PT1224314E - Adn triplex lentiviral e vectores e células recombinantes contendo adn triplex lentiviral. - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ADN TRIPLEX LENTIVIRAL E VECTORES E CÉLULAS RECOMBINANTES CONTENDO ADN TRIPLEX LENTIVIRAL

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Âmbito da Invenção A presente invenção diz respeito ao campo da biotecnologia, e especialmente a ácidos nucleicos virais e células contendo ácidos nucleicos virais. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito a sequências de ácidos nucleicos virais que podem fazer parte de estruturas de ADN triplex bem como a vectores de ácido nucleico, vírus, e células contendo estas sequências de ácidos nucleicos virais. Diz adicionalmente respeito a métodos de utilização de tais estruturas de ADN e sequências de ácidos nucleicos.

Descrição da Arte Relacionada A transferência de genes em células estaminais hematopoiéticas (HSC) tem grande potencial, tanto para terapia genética de doenças hereditárias bem como doenças adquiridas, e para a compreensão de mecanismos que regulam a hematopoiese normal e patológica. Como as HSC têm capacidades proliferativas extensas, a transferência de genes estável deverá incluir a integração genómica do transgene. Os retrovírus baseados no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) têm sido muito populares porque integram-se nos genomas da célula hospedeira e podem permitir expressão de transgene a longo prazo. Contudo, estes oncoretrovírus não se integram em células sem divisão, e a maioria das HSC é quiescente. Muitos protocolos de pré-estimulação usando diferentes associações de citocinas foram desenvolvidos para activar os ciclos das HSC de forma a torná-las transducíveis por vectores de transferência de genes derivados de oncovírus e dependentes da mitose. Contudo, a estimulação de citocina 1 induz diferenciação em conjunto com proliferação e as potencialidades das HSC podem ser perdidas durante o processo de transdução. Este problema pode ser superado usando vectores derivados de lentivírus uma vez que se mostrou que os lentivírus infectam tanto as células com divisão como sem divisão (Poznansky et al., 1991; Naldini et al., 1996). Divulgações iniciais publicadas nos últimos três anos usando tais vectores derivados de lentivírus para a transdução de HSC mostraram resultados promissores mas muito heterogéneos (Case et al., 1999; Evans et al., 1999; Uchida et al., 1998; Miyoshi et al., 1999).

Os lentivírus desenvolveram uma estratégia de importação nuclear que permite ao seu ADN genómico atravessar a membrana nuclear de uma célula hospedeira. Esta importação nuclear activa de lentivírus é responsável pela sua capacidade única, entre os retrovírus, em replicar eficazmente em células alvo sem-divisão, tal como tecido de macrófagos. A restrição de replicação de oncovírus como MoMLV para dividir células parece ser devido â exigência para rompimento da barreira da membrana nuclear durante a mitose, permitindo que complexos de pré-integração de MoMLV (PICs) entrem no núcleo (Roe et al., 1993). A replicação independente da mitose de lentivírus, na origem das suas estratégias de replicação in vivo e consequentemente da sua patogenicidade, também permitiu a geração de vectores de transferência de gene lentivirais com aplicações terapêuticas promissoras (Poznansky et al., 1991; Naldini et al., 1996). A replicação independente da mitose de lentivírus foi inicialmente demonstrada pela infecção produtiva de células condroídes não-mitóticas pelo lentivírus VISNA (Thormar, 1963) . Logo após a sua descoberta, o VIH mostrou replicar em macrófagos primários diferenciados (Gartner et al., 1986; Ho et al., 1986). 0 ADN de VIH integra na cromatina de células alvo não-mitóticas (Weinberg et al., 1991; Lewis et al., 1992), implicando que PICs de VIH-1 são capazes de atravessar 2 a membrana nuclear de células hospedeiras (Bukrinsky et al., 1992) . Assim, a importação nuclear independente da mitose é um evento essencial responsável pela capacidade do lentivírus em replicar em células sem-divisão. A procura dos determinantes virais responsáveis pela importação nuclear activa do ADN do genoma do VIH-1 constituiu um campo activo mas controverso de investigação. A presença de sinais de localização nuclear putativos (NLSs) dentro da matriz (MA) e de proteínas virais Vpr conduziu à proposição que pudessem actuar de uma forma redundante na importação nuclear de ADN do VIH-1 (Bukrinsky et al., 1993b;Emerman et al., 1994; Popov et al., 1998; von Schwedler et al., 1994). Foi proposto que a fosforilação de um pequeno subconjunto (1%) de moléculas da MA num resíduo tirosina exterminai activa a sua libertação da membrana plasmática e a sua associação com a proteína integrase do VIH-1 (Gallay et al., 1995a; 1995b). A contribuição destas proteínas para as propriedades cariofílicas dos PICs do VIH-1 é actualmente uma matéria de debate aceso (Freed e Martin, 1994; Freed et al., 1995; Fouchier et al., 1997; Freed et al., 1997; Koostra e Schuitemaker, 1999). Mais recentemente, foram identificados motivos de NLS na proteína integrase (IN) e foram relatadas mutações nestes motivos para abolir a interaeção de IN com carioferina a, um receptor NLS celular (Gallay et al., 1997).

RESUMO DA INVENÇÃO

Seja qual for o papel destas proteínas virais candidatas na importação nuclear do VIH, a presente invenção mostra que o genoma do VIH-1 retrotranscrito por si só produz um determinante de acção-cis para a sua importação nuclear. A invenção proporciona um ácido nucleico compreendendo uma estrutura de cadeia tripla (triplex), tal como uma de um lentivírus. 0 triplex estimula a entrada de ácidos nucleicos no núcleo de células. 0 ácido nucleico pode conter as 3 sequências de acção-cis cPPT e CTS de um lentivírus. 0 lentivírus pode ser qualquer lentivírus, incluindo, mas não limitado a, VIH-1, VIH-2, VISNA, EINV, FIV, e CAE. Em modos de execução, o ácido nucleico está no contexto de um vector, tal como um vector de expressão.

Assim, a invenção também proporciona um vector, por exemplo, um vector de ácido nucleico. 0 vector de ácido nucleico pode incluir sequências de qualquer vector conhecido do perito na arte de utilidade para a transferência de ácidos nucleicos para as células ou para expressão de ácidos nucleicos in vitro. A invenção proporciona adicionalmente vírus e células (eucarióticas e procarióticas) contendo o ácido nucleico da invenção. As células podem ser células recombinantes. A invenção proporciona adicionalmente um método de transferir ácido nucleico para um núcleo de célula hospedeira, por exemplo, por exposição da célula hospedeira ao ácido nucleico, vector, vírus, ou célula da invenção, para proporcionar uma célula recombinante. 0 método da invenção permite transferência de elevada-eficiência de ácidos nucleicos para o núcleo da célula hospedeira, tal como o núcleo de uma célula estaminal hematopoiética. A transferência de elevada eficiência permite ao perito na arte considerar o vector de expressão da invenção para uso como composto terapêutico, particularmente em terapia genética. De um modo geral a terapia genética pode ser usada para tratar doença do sangue, doença do cérebro, doença virai bem como muitas outras doenças hereditárias ou adquiridas.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS 4 A Figura 1 mostra que a iniciação central de transcrição reversa é um passo importante no ciclo de replicação do VIH-1. (A) Mutações introduzidas na sequência cPPT do VIH-1. Foram construídos vírus mutantes cPPT conservativos e semi-conservativos. A cPPT-D mutante semi-conservativo contém 10 mutações no 19-mer da cPPT. A cPPT-AG mutante é o seu vírus de controlo no qual uma única mutação purina por purina introduz a mesma alteração de aminoácido região de codificação da integrase de sobreposição. As mutações são mostradas em tipo invertido. (B) Impacto das mutações na cPPT na infecciosidade do VIH-1. Cinéticas de replicação virai em células PBLs (painel esquerdo) e MT4 (painel direito) estimuladas por PHA. As células foram infectadas com quantidades equivalentes de partículas virais de acordo com os teores de antigene da cápside (p24) dos sobrenadantes virais. A produção de vírus foi seguida ao longo do tempo por actividade RT. (C) Titulações de vírus de ciclo único em células P4 tratadas com afidicolina com divisão ou sem-divisão (HeLa CD4-LTR LacZ). A actividade da β-galactosidase foi medida usando um ensaio de quimioluminescência. Os resultados são expressos como unidades de luz relativa (RLU)/seg/ng p24 do inoculo, média ± DP de quatro experiências independentes. A Figura 2 ilustra mutações na cPPT que não afecta a produção virai, a síntese de ADN virai nem a capacidade de ADN virai integrar in vitro. (A) Efeito de mutações na cPPT na produção virai. Células HeLa foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos pLAI, pcPPT-AG, ou pcPPT-D. A produção virai foi medida por quantificação de antigene virai p24 em sobrenadantes celulares, 48 horas pós-transfecção. 5 (B) Efeito de mutações na cPPT na eficiência de transcrição reversa. Células P4 foram infectadas com as mesmas quantidades de partículas virais (300 ng de antigene p24 por 106 células) e o ADN foi extraído 12 horas depois. Quantidades totais do ADN virai de transcrição reversa, representado por um fragmento MscI do VIH-1 interno, foi detectado por Southern blot usando o mesmo fragmento de ADN como sonda e quantificadas usando um "phosphorimager". (C) Efeito de mutações na cPPT na integração in vitro. Células MT4 foram co-cultivadas com células H9-LAI ou H9-cPPT-225 cronicamente infectadas. A integração in vitro de complexos de pré-integração virais, isolados do citoplasma de células infectadas, foi executada como previamente descrito (Farnet e Haseltine, 1990). Cada banda é carregada com ADN citoplásmico de 2χ10β células infectadas. A Figura 3 mostra que os vírus mutantes de ADN triplex central são deficitários na importação nuclear de ADN virai. (A) Estratégia para o seguimento quantitativo da síntese, circularização, e integração de ADN do VIH-1. O ADN de células infectadas foi extraído em vários tempos pós-infecção, digerido com MscI e Xhol, e analisado por Southern blot usando uma sonda sobrepondo o sítio 5'MscI. O fragmento de ADN de 1,9 kb interno, comum a todas as espécies de ADN virai independentemente do seu estado integrado ou não integrado, indica a quantidade total de ADN virai em células infectadas. Os sinais 2,6 kb, 2,8 kb, e 3,4 kb correspondendo, respectivamente, a ADN linear não integrado, um, e duas LTRs de ADNs circular são reveladas. Uma vez que a sonda gerada por PCR sobrepõe exactamente o sítio MscI, a intensidade de cada banda é directamente proporcional à quantidade das espécies de ADN virai correspondente. Assim, a quantidade de ADN proviral integrado pode ser calculada subtraindo da quantidade total de ADN virai os sinais de ADN virai linear não integrado e circular. 6 (B) Análise de Southern blot de ADN virai processado em células infectadas. Células P4 foram infectadas com quantidades equivalentes de cada vírus, normalizadas nos teores de p24 dos sobrenadantes. Células infectadas foram lisadas a diferentes tempos pós-infecção, ADN extraído, e usado para a análise quantitativa acima descrita. (C) Perfis do ADN virai intracelular, em conclusão de um ciclo de infecção (48 horas pós-infecção). Os resultados são expressos como percentagens de ADN virai total. Foram obtidos perfis de ADN virai intracelular semelhantes usando células MT4 (dados não mostrados). A Figura 4 mostra que o ADN linear de vírus mutantes de ADN triplex central acumula na vizinhança da membrana nuclear. (A) Fraccionamento núcleo/citoplasma de células P4 infectadas. Análise Southern blot de ADN virai de fracções nuclear (N) e citoplásmica(C), 24 horas pós infecção. Fraccionamento baseado em lise de tritão foi executado como previamente descrito (Belgrader et al., 1991). 0 ADN foi restringido com MscI e hibridizado usando a sonda de sobreposição do sítio MscI. (B) Detecção de genomas de VIH-1 individuais por Hibridização In Si tu de Fluorescência (FISH). Células P4 foram infectadas a alta multiplicidade(2yg de antigene p24 por 106 células), e hibridizadas usando uma sonda de genoma do VIH-1 de comprimento total. Sinais fluorescentes foram amplificados por de precipitação de tiramida. Secções ópticas através das células foram analisadas por microscopia de deconvolução. A Figura 5 mostra que a inserção do ADN triplex central num vector baseado em VIH-1 aumenta a transdução de GFP e a importação nuclear do ADN genómico do vector. 7 (A) Diagrama esquemático dos genomas dos vectores. Sequências de acção-cis central cPPT e CTS do genoma do VIH-1, responsáveis pela formação do ADN triplex durante transcrição reversa, foram inseridas numa posição central no vector HR GFP previamente descrito (Naldini et al., 1996). TRIPinv-GFP inclui a sequência do ADN triplex central na orientação reversa, não-funcional. (B) Eficiência comparativa de transdução de GFP usando vectores de VIH com ou sem um ADN triplex central. Células HeLa (tratadas com afidicolina) com ou sem divisão foram usadas como alvos. A fluorescência GFP foi quantificada 48 horas pós-transdução usando um fluorímetro de microplacas (Wallac) . Os resultados são expressos como a média ± DP de uma experiência representativa executada em triplicado. A pseudotransdução da actividade GFP foi subtraída do sinal. (C) Análises Southern blot de vector de ADN processado em células transduzidas. Células HeLa transduzidas foram lisadas a diferentes tempos pós-infecção, ADN extraído, restringido, e executado Southern blot usando uma estratégia similar como para os vírus. Digestão por MscI é substituída por EcoNI e Avall, e a sonda é um fragmento de ADN de PCR que sobrepõe exactamente o sítio EcoNI. (D) Análise quantitativa do estado intracelular do vector de ADN, 48 horas pós infecção. Os resultados são apresentados como percentagens de vector de ADN total. A Figura 6 ilustra um modelo para importação nuclear do genoma do VIH-1 dependente do ADN triplex. (A) Avaliação dos fenótipo observados dos vírus mutantes de ADN triplex central. Os passos de iniciação central e de terminação da transcrição reversa do VIH-1 criam uma estrutura de retalho de ADN de cadeia positiva longa: o ADN triplex central. A cadeia positiva longa do VIH-1 é 8 sintetizada como dois segmentos de meio-genoma discretos. Um segmento a jusante é iniciado numa cópia central da sequência de tracto polipurínico (cPPT). 0 segmento a montante termina a jusante da cPPT, após um evento de deslocação de cadeia longa de 99 nucleótidos, bloqueado pela sequência de terminação central (CTS). Na conclusão de um único ciclo de infecção, o ADN virai do vírus do tipo selvagem é praticamente completamente processado em provírus integrado (*55%) , 1LTR (*35%) , e ADN circular 2LTRs (< 5%) , enquanto que uma pequena fracção permanece como ADN linear (< 10%) . Mutações na cPPT afectam a formação do ADN triplex central. 0 produto de transcrição reversa final de um vírus mutante de iniciação central é um ADN linear de cadeia dupla contínuo com carência do ADN triplex central (Charneau et al., 1992). 0 ADN virai do vírus mutante cPPT-D acumula-se em células infectadas como moléculas de ADN linear, e localiza-se nas imediações da membrana nuclear. (B) Dois mecanismos especulativos para importação nuclear do genoma do VIH-1 dependente do triplex por maturação do complexo de transcrição reversa (RTC) num complexo de pré-integração (PIC) e translocação de ADN linear através do poro nuclear. A transcrição reversa do VIH-1 ocorre provavelmente dentro de um complexo estruturado (ordenado) rodeado por um conjunto de proteínas da cápside. 0 tamanho do RTC excede o diâmetro de exclusão do poro nuclear. Antes da translocação, o RTC sofre uma maturação num PIC menor com perda das proteínas da cápside (Karageorgos et al., 1993). A formação do ADN triplex sinaliza a terminação da síntese de ADN virai e poderá sinalizar a fuga do ADN do VIH do conjunto da cápside. No PIC, as extremidades do ADN linear são provavelmente atravessadas em conjunto após dimerização de proteínas integrase ligadas âs extremidades de LTRs (Miller et al., 1997). 0 ADN triplex estando numa posição central, uma estrutura lógica para PIC do VIH-1 seria um filamento duplo, simetricamente dobrado em qualquer lado do triplex central pela dimerização da integrase. O ADN triplex poderia então constituir um vértice que poderia interagir com 9 proteínas de transporte cariofílicas, permitindo a passagem do filamento de ADN do VIH-1 através do poro nuclear. Em vírus mutantes cPPT, um defeito de maturação do RTC em PIC induzirá uma acumulação de cápsides virais integrais no poro nuclear. Alternativamente, a ausência do ADN triplex no ADN linear mutante cPPT proibirá a interacção com proteínas de transporte proibindo a translocação do genoma do VIH-1 pelo poro nuclear. Em ambos os casos, o ADN de vírus mutantes cPPT acumula-se como ADN linear nas imediações da membrana nuclear. A Figura 7 mostra os resultados de experiências de transdução usando células CD34+ de sangue de cordão humano. (A) Análises FACS de células CD34+ de sangue de cordão humano transduzidas durante 24 horas na presença de 100 ng/ml de P24 virai em condições aqui descritas. A análise foi executada 48 horas após lavagem das células no final do período de transdução de 24 horas. As percentagens são expressas como proporções de células hematopoiéticas morfologicamente controladas. Média X indica o valor médio de intensidade de fluorescência verde. (B) Expressão de GFP foi analisada no dia 5 pós transdução. A Figura 8 representa em diagrama o efeito de dosagem virai na eficiência de transfecção. (A) A percentagem de células CD34+ que expressam eGFP. (B) 0 valor médio de intensidade de fluorescência de GFP de células CD34+eGFP+. (C) 0 valor médio de intensidade de fluorescência GFP de células CD34+eGFP+ multiplicado pela percentagem de células CD34+eGFP+. As células CD34+ foram transduzidas durante 24 horas sob as condições aqui especificadas com o vector 10 lentiviral incluindo a sequência de codificação eGFP sob controlo do promotor do CMV, e incluindo (linha grossa) ou sem (linha tracejada) a estrutura triplex A análise foi executada 48 horas após lavagem das células no final do período de transdução de 24 horas. A Figura 9 ilustra análise FACS de células CD34+ de sangue de cordão humano transduzidas durante 24 horas sob as condições descritas no texto com um vector lentiviral tendo uma LTR do VIH-1 intacto (painéis esquerdos) ou uma LTR do VIH-1 com deleção U3 (painéis direitos) e um promotor do CMV interno (painéis superiores) ou um promotor de EF-1 alfa (painéis inferiores). (A) A análise foi executada 48 horas após lavagem das células no final do período de transdução de 24 horas. (B) A análise foi executada 120 horas após lavagem das células no final do período de transdução de 24 horas. A análise distingue entre células CD34 luminosas (imaturas) e sombrias.

As percentagens são expressas como proporções de células hematopoiéticas morfologicamente controladas. O segundo número, quando indicado, representa a média de fluorescência verde.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Mostrámos previamente que o VIH-1 desenvolveu uma estratégia de transcrição reversa complexa, que difere das do oncovírus por dois passos que ocorrem no centro do genoma: uma iniciação adicional de síntese de cadeia positiva acoplada com um passo de terminação. O ADN de cadeia positiva do VIH-1 é sintetizado como dois segmentos metade-genómicos discretos. Uma cópia adicional da sequência cis-activa do tracto 11 polipurínico, presente no centro de todos os genomas lentivirais (cPPT), inicia a síntese de cadeia positiva a jusante (Charneau et al., 1991, 1992). 0 segmento de cadeia positiva a montante iniciado no 3'PPT vai, após uma transferência de cadeia, prosseguir para o centro do genoma e terminar após um evento de deslocamento de cadeia discreto (Figura 6A) . Este último evento cronológico de transcrição reversa do VIH-1 é controlado pela sequência cis-ativa da sequência de terminação central (CTS) que ejecta a transcriptase reversa do VIH-1 (RT) neste sítio no contexto específico de síntese de deslocamento de cadeia (Charneau et al., 1994; Lavigne et al., 1997). Assim, o produto final de transcrição reversa de VIH-1 é uma molécula de ADN linear que traz no seu centro uma dobra de ADN longa de 99 nucleótidos estável, aqui designado por ADN triplex central (Figura 6A).

Ambos os vírus mutantes de iniciação central e de terminação sintetizam um produto de transcrição reversa desprovido de um ADN triplex do tipo selvagem. Como ilustrado na Figura 6A, no caso de um mutante de iniciação central, o produto final é um ADN linear de cadeia dupla contínuo que carece do triplex central (Charneau et al., 1992). 0 segmento de cadeia positiva a jusante iniciado no cPPT não é sintetizado. Assim, não ocorre deslocamento de cadeia no centro do genoma; o alongamento da cadeia positiva transferida prossegue por todo o genoma. No caso de um mutante de terminação central, eventos de deslocamento de cadeia central já não são controlados pela sequência CTS mutada e, são geradas sobreposições de cadeia positiva mais compridas e distribuídas aleatoriamente, comparado ao ADN triplex do tipo selvagem discreto (Charneau et al., 1994). As mutações nas sequências cis-activas cPPT ou CTS prejudicam gravemente a replicação de VIH, sugerindo um papel directo do triplex central no ciclo de vida retroviral (Charneau et al., 1992; Hungnes et al., 1992; Charneau et al., 1994). 12 A presente invenção descreve que o ADN triplex central do VIH-1 está envolvido num passo tardio de importação nuclear do genoma do VIH-1, imediatamente antes de, ou durante, translocação de ADN virai através do poro nuclear. Por este motivo as características distintivas de transcrição reversa lentiviral são responsáveis, pelo menos em parte, pela capacidade única de lentivírus, entre retrovírus, em replicarem em células sem-divisão. A invenção também divulga que vectores de transferência de genes do VIH carentes em ADN triplex central exibem um defeito de importação nuclear forte. Esta invenção estabelece que a inserção das sequências cis-activas centrais do genoma do VIH-1 num vector VIH previamente descrito (Naldini et al., 1996) aumenta a eficiência de transdução por complementar o defeito de importação nuclear do vector de ADN original para níveis do tipo selvagem. Esta constatação proporciona evidência adicional e independente do papel do ADN triplex central na importação nuclear do VIH-1. A descrição do ADN triplex como determinante de importação nuclear de lentivírus tem implicações importantes para o desenho de vectores lentivirais eficientes. Uma vez que a infecção de células alvo sem-divisão por lentivírus assenta no seu uso de uma via de importação nuclear activa, é preferível manter os determinantes de importação nuclear lentivirais em elementos vectoriais derivados. Elementos vectoriais retrovirais clássicos são vectores de substituição nos quais são deletadas as sequências de codificação virais completas entre as LTRs e substituídas pelas sequências de interesse (Miller AD, 1997). No caso de vectores lentivirais, esta estratégia clássica conduz à deleção das sequências cis-activas centrais cPPT e CTS. 0 papel importante do triplex na importação nuclear do VIH implica que tais elementos vectoriais de substituição não são óptimos. Esta constatação estabelece o facto que o determinante de importação nuclear do ADN triplex é operativo no contexto heterólogo de um vector lentiviral derivado do VIH-1. 0 ADN triplex per se fora do contexto do genoma do VIH-1 nativo pode promover a importação nuclear de 13 sequências heterólogas de ADN (PCT Francesa N° 9805197, 24 de Abril de 1998). A presença da sequência do ADN triplex induz um aumento acentuado de eficiência de transdução de genes em células estaminais hematopoiéticas.

Assim, num aspecto, a presente invenção proporciona ácidos nucleicos (ADN ou ARN, ou análogos destes) que são capazes de participar em estruturas de ácidos nucleicos triplex (i.e., cadeia tripla de ácidos nucleicos). Em modos de execução da invenção, os ácidos nucleicos são sequências lentivirais. Em modos de execução, os ácidos nucleicos são derivados de sequências lentivirais, tal como por mutagénese dirigida (i.e., deleção intencional, inserção, ou substituição de pelo menos um nucleótido) ou mutagénese de pressão selectiva. Os ácidos nucleicos da invenção permitem transferência de elevada-eficiência de ácidos nucleicos em células hospedeiras, e especialmente em núcleos de células hospedeiras. Devido a esta capacidade, os genes que estão operacional ou fisicamente ligados aos ácidos nucleicos da invenção podem ser expressos a níveis elevados e/ou numa elevada percentagem de células exposta aos ácidos nucleicos. 0 ADN inserido numa região de cadeia tripla de um genoma lentiviral de acordo com a presente invenção é particularmente estável no elemento, e ajuda a alcançar um elevado nível de transdução e transfecção.

Num modo de execução preferido, a invenção proporciona uma sequência de ADN de três cadeias induzida pelas regiões cPPT e CTS de um lentivírus, que é capaz de induzir uma elevada taxa de entrada de vector de ADN num núcleo de célula hospedeira, ou capaz de aumentar a taxa de importação nuclear de vector de ADN. Em modos de execução, a sequência de ADN de cadeia tripla pode ser covalentemente ligada a uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga, como um gene repórter ou gene de outro interesse. Por exemplo, o ácido nucleico da invenção pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que codifica um péptido, polipéptido, ou proteína. Em modos 14 de execução, a sequência de ácidos nucleicos heteróloga está presente na região de tripla-hélice. Em modos de execução, a sequência de ácidos nucleicos heteróloga está presente no mesmo ácido nucleico que a região de tripla-hélice, mas fora da tripla hélice. Em modos de execução, um único ácido nucleico compreende mais do que uma sequência de cadeia tripla induzida pelas regiões cPPT e CTS de um lentivírus.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona vectores, tais como vectores vai-vém, vectores de expressão, vectores de integração, transposões, retrotransposões, e semelhantes, que contêm pelo menos uma sequência capaz de participar na formação de estruturas de ácido nucleico triplex.

Em modos de execução, o vector compreende uma sequência única capaz de participar na formação de estruturas de ácido nucleico triplex. Em modos de execução, o vector compreende mais do que uma sequência capaz de participar na formação de estruturas de ácido nucleico triplex. Os vectores podem ser usados para transferir os ácidos nucleicos da invenção de uma célula para outra, ajudar na geração de grandes quantidades dos ácidos nucleicos da invenção, e servir como uma molécula de base na qual outras sequências de ácidos nucleicos de interesse (e.g., genes repórter, genes terapêuticos) podem ser inseridas.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método para eficazmente infectar, transfectar, ou transduzir células com uma sequência de ácidos nucleicos virai compreendendo pelo menos uma sequência que pode participar em estruturas de ácido nucleico triplex. Em modos de execução, o método compreende expor uma célula, ou uma pluralidade de células, a pelo menos uma cópia de um ácido nucleico, vector, vírus, ou célula da invenção. Em modos de execução, o passo de expor a célula ou células ao ácido nucleico, vector, vírus, ou célula da invenção é conduzido sob condições tais que o ácido nucleico, vector, vírus, ou célula da invenção 15 podem entrar na célula ou células alvo (hospedeira). Em modos de execução preferidos, as condições são tais que níveis elevados do ácido nucleico, vector, vírus, ou célula da invenção entram na célula ou células alvo.

Em modos de execução, o método é altamente eficiente, permitindo a inserção do ácido nucleico da invenção no núcleo de 30% ou mais das células expostas ao ácido nucleico. Em modos de execução, a percentagem de núcleos que incorporam o ácido nucleico da invenção é 40% ou superior, por exemplo 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, ou 90%-100%. Em modos de execução preferidos, a percentagem de núcleos que incorporam o ácido nucleico da invenção é superior a 80%, mais preferivelmente, superior a 85%, e mais preferencialmente superior a 90%, como superior a 95%. Em modos de execução, as células são infectadas ou transfectadas com vírus inteiros (incluindo fagos) ou bactérias contendo os ácidos nucleicos da invenção. Em modos de execução, os ácidos nucleicos da invenção são introduzidos nas células usando meios mecânicos e/ou químicos (e.g., electroporação, fusão de lipossomas). Em modos de execução, ácido nucleico nu de acordo com a invenção é incorporado pelas células hospedeiras alvo.

Assim, num modo de execução, a invenção proporciona o uso de uma sequência de nucleótidos compreendendo as regiões cPPT e CTS, que adoptam uma estrutura de ADN de cadeia tripla (triplex) após transcrição reversa, num vector lentiviral ou retrotransposão e que estimula a entrada de, e a taxa de importação nuclear de, vector de ADN no núcleo de uma célula transduzida.

Num aspecto da invenção, são facultadas células recombinantes que contêm os ácidos nucleicos ou vectores da invenção. As células recombinantes podem ser qualquer célula (procariótica ou eucariótica), incluindo descendência ou derivados desta. Assim, a invenção inclui células que são criadas usando uma 16 célula da invenção. Em modos de execução, as células são eucarióticas. Em modos de execução, as células são células de mamífero, tais como células HeLa ou células hematopoiéticas, tais como células estaminais hematopoiéticas. Assim, em modos de execução, a invenção proporciona um processo de transduzir células eucarióticas, em que o processo compreende uso de uma sequência de ADN de cadeia tripla induzida pelas regiões cPPT e CTS de um lentivírus, que é capaz de induzir uma elevada taxa de entrada de vector de ADN num núcleo de célula hospedeira, ou capaz de aumentar a taxa de importação nuclear de vector de ADN.

Porque as células recombinantes da invenção podem expressar um gene heterólogo de interesse a altos níveis, estas células podem ser usadas em numerosas aplicações. Aplicações incluem, mas não estão limitadas a, produção de níveis elevados de proteínas de interesse (como proteínas de valor terapêutico) em cultura de células.

Em modos de execução, este aspecto da invenção proporciona um método de produzir uma proteína recombinante de interesse expondo uma célula alvo a um ácido nucleico, vector, ou vírus da invenção e permitindo a célula alvo incorporar ácido nucleico da invenção, por exemplo, através de transdução, transformação, ou transfecção. Após introdução do ácido nucleico na célula alvo, a célula é cultivada sob condições por meio das quais a proteína recombinante de interesse é expressa, e assim produzida pela célula alvo que agora é considerada uma célula recombinante de acordo com a invenção. Embora o método possa ser praticado numa única célula individual, é evidente que o método será frequentemente mais prático se praticado numa colecção de células nas quais todas as células são clones. Tal como é aqui usado, "célula" refere-se a uma célula individual ou uma colecção de células idênticas. 17 0 método pode adicionalmente incluir purificar ou isolar a proteína de interesse da célula recombinante ou fluido de cultura celular. Em tal método, podem ser aplicados procedimentos de expressão e purificação de proteínas conhecidos dos peritos na arte. Estes procedimentos são bem conhecidos dos peritos na arte e portanto não necessitam ser aqui detalhados.

Num modo de execução preferido, este aspecto da invenção proporciona um processo para expressar um gene de interesse in vitro, em que o processo compreende: a) expor células alvos a um ácido nucleico isolado ou purificado compreendendo um gene de interesse e pelo menos uma cópia das regiões de actuação cis cPPT e CTS de um retrovírus, em que as regiões cPPT e CTS induzem uma estrutura de ADN de cadeia tripla, sob condições que permitem a incorporação do ácido nucleico na célula alvo para criar uma célula recombinante, e b) cultivar a célula recombinante sob condições que permitem pelo menos que parte do ácido nucleico seja transferido para o núcleo da célula recombinante e o gene de interesse ser expresso. Em modos de execução, o processo usa um vector de acordo com a invenção. Assim, a invenção proporciona um método de expressar um gene de interesse in vitro, por exemplo, em cultura de tecido. Em modos de execução, o método compreende expor células alvo a um ácido nucleico, vector, vírus, ou célula da invenção sob condições onde a célula alvo pode incorporar a molécula da invenção contendo o gene de interesse. A célula recombinante assim produzida é então permitida crescer e replicar sob condições onde o gene de interesse é expresso. Em modos de execução, o método in vitro de expressão de gene é acoplado a um método de purificar ou isolar a proteína de interesse. Nestes modos de execução, a proteína de interesse pode ser purificada ou isolada de outros componentes celulares usando técnicas conhecidos do perito na arte, incluindo, mas não limitado a, cromatografia líquida, precipitação, centrifugação, filtração em gel, e cromatografia de afinidade. Técnicas apropriadas são 18 conhecidas dos peritos na arte e não necessitam ser aqui detalhadas. A invenção é também dirigida a uma célula recombinante da invenção para uso na expressão de um gene de interesse, por exemplo num indivíduo com necessidade da proteína expressa pelo gene. A dita célula recombinante pode ser produzida fora do indivíduo por exposição de uma célula hospedeira a um vector, vírus, ou célula da invenção. Em modos de execução preferidos, a célula recombinante é uma célula estaminal hematopoiética. Em modos de execução, as células recombinantes também podem ser primeiro purificadas ou isoladas de células não-recombinantes, antes da sua administração.

Noutros modos de execução, o indivíduo é exposto a um vector, e/ou vírus da invenção, numa quantidade e forma suficiente para resultar na expressão do gene de interesse no corpo do indivíduo. A expressão do gene de interesse é de preferência obtida numa célula ou tecido alvo.

Além disso, a invenção também diz respeito a um vector VIH-1 de expressão compreendendo: a) um ácido nucleico isolado ou purificado compreendendo pelo menos uma cópia das regiões de acção-cis cPPT e CTS de um retrovírus, em que as ditas regiões cPPT e CTS induzem uma estrutura de ADN de cadeia tripla e b) uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga, em que a LTR do VIH-1 é deletada do promotor e do aumentador de U3, para uso no tratamento de um indivíduo sofrendo de, ou tendo uma elevada probabilidade de desenvolver, uma doença ou desordem com base genética, em que o dito vector retroviral está numa quantidade suficiente para resultar na expressão da dita proteína terapêutica numa quantidade suficiente para tratar a dita doença ou desordem. 19 A expressão do vector VIH-1 é usada num tratamento profiláctico, de melhoria, ou curativo. 0 tratamento pode abranger uma doença ou desordem sanguínea, uma doença ou desordem do cérebro ou do sistema nervoso, ou uma doença ou desordem do desenvolvimento. Técnicas para introduzir e/ou expressar genes in vivo são conhecidas do perito na arte. 0 médico pode seleccionar a técnica mais adequada para a dada proteína ou tecido ou célula alvo.

Em conformidade, a invenção também diz respeito a um vector de expressão de acordo com a invenção, que é capaz de induzir uma elevada taxa de entrada de vector de ADN num núcleo de uma célula hospedeira, ou capaz de aumentar a taxa de importação de vector de ADN, para tratar um hospedeiro.

De acordo com os aspectos anteriores da invenção, também é facultado um estojo. 0 estojo pode conter pelo menos um ácido nucleico, pelo menos um vector, pelo menos um vírus, ou pelo menos uma célula da invenção, ou uma combinação de quaisquer ou de todos dos anteriores. 0 estojo pode fornecer cada um dos modos de execução da invenção anteriores juntamente numa composição única ou separadamente, como por exemplo, em diferentes recipientes. Em modos de execução, o estojo inclui alguns ou todos os reagentes e provisões necessários para usar os ácidos nucleicos, vectores, vírus, e células da invenção para o propósito desejado. A presente invenção divulga um mecanismo original de importação nuclear de VIH-1 com um papel crucial de uma estrutura de ADN de cadeia tripla, o ADN triplex, neste mecanismo. 0 VIH-1 desenvolveu uma estratégia de transcrição reversa complexa, pela qual um evento de deslocamento de cadeia central, consecutivo â iniciação e terminação central de transcrição reversa, cria um ADN triplex no centro de moléculas de ADN linear do VIH-1 não integradas. Este ADN triplex actua por sua vez como um determinante cis-activo da importação nuclear do genoma de VIH-1. A invenção mostra que 20 a iniciação e terminação central, dois passos distintos da transcrição reversa do VIH-1, são responsáveis pela capacidade do VIH-1 em infectar células alvo sem-divisão.

Os exemplos da invenção mostram adicionalmente que a falta do ADN triplex conduz a um vírus que é quase não-infeccioso em células com divisão ou sem-divisão. Embora mutações em cPPT não afectam a taxa de síntese de ADN virai ou a sua capacidade para integrar in vitro, a maioria das moléculas de ADN retrotranscritas do vírus mutantes cPPT acumulam-se ao longo do tempo como ADN linear não integrado. Ao invés, o ADN linear do vírus do tipo selvagem é quase completamente processado em provírus integrados e ADN circular. Os perfis de ADN intracelular de vírus mutantes cPPT apontam para um defeito de importação nuclear, o ADN virai acumula-se como moléculas lineares como consequência da sua falta de acesso ao compartimento nuclear onde poderia integrar ou circularizar. Um defeito tardio de importação de ADN virai, afectando mais provavelmente translocação através do NPC, é demonstrado por fraccionamento de células infectadas e visualização directa (FISH) do ADN virai intracelular. As moléculas de ADN linear defeituosas em triplex associam-se com a membrana nuclear. A invenção centra-se na análise de vírus mutantes cPPT, que são caracterizados pela ausência de um ADN triplex central. A maioria das experiências aqui apresentadas também foram conduzidas em vírus mutante CTS previamente descritos (Charneau et al., 1994), com os mesmos resultados (dados não mostrados). No vírus mutante CTS, a transcrição reversa produz moléculas de ADN linear contendo sobreposições de cadeia positiva maiores, aleatoriamente distribuídas, comparado ao ADN triplex central discreto do vírus do tipo selvagem. Assim, não apenas a presença do ADN triplex, mas também a sua integridade estrutural, é importante para a importação nuclear de ADN do VIH. 21 A invenção mostra que o ADN triplex é operativo no contexto de um sistema vectorial baseado no VIH-1. A sua inserção num vector destituído do triplex reverte um defeito forte de importação nuclear do vector de ADN para níveis de importação nuclear do tipo selvagem. 0 ADN triplex central é um determinante de importação nuclear comum de lentivírus. A localização do ADN triplex central foi precisamente definida no caso do VIH-1 . 0 deslocamento da cadeia central começa no primeiro nucleótido a seguir à sequência cPPT (Charneau e Clavel,1991) e termina em geral 99 nucleótidos a jusante, no sítio ter2 da sequência CTS (Charneau et al., 1994). A configuração tridimensional das três cadeias de ADN do triplex é para já desconhecida. Não obstante, a presença de um ADN triplex no centro do genoma pode ser generalizada a todos os lentivírus. Uma cópia central de PPT é uma característica comum de todos os genomas lentivirais e um elemento de terminação CTS putativo, revelado pela presença de tractos(A)n e (T)n, também existe aproximadamente 100 nucleótidos a jusante (Charneau et al., 1994). 0 ADN triplex central do lentivírus ungulado EIAV foi recentemente caracterizado (Stetor et al., 1999). Uma descontinuidade da cadeia central no ADN do vírus VISNA, referido como uma abertura, mas mais provavelmente um corte resultante do deslocamento da cadeia central, foi revelado pela clivagem com nuclease SI (Harris et al., 1981). Uma vez que a replicação independente da mitose foi descrita para a maioria dos lentivírus (Gartner et al., 1986; Thormar, 1963), o papel do ADN triplex na importação nuclear aqui descrito para o VIH-1 pode ser generalizado a todos os lentivírus.

Sem ser limitante, a invenção proporciona uma hipótese de mecanismo para o papel do ADN triplex central na importação nuclear do VIH-1 como se segue: Uma estrutura de ADN de cadeia tripla actuando como um determinante cis da sua importação nuclear é um novo fenómeno biológico sem contrapartidas celulares ou virais conhecidas. Qualquer 22 hipótese de um mecanismo molecular que descreve o papel do ADN triplex central na importação nuclear do VIH é então especulativo. 0 triplex central poderá actuar como um determinante virai para iniciação da captação do filamento de ADN do VIH pelo poro nuclear. Tal poderá ser alcançado por interacção directa do ADN triplex com componentes do poro, ou alternativamente através da interacção do triplex com proteínas celulares ou virais que se movem entre o citoplasma e o núcleo da célula hospedeira e podem arrastar o genoma do VIH para o núcleo. A translocação do genoma do VIH de 9,7 kb através de um poro nuclear de diâmetro máximo de 26nm deve ocorrer numa orientação específica, após reconhecimento de uma extremidade do filamento de ADN do VIH-1 para iniciar a captação. Uma situação semelhante surge na exportação nuclear de RNA mensageiro, onde a captação do filamento de ARN através do poro é guiada pela estrutura 5'Cap (Hamm e Mattaj, 1990).

Embora a conformação de PICs do VIH-1 não seja bem conhecida, foi estabelecido que a ligação das extremidades do ADN linear são ocorre conjuntamente, provavelmente após dimerização das proteínas integrase ligadas nos topos das LTRs (Miller et al., 1997). De forma interessante, as sequências cis-activas cPPT e CTS são encontradas numa posição central em todos os genomas lentivirais. Uma estrutura lógica para PICs lentivirais seria um filamento de ADN duplo, simetricamente dobrado em ambos os lados do triplex central pela dimerização da integrase (Figura 6B) . O triplex constituirá então um vértice de um PIC do VIH-1 filamentoso e o dímero de integrase o vértice oposto. Em PICs mutantes de cPPT, a ausência de um ADN triplex conduziria à sua falta de reconhecimento pela maquinaria do poro nuclear ou pelas proteínas vai-vém. A identificação dos ligandos de proteínas do ADN triplex central promete ser de importância principal tanto para a nossa compreensão da importação nuclear de PIC do VIH-1 como para o desenvolvimento eventual de drogas que marcam este passo de replicação do VIH. 23

Outra hipótese de mecanismo para explicar as propriedades de vírus mutantes do triplex envolveria um defeito na maturação de cápsides de VIH em PICs, antes da translocação de ADN virai no núcleo. De acordo com este modelo, ADN virai defeituoso em triplex permaneceria incorporado como cápsides virais integrantes, incapaz de translocação. A transcrição reversa retroviral não ocorre em elevada diluição dos componentes virais no citoplasma de células infectadas, mas requer o ambiente estrutural de um complexo de transcrição reversa onde os componentes estão limitados num conjunto de proteínas da cãpside. 0 tamanho da cãpside do VIH excede o diâmetro de exclusão máximo de um poro nuclear (Dworetzky et al., 1998; Gelderblom,1991). Então, antes do ADN virai poder entrar no núcleo, os complexos de transcrição reversa do VIH têm que sofrer maturação em PICs de tamanho compatível com translocação através dos poros nucleares (Karageorgos et al., 1993) . A maturação de cápsides virais antes de translocação nuclear está bem estabelecida noutros sistemas virais nos quais o ciclo de replicação envolve translocação do ADN do genoma através da membrana nuclear da célula hospedeira (Whittaker e Helenius, 1998). Ao passo que a transcrição reversa dentro das cápsides virais foi fisicamente demonstrada para MLV (Bowerman et al., 1989), tal ainda não foi possível para o VIH-1 devido possivelmente à fragilidade das cápsides do VIH-1 (Borroto-Esoda e Boone, 1991) . 0 complexo de transcrição reversa do VIH contém numerosas cópias da polimerase RT (aproximadamente 30 a 50 por cápside) (Panet et al., 1975). Devido à distribuição importante da transcriptase reversa do VIH-1, uma elevada estoiquiometria de enzima para o modelo de ARN virai é necessária para superar um número de passos limitantes da transcrição reversa tais como pausas de transferência de cadeia ou de polimerização durante síntese de cadeia positiva e negativa e formação precisa do triplex central (Klarmann et al., 1993; Charneau et al., 1994). tal sugere fortemente que a terminação central, o último evento da transcrição reversa 24 lentiviral, ocorre numa estrutura da cápside integrante. A terminação central, que marca o fim da síntese de ADN virai, pode ser um sinal necessário para a eliminação do ADN da cápside virai e sua subsequente translocação no núcleo.

Estes dois mecanismos moleculares putativos para a importação nuclear mediada por ADN triplex do VIH-1 não são mutuamente exclusivos. A formação de um ADN triplex central poderá activar a maturação de cápsides virais em PICs, tornando assim o ADN triplex acessível a proteínas de vai-vém. 0 facto da integridade do ADN triplex central ser necessária para entrada do genoma do VIH-1 no núcleo da célula hospedeira implica que todo o processo de síntese de ADN, incluindo o último evento de deslocamento de cadeia central, é completado antes da translocação do PIC do VIH através do poro nuclear. A distribuição subcelular da transcrição reversa lentiviral está actualmente sob debate e se a replicação do VIH ocorre num compartimento celular específico ainda é uma questão aberta. Com base em estudos de fraccionamento, foi reportado que a transcrição reversa do VIH pode ocorrer completamente no núcleo da célula (Bukrinsky et al., 1993a). Contudo, técnicas de fraccionamento não distinguem entre uma localização intranuclear e associação com a membrana nuclear. Outros autores propuseram, pelo contrário, que a associação do complexo de transcrição reversa com o citoesqueleto é um pré-requisito para síntese de ADN virai (Bukrinskaya et al., 1998). Estudos cinéticos da síntese de ADN do VIH-1 e sua associação com a fracção nuclear indicam que o último processo é muito mais rápido que o primeiro. A síntese de ADN do VIH-1 no curso de um único ciclo de transcrição reversa só alcança um planalto 24 a 48 horas após a infecção, ao passo que mais de 95% do ADN do VIH-1 fracciona com os núcleos de células infectadas tão cedo quanto 4 a 6 horas após infecção (Barbosa et al., 1994). Então, favorecemos uma terceira possibilidade que a transcrição reversa lentiviral tem lugar principalmente na 25 vizinhança imediata da membrana nuclear e das NPCs, dentro da cápside virai, embora sejam necessárias experiências adicionais para confirmar esta hipótese. A mitose celular não proporciona uma via alternativa para a entrada de ADN virai defeituoso em triplex no núcleo de células hospedeiras. Os presentes Exemplos mostram que vírus mutantes de triplex central são fortemente impedidos na sua capacidade de replicação não apenas em células alvo sem-divisão mas também com divisão. Reciprocamente, a inserção de uma sequência de ADN triplex num vector baseado em VIH-1 estimula a transdução de genes tanto em células com divisão como sem-divisão. Tal difere do fenótipo publicado de vírus mutantes MA/Vpr, onde um defeito de replicação foi descrito exclusivamente em células sem-divisão(Bukrinsky et al., 1993b; Heinzinger et al., 1994; von Schwedler et al., 1994). Assim, mutantes MA/Vpr comportar-se-iam como oncovírus mitose-dependentes. Uma possível explicação para o comportamento diferente de mutantes de triplex central é que estes vírus são defeituosos num passo tardio do processo de importação nuclear, por conseguinte, as moléculas de ADN defeituosas em triplex deficientes associam-se com a membrana nuclear. Esta associação íntima persiste durante a mitose. 0 ADN virai mutante pode ser incorporado em vesículas da membrana nuclear mitóticas, onde não consegue alcançar os cromossomas celulares, como reportado no caso de proteínas NLS-LacZ (Bonnerot et al., 1987). Mutações em NLS celular, que inibem interacções com carioferínas, contudo, são conhecidas por induzir acumulação citoplãsmica da proteína mutada (Kalderon et al., 1984; Lanford e Butel, 1984). Assim, mutações nas sequências NLS contribuem para as propriedades cariofílicas de PICs do VIH-1 devem induzir retenção citoplásmica do ADN virai, como previamente sugerido (Gulizia et al., 1994). É então possível que PICs de vírus mutantes MA/Vpr alcancem os cromossomas celulares após rompimento da membrana nuclear durante a mitose. Não obstante, não existe ainda evidência experimental directa de uma via de importação 26 nuclear dependente de mitose de ADN de genoma lentiviral. Como o fenótipo publicado de vírus mutantes MA/Vpr deve ser visto com alguma precaução, a mesma precaução deve ser aplicada a hipótese inicial que uma deficiência de importação nuclear em lentivírus deveria conduzir a um defeito de replicação exclusivamente em células sem-divisão. Se os lentivírus podem adoptar uma estratégia de importação nuclear dependente da mitose, ou se a importação nuclear activa de genomas lentivirais ocorre tanto em células com divisão como sem-divisão, permanece uma questão aberta. A presente invenção proporciona desenhos para vectores lentivirais. Uma vez que a infecção de células alvos sem divisão por lentivírus baseia-se no seu uso de uma via de importação nuclear activa, é importante manter os determinantes de importação nuclear lentivirais em elementos vectoriais derivados. Elementos vectoriais retrovíricos clássicos são vectores de substituição nos quais as sequências de codificação virais inteiras entre as LTRs são deletadas e substituídas pelas sequências de interesse. No caso de vectores lentivirais, esta estratégia clássica conduz ã deleção das sequências cis-activas centrais cPPT e CTS. 0 papel importante do triplex na importação nuclear do VIH implica que tais elementos vectoriais de substituição não são óptimos. Assim, a inserção do ADN triplex do VIH no vector de substituição HR GFP (Naldini et al., 1996) aumentou a sua eficiência de transdução de gene por complementação de um defeito de importação nuclear do genoma do vector HR a uma taxa de importação de ADN perto da do VIH-1 do tipo selvagem. É de salientar que ao passo que vectores de VIH a que falta um ADN triplex ainda sejam capazes de transdução de gene (Figura 2C, 2D) , a replicação residual dos vírus mutados em cPPT está ausente ou é extremamente baixa (Figura 6A, 6B). Uma explicação possível é que importação nuclear independente do triplex pode ocorrer no caso de um genoma de vector 27 pequeno (aproximadamente 4 kb para HR-GFP), mas a presença de um ADN triplex será necessária para a importação do genoma do VIH-1 nativo de 9,7 kb. Na realidade, foi divulgada a importação nuclear activa, se relativamente ineficaz, de moléculas de ADN tão grandes quanto 3 a 4 kb (Hagstrom et al., 1997) .

As sequências cis-activas responsáveis por formação do ADN triplex encontram-se no centro de todos os genomas lentivirais. Esta posição central desenvolveu-se por causa das suas implicações estruturais para a conformação de PICs, na medida em que dobras simétricas dos braços esquerdo e direito da molécula de ADN linear ao redor do triplex poderiam ser necessárias para sua a captação eficaz através dos NPCs (Figura 7B) . Se tal for verdade para o vírus, então também poderá ser necessária uma posição central do ADN triplex para a importação nuclear eficaz de genomas de vectores.

EXEMPLOS A invenção será adicionalmente clarificada pelos exemplos seguintes, que se pretende que sirvam puramente como exemplos da invenção.

Exemplo 1: Procedimentos Experimentais. Células

As células MT4 são células humanas CD4+ T transformadas com HTLV-1 que permitem infecção por VIH-1 citopática aguda (Harada et al., 1985). As células H9 são menos permissivas a VIH mas permitem produção crónica após infecção. Células MT4 e H9 foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com soro de bezerro fetal a 10% (FCS). Os linfócitos do sangue periférico (PBLs) foram obtidos de dadores saudáveis, estimulados com ^g/ml de fitohemaglutinina (Wellcome), e mantidos na presença de Interleucina-2 (10% lymphocult; 28

Biotest Diagnostics) . Células 293T foram crescidas em meio DMEM suplementado com FCS a 10%. As células indicadoras P4 são células HeLa CD4+ VIH infectáveis que transportam o gene LacZ sob controlo da LTR do VIH-1 (Charneau et al., 1994). As células P4 são crescidas em meio DMEM suplementado com FCS a 10% e 500pg/ml de G418.

Recolha e fraccionamento de células.

Amostras de sangue do cordão foram recolhidas com o consentimento das mães. Células CD34+ foram purificadas como previamente descrito (Robin, C. et al., 1999) usando o sistema de separação de gota imunomagnética miniMACS (Milteny Biotec). A pureza de células de CD34+ separadas por gotas foi superior a 75%. As fracções CD34+CD3810 foram adicionalmente purificadas por selecção de células com um FACS VantageTM equipado com um laser de árgon ionizado (Becton Dickinson), usando anticorpos monoclonais de murino (MoAbs) dirigidos contra CD34-PE-Cy5 (Immunotech) e CD38-PE (Becton Dickinson). As células CD34+ foram ou congeladas em soro de bezerro fetal (FCS, Célula Estaminais) contendo DMSO a 10% (Sigma) ou usadas imediatamente.

Elementos de ADN

Plasmídeos provirais:

Mutagénese dirigida foi executada como previamente descrito (Kunkel, 1985) em M13mpl8 transportando uma inserção EcoRI de 1,1 kb (4684 a 5779) do clone molecular infeccioso pLAI3. Os Iniciadores mutagénicos eram como se segue: cPPT-AG 5'pCAATTTTAAAAGAAGAGGGGGGATT 3' (SEQ ID NO: 1) cPPT-D: 5'pATTCATCCACAACTTCAAGCGCCGCGGTGGTATTGGGGGGTAC 3' (SEQ ID NO: 2) . Os pcPPT-AG, pcPPT-D, pcPPT-25 e pCTS foram construídos por retro-clonagem do fragmento EcoRI mutado no pLAI3. 29

Vectores plasmidicos:

Os vectores plasmidicos foram derivados de HR'CMVLacZ (Naldini et al., 1996). 0 gene repórter LacZ foi substituído pelo gene EGFP (Clontech) . 0 gene EGFP foi amplificado por PCR usando polimerase Pfu (Stratagene) do plasmídeo pEGFP-Nl, adicionando sítios de restrição BamHI e Xhol nas extremidades 5' e 3' respectivamente. Os iniciadores de PCR eram como se segue:

Bam GFP: 5'CC GGATCC CCA CCG GTC GCC ACC 3' (SEQ ID NO: 3)

Xho GFP: 5'CC CTCGAG CTA GAG TCG CGG CCG 3' (SEQ ID NO: 4). 0 vector HR GFP foi construído por retro-clonagem deste fragmento de PCR nos sítios BamHI e Xhol do pHR'CMVLacZ, substituindo a ORF de LacZ com EGFP. TRIP AU3 CMV GFP e TRIP AU3 PL CMV GFP:

Primeiro, um subclone contendo uma única LTR foi construído e designado pUCLTR. 0 fragmento Kpnl/Xbal de TRIP GFP abrangendo a sua 3'LTR foi clonado em pUC18. Em seguia o sítio EcoRI foi destruído por preenchimento, criando o vector pUC LTR RI-. PCR divergente foi executada no pUC LTR RI- com o objectivo de amplificar todo o plasmídeo com excepção do promotor e do aumentador da sequência U3. Os iniciadores foram: DU3 - : 5'CGGAATTCGGATCCGCGGCCGCATCGATCTTGTCTTCGTTGGGAGTG 3' (SEQ ID NO:5)

DU3+: 5'CGGAATTCAGCCGTCTCGAGAGATGCTGCATATAAGCAGC 3' (SEQ ID NO:6).

Os iniciadores contêm os sítios de restrição a serem inseridos em vez da sequência U3 incluindo o sítio EcoRI 30 presente em cada iniciador. 0 produto de PCR foi digerido com EcoRI e em seguida usado para transformar bactérias competentes. 0 plasmídeo assim construído foi designado por pLTR AU3 RI-. 0 poliligador inserido em vez da sequência U3 no pLTR AU3 RI-é:

Ciai-NotI-BamHI-EcoRI-Mlul-Xhol. 0 plasmídeo TRIPAU3 PL GFP foi construído substituindo o fragmento Kpnl/Nhel de TRIP GFP contendo a 3'LTR com o fragmento Kpnl/Xbal de pLTR AU3 RI- (os produtos de restrição Nhel e Xbal são compatíveis) . Em seguida o poliligador (PL) foi deletado de pLTR Δυ3 RI- por digestão com Clal/Xhol e preenchimento. 0 plasmídeo TRIP AU3 GFP foi construído por troca do fragmento Kpnl/Nhel de TRIP GFP com o fragmento Kpnl/Xbal de pLTR AU3 APL RI-.

Um fragmento de 17 8 pb de pLAI3 (4793 a 4971), abrangendo cPPT e CTS, foi amplificado por PCR. Foram adicionados sítios de restrição NarI em 5' dos iniciadores com o objectivo de inserir este fragmento no sítio Ciai único de HR GFP:

Nar TRIP+: 5'GTC GTC GGCGCC GAATTC ACA AAT GGC AGT ATT CAT CC 3' (SEQ ID NO:7)

Nar TRIP-: 5'GTC GTC GGCGCC CCA AAG TGG ATC TCT GCT GTC C 3' (SEQID NO:8) A inserção desta sequência triplex na orientação correcta deu origem ao vector plasmídico TRIP GFP, e um TRIPinv GFP na orientação inversa. Alternativamente, o mesmo fragmento triplex foi amplificado dos plasmídeos pcPPT-AG, pcPPT-D, 31 pcPPT-225, e pCTS para gerar vectores incluindo as mesmas mutações no cPPT ou no CTS que os vírus correspondentes. TRIP EFla GFP e TRIP ÀU3 EFla GFP: 0 promotor do CMV de TRIP GFP foi substituído pelo promotor EFla. A sequência triplex e o promotor EFla foram em primeiro lugar separadamente amplificados, com iniciadores que se sobrepunham. A sequência triplex foi amplificada com os iniciadores Nar TRIP+ e Mlu TRIP- na matriz pLai e o promotor EFla foi amplificado na matriz pEFpgkneo com os iniciadores Mlu EF1+ e Bam EF1-,

Nar TRIP+: 5'GTC GTC GGCGCC GAATTC ACA AAT GGC AGT ATT CAT CC 3' (SEQ ID NO:9)

MluTRIP-: 5'AGC CTC ACG ACGCGT AT CAG CCA AAG TGG ATC TCT GCT G3' (SEQ ID NO: 10)

MluEFl+: 5' CTG AT ACGCGT CGT GAG GCT CCG GTG 3' (SEQ ID NO: 11)

Bam EF1 -: 5'CG GGATCC TGT GTT CTG GCG GCA AAC3' (SEQ ID NO: 12)

Em seguida foi executado um segundo ciclo de PCR numa mistura dos dois primeiros produtos de PCR, usando os iniciadores externos Nar TRIP+ e BamEFl-. A sequência triplex e promotor EFla ficaram juntos por esta técnica. O plasmídeo TRIP EFla GFP foi construído substituindo o fragmento EcoRI/BamHI de TRIP GFP contendo a sequência triplex e o promotor de CMV pelo produto de PCR TRIP EFla digerido com o EcoRI/BamHI (o iniciador Nar TRIP+ possui um sítio EcoRI na sua extremidade 5').

Para construir o plasmídeo TRIP AU3 EFla GFP, o fragmento EcoRI/BamHI de TRIP EFla GFP contendo a sequência triplex e o 32 promotor EFla foi inserido em TRIP AU3 GFP em vez do fragmento EcoRl/BamHI contendo a sequência triplex e o promotor do CMV.

Produção de vírus e de vector

Para as investigações ilustradas nas Figuras 1-6, foram produzidos vírus por transfecção transitória de células HeLa pela técnica de co-precipitação de fosfato de cálcio. As partículas vectoriais foram produzidas por co-transfecção transitória de 293T pelo vector plasmídico, e plasmídeo de encapsidação (p8.2) e um plasmídeo de expressão envelope VSV (pHCMV-G, (Yee. et al., 1994)), como previamente descrito (Naldini. et al., 1996). Todos os sobrenadantes de vírus e de vector foram tratados com DNasel (1 pg/ml na presença de

MgCl2 ΙμΜ) durante 15 minutos a 37°C.

Produção de partículas de vector lentiviral

Para as investigações ilustradas nas Figuras 7-9, foram produzidos vírus por co-transfecção transitória de 293T pelo vector plasmídico, um plasmídeo de encapsidação (p8.2) e um plasmídeo de expressão envelope VSV (pHCMV-G, (Yee. et al., 1994)), como previamente descrito (Naldini. et al., 1996).

Todos os sobrenadantes de vírus e de vector foram tratados com DNasel (1 pg/ml na presença de MgCl2 ΙμΜ) durante 15 minutos a 37°C.

Titulações de vírus e de vector

Para as investigações ilustradas nas Figuras 1-6, foi executado um ciclo de titulação de vírus em triplicado por infecção de células P4 plaqueadas em placas de 96 poços, com quantidades equivalentes de partículas (lng de antigene virai p24 por poço), na presença de DEAE-dextrano 20 μΜ. 0 inibidor de protease Saquinavir (Roche), foi adicionado (ΙμΜ) ao longo da experiência, para restringir a análise a um único ciclo de 33 infecção. A mitose celular foi inibida por tratamento com aficolina (8μΜ), no dia anterior à infecção. A actividade de β-Galactosidase foi medida 48 horas após a infecção usando um ensaio de gene repórter β-Gal quemiluminescente (Boehringer). Células HeLa foram infectadas em triplicado com quantidades equivalentes de partículas de vector (5ng P24 por poço). A 48 horas pos-transdução, o meio foi substituído por 200μ1 de TNB (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM) e a fluorescência de células vivas foi quantificada usando um fluorímetro de microplacas (Victor2, Wallac) e filtros adaptados a EGFP (excitação: 485 nm, emissão: 520 nm).

Protocolo de transdução

Para as investigações divulgadas nas Figuras 7-9, revestiram-se placas de cultura de tecido de 24-ou 96-poços com fibronectina (Bio-Whittaker Europa) de acordo com as instruções do fabricante. Populações de CD34+ humanas foram plaqueadas, imediatamente após purificação ou descongelamento, a 2 a 3 X105 células/ml em meio isento de soro (IMDM contendo 11,5μΜ a-tioglicerol, BSA a 1,5% (ambos da Sigma), lípidos sonicados e transferrina humana ferro-saturada) ou um-MEM contendo FCS a 10% na presença de 4pg/ml de polibreno (Sigma) e 4 citocinas humanas (hu) recombinantes (r): Factor de Célula Estaminal-rhu (SCF, lOOng/ml, fornecido por Amgen), Ligando-Flt3 (FL, lOOng/ml, Diaclone), IL-3

(60ng/ml, Sandoz), e Factor de Crescimento e Diferenciação Megacarióocito-rhu peguilado- (PEG) (MGDF) (1 ng/ml, Amgen), e vírus lentivirais concentrados a 100 ng de P24 viral/ml durante 24 horas. As células foram então lavadas e cultivadas em condições linfo-mielóides (em placas de cultura de tecido de cultura pré-revestidas com células MS5 em RPMI suplementado com soro humano a 10%, FCS a 5% e as seguintes 7 citocinas: rhu-SCF (50ng/ml), rhu-FL (50ng/ml), PEG-rhu-MGDF (50ng/ml), rhu-IL-3 (lOng/ml), rhu-IL-2 (5 ng/ml), rhu-IL-15 (lOng/ml), e rhu IL-7 (20ng/ml) (sendo as três IL- de 34

Diaclone) durante 48 horas. Em seguia, a expressão de eGFP na fracção celular CD34+ foi avaliado usando um CD34-PE-Cy5 MoAb (Immunotech). A análise foi efectuada num Varrimento FACS usando o software Cellquest (Becton Dickinson).

Ensaios clonogénicos e cultura a longo prazo (LTC)

Os progenitores clonogénicos de células CB frescas humanas foram analisados em FCS a 30% contendo metilcelulose a 0,8%, BSA desionizada a 1%, e 2-mercaptoetanol 10-4M, na presença de rhu-SCF 50ng/ml, rhu-GCSF lOng/ml (Amgen), rhu-IL3 2ng/ml, e rhu-EPO 2U/ml (Amersham). Células da medula óssea (BM) de NOD-SCID enxertados de ratinhos foram plaqueados na presença de rhu-SCF, -IL-3, -EPO, e -GM-CSF (10 ng/ml) como descrito (Pflumio, F. et al., 1996). Os progenitores foram marcados no dia 14-16 de acordo com critérios já descritos (Croisille L. et al. 1994) e a expressão de EGFP observada por microscopia de fluorescência usando um Microscópio Nikon Eclipse TE300. A Cultura a Longo Prazo (LTC) foi executada como previamente descrito (Issaad C. et al., 1993) ou em diluição limite em placas de 96-poços usando a vantagem de FACS equipada com um ACDU (BD) ou em cultura em massa em placas de 24-poços contendo uma camada confluente da linhagem celular estromal MS5 murina. Após 5 a 10 semanas, as células aderentes e não-aderentes foram colhidas e plaqueadas para o ensaio clonogénico. Para ambos os ensaios clonogénico e LTC-IC, foram seleccionadas individualmente colónias e congeladas antes de análise PCR.

Análise PCR

Foi levada a cabo análise de PCR em ADN genómico obtido de colónias derivadas de progenitores clonogénicos ou de clones crescidos em culturas linfo-mielóides. Foram lisadas células e proteínas digeridas em 20μ1 de tampão contendo proteinase K (10pg/ml), KC1 (50mM), Tris-HCl (lOmM, pH 8,3), MgCl2 (2,5mM), gelatina (0,lmg/ml), NP40 (0,45%), e Tween 20 35 (0,45%). Foi executada amplificação de ADN genómico com o iniciador sentido 5'CCCTCGAGCTAGAGTCGCGGCCG 3' (SEQ ID NO:13) e o iniciador antisentido 5'CCGGATCCCCACCGGTCGCCACC 3' (SEQ ID NO:14) à temperatura de cozimento de 62°C. A amplificação resultou num produto de 800 pb.

Análise de ADN virai e vectorial Células P4 ou MT4 foram infectadas a uma elevada multiplicidade de vírus (150 ng de p24 por 106 células) ou transduzidas por vectores (25 ng de p24 por 106 células), na presença de 20μg/ml de DEAE-dextran no caso de células P4. O ADN de células infectadas ou transduzidas foi extraído a vários tempos, restringido, e analisado por Southern blot. Em todos os casos, o ADN plasmídico bacteriano contaminante foi removido da análise por digestão com Dpnl. 0 ADN de células infectadas foi digerido por MscI e Xhol e o ADN de células transduzidas por de EcoNI, Avall e Xhol. Após electroforese e transferência de lC^g de ADN digerido, as membranas foram hibridizadas com sondas de ADN marcado com [32P] aleatoriamente iniciado (Rediprime II, Amersham). A sonda de ADN específica de vírus foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo modelo pLAI3 usando os iniciadores seguintes: 5Msc: 5'AGA AGA AAT GAT GAC AGC ATG 3' (SEQ ID NO: 15) 3Msc: 5'TGC CAG TTC TAG CTC TG 3' (SEQ ID NO: 16). 0 fragmento de ADN de 1680 pb resultante (da posição 1818 a 3498 do pLAI3) sobrepõe o sítio de restrição MscI na posição 2655 de genomas virais. A sonda de vector foi sintetizada por PCR em pTRIP GFP com os iniciadores: 5ECONI: 5'CAG GGA CTT GAA AGC GAA AG 3' (SEQ ID NO:17) 3EcoNI: 5'GCT TGT GTA ATT GTT AAT TTC TCT GTC 3' (SEQ ID NO:18) 36 A sonda de vector é um fragmento de 1027pb (da posição 649 a 1676 do pTRIP GFP) e sobrepõe o sítio EcoNI na posição 1156 de genomas de vector.

Para analisar a quantidade de ADN retrotranscrito do tipo selvagem e vírus PPT-AG e cPPT-D, foi seguido um protocolo semelhante excepto que o ADN extraído às 12 horas pos-infecção foi restringido por MscI e Dpnl. A sonda usada para hibridação foi o fragmento interno MscI de 1,9 kb de pLAI3. Os sinais de hibridação foram quantificados usando um "phosphorimager" (Molecular Dinamics) e o software ImageQuant.

Hibridação in si tu

Células P4 foram infectadas a elevada multiplicidade (2pg de antigene p24 de cada vírus por 106 células) , na presença de 2 0 pg/ml de DEAE dextrano. Às 24 horas pós-infecção, as células foram tripsinizadas, extensivamente lavadas (para remover partículas virais adsorvidas na membrana plasmática), e re-plaqueadas em lâminas de vidro em placas de 24 poços. As células foram crescidas durante 48 horas adicionais e fixas em PFA/PBS a 4% durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas em PBS e permeabilizadas por Triton 0,5%/Saponina 0,5% em PBS, durante 5 minutos à temperatura ambiente. As amostras desidratadas foram tratadas com RNase A (200ug/ml em 2X SSC), uma hora a 37°C e pela proteinase K (6 pg/ml em PBS), aproximadamente 5 minutos. As amostras foram desnaturadas por incubação em formamida desionizada a 70%/2X SSC durante 2 minutos a 70°C seguido de formamida desionizada a 30%/2X SSC durante 2 minutos a 70°C. As hibridações foram executadas durante a noite a 37°C usando um plasmídeo pLAI3 marcado com biotina traduzido por corte (formamida desionizada a 50%, sulfato de dextrano a 10%, lOpg/ml de ADN de esperma de salmão, Tween 20 a 0,1% em 2X SSC). As amostras foram extensivamente lavadas (lavagem em série em 2X 37 SSC/formamida a 50% à temperatura ambiente e em seguida a 50°C) . A detecção de sondas hibridizadas foi executada usando o estojo Tyramid-Streptavidin TSA-Direct (NEN) de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 2: A iniciação central da transcrição reversa é um passo essencial do ciclo replicativo de VIH-1

Num trabalho anterior, mostrámos que as mutações conservativas nas sequências cPPT e CTS prejudicaram seriamente a replicação de vírus (Charneau et al., 1992; Hungnes et al., 1992). Um vírus mutante de iniciação central (cPPT-225) e um vírus mutante de terminação (CTS) apresentaram respectivamente uma diminuição de quatro vezes e dez vezes em infecciosidade numa experiências de uma única titulação. Com vista a inactivar a função da cPPT, foram introduzidas mutações semi-conservativas na região de codificação da integrase de sobreposição. No vírus cPPT-D mutante, a alteração de lisina para arginina na posição 188 permitiu a introdução de um total de 10 mutações na sequência de 19 nucleótidos do iniciador PPT (Figura IA) (Huber e Richardson, 1990). 0 efeito desta alteração de aminoácido na replicação do vírus foi conferido por construção do vírus mutante cPPT-AG de controlo, no qual uma única mutação de purina para purina, com respeito à natureza polipurina de cPPT, induziu a mesma alteração de aminoácido. A presença de um ADN triplex no ADN retrotranscrito de vírus do tipo selvagem e de cPPT-AG, e a sua ausência do ADN do vírus cPPT-D, foi confirmado por clivagem por SI nuclease de ADN "Hirt" de células infectadas como previamente descrito (Harris et al., 1981; Charneau e Clavel, 1991). A infecciosidade virai foi avaliada em primeiro lugar em experiências de replicação cinética clássica em cultura de células. Linfócitos de sangue periférico estimulados por PHA (PBLs) e células MT4 foram infectadas com números iguais de partículas virais, normalizadas de acordo com o teor dos 38 sobrenadantes virais em proteína da cápside (p24), e a actividade da transcriptase reversa foi seguida ao longo do tempo nos sobrenadantes da cultura (Figura 1B) . As curvas de crescimento dos vírus do tipo selvagem VIH-1 LAI e cPPT-AG de controlo foram semelhantes em ambos os sistemas celulares. 0 facto que a mutação K188R ocorre naturalmente em alguns isolados de VIH-1, já sugeriu que tem pouco ou nenhum efeito nas funções da integrase e PPT. Ao invés, quando PBLs foram infectados com os vírus mutantes cPPT-D, não foi detectada replicação durante os 15 dias de cultura. 0 mesmo foi verdade para células MT4, apesar da sua elevada susceptibilidade para infecção por VIH. Os vírus mutantes cPPT-D também não foram infecciosos em linhagens celulares imortalizadas tais como H9 ou CEM (dados não mostrados). A infecciosidade por vírus foi então quantitativamente analisada por titulações com base num único ciclo de replicação (Figura 1C) . AS células indicadoras P4 (HeLa CD4 LTR-LacZ) (Charneau et al., 1994) foram infectadas com números equivalentes de partículas virais dos diferentes vírus. Estas titulações de um ciclo confirmaram a perda quase completa de infecciosidade de vírus mutante cPPT-D. Em células P4, a infecciosidade do controlo cPPT-AG foi idêntica à do vírus do tipo selvagem, ao passo que a infecciosidade do mutante cPPT-D foi fortemente reduzida, para níveis perto da linha base. Os mesmos resultados foram obtidos em células P4 tratadas com afidicolina, sem divisão (Figura 1C, painel direito).

Estes resultados sugerem fortemente que a iniciação central da transcrição reversa é necessária para replicação de VIH em células sem divisão bem como em proliferativas.

Exemplo 3: A produção de vírus não ê afectada por mutações em CPPT 39

Verificámos que as diferentes mutações introduzidas nos provírus plasmídicos cPPT-AG e cPPT-D não afectaram os últimos passos do ciclo replicativo. A produção virai foi quantificada, de acordo com o teor em P24 dos sobrenadantes, após transfecções transitórias de células HeLa por plasmídeos provirais. Constatou-se que a produção dos vírus mutantes cPPT não era significativamente diferente da dos vírus do tipo selvagem (Figura 2A) . Consequentemente a mutação K188R não afecta a última fase da replicação de VIH-1. Assim, o passo defeituoso envolvido no fenótipo dos vírus mutantes cPPT-D tem de preceder a expressão de ADN virai e tem de pertencer à fase precoce do ciclo replicativo de VIH.

Exemplo 4: As mutações no cPPT não afectam a taxa de transcrição reversa do genoma do VIH-1 0 efeito de mutações em cPPT em síntese de ADN virai foi avaliado por quantificação do ADN sintetizado num único ciclo de retrotranscrição (Figura 2B) . Um fragmento de restrição MscI interno do ADN virai de células infectadas foi detectado por Southern blotting e quantificado, usando o fragmento de ADN de MscI correspondente como sonda. Uma vez que o fragmento de MscI interno é comum ao ADN proviral integrado e às moléculas lineares e circulares não integradas, a sua quantificação reflecte a quantidade total de ADN virai, independentemente do seu estado integrado ou não integrado. Para limitar a análise ao primeiro ciclo de transcrição reversa, colheu-se ADN de células P4 infectadas 12 horas após infecção, antes do início de um segundo ciclo de infecção. A quantidade total de ADN retrotranscrito num único ciclo de transcrição reversa foi a mesma após infecção com o cPPT-D mutante, o cPPT-AG de controlo ou o vírus do tipo selvagem. Estas experiências mostraram que, ao passo que mutações em cPPT abolem a replicação de vírus, não afectam a taxa de síntese de ADN. 0 defeito replicativo de vírus cPPT mutantes implica um passo subsequente para a síntese de ADN virai. 40

Exemplo 5: A falta de um ADN triplex central não afecta a integração in vitro de PICs do VIH-1 A capacidade de integração in vitro de PICs do VIH-1 do tipo selvagem e de mutantes de iniciação central foi comparada (Figura 2C) usando um ensaio quantitativo de integração in vitro como descrito por Farnet (Farnet e Haseltine, 1990) , com modificações menores. Uma vez que os complexos de replicação de VIH-1 residem apenas de modo transiente no citoplasma de células acabadas de infectar (Barbosa et al., 1994), a preparação de quantidades suficientes de PICs do VIH requer infecção massiva e fraccionamento celular em 4 a 6 horas. Tal foi alcançado por co-cultura de células H9 cronicamente infectadas por vírus do tipo selvagem ou cPPT-225 e células alvo HUT 78 não infectadas. O vírus mutante CPPT0225 (Figura IA) foi escolhido para estas experiências em vez do cPPT-D não infeccioso, que não é capaz de estabelecer uma infecção crónica. A infecciosidade residual de vírus mutante cPPT-225 é baixa mas suficiente para permitir que se propague lentamente em culturas celulares (Charneau et al., 1992) .

Isolaram-se PICs do VIH do citoplasma de células infectadas e incubou-se na presença de ADN alvo do plasmídeo Bluescript linearizado. A integração foi revelada pela presença de um fragmento de 12,7 kb, reactivo para a sonda VIH-1, correspondendo ao tamanho esperado do genoma de VIH linear de 9,7 kb integrado no ADN alvo de 3 kb. A quantidade de ADN linear integrado no ADN plasmídico não diferiu entre os vírus do tipo selvagem e cPPT 225 mutante (Figura 2C) . Assim PICs do VIH-1 do cPPT mutante retiveram a sua completa capacidade para integrar in vitro. O passo de replicação defeituoso do ADN triplex central de vírus mutantes deve ocorrer após a transcrição reversa mas antes da integração do seu genoma de VIH linear na cromatina da célula hospedeira. 41

Exemplo 6; Importação nuclear enfraquecido de ADN triplex central de vírus mutantes

As experiências precedentes sugerem que o defeito replicativo de ADN triplex central de vírus mutantes estava relacionado com o acesso de PICs do VIH a cromatina do alvo celular. Consequentemente testámos a hipótese de um defeito de importação nuclear de ADN de vírus mutantes de cPPT. Os estudos da importação nuclear de PICs do VIH-1 são dificultados por falta de um ensaio quantitativo e reprodutível para importação nuclear ao nível do ADN virai. Uma vez retrotranscrito no citoplasma, o ADN linear retroviral é importado no núcleo onde ou integra ou circulariza. 0 ADN circular retroviral não integrado, contendo uma ou duas LTRs, encontra-se exclusivamente no núcleo, e assim representa marcadores convenientes de importação nuclear de ADN virai. Para avaliar a importação nuclear de ADN de VIH, estudos prévios usaram amplificação por PCR de dois ADN circulares de LTR não integrado. Contudo, como aqui divulgado e por Barbosa et al., (1994), porque dois LTR circulares representam uma fracção minuta do ADN de VIH em células infectadas, a sua detecção é muito sensível a alterações menores de fisiologia celular ou infecciosidade de vírus. Assim, projectámos um novo ensaio que permite um seguimento quantitativo por Southern blot da síntese, circularização, e integração de ADN de VIH.

Resumidamente, o ADN de células infectadas é preparado a vários tempos e digerido com MscI, uma enzima de restrição que corta o genoma de VIH-1 duas vezes. Usando uma sonda de ADN gerada por PCR que sobrepõe exactamente o sítio 5'MscI, são reveladas várias bandas específicas (Figura 3A). 0 fragmento MscI interno de 1,9 kb é comum a todas as espécies de ADN virai independentemente do seu estado integrado ou não integrado e a quantificação desta banda indica a quantidade total de ADN virai em células infectadas. Uma banda de 2,6 kb 42 corresponde ao fragmento 5'MscI distai de ADN-VIH linear não integrado. Para minimizar a propensão de transferência devido ao grande tamanho de fragmentos específicos de ADN circular, o ADN é adicionalmente cortado com Xhol. Aparecem então um e dois LTR de ADN circulares de nas bandas 2,8 e 3,4 kb respectivamente. Uma vez que a sonda de ADN sobrepõe exactamente o sítio 5'MscI, a intensidade de cada banda é directamente proporcional â quantidade das espécies de ADN virai correspondentes. A quantidade de ADN proviral integrado é calculada subtraindo da quantidade total de ADN virai os sinais de ADNs virai linear e circular não integrado. Uma quantificação paralela da mesma população de células infectadas foi executada após um fraccionamento "Hirt" para separar ADN virai de baixa massa molecular não integrado de ADN proviral integrado de elevada massa molecular. Tal deu origem a resultados idênticos, validando assim o cálculo de subtracção de um passo.

Como indicado pela cinética de acumulação de ADN virai total (fragmento interno de 1,9 kb), a síntese de ADN virai prosseguiu durante 24 a 48 horas após infecção, reflectindo um processo de infecção assíncrono. As quantidades de ADN virai total de vírus mutantes cPPT-AG e cPPT-D foram semelhantes às de VIH-1 do tipo selvagem. Como previamente, as mutações em cPPT não influenciaram a taxa de síntese de ADN. Estavam presentes quantidades detectáveis de ADN linear não integrado de comprimento total em células tão cedo quanto 6 horas após infecção (Figura 3B). Provirus integrados e ADN circular foram pela primeira vez detectados 12 horas após infecção. A integração e a circularização seguiram até à conclusão durante 36 horas adicionais.

No final de um ciclo de infecção, no caso do vírus do tipo selvagem, cerca de 55% do ADN virai tinha integrado no ADN da célula hospedeira, cerca de 35% tinha circularizado num círculo de LTR, e uma pequena fracção inferior a 10% permaneceu na forma de ADN linear não integrado estável 43 (Figura 3C) . Notavelmente, duas LTR de ADN circular, embora detectáveis 48 horas após infecção, estavam apenas presentes em quantidades traço. 0 ADN do vírus de controlo cPPT-AG foi processado de uma maneira bastante similar ao ADN do vírus do tipo selvagem.

No caso de vírus mutantes cPPT-D, foi evidente uma alteração acentuada no padrão de ADN virai intracelular, com uma acumulação clara e persistente de moléculas lineares não integradas. A 48 horas após infecção, apenas quantidades muito pequenas de uma LTR de ADN circular e ADN proviral integrado tinha sido gerada e mais que 90% do ADN mutante de cPPT-D permaneceu bloqueado na forma linear não integrada (Figura 3C). É esperado que um defeito de importação nuclear diminua a proporção de espécies de ADN virai nuclear (provírus integrados e uma e duas LTR circulares) e para aumentar concomitantemente a proporção de moléculas de ADN linear não translocadas. Assim, o perfil de ADN intracelular de vírus mutantes cPPT-D sugere fortemente um defeito de importação nuclear de ADN virai.

Exemplo 7: ADN linear de ADN triplex central de vírus mutantes acumula na vizinhança da membrana nuclear

Para caracterizar adicionalmente o defeito de importação nuclear de ADN triplex central de vírus mutantes, endereçamos as questões de se as moléculas de ADN linear mutadas acumulam ou não num compartimento subcelular particular. 0 processo de importação nuclear pode ser dividido em duas fases principais, condução do componente nuclear à membrana nuclear e a sua translocação pelo complexo de poros nucleares (NPC). Conduzimos em primeiro lugar um fraccionamento nucleico/citoplasmático clássico de células infectadas, seguido por detecção por Southern blot de ADN virai. A totalidade de ADN virai de todos os vírus foi associada com 44 os núcleos de células P4 infectadas, 24 horas após infecção (Figura 4A) , sugerindo que a condução de ADN de VIH para a membrana nuclear não foi afectada pela falta de um ADN triplex central.

Para confirmar que as moléculas de ADN triplex central deficientes acumulam na membrana nuclear, usámos hibridação in si tu fluorescente (FISH) para visualizar directamente a localização intracelular de genomas de VIH. As células P4 foram infectadas a uma elevada multiplicidade num ciclo de condições, hibridizadas com uma sonda de genoma de VIH-1 de comprimento total, e observadas por microscopia de "deconvolution". Foram encontradas manchas específicas predominantemente no núcleo no caso dos vírus do tipo selvagem e cPPT-AG de controlo (Figura 4B) . Uma vez que FISH não pode distinguir entre as diferentes espécies de ADN de VIH, estas moléculas de ADN virai intranucleares podiam ser provirus integrados ou ADN circular não integrado. Alguns genomas raros foram associados com a membrana nuclear e provavelmente representavam o ADN linear residual detectado por Southern blotting ao mesmo tempo após infecção. Outras manchas associadas com a membrana plasmática derivaram mais provavelmente de partículas defeituosas adsorvidas na membrana contendo genomas parcialmente retrotranscritos (Lori et ai., 1992). Ao invés, os genomas de VIH encontravam-se predominantemente localizados na membrana nuclear e quase completamente ausentes do núcleo no caso de vírus mutantes de cPPT-D. Como o perfil de ADN do Southern blot indicou que praticamente todo o ADN de cPPT-D estava bloqueado na forma linear, podemos assumir que estes genomas de VIH associados com a membrana nuclear eram moléculas de ADN linear não integrado. Esta visualização directa de moléculas de ADN virai em células infectadas confirmou a associação do ADN virai de mutantes triplex centrais com a membrana nuclear.

As nossas experiências FISH sugerem que vírus mutantes cPPT são defeituosos na translocação do seu genoma pelos NPCs. Não 45 obstante, a demonstração clara de um defeito de translocação, por localização de ADN virai mutante no lado citoplásmico de NPCs, não é acessível através de experiências FISH.

Concluímos destes resultados, como um todo, que o ADN triplex central de VIH-1, criado por passos de iniciação e terminação centrais durante transcrição reversa, é importante para PICs do VIH-1 entrarem no núcleo da célula hospedeira. Na ausência de ADN triplex, a importação nuclear de ADN virai é gravemente prejudicada numa fase imediatamente antes ou durante a translocação de ADN de VIH-1 pelo poro nuclear.

Exemplo 8: Impacto do ADN triplex central na transdução de gene por um sistema de vector baseado em VIH-1

Tendo identificado o ADN triplex central como determinante chave para a importação nuclear de VIH-1, testámos o efeito de inserir as sequências cis-activas centrais de VIH-1 no vector HR VIH-1 previamente descrito (Naldini et al. , 1996) (Figura 5A). Para monitorar a transdução de gene, foi adicionalmente inserido um gene que codifica a proteína fluorescente verde (GFP). 0 vector contendo uma sequência de ADN triplex foi designada TRIP GFP. Os controlos incluíram elementos similares com cPPT ou CTS mutados e uma região central do tipo selvagem inserida ao contrário, orientação não-funcional (TRIPinv GFP). A presença de um ADN triplex em vector de ADN TRIP GFP retrotranscrito, e a sua ausência de HR GFP, TRIPinv GFP, e de vectores contendo uma versão mutada da sequência do triplex central, foi confirmada por clivagem com nuclease SI de ADN Hirt isolado de células transduzidas. 0 número de partículas de vector produzidas por transfecção transiente foi normalizado antes da transdução de acordo com níveis de proteína da cápside (p24), actividade de transcriptase reversa, e a quantidade de ARN vector genómico em sobrenadantes de células transfectadas. Foi obtida produção similar dos vários vectores, com uma correlação linear entre os três critérios de normalização (dados não 46 mostrados). Assim a inserção da região central do genoma de VIH-1 no vector HR não influenciou a taxa de encapsidação de ARN genómico. As células HeLa com divisão ou não (tratadas com afidicolina), foram transduzidas com números equivalentes de partículas de vector HR-GFP ou TRIP-GFP e a expressão de GFP foi monitorizada 48 horas depois por quantificação por fluorescência. A pseudotransdução de actividade de GFP devido à entrega directa de proteínas GFP a células alvo pelas partículas de vector fundindo foi calculada da transdução de células tratadas com um inibidor de RT VIH-1 (Nevirapin 1 μΜ, Boehringer Ingelheim) e esta linha base subtraída do sinal de fluorescência. A fluorescência não-específica devido a transfecção secundária causada por co-precipitação de ADN por cálcio/fosfato nos sobrenadantes do vector foi eliminada por tratamento da reserva de vector com DNasel antes da transdução.

Sob estas condições, a presença da sequência triplex no vector VIH aumentou a transdução de GFP em células HeLa em mais de dez vezes (Figura 5B) . Foi observado um aumento semelhante de transdução de gene noutras linhagens celulares tais como MT4 ou 293T (dados não mostrados) . Este efeito foi perdido se a sequência triplex fosse inserida na orientação inversa (Figura 5B) ou mutada no cPPT (não mostrado).

Exemplo 9: A presença de um ADN triplex em vectores VIH-1 aumenta a taxa de importação nuclear de genoma de vector para níveis do tipo selvagem

Era então de interesse determinar se o aumento em fluorescência de GFP induzida por inserção de uma sequência triplex no vector de VIH era devido ao seu efeito na importação nuclear de vector de ADN. Para dirigir esta questão, adaptámos o nosso ensaio de Southern blot quantitativo para ADN virai intracelular no sistema de 47 vector. 0 ADN de células transduzidas por vector foi digerido com EcoNI e Avall para produzir um fragmento interno de 0,8 kb, e com Xhol. Usando uma sonda de ADN gerada por PCR sobrepondo-se exactamente ao sítio EcoNI, foram esperados sinais específicos para o genoma do vector linear não integrado, e para uma e duas LTR de ADN circular a 1,2 kb, 1,4 kb, e 2 kb respectivamente. O processamento de vector de ADN foi analisado a vários tempos após transdução de células HeLa. A quantidade total de vector de ADN sintetizado em células transduzidas foi comparável para vectores contendo ou a que faltava o ADN triplex (Figura 5C) . Uma vez mais, a inserção das sequências cPPT e CTS, em qualquer das orientações, no vector HR não influenciaram a taxa de transcrição reversa do seu genoma. Após quantificação por "phosphorimager", constatámos o destino intracelular de ADN dos vectores HR-GFP e TRIPinv-GFP (Figura 5D) se assemelhar bastante ao ADN do triplex central de vírus defeituosos e ao vector de ADN TRIP-GFP em se assemelhar ao ADN do vírus LAI VIH-1 do tipo selvagem (Figura 3C).

Um defeito de importação nuclear de ADN foi evidente no caso dos vectores HR-GFP e TRIPinv-GFP. 0 ADN intracelular destes vectores foi caracterizado por uma forte acumulação de moléculas lineares não integradas, juntamente com pequenas quantidades de provi rus integrado e uma e duas LTR circulares. Este perfil de ADN lembrava fortemente o do vírus mutante cPPT-D. Na conclusão do processamento de vector de ADN em células transduzidas, 70 a 80% do ADN de elementos HR-GFP e TRIPinv-GFP permaneceram na forma de moléculas lineares não integradas, enquanto apenas 10 a 15% estavam presentes como não integrados em LTR circular e 5 a 10% como provírus integrados. Esta baixa mas detectável quantidade de vector de ADN integrado responderia pela transdução de gene obtida usando vectores HR-GFP ou de TRIPinv-GFP. 48

Este ensaio quantitativo também mostrou que a inserção da sequência ADN triplex de VIH no vector HR na orientação correcta complementou a sua deficiência de importação nuclear a níveis do tipo selvagem. 0 estado final do ADN de TRIP-GFP em células transduzidas era semelhante ao observado com vírus VIH-1 do tipo selvagem: 50% ou mais do vector de ADN integrou a cromatina da célula alvo, uma fracção importante circularizou e algumas moléculas permaneceram como ADN linear não integrado (comparar Figura 5D e 3C). Ao invés, a inserção da sequência triplex no vector HR a montante do promotor do CMV interno não influenciou a expressão de GFP ao nível transcricional. Tal foi conferido por transfecção de células HeLa com plasmídeos pHR-GFP, pTRIP-GFP, e pTRIPinv-GFP e quantificação por fluorescência (dados não mostrados) .

Pode ser deduzido destes resultados que o aumento na transdução de GFP obtido com o vector TRIP-GFP é completamente imputável a forte estimulação da sua importação nuclear pela presença do triplex. Esta constatação realça novamente o papel importante do ADN triplex de VIH na importação nuclear de ADN virai e vector.

Exemplo 10: Os vectores VIH-1 contendo a sequência de ADN triplex permitem uma transferência de gene eficiente em células estaminais hematopoiéticas

As figuras 7A e 7B ilustram os resultados de duas experiências de transdução com sucesso usando células CD34+ de cordão humano. Mostram que após um protocolo de transdução curto de 24 ou 60 horas, respectivamente 71,5% e mais de 90% das células CD34+ expressam fortemente a proteína repórter GFP. Esta expressão reflecte transdução estável das células uma vez que a integração virai foi confirmada, pelo menos nas mesmas proporções, por ensaios de PCR em ADN extraído de colónias de célula derivadas de progenitores recolhidas 14 dias após terem semeado células em ensaio de progenitor clonogénico. Foram obtidos resultados idênticos usando 49 células CD34+ purificadas de fresco ou as mesmas células CD34+ que foram congeladas após purificação e descongeladas várias semanas depois para a experiência de transdução. Também obtivemos eficiências de transdução comparáveis usando outra fonte de células estaminais hematopoiéticas, células estaminais mobilizadas de sangue periférico (PBMC), recolhidas por "cytapheresis" após estimulação por citocina. As CD34+ PBMC também foram transduzidas imediatamente após purificação ou após um passo de congelamento/descongelamento com resultados idênticos. Usando cultura a longo prazo (LTC) e ensaios de repopulação de NOD-SCID mostrámos que transduzimos células tendo potencialidades linfo-mielóide múltiplas e a capacidade a repopular medula óssea de ratinho NOD-SCID 4 meses após enxerto. Estes ensaios funcionais representam as últimas experiências disponíveis, no momento, para avaliar a função de células hematopoiéticas humanas.

Exemplo 11: A presença da sequência de ADN triplex em elementos de vector lentiviral estimula fortemente a transferência de gene para células estaminais hematopoiéticas A experiência de dose/resposta ilustrada na Figura 8 (representativa de 3 experiências) foi projectada para comparar a eficiência de transdução em células estaminais hematopoiéticas humanas de vectores VIH-1 incluindo ou a que falta a sequência de ADN triplex. Traçámos em primeiro lugar (A) a percentagem de células CD34+ eGFP+ obtidas em função da concentração de vector usada para transdução. Observámos que independentemente da dose de vector, o vector TRIP+ era mais eficiente que o TRIP, com respectivamente uma média de 40±19% e 15,4±12.5% das células CD34+ sendo eGFP+ para 500ng P24 viral/ml de cada vector (n=3 exp). Foi obtido um aumento de 4-6 vezes na percentagem final de células GFP+ após transdução pelo vector TRIP-GFP quando comparado a resultados obtidos após transdução com vector HR-GFP. A diferença em eficiência entre os dois vectores também é realçada quando a média de intensidade de fluorescência é traçada em função da 50 dose de vírus. É alcançado em patamar para o vector TRIP-(HR-GFP) a doses de lOOng P24/ml ao passo que a intensidade de fluorescência em células transduzidos aumenta com a dose de vector TRIP+. Tal poderia reflectir a limitação em importação nuclear das forma pre-integrativas do vector-TRIP e o número crescente de cópias integradas por célula após transdução com doses crescentes do vector TRIP-GFP. 0 terceiro gráfico integra ambos os aspectos e mostra o efeito resultante da sequência de ADN triplex em actividade de fluorescência de GFP em HSC humano. Como mostrado, a presença da sequência de ADN triplex no vector VIH induz uma maior produção de GFP em HSC por um factor superior a dez vezes.

Exemplo 12: Uma fracção de copias integradas de genomas de vector VIH permanece silenciosa em células transduzidas hematopoiéticas humanas É possível que possa ocorrer a inactivação do transgene integrado. A eficiência de transferência foi sempre melhor quando avaliada pela percentagem de colónias de células derivadas de progenitor transduzidas determinada por ensaio PCR para o vector lentiviral integrado em vez de quando avaliada pela percentagem de células CD34+/eGFP+ determinada por análises FACS 48 horas após o término do protocolo de transdução. Isto reflecte a ocorrência de provirus transcriccionalmete inactivos ou devido ao seu sítio de integração ou à inactivação progressiva e aleatória do provirus enquanto as células proliferam e diferenciam. Observámos em colónias derivadas de um único progenitor clonogénico mielóide que algum do subclones pudesse ser GFP luminosos enquanto outros foram negativos, reflectindo a inactivação transcripcional aleatória do transgene integrado nesta descendência clonal fenotipicamente homogénea.

Exemplo 13: Os vectores VIH contendo uma versão deletada da região U3 do LTR e um EFla interno são sistemas mais potentes para a transdução de células estaminais hematopoiéticas 51

Na Figura 9, comparamos a capacidade de vários vectores derivados de VIH-1, incluindo a sequência de ADN triplex, em transduzir células CD34+ de sangue de cordão humano. 0 efeito de deleção da maioria da região U3 de 3'LTR na transdução de GFP e expressão em células CD34+ foi analisado. A comparação de vectores contendo uma LTR do VIH-1 intacta ou uma versão deletada de U3 foi conduzida no contexto de um promotor interno do CMV ou um promotor interno de EFIa (Kim et al., 1990) para conduzir a expressão do gene repórter GFP. Todas as experiências de transdução foram conduzidas usando a mesma concentração de partículas de vector (500 ng P24/ml) após normalização de reservas de vector usando um ensaio ELISA comercialmente disponível para o antigene (Dupont) de VIH-1 de P24 (proteína da cápside). Análise de citometria de fluxo (FACS) foi executada ou 4 8 horas (Figura 9A) ou 120 horas (Figura 9B) após o período de transdução de 24 horas.

Interessantemente, a deleção da região U3 do LTR em vectores VIH-1 induziram um ligeiro aumento na percentagem de células positivas GFP em todos os casos. Este aumento foi modesto quando analisado ao fim de 48 horas. Nesta altura, um mecanismo de pseudotransdução pode ser responsável por uma fracção das células positivas GFP. A pseudotransdução é a entrega directa de proteínas GFP a células alvo pela partícula de vector retroviral fundindo, sem a necessidade para uma integração actual do genoma de vector retroviral. O aumento na percentagem de GFP positivo após transdução pelas versões deletadas de U3 dos vectores VIH-1 tornou-se mais evidentes 120 horas após transdução (Figura 9B) . Nesta altura, é observado um aumento de até duas vezes na percentagem de células positivas GFP após transdução pelo vector TRIP AU3 -EFIa-GFP quando comparado aos resultados obtidos com o vector equivalente mas contendo uma LTR do VIH-1 intacto. 52

Mais importante, a deleção da região U3 da LTR do VIH-1 nos vectores VIH-1 triplex induziu uma melhor expressão da proteína repórter GFP. A média de intensidade de fluorescência em HSC humano transduzido quando analisado por FACS foi sempre superior num factor de três a cinco vezes no caso das versões deletadas de U3 do que com vectores contendo uma LTR do VIH-1 intacto. Este benefício de expressão de GFP foi observado quer fossem usados os promotores do CMV ou do EFla como promotor interno no elemento vector VIH-1. 0 mecanismo molecular que explica esta expressão aumentada de proteínas GFP em células transduzidas não é conhecido. Alguma sequência na LTR do VIH-1 pode influenciar negativamente a expressão conduzida pelo promotor interno. Alternativamente, uma transcrição basal iniciada na LTR do VIH-1 pode interferir com a iniciação de transcrição no promotor interno.

Este estudo também mostra que o promotor de EFla é um melhor promotor em HSC humano que o promotor do CMV. Na Figura 9B, a média de intensidade de fluorescência GFP é três a cinco vezes melhor no caso do promotor de EFla que no caso do promotor do CMV. 53

REFERÊNCIAS

Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas na sua totalidade para consulta.

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

<110> INSTITUTO PASTEUR INSERM <120> ADN TRIPLEX LENTIVIRAL, E VECTORES E CÉLULAS RECOMBINANTES CONTENDO ADN TRIPLEX LENTIVIRAL <130> B4681_01.app <140> AINDA NÃO CONCEDIDO <141> 2000-10-10 <150> 60/158.387 <151> 1999-10-12 <160> 24 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR DE MUTAGÉNESE BASEADO NO PLASMÍDEO pLAI3 <400> 1 caattttaaa agaagagggg ggatt 25

<210> 2 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial 63 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR DE MUTAGÉNESE BASEADO NO PLASMÍDEO pLAI3 <400> 2 attcatccac aacttcaagc gccgcggtgg tattgggggg tac 43

<210> 3 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA A PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE AUMENTADA <400> 3 ccggatcccc accggtcgcc acc 23

<210> 4 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR NUCLEÓTIDO QUE CODIFICA A PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE AUMENTADA <400> 4 ccctcgagct agagtsgcgg ccg 23

<210> 5 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial 64 <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR pUCLTRRI <400> 5 cggaattcgg atccgcggcc gcatcgatct tgtcttcgtt gggagtg 47

<210> 6 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR pUCLTRRI <400> 6 cggaattcag ccgtctcgag agatgctgca tataagcagc 40

<210> 7 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR cPPT E CTS DE pLAI3 <400> 7 gtggtcggcg ccgaattcac aaatggcagt attcatcc 38

<210> 8 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 65 <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR cPPT E CTS DE pLAI3 <400> 8 gtcgtcggcg ccccaaagtg gatctctgct gtcc 34

<210> 9 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR SEQUÊNCIA TRIPLEX DO P>ROMOTOR DE EF1 alfa NA MATRIZ pLai <400> 9 gtcgtcggcg ccgaattcac aaatggcagt attcatcc 38

<210> 10 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR SEQUÊNCIA TRIPLEX DO PROMOTOR DE EF1 alfa NA MATRIZ pLai <400> 10 agcctcacga cgcgtatcag ccaaagtgga tctctgctg 39

<210> 11 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial 66 <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR SEQUÊNCIA TRIPLEX DO PROMOTOR DE EF1 alfa NA MATRIZ pEFpgkneo <400> 11 ctgatacgcg tcgtgaggct ccggtg 26

<210> 12 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR SEQUÊNCIA TRIPLEX DO PROMOTOR DE EF1 alfa NA MATRIZ pEFpgkneo <400> 12 cgggatcctg tgttctggcg gcaaac 26 <210> 13 <211> 23

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 2 23 ccctcgagct agagtcgcgg ccg <210> 14 <211> 23

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 ccggatcccc accggtcgcc acc 67

<210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAÇÃO DE ADN VIRAL DE pLAI3R <400> 15 agaagaaatg atgacagcat g 21

<210> 16 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAÇÃO DE ADN VIRAL DE pLAI3R <400> 16 tgccagttct agctctg 17

<210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA SÍNTESE DE SONDA PARA VECTOR pTRIPGFP <400> 17 cagggacttg aaagcgaaag 20 <210> 18 68

<211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR PARA SÍNTESE DE SONDA PARA VECTOR pTRIPGFP <400> 18 gcttgtgtaa ttgttaattt ctctgtc 27 <210> 19 <211> 7

<212> PRT <213> Vírus do tipo 1 da imunodeficiência humana <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(7) <223> Sequência cPPT do VIH-1 parcial <400> 19

Asn Fen Lis Arg Lis Gli Gli 1 5

<210> 20 <211> 19 <212> ADN <213> Vírus do tipo 1 da imunodeficiência humana <400> 20 ttttaaaaga aaagggggg

<210> 21 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial 69 19 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: MUTAÇÃO NA SEQUÊNCIA cPPT DO VIH-1 <400> 21 ttttaaacgc aaaggtggt

<210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de Sequência Artificial: PÉPTIDO SEQUÊNCIA cPPT DO VIH-1 <400> 22

Asn Fen Lis Arg Arg Gli Gli 1 5

<210> 23 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: MUTAÇÃO NA SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE cPPT DO VIH <400> 23 ttttaaaaga agagggggg

<210> 24 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial

INTRODUZIDA 19

MUTANTE NA INTRODUZIDA 1 19 70 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: MUTAÇÕES INTRODUZIDAS DE CODIFICAÇÃO DE cPPT DO VIH-1 <400> 24 cttcaagcgc cgcggtggt 19 17-04-2007 71

Claims (32)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Vector de expressão HIV-1 compreendendo: a) um ácido nucleico isolado ou purificado compreendendo pelo menos uma cópia das regiões de actuação-cis cPPT e CTS de um retrovírus, em que as ditas regiões cPPT e CTS induzem uma estrutura de ADN de três-cadeias e b) uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga, em que a LTR do VIH-1 é deletada para o promotor e o aumentador de U3.
2. 2. Vector da reivindicação 1 em que o dito ácido nucleico compreendendo pelo menos uma cópia das regiões cPPT e CTS é de um lentivírus.
3. 3. Vector da reivindicação 2 em que o dito ácido nucleico compreendendo pelo menos uma cópia das regiões cPPT e CTS é do vírus da imunodeficiência humana (VIH).
4. 4. Vector da reivindicação 3, em que o dito ácido nucleico compreendendo pelo menos uma cópia das regiões cPPT e CTS é de VIH-1 ou VIH-2.
5. 5. Vector da reivindicação 2, em que o dito ácido nucleico compreendendo pelo menos uma cópia das regiões cPPT e CTS é de VISNA, EIAV, FIV, OU CAEV.
6. 6. Vector da reivindicação 1 a 5, compreendendo uma cópia única das regiões cPPT e CTS do retrovírus.
7. 7. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a sequência de ácidos nucleicos heteróloga está operacionalmente ou fisicamente ligada ao ácido nucleico compreendendo pelo menos uma cópia das regiões cPPT e CTS. 1
8. 8. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a sequência de ácidos nucleicos heteróloga codifica um péptido, polipéptido, ou proteína.
9. 9. Vector da reivindicação 8, contendo uma cópia das regiões de actuação-cis cPPT-CTS, o gene repórter GFP sob controlo do promotor de EFla, e a sequência U3 de uma LTR, privado do seu promotor e aumentador, e que é pTRlP Δυ3 EFlaGFP.
10. 10. Vector da reivindicação 8, em que a sequência de ácidos nucleicos heteróloga codifica uma proteína terapêutica.
11. 11. Célula recombinante compreendendo um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
12. 12. Célula recombinante da reivindicação 11, em que a célula é uma célula HeLa ou uma célula hematopoiética.
13. 13. Célula recombinante da reivindicação 11, que é uma célula estaminal hematopoiética.
14. 14. Processo in vítro para inserir uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga no núcleo de uma célula alvo, compreendendo o dito método expor um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 sob condições que permitem a captação da dita sequência de ácidos nucleicos heteróloga na célula alvo.
15. 15. Processo da reivindicação 14, em que a eficiência de inserção do ácido nucleico de interesse no núcleo da célula alvo é 30% ou superior.
16. 16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 15, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um péptido, polipéptido, ou proteína. 2
17. 17. Processo da reivindicação 16, em que a proteína é uma proteína terapêutica.
18. 18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, em que a célula alvo é uma célula sem-divisão.
19. 19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, em que a célula alvo é uma célula HeLa ou uma célula hematopoiética.
20. 20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, em que a célula alvo é uma célula estaminal hematopoiética.
21. 21. Processo para expressar uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga in vitro, compreendendo o dito processo: a) expor células alvo a um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, sob condições que permitem a captação do vector contendo a sequência de ácidos nucleicos heteróloga na célula alvo para criar uma célula recombinante, e b) cultivar a célula recombinante sob condições onde a sequência de ácidos nucleicos heteróloga é expressa.
22. 22. Processo da reivindicação 21, em que a sequência de ácidos nucleicos heteróloga é expressa em cultura de tecido.
23. 23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 22, que compreende adicionalmente purificar ou isolar o produto de expressão da sequência de ácidos nucleicos heteróloga.
24. 24. Célula recombinante compreendendo um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para uso como composto terapêutico para permitir que a célula recombinante expresse o ácido nucleico no corpo do indivíduo. 3
25. 25. Célula recombinante da reivindicação 24 para uso como composto terapêutico numa célula estaminal hematopoiética.
26. 26. Vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para uso como composto terapêutico, em que o ácido nucleico está em numa quantidade e forma suficiente para resultar na expressão do gene de interesse no corpo do indivíduo.
27. 27. Vector da reivindicação 26, caracterizado por ser expresso num tecido alvo.
28. 28. Vector VIH-1 de expressão compreendendo: a) um ácido nucleico isolado ou purificado compreendendo pelo menos uma cópia das regiões de actuação-cis cPPT e CTS de um retrovírus, em que as ditas regiões cPPT e CTS induzem uma estrutura de ADN de três-cadeias e b) uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga, em que a LTR do VIH-1 é deletada para o promotor e o aumentador de U3, para uso no tratamento de um indivíduo sofrendo de, ou tendo uma alta probabilidade de desenvolver, uma doença ou desordem tendo uma base genética, em que o dito vector retroviral está numa quantidade suficiente para resultar na expressão da dita proteína terapêutica numa quantidade suficiente para tratar a dita doença ou desordem.
29. 29. Vector da reivindicação 28 para uso como droga num tratamento profiláctico, de melhoria ou curativo.
30. 30. Vector da reivindicação 29, para uso no tratamento de uma doença ou desordem do sangue, uma doença ou desordem do cérebro ou do sistema nervoso, ou uma doença ou desordem em desenvolvimento. 4
31. 31. Estojo contendo pelo menos um recipiente contendo um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
32. 32. Estojo da reivindicação 31, em que a sequência de ácidos nucleicos heteróloga codifica uma proteína terapêutica. 17-04-2007