JP4861314B2 - 非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルス、その調製および使用 - Google Patents
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Description
a)いかなるpsi包膜化シグナルも欠いておりそしてレンチウイルスgag配列および組み込み機能のないインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスpol配列を含み、場合によりvif、nef、vpuおよび/またはvprなどのアクセサリー遺伝子を欠失しているトランス相補性プラスミド、
b)プロモーター−env−PolyA配列を含むエンベローププラスミド、および
c)レンチウイルスLTR5’配列とLTR3’配列との間にレンチウイルス包膜化psi配列、RNA核外移行エレメント、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび/またはRNAの核内移行を促進する配列を含む組換えゲノム、ならびに該ゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含み、レンチウイルスのいかなるコード配列も欠いているレンチウイルスベクタープラスミド、
を含む非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクター系を使用する細胞のトランスフェクション、および
産生したレンチウイルスの回収、
を含む非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルスを調製する方法に関する。
本発明は、任意の哺乳動物細胞、特にヒト細胞への遺伝子の導入を可能とする非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスを記載する。これらは、分裂細胞又は休止細胞、肝臓、膵臓、筋肉、心臓等の中枢器官又は末梢器官に属する細胞であることができる。本発明の1つの特定の目的は、神経系(眼球系を含む)におけるおよび特にニューロン、アストロサイト型グリア細胞および網膜細胞におけるならびに癌腫瘍における遺伝子の導入に関する。これらのレンチウイルスベクターは、特に神経系内での核酸配列のインビボ導入および発現のために有用である。
他のレトロウイルスと同様に、レンチウイルスは、2つのLTR(長い末端反復)配列によりフランキングされたgag、polおよびenv遺伝子を有する。これらの遺伝子の各々は、単一の前駆体ポリペプチドの形態で最初に発現される多数のタンパク質をコードする。gag遺伝子は内部構造タンパク質(キャプシドおよびヌクレオキャプシド)をコードする。pol遺伝子は、逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼをコードする。env遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。さらに、レンチウイルスゲノムは、パッケージされるウイルスゲノムRNAの核外移行の責任を担うシス作用性RRE(Rev応答エレメント)エレメントを含有する。LTR5’およびLTR3’配列は、ウイルスRNAsの転写およびポリアデニル化を促進するのに役立つ。LTRは、ウイルス複製に必要な他のシス作用性配列のすべてを含有する。ゲノムの逆転写のために必要な配列(RNAtプライマーの連結部位)および粒子におけるウイルスRNAの包膜化のために必要な配列(Ψ部位)は、LTR5’に隣接している。包膜化のため(または感染性ビリオン中にレトロウイルスRNAをパッケージするため)に必要な配列がウイルスゲノムに存在しないならば、ゲノムRNAは能動的にパッケージされないであろう。さらに、レンチウイルスゲノムは、vif、vpr、vpu、nef、TAT、REVなどのアクセサリー遺伝子を含む。
H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D116I、D116A、N120G、N120I、N120E、E152G、E152A、D−35−E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T(C末端塩基性領域のL領域)、K188T、E198A、R199C、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L(C末端塩基性領域のQ領域に属する214および216)、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A(C末端塩基性領域のN領域)およびK264Hである。
− ゲノムの包膜化のために必要な配列(レンチウイルス起源のpsi配列);
− RNA核外移行エレメント、を保存するのみである。後者は、有利には、レンチウイルスゲノム、特にVIH、例えばVIH−1のREV応答エレメント(「REV応答エレメント」のためのRRE配列)(RRE配列は、ウイルスRNA上に存在し、REV調節エレメントと相互作用する)、メイソン−ファイザーモンキーウイルスのCTE[構成的輸送エレメント(“Constitutive Transport Element”)」、SIV、HIV−2またはFIVの核外移行システムまたはあらゆる他のレトロウイルスの同等なエレメント(例えばSIV、HIV2またはFIVの核外移行システム);
RNAの核内移行を促進する配列、例えば逆転写ベクターゲノムの有効な核内移行を可能とするflap配列[cPPT−CTS領域(セントラルポリプリントラクト−セントラルターミネーション配列(central polypurine tract−central termination sequence));Charneau et al., Journal of Virology, May 1992; WO 01/27304];および
− パッケージされたベクターRNAの転写に介在する、場合により修飾されたLTR5’および3’、
から選ばれる。
本発明に従うレンチウイルスベクターは、安定な系統において一過性トランスフェクションによりおよび/またはヘルパーウイルスにより種々の方法で調製することができる。
a)いかなるpsi包膜化シグナルも欠いており、レンチウイルスgag配列および組み込み機能のないインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスpol配列を含み、場合によりvif、nef、vpuおよび/またはvprアクセサリー遺伝子を欠失しているトランス相補性プラスミド、
b)プロモーター−env−PolyA配列を含むエンベローププラスミド、および
c) 場合によりLTR3’のプロモーター領域又はLTR3’のU3エンハンサー配列を欠失しており、そしてレンチウイルスのLTR5’配列とLTR3’配列との間にレンチウイルス包膜化psi配列、RNA核外移行エレメント(好ましくは、HIV RREまたは任意の他のレトロウイルスからの同等なエレメント)、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび/またはRNAの核内移行を促進する配列(例えばcPPT CTS配列)を含む組換えゲノム、ならびに該ゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼ、を含むレンチウイルスベクタープラスミドであって、レンチウイルスのいかなるコード配列も欠いているレンチウイルスベクタープラスミド、
を組合せて組換えビリオンまたは組換えレンチウイルスを産生すること、および
レンチウイルス産物の回収、
を提唱する。
a)いかなるpsi包膜化シグナルも欠いており、そしてレンチウイルスのgag配列および組み込み機能のない、(インテグラーゼのコードされた配列におけるC末端領域の塩基性領域における)AAHによる262RRKモチーフの置換を含むインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスpol配列を含み、vif、nef、vpuおよび/またはvprなどのいかなるアクセサリー遺伝子も欠失している、トランス相補性プラスミド、
b)好ましくはウイルスプロモーターを含みそしてVSV−Gエンベロープ、さらに好ましくはCMV−VSV−G−PolyA配列をコードする上記したエンベローププラスミド、および
c)場合によりLTR3’のプロモーター領域またはLTR3’のU3エンハンサー配列を欠いており、LTR5’とLTR3’との間にpsiエレメント、PRE、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび/またはflap配列、cPPT CTSを含み、レンチウイルス(例えばHIV−1)の遺伝子のすべてを欠いているレンチウイルスベクタープラスミド
を含む。
a)いかなるpsi包膜化シグナルも欠いており、そしてgag配列および/または例えばコードされたインテグラーゼ配列の塩基性領域および/またはC末端領域におけるAAHによる262RRKモチーフの置換を可能とするクラス1突然変異を含むpol配列を含み、vif、nef、vpuおよび/またはvprなどのいかなるアクセサリー遺伝子も欠いている、少なくとも1つのトランス相補性プラスミド、
b)(例えばVSV−G)−PolyA(例えばCMV−)エンベローププロモーター配列を含むエンベローププラスミド、
c)場合によりLTR3’のU3エンハンサー配列を欠失しており、5’LTRと3’’LTRとの間にpsiエレメント、PRE、導入遺伝子および場合によりプロモーターおよび/またはflap配列、cPPT CTSを含み、レンチウイルス(例えばHIV−1)のコード配列を欠失しているベクタープラスミド、
を含む上記した非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスベクター系によるコンピテント細胞のトランスフェクション、および
レンチウイルス産物の回収、
を含む、導入遺伝子のインビボ発現を可能とする非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスを産生するための特に有利な方法に関する。
本発明に従うウイルスおよび系統は、例えば、好ましくは分裂しない細胞における導入遺伝子または他の核酸の発現のため、あるいは他のベクターによる他のトランスフェクションに対してまたは形質導入法に対してすら抵抗性分裂細胞の遺伝子の一過性発現のために使用することができる。
−遺伝子治療、即ち、任意の哺乳動物細胞、特にヒト細胞における遺伝子導入を含む。これらは、分裂細胞もしくは休止細胞、中枢器官もしくは末梢器官、例えば肝臓、膵臓、筋肉、心臓などに属する細胞であることができる。それは、好ましくは、例えば神経変性病理または網膜の疾患の処置の枠内で、休止細胞(分裂しない)における、特に中枢神経系の細胞における、特に脳、骨髄および眼球の細胞における遺伝子の導入、および一過性発現のための分裂細胞への遺伝子の導入(例えば、抗腫瘍自殺ストラテジー、脊髄の損傷を処置するための軸索拒絶ストラテジー)である。
遺伝子治療は、タンパク質、例えば神経栄養因子、酵素、転写因子、受容体等の発現を可能とすることができる。さらに、それは「オリゴヌクレオチド」ストラテジー(アンチセンスまたは干渉RNAs、リボザイム等)の実施を可能とする。
−細胞治療、即ち、移植前に選ばれた行き先に向けて細胞を方向付けるための前駆細胞における分化因子の発現、または細胞が有利な因子を発現するように細胞のエクスビボ形質導入、それに続く該細胞の移植。
最初に、レンチウイルスベクター(p8.91 INWTおよびp8.91 INNプラスミド)を産生するために使用されるトランス相補性プラスミドにおいて突然変異したまたは突然変異していないインテグラーゼ配列(ヘマグルチニンと融合した)を使用した。次いで、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)の早発ウイルスプロモーターの制御下にグリーン蛍光タンパク質(GFP)を発現しそして正常な(INWT CMV GFPベクター)もしくは突然変異した(INN CMV GFP)インテグラーゼを有するVIH−1に由来するベクターのストックを産生した。神経細胞内のGFP導入遺伝子の発現を操作するためのINN CMV GFPベクターの効率に関する研究を最後に行い、始めインビトロ、次いでインビボで行った。
インビトロGFP導入遺伝子の発現
非組み込み型レンチウイルスベクターの、細胞系に形質導入しそしてそこで導入遺伝子を発現する能力を評価するために、293T、HeLaおよびMT4細胞を種々の容量のINWT CMV GFPおよびINN CMV GFPベクターの存在下にインキュベーションした。INWT CMV GFP組み込み型ベクターによる形質導入の72時間後に、ある百分率の細胞がGFPを発現する(FACSによる分析)。同じようにして、GFP+細胞がINN CMV GFPベクターによる形質導入の72時間後にFACSにより証明された(図2)。この最初の結果は、そのインテグラーゼが不活性化されているベクターの良好な形質導入有効性を示唆する。
レンチウイルスベクターのストックを、それらの産生期間中、プラスミドDNA、特にpTrip CMV GFPベクタープラスミドによりおよびトランスフェクションされた細胞におけるこの同じプラスミドから産生されたGFPタンパク質により汚染させる。これらの2つのエレメントは、GFPがレトロ転写されたベクターゲノムの発現に由来しない偽のポジティブ細胞を発生させることができる。したがって、これらのGFP+細胞は形質導入されていなくて、「偽形質導入されている」。
突然変異したIN−HANインテグラーゼを有する粒子のエピソーム性格を証明するために、GFPの発現を異なるHela、293TおよびMT4細胞系における形質導入の後の15日まで分析した。細胞を、5のMOIで、突然変異体INN CMV GFPベクターにより、組み込み型INWT CMV GFP対照によりまたは非組み込み型CMV GFPアデノウイルス対照により形質導入させた。形質導入された細胞の各バッチを12〜15日間増幅しそして72時間毎にFACSにより分析した。最後の細胞を回収する24時間前に、これらのいくらかを5mM酪酸ナトリウムで処理して、GFPの発現に対するハイポアセチル化の可能な影響を評価した。得られた結果は、図4に示される。
時間に対するGFP+細胞の百分率の減少は、形質導入された細胞の核におけるベクターゲノムの不安定性およびそれらの分解を反映することもできる。この仮定を立証するために、GFP導入遺伝子の発現を2つの型のベクターによるニューロン細胞の形質導入後に研究した。実際、初代ニューロン(胚ラット皮質)は培養において分裂しない。GFPの発現は、INN CMV GFPベクターによるこれらの細胞の形質導入後の少なくとも16日間は持続する(図5Aおよび5B)。考慮された異なる時間におけるWTベクターにより形質導入された免疫反応性細胞の百分率と、Nベクターで得られた百分率との間に有意な差は観察できなかった(反復した測定において2因子ANOVA、p=0.9321)。追加の実験は、導入遺伝子の発現は形質導入後25日まで持続することを示すことを可能とした(図5C)。
マウス線条体における発現
インビボで細胞に形質導入することにおけるインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの有効性を決定するためおよびGFP導入遺伝子の発現を可能とするために、INN CMV GFPベクターを、マウス線条体に注射した。この注射の10日後に、GFP発現を証明することができた。この発現は、注射に続く少なくとも1ヶ月の期間持続する。この結果は、SNC細胞における導入遺伝子の発現を可能としそして維持することにおける非組み込み型ベクターの有効性を確認する(図6)。形質導入された細胞の表現型を同定するために、一方ではGFP/GFAP免疫組織蛍光(グリア細胞繊維性酸性タンパク質、アストロサイトマーカー)および他方ではGFP/NeuN(ニューロンマーカー)による共標識化を隣接切片で実施した。共焦点顕微鏡によるスライドの分析の後に、GFP のGFAPマーカーとの大部分の共局在(colocalisation)(図7A)およびGFP のNeuNマーカーとの非常に僅かな共局在(図7B)を観察することができた。これらの結果は、VSVエンベロープでシュードタイプ化されたインビボでのINN CMV GFPベクターは、好ましくはアストロサイト細胞に形質導入することを示唆する。
非組み込み型レンチウイルスベクターの網膜の色素上皮細胞に形質導入する能力を評価した。このために、ベクターの網膜下注射をラットおよびイヌにおいて実施した。予備的結果は、ラットにおいて少なくとも9週間そしてイヌにおいて3ヶ月間GFPの発現を示す(図8)。これらの2つのシステムにおける発現の安定性の評価は続行されている。本発明者により以前に得られた結果は、レンチウイルスベクターは、ラットにおける網膜下注射後に、本質的に色素上皮細胞に形質導入することを示す。
臨床的適用のための非組み込み型レンチウイルスベクターの使用、治療導入遺伝子を発現することにおける該ベクターの有効性を立証する目的で、グリア由来の神経栄養因子(GDNF)を、色素網膜炎により特徴付けられたモデル、RD10ラットにおける網膜下注射後に試験した。表現「色素網膜炎(RP)」は、桿体および錐状体(網膜の神経細胞)のアポトーシスによる、進行性変性により特徴付けられる眼障害の雑多なグループを示す。3000に1つの個体の発生率で、これは失明の主要な原因である。色素上皮細胞および光受容体の形質導入は、この型の病理においてきわめて有益である。遺伝子置換ストラテジーは、光受容体又は色素上皮の形質導入を必要とするが、これに対して神経保護のストラテジーは、色素上皮の形質導入から利益を得ることができる。実際、この方法は、それが神経細胞を修飾しないで、色素上皮のみを修飾し、これは次いで拡散性栄養因子、例えばGDNFを合成し、そしてそれを保護されるべき光受容体を取り囲んでいる区域に分泌するであろうという利益を有する。
Claims (22)
- (i)LTR5’レンチウイルス配列とLTR3’レンチウイルス配列との間にレンチウイルス包膜化psi配列、RNA核外移行エレメント、導入遺伝子を含み、レンチウイルスタンパク質をコードしない組換えレンチウイルスゲノム、ならびに
(ii)突然変異したHIV−1レンチウイルスインテグラーゼであって、該突然変異が、インテグラーゼの組込み機能を消滅させ、それによって、該組換えゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止し、該突然変異が、HIV−1インテグラーゼのC末端塩基性基領域の、L及び/又はQ領域におけるか又はN領域における一つ以上の点突然変異からなるインテグラーゼを含む、
非複製型且つ非組み込み型組換えレンチウイルス。 - 一つ以上の点突然変異が、HIV−1インテグラーゼ配列におけるAAHモチーフによる262RRKモチーフの置換であることを特徴とする、請求項1に記載のレンチウイルス。
- C末端塩基性領域のL領域における一つ以上の点突然変異が、HIV−1インテグラーゼ配列におけるアミノ酸186の置換であることを特徴とする、請求項1に記載のレンチウイルス。
- C末端塩基性領域のQ領域における一つ以上の点突然変異が、HIV−1インテグラーゼ配列におけるQ214L及び/又はQ216Lであることを特徴とする、請求項1に記載のレンチウイルス。
- RNA核外移行エレメントが、HIV−1のREV応答エレメント(RRE配列)を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載のレンチウイルス。
- 組換えレンチウイルスゲノムが、さらにRNAの核内移行を促進する配列であるcPPT CTSを含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載のレンチウイルス。
- 導入遺伝子が、触媒核酸(干渉、アンチセンス、リボザイム)、毒素をコードする核酸または、生物学的に活性なポリペプチドをコードする核酸であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載のレンチウイルス。
- HIV−1レンチウイルスインテグラーゼであって、そのC末端塩基性領域の、L及び/又はQ領域、又はN領域に1つ以上の点突然変異を含み、該突然変異したインテグラーゼが、組み込み機能を欠いている、HIV−1レンチウイルスインテグラーゼを安定な方式で発現する細胞系。
- 非組み込み型且つ非複製型組換えレンチウイルスをインビトロで調製するための、請求項8に記載の細胞系の使用。
- a.レンチウイルス包膜化psi配列を欠いており、そしてレンチウイルスgag配列および組み込み機能のないインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスpol配列を含み、pol配列における突然変異が、HIV−1インテグラーゼのC末端塩基性領域の、L及び/又はQ領域におけるか又はN領域における一つ以上の突然変異からなる、トランス相補性プラスミド、
b.プロモーター−env−PolyA配列を含むエンベローププラスミド、および
c.LTR5’配列とLTR3’配列との間にレンチウイルス包膜化psi配列、RNA核外移行エレメント、導入遺伝子、ならびに該ゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みを阻止する突然変異したインテグラーゼを含み、レンチウイルスのいかなるコード配列も欠いているレンチウイルスベクタープラスミド、
を含む非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスを得ることを可能とするベクター系による細胞のトランスフェクション、および
産生したレンチウイルスの回収、
を含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載のレンチウイルスを調製する方法。 - a.レンチウイルス包膜化psi配列を欠いており、そしてレンチウイルスgag配列および組み込み機能のないインテグラーゼをコードする突然変異したレンチウイルスpol配列を含み、pol配列における突然変異が、HIV−1インテグラーゼのC末端塩基性領域の、L及び/又はQ領域におけるか又はN領域における一つ以上の突然変異からなる、トランス相補性プラスミド、ここで、該突然変異したインテグラーゼは、組込み機能を欠き、該プラスミドは、vif、nef、vpuおよび/またはvprアクセサリー遺伝子を欠失しているか又は欠失していない、
b.プロモーター−env−PolyA配列を含むエンベローププラスミド、および
c.LTR5’配列とLTR3’配列との間にレンチウイルス包膜化psi配列、REv応答エレメント、及び導入遺伝子を含み、ここで、該レンチウイルスベクタープラスミドは、レンチウイルスタンパク質をコードしない、
を含む非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスを得ることを可能とするベクター系による細胞のトランスフェクション、および
産生したレンチウイルスの回収、
ことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載のレンチウイルスを調製する方法。 - トランス相補性プラスミドにおけるpol配列における突然変異が、コードされたインテグラーゼの配列の塩基性領域、C末端領域および/または触媒部位に影響を与える1つ以上の点突然変異からなることを特徴とする、請求項10または11に記載の方法。
- トランス相補性プラスミドが、WPRE、APP5’UTR、TAU3’UTR、およびインシュレーティング配列から選ばれる転写調節エレメントをさらに含むことを特徴とする、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- エンベローププラスミドのエンベロープタンパク質が、VSV−G、狂犬病ウイルス:たとえば、狂犬病(RAB)、デューベンヘージ(DUV)、ヨーロピアンバット1型(EB−1)、ヨーロピアンバット2型(EB−2)、コトンカン(KOT)、ラゴスバット(LB)、オボジアング(OBD)、ロシャンボー(RBU)の血清群のウイルスのエンベロープタンパク質、モコラウイルス(MOK)の血清群のウイルスのエンベロープタンパク質から選ばれることを特徴とする、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
- エンベローププラスミドに存在するプロモーターおよび/またはベクタープラスミドに存在するプロモーターが、同一であるかまたは異なっており、そして細胞またはウイルスプロモーターであることを特徴とする、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 使用されるプロモーターが、PGK、RhoおよびEF1αプロモーターから選ばれる細胞プロモーターであることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 使用されるプロモーターが、CMV、TK、RSV LTR遺伝子のプロモーターから選ばれるウイルスプロモーターおよびRNAポリメラーゼIIIのU6またはH1プロモーターであることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- レンチウイルスベクタープラスミドが、プロモーター領域又はLTR3’U3エンハンサー配列を欠いていることを特徴とする、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
- エクスビボまたはインビボで被験体の中枢神経系からの細胞に遺伝子を導入するための組成物を調製するための請求項1〜7のいずれか1項に記載の非組み込み型且つ非複製型レンチウイルスの使用。
- 神経系(眼球を含む)の疾患の処置のための組成物を調製するための請求項19に記載の使用。
- 神経変性疾患(パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、SLA、SMA、DMLA等)、中枢神経系の損傷(脊髄の損傷、卒中等)、神経系に影響を与える代謝疾患(ムコ多糖症、シャルコ−マリー、等)、または眼球に影響を与える疾患(色素網膜炎、緑内障等)の処置のための請求項20に記載の使用。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のレンチウイルスおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
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