JPWO2006090689A1 - Ｓｉｖ−ｐｅｄｆベクターを用いた眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療薬 - Google Patents
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Abstract
本発明は、色素上皮由来因子（PEDF）の効果的投与による眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の新規治療方法を提供する。緑内障の最終病態である神経節細胞死を防止する手段としてPEDFに着目した。さらにPEDFの効果的なデリバリー方法としてSIVベクターに着目し、SIV-PEDFベクターを構築した。SIV-PEDFベクターを、虚血性再灌流モデルおよびNMDA-inducedモデルに網膜下投与したところ、神経節細胞死の顕著な抑制効果を観察し、SIV-PEDFベクターが緑内障などの眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患治療用医薬品として有効であることを見出した。
Description
本発明は、神経栄養因子を搭載したレンチウイルスベクターによる、緑内障の治療方法に関する。
緑内障は、視神経乳頭、視野の特徴的変化の少なくとも一つを有し、通常、眼圧を十分に下降させることにより視神経障害の改善あるいは進行を阻止し得る眼の機能的構造的異常を特徴とする疾患である。緑内障について適切な治療が施されない場合は失明に至ることも多く、緑内障による失明は、わが国の中途失明原因の第２位を占める。
緑内障は、原発緑内障（primary glaucoma）、続発緑内障、発達緑内障に分類することができ、原発緑内障はさらに、原発開放隅角緑内障（広義）、原発閉塞隅角緑内障、混合型緑内障に分類される。広義の原発開放隅角緑内障には、原発開放隅角緑内障（狭義）と正常眼圧緑内障が含まれ、正常眼圧緑内障は、眼圧が正常範囲内（21mmHg以下、平均15.5mmHg）にもかかわらず、視神経が傷害される疾患である。40歳以上の約5.8%前後が緑内障に罹患しているといわれ、2000年の統計では、わが国の40歳以上の人口が約6,500万人であることから、40歳以上の緑内障の有病者は370万人を超えると考えられる。
緑内障における視神経障害の発生と進行において「眼圧」は重要なRisk Factorであり、従来、眼圧下降は唯一の確実な治療法であると認識されている。眼圧を下降させる治療法としては、点眼薬（βブロッカー、プロスタグランジン関連薬、炭酸脱水酵素阻害薬、など）、内服・注射薬（炭酸脱水酵素阻害薬、高張滲透圧薬）、手術（レーザー手術、観血的手術）の手段が一般的である。
しかしその一方で、緑内障について、視神経の微小循環障害や脆弱性などといった「眼圧」以外の因子の関与も示唆されており、眼圧下降療法の限界が指摘されている。そこで眼圧下降療法とは異なる緑内障治療法の開発が求められている。その一つとして、緑内障の最終的な病態である網膜神経節細胞死（アポトーシス）を抑制する方法、すなわち網膜神経節細胞保護療法が注目されている。
一方、神経栄養因子は、未分化な神経芽細胞の増殖および分化、または成熟した神経細胞の生存および機能の維持を促進する因子である。色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）は、神経栄養因子の一つである。PEDFの生物活性として、これまでに、神経分化・保護作用、血管新生抑制作用の2種類が報告されている。PEDFは当初、1989年にヒト網膜芽細胞種Y-79細胞の神経分化を促進する因子として、ヒト胎児網膜色素上皮細胞の培養上清から精製された（非特許文献１）。これまで種々の神経細胞に対して、分化誘導、及び傷害による神経アポトーシス死を抑制する作用を持つことがin vitro, in vivoの系で報告されている。その機序に関しては培養未熟小脳顆粒細胞を用いた検討がされており、転写因子NFκBの活性化が関与し、また抗アポトーシス遺伝子であるBcl-2、Bcl-xや、神経栄養因子であるNGF、BDNFの発現を誘導することが報告されている（非特許文献２）。一方同じく培養未熟小脳顆粒細胞を対象としたマイクロアレイによる検討では、PEDF添加により種々の神経栄養因子（NGF, Neurotrophin-3, GDNF）の発現を誘導するが、中和抗体を用いた解析で誘導された神経栄養因子はPEDFの神経保護効果に影響しないことが報告され（非特許文献３）、保護効果はPEDFの直接の作用であることが示唆されている。また1999年には、PEDFはin vitroの系でFGF-2に誘導される血管内皮細胞のmigrationを濃度依存的に抑制し、その効果がangiostatinやendostatinよりも高いこと、さらにin vivoにおいてFGF2に誘導される角膜血管新生を有意に抑制することが報告された（非特許文献４）。以降、種々の血管新生モデル、腫瘍血管新生を抑制する現象が多数報告されている。その機序は詳細に解明されてはいないが、(1)PEDFが血管内皮細胞におけるFasLの発現を誘導し、さらに新生過程にある血管内皮細胞ではFasが高発現していることから、Fas/FasLを介した内皮細胞のアポトーシスが血管新生を抑制する可能性（非特許文献５）、(2)細胞外でのリン酸化が関与する可能性（非特許文献６）、また(3)細胞外基質との結合が関与する可能性、などが考えられている。
上述のアポトーシス抑制作用から、神経栄養因子による神経節細胞の保護方法が検討されている。これまでに、網膜虚血再還流モデルを用いたPEDFによる遺伝子治療の検討例が２例知られている。これら検討例においては、緑内障と同様に神経節細胞が傷害されアポトーシス死を生じる「網膜虚血再還流モデル」ラットを用い、PEDFによる細胞障害抑制効果が検討された。上記検討例は、一つはPEDF蛋白（非特許文献７）、もう一つはPEDFを搭載したアデノウイルスベクター（非特許文献８）を動物の硝子体内に投与し、虚血再還流による網膜神経節細胞傷害を組織学的に抑制したというものである。
しかしながら、神経栄養因子は分子量が大きい。分子量の大きなタンパク質を持続的に網膜に到達させることは、現状のdrug delivery systemでは困難である。また、アデノウイルスベクターは、導入した遺伝子が核内にエピソームとして存在し染色体ＤＮＡに組み込まれないため、細胞増殖に伴い、自律的な複製能を持たない導入遺伝子は希釈され、導入遺伝子の発現は一過性となってしまう。緑内障が持続的な疾患であることを考慮すると、一過性の効果しか期待できない投与方法は、緑内障治療法として適当な方法ということはできない。一方、レトロウイルスベクターは、一般に、分裂する細胞の染色体に安定に組み込まれることにより長期に遺伝子の発現が可能と考えられるが、これまでに、PEDFを組み込んだレトロウイルスベクターによる緑内障治療の検討例は知られていない。
国際出願番号PCT/JP2002/005225 国際公開番号WO2002/101057
国際出願番号PCT/JP00/03955 国際公開番号WO00/078987
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本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、PEDFの効果的デリバリーによる、緑内障等の、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品を構築することである。
上記課題を解決すべく、本発明者らは鋭意研究を行い、PEDF投与手段として、レトロウイルスベクターである、サル由来レンチウイルス、特にサル免疫不全ウイルス（simian immunodeficiency virus：SIV）のベクターに着目した。本発明者らは、サル免疫不全ウイルス（SIV）ベクターの網膜下投与という遺伝子導入法により、治療遺伝子を網膜内に長期間安定に発現させることが可能で、現状のdrug delivery systemの限界を超えることができると考えた。すなわち、SIVベクターによる遺伝子導入は、（i）血液網膜関門（BRB）の影響を受けない、（ii）治療有効濃度の維持が可能であり副作用を軽減できる、（iii）治療製剤の頻回投与により生じるコストを軽減できる、といった点を期待できる。また、本発明者らは、PEDFを組み込んだSIVベクターを網膜色素変性モデル動物に投与し、視細胞死（アポトーシス）に対する有意な抑制効果を明らかにした経験がある（非特許文献９）。以上のことから、神経栄養因子を搭載したSIVベクター投与は、有効な緑内障の網膜神経節細胞死に対する神経保護療法となりうると考えられる。
本発明者らは、PEDFを組み込んだSIVベクター（以下、「SIV-PEDFベクター」と記載する。）による緑内障治療への適用の可能性を検討するにあたり、改良型のSIVベクターを用いた。改良型のSIVベクターは、従来のSIVベクターの安全性および性能を高める改良が施されたベクターである。改良点は、第一には、SIVベクターの製造に用いるジーントランスファーベクターに、cPPT（central polypurine tract)配列およびWPRE （woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)配列を導入し、遺伝子導入効率および発現効率の上昇を図った点である。また第二には、パッケージングベクターについては、補助因子（vif, vpr, tat）を除去し、さらにrev配列を他のベクターに移すことにより、安全性の向上を図った点である。
本発明者らは、上記の改良型SIV-PEDFベクターの緑内障への適用を虚血性再灌流モデル動物およびNMDA-inducedモデル動物を用いて検討した。小動物に緑内障を厳密な意味で発病させることは困難であるため、通常は、緑内障で傷害される神経節細胞を、人為的に傷害した上記モデルが、緑内障の検討に用いられる。虚血性再灌流モデルは、眼圧を上げて虚血状態にした後に再灌流させることにより、神経節を急激に傷害するモデルである。NMDA-inducedモデルは、NMDAの投与により神経節細胞のみが選択的に傷害されるモデルである。検討は以下のように行った。SIV-PEDFベクターを動物（ラット）の網膜下に投与した後、虚血再灌流またはNMDAにより神経節細胞を傷害した。その後、DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）を両上丘に注入し、神経節細胞を標識し、標識神経節細胞数を計測したところ、いずれのモデルにおいてもSIV-PEDFベクター投与群では、神経節細胞数の減少が顕著に抑制されていることが観察された。これらの結果から、SIV-PEDFベクターは、神経節細胞を有効に保護することができ、緑内障治療薬として有効であるということが初めて実証された。さらに本発明のSIV-PEDFは、緑内障と同様にアポトーシス変性を伴う他の眼科疾患にも有効であると考えられる。すなわち、本発明は、SIV-PEDFベクターによる、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療に関し、より具体的には以下の発明を提供するものである。
（１）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクター、および薬学的に許容される媒体を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品、
（２）サル免疫不全ウイルスベクターがcPPT配列および／またはWPRE配列を含む、上記（１）に記載の医薬品、
（３）サル免疫不全ウイルスベクターがVSV-Gでシュードタイプ化されている、上記（１）または（２）に記載の医薬品、
（４）サル免疫不全ウイルスベクターがagm株由来である、上記（１）から（３）のいずれかに記載の医薬品、
（５）眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患が、緑内障、網膜色素変性、網膜剥離、網膜虚血性疾患のいずれかである、上記（１）から（４）のいずれかに記載の医薬品、
（６）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを投与する、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療方法、
（７）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを網膜下投与、硝子体内投与、または前房内投与する工程を含む、上記（６）に記載の方法。
（８）配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いる、上記（１）から上記（５）のいずれかに記載の医薬品の製造方法、
（９）配列番号：２に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いる、上記（８）に記載の医薬品の製造方法、
（１０）配列番号：３に記載の塩基配列を含むパッケージングベクターが導入されたパッケージング細胞に該ジーントランスファーベクターを導入する工程を含む、上記（８）または上記（９）に記載の方法、
（１１）配列番号：１記載の塩基配列または該配列中に外来遺伝子配列が挿入された配列を含む、サル免疫不全ウイルスのゲノムRNAをコードするベクター、
（１２）外来遺伝子がPEDFである、上記（１１）に記載のベクター、
（１３）上記（１１）または（１２）に記載のベクターから転写されたゲノムRNAを含む、サル免疫不全ウイルス、
（１４）VSV-Gでシュードタイプ化されている、上記（１３）に記載のサル免疫不全ウイルス。
（１）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクター、および薬学的に許容される媒体を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品、
（２）サル免疫不全ウイルスベクターがcPPT配列および／またはWPRE配列を含む、上記（１）に記載の医薬品、
（３）サル免疫不全ウイルスベクターがVSV-Gでシュードタイプ化されている、上記（１）または（２）に記載の医薬品、
（４）サル免疫不全ウイルスベクターがagm株由来である、上記（１）から（３）のいずれかに記載の医薬品、
（５）眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患が、緑内障、網膜色素変性、網膜剥離、網膜虚血性疾患のいずれかである、上記（１）から（４）のいずれかに記載の医薬品、
（６）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを投与する、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療方法、
（７）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを網膜下投与、硝子体内投与、または前房内投与する工程を含む、上記（６）に記載の方法。
（８）配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いる、上記（１）から上記（５）のいずれかに記載の医薬品の製造方法、
（９）配列番号：２に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いる、上記（８）に記載の医薬品の製造方法、
（１０）配列番号：３に記載の塩基配列を含むパッケージングベクターが導入されたパッケージング細胞に該ジーントランスファーベクターを導入する工程を含む、上記（８）または上記（９）に記載の方法、
（１１）配列番号：１記載の塩基配列または該配列中に外来遺伝子配列が挿入された配列を含む、サル免疫不全ウイルスのゲノムRNAをコードするベクター、
（１２）外来遺伝子がPEDFである、上記（１１）に記載のベクター、
（１３）上記（１１）または（１２）に記載のベクターから転写されたゲノムRNAを含む、サル免疫不全ウイルス、
（１４）VSV-Gでシュードタイプ化されている、上記（１３）に記載のサル免疫不全ウイルス。
本発明は、色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクター、および薬学的に許容される媒体を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品に関する。
ウイルスの生活環は大きく感染と増殖の段階に分けられる。一般にウイルスベクターは、ウイルスの感染システムを利用して、遺伝子を効率よく宿主の細胞内に導入出来ることが特徴である。多くのウイルスベクターは、安全性確保のため、増殖システムを排除して自己複製能を欠如させ、導入された細胞内での増殖を防止する措置がとられている。
ベクター粒子の構造を簡単に説明すると、ベクター粒子には、カプシドと呼ばれる蛋白質の外殻がある。カプシドはgag遺伝子産物の構造蛋白質から構成されている。そのカプシドの外側にエンペロープと呼ばれる膜構造がある。エンベロープは、感染する細胞の種類を決定する機能を有する。カプシドの中には、２コピーのベクターゲノムRNA、pol遺伝子産物である逆転写酵素が存在している。ウイルスベクターは宿主細胞に感染すると、ベクターゲノムRNAは自らの上記逆転写酵素により逆転写された後、宿主染色体に組み込まれてプロウイルスDNAとなり、感染を成立させる。
一般にウイルスベクターは、パッケージングベクターとジーントランスファーベクターによって調製することができる。パッケージングベクターは、パッケージングシグナルが除去されたウイルスDNAを搭載している。ウイルスDNAには、ウイルスタンパク質配列が含まれている。パッケージングベクターを宿主に導入すると、宿主細胞（パッケージング細胞）では、パッケージングシグナルがないために、空のウイルス粒子が作られる。一方のジーントランスファーベクターは、宿主染色体DNAに組み込まれるために必要なウイルス由来の遺伝子配列と、導入する外来遺伝子を搭載している。このジーントランスファーベクターをパッケージング細胞に導入すると、ジーントランスファーベクターから供給されるベクターゲノムDNAが宿主染色体に組み込まれた後、転写によってベクターゲノムRNAが作られる。このベクターゲノムRNAが、パッケージング細胞によって作られるウイルス粒子に取り込まれ、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子が生成される。
本発明において「ウイルスベクター」とは、自己複製能を欠如し、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子を指す。「組換え」ウイルスベクターとは、遺伝子組換え技術により構築されたウイルスベクターを言う。ウイルスゲノムをコードするDNAとパッケージング細胞を用いて構築したウイルスベクターは、組換えウイルスベクターに含まれる。
本発明において「サル免疫不全ウイルス（SIV）ベクター」とは、ウイルス粒子中の核酸分子のうち、ウイルスベクターとしての機能に必須な配列がSIVゲノムに基づく配列であるベクターを指す。本発明において「ウイルスベクターとしての機能に必須な配列」とは、5’側から順に、5’LTRのR領域、U5領域、パッケージングシグナル（φ）、RRE、3’LTRのプロモーター領域以外のU3領域、R領域の配列である。5’LTR領域からパッケージングシグナルまでの塩基配列を配列番号：４に、RRE配列を配列番号：５に、3’LTRのプロモーター領域を欠如したU3領域からR領域までの塩基配列を配列番号：６に示す。本発明のSIVベクターは、上述の定義に当てはまる限り、改変が施されていてもよく、例えば、「ウイルスベクターとしての機能に必須な配列」がSIV由来である限り、他にSIV由来の配列またはSIV以外の由来の配列を含んでいてもよい。好適に含まれ得る配列として、例えば、後述するcPPT、内部プロモーター（CMV）、WPREを挙げることができる。
本発明においてサル免疫不全ウイルス（simian immunodeficiency virus; SIV）には、SIVの全ての株およびサブタイプが含まれる。SIV単離株としては、SIVagm、SIVcpz、SIVmac、SIVmnd、SIVsm、SIVsnm、SIVsyk等が例示できるがこれらに制限されない。
サル免疫不全ウイルス（Simian Immunodeficiency Virus, SIV）はサルにおけるHIV類似ウイルスとして発見され、HIVとともにPrimates Lentivirusグループを形成している（井戸栄治, 速水正憲, サル免疫不全ウイルスの遺伝子と感染・病原性. 蛋白質 核酸 酵素: Vol..39, No.8. 1994）。このグループはさらに大きく４つのグループに分類され、1)ヒトにおいて後天性免疫不全症候群（acquired immune deficiency syndrome, AIDS）の原因となるHIV-1とチンパンジーより分離されたSIVcpzを含むHIV-1グループ、2)スーティーマンガベイ Cercocebus atys より分離されたSIVsmmとアカゲザル Macaca mulatta より分離されたSIVmac、およびヒトに対し低頻度ではあるが病原性を示すHIV-2（Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 16(5), 327-32, 1997）よりなるHIV-2グループ、3)アフリカミドリザル Cercopithecus aethiops から分離されたSIVagmに代表されるSIVagmグループ、4)マンドリル Papio sphinx から分離されたSIVmndに代表されるSIVmndグループからなっている。
このうち、SIVagmおよびSIVmndでは自然宿主における病原性の報告はなく（Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115-22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol., 18(3-4), 255-9, 1989; 速水正憲, 日本臨床, 47, 1, 1989）、特に本実施例で用いたSIVagmの一種であるTYO-1株は自然宿主でも、カニクイザル Macaca facicularis 、アカゲザル Macaca mulatta に対する実験感染でも病原性を示さないことが報告されている（Ali, M. et al, Gene Therapy, 1(6), :367-84, 1994; Honjo, S. et al., J. Med. Primatol., 19(1), 9-20, 1990）。SIVagmのヒトに対する感染、発症については報告がなく、ヒトに対する病原性は知られていないが、一般に霊長類におけるレンチウイルスは種特異性が高く、自然宿主から他種に感染、発症した例は少なく、その発症も低頻度あるいは進行が遅いという傾向がある（Novembre, F. J. et al., J. Virol., 71(5), 4086-91, 1997）。従って、SIVagm、特にSIVagm TYO-1株をベースとして作製したウイルスベクターは、HIV-1や他のレンチウイルスをベースとしたベクターと比べて安全性が高いと考えられ、本発明において好適に用いられ得る。SIVagm TYO-1株のゲノム塩基配列を配列番号：７に示す。
本発明のサル免疫不全ウイルスベクターは、他のレトロウイルスのゲノムRNA配列の一部を有していてもよい。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus；HIV）、ネコ免疫不全ウイルス（Feline Immunodeficiency Virus：FIV）（Poeschla, E. M. et al., Nature Medicine, 4(3), 354-7, 1998）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（Caprine Arthritis Encephalitis Virus：CAEV）（Mselli-Lakhal, L. et al., Arch. Virol., 143(4), 681-95, 1998）などの他のレンチウイルスのゲノム配列の一部をサル免疫不全ウイルスのゲノムの一部と置換したキメラ配列を有するベクターも、本発明のサル免疫不全ウイルスベクターに含まれる。
本発明の色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクター（SIV-PEDFベクター）とは、PEDF遺伝子を搭載している組換えSIVベクターを指す。ヒトPEDF（hPEDF）のcDNA配列を、配列番号：８に示す。本発明のSIV-PEDFベクターは、上述の定義に該当する限り、種類・構造を問わないが、好ましい例としては、配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターであり、より好ましい例としては、配列番号：２に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターである。
本発明のSIV-PEDFベクターは、VSV-Gシュードタイプ化されていてもよい。VSV-Gシュードタイプ化とは、ベクターのエンベロープに水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）の表面糖蛋白質であるVSV-G蛋白質を含ませることを言う。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよい。例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。また、VSV-G蛋白質は、天然由来の蛋白質から１または複数のアミノ酸の置換、欠失、および/または付加などにより改変されていてもよい。VSV-Gシュードタイプ化ベクターは、ウイルスの産生時にVSV-G蛋白質を共存させることにより製造することができる。例えば、VSV-G発現ベクターのトランスフェクションや、宿主染色体DNAに組み込んだVSV-G遺伝子からの発現誘導により、パッケージング細胞内でVSV-Gを発現させることにより、この細胞から産生されるウイルス粒子がVSV-Gでシュードタイプ化される。VSV-G蛋白質は１種類の糖蛋白が安定な３量体を形成して膜上に存在するため、精製過程でのベクター粒子の破壊が起こりにくく、遠心による高濃度の濃縮が可能となる（Yang, Y. et al., Hum Gene Ther: Sep, 6(9), 1203-13. 1995）。
本発明のSIV-PEDFベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質をさらに含むことができる。例えば、このような蛋白質として、ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。このような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質などが挙げられる。レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウイルス（MuLV）4070A株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、MuMLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えばpCL-10A1(Imgenex)（Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996)）。また、ヘルペスウイルス科の蛋白質としては、例えば単純ヘルペスウイルスのgB、gD、gH、gp85蛋白質、EBウイルスのgp350、gp220蛋白質などが挙げられる。ヘパドナウイルス科の蛋白質としては、B型肝炎ウイルスのS蛋白質などが挙げられる。
本発明の組換えサル免疫不全ウイルスベクターとしては、LTR（long terminal repeat）に改変を加えることもできる。LTRはレトロウイルスに特徴的な配列であり、ウイルスゲノムの両端に存在している。5' LTRはプロモーターとして働き、プロウイルスからのmRNAの転写を促す。したがって、ウイルス粒子内にパッケージングされるウイルスRNAゲノムをコードするジーントランスファーベクターの5' LTRのプロモーター活性をもつ部分を別の強力なプロモーターと置換すれば、ジーントランスファーベクターのmRNA転写量が増大し、パッケージング効率が上昇、ベクター力価を上昇させる可能性がある。さらに、例えばレンチウイルスの場合、5' LTRはウイルス蛋白質tatによる転写活性の増強を受けることが知られており、5' LTRをtat蛋白質に依存しないプロモーターに置換することで、パッケージングベクターからtatを削除することが可能となる。また、細胞に感染し細胞内に侵入したウイルスRNAは逆転写された後、両端のLTRを結合させた環状構造となり、結合部位とウイルスのインテグラーゼが共役して細胞の染色体内にインテグレートされる。プロウイルスから転写されるmRNAは5' LTR内の転写開始点より下流、3' LTRのpolyA配列までであり、5' LTRのプロモーター部分はウイルス内にパッケージングされない。したがって、プロモーターを置換したとしても標的細胞の染色体に挿入される部分には変化が無い。以上のことから、5' LTRのプロモーターの置換は、より高力価で安全性の高いベクターを作製することにつながると考えられる。従って、ジーントランスファーベクターの5' 側プロモーターの置換を行い、パッケージングされるベクターの力価を上昇させることができる。
また、3' LTRの配列を部分的に削除し、標的細胞から全長のベクターmRNAが転写されることを防止する自己不活性化型ベクター（Self Inactivating Vector：SINベクター）の作製により、安全性を上昇させることも可能である。標的細胞の染色体に侵入したレンチウイルスのプロウイルスは、3' LTRのU3部分を5' 端に結合した形となる。したがってジーントランスファーベクターの転写産物は、逆転写後、標的細胞の染色体に組み込まれた状態では 5' 端にU3が配置され、そこからジーントランスファーベクターからの転写産物と同様の構造を持つRNAが転写されることになる。仮に、標的細胞内にレンチウイルスあるいはその類似の蛋白質が存在した場合、転写されたRNAが再びパッケージングされ、他の細胞に再感染する可能性がある。また3' LTRのプロモーターにより、ウイルスゲノムの3' 側に位置する宿主由来の遺伝子が発現されてしまう可能性がある（Rosenberg, N., Jolicoeur, P., Retoroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997）。この現象はレトロウイルスベクターにおいてすでに問題とされ、回避の方法としてSINベクターが開発された(Yu, S. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 83(10), 3194-8, 1986)。ジーントランスファーベクター上の3' LTRのU3部分を欠失させることにより、標的細胞内では5' LTRや3' LTRのプロモーターが無くなるため、全長のRNAや宿主遺伝子の転写が起こらない。そして、内部プロモーターからの目的遺伝子の転写のみが行われることになり、安全性が高く、高発現のベクターとなることが期待される。このようなベクターは、本発明において好適である。SINベクターの構築は、公知の方法または本発明者らによる特許出願：国際公開番号WO2002/101057（特許文献1）の実施例１-４に記載の方法などに従えばよい。
レトロウイルスベクターなどそのゲノムにLTR配列を含むウイルスベクターを用いた遺伝子治療の問題点の一つに導入遺伝子の発現が次第に低下することがある。これらのベクターは宿主ゲノムに組み込まれると、宿主側の機序によりそのLTRがメチル化され、導入遺伝子の発現が抑制されてしまうことが原因の一つと考えられている（Challita, P. M. and Kohn, D. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2567, 1994）。自己不活性化（SIN）型ベクターでは、宿主ゲノムに組み込まれるとLTR配列の大部分を失うため、LTRのメチル化による遺伝子発現の減弱を受けにくい利点がある。本発明者らによって、ジーントランスファーベクターの3'LTRのU3領域を他のプロモーター配列に置換して製造した自己不活性化型ベクターは、霊長類ES細胞に導入後、２ヵ月以上にわたって安定した発現を維持することが判明している（特許文献１）。このように、LTR U3領域の改変により自己不活性化するように設計されたSINベクターは、本発明において特に好適である。具体的には、3'LTRのU3領域の1または複数の塩基が置換、欠失、および/または付加により改変されたベクターは、本発明に含まれる。このU3領域は、単に欠失させてもよいし、あるいはこの領域に他のプロモーターを挿入してもよい。このようなプロモーターとしては、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、またはCAGプロモーターなどを挙げることができる。
また、本発明のベクターにコードされるPEDF遺伝子は、LTR以外のプロモーターにより転写されるように設計することが好ましい。例えば、上記のようにLTR U3領域を非LTRプロモーターと置換した場合には、この改変LTRによりPEDF遺伝子の発現を駆動することが好ましい。あるいは、実施例において示されるように、LTR領域とは別の位置に非LTRプロモーターを配置し、その下流にPEDF遺伝子を連結することにより、LTRに依存せずにPEDF遺伝子の発現を誘導することができる。本発明者らによって、外来遺伝子の発現を非LTRプロモーターにより駆動するように構築されたSIVベクターは、ES細胞においてこの外来遺伝子を長期間安定に発現することが示された（特許文献１）。同様に、PEDF遺伝子の上流に非LTRプロモーターが連結されており、このプロモーターからPEDF遺伝子が転写されるようなベクターは本発明において特に適しているということができる。非LTRプロモーターとしては、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、またはCAGプロモーターが挙げられ、特にCMVプロモーターが好適である。本実施例で使用したCMVプロモーターの塩基配列を配列番号：９に示す。このようなベクターは、特に上記の自己不活性化（SIN）型ベクターにおいて構築することで高い効果を発揮する。
HIVベクターをはじめとするレンチウイルスベクターは、宿主ゲノムがHIVプロウイルスをすでに保持している場合、外来ベクターと内因性プロウイルスの間で組換えが生じ、複製可能ウイルスが発生しないかという危惧が指摘されている。これは、将来実際にHIV感染患者にHIVベクターを用いる時には確かに大きな問題になろう。今回使用したSIVベクターは、HIVとの相同配列はほとんどない上、ウイルス由来の配列を80％以上取り除いた複製不能ウイルスであり、この危険性は極めて小さく、他のレンチウイルスベクターに比べて安全性が高い。本発明のSIV-PEDFベクターは、上述の「ウイルスベクターとしての機能に必須な配列」以外のSIVゲノム配列が一定以上除去されたベクターであり、好ましくは、このベクターが由来するSIVのゲノム配列の40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは60％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上が取り除かれた複製不能ウイルスである。
レトロウイルスの産生には、宿主細胞でパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターDNAを転写させ、gag, pol蛋白質およびエンベロープ蛋白質の存在下でウイルス粒子を形成させる。パッケージング細胞内のgag, pol蛋白質はパッケージングベクターを用いて供給することができる。エンベロープ蛋白質は、パッケージングベクターによって供給されてもよいが、別のベクターによって供給されてもよい。例えば実施例のように、VSV-G発現ベクターによって供給されてもよい。
本発明のジーントランスファーベクターは、最も基本的には、5’LTR、パッケージングシグナル配列、PEDF遺伝子またはFGF2遺伝子、3’LTR配列を有する。LTR配列は、SIVベクターの改変として上述したLTRの改変が施されていてもよい。また、上述のcPPT配列、CMV配列、RRE配列等が組み込まれていてもよい。ジーントランスファーベクターDNAにコードされるパッケージングシグナル配列は、この配列により形成される構造を保持できるように可能な限り長く組み込むことが好ましい一方で、該ベクターDNA上のパッケージングシグナルと、gag,pol蛋白質を供給するパッケージングベクターとの間で起こる組換えによる野生型ウイルスの出現頻度を抑制するためにはこれらベクター間の配列の重複を最小限にする必要がある。従って、ジーントランスファーベクターDNAの構築においては、パッケージング効率および安全性の両者を満足させるために、パッケージングに必要な配列を含むできる限り短い配列を用いることが好ましい。
例えば、パッケージングベクターをSIVagm由来のものにした場合は、HIV由来のジーントランスファーベクターはパッケージングされないため、ジーントランスファーベクターDNAに用いられるパッケージングシグナルの由来としてはSIVのみに制限されると考えられる。但し、HIV由来のパッケージングベクターを用いた場合、SIV由来のジーントランスファーベクターもパッケージングされるので、組換えウイルスの出現頻度を低下させるために、異なるレンチウイルス由来のジーントランスファーベクターとパッケージングベクターとを組み合わせてベクター粒子を形成させることが可能であると考えられる。このようにして製造されたSIVベクターも、本発明のベクターに含まれる。この場合、霊長類のレンチウイルスの間の組み合わせ（例えば、HIVとSIV）であることが好ましい。
ジーントランスファーベクターDNAでは、gag蛋白質が発現しないように改変されていることが好ましい。ウイルスgag蛋白質は、生体にとって異物として認識され、抗原性が現れる可能性がある。また、細胞の機能に影響を及ぼす可能性もある。gag蛋白質を発現しないようにするためには、gagの開始コドンの下流に塩基の付加や欠失等によりフレームシフトするように改変することができる。また、gag蛋白質のコード領域の一部を欠失させることが好ましい。一般にウイルスのパッケージングには、gag蛋白質のコード領域の5'側が必要であるとされている。従って、ジーントランスファーベクターにおいては、gag蛋白質のC末側のコード領域を欠失していることが好ましい。パッケージング効率に大きな影響を与えない範囲でできるだけ広いgagコード領域を欠失させることが好ましい。また、gag蛋白質の開始コドン（ATG）をATG以外のコドンに置換することも好ましい。置換するコドンは、パッケージング効率に対する影響が少ないものを適宜選択する。これにより構築されたパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターDNAを、適当なパッケージング細胞に導入することにより、ウイルスベクターを生産させることができる。生産させたウイルスベクターは、例えばパッケージング細胞の培養上清から回収することができる。
さらにジーントランスファーベクターDNAでは、PEDF遺伝子の導入効率および発現効率を高める改変がなされていることが好ましい。導入効率を上昇させる改変の例として、cPPT（central polypurine tract)配列の導入を挙げることができる。cPPTは、もともとSIVゲノムに存在する配列である。HIVウイルスにおいてはかなり以前から報告があり（P.Charneau et al. : J.Virol 65: 2415-2431, 1991）、HIVベクターにおいてはcPPTを導入するとベクターゲノムの核への移行が良くなり、遺伝子導入効率が上昇することが報告されている(A.Sirven et al. : Blood 96:4103-4110, 2000)。本実施例で使用したcPPTの塩基配列を配列番号：１０に示す。また発現効率を高める改変の例としては、WPRE（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)配列の導入を挙げることができる。WPREは遺伝子発現効率を高める機能を有する因子である（US Patent 6284469 : RNA export element and methods of use）。他のレンチウイルスベクターではcPPTとWPREの２つの因子の同時導入は個々の効果を更に高める結果が報告されている(SC.Barry et al. : Hum. Gene Ther. 12: 1103-1108, 2001)。本実施例で使用したWPREの塩基配列を配列番号：１１に示す。本発明のSIV-PEDFベクターにおいて、cPPTは、一般的なレンチウイルスベクターにおける配置と同様の配置をとることができる。例えば、cPPTをプロモーターと外部遺伝子との間に配置してもよく、またはRRE配列の上流に配置することもできるが、好ましくは、PEDFの転写を駆動する上述の非LTRプロモーターの上流に配置する。WPREは、PEDF遺伝子の下流に配置することができる。このようなジーントランスファーベクターの好ましい具体例として、配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターを挙げることができ、より好ましい例としては、配列番号：２に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターを挙げることができる。
本発明において、パッケージングベクターは、PEDF遺伝子導入に必要でない配列を取り除いたものを用いることができる。必要でない配列として、修飾遺伝子と呼ばれるvif,vprと制御遺伝子のtat,revを例示することができる。修飾遺伝子産物はベクターにおいて必要でないことが報告されており(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998)、近年は、安全性を高めるため、修飾遺伝子が削除されたベクターが使用されている。また、tatも削除され、revは別のプラスミドに移すことにより更に安全性が高められた、第三世代と呼ばれるベクターが開発されている。パッケージングベクターからrevを除いた場合は、別に、rev発現ベクターを構築し、該rev発現ベクターを本発明のSIV-PEDFベクターの製造において使用することができる。SIVagm TYO-1株のrevの塩基配列を配列番号：１２に示す。上記のようにして構築されたパッケージングベクターは、例えば、プロモーター配列、ウイルスコアタンパク質配列（gag）、逆転写酵素配列（pol）、polyA配列を含む構成とすることができ、実施例に示すように上記構成にさらにRRE配列が含まれていてもよい。またrev発現ベクターは、rev配列の上流に該配列を制御するためのプロモーター、rev配列の下流にpolyA配列を配置した構成とすることができる。
パッケージング細胞に使われる細胞としては、一般的にウイルスの産生に使用される細胞株であれば制限はない。ヒトの遺伝子治療用に用いることを考えると、細胞の由来としてはヒトまたはサルが適当であると考えられる。パッケージング細胞として使用されうるヒト細胞株としては、例えば293細胞、293T細胞、293EBNA細胞、SW480細胞、u87MG細胞、HOS細胞、C8166細胞、MT-4細胞、Molt-4細胞、HeLa細胞、HT1080細胞、TE671細胞などが挙げられる。サル由来細胞株としては、例えば、COS1細胞、COS7細胞、CV-1細胞、BMT10細胞などが挙げられる。
本発明のSIV-PEDFベクターは、実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルター濾過、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法により行うことができる。例えば、ベクター溶液を0.45μmのフィルターにて濾過後、42500×g、90分、４℃で遠心を行うことで、ベクターを沈殿・濃縮することができる。
本発明のSIV-PEDFベクターは、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療および予防へ使用することができる。実施例にあるように、本発明者らは、SIV-PEDFベクターが網膜神経節細胞保護に極めて有効であることを、疾患モデル動物で確認している。緑内障の最終的病態は、網膜神経節細胞のアポトーシスである。すなわち、本発明のSIV-PEDFベクターは、網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制することにより、緑内障の進行抑制、予防、治療に効果を有する。また、緑内障以外にも、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用に広く用いることができると考えられる。本発明のSIV-PEDFベクターは、必要に応じて薬学的に許容される所望の担体または媒体と適宜組み合わせて眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品とすることができる。「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。具体的には、例えば滅菌水、生理食塩水、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などと適宜組み合わせることが考えられる。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。本発明のSIV-PEDFを含む眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患治療用医薬品を投与する場合は、網膜神経節細胞保護効果を得られる限り、特に投与経路を問わないが、好ましくは、網膜下投与、硝子体内投与、前房内投与、より好ましくは、網膜下投与、硝子体内投与である。本発明のSIV-PEDFを含む医薬品の投与量（ヒト１眼球あたり）は、例えば、2.5×105TU-2.5×108TU、好ましくは、5.0×105TU-5.0×107 TUを目安とすることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］VSV-GシュードタイプSIVベクターの構築
ベクターの構築には図１に示す４種のプラスミド（ジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクター、VSV-G発現ベクター）を用いた。３種のジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクターについては、従来型のベクタープラスミド（PCT/JP00/03955）を改良して作製した。VSV-G発現ベクターについては従来のものをそのまま用いた。
ベクターの構築には図１に示す４種のプラスミド（ジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクター、VSV-G発現ベクター）を用いた。３種のジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクターについては、従来型のベクタープラスミド（PCT/JP00/03955）を改良して作製した。VSV-G発現ベクターについては従来のものをそのまま用いた。
プラスミド作製にあたっては、市販の各種キットを使用した。制限酵素はNew England Biolabs社製品を使用し、プラスミドDNAの抽出,精製,回収にはキアゲンのキット（QIAquick PCR purification kit, QIAquick Nucleotide Removal kit, QIAquick Gel extraction kit, Plasmid Maxi kit）を使用した。PCRにはTaKaRaのEX Taq酵素を用い、使用するプライマーは外部のメーカー（シグマジェノシス・ジャパン）に合成を依頼した。DNA末端の脱リン酸化はTaKaRaのAlkalline Phosphatase (E.coli C75)を使用した。ライゲーションにはTaKaRaのDNA Ligation kit ver.2を用い、トランスフォーメーションにはTOYOBOのDH5α COMPETENT highを利用した。
１−１．ジーントランスファーベクターの改良
従来型ジーントランスファーベクターに、cPTT(central polypurine tract)およびWPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)の導入を行い、ジーントランスファーベクターの性能改良を図った（図２Ａ、Ｂ）。使用した従来型のジーントランスファーベクターは、非病原性のアフリカミドリザル免疫不全ウイルスのクローンであるSIVagmを基本とし、5’LTR領域、RRE、CMV（cytomegalovirus）プロモーター、EGFP（enhanced green fluorescent protein）遺伝子、3’LTRを順に有するベクターである。該従来型ジーントランスファーベクターは、本発明者らによって構築されたものであり、構築方法等については、既に報告済みである（特許文献２）。該従来型ジーントランスファーベクターの塩基配列を、配列番号：１３に示す。
従来型ジーントランスファーベクターに、cPTT(central polypurine tract)およびWPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)の導入を行い、ジーントランスファーベクターの性能改良を図った（図２Ａ、Ｂ）。使用した従来型のジーントランスファーベクターは、非病原性のアフリカミドリザル免疫不全ウイルスのクローンであるSIVagmを基本とし、5’LTR領域、RRE、CMV（cytomegalovirus）プロモーター、EGFP（enhanced green fluorescent protein）遺伝子、3’LTRを順に有するベクターである。該従来型ジーントランスファーベクターは、本発明者らによって構築されたものであり、構築方法等については、既に報告済みである（特許文献２）。該従来型ジーントランスファーベクターの塩基配列を、配列番号：１３に示す。
具体的なベクターの改良方法は以下のとおりである。まず、従来型のジーントランスファーベクターを制限酵素Sac IIで切断し、サンプルを泳動してCMVプロモーターとEGFP遺伝子を取り除き、セルフライゲーションを行った。次に、プラスミドのNot I部位をなくすために、上記ベクターをNot Iで切断し、切断末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑化し、セルフライゲーションを行った。
続いて、上記ベクターを制限酵素Sac IIで切断し、BAP処理を用い、切断末端を脱リン酸化した。従来型のジーントランスファーベクターをテンプレートにし、プライマー１F（配列番号：１４）と１R（配列番号：１５）でPCRを行い、PCR産物をSac IIで切断し、CMVプロモーター（配列番号：９）の末端にSac II部位を付加した断片を作成した。該CMVプロモーター断片を、BAP処理した上記ベクターのSac II部位に組み込んだ。
ベクターをNot I、BamH Iで順番に切断し、その切断部位に2種の合成オリゴDNA２F（配列番号：１６）と２R（配列番号：１７）をアニールして作成したアダプターをライゲーションし、制限酵素部位を改変した。ベクターを制限酵素Sac IIで切断し、BAP処理を用い、切断末端を脱リン酸化した。
導入用のcPTT断片（配列番号：１０）を得るために、SIVagmTYO1ゲノム（配列番号：７）を組み込んだプラスミドｐSA212をテンプレートとし、プライマー３F（配列番号：１８）と３R（配列番号：１９）でPCRを行った。該PCR増幅断片の末端をSAC IIで切断し、cPPTの両端にSAC II部位を付加した断片を作成した。cPPT断片を、BAP処理した上記ベクターのSac II部位にライゲーションした。
ベクターをBamH Iで切断し、BAP処理を用い、切断末端を脱リン酸化した。導入するWPRE断片を得るために、WPRE cDNA（配列番号：１１）の入ったプラスミドをテンプレートとし、プライマー４F（配列番号：２０）と４R（配列番号：２１）でPCRを行った。得られたPCR増幅産物の末端をBamH IとBgl IIで切断し、WPREの末端に制限酵素部位を付加した断片を作成した。ベクターのBamH I部位に上記WPRE断片をライゲーションし、搭載遺伝子のない改良型ジーントランスファーベクター（配列番号：１）を完成させた。
搭載遺伝子断片を作成し、上記の改良型ジーントランスファーベクターNot I部位に組み込んだ。EGFP断片は、EGFP cDNA（配列番号：２２）の入ったプラスミドをテンプレートとし、プライマー５F（配列番号：２３）と５R（配列番号：２４）でPCRを行い、Not Iで切断し作成した。PEDF断片はhPEDF cDNA （配列番号：８）の入ったプラスミドをテンプレートとし、プライマー７F（配列番号：２５）と７R（配列番号：２６）でPCRを行い、pGEM-T Easy vector（プロメガ社）へTAクローニングし、Not Iで切り出し作成した。
また、cPPT,WPREを組み込んだプラスミドの構築と同時に、cPPT,WPREの効果を確認するために、cPPTのみ、またはWPREのみを組み込んだジーントランスファーベクターもそれぞれ作成した。
１−２．パッケージングベクターの改良
従来型パッケージングベクターにはgag,polの他に、修飾遺伝子と呼ばれるvif,vprと制御遺伝子のtat,revが含まれている。しかし、修飾遺伝子産物はベクターにおいて必要でないことが分かり(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998)、近年は、安全性を高めるため、修飾遺伝子が削除されたベクターが使用されている。また、tatも削除され、revは別のプラスミドに移すことにより更に安全性が高められた、第三世代と呼ばれるベクターが開発されており、現在ではベクターの第三世代化は必須となっている。そこで本発明においても、従来型パッケージングベクター（配列番号：２７）から補助遺伝子（vif,vpr,tat）を取り除き、revを別のプラスミドに移し、安全性を高めることとした（図３）。方法は、基本的には、HIVベクターで以前に報告されている(T.Dull.et al.: J.Virol 72:8463-8471, 1998)。
従来型パッケージングベクターにはgag,polの他に、修飾遺伝子と呼ばれるvif,vprと制御遺伝子のtat,revが含まれている。しかし、修飾遺伝子産物はベクターにおいて必要でないことが分かり(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998)、近年は、安全性を高めるため、修飾遺伝子が削除されたベクターが使用されている。また、tatも削除され、revは別のプラスミドに移すことにより更に安全性が高められた、第三世代と呼ばれるベクターが開発されており、現在ではベクターの第三世代化は必須となっている。そこで本発明においても、従来型パッケージングベクター（配列番号：２７）から補助遺伝子（vif,vpr,tat）を取り除き、revを別のプラスミドに移し、安全性を高めることとした（図３）。方法は、基本的には、HIVベクターで以前に報告されている(T.Dull.et al.: J.Virol 72:8463-8471, 1998)。
具体的には、まず、パッケージングベクターのプラスミドを制限酵素Not Iで切断し、続いてEcot22Iで切断した。サンプルを泳動し、EcoT22I-Not I断片を除去し、サイズの大きいベクター断片とpol遺伝子の一部のEcoT22I-EcoT22I断片を回収した。
２種類の合成オリゴDNA1F（配列番号：２８）と1R（配列番号：２９）をアニールさせて作製したアダプターを、上記ベクターのEcoT22I-Not I部位にライゲーションした。続いて、ベクターをEcoT22Iで切断し、BAP処理を行い、切断末端を脱リン酸化し、BAP処理したEcoT22I部位に、回収して置いたpol遺伝子のEcoT22I断片を組み込んだ。
上記ベクターをNot Iで切断し、BAP処理を行い、切断末端を脱リン酸化した。RRE断片を得るために、従来型のパッケージングベクター（配列番号：２７）をテンプレートにし、プライマー８F（配列番号：３０）と８R（配列番号：３１）でPCRを行い、pGEM-T Easy vector（プロメガ社）へTAクローニングした。Not IでRRE断片を切り出した。脱リン酸化したベクターのNot I部位へRRE断片をライゲーションし、改良型パッケージングベクター（配列番号：３）を完成させた。
１−３．rev発現ベクターの構築
rev蛋白はこれまで従来型のパッケージングベクターより供給されていたが、パッケージングベクターの上記改良に伴い、rev蛋白を別の発現プラスミドの形で供給することとし、新たに発現ベクターを構築した。revはゲノム上ではイントロンで２つに分かれているが、一つに結合して発現プラスミドに組み込むこととした（図４Ａ、Ｂ）。
rev蛋白はこれまで従来型のパッケージングベクターより供給されていたが、パッケージングベクターの上記改良に伴い、rev蛋白を別の発現プラスミドの形で供給することとし、新たに発現ベクターを構築した。revはゲノム上ではイントロンで２つに分かれているが、一つに結合して発現プラスミドに組み込むこととした（図４Ａ、Ｂ）。
まず、従来のパッケージングベクターをテンプレートとし、２つの断片をPCRにより作製した。5’側の断片はプライマー１F（配列番号：３２）と１R（配列番号：３３）を使い、3’側の断片はプライマー２F（配列番号：３４）と２R（配列番号：３５）を使用して増幅した。２種のPCR断片を回収し、混合してPCRのテンプレートとし、プライマー１Fと２Rを用いて増幅し、２つの断片をつなげた目的のrev遺伝子断片（配列番号：１２）を得た。PCRで増幅したrev断片を、pGEM-T Easy vectorへTAクローニングした。続いて、該ベクターをEcoR Iで切断し、EcoR I部位が付加されたrev断片を回収した。一方、蛋白発現用のpCIベクター（プロメガ社）をEcoR Iで切断し、切断部位をBAP処理した。回収したrev断片とpCI発現ベクターをライゲーションし、rev発現ベクターとした。
［実施例２］cPPT,WPREを搭載したSIVベクターの機能評価
cPPT,WPREの導入の効果を調べるために、cPPT,WPRE同時搭載の他に、cPPT単独搭載、WPRE単独搭載のベクターを生産し、従来型のコントロールと比較した。全てのジーントランスファーベクターはEGFPを搭載しているものを用いた。パッケージングベクターは従来型（配列番号：２７）を使用した。
cPPT,WPREの導入の効果を調べるために、cPPT,WPRE同時搭載の他に、cPPT単独搭載、WPRE単独搭載のベクターを生産し、従来型のコントロールと比較した。全てのジーントランスファーベクターはEGFPを搭載しているものを用いた。パッケージングベクターは従来型（配列番号：２７）を使用した。
２−１．SIVベクターの調製
ヒト胎児腎細胞由来細胞株293T細胞を15cmプラスチックシャーレ１枚あたり約1×107（翌日70-80％密度）になるように播種し、10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地（Gibco BRL）20mlで24時間培養した。24時間培養後、培地を10mlのOPTI-MEM培地（Gibco BRL）に置換して、細胞をトランスフェクトに用いた。
ヒト胎児腎細胞由来細胞株293T細胞を15cmプラスチックシャーレ１枚あたり約1×107（翌日70-80％密度）になるように播種し、10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地（Gibco BRL）20mlで24時間培養した。24時間培養後、培地を10mlのOPTI-MEM培地（Gibco BRL）に置換して、細胞をトランスフェクトに用いた。
シャーレ１枚あたりジーントランスファーベクター６μg、パッケージングベクター３μg、VSV-G発現ベクター１μgを1.5mlのOPTI-MEM培地に溶解後、40μlのPLUS Reagent（インビトロジェン社）を加えて撹拌し、15分間室温で静置した。ジーントランスファーベクターは、cPPT,WPRE同時搭載、cPPT単独搭載、WPRE単独搭載、または従来型（cPPT,WPREいずれも搭載していない）のものを使用した。これに1.5mlのOPTI-MEM培地で希釈した60μlのLIPOFECTAMINE Reagent（インビトロジェン社）を加え撹拌し、15分間室温で静置した。
上記DNA複合体を15cmシャーレの細胞に滴下し、穏やかに振とうさせて混ぜ、37℃,５%CO2インキュベーターで３時間インキュベートした。インキュベート後、シャーレに13mlの20％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地を加えて培養した。トランスフェクトの翌日に、新しい10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地30mlと交換し培養した。トランスフェクトの２日後に、上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過し、ベクター液とした。
２−２．SIVベクターの力価測定
SIVベクターの力価には、搭載遺伝子蛋白の発現細胞数から算出する機能力価（Functional titer : TU/ml）とベクター粒子数から算出する値（Particle titer : particles/ml）がある。cPPT,WPREの性能評価はPartilce titerをそろえて細胞に感染させて評価するため、以下のようにドットブロッティングによる方法でParticle titerを測定した。
SIVベクターの力価には、搭載遺伝子蛋白の発現細胞数から算出する機能力価（Functional titer : TU/ml）とベクター粒子数から算出する値（Particle titer : particles/ml）がある。cPPT,WPREの性能評価はPartilce titerをそろえて細胞に感染させて評価するため、以下のようにドットブロッティングによる方法でParticle titerを測定した。
まず、上記のとおり生産したベクター液から、市販のキット（キアゲン社のQIAamp Viral RNA mini kit）を用いてRNA抽出を行った。次に、スロットブロッターを用いてHybondN+メンブレン（アマシャム社）にRNAをブロッティングした。同時に検量線用のモル数を計算したプラスミドDNAもブロッティングした。なお、RNAの処理方法はメンブレン付属のプロトコールに従った。DNAは加熱急冷した。メンブレンをアルカリ固定した後、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズに関してはロシュのDIGラベルでの検出システムを使用した。プローブはDIGラベルNTPを用いて作製し、ハイブリダイゼーション以降の操作はDIG Easy Hyb, DIG Wash and Block Buffer Set（ロシュ）を使用した。anti-DIG AP conjugate antibody（ロシュ）およびCSPD（ロシュ）を用い、化学発光させ、ルミノイメージアナライザー(富士写真フイルム：LAS-1000)を用いて、シグナルを検出・定量した。
２−３．SIVベクターの細胞への遺伝子導入、評価
Particle titerを測定した４種類のベクターは、以下のようにMOI(multiplicity of infection)を変えて細胞に感染させ、FACS解析を行った。293T細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートに１ウェルあたり1×106個で播き、37℃、５％CO2で一晩培養した。翌日、プレート１ウェルの細胞数を血球計数板で計算し、プレートの培地を除き、新しい10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地２mlで希釈したベクターをMOI(Particles/cell)が0.3、1.5、7.5、15になるように加えた。感染１日後、細胞の培地を２mlの新しいものと交換した。感染２日後、ベクターにより遺伝子導入されたEGFPを蛍光顕微鏡で観察し、EGFP陽性細胞の割合を測定し、更に蛍光強度（EGFP蛋白量の目安となる値）も測定した。
Particle titerを測定した４種類のベクターは、以下のようにMOI(multiplicity of infection)を変えて細胞に感染させ、FACS解析を行った。293T細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートに１ウェルあたり1×106個で播き、37℃、５％CO2で一晩培養した。翌日、プレート１ウェルの細胞数を血球計数板で計算し、プレートの培地を除き、新しい10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地２mlで希釈したベクターをMOI(Particles/cell)が0.3、1.5、7.5、15になるように加えた。感染１日後、細胞の培地を２mlの新しいものと交換した。感染２日後、ベクターにより遺伝子導入されたEGFPを蛍光顕微鏡で観察し、EGFP陽性細胞の割合を測定し、更に蛍光強度（EGFP蛋白量の目安となる値）も測定した。
２−４．ベクター機能評価の結果
従来型のジーントランスファーベクターをコントロールとして、cPPT単独搭載、WPRE単独搭載、cPPT, WPRE同時搭載の４種類のベクターを生産した。ベクターデザインの模式図を図５-(a)に示す。
従来型のジーントランスファーベクターをコントロールとして、cPPT単独搭載、WPRE単独搭載、cPPT, WPRE同時搭載の４種類のベクターを生産した。ベクターデザインの模式図を図５-(a)に示す。
生産したベクターのParticle titerを測定したところ、４種ともベクター粒子の生産性には違いが見られなかった。ベクター粒子数でMOI（1個の細胞に感染させたベクター粒子数）を統一して293T細胞に遺伝子導入し、蛍光顕微鏡で観察したところ、MOI:15では図５-(b)に示すように、cPPTとWPREのない従来型のコントロール（-cPPT,-WPRE)ではEGFP陽性細胞の数が少なく蛍光も弱かった。cPPT単独搭載（+cPPT,-WPRE)ではEGFP陽性細胞の数が増加した。WPRE単独搭載（-cPPT,+WPRE)ではEGFP陽性細胞の数はコントロールに比べわずかな増加しか認められなかったものの、EGFP蛋白の蛍光は増強された。cPPT,WPRE同時搭載（+cPPT,+WPRE)では２つの因子が相乗的に効果を発揮し、細胞数，蛍光強度の両方ともcPPT,WPRE単独搭載のものより大幅に増加し、期待以上の結果となった。
EGFP陽性細胞の割合をFACSで調べたところ（図６）、いずれもMOI依存的に遺伝子挿入割合が増加したが、cPPT, WPRE同時搭載のものはコントロールに比べて約10倍も導入効率が上昇した。つまり実質的な機能力価（生産性）が10倍上昇した。
また、EGFP陽性細胞の平均蛍光強度を調べたところ（図７）、cPPT,WPRE同時搭載のものはWPRE単独搭載のものよりかなり高くなっており、細胞当たりの蛋白発現量も大幅に増大している事が明らかとなった。
[実施例３]治療用遺伝子搭載SIVベクターの大量調製および濃縮
図１に示す改良型のジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクター、およびVSV-G発現ベクターの４種類のプラスミドをもとに以下のようにSIVベクターを調製した。PEDFの治療遺伝子を搭載したベクターは15cmシャーレ20枚単位で生産を行った。
図１に示す改良型のジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクター、およびVSV-G発現ベクターの４種類のプラスミドをもとに以下のようにSIVベクターを調製した。PEDFの治療遺伝子を搭載したベクターは15cmシャーレ20枚単位で生産を行った。
293T細胞を15cmプラスチックシャーレ１枚あたり約1×107（翌日70-80％密度）になるように播き、10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地20mlで24時間培養した。24時間培養後、培地を10mlのOPTI-MEM培地に置換してトランスフェクトに用いた。シャーレ１枚あたりジーントランスファーベクター１０μg、パッケージングベクター５μg、rev発現ベクター２μg、VSV-G発現ベクター２μgを1.5mlのOPTI-MEM培地に溶解後、40μlのPLUS Reagent（インビトロジェン社）を加えて撹拌し、15分間室温で静置した。これに1.5mlのOPTI-MEM培地で希釈した60μlのLIPOFECTAMINE Reagentを加え撹拌し、15分間室温で静置した。このDNA複合体を、上記の15cmシャーレの細胞に滴下し、穏やかに振とうさせて混ぜ、37℃,５%CO2インキュベーターで３時間インキュベートした。上記シャーレに13mlの20％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地を加えて培養した。
トランスフェクトの翌日に、新しい10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地30ｍｌと交換し培養した。トランスフェクトの２日後に、上清を回収し、新しい培地を20ml加えた。回収した上清は0.45μmのフィルターで濾過し、４℃で保存した。トランスフェクトの３日後に上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過し、前日の回収ベクターと合わせ、高速遠心機を利用して濃縮操作を行った。回収したベクター液を滅菌処理したチューブに分注し、42500G,4℃,1時間遠心した。この遠心操作を2回繰り返し、ベクター液を500倍−1000倍に濃縮した。ベクターはペレットとして沈殿するが、ペレットは5％ウシ胎児血清を含むPBSに溶解した。濃縮したベクターは少量ずつ分注したのち-80℃で保存し、一部を用いてParticle titerを測定した。Particle titerの測定は前述の方法と同様に行った。
［実施例４］虚血性再灌流モデル動物によるSIV-PEDFの緑内障治療効果の検討
緑内障モデル動物として虚血性再灌流モデルを作成し、SIV-PEDFベクターによる緑内障治療の可能性を検討した。まず、本発明のベクター：SIV-hPEDF、または外来遺伝子を持たない空ベクター： SIV-empty (2.5×107TU/ml、TU: transducing units)溶液を、4週齢のWistar 系ラットの網膜下腔に投与した。ベクター導入14日後に、上記ラットの眼内を110mmHgの圧にて60分間虚血状態とし、網膜神経節細胞を傷害した。障害4日後、脳定位固定装置を用いて蛍光色素DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）を両上丘に注入し、神経節細胞を標識した。網膜神経節細胞障害7日後（ベクター導入21日後）に眼球を摘出し、flat mountにて蛍光顕微鏡で観察し、視神経から1mmの部位における1mm2当たりの標識神経節細胞数を計測した。
コントロールとして、ベクター溶液の代わりに網膜下腔にBSS溶液を投与され、虚血性再灌流障害処置されていない「ベクター非投与/非虚血再灌流障害群」、およびベクター溶液の代わりに網膜下腔にBSS溶液を投与され、虚血性再灌流障害処置された「ベクター非投与/虚血再灌流障害群」についても、蛍光顕微鏡による観察、および標識神経節細胞数の計測を同様の手順で行った。
緑内障モデル動物として虚血性再灌流モデルを作成し、SIV-PEDFベクターによる緑内障治療の可能性を検討した。まず、本発明のベクター：SIV-hPEDF、または外来遺伝子を持たない空ベクター： SIV-empty (2.5×107TU/ml、TU: transducing units)溶液を、4週齢のWistar 系ラットの網膜下腔に投与した。ベクター導入14日後に、上記ラットの眼内を110mmHgの圧にて60分間虚血状態とし、網膜神経節細胞を傷害した。障害4日後、脳定位固定装置を用いて蛍光色素DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）を両上丘に注入し、神経節細胞を標識した。網膜神経節細胞障害7日後（ベクター導入21日後）に眼球を摘出し、flat mountにて蛍光顕微鏡で観察し、視神経から1mmの部位における1mm2当たりの標識神経節細胞数を計測した。
コントロールとして、ベクター溶液の代わりに網膜下腔にBSS溶液を投与され、虚血性再灌流障害処置されていない「ベクター非投与/非虚血再灌流障害群」、およびベクター溶液の代わりに網膜下腔にBSS溶液を投与され、虚血性再灌流障害処置された「ベクター非投与/虚血再灌流障害群」についても、蛍光顕微鏡による観察、および標識神経節細胞数の計測を同様の手順で行った。
蛍光顕微鏡による観察結果を図８に示す。また標識神経節細胞数を図９に示す。カウントした神経節細胞の数は、ベクター非投与/虚血再灌流障害群：177.4 /mm2、SIV-empty投与群：185.3 /mm2、SIV-hPEDF投与群：217.8 /mm2であった。これら結果から、SIV-hPEDFによる神経節細胞保護効果が明らかになった。
［実施例５］NMDA-inducedモデルによるSIV-PEDFの緑内障治療効果の検討
緑内障モデル動物としてNMDA-inducedモデルを作成し、SIV-PEDFベクターによる緑内障治療の可能性を検討した。まず、本発明のベクターSIV-hPEDF、または外来遺伝子を持たない空ベクターSIV-empty (2.5×107TU/ml、TU: transducing units)溶液を、4週齢のWistar 系ラットの網膜下腔に投与した。ベクター導入14日後に、NMDA 40mM，5μlを硝子体内に投与して、神経節細胞層を選択的に傷害した。障害4日後、脳定位固定装置を用いて蛍光色素DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）を両上丘に注入し、神経節細胞を標識した。網膜神経節細胞障害7日後（ベクター導入21日後）に眼球を摘出し、flat mountにて蛍光顕微鏡で観察し、視神経から1mmの部位における1mm2当たりの標識神経節細胞数を計測した。
コントロールとして、ベクター溶液の代わりに網膜下腔にBSS溶液を投与され、NMDA処置されていない「ベクター非投与/非NMDA-induced群」、およびベクター溶液の代わりに網膜下腔にBSS溶液を投与され、NMDA処置された「ベクター非投与/NMDA-induced群」についても、蛍光顕微鏡による観察、および標識神経節細胞数の計測を同様の手順で行った。
緑内障モデル動物としてNMDA-inducedモデルを作成し、SIV-PEDFベクターによる緑内障治療の可能性を検討した。まず、本発明のベクターSIV-hPEDF、または外来遺伝子を持たない空ベクターSIV-empty (2.5×107TU/ml、TU: transducing units)溶液を、4週齢のWistar 系ラットの網膜下腔に投与した。ベクター導入14日後に、NMDA 40mM，5μlを硝子体内に投与して、神経節細胞層を選択的に傷害した。障害4日後、脳定位固定装置を用いて蛍光色素DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）を両上丘に注入し、神経節細胞を標識した。網膜神経節細胞障害7日後（ベクター導入21日後）に眼球を摘出し、flat mountにて蛍光顕微鏡で観察し、視神経から1mmの部位における1mm2当たりの標識神経節細胞数を計測した。
コントロールとして、ベクター溶液の代わりに網膜下腔にBSS溶液を投与され、NMDA処置されていない「ベクター非投与/非NMDA-induced群」、およびベクター溶液の代わりに網膜下腔にBSS溶液を投与され、NMDA処置された「ベクター非投与/NMDA-induced群」についても、蛍光顕微鏡による観察、および標識神経節細胞数の計測を同様の手順で行った。
蛍光顕微鏡による結果を図１０に示す。また標識神経節細胞数を図１１に示す。カウントした神経節細胞の数は、虚血性再灌流モデルの場合と同様に、NMDA-inducedモデルにおいても、SIV-hPEDFベクターによる神経節細胞保護効果が証明された。
本発明によって、PEDFを有効に眼組織細胞へ到達させるベクターが提供された。本発明のSIV-PEDFベクターは、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の新規治療手段をもたらす。すなわち、本発明のSIV-PEDFベクターを眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患患者に投与することにより、PEDFが患者の細胞内で持続的に提供され、緑内障などの最終的病態である、網膜神経節細胞のアポトーシスを抑制することができる。アポトーシス変性を伴う眼疾患の多くが慢性的疾患であることを考慮すると、本発明のSIV-PEDFは、上記疾患に対する極めて有効な医薬品であるということが証明された。
Claims (14)
- 色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクター、および薬学的に許容される媒体を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品。
- サル免疫不全ウイルスベクターがcPPT配列および／またはWPRE配列を含む、請求項１に記載の医薬品。
- サル免疫不全ウイルスベクターがVSV-Gでシュードタイプ化されている、請求項１または２に記載の医薬品。
- サル免疫不全ウイルスベクターがagm株由来である、請求項１から３のいずれかに記載の医薬品。
- 眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患が、緑内障、網膜色素変性、網膜剥離、網膜虚血性疾患のいずれかである、請求項１から４のいずれかに記載の医薬品。
- PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを投与する、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療方法。
- PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを網膜下投与、硝子体内投与、または前房内投与する工程を含む、請求項６に記載の方法。
- 配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いる、請求項１から請求項５のいずれかに記載の医薬品の製造方法。
- 配列番号：２に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いる、請求項８に記載の医薬品の製造方法。
- 配列番号：３に記載の塩基配列を含むパッケージングベクターが導入されたパッケージング細胞に該ジーントランスファーベクターを導入する工程を含む、請求項８または請求項９に記載の方法。
- 配列番号：１記載の塩基配列または該配列中に外来遺伝子配列が挿入された配列を含む、サル免疫不全ウイルスのゲノムRNAをコードするベクター。
- 外来遺伝子がPEDFである、請求項１１に記載のベクター。
- 請求項１１または１２に記載のベクターから転写されたゲノムRNAを含む、サル免疫不全ウイルス。
- VSV-Gでシュードタイプ化されている、請求項１３に記載のサル免疫不全ウイルス。
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