PT1792997E - Adn triplex lentiviral, vetores e células recombiantes contendo adn triplex lentiviral - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ADN TRIPLEX LENTIVIRAL, VETORES E CÉLULAS RECOMBIANTES CONTENDO ADN TRIPLEX LENTIVIRAL

ANTECEDENTES DO INVENTO Âmbito do Invento 0 presente invento diz respeito ao campo da biotecnologia, e especialmente a ácidos nucleicos virais e a células contendo ácidos nucleicos virais. Mais particularmente, o presente pedido descreve sequências de ácidos nucleicos virais que podem fazer parte de estruturas de ADN triplex bem como a vetores de ácido nucleico, vírus, e células contendo estas sequências de ácidos nucleicos virais. Refere-se adicionalmente a métodos de utilização de tais estruturas de ADN e sequências de ácidos nucleicos.

Descrição da Arte Relacionada A transferência de genes em células estaminais hematopoiéticas (HSC) tem grande potencial, tanto para terapia genética de doenças hereditárias bem como doenças adquiridas, e para a compreensão de mecanismos que regulam a hematopoiese normal e patológica. Como as HSC têm capacidades proliferativas extensas, a transferência de genes estável deverá incluir a integração genómica do transgene. Os retrovírus baseados no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) têm sido muito populares porque integram-se nos genomas da célula hospedeira e podem permitir expressão de transgene a longo termo. Contudo, estes oncoretrovírus não se integram em células sem capacidade de divisão, e a maioria 1 das HSC é quiescente. Muitos protocolos de pré-estimulação usando diferentes associações de citocinas foram desenvolvidos para ativar os ciclos das HSC de forma a torná-las transduciveis por vetores de transferência de genes derivados de oncovírus e dependentes da mitose. Contudo, a estimulação de citocina induz a diferenciação juntamente com a proliferação e as potencialidades das HSC podem ser perdidas durante o processo de transdução. Este problema pode ser superado usando vetores derivados de lentivirus uma vez que se mostrou que os lentivirus infetam tanto as células com divisão como sem divisão (Poznansky et al., 1991; Naldini et al., 1996). Divulgações iniciais publicadas nos últimos três anos usando tais vetores derivados de lentivirus para a transdução de HSC mostraram resultados promissores mas muito heterogéneos (Case et al.r 1999; Evans et al., 1999; Uchida et al., 1998; Miyoshi et al., 1999).

Os lentivirus desenvolveram uma estratégia de importação nuclear que permite ao seu ADN genómico atravessar a membrana nuclear de uma célula hospedeira. Esta importação nuclear ativa de lentivirus é responsável pela sua capacidade única, entre os retrovirus, em replicar eficazmente em células alvo sem-divisão, tal como o tecido de macrófagos. A restrição da replicação de oncovirus como o MoMLV em células com divisão parece ser devido à exigência para rompimento da barreira da membrana nuclear durante a mitose, permitindo que complexos de pré-integração do MoMLV (PICs) entrem no núcleo (Roe et al., 1993) . A replicação independente da mitose dos lentivirus, na origem das suas estratégias de replicação in vivo e consequentemente da sua patogenicidade, também permitiu a geração de vetores de transferência de genes lentivirais com aplicações terapêuticas promissoras (Poznansky et al., 1991; Naldini et al., 1996). 2 A replicação independente da mitose dos lentivirus foi inicialmente demonstrada pela infeção produtiva de células condroides não-mitóticas pelo lentivirus VISNA (Thormar, 1963). Logo após a sua descoberta, mostrou-se que o VIH replica em macrófagos primários diferenciados (Gartner et al., 1986 ; Ho et al., 1986) . 0 ADN de VIH integra na cromatina de células alvo não-mitóticas (Weinberg et al. , 1991; Lewis et al. , 1992), implicando que PICs de VIH-1 são capazes de atravessar a membrana nuclear de células hospedeiras (Bukrinsky et al., 1992). Assim, a importação nuclear independente da mitose é um evento essencial responsável pela capacidade do lentivirus em replicar em células sem-divisão. A procura dos determinantes virais responsáveis pela importação nuclear ativa do ADN do genoma do VIH-1 constituiu um campo ativo mas controverso de investigação. A presença de sinais de localização nucleares putativos (NLSs) dentro da matriz (MA) e de proteínas virais Vpr conduziu à proposição que pudessem atuar de uma forma redundante na importação nuclear de ADN do VIH-1 (Bukrinsky et al. , 1993b; Emerman et al. , 1994; Popov et al., 1998; von Schwedler et al., 1994).

Foi proposto que a fosforilação de um pequeno subconjunto (1%) de moléculas da MA num resíduo tirosina C-terminal ativa a sua libertação da membrana plasmática e a sua associação com a proteína integrase do VIH-1 (Gallay et al., 1995a; 1995b). A contribuição destas proteínas para as propriedades cariofílicas dos PICs do VIH-1 é atualmente uma matéria de debate aceso (Freed e Martin, 1994; Freed et al., 1995;

Fouchier et al., 1997; Freed et al., 1997; Koostra e

Schuitemaker, 1999). Mais recentemente, foram identificados motivos de NLS na proteína integrase (IN) e foram relatadas 3 mutações nestes motivos para abolir a interaçao de IN com carioferina a, um receptor NLS celular (Gallay et al. , 1997).

RESUMO DO INVENTO

Seja qual for o papel destas proteínas virais candidatas na importação nuclear do VIH, o presente invento mostra que o genoma do VIH-1 retrotranscrito por si só transporta um determinante de acção-cis para a sua importação nuclear. 0 invento proporciona um ácido nucleico compreendendo uma estrutura de cadeia tripla (triplex), tal como uma de um lentivírus. 0 triplex estimula a entrada de ácidos nucleicos no núcleo de células. 0 ácido nucleico pode conter as sequências de acção-cis cPPT e CTS de um lentivírus. 0 lentivírus pode ser qualquer lentivírus, incluindo, mas não limitado a, VIH-1, VIH-2, VISNA, EINV, FIV, e CAEV. Em modos de execução, o ácido nucleico encontra-se no contexto de um vetor, tal como um vetor de expressão.

Assim, o pedido também divulga um vetor, por exemplo, um vetor de ácido nucleico. 0 vetor de ácido nucleico pode incluir sequências de qualquer vetor conhecido do perito na técnica de utilidade para a transferência de ácidos nucleicos para as células ou para expressão de ácidos nucleicos in vivo ou in vitro. 0 pedido descreve adicionalmente vírus e células (eucarióticas e procarióticas) contendo o ácido nucleico aqui descrito. As células podem ser células recombinantes. 0 pedido divulga adicionalmente um método de transferência de ácido nucleico para um núcleo de célula hospedeira, por 4 exemplo, por exposição da célula hospedeira ao ácido nucleico, vetor, virus, ou célula do invento, para proporcionar uma célula recombinante. Este método permite transferência de elevada eficiência de ácidos nucleicos para o núcleo da célula hospedeira, tal como o núcleo de uma célula estaminal hematopoiética. A transferência de elevada eficiência permite ao perito na técnica praticar vários métodos de tratamento, incluindo, mas não limitado a, métodos de tratamento profilático, métodos de tratamento benéfico, e métodos de tratamento curativo. Por exemplo, são possibilitados por este invento métodos de terapia genética. De um modo geral a terapia genética pode ser usada para tratar doença do sangue, doença do cérebro, doenças virais bem como muitas outras doenças hereditárias ou adquiridas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra que a iniciação central de transcrição reversa é um passo importante no ciclo de replicação do VIH-1. (A) Mutações introduzidas na sequência cPPT do VIH-1. Foram construídos virus mutantes cPPT conservativos e semi-conservativos. 0 mutante cPPT-D semi-conservativo contém 10 mutações no 19-mer da cPPT. 0 mutante cPPT-AG é o seu vírus de controlo no qual uma única mutação purina por purina introduz a mesma alteração de aminoácido na região de codificação da integrase de sobreposição. As mutações são mostradas em tipo invertido. (B) Impacto das mutações na cPPT na infecciosidade do VIH-1. Cinéticas de replicação virai em células PBLs (painel esquerdo) e MT4 (painel direito) 5 estimuladas por PHA. As células foram infetadas com quantidades equivalentes de partículas virais de acordo com os teores de antigene da cápside (p24) dos sobrenadantes virais. A produção de vírus foi seguida ao longo do tempo por atividade RT. (C)Titulações de vírus de ciclo único em células P4 tratadas com afidicolina com divisão ou sem-divisão (HeLa CD4-LTR LacZ). A atividade da β-galactosidase foi medida usando um ensaio de quimioluminescência. Os resultados são expressos como unidades de luz relativa (RLU)/seg/ng p24 do inoculo, média ± DP de quatro experiências independentes. A Figura 2 ilustra mutações na cPPT que não afeta a produção virai, a síntese de ADN virai nem a capacidade do ADN virai integrar in vitro. (A) Efeito de mutações na cPPT na produção virai. As células HeLa foram transitoriamente transfetadas com plasmídeos pLAI, pcPPT-AG, ou pcPPT-D. A produção virai foi medida por quantificação de antigene virai p24 em sobrenadantes celulares, 48 horas pós-transfeção. (B) Efeito de mutações na cPPT na eficiência de transcrição reversa. As células P4 foram infetadas com as mesmas quantidades de partículas virais (300 ng de antigene p24 por 106 células) e o ADN foi extraído 12 horas depois. As quantidades totais de ADN virai de transcrição reversa, representado por um fragmento MscI do VIH-1 interno, foram detetadas por Southern blot usando o mesmo fragmento de ADN como sonda e quantificadas usando um "phosphorimager". 6 (C) Efeito de mutações na cPPT na integração in vitro. As células MT4 foram co-cultivadas com células H9-LAI ou H9-cPPT-225 cronicamente infetadas. A integração in vitro de complexos de pré-integração virais, isolados do citoplasma de células infetadas, foi executada como previamente descrito (Farnet e Haseltine, 1990). Cada banda é carregada com ADN citoplasmático de 2xl08 células infetadas. A Figura 3 mostra que os vírus mutantes de ADN triplex central são deficitários na importação nuclear de ADN virai. (A)E stratégia para o seguimento quantitativo da sintese, circularização, e integração de ADN do VIH-1. O ADN de células infetadas foi extraído em vários tempos pós-infeção, digerido com MscI e Xhol, e analisado por Southern blot usando uma sonda sobrepondo o sítio 5'MscI. O fragmento de ADN de 1,9 kb interno, comum a todas as espécies de ADN virai independentemente do seu estado integrado ou não integrado, indica a quantidade total de ADN virai em células infetadas. Os sinais 2,6 kb, 2,8 kb, e 3,4 kb correspondendo, respetivamente, a ADN linear não integrado, um, e duas LTRs de ADNs circular são revelados. Uma vez que a sonda gerada por PCR sobrepõe exatamente o sítio MscI, a intensidade de cada banda é diretamente proporcional à quantidade das espécies de ADN virai correspondente. Assim, a quantidade de ADN proviral integrado pode ser calculada subtraindo da 7 quantidade total de ADN virai os sinais de ADN virai linear e circular não integrado. (B) Análise de Southern blot de ADN virai processado em células infetadas. As células P4 foram infetadas com quantidades equivalentes de cada vírus, normalizadas nos teores de p24 dos sobrenadantes. As células infetadas foram lisadas a diferentes tempos pós-infeção, ADN extraído, e usado para a análise quantitativa acima descrita. (C) Perfis de ADN virai intracelular, em conclusão de um ciclo de infeção (48 horas pós-infeção) . Os resultados são expressos como percentagens de ADN virai total. Foram obtidos perfis de ADN virai intracelular semelhantes usando células MT4 (dados não mostrados). A Figura 4 mostra que o ADN linear de vírus mutantes de ADN triplex central acumula na vizinhança da membrana nuclear. (A) Fracionamento núcleo/citoplasma de células P4 infetadas. Análise Southern blot de ADN virai de frações nucleares (N) e citoplasmáticas (C), 24 horas pós infeção. 0 fracionamento baseado em lise de tritão foi executado como previamente descrito (Belgrader et al., 1991). 0 ADN foi restringido com MscI e hibridizado usando a sonda de sobreposição do sítio MscI. (B) Deteção de genomas de VIH-1 individuais por Hibridização In Sítu de Fluorescência (FISH) . As células P4 foram infetadas a alta multiplicidade (2pg de antigene p24 por 106 células), e hibridizadas usando uma sonda de genoma completo do VIH-1. Os sinais fluorescentes foram amplificados por precipitação de tiramida. As secções óticas ao longo das células foram analisadas por microscopia de deconvolução. A Figura 5 mostra que a inserção do ADN triplex central num vetor baseado em VIH-1 aumenta a transdução da GFP e a importação nuclear do ADN genómico do vetor. (A) Diagrama esquemático dos genomas dos vetores. As sequências de acção-cis central cPPT e CTS do genoma do VIH-1, responsáveis pela formação do ADN triplex durante a transcrição reversa, foram inseridas numa posição central no vetor HR da GFP previamente descrito (Naldini et al., 1996) . 0 TRIPinv-GFP inclui a sequência do ADN triplex central na orientação reversa, não-funcional. (B) Eficiência comparativa de transduçao de GFP usando vetores de VIH com ou sem um ADN triplex central. Utilizaram-se como alvo células HeLa com ou sem divisão (tratadas com afidicolina). A fluorescência da GFP foi quantificada 48 horas pós-transdução usando um fluorímetro de microplacas (Wallac) . Os resultados são expressos como a média ± DP de uma experiência representativa executada em triplicado. A pseudotransdução da atividade da GFP foi subtraída do sinal. (C) Análises Southern blot de vetor de ADN processado em células transduzidas. As células HeLa transduzidas foram lisadas a diferentes tempos pós-infeção, ADN extraído, restringido, e executado Southern blot usando uma estratégia similar como para os vírus. A digestão por MscI é substituída 9 por EcoNI e Avall, e a sonda é um fragmento de ADN de PCR que sobrepõe exatamente o sítio EcoNI. (D) Análise quantitativa do estado intracelular do vetor de ADN, 48 horas pós infeção. Os resultados são apresentados como percentagens de vetor de ADN total. A Figura 6 ilustra um modelo para importação nuclear do genoma do VIH-1 dependente do ADN triplex. (A) Avaliaçao dos fenótipos observados dos vírus mutantes de ADN triplex central. Os passos de iniciação e de terminação central da transcrição reversa do VIH-1 criam uma estrutura de retalho de ADN de cadeia positiva longa: o ADN triplex central. A cadeia positiva longa do VIH-1 é sintetizada como dois segmentos de meio-genoma discretos. Um segmento a jusante é iniciado numa cópia central da sequência de trato polipurínico (cPPT). 0 segmento a montante termina a jusante da cPPT, após um evento de deslocação de cadeia longa de 99 nucleótidos, bloqueado pela sequência de terminação central (CTS) . Na conclusão de um único ciclo de infeção, o ADN virai do vírus do tipo selvagem é praticamente completamente processado em provírus integrado («55%), 1LTR («35%), e ADN circular 2LTRs (< 5%), enquanto que uma pequena fração permanece como ADN linear (< 10%). As

mutações na cPPT afetam a formação do ADN triplex central. 0 produto de transcrição reversa final de um vírus mutante de iniciação central é um ADN linear de cadeia dupla contínuo com carência no ADN triplex central (Charneau et al., 1992) . O ADN 10 virai do vírus mutante cPPT-D acumula-se em células infetadas como moléculas de ADN linear, e localiza-se nas imediações da membrana nuclear. (B) Dois mecanismos especulativos para importação nuclear do genoma do VIH-1 dependente do triplex por maturação do complexo de transcrição reversa (RTC) num complexo de pré-integração (PIC) e translocação de ADN linear através do poro nuclear. A transcrição reversa do VIH-1 ocorre provavelmente dentro de um complexo estruturado (ordenado) rodeado por um conjunto de proteínas da cápside. 0 tamanho do RTC excede o diâmetro de exclusão do poro nuclear. Antes da translocação, o RTC sofre uma maturação num PIC menor com perda das proteínas da cápside (Karageorgos et al. , 1993). A formação do ADN triplex sinaliza a terminação da síntese de ADN virai e poderá sinalizar a fuga do ADN do VIH do conjunto da cápside. No PIC, as extremidades do ADN linear são provavelmente atravessadas em conjunto após dimerização de proteínas integrase ligadas às extremidades de LTRs (Miller et al., 1997) . 0 ADN triplex estando numa posição central, uma estrutura lógica para PIC do VIH-1 seria um filamento duplo, simetricamente dobrado em qualquer lado do triplex central pela dimerização da integrase. 0 ADN triplex poderia então constituir um vértice que poderia interagir com proteínas de transporte cariofílicas, permitindo a passagem do filamento de ADN do VIH-1 através do poro nuclear. Em vírus mutantes cPPT, um defeito de maturação do RTC em PIC induzirá uma acumulação de cápsides virais integrais no poro nuclear. Alternativamente, a ausência do ADN triplex no ADN linear mutante 11 cPPT proibirá a interação com proteínas de transporte proibindo a translocação do genoma do VIH-1 pelo poro nuclear. Em ambos os casos, o ADN de virus mutantes cPPT acumula-se como ADN linear nas imediações da membrana nuclear. A Figura 7 mostra os resultados de experiências de transdução usando células CD34+ de sangue de cordão humano. (A) Análises FACS de células CD34+ de sangue de cordão humano transduzidas durante 24 horas na presença de 100 ng/ml de P24 virai em condições aqui descritas. A análise foi executada 48 horas após lavagem das células no final do período de transdução de 24 horas. As percentagens são expressas como proporções de células hematopoiéticas morfologicamente controladas. Média X indica o valor médio de intensidade de fluorescência verde. (B) A expressão da GFP foi analisada no dia 5 pós transdução. A Figura 8 representa em diagrama o efeito de dosagem virai na eficiência de transfeção. (A) A percentagem de células CD34+ que expressam eGFP. (B) O valor médio de intensidade de fluorescência da GFP de células CD34+eGFP+. (C) O valor médio de intensidade de fluorescência da GFP de células CD34+eGFP+ multiplicado pela percentagem de células CD34+eGFP+. As células CD34+ 12 foram transduzidas durante 24 horas sob as condições aqui especificadas com o vetor lentiviral incluindo a sequência de codificação da eGFP sob controlo do promotor do CMV, e incluindo (linha grossa) ou sem (linha tracejada) a estrutura triplex. A análise foi executada 48 horas após lavagem das células no final do período de transdução de 24 horas. A Figura 9 ilustra análise FACS de células CD34+ de sangue de cordão humano transduzidas durante 24 horas sob as condições descritas no texto com um vetor lentiviral tendo uma LTR do VIH-1 intacto (painéis esquerdos) ou uma LTR do VIH-1 com deleção U3 (painéis direitos) e um promotor do CMV interno (painéis superiores) ou um promotor de EF-1 alfa (painéis inferiores). (A) A análise foi executada 48 horas após lavagem das células no final do período de transdução de 24 horas. (B) A análise foi executada 120 horas após lavagem das células no final do período de transdução de 24 horas. A análise distingue entre células CD34 luminosas (imaturas) e sombrias. As percentagens são expressas como proporções de células hematopoiéticas morfologicamente controladas. O segundo número, quando indicado, representa a média de fluorescência verde.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DO INVENTO

Mostrámos previamente que o VIH-1 desenvolveu uma estratégia de transcrição reversa complexa, que difere das do oncovírus por dois passos que ocorrem no centro do genoma: uma 13 iniciação adicional de síntese de cadeia positiva acoplada com um passo de terminação. 0 ADN de cadeia positiva do VIH-1 é sintetizado como dois segmentos metade-genómicos discretos. Uma cópia adicional da sequência cis-ativa do trato polipurinico, presente no centro de todos os genomas lentivirais (cPPT), inicia a síntese de uma cadeia positiva a jusante (Charneau et al., 1991, 1992). 0 segmento de cadeia positiva a montante iniciado no 3'PPT vai, após uma transferência de cadeia, prosseguir para o centro do genoma e terminar após um evento de deslocamento de cadeia discreto (Figura 6A) . Este último evento cronológico de transcrição reversa do VIH-1 é controlado pela sequência cis-ativa da sequência de terminação central (CTS) que ejeta a transcriptase reversa do VIH-1 (RT) neste sítio no contexto específico de síntese de deslocamento de cadeia (Charneau et ai., 1994; Lavigne et al., 1997) . Assim, o produto final da transcrição reversa do VIH-1 é uma molécula de ADN linear que traz no seu centro uma dobra de ADN longa de 99 nucleótidos estável, aqui designado por ADN triplex central (Figura 6A).

Ambos os vírus mutantes de iniciação e de terminação central sintetizam um produto de transcrição reversa desprovido de um ADN triplex do tipo selvagem. Como ilustrado na Figura 6A, no caso de um mutante de iniciação central, o produto final é um ADN linear de cadeia dupla contínuo que carece do triplex central (Charneau et al., 1992). 0 segmento de cadeia positiva a jusante iniciado no cPPT não é sintetizado. Assim, não ocorre deslocamento de cadeia no centro do genoma; o alongamento da cadeia positiva transferida prossegue por todo o genoma. No caso de um mutante de terminação central, os eventos de deslocamento da cadeia central já não são controlados pela sequência CTS mutada e, são geradas sobreposições de cadeia positiva mais compridas e 14 distribuídas aleatoriamente, comparado ao ADN triplex do tipo selvagem discreto (Charneau et ai., 1994). As mutações nas sequências cis-ativas cPPT ou CTS prejudicam gravemente a replicação do VIH, sugerindo um papel direto do triplex central no ciclo de vida retroviral (Charneau et al., 1992; Hungnes et al., 1992; Charneau et al., 1994). 0 presente invento divulga o uso de um vetor retroviral, compreendendo regiões cPPT e CTS de origem lentiviral nas quais a LTR é deletada para o promotor e amplificador de U3, para aumentar a taxa de importação in vitro de uma sequência de ácidos nucleicos contida no dito vetor, num núcleo de uma célula hospedeira. 0 invento também proporciona um vetor retroviral, compreendendo regiões cPPT e CTS de origem lentiviral e uma LTR de origem retroviral deletada no promotor e amplificador da sua região U3, para uso para aumentar a taxa de importação de um ácido nucleico contido no dito vetor num núcleo de célula hospedeira, para tratar o dito hospedeiro.

0 presente pedido divulga que o ADN triplex central do VIH-1 está envolvido num passo tardio de importação nuclear do genoma do VIH-1, imediatamente antes de, ou durante, a translocação do ADN virai através do poro nuclear. Por este motivo as características distintivas de transcrição reversa lentiviral são responsáveis, pelo menos em parte, pela capacidade única dos lentivírus, entre os retrovírus, em replicarem em células sem-divisão. 0 pedido também divulga que vetores de transferência de genes do VIH carentes em ADN triplex central exibem um defeito de importação nuclear forte. Esto pedido estabelece que a inserção das sequências cis-ativas centrais do genoma do VIH-1 num vetor VIH 15 previamente descrito (Naldini et al. , 1996) aumenta a eficiência de transdução por complementar o defeito de importação nuclear do vetor de ADN original para níveis do tipo selvagem. Esta constatação proporciona evidência adicional e independente do papel do ADN triplex central na importação nuclear do VIH-1. A descrição do ADN triplex como determinante de importação nuclear de lentivírus tem implicações importantes para o desenho de vetores lentivirais eficientes. Uma vez que a infeção de células alvo sem-divisão por lentivírus assenta no seu uso de uma via de importação nuclear ativa, é preferível manter os determinantes de importação nuclear lentivirais em elementos vetoriais derivados. Elementos vetoriais retrovirais clássicos são vetores de substituição nos quais são deletadas as sequências de codificação virais completas entre as LTRs e substituídas pelas sequências de interesse (Miller AD, 1997) . No caso de vetores lentivirais, esta estratégia clássica conduz à deleção das sequências cis-ativas centrais cPPT e CTS. 0 papel importante do triplex na importação nuclear do VIH implica que tais elementos vetoriais de substituição não são ótimos. Esta constatação estabelece o facto que o determinante de importação nuclear do ADN triplex é operativo no contexto heterólogo de um vetor lentiviral derivado do VIH-1. 0 ADN triplex per se fora do contexto do genoma do VIH-1 nativo pode promover a importação nuclear de sequências heterólogas de ADN (PCT Francesa N° 9805197, 24 de Abril de 1998). A presença da sequência do ADN triplex induz um aumento acentuado na eficiência de transdução de genes em células estaminais hematopoiéticas. 0 presente pedido descreve ácidos nucleicos (ADN ou ARN, ou seus análogos) que são capazes de participar em estruturas de ácidos nucleicos triplex (i.e., ácidos nucleicos de cadeia 16 tripla). Em modos de execução, os ácidos nucleicos são sequências lentivirais. Em modos de execução, os ácidos nucleicos são derivados de sequências lentivirais, tais como por mutagénese dirigida (i.e., deleção intencional, inserção, ou substituição de pelo menos um nucleótido) ou mutagénese de pressão seletiva. Estes ácidos nucleicos permitem transferência de elevada eficiência de ácidos nucleicos para células hospedeiras, e especialmente para núcleos de células hospedeiras. Devido a esta capacidade, os genes que estão operacional ou fisicamente ligados a estes ácidos nucleicos podem ser expressos a níveis elevados e/ou numa elevada percentagem de células expostas aos ácidos nucleicos. 0 ADN inserido numa região de cadeia tripla de um genoma lentiviral é particularmente estável no elemento, e ajuda a alcançar um elevado nível de transdução e transfeção. 0 presente pedido descreve uma sequência de ADN de três cadeias induzida pelas regiões cPPT e CTS de um lentivírus, que é capaz de induzir uma elevada taxa de entrada de vetor de ADN num núcleo de célula hospedeira, ou capaz de aumentar a taxa de importação nuclear de vetor de ADN. Em modos de execução, a sequência de ADN de cadeia tripla pode estar covalentemente ligada a uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga, tal como um gene repórter ou gene de outro interesse. Por exemplo, o ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que codifica um péptido, polipéptido, ou proteína. Em modos de execução, a sequência de ácidos nucleicos heteróloga está presente na região de hélice-tripla. Em modos de execução, a sequência de ácidos nucleicos heteróloga está presente no mesmo ácido nucleico que a região de hélice-tripla, mas fora da hélice tripla. Em modos de execução, um único ácido nucleico 17 compreende mais do que uma sequência de cadeia tripla induzida pelas regiões cPPT e CTS de um lentivirus. 0 presente invento descreve vetores, tais como vetores vaivém, vetores de expressão, vetores de integração, transposões, retrotransposões, e semelhantes, que contêm pelo menos uma sequência capaz de participar na formação de estruturas de ácido nucleico triplex. Em modos de execução, o vetor compreende mais de uma sequência capaz de participar na formação de estruturas de ácido nucleico triplex. Os vetores podem ser usados para transferir os ácidos nucleicos aqui descritos de uma célula para outra, ajudar na geração de grandes quantidades dos ácidos nucleicos e servir como uma molécula de base na qual outras sequências de ácidos nucleicos de interesse (e.g. , genes repórter, genes terapêuticos) podem ser inseridas.

Ainda noutro aspeto, o presente invento proporciona um método para eficazmente infetar, transfetar, ou transduzir células com uma sequência de ácidos nucleicos virai compreendendo pelo menos uma sequência que pode participar em estruturas de ácido nucleico triplex. Em modos de execução, o método compreende expor uma célula, ou uma pluralidade de células, a pelo menos uma cópia de um ácido nucleico, vetor, virus, ou célula do invento. Em modos de execução, o passo de expor a célula ou células ao ácido nucleico, vetor, virus, ou célula do invento é conduzido sob condições tais que o ácido nucleico, vetor, virus, ou célula do invento podem entrar na célula ou células alvo (hospedeira). Em modos de execução preferidos, as condições são tais que elevados niveis do ácido nucleico, vetor, virus, ou célula do invento entram na célula ou células alvo. 18

Em modos de execução, o método é altamente eficiente, permitindo a inserção do ácido nucleico aqui descrito no núcleo de 30% ou mais das células expostas ao ácido nucleico. Em modos de execução, a percentagem de núcleos que incorporam o ácido nucleico aqui descrito é 40% ou mais, por exemplo 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, ou 90%-100%. Em modos de execução preferidos, a percentagem de núcleos que incorporam o ácido nucleico aqui descrito é superior a 80%, mais preferivelmente, superior a 85%, e mais preferencialmente superior a 90%, como superior a 95%. Em modos de execução, as células são infetadas ou transfetadas com vírus inteiros (incluindo fagos) ou bactérias contendo os ácidos nucleicos aqui descritos. Em modos de execução, os ácidos nucleicos são introduzidos nas células usando meios mecânicos e/ou químicos (e.g., eletroporação, fusão de lipossomas). Em modos de execução, o ácido nucleico nu aqui descrito é incorporado pelas células hospedeiras alvo.

Assim, num modo de execução, o invento proporciona o uso de uma sequência de nucleótidos compreendendo as regiões cPPT e CTS, que adotam uma estrutura de ADN de cadeia tripla (triplex) após transcrição reversa, num vetor lentiviral ou retrotransposão e que estimula a entrada, e a taxa de importação nuclear, do vetor de ADN no núcleo de uma célula transduz ida. O pedido também descreve células recombinantes que contêm os ácidos nucleicos ou vetores do invento como aqui descritos. As células recombinantes podem ser qualquer célula (procariótica ou eucariótica), incluindo descendência ou derivados da mesma. Assim, o pedido inclui células que são criadas usando uma célula como aqui descrito. Em modos de execução, as células são eucarióticas. Em modos de execução, 19 as células são células de mamífero, tais como células HeLa ou células hematopoiéticas, tais como células estaminais hematopoiéticas. Assim, em modos de execução, o invento divulga um processo para transduzir células eucarióticas, em que o processo compreende uso de uma sequência de ADN de cadeia tripla induzida pelas regiões cPPT e CTS de um lentivírus, que é capaz de induzir uma elevada taxa de entrada de vetor de ADN num núcleo de célula hospedeira, ou capaz de aumentar a taxa de importação nuclear de vetor de ADN.

Porque as células recombinantes podem expressar um gene heterólogo de interesse a altos níveis, estas células podem ser usadas em numerosas aplicações. As aplicações incluem, mas não estão limitadas a, produção de elevados níveis de proteínas de interesse (tais como proteínas de valor terapêutico) em cultura de células e produção de uma proteína de interesse ín vivo por introdução da célula recombinante do invento num indivíduo que necessite da proteína. 0 indivíduo pode ser animal ou humano. Em conformidade, o pedido diz respeito tanto a aplicações veterinárias bem como a médicas.

Em modos de execução, o pedido descreve um método de produção de uma proteína recombinante de interesse expondo uma célula alvo a um ácido nucleico, vetor, ou vírus do invento e permitindo que a célula alvo incorpore o ácido nucleico como aqui descrito, por exemplo, através de transdução, transformação, ou transfeção. Após introdução do ácido nucleico na célula alvo, a célula é cultivada sob condições por meio das quais a proteína recombinante de interesse é expressa, e assim produzida pela célula alvo que agora é considerada uma célula recombinante. Embora o método possa ser praticado numa única célula individual, é evidente que o 20 método será frequentemente mais prático se praticado numa coleção de células nas quais todas as células são clones. Tal como é aqui utilizado, "célula" refere-se a uma célula individual ou uma coleção de células idênticas. 0 método pode incluir adicionalmente purificar ou isolar a proteina de interesse da célula recombinante ou fluido de cultura celular. Em tal método, podem ser aplicados procedimentos de expressão e purificação de proteínas conhecidos dos peritos na técnica. Estes procedimentos são bem conhecidos dos peritos na técnica e portanto não necessitam de ser aqui pormenorizados.

Num modo de execução preferido, o pedido descreve um processo para expressar um gene de interesse in vitro, em que o processo compreende: a) expor células alvos a um ácido nucleico isolado ou purificado compreendendo um gene de interesse e pelo menos uma cópia das regiões de atuação cis cPPT e CTS de um retrovirus, em que as regiões cPPT e CTS induzem uma estrutura de ADN de cadeia tripla, sob condições que permitem a incorporação do ácido nucleico na célula alvo para criar uma célula recombinante, e b) cultivar a célula recombinante sob condições que permitem que pelo menos parte do ácido nucleico seja transferido para o núcleo da célula recombinante e o gene de interesse seja expresso. Em modos de execução, o processo usa um vetor como acima descrito. Assim, o pedido descreve um método de expressar um gene de interesse in vitro, por exemplo, em cultura de tecido. Em modos de execução, o método compreende expor células alvo a um ácido nucleico, vetor, virus, ou célula do invento sob condições nas quais a célula alvo pode incorporar a molécula do invento contendo o gene de interesse. A célula recombinante assim produzida é então permitida crescer e replicar sob condições 21 nas quais o gene de interesse é expresso. Em modos de execução, o método de expressão de gene in vitro é acoplado a um método de purificar ou isolar a proteína de interesse. Nestes modos de execução, a proteína de interesse pode ser purificada ou isolada de outros componentes celulares usando técnicas conhecidos do perito na técnica, incluindo, mas não limitadas a, cromatografia líquida, precipitação, centrifugação, filtração em gel, e cromatografia de afinidade. As técnicas adequadas são conhecidas dos peritos na técnica e não necessitam ser aqui pormenorizadas.

Assim, o invento descreve um método para expressar um gene de interesse in vivo, por exemplo, num indivíduo com necessidade da proteína expressa pelo gene. 0 método de expressar um gene in vivo compreende produzir uma célula hospedeira fora do indivíduo por exposição de uma célula hospedeira a um ácido nucleico, vetor, vírus ou célula do invento, para produzir uma célula recombinante de acordo com o invento. A célula recombinante do invento é então administrada, introduzida, ou de outro modo exposta, ao indivíduo, após o que o gene de interesse é expresso. Por exemplo, o método pode compreender administrar uma célula recombinante compreendendo um ácido nucleico, como aqui descrito, a um indivíduo, e permitir que a célula recombinante expresse o ácido nucleico no corpo do indivíduo. Em aplicações preferidas a célula recombinante é uma célula estaminal hematopoiética. As células recombinantes são em primeiro lugar purificadas ou isoladas de células não-recombinantes, e em seguida administradas, introduzidas, ou de outro modo expostas, ao indivíduo. 0 método de expressar um gene in vivo compreende expor (e.g., administrar, introduzir, etc.) o indivíduo a um ácido nucleico, vetor, e/ou vírus como aqui descrito. 0 ácido 22 nucleico, vetor, e/ou vírus transfeta/transduz/infeta pelo menos uma das células do indivíduo, após o que o gene de interesse é expresso. Por exemplo, o método pode compreender administrar um ácido nucleico, vetor, ou vírus do invento a um indivíduo numa quantidade e forma suficiente para resultar em expressão do gene de interesse no corpo do indivíduo. De preferência, o método resulta na expressão do gene de interesse num tecido ou célula alvos. 0 pedido descreve um processo para tratar um indivíduo que padece de, ou que tem elevada probabilidade de desenvolver, uma doença ou desordem tendo uma base genética. 0 processo compreende administrar um vetor retroviral compreendendo a)um ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica e b) pelo menos uma cópia das regiões de acção-cis cPPT e CTS de um retrovirus, em que as ditas regiões cPPT e CTS induzem uma estrutura de ADN de cadeia tripla ao indivíduo numa quantidade suficiente para resultar na expressão da dita proteína terapêutica numa quantidade suficiente para tratar a doença ou desordem. 0 tratamento pode ser profilático, de melhoria, ou curativo. 0 processo pode tratar uma doença ou desordem sanguínea, uma doença ou desordem do cérebro ou do sistema nervoso, ou uma doença ou desordem do desenvolvimento. Técnicas para introduzir e/ou expressar genes in vivo são conhecidas do perito na técnica. 0 médico pode selecionar a técnica mais adequada para a dada proteína ou tecido ou célula alvos.

Em conformidade, o pedido descreve um processo para tratar um hospedeiro compreendendo o uso de um vetor retroviral contendo uma sequência de ADN de três cadeias induzido pelas regiões cPPT e CTS de um lentivírus, que é capaz de induzir uma elevada taxa de entrada de vetor de ADN num núcleo de uma 23 célula hospedeira, ou capaz de aumentar a taxa de importação de vetor de ADN. 0 pedido também divulga um estojo. 0 estojo pode conter pelo menos um ácido nucleico, pelo menos um vetor, ou pelo menos um virus, ou pelo menos uma célula como aqui descrito, ou uma combinação de quaisquer ou de todos dos anteriores. 0 estojo pode fornecer cada um dos modos de execução do invento anteriores juntamente numa composição única ou separadamente, como por exemplo, em diferentes recipientes. Em modos de execução, o estojo inclui alguns ou todos os reagentes e provisões necessários para usar os ácidos nucleicos, vetores, virus, e células para o propósito desejado. 0 presente invento divulga um mecanismo original de importação nuclear de VIH-1 com um papel crucial de uma estrutura de ADN de cadeia tripla, o ADN triplex, neste mecanismo. 0 VIH-1 desenvolveu uma estratégia de transcrição reversa complexa, pela qual um evento de deslocamento de cadeia central, consecutivo à iniciação e terminação centrais da transcrição reversa, cria um ADN triplex no centro de moléculas de ADN linear do VIH-1 não integradas. Este ADN triplex atua por sua vez como um determinante cis-ativo da importação nuclear do genoma de VIH-1. 0 invento mostra que a iniciação e terminação centrais, dois passos distintos da transcrição reversa do VIH-1, são responsáveis pela capacidade do VIH-1 em infetar células alvo sem-divisão.

Os exemplos mostram adicionalmente que a falta do ADN triplex conduz a um virus que é quase não-infecioso em células com ou sem-divisão. Embora as mutações no cPPT não afetem a taxa de síntese de ADN virai ou a sua capacidade para integrar in vitrOf a maioria das moléculas de ADN retrotranscritas do vírus mutantes cPPT acumulam-se ao longo do tempo como ADN linear não integrado. Ao invés, o ADN linear do vírus do tipo selvagem é quase completamente processado em provírus integrados e ADN circular. Os perfis de ADN intracelular dos vírus mutantes cPPT apontam para um defeito de importação nuclear, o ADN virai acumula-se como moléculas lineares como consequência da sua falta de acesso ao compartimento nuclear onde poderia integrar ou circularizar. Um defeito tardio de importação de ADN virai, afetando mais provavelmente a translocação através do NPC, é demonstrado por fracionamento de células infetadas e visualização direta (FISH) do ADN virai intracelular. As moléculas de ADN linear defeituosas em triplex associam-se com a membrana nuclear.

Os exemplos centram-se na análise de vírus mutantes cPPT, que são caracterizados pela ausência de um ADN triplex central. A maioria das experiências aqui apresentadas também foram conduzidas em vírus mutante CTS previamente descritos (Charneau et al. , 1994), com os mesmos resultados (dados não mostrados). No vírus mutante CTS, a transcrição reversa produz moléculas de ADN linear contendo sobreposições de cadeia positiva maiores, aleatoriamente distribuídas, comparado ao ADN triplex central discreto do vírus do tipo selvagem. Assim, não apenas a presença do ADN triplex, mas também a sua integridade estrutural, é importante para a importação nuclear de ADN do VIH. 0 invento mostra que o ADN triplex é operativo no contexto de um sistema vetorial baseado no VIH-1. A sua inserção num vetor destituído do triplex reverte num defeito forte de importação nuclear do vetor de ADN para níveis de importação nuclear do tipo selvagem. 0 ADN triplex central é um determinante de importação nuclear 25 comum dos lentivírus. A localização do ADN triplex central foi precisamente definida no caso do VIH-1. 0 deslocamento da cadeia central começa no primeiro nucleótido a seguir à sequência cPPT (Charneau e Clavel,1991) e termina em geral 99 nucleótidos a jusante, no sitio ter2 da sequência CTS (Charneau et al. , 1994). A configuração tridimensional das três cadeias de ADN do triplex é para já desconhecida. Não obstante, a presença de um ADN triplex no centro do genoma pode ser generalizada a todos os lentivírus. Uma cópia central de PPT é uma característica comum de todos os genomas lentivirais e um elemento de terminação CTS putativo, revelado pela presença de tratos (A)n e (T)n, também existe aproximadamente 100 nucleótidos a jusante (Charneau et al., 1994). 0 ADN triplex central do lentivírus ungulado EIAV foi recentemente caracterizado (Stetor et al., 1999). Uma descontinuidade da cadeia central no ADN do vírus VISNA, referido como uma abertura, mas mais provavelmente um corte resultante do deslocamento da cadeia central, foi revelado pela clivagem com nuclease SI (Harris et al., 1981). Uma vez que a replicação independente da mitose foi descrita para a maioria dos lentivírus (Gartner et al., 1986; Thormar, 1963), o papel do ADN triplex na importação nuclear aqui descrito para o VIH-1 pode ser generalizado a todos os lentivírus.

Sem ser limitante, o invento proporciona uma hipótese mecanicista para o papel do ADN triplex central na importação nuclear do VIH-1 como se segue: Uma estrutura de ADN de cadeia tripla atuando como um determinante cis da sua importação nuclear é um novo fenómeno biológico sem contrapartidas celulares ou virais conhecidas. Qualquer hipótese de um mecanismo molecular que descreve o papel do ADN triplex central na importação nuclear do VIH é então especulativa. O triplex central poderá atuar como um 26 determinante virai para a iniciação da incorporação do filamento de ADN do VIH pelo poro nuclear. Tal poderá ser alcançado por interação direta do ADN triplex com componentes do poro, ou alternativamente através da interação do triplex com proteínas celulares ou virais que se movem entre o citoplasma e o núcleo da célula hospedeira e podem arrastar o genoma do VIH para o núcleo. A translocação do genoma do VIH de 9,7 kb através de um poro nuclear de diâmetro máximo de 26nm deve ocorrer numa orientação específica, após reconhecimento de uma extremidade do filamento de ADN do VIH-1 para iniciar a incorporação. Uma situação semelhante surge na exportação nuclear do ARN mensageiro, onde a incorporação do filamento de ARN através do poro é guiada pela estrutura 5'Cap (Hamm e Mattaj, 1990).

Embora a conformação de PICs do VIH-1 não seja bem conhecida, foi estabelecido que a ligação das extremidades do ADN linear ocorre conjuntamente, provavelmente após a dimerização das proteínas integrase ligadas nas extremidades das LTRs (Miller et al. , 1997) . De forma interessante, as sequências cis-ativas cPPT e CTS são encontradas numa posição central em todos os genomas lentivirais. Uma estrutura lógica para PICs lentivirais seria um filamento de ADN duplo, simetricamente dobrado em ambos os lados do triplex central pela dimerização da integrase (Figura 6B) . 0 triplex constituiria então um vértice de um PIC do VIH-1 filamentoso e o dímero de integrase o vértice oposto. Em PICs mutantes de cPPT, a ausência de um ADN triplex conduziria à sua falta de reconhecimento pela maquinaria do poro nuclear ou pelas proteínas vai-vém. A identificação dos ligandos de proteínas do ADN triplex central promete ser de importância principal tanto para a nossa compreensão da importação nuclear de PIC 27 do VIH-1 como para o eventual desenvolvimento de drogas que marcam este passo da replicação do VIH.

Outra hipótese mecanicista para explicar as propriedades dos vírus mutantes do triplex envolveria um defeito na maturação de cápsides de VIH em PICs, antes da translocação de ADN virai no núcleo. De acordo com este modelo, o ADN virai defeituoso em triplex permaneceria incorporado como cápsides virais integrantes, incapaz de translocação. A transcrição reversa retroviral não ocorre em elevada diluição dos componentes virais no citoplasma de células infetadas, mas requer o ambiente estrutural de um complexo de transcrição reversa onde os componentes estão confinados num conjunto de proteínas da cápside. 0 tamanho da cápside do VIH excede o diâmetro de exclusão máximo de um poro nuclear (Dworetzky et ai., 1998; Gelderblom,1991). Então, antes do ADN virai poder entrar no núcleo, os complexos de transcrição reversa do VIH têm que sofrer maturação em PICs de tamanho compatível com translocação através dos poros nucleares (Karageorgos et al., 1993) . A maturação de cápsides virais antes da translocação nuclear está bem estabelecida noutros sistemas virais nos quais o ciclo de replicação envolve a translocação do ADN do genoma através da membrana nuclear da célula hospedeira (Whittaker e Helenius, 1998). Ao passo que a transcrição reversa dentro das cápsides virais foi fisicamente demonstrada para MLV (Bowerman et al. , 1989), tal ainda não foi possível para o VIH-1 devido possivelmente à fragilidade das cápsides do VIH-1 (Borroto-Esoda e Boone, 1991). 0 complexo da transcrição reversa do VIH contém numerosas cópias da polimerase RT (aproximadamente 30 a 50 por cápside) (Panet et al., 1975). Devido à importante distribuição da transcriptase reversa do VIH-1, uma elevada estequiometria da enzima para o modelo de ARN virai é necessária para superar 28 um número de passos limitantes da transcrição reversa tais como pausas de transferência ou de polimerização de cadeia durante a síntese da cadeia positiva e negativa e formação precisa do triplex central (Klarnann et al., 1993; Charneau et al.r 1994). Tal sugere fortemente que a terminação central, o último evento da transcrição reversa lentiviral, ocorre numa estrutura da cápside integral. A terminação central, que marca o fim da síntese de ADN virai, pode ser um sinal necessário para a eliminação do ADN da cápside virai e a sua subsequente translocação no núcleo.

Estes dois mecanismos moleculares putativos para a importação nuclear mediada pelo ADN triplex do VIH-1 não são mutuamente exclusivos. A formação de um ADN triplex central poderá ativar a maturação de cápsides virais em PICs, tornando assim o ADN triplex acessível a proteínas vai-vém. 0 fato da integridade do ADN triplex central ser necessária para entrada do genoma do VIH-1 no núcleo da célula hospedeira implica que todo o processo de síntese de ADN, incluindo o último evento de deslocamento da cadeia central, é completado antes da translocação do PIC do VIH através do poro nuclear. A distribuição subcelular da transcrição reversa lentiviral encontra-se atualmente em debate e se a replicação do VIH ocorre num compartimento celular específico ainda é uma questão aberta. Com base em estudos de fracionamento, foi reportado que a transcrição reversa do VIH pode ocorrer completamente no núcleo da célula (Bukrinsky et al., 1993a). Contudo, técnicas de fracionamento não distinguem entre uma localização intranuclear e associação com a membrana nuclear. Outros autores propuseram, pelo contrário, que a associação do complexo de transcrição reversa com o citoesqueleto é um pré-requisito para a síntese 29 de ADN virai (Bukrinskaya et al. , 1998). Estudos de cinética da síntese de ADN do VIH-1 e da sua associação com a fração nuclear indicam que o último processo é muito mais rápido que 0 primeiro. A síntese de ADN do VIH-1 no curso de um único ciclo de transcrição reversa só alcança um planalto 24 a 48 horas após a infeção, ao passo que mais de 95% do ADN do VIH- 1 fraciona com os núcleos das células infetadas tão cedo quanto 4 a 6 horas após infeção (Barbosa et al., 1994). Então, favorecemos uma terceira possibilidade que a transcrição reversa lentiviral ocorre principalmente na vizinhança imediata da membrana nuclear e das NPCs, dentro da cápside virai, embora sejam necessárias experiências adicionais para confirmar esta hipótese. A mitose celular não proporciona uma via alternativa para a entrada de ADN virai defeituoso em triplex no núcleo de células hospedeiras. Os presentes Exemplos mostram que os vírus mutantes de triplex central são fortemente impedidos na sua capacidade de replicação não apenas em células alvo sem-divisão mas também com divisão. Reciprocamente, a inserção de uma sequência de ADN triplex num vetor baseado em VIH-1 estimula a transdução de genes tanto em células com divisão como sem-divisão. Tal difere do fenótipo publicado dos vírus mutantes MA/Vpr, onde um defeito na replicação foi descrito exclusivamente em células sem-divisão (Bukrinsky et al., 1993b; Heinzinger et ai., 1994; von Schwedler et al., 1994). Assim, os mutantes MA/Vpr comportar-se-iam como oncovírus mitose-dependentes. Uma possível explicação para o comportamento diferente dos mutantes de triplex central é que estes vírus são defeituosos num passo tardio do processo de importação nuclear, por conseguinte, as moléculas de ADN deficientes em triplex associam-se com a membrana nuclear. Esta associação íntima persiste durante a mitose. 0 ADN virai 30

mutante pode ser incorporado em vesículas da membrana nuclear mitóticas, onde não consegue alcançar os cromossomas celulares, tal como reportado no caso de proteínas NLS-LacZ (Bonnerot et al. , 1987) . As mutações em NLS celular, que inibem interações com as carioferinas, contudo, são conhecidas por induzir a acumulação citoplasmática da proteína mutada (Kaldemn et al., 1984; Lanford e Butel, 1984) . Assim, as mutações nas sequências NLS contribuem para as propriedades cariofílicas de PICs do VIH-1 devem induzir a retenção citoplasmática do ADN virai, como previamente sugerido (Gulizia et al., 1994). É então possível que os PICs dos vírus mutantes MAIVpr alcancem os cromossomas celulares após rompimento da membrana nuclear durante a mitose. Não obstante, não existe ainda evidência experimental direta para uma via de importação nuclear dependente da mitose de ADN de genoma lentiviral. Como o fenótipo publicado de vírus mutantes MA/Vpr deve ser visto com alguma precaução, a mesma precaução deve ser aplicada à hipótese inicial que uma deficiência na importação nuclear em lentivírus deve conduzir a um defeito de replicação exclusivamente em células sem-divisão. Se os lentivírus podem adotar uma estratégia de importação nuclear dependente da mitose, ou se a importação nuclear ativa de genomas lentivirais ocorre tanto em células com divisão como sem-divisão, permanece uma questão aberta. 0 presente pedido divulga desenhos para vetores lentivirais. Uma vez que a infeção de células alvo sem divisão por lentivírus assenta no seu uso de uma via de importação nuclear ativa, é importante manter os determinantes da importação nuclear lentiviral em elementos vetoriais derivados. Elementos vetoriais retrovíricos clássicos são vetores de substituição nos quais as sequências completas de codificação virais entre as LTRs são deletadas e substituídas 31 de vetores

No caso pelas sequências de interesse, lentivirais, esta estratégia clássica conduz à deleção das sequências cis-ativas centrais cPPT e CTS. 0 papel importante do triplex na importação nuclear do VIH implica que tais elementos vetoriais de substituição não são ótimos. Assim, a inserção do ADN triplex do VIH no vetor de substituição HR GFP (Naldini et al., 1996) aumentou a sua eficiência de transdução de gene por complementação de um defeito de importação nuclear do genoma do vetor HR a uma taxa de importação de ADN próxima da do VIH-1 do tipo selvagem. É de salientar que ao passo que os vetores de VIH a que falta um ADN triplex ainda sejam capazes de transdução de gene (Figuras 2C, 2D) , a replicação residual dos virus mutados em cPPT está ausente ou é extremamente baixa (Figuras 6A, 6B) .

Uma explicação possível é que a importação nuclear independente do triplex pode ocorrer no caso de um genoma de vetor pequeno (aproximadamente 4 kb para HR-GFP), mas a presença de um ADN triplex será necessária para a importação do genoma do VIH-1 nativo de 9,7 kb. Na realidade, foi divulgada a importação nuclear ativa, se relativamente ineficaz, de moléculas de ADN tão grandes quanto 3 a 4 kb (Hagstrom et al., 1997).

As sequências cis-ativas responsáveis pela formação do ADN triplex encontram-se no centro de todos os genomas lentivirais. Esta posição central pode ter-se desenvolvido por causa das suas implicações estruturais para a conformação de PICs, na medida em que as dobras simétricas dos braços esquerdo e direito da molécula de ADN linear ao redor do triplex podem ser necessárias para sua a incorporação eficaz através dos NPCs (Figura 7B) . Se tal for verdade para os vírus, então também poderá ser necessária uma posição central 32 do ADN triplex para a importação nuclear eficaz de genomas de vetores.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Procedimentos Experimentais. Células

As células MT4 são células humanas CD4+ T transformadas com HTLV-1 que permitem infeção por VIH-1 citopática aguda (Harada et al. , 1985) . As células H9 são menos permissivas a VIH mas permitem a produção crónica após infeção. As células MT4 e H9 foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com soro de bezerro fetal a 10% (FCS) . Os linfócitos do sangue periférico (PBLs) foram obtidos de dadores saudáveis, estimulados com lpg/ml de fito-hemaglutinina (Wellcome), e mantidos na presença de Interleucina-2 (10% lymphocult; Biotest Diagnostics). As células 293T foram crescidas em meio DMEM suplementado com FCS a 10%. As células indicadoras P4 são células HeLa CD4+ VIH infetáveis que transportam o gene LacZ sob controlo da LTR do VIH-1 (Charneau et al., 1994). As células P4 são crescidas em meio DMEM suplementado com FCS a 10% e 500pg/ml de G418.

Recolha e fracionamento de células.

Amostras de sangue do cordão foram recolhidas com o consentimento das mães. Células CD34+ foram purificadas como previamente descrito (Robin, C. et ai., 1999) usando o sistema de separação de gota imuno-magnético miniMACS (Milteny Biotec) . A pureza de células de CD34+ separadas por 33 gotas foi superior a 75%. As frações CD34+CD381o/- foram adicionalmente purificadas por seleção de células com um FACS VantageTM equipado com um laser de árgon ionizado (Becton Dickinson), usando anticorpos monoclonais de murino (MoAbs) dirigidos contra CD34-PE-Cy5 (Immunotech) e CD38-PE (Becton Dickinson). As células CD34+ foram ou congeladas em soro de bezerro fetal (FCS, Células Estaminais) contendo DMSO a 10% (Sigma) ou usadas imediatamente.

Elementos de ADN

Plasmídeos provirais:

Mutagénese dirigida foi executada como previamente descrito (Kunkel, 1985) em M 13mp 18 transportando uma inserção EcoRI de 1,1 kb (4684 a 5779) do clone molecular infecioso pLAl3. Os Iniciadores mutagénicos eram como se segue: cPPT-AG 5'pCAAlTITAAAAGAAGAGGGGGGAIT 3' (SEQ ID NO:

D cPPT-D: 5'pATTCATCCACAACTTCAAGCGCCGCGGTGGTATTGGGGGGTAC 3 ' (SEQ ID NO: 2) . Os pcPPT-AG, pcPPT-D, pcPPT-25 e pCTS foram construídos por retro-clonagem do fragmento EcoRI mutado no pLAl3.

Vetores plasmídícos:

Os vetores plasmídícos foram derivados de HR'CMVLacZ (Naldini et al., 1996). O gene repórter LacZ foi substituído pelo gene EGFP (Clontech) . O gene EGFP foi amplificado por PCR usando a polimerase Pfu (Stratagene) 34 do plasmídeo pEGFP-Nl, adicionando sítios de restrição BamHI e Xhol nas extremidades 5' e 3' respetivamente. Os iniciadores de PCR eram como se segue:

Bam GFP: 5'CC GGATCC CCA CCG GTC GCC ACC 3 ' (SEQ ID NO: 3) Xho GFP: 5'CC CTCGAG CTA GAG TCG CGG CCG 3 ' (SEQ ID NO: 4) . 0 vetor HR GFP foi construído por retro-clonagem deste fragmento de PCR nos sítios BamHI e Xhol do pHR 'CMVLaeZ, substituindo a ORF de LacZ com EGFP TRIP AU3 CMV GFP e TRIP AU3 PL CMV GFP: Primeiro , um subclone contendo uma única LTR foi construído e designado pUC LTR. 0 fragmento Kpnl/Xbal de TRIP GFP abrangendo a sua 3'LTR foi clonado no pUC18. Em seguia o sítio EcoRI foi destruído por preenchimento, criando o vetor pUC LTR RI-. PCR divergente foi executada no pUC LTR RI- com o objetivo de amplificar todo o plasmídeo com exceção do promotor e do amplificador da sequência U3. Os iniciadores foram:

DU3- : 5'CGGAATTCGGATCCGCGGCCGCATCGATCTTGTCTTCGTTGGGAGTG 3 ' (SEQ ID NO:5)

DU3+: 5'CGGAATTCAGCCGTCTCGAGAGATGCTGCATATAAGCAGC 3' (SEQ ID NO:6).

Os iniciadores contêm os sítios de restrição a serem inseridos em vez da sequência U3 incluindo o sítio EcoRI presente em cada iniciador. 0 produto de PCR foi digerido com EcoRI e em seguida usado para transformar bactérias 35 competentes. 0 plasmídeo assim construído foi designado por pLTR AU3 RI-. 0 poliligador inserido em vez da sequência U3 no pLTR AU3 RI-é:

Clal-Notl-BamHI-EcoRI-MluI-XhoI. 0 plasmídeo TRIPAU3 PL GFP foi construído substituindo o fragmento Kpnl/Nhel de TRIP GFP contendo a 3'LTR com o fragmento Kpnl/Xbal do pLTR AU3 RI- (os produtos de restrição Nhel e Xbal são compatíveis,) . Em seguida o poliligador (PL) foi deletado do pLTR AU 3 RI- por digestão com Clal/Xhol e preenchimento. 0 plasmídeo TRIP Δυ3 GFP foi construído por troca do fragmento Kpnl/Nhel de TRIP GFP com o fragmento Kpnl/Xbal de pLTR U3 ÀPL RI-.

Um fragmento de 178 pb do pLAl3 (4793 a 4971), abrangendo os cPPT e CTS, foi amplificado por PCR. Foram adicionados sítios de restrição NarI em 5' dos iniciadores com o objetivo de inserir este fragmento no sítio Ciai único de HR GFP:

Nar TRIP+: 5'GTC GTC GGCGCC GAATTC ACA AAT GGC AGT ATT CAT CC 3' (SEQ ID NO:7)

Nar TRIP-: 5'GTC GTC GGCGCC CCA AAG TGG ATC TCT GCT GTC C 3' (SEQID NO:8) A inserção desta sequência triplex na orientação correta deu origem ao vetor plasmídico TRIP GFP, e um TRIPinv GFP na orientação inversa. Alternativamente, o mesmo fragmento triplex foi amplificado dos plasmídeos pcPPT-AG, pcPPT-D, pcPPT-225, 36 e pCTS para gerar vetores incluindo as mesmas mutações no cPPT ou no CTS como os vírus correspondentes. TRIP EFla GFP e TRIP Δυ3 EFla GFP: 0 promotor do CMV de TRIP GFP foi substituído pelo promotor EFla. A sequência triplex e o promotor EFla foram em primeiro lugar separadamente amplificados, com iniciadores que se sobrepunham. A sequência triplex foi amplificada com os iniciadores Nar TRIP+ e Mlu TRIP- na matriz pLai e o promotor EFla foi amplificado na matriz pEFpgkneo com os iniciadores Mlu EF1+ e Bam EF1-.

Nar TRIP+: 5'GTC GTC 3GGCGCC GAATTC ACA AAT GGC AGT ATT CAT CC 3' (SEQ ID NO:9)

Mlu TRIP-: 5'AGC CTC ACG ACGCGT AT CAG CCA AAG TGG ATC TCT GCT G 3' (SEQ ID NO: 10)

Mlu EF1+: 5' CTG AT ACGCGT CGT GAG GCT CCG GTG 3' (SEQ ID NO: 11)

Bam EF1-: 5'CG GGATCC TGT GTT CTG GCG GCA AAC3' (SEQ ID NO: 12)

Em seguida foi executado um segundo ciclo de PCR numa mistura dos dois primeiros produtos de PCR, usando os iniciadores externos Nar TRIP+ e Bam EFI-. A sequência triplex e o promotor EFla ficaram juntos por esta técnica. O plasmideo TRIP EFla GFP foi construído substituindo o fragmento EcoRI/BamHI de TRIP GFP contendo a sequência triplex e o promotor do CMV pelo produto de PCR TRIP EFla digerido com EcoRI/BamHI (o iniciador Nar TRIP+ possui um sítio EcoRI na sua extremidade 5'). 37

Para construir o plasmídeo TRIP Δυ3 EFla GFP, o fragmento EcoRI/BamHI do TRIP EFla GFP contendo a sequência triplex e o promotor EFla foram inseridos em TRIP Δυ3 GFP em vez do fragmento EcoRI/BamHI contendo a sequência triplex e o promotor do CMV.

Produção de vírus e de vetor

Para as investigações ilustradas nas Figuras 1-6, foram produzidos vírus por transfeção transitória de células HeLa pela técnica de co-precipitação com fosfato de cálcio. As partículas vetoriais foram produzidas por co-transfeção transitória de 293T pelo vetor plasmídico, e plasmídeo de encapsidação (p8.2) e um plasmídeo de expressão envelope VSV (pHCMV-G, (Yee. et al., 1994)), como previamente descrito (Naldini. et al., 1996). Todos os sobrenadantes de vírus e de vetor foram tratados com DNasel (1 μg/ml na presença de MgCl2 ΙμΜ) durante 15 minutos a 37°C.

Produção de partículas de vetor lentiviral

Para as investigações ilustradas nas Figuras 7-9, foram produzidos vírus por co-transfeção transitória de 293T pelo vetor plasmídico, um plasmídeo de encapsidação (p8.2) e um plasmídeo de expressão envelope VSV (pHCMV-G, (Yee. et al., 1994)), como previamente descrito (Naldini. et al., 1996).

Todos os sobrenadantes de vírus e de vetor foram tratados com DNasel (1 pg/ml na presença de MgCl2 ΙμΜ) durante 15 minutos a 37°C.

Titulações de vírus e de vetor 38

Para as investigações ilustradas nas Figuras 1-6, foi executado um ciclo de titulação de virus em triplicado por infeção de células P4 plaqueadas em placas de 96 poços, com quantidades equivalentes de partículas (lng de antigene virai p24 por poço), na presença de DEAE-dextrano 20 μΜ. 0 inibidor de protease Saquinavir (Roche) foi adicionado (ΙμΜ) ao longo da experiência, para restringir a análise a um único ciclo de infeção. A mitose celular foi inibida por tratamento com aficolina (8μΜ), no dia anterior à infeção. A atividade da β-Galactosidase foi medida 48 horas após a infeção usando um ensaio de gene repórter β-Gal quemiluminescente (Boehringer). Células HeLa foram infetadas em triplicado com quantidades equivalentes de partículas de vetor (5ng P24 por poço). A 48 horas pós-transdução, o meio foi substituído por 200μ1 de TNB (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM) e a fluorescência das células vivas foi quantificada usando um fluorímetro de microplacas (Victory Wallac) e filtros adaptados a EGFP (excitação: 485 nm, emissão: 520 nm).

Protocolo de transdução

Para as investigações divulgadas nas Figuras 7-9, revestiram- se placas de cultura de tecido de 24-ou 96-poços com fibronectina (Bio-Whittaker Europa) de acordo com as instruções do fabricante. Populações de CD34+ humanas foram plaqueadas, imediatamente após purificação ou descongelamento, a 2 a 3 X 105 células/ml em meio isento de soro (IMDM contendo 11,5μΜ a-tioglicerol, BSA a 1,5% (ambos da Sigma), lípidos sonicados e transferrina humana ferro- saturada) ou a-MEM contendo FCS a 10% na presença de 4pg/ml de polibreno (Sigma) e 4 citocinas humanas (hu) recombinantes (r): Fator de Célula Estaminal-rhu (SCF, lOOng/ml, fornecido 39 por Amgen), Ligando-Flt3 (FL, lOOng/ml, Diaclone), IL-3 (60ng/ml, Sandoz), e Fator de Crescimento e Diferenciação Megacarióocito-rhu peguilado- (PEG) (MGDF) (10 ng/ml, Amgen), e virus lentivirais concentrados à concentração de 100 ng de P24 viral/ml durante 24 horas. As células foram então lavadas e cultivadas em condições linfo-mielóides (em placas de cultura de tecido de cultura pré-revestidas com células MS5 em RPMI suplementado com soro humano a 10%, FCS a 5% e as seguintes 7 citocinas: rhu-SCF (50ng/ml), rhu-FL (50ng/ml), PEG-rhu-MGDF (50ng/ml), rhu-IL-3 (lOng/ml), rhu-IL-2 (5 ng/ml), rhu-IL-15 (lOng/ml), e rhu IL-7 (20ng/ml) (sendo as três IL- da Diaclone) durante 48 horas. Em seguia, a expressão de eGFP na fracção celular CD34+ foi avaliada usando um CD34-PE-Cy5 MoAb (Immunotech). A análise foi efetuada num Varrimento FACS usando o software Cellquest (Becton Dickinson).

Ensaios clonogénicos e cultura a longo prazo (LTC)

Os progenitores clonogénicos de células CB frescas humanas foram analisados em FCS a 30% contendo metilcelulose a 0,8%, BSA desionizada a 1%, e 2-mercaptoetanol 10-4M, na presença de rhu-SCF 50ng/ml, rhu-GCSF lOng/ml (Amgen), rhu-IL3 2ng/ml, e rhu-EPO 2U/ml (Amersham). Células da medula óssea (BM) de ratinhos NOD-SCID enxertados foram plaqueadas na presença de rhu-SCF, -IL-3, -EPO, e -GM-CSF (10 ng/ml) como descrito (Pflumio, F. et al., 1996). Os progenitores foram marcados no dia 14-16 de acordo com critérios já descritos (Croisille L. et al. 1994) e a expressão de EGFP observada por microscopia de fluorescência usando um Microscópio Nikon Eclipse TE300. A Cultura a Longo Prazo (LTC) foi executada como previamente descrito (Issaad C. et al., 1993) ou em diluição limite em placas de 96-poços usando a vantagem de FACS equipada com um 40 ACDU (BD) ou em cultura em massa em placas de 24-poços contendo uma camada confluente da linhagem celular estromal MS5 murina. Após 5 a 10 semanas, as células aderentes e não-aderentes foram colhidas e plaqueadas para o ensaio clonogénico. Para ambos os ensaios clonogénico e LTC-IC, foram selecionadas individualmente colónias e congeladas antes de análise por PCR.

Análise PCR

Foi levada a cabo análise de PCR em ADN genómico obtido de colónias derivadas de progenitores clonogénicos ou de clones crescidos em culturas linfo-mielóides. Foram lisadas células e proteínas digeridas em 20μ1 de tampão contendo proteinase K (10pg/ml), KC1 (50mM), Tris-HCl (lOmM, pH 8,3), MgCl2 (2,5mM), gelatina (0,1 mg/ml), NP40 (0,45%), e Tween 20 (0,45%). Foi executada amplificação de ADN genómico com o iniciador sentido 5'CCCTCGAGCTAGAGTCGCGGCCG 3' (SEQ ID NO:13) e o iniciador antisentido 5'CCGGATCCCCACCGGTCGCCACC 3' (SEQ ID NO:14) à temperatura de cozimento de 62°C. A amplificação resultou num produto de 800 pb.

Análise de ADN virai e vetorial Células P4 ou MT4 foram infetadas a uma elevada multiplicidade de vírus (150 ng de p24 por 106 células) ou transduzidas por vetores (25 ng de p24 por 106 células), na presença de 20 pg/ml de DEAE-dextran no caso de células P4. O ADN de células infetadas ou transduzidas foi extraído a vários tempos, restringido, e analisado por Southern blot. Em todos os casos, o ADN plasmídico bacteriano contaminante foi removido da análise por digestão com Dpnl. 0 ADN de células infetadas foi digerido por MscI e Xhol e o ADN de células 41 transduzidas por de EcoNI, Avall e Xhol. Após eletroforese e transferência de 10 pg de ADN digerido, as membranas foram hibridizadas com sondas de ADN marcado com [ P] aleatoriamente iniciado (Rediprime II, Amersham). A sonda de ADN especifica de vírus foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo modelo pLAl3 usando os iniciadores seguintes: 5Msc: 5' AGA AGA AAT GAT GAC AGC ATG 3' (SEQ ID NO: 15) 3Msc: 5' TGC CAG TTC TAG CTC TG 3' (SEQ ID NO: 16). 0 fragmento de ADN de 1680 pb resultante (da posição 1818 a 3498 do pLAl3) sobrepõe o sitio de restrição MscI na posição 2655 de genomas virais. A sonda de vetor foi sintetizada por PCR em pTRIP GFP com os iniciadores: 5EcoNI: 5'CAG GGA CTT GAA AGC GAA AG 3' (SEQ ID NO:17)

3EcoNI: 5'GCT TGT GTA ATT GTT AAT TTC TCT GTC 3' (SEQ ID NO:18) A sonda de vetor é um fragmento de 1027pb (da posição 649 a 1676 do pTRIP GFP) e sobrepõe o sítio EcoNI na posição 1156 de genomas de vetor.

Para analisar a quantidade de ADN retrotranscrito do tipo selvagem e vírus PPT-AG e cPPT-D, foi seguido um protocolo semelhante exceto que o ADN extraído às 12 horas pós-infeção foi restringido por MscI e Dpnl. A sonda usada para hibridação foi o fragmento interno MscI de 1,9 kb do pLAl3. Os sinais de hibridação foram quantificados usando um "phosphorimager" (Molecular Dinamics) e o software ImageQuant. 42

Hibridação in situ Células P4 foram infetadas a elevada multiplicidade (2pg de antigene p24 de cada vírus por 106 células) , na presença de 20 pg/ml de DEAE dextrano. Às 24 horas pós-infeção, as células foram tripsinizadas, extensivamente lavadas (para remover partículas virais adsorvidas na membrana plasmática), e re-plaqueadas em lâminas de vidro em placas de 24 poços. As células foram crescidas durante 48 horas adicionais e fixas em PFA/PBS a 4% durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas em PBS e permeabilizadas por Triton 0,5%/Saponina 0,5% em PBS, durante 5 minutos à temperatura ambiente. As amostras desidratadas foram tratadas com RNase A (200pg/ml em 2X SSC) , uma hora a 37°C e pela proteinase K (6 yg/ml em PBS), aproximadamente 5 minutos. As amostras foram desnaturadas por incubação em formamida desionizada a 70%/2X SSC durante 2 minutos a 70°C seguido de formamida desionizada a 30%/2X SSC durante 2 minutos a 70°C. As hibridações foram executadas durante a noite a 37°C usando um plasmídeo pLAl3 marcado com biotina traduzido por corte (formamida desionizada a 50%, sulfato de dextrano a 10%, 10pg/ml de ADN de esperma de salmão, Tween 20 a 0,1% em 2X SSC). As amostras foram extensivamente lavadas (lavagem em série em 2X SSC/formamida a 50% à temperatura ambiente e em seguida a 50°C) . A deteção de sondas hibridizadas foi executada usando o estojo Tyramid-Streptavidin TSA-Direct (NEN) de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 2: A iniciação central da transcrição reversa é um passo essencial do ciclo replicativo do VIH-1

Num trabalho anterior, mostrámos que as mutações conservativas nas sequências cPPT e CTS prejudicaram 43 seriamente a replicação de vírus (Charneau et al., 1992; Hungnes et al., 1992). Um vírus mutante de iniciação central (cPPT-225) e um vírus mutante de terminação (CTS) apresentaram respetivamente uma diminuição de quatro vezes e dez vezes em inf ecciosidade numa experiência de uma única titulação. Com vista a inativar a função da cPPT, foram introduzidas mutações semi-conservativas na região de codificação da integrase de sobreposição. No vírus cPPT-D mutante, a alteração de lisina para arginina na posição 188 permitiu a introdução de um total de 10 mutações na sequência de 19 nucleótidos do iniciador PPT (Figura IA) (Huber e Richardson, 1990). 0 efeito desta alteração de aminoácido na replicação do vírus foi conferido por construção do vírus mutante cPPT-AG de controlo, no qual uma única mutação de purina para purina, com respeito à natureza polipurina de cPPT, induziu a mesma alteração de aminoácido. A presença de um ADN triplex no ADN retrotranscrito de vírus do tipo selvagem e de cPPT-AG, e a sua ausência do ADN do vírus cPPT-D, foi confirmada por clivagem por nuclease SI de ADN "Hirt" de células infetadas como previamente descrito (Harris et al., 1981; Charneau e Clavel, 1991). A infecciosidade virai foi avaliada em primeiro lugar em experiências de replicação cinética clássica em cultura de células. Linfócitos de sangue periférico estimulados por PHA (PBLs) e células MT4 foram infetadas com números iguais de partículas virais, normalizadas de acordo com o teor dos sobrenadantes virais em proteína da cápside (p24), e a atividade da transcriptase reversa foi seguida ao longo do tempo nos sobrenadantes da cultura (Figura 1B). As curvas de crescimento dos vírus do tipo selvagem VIH-1 LAI e cPPT-AG de controlo foram semelhantes em ambos os sistemas celulares. 0 fato que a mutação K188R ocorre naturalmente em alguns 44 isolados de VIH-1, já sugeriu que tem pouco ou nenhum efeito nas funções da integrase e PPT. Ao invés, quando PBLs foram infetados com os virus mutantes cPPT-D, não foi detetada replicação durante os 15 dias de cultura. 0 mesmo foi verdade para células MT4, apesar da sua elevada suscetibilidade para infeção por VIH. Os vírus mutantes cPPT-D também não foram infeciosos em linhagens celulares imortalizadas tais como H9 ou CEM (dados não mostrados). A infecciosidade por virus foi então quantitativamente analisada por titulações com base num único ciclo de replicação (Figura 1C) . AS células indicadoras P4 (HeLa CD4 LTR-LacZ) (Charneau et al., 1994) foram infetadas com números equivalentes de partículas virais dos diferentes virus. Estas titulações de um ciclo confirmaram a perda quase completa de infecciosidade de vírus mutante cPPT-D. Em células P4, a infecciosidade do controlo cPPT-AG foi idêntica à do vírus do tipo selvagem, ao passo que a infecciosidade do mutante cPPT-D foi fortemente reduzida, para níveis perto da linha base. Os mesmos resultados foram obtidos em células P4 tratadas com afidicolina, sem divisão (Figura 1C, painel direito).

Estes resultados sugerem fortemente que a iniciação central da transcrição reversa é necessária para replicação de VIH em células sem capacidade de divisão bem como em células proliferativas.

Exemplo 3: A produção de vírus não é afetada por mutações em cPPT

Verificámos que as diferentes mutações introduzidas nos provírus plasmídicos cPPT-AG e cPPT-D não afetaram os últimos passos do ciclo replicativo. A produção virai foi 45 quantificada, de acordo com o teor em P24 dos sobrenadantes, após transfecções transitórias de células HeLa por plasmideos provirais. Constatou-se que a produção dos vírus mutantes cPPT não era significativamente diferente da dos vírus do tipo selvagem (Figura 2A) . Consequentemente a mutação K188R não afeta a última fase da replicação de VIH-1. Assim, o passo defeituoso envolvido no fenótipo dos vírus mutantes cPPT-D tem de preceder a expressão de ADN virai e tem de pertencer à fase precoce do ciclo replicativo do VIH.

Exemplo 4: As mutações no cPPT não afetam a taxa de transcrição reversa do genoma do VIH-1 0 efeito das mutações em cPPT na síntese de ADN virai foi avaliado por quantificação do ADN sintetizado num único ciclo de retrotranscrição (Figura 2B) . Um fragmento de restrição MscI interno do ADN virai de células infetadas foi detetado por Southern blotting e quantificado usando o fragmento de ADN de MscI correspondente como sonda. Uma vez que o fragmento de MscI interno é comum ao ADN proviral integrado e às moléculas lineares e circulares não integradas, a sua quantificação reflete a quantidade total de ADN virai, independentemente do seu estado integrado ou não integrado. Para limitar a análise ao primeiro ciclo de transcrição reversa, colheu-se ADN de células P4 infetadas 12 horas após

infeção, antes do início de um segundo ciclo de infeção. A quantidade total de ADN retrotranscrito num único ciclo de transcrição reversa foi a mesma após infeção com o cPPT-D mutante, o cPPT-AG de controlo ou o vírus do tipo selvagem. Estas experiências mostraram que, ao passo que mutações em cPPT abolem a replicação do vírus, elas não afetam a taxa de síntese de ADN. 0 defeito replicativo de vírus cPPT mutantes implica um passo subsequente para a síntese de ADN virai. 46

Exemplo 5: A falta de um ADN triplex central nao afeta a integração in vitro de PICs do VIH-1 A capacidade de integração in vitro de PICs do VIH-1 do tipo selvagem e de mutantes de iniciação central foi comparada (Figura 2C) usando um ensaio quantitativo de integração in vitro como descrito por Farnet (Farnet e Haseltine, 1990), com modificações menores. Uma vez que os complexos de replicação do VIH-1 residem apenas de modo transiente no citoplasma de células acabadas de infetar (Barbosa et al. , 1994), a preparação de quantidades suficientes de PICs do VIH requer infeção massiva e fracionamento celular em 4 a 6 horas. Tal foi alcançado por co-cultura de células H9 cronicamente infetadas por vírus do tipo selvagem ou cPPT-225 e células alvo HUT 78 não infetadas. O vírus mutante CPPT0225 (Figura IA) foi escolhido para estas experiências em vez do cPPT-D não infecioso, que não é capaz de estabelecer uma infeção crónica. A infecciosidade residual de vírus mutante cPPT-225 é baixa mas suficiente para permitir que se propague lentamente em culturas celulares (Charneau et al., 1992).

Isolaram-se PICs do VIH do citoplasma de células infetadas e incubou-se na presença de ADN alvo do plasmídeo Bluescript linearizado. A integração foi revelada pela presença de um fragmento de 12,7 kb, reativo para a sonda VIH-1, correspondendo ao tamanho esperado do genoma do VIH linear de 9,7 kb integrado no ADN alvo de 3 kb. A quantidade de ADN linear integrado no ADN plasmídico não diferiu entre os virus do tipo selvagem e cPPT 225 mutante (Figura 2C). Assim os PICs do VIH-1 do cPPT mutante retiveram a sua completa capacidade para integrar in vitro. O passo de replicação defeituoso do ADN triplex central de vírus 47 mutantes deve ocorrer após a transcrição reversa mas antes da integração do seu genoma de VIH linear na cromatina da célula hospedeira.

Exemplo 6: Importação nuclear enfraquecido de ADN triplex central de vírus mutantes

As experiências precedentes sugerem que o defeito replicativo de ADN triplex central de vírus mutantes estava relacionado com o acesso de PICs do VIH à cromatina do alvo celular. Consequentemente testámos a hipótese de um defeito de importação nuclear de ADN de vírus mutantes de cPPT. Os estudos da importação nuclear de PICs do VIH-1 são dificultados por falta de um ensaio quantitativo e reprodutível para importação nuclear ao nível do ADN virai. Uma vez retrotranscrito no citoplasma, o ADN linear retroviral é importado para o núcleo onde ou integra ou circulariza. 0 ADN circular retroviral não integrado, contendo uma ou duas LTRs, encontra-se exclusivamente no núcleo, e assim representam marcadores convenientes de importação nuclear de ADN virai. Para avaliar a importação nuclear de ADN de VIH, estudos prévios usaram amplificação por PCR de dois ADN circulares de LTR não integrado. Contudo, como aqui divulgado e por Barbosa et al., (1994), porque dois LTR circulares representam uma fração minuta do ADN de VIH em células infetadas, a sua deteção é muito sensível a alterações menores de fisiologia celular ou infecciosidade de vírus. Assim, projetámos um novo ensaio que permite um seguimento quantitativo por Southern blot da síntese, circularização, e integração de ADN de VIH.

Resumidamente, o ADN de células infetadas é preparado a vários tempos e digerido com MscI, uma enzima de restrição 48 que corta o genoma do VIH-1 duas vezes. Usando uma sonda de ADN gerada por PCR que sobrepõe exatamente o sítio 5'MscI, são reveladas várias bandas específicas (Figura 3A) . 0 fragmento MscI interno de 1,9 kb é comum a todas as espécies de ADN virai independentemente do seu estado integrado ou não integrado e a quantificação desta banda indica a quantidade total de ADN virai em células infetadas. Uma banda de 2,6 kb corresponde ao fragmento 5'MscI distai de ADN-VIH linear não integrado. Para minimizar a propensão de transferência devido ao grande tamanho de fragmentos específicos de ADN circular, o ADN é adicionalmente cortado com Xhol. Aparecem então um e dois LTR de ADN circular nas bandas 2,8 e 3,4 kb respetivamente. Uma vez que a sonda de ADN sobrepõe exatamente o sítio 5'MscI, a intensidade de cada banda é diretamente proporcional à quantidade das espécies de ADN virai correspondentes. A quantidade de ADN proviral integrado é calculada subtraindo da quantidade total de ADN virai os sinais de ADNs virai linear e circular não integrado. Uma quantificação paralela da mesma população de células infetadas foi executada após um fracionamento "Hirt" para separar ADN virai de baixa massa molecular não integrado de ADN proviral integrado de elevada massa molecular. Tal deu origem a resultados idênticos, validando assim o cálculo de subtração de um passo.

Como indicado pela cinética de acumulação de ADN virai total (fragmento interno de 1,9 kb), a síntese de ADN virai prosseguiu durante 24 a 48 horas após infeção, refletindo um processo de infeção assíncrono. As quantidades de ADN virai total de vírus mutantes cPPT-AG e cPPT-D foram semelhantes às de VIH-1 do tipo selvagem. Como previamente, as mutações em cPPT não influenciaram a taxa de síntese de ADN. Estavam presentes quantidades detetáveis de ADN linear não integrado 49 de comprimento total em células tão cedo quanto 6 horas após infeção (Figura 3B). Provírus integrados e ADN circular foram pela primeira vez detetados 12 horas após infeção. A integração e a circularização seguiram até à conclusão durante 36 horas adicionais.

No final de um ciclo de infeção, no caso do vírus do tipo selvagem, cerca de 55% do ADN virai tinha integrado no ADN da célula hospedeira, cerca de 35% tinha circularizado num círculo de LTR, e uma pequena fração inferior a 10% permaneceu na forma de ADN linear não integrado estável (Figura 3C) . Notavelmente, duas LTR de ADN circular, embora detetáveis 48 horas após infeção, estavam apenas presentes em quantidades traço. 0 ADN do vírus de controlo cPPT-AG foi processado de uma maneira bastante similar ao ADN do vírus do tipo selvagem.

No caso de vírus mutantes cPPT-D, foi evidente uma alteração acentuada no padrão de ADN virai intracelular, com uma acumulação clara e persistente de moléculas lineares não integradas. A 48 horas após infeção, apenas quantidades muito pequenas de uma LTR de ADN circular e ADN proviral integrado tinha sido gerada e mais que 90% do ADN mutante de cPPT-D permaneceu bloqueado na forma linear não integrada (Figura 3C) . É esperado que um defeito de importação nuclear diminua a proporção de espécies de ADN virai nuclear (provírus integrados e uma e duas LTR circulares) e para aumentar concomitantemente a proporção de moléculas de ADN linear não translocadas. Assim, o perfil de ADN intracelular de vírus mutantes cPPT-D sugere fortemente um defeito de importação nuclear de ADN virai. 50

Exemplo 7: ADN linear de ADN triplex central de vírus mutantes acumula na vizinhança da membrana nuclear

Para caracterizar adicionalmente o defeito de importação nuclear de ADN triplex central de vírus mutantes, abordámos as questões de se as moléculas de ADN linear mutadas acumulam ou não num compartimento subcelular particular. 0 processo de importação nuclear pode ser dividido em duas fases principais, condução do componente nuclear à membrana nuclear e a sua translocação pelo complexo de poros nucleares (NPC). Conduzimos em primeiro lugar um fracionamento nucleico/citoplasmático clássico de células infetadas, seguido por deteção por Southern blot de ADN virai. A totalidade de ADN virai de todos os vírus foi associada com os núcleos de células P4 infetadas, 24 horas após infeção (Figura 4A) , sugerindo que a condução de ADN de VIH para a membrana nuclear não foi afetada pela falta de um ADN triplex central.

Para confirmar que as moléculas de ADN triplex central deficientes acumulam na membrana nuclear, usámos hibridação in situ fluorescente (FISH) para visualizar diretamente a localização intracelular de genomas de VIH. As células P4 foram infetadas a uma elevada multiplicidade num ciclo de condições, hibridizadas com uma sonda de genoma de VIH-1 de comprimento total, e observadas por microscopia de deconvolução. Foram encontradas manchas específicas predominantemente no núcleo no caso dos vírus do tipo selvagem e cPPT-AG de controlo (Figura 4B). Uma vez que FISH não pode distinguir entre as diferentes espécies de ADN de VIH, estas moléculas de ADN virai intranucleares podiam ser provírus integrados ou ADN circular não integrado. Alguns genomas raros foram associados com a membrana nuclear e 51 provavelmente representavam o ADN linear residual detetado por Southern blotting ao mesmo tempo após infeção. Outras manchas associadas com a membrana plasmática derivaram mais provavelmente de partículas defeituosas adsorvidas na membrana contendo genomas parcialmente retrotranscritos (Lori et ai. , 1992) . Ao invés, os genomas de VIH encontravam-se predominantemente localizados na membrana nuclear e quase completamente ausentes do núcleo no caso de vírus mutantes de cPPT-D. Como o perfil de ADN do Southern blot indicou que praticamente todo o ADN de cPPT-D estava bloqueado na forma linear, podemos assumir que estes genomas de VIH associados com a membrana nuclear eram moléculas de ADN linear não integrado. Esta visualização direta de moléculas de ADN virai em células infetadas confirmou a associação do ADN virai de mutantes triplex centrais com a membrana nuclear.

As nossas experiências FISH sugerem que vírus mutantes cPPT são defeituosos na translocação do seu genoma pelos NPCs. Não obstante, a demonstração clara de um defeito de translocação, por localização de ADN virai mutante no lado citoplásmico de NPCs, não é acessível através de experiências FISH.

Concluímos destes resultados, como um todo, que o ADN triplex central de VIH-1, criado por passos de iniciação e terminação centrais durante a transcrição reversa, é importante para PICs do VIH-1 entrarem no núcleo da célula hospedeira. Na ausência de ADN triplex, a importação nuclear de ADN virai é gravemente prejudicada numa fase imediatamente antes ou durante a translocação do ADN do VIH-1 pelo poro nuclear.

Exemplo 8: Impacto do ADN triplex central na transdução de gene por um sistema de vetor baseado em VIH-1 52

Tendo identificado o ADN triplex central como determinante chave para a importação nuclear de VIH-1, testámos o efeito de inserir as sequências cis-ativas centrais de VIH-1 no vetor HR VIH-1 previamente descrito (Naldini et al., 1996) (Figura 5A) . Para monitorar a transdução de gene, foi adicionalmente inserido um gene que codifica a proteína fluorescente verde (GFP). 0 vetor contendo uma sequência de ADN triplex foi designada por TRIP GFP. Os controlos incluíram elementos similares com cPPT ou CTS mutados e uma região central do tipo selvagem inserida em orientação inversa e não-funcional (TRIPinv GFP) . A presença de um ADN triplex em vetor de ADN TRIP GFP retrotranscrito, e a sua ausência de HR GFP, TRIPinv GFP, e de vetores contendo uma versão mutada da sequência do triplex central, foi confirmada por clivagem com nuclease SI de ADN Hirt isolado de células transduzidas. 0 número de partículas de vetor produzidas por transfeção transiente foi normalizado antes da transdução de acordo com níveis de proteína da cápside (p24), atividade da transcriptase reversa, e da quantidade de ARN vetor genómico em sobrenadantes de células transfetadas. Foi obtida produção similar dos vários vetores, com uma correlação linear entre os três critérios de normalização (dados não mostrados). Assim a inserção da região central do genoma do VIH-1 no vetor HR não influenciou a taxa de encapsidação de ARN genómico. As células HeLa com ou sem divisão (tratadas com afidicolina), foram transduzidas com números equivalentes de partículas de vetor HR-GFP ou TRIP-GFP e a expressão de GFP foi monitorizada 48 horas depois por quantificação por fluorescência. A pseudotransdução da atividade de GFP devido à entrega direta de proteínas GFP a células alvo pelas partículas de vetor de fusão foi calculada da transdução de 53 células tratadas com um inibidor de RT VIH-1 (Nevirapin 1 pM, Boehringer Ingelheim) e esta linha base subtraída do sinal de fluorescência. A fluorescência não-específica devido a transfeção secundária causada por co-precipitação de ADN por cálcio/fosfato nos sobrenadantes do vetor foi eliminada por tratamento da reserva de vetor com DNasel antes da transdução.

Sob estas condições, a presença da sequência triplex no vetor VIH aumentou a transdução de GFP em células HeLa em mais de dez vezes (Figura 5B). Foi observado um aumento semelhante de transdução de gene noutras linhagens celulares alvo tais como MT4 ou 293T (dados não mostrados). Este efeito era perdido se a sequência triplex fosse inserida na orientação inversa (Figura 5B) ou mutada no cPPT (não mostrado).

Exemplo 9: A presença de um ADN triplex em vetores VIH-1 aumenta a taxa de importação nuclear de genoma de vetor para níveis do tipo selvagem

Era então de interesse determinar se o aumento em fluorescência de GFP induzida pela inserção de uma sequência triplex no vetor de VIH era devido ao seu efeito na importação nuclear de vetor de ADN. Para abordar esta questão, adaptámos o nosso ensaio de Southern blot quantitativo para ADN virai intracelular no sistema de vetor. 0 ADN de células transduzidas por vetor foi digerido com EcoNI e Avall para produzir um fragmento interno de 0,8 kb, e com Xhol. Usando uma sonda de ADN gerada por PCR sobrepondo-se exatamente ao sitio EcoNI, foram esperados sinais específicos para o genoma do vetor linear não integrado, e para uma e duas LTR de ADN circular a 1,2 kb, 1,4 kb, e 2 kb 54 respetivamente. 0 processamento do vetor de ADN foi analisado a vários tempos após transdução de células HeLa. A quantidade total de vetor de ADN sintetizado em células transduzidas foi comparável para vetores contendo ou a que faltava o ADN triplex (Figura 5C) . Uma vez mais, a inserção das sequências cPPT e CTS, em qualquer das orientações, no vetor HR não influenciaram a taxa de transcrição reversa do seu genoma. Após quantificação por "phosphorimager", constatámos o destino intracelular do ADN dos vetores HR-GFP e TRIPinv-GFP (Figura 5D) se assemelhar bastante ao do ADN do triplex central de virus defeituosos e ao vetor de ADN TRIP-GFP em se assemelhar ao ADN do virus LAI VIH-1 do tipo selvagem (Figura 3C).

Um defeito de importação nuclear de ADN foi evidente no caso dos vetores HR-GFP e TRIPinv-GFP. 0 ADN intracelular destes vetores foi caracterizado por uma forte acumulação de moléculas lineares não integradas, juntamente com pequenas quantidades de provírus integrado e uma e duas LTR circulares. Este perfil de ADN lembrava fortemente o do virus mutante cPPT-D. Na conclusão do processamento de vetor de ADN em células transduzidas, 70 a 80% do ADN dos elementos HR-GFP e TRIPinv-GFP permaneceram na forma de moléculas lineares não integradas, enquanto apenas 10 a 15% estavam presentes como não integrados em LTR circular e 5 a 10% como provirus integrados. Esta baixa mas detetável quantidade de vetor de ADN integrado responderia pela transdução de gene obtida usando vetores HR-GFP ou de TRIPinv-GFP.

Este ensaio quantitativo também mostrou que a inserção da sequência ADN triplex de VIH no vetor HR na orientação correta complementou a sua deficiência em importação nuclear 55 a níveis do tipo selvagem. 0 estado final do ADN de TRIP-GFP em células transduzidas foi semelhante ao observado com vírus VIH-1 do tipo selvagem: 50% ou mais do vetor de ADN integrou a cromatina da célula alvo, uma fração importante circularizou e algumas moléculas permaneceram como ADN linear não integrado (comparar Figura 5D e 3C). Ao invés, a inserção da sequência triplex no vetor HR a montante do promotor do CMV interno não influenciou a expressão de GFP ao nível transcricional. Tal foi conferido por transfeção de células HeLa com plasmídeos pHR-GFP, pTRIPGFP, e pTRIPinv-GFP e quantificação por fluorescência (dados não mostrados).

Pode ser deduzido destes resultados que o aumento na transdução de GFP obtida com o vetor TRIP-GFP é completamente imputável a forte estimulação da sua importação nuclear pela presença do triplex. Esta constatação realça novamente o papel importante do ADN triplex de VIH na importação nuclear de ADN virai e vetor.

Exemplo 10: Os vetores VIH-1 contendo a sequência de ADN triplex permitem uma transferência de gene eficiente em células estaminais hematopoiéticas

As figuras 7A e 7B ilustram os resultados de duas experiências de transdução com sucesso usando células CD34+ de cordão humano. Elas mostram que após um protocolo de transdução curto de 24 ou 60 horas, respetivamente 71,5% e mais de 90% das células CD34+ expressam fortemente a proteína repórter GFP. Esta expressão reflete transdução estável das células uma vez que a integração virai foi confirmada, pelo menos nas mesmas proporções, por ensaios de PCR em ADN extraído de colónias de célula derivadas de progenitores recolhidas 14 dias após terem semeado células em ensaio de 56 progenitor clonogénico. Foram obtidos resultados idênticos usando células CD34+ purificadas de fresco ou as mesmas células CD34+ que foram congeladas após purificação e descongeladas várias semanas depois para a experiência de transdução. Também obtivemos eficiências de transdução comparáveis usando outra fonte de células estaminais hematopoiéticas, células estaminais mobilizadas de sangue periférico (PBMC), recolhidas por "cytapheresis" após estimulação por citocina. As CD34+ PBMC também foram transduzidas imediatamente após purificação ou após um passo de congelamento/descongelamento com resultados idênticos. Usando cultura a longo prazo (LTC) e ensaios de repopulação de NOD-SCID mostrámos que transduzimos células tendo potencialidades linfo-mielóide múltiplas e a capacidade para repopular medula óssea de ratinho NOD-SCID 4 meses após enxerto. Estes ensaios funcionais representam as últimas experiências disponíveis, no momento, para avaliar a função de células hematopoiéticas humanas.

Exemplo 11: A presença da sequência de ADN triplex em elementos de vetor lentiviral estimula fortemente a transferência de gene para células estaminais hematopoiéticas A experiência de dose/resposta ilustrada na Figura 8 (representativa de 3 experiências) foi projetada para comparar a eficiência de transdução em células estaminais hematopoiéticas humanas de vetores VIH-1 incluindo ou a que falta a sequência de ADN triplex. Traçámos em primeiro lugar (A) a percentagem de células CD34+ eGFP+ obtidas em função da concentração de vetor usada para transdução. Observámos que independentemente da dose de vetor, o vetor TRIP+ era mais eficiente que o TRIP, com, respetivamente, uma média de 40±19% e 15,4±12,5% das células CD34+ sendo eGFP+ para 500ng 57 Ρ24 viral/ml de cada vetor (n=3 exp) . Foi obtido um aumento de 4-6 vezes na percentagem final de células GFP+ após transdução pelo vetor TRIP-GFP quando comparado a resultados obtidos após transdução com vetor HR-GFP. A diferença em eficiência entre os dois vetores também é realçada quando a média de intensidade de fluorescência é traçada em função da dose de vírus. É alcançado em patamar para o vetor TRIP- (HR-GFP) a doses de lOOng P24/ml ao passo que a intensidade de fluorescência em células transduzidas aumenta com a dose de vetor TRIP+. Tal poderia refletir a limitação na importação nuclear das formas pré-integrativas do vetor-TRIP e o número crescente de cópias integradas por célula após transdução com doses crescentes do vetor TRIP-GFP. 0 terceiro gráfico integra ambos os aspetos e mostra o efeito resultante da sequência de ADN triplex em atividade de fluorescência de GFP em HSC humano. Como mostrado, a presença da sequência de ADN triplex no vetor VIH induz uma maior produção de GFP em HSC por um fator superior a dez vezes.

Exemplo 12; Uma fração de cópias integradas de genomas de vetor VIH permanece silenciosa em células transduzidas hematopoiéticas humanas É possível que possa ocorrer a inativação do transgene integrado. A eficiência da transferência foi sempre melhor quando avaliada pela percentagem de colónias de células derivadas de progenitor transduzidas determinada por ensaio PCR para o vetor lentiviral integrado em vez de quando avaliada pela percentagem de células CD34+/eGFP+ determinada por análises FACS 48 horas após o término do protocolo de transdução. Isto reflete a ocorrência de provírus inativos sob o ponto de vista da transcrição devido ao seu sítio de integração ou à inativação progressiva e aleatória do 58 provírus enquanto as células proliferam e diferenciam. Observámos em colónias derivadas de um único progenitor clonogénico mielóide que alguns dos subclones pudessem ser GFP luminosos enquanto outros foram negativos, refletindo a inativação transcricional aleatória do transgene integrado nesta descendência clonal fenotipicamente homogénea.

Exemplo 13: Os vetores VIH contendo uma versão deletada da região U3 do LTR e um EFla interno são sistemas mais potentes para a transdução de células estaminais hematopoiéticas

Na Figura 9, comparamos a capacidade de vários vetores derivados de VIH-1, incluindo a sequência de ADN triplex, em transduzir células CD34+ de sangue de cordão humano. 0 efeito da deleção da maioria da região U3 de 3'LTR na transdução de GFP e a expressão em células CD34+ foram analisados. A comparação de vetores contendo uma LTR do VIH-1 intacta ou uma versão deletada de U3 foi conduzida no contexto de um promotor interno do CMV ou um promotor interno de EFla (Kim et al., 1990) para conduzir a expressão do gene repórter da GFP. Todas as experiências de transdução foram conduzidas usando a mesma concentração de partículas de vetor (500 ng P24/ml) após normalização das reservas de vetor usando um ensaio ELISA comercialmente disponível para o antigene P24 (proteína da cápside) do VIH-1 (Dupont). Análise de citometria de fluxo (FACS) foi executada ou 48 horas (Figura 9A) ou 120 horas (Figura 9B) após o período de transdução de 24 horas.

Interessantemente, a deleção da região U3 do LTR em vetores VIH-1 induziram um ligeiro aumento na percentagem de células positivas GFP em todos os casos. Este aumento foi modesto um quando analisado ao fim de 48 horas. Nesta altura, 59 mecanismo de pseudotransdução pode ser responsável por uma fração das células positivas GFP. A pseudotransdução é a entrega direta de proteínas GFP a células alvo pela partícula de vetor retroviral fundindo, sem a necessidade para uma integração atual do genoma de vetor retroviral. 0 aumento na percentagem de GFP positivo após transdução pelas versões deletadas de U3 dos vetores VIH-1 tornou-se mais evidentes 120 horas após transdução (Figura 9B) . Nesta altura, é observado um aumento de até duas vezes na percentagem de células positivas GFP após transdução pelo vetor TRIP Δυ3 -EFIa-GFP quando comparado aos resultados obtidos com o vetor equivalente mas contendo uma LTR do VIH-1 intacta.

Mais importante, a deleção da região U3 da LTR do VIH-1 nos vetores VIH-1 triplex induziu uma melhor expressão da proteína repórter GFP. A média da intensidade de fluorescência em HSC humano transduzido quando analisado por FACS foi sempre superior num fator de três a cinco vezes no caso das versões deletadas de U3 do que com vetores contendo uma LTR do VIH-1 intacta. Este beneficio na expressão de GFP foi observado quer fossem usados os promotores do CMV ou do EFla como promotor interno no elemento vetor VIH-1. 0 mecanismo molecular que explica esta expressão aumentada de proteínas GFP em células transduzidas não é conhecido. Alguma sequência na LTR do VIH-1 pode influenciar negativamente a expressão conduzida pelo promotor interno. Alternativamente, uma transcrição basal iniciada na LTR do VIH-1 pode interferir com a iniciação da transcrição no promotor interno.

Este estudo também mostra que o promotor do EFla é um melhor promotor em HSC humano que o promotor do CMV. Na Figura 9B, a 60 média de intensidade de fluorescência da GFP é três a cinco vezes melhor no caso do promotor do EFla que no caso do promotor do CMV.

Será aparente para o perito na técnica que podem ser realizadas diversas modificações e variações na prática do presente invento sem sair do âmbito ou espirito do invento.

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

<110> INSTITUTO PASTEUR INSERM

<120> ADN TRIPLEX LENTIVIRAL, E VETORES E CÉLULAS RECOMBINANTES CONTENDO ADN TRIPLEX LENTIVIRAL

<130> B4681AC - AD/LV/KN <140> 07000486.6 <141> 2007-01-10 <150> 60/158.387 <151> 1999-10-12 <150> PCT/EP0 0/10418 <151> 2000-10-10 <16 0> 24 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial 70 <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR DE MUTAGÉNESE BASEADO NO PLASMÍDEO pLAl3 <400> 1 caattttaaa agaagagggg ggatt 25

<210> 2 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR DE MUTAGÉNESE BASEADO NO PLASMÍDEO pLAl3 <400> 2 attcatccac aacttcaagc gccgcggtgg tattgggggg tac 43

<210> 3 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA A PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE AUMENTADA <400> 3 ccggatcccc accggtcgcc acc 23 71 <210> 4

<211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR NUCLEÓTIDO QUE CODIFICA A PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE AUMENTADA <400> 4 ccctcgagct agagtcgcgg ccg 23

<210> 5 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR pUCLTRRI-. <400> 5 cggaattcgg atccgcggcc gcatcgatct tgtcttcgtt gggagtg 47

<210> 6 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR pUCLTRRI-. 72 < 4 Ο Ο > 6 cggaattcag ccgtctcgag agatgctgca tataagcagc 40

<210> 7 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR cPPT E CTS DE pLAl3 <400> 7 gtggtcggcg ccgaattcac aaatggcagt attcatcc 38

<210> 8 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAR cPPT E CTS DE pLAl3 <400> 8 gtcgtcggcg ccccaaagtg gatctctgct gtcc 34 <210> 9 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial 73 <220>

<220> : INICIADOR PARA DE EF1 alfa NA <223> Descrição da Sequência Artificial AMPLIFICAR SEQUÊNCIA TRIPLEX DO PROMOTOR MATRIZ pLai <400> 9 38 gtcgtcggcg ccgaattcac aaatggcagt attcatcc

<210> 10 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

: INICIADOR PARA DE EF1 alfa NA <223> Descrição da Sequência Artificial AMPLIFICAR SEQUÊNCIA TRIPLEX DO PROMOTOR MATRIZ pLai <400> 10 39 agcctcacga cgcgtatcag ccaaagtgga tctctgctg

<210> 11 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

: INICIADOR PARA DE EF1 alfa NA <223> Descrição da Sequência Artificial AMPLIFICAR SEQUÊNCIA TRIPLEX DO PROMOTOR MATRIZ pEFpgkneo <400> 11 ctgatacgcg tcgtgaggct ccggtg 26 74 <210> 12 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência AMPLIF ' ICAR SEQUÊNCIA TRIPLEX DO MATRIZ , pEFpgkneo <400> 12 cgggat .cctg tgttctggcg gcaaac <210> 13 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 ccctcgagct agagtcgcgg ccg 23 <210> 14 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 ccggatcccc accggtcgcc acc 23 <210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial 26

Artificial: INICIADOR PROMOTOR DE EF1 alf

PARA i NA 75 <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR PARA

AMPLIFICAÇÃO DE ADN VIRAL DE pLAl3R <400> 15 agaagaaatg atgacagcat g 21

<210> 16 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR PARA AMPLIFICAÇÃO DE ADN VIRAL DE pLAl3 <400> 16 tgccagttct agctctg 17

<210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR PARA

SÍNTESE DE SONDA PARA O VETOR pTRIPGFP <400> 17 cagggacttg aaagcgaaag 20 <210> 18 <2ll> 27 76

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR PARA

SÍNTESE DE SONDA PARA O VETOR pTRIPGFP <400> 18 gcttgtgtaa ttgttaattt ctctgtc 27

<210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Vírus do tipo 1 da imunodeficiência humana <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(7) <223> Sequência parcial de cPPT do VIH-1 <400> 19

Asn Fen Lis Arg Lis Gli Gli 1 5

<210> 20 <211> 19 <212> ADN <213> Vírus do tipo 1 da imunodeficiência humana <400> 20 ttttaaaaga aaagggggg 19 77 <210> 21

<211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: MUTAÇÃO INTRODUZIDA NA SEQUÊNCIA cPPT DO VIH-1 <400> 21 ttttaaacgc aaaggtggt 19

<210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: MUTANTE <400> 22

Asn Fen Lis Arg Arg Gli Gli 1 5

<210> 23 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> MUTAÇAO -1 <223> Descrição da Sequência Artificial:

INTRODUZIDA NA SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE cPPT DO VIH 78 <400> 23 ttttaaaaga agagggggg 19

<210> 24 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> MUTAÇÕES VIH-1 <223> Descrição da Sequência Artificial: INTRODUZIDAS NA SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE cPPT DO <400> 24 cttcaagcgc cgcggtggt 19 20-01-2012 79

Claims (30)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uso de um vetor retroviral, compreendendo regiões cPPT e CTS de origem lentiviral nas quais a LTR está deletada para o promotor e amplificador de U3, para aumentar a taxa de importação in vitro, de uma sequência de ácidos nucleicos contida no dito vetor, no núcleo de uma célula hospedeira.
2. 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o dito vetor retroviral é um vetor lentiviral.
3. 3. Uso de acordo com a reivindicação 2, em que o dito vetor lentiviral é um vetor derivado do VIH.
4. 4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o dito vetor retroviral é um vetor de expressão ou um vetor de integração.
5. 5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o dito vetor retroviral é um vetor de substituição no qual a totalidade das sequências de codificação retrovirais entre as LTRs estão deletadas.
6. 6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a dita sequência de ácidos nucleicos é uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga.
7. 7. Uso de acordo com a reivindicação 6, em que a dita sequência de ácidos nucleicos heteróloga codifica um péptido, um polipéptido ou uma proteína.
8. 8. Uso de acordo com a reivindicação 7, em que a dita sequência de ácidos nucleicos heteróloga codifica uma 1 proteína terapêutica.
9. 9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a dita célula é uma célula eucariótica.
10. 10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a dita célula é uma célula com divisão ou uma célula sem divisão.
11. 11. Uso de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que a dita célula é uma célula de mamífero, desde que a dita célula não seja uma célula germinal humana.
12. 12. Uso de acordo com a reivindicação 11, em que a dita célula é uma célula hematopoiética, tal como uma célula estaminal hematopoiética.
13. 13. Uso de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que a dita célula é um derivado de uma célula como definido na reivindicação 11 ou 12.
14. 14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que as ditas regiões cPPT e CTS originam do VIH, tais como VIH—1 ou VIH-2, do vírus VISNA, EIAV, FIV ou CAEV.
15. 15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que a percentagem de células expostas aos ácidos nucleicos contidos no vetor retroviral que incorporam o dito vetor no seu núcleo é superior a 30%, de preferência superior a 50%, e mais preferencialmente superior a 80%.
16. 16. Vetor retroviral, compreendendo regiões cPPT e CTS de 2 origem lentiviral e uma LTR de origem retroviral deletada do promotor e amplificador da sua região U3, destinado ao uso para aumentar a taxa de importação de um ácido nucleico contido no dito vetor, no núcleo de uma célula hospedeira, para tratar o dito hospedeiro.
17. 17. Vetor retroviral de acordo com a reivindicação 16, em que o dito vetor retroviral é um vetor lentiviral.
18. 18. Vetor lentiviral de acordo com a reivindicação 17, em que o dito vetor lentiviral é um vetor derivado do VIH.
19. 19. Vetor retroviral ou lentiviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, que é um vetor de expressão ou um vetor de integração.
20. 20. Vetor retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, que é um vetor de substituição no qual a totalidade das sequências de codificação retrovirais entre as LTRs estão deletadas.
21. 21. Vetor retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, em que a dita sequência de ácidos nucleicos é uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga.
22. 22. Vetor retroviral de acordo com a reivindicação 21, em que a dita sequência de ácidos nucleicos heteróloga codifica um péptido, um polipéptido ou um proteína.
23. 23. Vetor retroviral de acordo com a reivindicação 22, em que a dita sequência de ácidos nucleicos heteróloga codifica uma proteína terapêutica. 3
24. 24. Vetor retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, em que a dita célula é uma célula eucariótica.
25. 25. Vetor retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, em que a dita célula é uma célula com divisão ou uma célula sem divisão.
26. 26. Vetor retroviral de acordo com a reivindicação 24 ou 25, em que a dita célula é uma célula de mamífero, desde que a dita célula não seja uma célula germinal humana.
27. 27. Vetor retroviral de acordo com a reivindicação 26, em que a dita célula é uma célula hematopoiética, tal como uma célula estaminal hematopoiética.
28. 28. Vetor retroviral de acordo com a reivindicação 24 ou 25, em que a dita célula é um derivado de uma célula como definido na reivindicação 26 ou 27. acordo com qualquer uma das que as ditas regiões cPPT e CTS VIH-1 ou VIH-2, do vírus VISNA,
29. 29. Vetor retroviral de reivindicações 16 a 28, em originam do VIH, tais como EIAV, FIV ou CAEV.
30. 30. Vetor retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 29, em que a percentagem de células expostas aos ácidos nucleicos contidos no vetor que incorporam o dito vetor no seu núcleo é superior a 30%, de preferência superior a 50%, e mais preferencialmente superior a 80%. 20-01-2012 4