OPTI-MEM 배지에서 희석한 60 ㎕의 LIPOFECTAMINE Reagent를 첨가하여 교반하고, 15분간 실온에서 정치하였다. 이 DNA 복합체를 상기의 15 ㎝ 샬레의 세포에 적하하고, 부드럽게 진탕시켜서 섞어 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3시간 인큐베이트하였다. 상기 샬레에 13 ㎖의 20% 소태아 혈청을 포함하는 D-MEM 배지를 첨가하여 배양하였다.
트랜스펙트 다음날에 새로운 10% 소태아 혈청을 포함하는 D-MEM 배지 30 ㎖와 교환하여 배양하였다. 트랜스펙트 2일 후 상청을 회수하고, 새로운 배지를 20 ㎖ 첨가하였다. 회수한 상청은 0.45 ㎛의 필터로 여과하고 4℃에서 보존하였다. 트랜스펙트 3일 후 상청을 회수하고, 0.45 ㎛의 필터로 여과하여 전일 회수한 벡터와 합쳐서 고속 원심기를 이용하여 농축조작을 행하였다. 회수한 벡터액을 멸균처리한 튜브에 분주(分注)하고, 42500G, 4℃, 1시간 원심하였다. 이 원심조작을 2회 반복 하고, 벡터액을 500배-1000배로 농축하였다. 벡터는 펠릿으로서 침전하지만, 펠릿은 5% 소태아 혈청을 포함하는 PBS에 용해하였다. 농축한 벡터는 소량씩 분주한 후 -80℃에서 보존하고, 일부를 사용하여 Particle titer를 측정하였다. Particle titer의 측정은 전술한 방법과 동일하게 행하였다.
[실시예 4] 허혈성 재관류 모델 동물에 의한 SIV-PEDF의 녹내장 치료효과의 검토
녹내장 모델 동물로서 허혈성 재관류 모델을 제작하고, SIV-PEDF 벡터에 의한 녹내장 치료의 가능성을 검토하였다. 먼저, 본 발명의 벡터 : SIV-hPEDF 또는 외래 유전자를 가지지 않는 공벡터 : SIV-empty(2.5×107 TU/㎖, TU : transducing units) 용액을 4주령의 Wistar계 랫트의 망막하강에 투여하였다. 벡터 도입 14일 후에 상기 랫트의 눈 내를 110 ㎜Hg의 압으로 60분간 허혈상태로 하고, 망막 신경절세포를 손상시켰다. 손상 4일 후, 뇌정위 고정장치를 사용하여 형광색소 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 양쪽 상구에 주입하고, 신경절세포를 표지하였다. 망막 신경절세포 손상 7일 후(벡터 도입 21일 후) 안구를 적출하고 flat mount에서 형광 현미경으로 관찰하여 시신경으로부터 1 ㎜의 부위에 있어서의 1 ㎟당 표지 신경절세포수를 계측하였다.
대조로서, 벡터 용액 대신에 망막하강에 BSS 용액을 투여하고, 허혈성 재관류 손상처치되어 있지 않은 「벡터 비투여/비허혈 재관류 손상군」 및 벡터 용액 대신에 망막하강에 BSS 용액을 투여하고, 허혈성 재관류 손상처치된 「벡터 비투여/허혈 재관류 손상군」에 대해서도 형광 현미경에 의한 관찰 및 표지 신경절세포수 의 계측을 동일한 순서로 행하였다.
형광 현미경에 의한 관찰결과를 도 8에 나타낸다. 또한 표지 신경절세포수를 도 9에 나타낸다. 카운트한 신경절세포수는 벡터 비투여/허혈 재관류 손상군 : 177.4/㎟, SIV-empty 투여군 : 185.3/㎟, SIV-hPEDF 투여군 : 217.8/㎟였다. 이들 결과로부터 SIV-hPEDF에 의한 신경절세포 보호효과가 명백해졌다.
[실시예 5] NMDA-induced 모델에 의한 SIV-PEDF의 녹내장 치료효과의 검토
녹내장 모델 동물로서 NMDA-induced 모델을 제작하고, SIV-PEDF 벡터에 의한 녹내장 치료의 가능성을 검토하였다. 먼저, 본 발명의 벡터 SIV-hPEDF 또는 외래 유전자를 갖지 않는 공벡터 SIV-empty(2.5×107 TU/㎖, TU : transducing units) 용액을 4주령의 Wistar계 랫트의 망막하강에 투여하였다. 벡터 도입 14일 후에 NMDA 40 mM, 5 ㎕를 유리체 내에 투여하고, 신경절세포층을 선택적으로 손상시켰다. 손상 4일 후, 뇌정위 고정장치를 사용하여 형광색소 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 양쪽 상구에 주입하고, 신경절세포를 표지하였다. 망막 신경절세포 손상 7일 후(벡터 도입 21일 후) 안구를 적출하고, flat mount에서 형광 현미경으로 관찰하여 시신경으로부터 1 ㎜ 부위에 있어서의 1 ㎟당 표지 신경절세포수를 계측하였다.
대조로서, 벡터 용액 대신에 망막하강에 BSS 용액을 투여하고, NMDA 처치되어 있지 않은 「벡터 비투여/비NMDA-induced군」 및 벡터 용액 대신에 망막하강에 BSS 용액을 투여하고, NMDA 처치된 「벡터 비투여/NMDA-induced군」에 대해서도 형 광 현미경에 의한 관찰 및 표지 신경절세포수의 계측을 동일한 순서로 행하였다.
형광 현미경에 의한 결과를 도 10에 나타낸다. 또한 표지 신경절세포수를 도 11에 나타낸다. 카운트한 신경절세포의 수는 허혈성 재관류 모델의 경우와 동일하게 NMDA-induced 모델에 있어서도 SIV-hPEDF 벡터에 의한 신경절세포 보호효과가 증명되었다.
본 발명에 의해서 PEDF를 유효하게 안조직 세포로 도달시키는 벡터가 제공되었다. 본 발명의 SIV-PEDF 벡터는 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 신규 치료수단을 가져온다. 즉, 본 발명의 SIV-PEDF 벡터를 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환환자에게 투여함으로써, PEDF가 환자의 세포 내에서 지속적으로 제공되어, 녹내장 등의 최종적 병태인 망막 신경절세포의 아포토시스를 억제할 수 있다. 아포토시스 변성을 동반하는 안질환의 다수가 만성적 질환인 것을 고려하면, 본 발명의 SIV-PEDF는 상기 질환에 대한 매우 유효한 의약품이라고 하는 것이 증명되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> DNAVEC CORPORATION
<120> A pharmaceutical composition comprising SIV-PDEF vector for treatment of apotosis-related ophthalmologic disease
<130> D4-A0403P
<150> JP 2005-047951
<151> 2005-02-23
<160> 35
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7062
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized vector sequence
<400> 1
ggtacctcaa tattggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat 60
tggctattgg ccattgcata cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc 120
atgtccaata tgaccgccat gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat 180
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 240
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 360
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt 420
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc 480
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 540
gtacaccaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 600
tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660
caactgcgat cgcccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 720
tatataagca gagctcgctg gcttgtaact cagtctctta ctaggagacc agcttgagcc 780
tgggtgttcg ctggttagcc taacctggtt ggccaccagg ggtaaggact ccttggctta 840
gaaagctaat aaacttgcct gcattagagc ttatctgagt caagtgtcct cattgacgcc 900
tcactctctt gaacgggaat cttccttact gggttctctc tctgacccag gcgagagaaa 960
ctccagcagt ggcgcccgaa cagggacttg agtgagagtg taggcacgta cagctgagaa 1020
ggcgtcggac gcgaaggaag cgcggggtgc gacgcgacca agaaggagac ttggtgagta 1080
ggcttctcga gtgccgggaa aaagctcgag cctagttaga ggactaggag aggccgtagc 1140
cgtaactact ctgggcaagt agggcaggcg gtgggtacgc aatgggggcg gctacctcag 1200
cactaaatag gagacaatta gaccaatttg agaaaatacg acttcgcccg aacggaaaga 1260
aaaagtacca aattaaacat ttaatatggg caggcaagga gatggagcgc ttcggcctcc 1320
atgagaggtt gttggagaca gaggaggggt gtaaaagaat catagaagtc ctctaccccc 1380
tagaaccaac aggatcggag ggcttaaaaa gtctgttcaa tcttgtgtgc gtgctatatt 1440
gcttgcacaa ggaacagaaa gtgaaagaca cagaggaagc agtagcaaca gtaagacaac 1500
actgccatct agtggaaaaa gaaaaaagtg caacagagac atctagtgga caaaagaaaa 1560
atgacaaggg aatagcagcg ccacctggtg gcagtcagaa ttttccagcg caacaacaag 1620
gaaatgcctg ggtacatgta cccttgtcac cgcgcacctt aaatgcgtgg gtaaaagcag 1680
tagaggagaa aaaatttgga gcagaaatag tacccatgtt tcaagcccta tcgaattccc 1740
gtttgtgcta gggttcttag gcttcttggg ggctgctgga actgcaatgg gagcagcggc 1800
gacagccctg acggtccagt ctcagcattt gcttgctggg atactgcagc agcagaagaa 1860
tctgctggcg gctgtggagg ctcaacagca gatgttgaag ctgaccattt ggggtgttaa 1920
aaacctcaat gcccgcgtca cagcccttga gaagtaccta gaggatcagg cacgactaaa 1980
ctcctggggg tgcgcatgga aacaagtatg tcataccaca gtggagtggc cctggacaaa 2040
tcggactccg gattggcaaa atatgacttg gttggagtgg gaaagacaaa tagctgattt 2100
ggaaagcaac attacgagac aattagtgaa ggctagagaa caagaggaaa agaatctaga 2160
tgcctatcag aagttaacta gttggtcaga tttctggtct tggttcgatt tctcaaaatg 2220
gcttaacatt ttaaaaatgg gatttttagt aatagtagga ataatagggt taagattact 2280
ttacacagta tatggatgta tagtgagggt taggcaggga tatgttcctc tatctccaca 2340
gatccatatc cgcggcaatt ttaaaagaaa gggaggaata gggggacaga cttcagcaga 2400
gagactaatt aatataataa caacacaatt agaaatacaa catttacaaa ccaaaattca 2460
aaaaatttta aattttagag ccgcggtagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta 2520
gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 2580
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 2640
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 2700
gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 2760
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 2820
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 2880
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 2940
agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 3000
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta 3060
gtgaaccgtc agatccagcg gccgcaagct tggatcctta agttaatcaa cctctggatt 3120
acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg 3180
gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct 3240
cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc 3300
aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca 3360
ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac 3420
tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 3480
ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct 3540
ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc 3600
cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga 3660
cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcagatccg cactttttaa aagaaaaggg 3720
aggactggat gggatttatt actccgatag gacgctggct tgtaactcag tctcttacta 3780
ggagaccagc ttgagcctgg gtgttcgctg gttagcctaa cctggttggc caccaggggt 3840
aaggactcct tggcttagaa agctaataaa cttgcctgca ttagagctct tacgcgtgct 3900
agcccgggct cgagatccgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc 3960
gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 4020
tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg 4080
aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagcta acttgtttat tgcagcttat 4140
aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 4200
cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg tcgaccgatg 4260
cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc 4320
gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc 4380
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 4440
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 4500
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 4560
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 4620
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 4680
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 4740
cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 4800
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 4860
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 4920
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 4980
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 5040
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 5100
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 5160
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 5220
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 5280
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 5340
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 5400
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 5460
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 5520
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 5580
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 5640
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 5700
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 5760
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 5820
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 5880
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 5940
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 6000
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 6060
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 6120
aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 6180
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 6240
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 6300
agtgccacct gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 6360
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 6420
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 6480
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 6540
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 6600
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 6660
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acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttccc attcgccatt 6780
caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagcc 6840
caagctacca tgataagtaa gtaatattaa ggtacgggag gtacttggag cggccggccg 6900
caataaaata tctttatttt cattacatct gtgtgttggt tttttgtgtg aatcgatagt 6960
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ccccagtgca agtgcaggtg ccagaacatt tctctatcga ta 7062
<210> 2
<211> 8363
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized vector sequence
<400> 2
ggtacctcaa tattggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat 60
tggctattgg ccattgcata cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc 120
atgtccaata tgaccgccat gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat 180
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 240
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 360
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt 420
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc 480
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 540
gtacaccaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 600
tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660
caactgcgat cgcccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 720
tatataagca gagctcgctg gcttgtaact cagtctctta ctaggagacc agcttgagcc 780
tgggtgttcg ctggttagcc taacctggtt ggccaccagg ggtaaggact ccttggctta 840
gaaagctaat aaacttgcct gcattagagc ttatctgagt caagtgtcct cattgacgcc 900
tcactctctt gaacgggaat cttccttact gggttctctc tctgacccag gcgagagaaa 960
ctccagcagt ggcgcccgaa cagggacttg agtgagagtg taggcacgta cagctgagaa 1020
ggcgtcggac gcgaaggaag cgcggggtgc gacgcgacca agaaggagac ttggtgagta 1080
ggcttctcga gtgccgggaa aaagctcgag cctagttaga ggactaggag aggccgtagc 1140
cgtaactact ctgggcaagt agggcaggcg gtgggtacgc aatgggggcg gctacctcag 1200
cactaaatag gagacaatta gaccaatttg agaaaatacg acttcgcccg aacggaaaga 1260
aaaagtacca aattaaacat ttaatatggg caggcaagga gatggagcgc ttcggcctcc 1320
atgagaggtt gttggagaca gaggaggggt gtaaaagaat catagaagtc ctctaccccc 1380
tagaaccaac aggatcggag ggcttaaaaa gtctgttcaa tcttgtgtgc gtgctatatt 1440
gcttgcacaa ggaacagaaa gtgaaagaca cagaggaagc agtagcaaca gtaagacaac 1500
actgccatct agtggaaaaa gaaaaaagtg caacagagac atctagtgga caaaagaaaa 1560
atgacaaggg aatagcagcg ccacctggtg gcagtcagaa ttttccagcg caacaacaag 1620
gaaatgcctg ggtacatgta cccttgtcac cgcgcacctt aaatgcgtgg gtaaaagcag 1680
tagaggagaa aaaatttgga gcagaaatag tacccatgtt tcaagcccta tcgaattccc 1740
gtttgtgcta gggttcttag gcttcttggg ggctgctgga actgcaatgg gagcagcggc 1800
gacagccctg acggtccagt ctcagcattt gcttgctggg atactgcagc agcagaagaa 1860
tctgctggcg gctgtggagg ctcaacagca gatgttgaag ctgaccattt ggggtgttaa 1920
aaacctcaat gcccgcgtca cagcccttga gaagtaccta gaggatcagg cacgactaaa 1980
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tcggactccg gattggcaaa atatgacttg gttggagtgg gaaagacaaa tagctgattt 2100
ggaaagcaac attacgagac aattagtgaa ggctagagaa caagaggaaa agaatctaga 2160
tgcctatcag aagttaacta gttggtcaga tttctggtct tggttcgatt tctcaaaatg 2220
gcttaacatt ttaaaaatgg gatttttagt aatagtagga ataatagggt taagattact 2280
ttacacagta tatggatgta tagtgagggt taggcaggga tatgttcctc tatctccaca 2340
gatccatatc cgcggcaatt ttaaaagaaa gggaggaata gggggacaga cttcagcaga 2400
gagactaatt aatataataa caacacaatt agaaatacaa catttacaaa ccaaaattca 2460
aaaaatttta aattttagag ccgcggtagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta 2520
gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 2580
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 2640
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 2700
gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 2760
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 2820
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 2880
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ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta 3060
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<210> 3
<211> 10023
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized vector sequence
<400> 3
gctcgagact agtgacttgg tgagtaggct tcgagcctag ttagaggact aggagaggcc 60
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att 10023
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<212> DNA
<213> Simian immunodeficiency virus
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc 590
<210> 10
<211> 125
<212> DNA
<213> Simian immunodeficiency virus
<400> 10
caattttaaa agaaagggag gaataggggg acagacttca gcagagagac taattaatat 60
aataacaaca caattagaaa tacaacattt acaaaccaaa attcaaaaaa ttttaaattt 120
tagag 125
<210> 11
<211> 591
<212> DNA
<213> woodchuck hepatitis virus
<400> 11
ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg 60
ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc 120
gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt 180
tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca 240
ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc 300
ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc 360
tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc 420
tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc 480
tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc 540
ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg c 591
<210> 12
<211> 255
<212> DNA
<213> Simian immunodeficiency virus
<400> 12
atgcccctag gaccagaaga aagaagattc gttcgcttaa tttggctcct ttacagcacc 60
aatccatatc caccaagtgg ggaagggacg gccagacaac gccgacgagc caggagaagg 120
tggagacaac agcaggatca aattagagtc ttggtagaaa gactccaaga gcaggtgtat 180
gcagttgacc gcctggctga cgaggctcaa cacttggcta tacaacagtt gcctgaccct 240
cctcattcag cttag 255
<210> 13
<211> 7060
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized vector sequence
<400> 13
ggtacctcaa tattggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat 60
tggctattgg ccattgcata cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc 120
atgtccaata tgaccgccat gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat 180
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 240
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 360
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt 420
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc 480
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 540
gtacaccaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 600
tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660
caactgcgat cgcccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 720
tatataagca gagctcgctg gcttgtaact cagtctctta ctaggagacc agcttgagcc 780
tgggtgttcg ctggttagcc taacctggtt ggccaccagg ggtaaggact ccttggctta 840
gaaagctaat aaacttgcct gcattagagc ttatctgagt caagtgtcct cattgacgcc 900
tcactctctt gaacgggaat cttccttact gggttctctc tctgacccag gcgagagaaa 960
ctccagcagt ggcgcccgaa cagggacttg agtgagagtg taggcacgta cagctgagaa 1020
ggcgtcggac gcgaaggaag cgcggggtgc gacgcgacca agaaggagac ttggtgagta 1080
ggcttctcga gtgccgggaa aaagctcgag cctagttaga ggactaggag aggccgtagc 1140
cgtaactact ctgggcaagt agggcaggcg gtgggtacgc aatgggggcg gctacctcag 1200
cactaaatag gagacaatta gaccaatttg agaaaatacg acttcgcccg aacggaaaga 1260
aaaagtacca aattaaacat ttaatatggg caggcaagga gatggagcgc ttcggcctcc 1320
atgagaggtt gttggagaca gaggaggggt gtaaaagaat catagaagtc ctctaccccc 1380
tagaaccaac aggatcggag ggcttaaaaa gtctgttcaa tcttgtgtgc gtgctatatt 1440
gcttgcacaa ggaacagaaa gtgaaagaca cagaggaagc agtagcaaca gtaagacaac 1500
actgccatct agtggaaaaa gaaaaaagtg caacagagac atctagtgga caaaagaaaa 1560
atgacaaggg aatagcagcg ccacctggtg gcagtcagaa ttttccagcg caacaacaag 1620
gaaatgcctg ggtacatgta cccttgtcac cgcgcacctt aaatgcgtgg gtaaaagcag 1680
tagaggagaa aaaatttgga gcagaaatag tacccatgtt tcaagcccta tcgaattccc 1740
gtttgtgcta gggttcttag gcttcttggg ggctgctgga actgcaatgg gagcagcggc 1800
gacagccctg acggtccagt ctcagcattt gcttgctggg atactgcagc agcagaagaa 1860
tctgctggcg gctgtggagg ctcaacagca gatgttgaag ctgaccattt ggggtgttaa 1920
aaacctcaat gcccgcgtca cagcccttga gaagtaccta gaggatcagg cacgactaaa 1980
ctcctggggg tgcgcatgga aacaagtatg tcataccaca gtggagtggc cctggacaaa 2040
tcggactccg gattggcaaa atatgacttg gttggagtgg gaaagacaaa tagctgattt 2100
ggaaagcaac attacgagac aattagtgaa ggctagagaa caagaggaaa agaatctaga 2160
tgcctatcag aagttaacta gttggtcaga tttctggtct tggttcgatt tctcaaaatg 2220
gcttaacatt ttaaaaatgg gatttttagt aatagtagga ataatagggt taagattact 2280
ttacacagta tatggatgta tagtgagggt taggcaggga tatgttcctc tatctccaca 2340
gatccatatc cgcggtagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 2400
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 2460
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 2520
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 2580
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 2640
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 2700
agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 2760
gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 2820
gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat 2880
gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctggtttag tgaaccgtca 2940
gatccgctag cgctaccggt cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 3000
gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 3060
ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 3120
ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 3180
ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 3240
ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 3300
gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 3360
aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 3420
tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 3480
atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 3540
ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 3600
cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 3660
ctcggcatgg acgagctgta caagtaagcg gccgcggatc cgcacttttt aaaagaaaag 3720
ggaggactgg atgggattta ttactccgat aggacgctgg cttgtaactc agtctcttac 3780
taggagacca gcttgagcct gggtgttcgc tggttagcct aacctggttg gccaccaggg 3840
gtaaggactc cttggcttag aaagctaata aacttgcctg cattagagct cttacgcgtg 3900
ctagcccggg ctcgagatcc gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact 3960
ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 4020
atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag 4080
tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc taacttgttt attgcagctt 4140
ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 4200
tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgtcgaccga 4260
tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg 4320
tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc 4380
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 4440
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 4500
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 4560
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 4620
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 4680
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 4740
agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 4800
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 4860
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 4920
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 4980
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 5040
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 5100
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 5160
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 5220
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 5280
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 5340
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 5400
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 5460
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 5520
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 5580
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 5640
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 5700
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 5760
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 5820
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 5880
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 5940
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 6000
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 6060
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 6120
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 6180
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 6240
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 6300
aaagtgccac ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 6360
cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 6420
tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 6480
gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 6540
tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 6600
ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 6660
tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 6720
taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc ccattcgcca 6780
ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag 6840
cccaagctac catgataagt aagtaatatt aaggtacggg aggtacttgg agcggccgca 6900
ataaaatatc tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgaa tcgatagtac 6960
taacatacgc tctccatcaa aacaaaacga aacaaaacaa actagcaaaa taggctgtcc 7020
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<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 14
atatccgcgg tagttattaa tagtaatc 28
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 15
tggccgcggc cgctggatct gacggttcac taaaccagc 39
<210> 16
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 16
ggccgcaagc ttg 13
<210> 17
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 17
gatccaagct tgc 13
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 18
ttgccgcggc aattttaaaa gaaagggagg a 31
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 19
gagccgcggc tctaaaattt aaaatttttt g 31
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 20
taaggatcct taagttaatc aacctctgga ttaca 35
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 21
cgcagatctg cggggaggcg gcccaaag 28
<210> 22
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized nucleotide sequence
<400> 22
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
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ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 23
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 23
ccatggcggc cgccatggtg agcaagggcg agga 34
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 24
agtagcggcc gctacttact tgtacagctc gtccat 36
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 25
aggatgcagg ccctggtgct actcct 26
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 26
ttatattagg ggcccctggg gtccaga 27
<210> 27
<211> 11471
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized vector sequence
<400> 27
gctcgagact agtgacttgg tgagtaggct tcgagcctag ttagaggact aggagaggcc 60
gtagccgtaa ctactctggg caagtagggc aggcggtggg tacgcaatgg gggcggctac 120
ctcagcacta aataggagac aattagacca atttgagaaa atacgacttc gcccgaacgg 180
aaagaaaaag taccaaatta aacatttaat atgggcaggc aaggagatgg agcgcttcgg 240
cctccatgag aggttgttgg agacagagga ggggtgtaaa agaatcatag aagtcctcta 300
ccccctagaa ccaacaggat cggagggctt aaaaagtctg ttcaatcttg tgtgcgtact 360
atattgcttg cacaaggaac agaaagtgaa agacacagag gaagcagtag caacagtaag 420
acaacactgc catctagtgg aaaaagaaaa aagtgcaaca gagacatcta gtggacaaaa 480
gaaaaatgac aagggaatag cagcgccacc tggtggcagt cagaattttc cagcgcaaca 540
acaaggaaat gcctgggtac atgtaccctt gtcaccgcgc accttaaatg cgtgggtaaa 600
agcagtagag gagaaaaaat ttggagcaga aatagtaccc atgtttcaag ccctatcaga 660
aggctgcaca ccctatgaca ttaatcagat gcttaatgtg ctaggagatc atcaaggggc 720
attacaaata gtgaaagaga tcattaatga agaagcagcc cagtgggatg taacacaccc 780
actacccgca ggacccctac cagcaggaca gctcagggac cctcgcggct cagatatagc 840
agggaccacc agctcagtac aagaacagtt agaatggatc tatactgcta acccccgggt 900
agatgtaggt gccatctacc ggagatggat tattctagga cttcaaaagt gtgtcaaaat 960
gtacaaccca gtatcagtcc tagacattag gcagggacct aaagagccct tcaaggatta 1020
tgtggacaga ttttacaagg caattagagc agaacaagcc tcaggggaag tgaaacaatg 1080
gatgacagaa tcattactca ttcaaaatgc taatccagat tgtaaggtca tcctgaaggg 1140
cctaggaatg caccccaccc ttgaagaaat gttaacggct tgtcaggggg taggaggccc 1200
aagctacaaa gcaaaagtaa tggcagaaat gatgcagacc atgcaaaatc aaaacatggt 1260
gcagcaggga ggtccaaaaa gacaaagacc cccactaaga tgttataatt gtggaaaatt 1320
tggccatatg caaagacaat gtccggaacc aaggaaaaca aaatgtctaa agtgtggaaa 1380
attgggacac ctagcaaaag actgcagggg acaggtgaat tttttagggt atggacggtg 1440
gatgggggca aaaccgagaa attttcccgc cgctactctt ggagcggaac cgagtgcgcc 1500
tccttcaccg agcggcacca ccccatacga cccagcaaag aagctcctgc agcaatatgc 1560
agagaaaggg aaacaactga gggagcaaaa gaggaatcca ccggcaatga atccggattg 1620
gaccgaggga tattctttga actccctctt tggagaagac caataaagac agtgtatata 1680
gaaggggtcc ccattaaggc actgctagac acaggggcag atgacaccat aattaaagaa 1740
aatgatttac aattatcagg tccatggaga cccaaaatta tagggggcat aggaggaggc 1800
cttaatgtaa aagaatataa cgacagggaa gtaaaaatag aagataaaat tttgagagga 1860
acaatattgt taggagcaac tcccattaat ataataggta gaaatttgct ggccccggca 1920
ggtgcccggt tagtaatggg acaattatca gaaaaaattc ctgtcacacc tgtcaaattg 1980
aaggaagggg ctcggggacc ctgtgtaaga caatggcctc tctctaaaga gaagattgaa 2040
gctttacagg aaatatgttc ccaattagag caggaaggaa aaatcagtag agtaggagga 2100
gaaaatgcat acaatacccc aatattttgc ataaagaaga aggacaaatc ccagtggagg 2160
atgctagtag actttagaga gttaaataag gcaacccaag atttctttga agtgcaatta 2220
gggatacccc acccagcagg attaagaaag atgagacaga taacagtttt agatgtagga 2280
gacgcctatt attccatacc attggatcca aattttagga aatatactgc ttttactatt 2340
cccacagtga ataatcaggg acccgggatt aggtatcaat tcaactgtct cccgcaaggg 2400
tggaaaggat ctcctacaat cttccaaaat acagcagcat ccattttgga ggagataaaa 2460
agaaacttgc cagcactaac cattgtacaa tacatggatg atttatgggt aggttctcaa 2520
gaaaatgaac acacccatga caaattagta gaacagttaa gaacaaaatt acaagcctgg 2580
ggcttagaaa ccccagaaaa gaaggtgcaa aaagaaccac cttatgagtg gatgggatac 2640
aaactttggc ctcacaaatg ggaactaagc agaatacaac tggaggaaaa agatgaatgg 2700
actgtcaatg acatccagaa gttagttggg aaactaaatt gggcagcaca attgtatcca 2760
ggtcttagga ccaagaatat atgcaagtta attagaggaa agaaaaatct gttagagcta 2820
gtgacttgga cacctgaggc agaagctgaa tatgcagaaa atgcagagat tcttaaaaca 2880
gaacaggaag gaacctatta caaaccagga atacctatta gggcagcagt acagaaattg 2940
gaaggaggac agtggagtta ccaattcaaa caagaaggac aagtcttgaa agtaggaaaa 3000
tacaccaagc aaaagaacac ccatacaaat gaacttcgca cattagctgg tttagtgcag 3060
aagatttgca aagaagctct agttatttgg gggatattac cagttctaga actcccgata 3120
gaaagagagg tatgggaaca atggtgggcg gattactggc aggtaagctg gattcccgaa 3180
tgggattttg tcagcacccc acctttgctc aaactatggt acacattaac aaaagaaccc 3240
atacccaagg aggacgttta ctatgtagat ggagcatgca acagaaattc aaaagaagga 3300
aaagcaggat acatctcaca atacggaaaa cagagagtag aaacattaga aaacactacc 3360
aatcagcaag cagaattaac agctataaaa atggctttgg aagacagtgg gcctaatgtg 3420
aacatagtaa cagactctca atatgcaatg ggaattttga cagcacaacc cacacaaagt 3480
gattcaccat tagtagagca aattatagcc ttaatgatac aaaagcaaca aatatatttg 3540
cagtgggtac cagcacataa aggaatagga ggaaatgagg agatagataa attagtgagt 3600
aaaggcatta gaagagtttt attcttagaa aaaatagaag aagctcaaga agagcatgaa 3660
agatatcata ataattggaa aaacctagca gatacatatg ggcttccaca aatagtagca 3720
aaagagatag tggccatgtg tccaaaatgt cagataaagg gagaaccagt gcatggacaa 3780
gtggatgcct cacctggaac atggcagatg gattgtactc atctagaagg aaaagtagtc 3840
atagttgcgg tccatgtagc cagtggattc atagaagcag aagtcatacc tagggaaaca 3900
ggaaaagaaa cggcaaagtt tctattaaaa atactgagta gatggcctat aacacagtta 3960
cacacagaca atgggcctaa ctttacctcc caagaagtgg cagcaatatg ttggtgggga 4020
aaaattgaac atacaacagg tataccatat aacccccaat ctcaaggatc aatagaaagc 4080
atgaacaaac aattaaaaga gataattggg aaaataagag atgattgcca atatacagag 4140
acagcagtac tgatggcttg ccatattcac aattttaaaa gaaagggagg aataggggga 4200
cagacttcag cagagagact aattaatata ataacaacac aattagaaat acaacattta 4260
caaaccaaaa ttcaaaaaat tttaaatttt agagtctact acagagaagg gagagaccct 4320
gtgtggaaag gaccagcaca attaatctgg aaaggggaag gagcagtggt cctcaaggac 4380
ggaagtgacc taaaggttgt accaagaagg aaagctaaaa ttattaagga ttatgaaccc 4440
aaacaaagag tgggtaatga gggtgacgtg gaaggtacca ggggatctga taactaaatg 4500
gcagggaata gtcagatatt ggatgagaca aagaaatttg aaatggaact attatatgca 4560
ttaccaaatt acatgggctt ggtacaccat gagtagatat gtaataccaa taggaaaaca 4620
tggggaaata tgtgtagacc tatattggca tttaacacca gagcaaggat ggctatccac 4680
atatgcagta ggtatacaat atgtaagcaa tttagaatct aaatatagaa cagaattaga 4740
ccctgctaca gcagatagta taatacatgg tcactatttt aattgtttta aagaaagagc 4800
catccaacaa gctctgaggg gccacagatt tgtcttctgt cagtttccag aagggcataa 4860
aagcacagga caggtaccat ctttgcagta cctagctctg ctcgcacatc aaaatggcct 4920
cagggagaga tccaagagag gcaagaccag gagaagtaga aatttgggat ctaagcaggg 4980
agccgtggga cgaatggcta agagatatgt tacaagatct caaccaggag gcgaggctgc 5040
attttgggag agaactcctg ttccaagtat ggaactactg tcaggaggaa ggagaaagac 5100
atggtactcc catgatggaa agggcctaca aatattatag gctagtacaa aaggctctct 5160
ttgtgcattt tcgatgtggg tgcaggagaa ggcagccctt tgaaccatac gaggagagga 5220
gagatggaca agggggaggc agagcaaatc gtgtcccacc aggacttgag tgaagactat 5280
cagaagcctc tgcagacttg taaaaataaa tgtttttgca aaaaatgttg ttaccactgt 5340
cagctttgct ttctgcaaaa aggcctaggt gttacctatc atgcccctag gaccagaaga 5400
aagaagattg cttcgcttga tttggctcct ttacagcacc agtaagtaga attcttttat 5460
tgtaagatgg attggttttt aaattactta aataataaaa catgggatgc agaccataat 5520
ttttgtagca gcaaaaagaa aggacacgca ccaggaccat gtgtacaaag gacgtatgtt 5580
gcttgccata tcaggtctgt aataaatgat tggtataccc tatcaaagaa aacttatgct 5640
ccgccaagag aaggacattt gcaatgcagg tccacagtca ctgggatgac agttgagctt 5700
aattataata gtaaaaacag aaccaacgtg acactaagtc cccagataga atctatctgg 5760
gcggctgaat tgggcagata caaattagtg gaaatcacac caattggctt tgcacccaca 5820
gaagtaaggc gttatacggg aggacatgag aggcaaaaga gagtcccgtt tgtgctaggg 5880
ttcttaggct tcttgggggc tgctggaact gcaatggaag cagcggcgac agccctgacg 5940
gtccagtctc agcatttgct tgctgggata ctgcagcagc agaagaatct gctggcggct 6000
gtggaggctc aacagcagat gttgaagctg accatttggg gtgttaaaaa cctcaatgcc 6060
cgcgtcacag cccttgagaa gtacctagag gatcaggcac gactaaactc ctgggggtgc 6120
gcatggaaac aagtatgtca taccacagtg gagtggccct ggacaaatcg gactccggat 6180
tggcaaaata tgacttggtt ggagtgggaa agacaaatag ctgatttgga aagcaacatt 6240
acgagacaat tagtgaaggc tagagaacaa gaggaaaaga atctagatgc ctatcagaag 6300
ttaactagtt ggtcagattt ctggtcttgg ttcgatttct caaaatggct taacatttta 6360
aaaatgggat ttttagtaat agtaggaata atagggttaa gattacttta cacagtatat 6420
ggatgtatag tgagggttag gcagggatat gttcctctat ctccacagat ccatatccac 6480
caagtgggga agggacggcc agacaacgcc gacgagccag gagaaggtgg agacaacagc 6540
aggatcaaat tagagtcttg gtagaaagac tccaagagca ggtgtatgca gttgaccgcc 6600
tggctgacga ggctcaacac ttggctatac aacagttgcc tgaccctcct cattcagctt 6660
agctagcggc cgcaattcac tcctcaggtg caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt 6720
gtggccaatg ccctggctca caaataccac tgagatcttt ttccctctgc caaaaattat 6780
ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc 6840
attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata tgggagggca 6900
aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt tggcaacata tgcccatatg 6960
ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc agtatatgaa acagccccct 7020
gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt ttttatattt 7080
tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt tttactagcc 7140
agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg tccctcttct cttatggaga 7200
tccctcgacc tgcagcccaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 7260
ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 7320
gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 7380
gtcgggaaac ctgtcgtgcc agcggatccg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg 7440
cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 7500
ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 7560
cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct aacttgttta 7620
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 7680
ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 7740
ggatccgctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 7800
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 7860
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 7920
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 7980
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 8040
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 8100
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 8160
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 8220
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 8280
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 8340
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 8400
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 8460
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 8520
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 8580
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 8640
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 8700
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 8760
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 8820
cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 8880
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 8940
cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 9000
ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 9060
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 9120
atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 9180
tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 9240
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 9300
aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 9360
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 9420
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 9480
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 9540
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 9600
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 9660
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 9720
aaaagtgcca cctgggtcga tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 9780
acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 9840
ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 9900
cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 9960
actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 10020
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 10080
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg 10140
ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt 10200
ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 10260
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 10320
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 10380
aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc 10440
gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc 10500
gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt 10560
tcttttctgt ggctgcgtga aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg 10620
agcggctcgg ggggtgcgtg cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg 10680
ctgcccggcg gctgtgagcg ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg 10740
cgcgagggga gcgcggccgg gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac 10800
aaaggctgcg tgcggggtgt gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc 10860
gggctgcaac cccccctgca cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt 10920
gcggggctcc gtacggggcg tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag 10980
gtgggggtgc cgggcggggc ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc 11040
ggcggccccc ggagcgccgg cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta 11100
tggtaatcgt gcgagagggc gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa 11160
tctgggaggc gccgccgcac cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc 11220
aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct 11280
ctccagcctc ggggctgtcc gcggggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg 11340
gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc 11400
ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt 11460
ggcaaagaat t 11471
<210> 28
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 28
tcagctggc 9
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 29
ggccgccagc tgatgca 17
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 30
cccgtttgtg ctagggttct tagg 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 31
ggatatggat ctgtggagat agag 24
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 32
atgcccctag gaccagaaga aag 23
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 33
acttggtgga tatggattgg tgctgtaaag gagccaa 37
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 34
ttggctcctt tacagcacca atccatatcc accaagt 37
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 35
ctaagctgaa tgaggagggt cag 23
Claims (14)
- 색소상피 유래 인자(Pigment epithelium derived factor:PEDF) 유전자를 보유하는 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터 및 약학적으로 허용되는 매체를 포함하는 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료용 의약품.
- 제1항에 있어서, 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 cPPT 서열 및/또는 WPRE 서열을 포함하는 의약품.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 VSV-G로 슈도타입화되어 있는 의약품.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 원숭이 면역부전 바이러스 벡터가 agm주 유래인 의약품.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환이 녹내장, 망막색소 변성, 망막 박리, 망막 허혈성 질환 중 어느 하나인 의약품.
- PEDF 유전자를 보유하는 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를 투여하는 안조직 세포에 있어서의 아포토시스 변성을 동반하는 질환의 치료방법.
- 제6항에 있어서, PEDF 유전자를 보유하는 재조합 원숭이 면역부전 바이러스 벡터를 망막하 투여, 유리체 내 투여, 또는 전방 내 투여하는 공정을 포함하는 방법.
- 서열번호 : 1에 기재된 염기서열에 PEDF 유전자가 삽입된 염기서열을 포함하는 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 의약품의 제조방법.
- 제8항에 있어서, 서열번호 : 2에 기재된 염기서열을 포함하는 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용하는 의약품의 제조방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 서열번호 : 3에 기재된 염기서열을 포함하는 패키징 벡터가 도입된 패키징 세포에 상기 유전자 트랜스퍼 벡터를 도입하는 공정을 포함하는 방법.
- 서열번호 : 1에 기재된 염기서열 또는 상기 서열 중에 외래 유전자 서열이 삽입된 서열을 포함하는 원숭이 면역부전 바이러스의 게놈 RNA를 코드하는 벡터.
- 제11항에 있어서, 외래 유전자가 PEDF인 벡터.
- 제11항 또는 제12항의 벡터로부터 전사된 게놈 RNA를 포함하는 원숭이 면역부전 바이러스.
- 제13항에 있어서, VSV-G로 슈도타입화되어 있는 원숭이 면역부전 바이러스.
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