CN117120085A - Sars-cov-2免疫原性组合物、疫苗和方法 - Google Patents

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Abstract

一种诱导针对严重急性呼吸综合征β‑冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)的保护性免疫应答的方法，包括向受试者的上呼吸道施用有效量的诱导针对SARS‑CoV‑2的保护性免疫应答的药剂。一种用于向上呼吸道施用编码严重急性呼吸综合征β‑冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段的假型慢病毒载体颗粒的剂型。

Description

SARS-COV-2免疫原性组合物、疫苗和方法
背景技术
出现的新型严重急性呼吸综合症β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)具有极强的传染性，并在全球迅速传播(Guo等人，2020年)。与之前出现的SARS或中东呼吸综合征(Middle EastRespiratory Syndrome，MERS)冠状病毒相比，SARS-CoV-2对全球健康造成前所未有的威胁，并带来巨大的社会经济后果。因此，迫切需要开发有效的SARS-CoV-2预防性疫苗，以遏制疫情的传播和减轻2019冠状病毒疾病(COVID-19)的发病，例如有害炎症和进行性呼吸衰竭(Amanat和Krammer，2020年)。虽然肺是SARS-CoV-2的好发器官，但其神经嗜性，与SARS-CoV和中东呼吸综合征(MERS)-CoV的神经嗜性一样(Glass等人，2004年；Li等人，2016年；Netland等人，2008年)，已经被报告(Aghagoli等人，2020年；Fotuhi等人，2020年；Hu等人，2020年；Liu等人，2020年；Politi等人，2020年；Roman等人，2020年；von Weyhern等人，2020年；Whittaker等人，2020年)。此外，已经描述了血管紧张素转换酶2(ACE2)在神经元细胞和神经胶质细胞中的表达(Chen等人，2020年；Xu和Lazartigues，2020年)。因此，COVID-19人类患者可能会出现头痛、肌肉疼痛、嗅觉障碍、味觉障碍、意识障碍和急性脑血管病等症状(Bourgonje等人，2020年；Hu等人，2020年；Mao等人，2020年)。病毒可通过神经传播或血源性途径进入大脑(Desforges等人，2014年)。对COVID-19死亡患者的尸检分析表明，SARS-CoV-2存在于鼻咽和大脑中，病毒通过嗅粘膜的神经-粘膜界面进入中枢神经系统(centralnervous system，CNS)(Meinhardt等人，2020年)。因此，在下文中，关注COVID-19候选疫苗在呼吸道以及大脑中的保护性特性至关重要。
冠状病毒是有包膜的非节段正链RNA病毒，其特征在于其膜锚定的刺突(S)糖蛋白(Walls等人，2020年)。SARS-CoV-2S(SCoV-2)是(180kDa)3同源三聚体I类病毒融合蛋白，其与在宿主细胞上表达的羧肽酶血管紧张素转换酶2(ACE2)结合。SCoV-2蛋白的单体具有一个胞外结构域、一个跨膜锚定结构域和一个短的胞内尾巴。SCoV-2通过两步顺序蛋白水解裂解激活，以启动与宿主细胞膜的融合。在导致构象重组的SCoV-2-ACE2相互作用之后，SCoV-2的胞外结构域首先在高度特异性的弗林蛋白酶682RRAR685(SEQ ID NO：99)位点处被切割(Guo等人，2020年；Walls等人，2020年)，这是决定病毒病理特征的关键因素，与普遍存在的弗林蛋白酶表达有关(Wang等人，2020年)。产生的亚基(subunit)由以下组成：(i)S1，其包含ACE2受体结合域(RBD)，其原子接触限于ACE2蛋白酶结构域，还包含靶向NAb的主要B细胞表位(Walls等人，2020年)，和(ii)S2，其具有膜融合元件。与SCoV-1一样，S1的脱落可得到S2上的第二个蛋白水解切割位点797R，即S2’(Belouzard等人，2009年)。根据细胞或组织类型，一种或多种宿主蛋白酶，包括弗林蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶或跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS)-2或-4，可参与第二个切割步骤(Coutard等人，2020年)。随后S的“膜融合性”构象变化导致SCoV-2的高度稳定的融合后形式，其启动与宿主细胞膜的融合反应(Sternberg和Naujokat，2020年)，并导致与S2’相邻的融合肽(FP)的暴露。将FP插入宿主细胞/囊泡膜引发融合反应，由此病毒RNA释放到宿主细胞溶质中(Lai等人，2017年)。SCoV-2-ACE2相互作用是迄今为止确定的SARS-CoV-2感染宿主细胞的唯一机制，并且RBD包含许多构象B细胞表位(Walls等人，2020年)，这些事实表明这种病毒包膜糖蛋白是中和抗体(nAb)的主要靶点。与包括呼吸道合胞病毒、HIV、埃博拉病毒、人偏肺病毒和拉沙病毒在内的其他几种病毒的包膜糖蛋白一样(Bos等人，2020年)，可设计SCoV-2以避免其构象动力学及其在融合前构象下的稳定性，这可能会更好地保持S1 B细胞表位的暴露，并可能提高免疫原的可用性(McCallum等人，2020年)。
几种疫苗替代品具有明显的缺点。具体而言：(i)需要广泛安全性测试的候选减毒或灭活病毒疫苗，(ii)编码S的核酸在长期保护方面未证明有效，(iii)蛋白质疫苗需要使用佐剂和增强剂，以及(iv)病毒载体、如腺病毒载体的预存免疫性可产生强烈的抗载体免疫应答，这在很大程度上降低其免疫原性(Rosenberg等人，1998年；Schirmbeck等人，2008年)。
在病毒载体中，慢病毒载体以整合型(ILV)和非整合型(NILV)形式存在，其允许插入最长达8kb的疫苗相关的转基因，并具有向宿主细胞核转移基因的突出潜力(Di Nunzio等人，2012年；Hu等人，2011年；Ku等人，2020年；Zennou等人，2000年)。慢病毒载体在体内表现出对免疫细胞(尤其是树突状细胞)的嗜性，是非复制性、非细胞病变性且几乎没有炎症的，并诱导持久的B细胞和T细胞免疫(Di Nunzio等人，2012年；Hu等人，2011年；Ku等人，2020年；Zennou等人，2000年)。LV在其包膜上使用水泡性口炎病毒(人类种群几乎没有遭受其攻击)的表面糖蛋白进行假型化，LV不是人类预先存在的特异性免疫的靶点，这与腺病毒载体形成鲜明(Rosenberg等人，1998年；Schirmbeck等人，2008年)。此外，在I/II期人类免疫缺陷病毒(HIV)-1疫苗试验(2011-006260-52EN)中，LV的安全性已在人体中得到证实。
需要诱导抗SARS-CoV-2的保护性免疫应答的组合物和方法。本公开满足了这些及其他需求。
发明内容
为开发能够预防COVID-19或降低其严重程度的候选疫苗，生成了编码以下结构的LV：(i)全长膜锚定形式的S(LV::SFL/LV::SFL)，(ii)S1-S2胞外结构域，不含跨膜和胞内尾巴结构域(LV::S1-S2)，(iii)单独的S1(LV::S1)，(iv)突变的S，缺失包含弗林蛋白酶位点的序列并在残基K986P和V987P处被取代，以在S2(2P突变)中引入连续的脯氨酸残基(LV::SΔF2P)，从而提供稳定的(2P)和预融合(ΔF)形式的蛋白质。生成了其他候选疫苗，包括编码以下结构的LV：(i)变体B1.351(所谓的南非或β变体)的刺突蛋白，(ii)变体B1.1.7(所谓的英国或α变体)的刺突蛋白，(iii)变体B1.351的在残基K986P和V987P处被取代的刺突蛋白，(iv)与D614G取代相结合的全长膜锚定形式的S(LV::SFL-D614G)，和(v)变体P.1(所谓的Manaus或γ变体)的刺突蛋白。实施例中提供的数据特别证实了LV::SFL和LV::SΔF2P在整合型或非整合型载体中(i)诱导对SARS-CoV-2(COVID-19的病原体)的刺突糖蛋白(S)具有特异性的中和抗体，其中和活性与在SARS-CoV-2患者队列中发现的中和活性相当，以及(ii)诱导刺突特异性CD8+T细胞。此外，使用对SARS-CoV-2复制高度敏感的黄金仓鼠，证明了LV::SFL或LV::SΔF2P免疫对SARS-CoV-2临床分离株复制的强大预防作用。在小鼠模型中获得了类似的结果，在该模型中，腺病毒载体血清型5(Ad5)在呼吸道中诱导人ACE2(hACE2)的表达。此外，在作为临床前模型生成的转基因小鼠中，显示出对SARS-CoV-2复制(包括在大脑中)的空前允许性，发明人能够证明编码SARS-CoV-2刺突糖蛋白预融合形式的LV(例如LV::SΔF2P)诱导呼吸道和CNS抗SARS-CoV-2的实质性保护。出乎意料的是，根据下文提供的定义以及在实验性实施例中所说明的，所生成的转基因小鼠能够通过所开发的编码刺突蛋白或其衍生物或它们的片段的LV来解决对CNS的保护能力。此外，发明人已经证明，在易感仓鼠模型中，单次鼻内施用编码SARS-CoV-2刺突糖蛋白预融合形式的LV诱导了对呼吸道的实质性保护，并完全避免了肺部炎症。同样重要的是，用LV::SFL或者用LV::SΔF2P进行的上呼吸道粘膜增强/靶向免疫在由所生成的转基因小鼠构成的严格的临床前模型中有助于保护效力。所提供的病毒学、免疫学和组织病理学数据表明：(i)基于LV的抗SARS-CoV-2的疫苗接种策略的显著预防效果，(ii)基于LV的免疫是开发抗冠状病毒的候选疫苗的一种有前景的策略，以及(iii)粘膜免疫能够实现强有力的保护性肺部免疫和保护性CNS免疫。在SARS-CoV-2对受感染宿主的多个器官表现出嗜性的特定背景下，任何形式的慢病毒载体都包含的靶向宿主细胞和实现转基因表达所必需的慢病毒序列、例如编码SARS-CoV-2的刺突蛋白或其具有B表位和T表位的衍生物或片段，已经显示出诱导和/或激活针对转基因抗原的免疫应答的能力。发明人特别证明了慢病毒载体保留或支持S抗原(无论是野生型还是本文公开的突变型)构象的能力，该构象能够将表位、特别是B表位有效呈递给宿主的免疫系统。此外，本文公开的实验数据表明，包含施用至宿主上呼吸道的步骤的给药途径可改善病毒靶向的某些组织或器官的免疫应答。这些结果是令人惊讶且出乎意料的。
实施例中的数据还表明：(i)NILV::SCoV-2祖先在全身水平上诱导的强CD8+T细胞应答，(ii)显著比例的对几种SCoV-2表位特异的产生IFN-γ的肺CD8+T细胞，(iii)高比例的具有效应记忆(Tem)和驻留记忆(Trm)表型的肺CD8+T细胞，(iv)在接种疫苗并用SARS-CoV-2祖先株或SARS-CoV-2P.1变体攻击的小鼠中可检测到CD8+T细胞在嗅球中的募集。值得注意的是，在SCoV-2祖先序列上鉴定的所有小鼠和人类CD8+T细胞表位都保留在突变的SCoV-2Manaus P.1中。这些观察结果表明，NILV具有通过引发显著的B细胞和T细胞应答而诱导肺部和大脑抗祖先SARS-CoV-2和新出现的SARS-CoV-2变体的全面保护方面的强大潜力。与作为NAb靶点的B细胞表位相比，迄今为止鉴定的T细胞表位并未受到新出现变体的SCoV-2中积累的突变的影响。这些结果是令人惊讶且出乎意料的。
实施例中的数据进一步表明：(i)用LV::SCoV-2B1.1.7免疫的小鼠血清在高EC50下中和携带SCoV-2祖先和LV::S SCoV-2B1.1.7的假病毒，但对携带SCoV-2B1.351和LV::S SCoV-2P.1的假病毒的中和效果较差。
(ii)用LV::S SCoV-2P.1免疫的小鼠血清在高EC50下中和携带SCoV-2P.1和LV::SCoV-2B1.351的假病毒，但对携带SCoV-2祖先和LV::SCoV-2B1.1.7的假病毒的中和效果较差。
(iii)用LV::SCoV-2B1.351免疫的小鼠血清在高EC50下不仅中和携带SCoV-2P.1和LV::SCoV-2B1.351的假病毒，还中和携带SCoV-2祖先和LV::SCoV-2B1.1.7的假病毒。
这些结果表明，就中和抗体而言，来自B1.351(南非或β)变体的刺突序列是最具交叉反应性的免疫原。
此外，数据显示，在LV的情况下，通过K986P-V987P取代(2P)稳定刺突可显著提高(交叉)中和抗体活性。
综合这些数据，令人惊讶且出乎意料地表明，一种特别有效的抗原是来自具有2P的B1.351(南非或β)变体的全长刺突。
因此，在第一方面，本发明提供了一种在受试者中诱导抗严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)的保护性免疫应答的方法，包括向受试者的上呼吸道施用有效量的诱导抗SARS-CoV-2的保护性免疫应答的药剂。在某些实施方案中，诱导抗SARS-CoV-2的保护性免疫应答的所述药剂是编码SARS-CoV-2刺突(S)糖蛋白或其衍生物或它们的片段的假型LV载体颗粒。在一些实施方案中，药剂通过雾化吸入施用。在一些实施方案中，药剂通过经鼻滴注施用。在一些实施方案中，药剂通过鼻腔吹入施用。在一些实施方案中，治疗过程由对上呼吸道的单次给药组成。在一些实施方案中，治疗过程包括在呼吸道外进行至少一次初免给药，随后对上呼吸道进行至少一次增强给药。在一些实施方案中，保护性免疫应答包括在受试者体内产生SARS-CoV-2中和抗体。在一些实施方案中，中和抗体包括IgG抗体。在一些实施方案中，中和抗体包括IgA抗体。在一些实施方案中，保护性免疫应答包括在受试者体内产生SARS-CoV-2S特异性T细胞。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、或者CD4+T细胞和CD8+T细胞两种。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞包括肺CD8+T细胞。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞包括产生IFN-γ的T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞包括具有效应记忆(Tem)和/或驻留记忆(Trm)表型的T细胞。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞被募集到嗅球。在一些实施方案中，保护性免疫应答降低了受试者发生SARS-CoV-2感染相关炎症的可能性。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白衍生物具有与SEQ ID NO:1至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白衍生物由具有与SEQ ID NO:2至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列表达。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白片段包含选自肽61-75(NVTWFHAIHVSGTNG(SEQ ID NO:15))、肽536-550(NKCVNFNFNGLTGTG(SEQ IDNO:16))和肽576-590(VRDPQTLEILDITPC(SEQ ID NO:17))的肽。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S衍生物或其片段包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，该修饰选自：(i)986K→P和987V→P，(ii)681PRRARS686(SEQ ID NO:22)→681PGSAGS686(SEQ ID NO:23)，和(iii)986K→P、987V→P和675QTQTNSPRRAR685(SEQ ID NO:24)缺失。在一些实施方案中，严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：111、SEQ IDNO：114、SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120的氨基酸序列或由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段由SEQ ID NO:1组成。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段由SEQ ID NO:5组成。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段由SEQ ID NO:8组成。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段包含SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段由SEQ ID NO:11组成。
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在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段包含SEQ ID NO:117。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段由SEQ ID NO:117组成。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段包含SEQ ID NO:120。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段由SEQ ID NO:120组成。
在一些实施方案中，所施用的LV载体颗粒是整合型的(ILV)。在一些实施方案中，所施用的慢病毒载体颗粒与缺陷型整合酶蛋白(NILV)是非整合型的。在一些实施方案中，所施用的NILV在整合酶编码序列中包含D64V突变。在一些实施方案中，所施用的LV载体颗粒是用水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型化的。在一些实施方案中，LV载体颗粒作为包含LV载体颗粒和药学上可接受的载体的疫苗制剂施用。
另一方面，本发明涉及一种用于向受试者的上呼吸道施用编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段的假型LV载体颗粒的剂型。在一些实施方案中，剂型用于通过雾化吸入施用。在一些实施方案中，剂型用于通过经鼻滴注施用。在一些实施方案中，剂型用于通过鼻腔吹入施用。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白衍生物具有与SEQ IDNO:1至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白衍生物由具有与SEQ ID NO:2至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列表达。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白片段包含选自肽61-75(NVTWFHAIHVSGTNG(SEQ ID NO:15))、肽536-550(NKCVNFNFNGLTGTG(SEQ ID NO:16))和肽576-590(VRDPQTLEILDITPC(SEQ ID NO:17))的肽。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S衍生物或其片段包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，该修饰选自：(i)986K→P和987V→P，(ii)681PRRARS686(SEQ ID NO:22)→681PGSAGS686(SEQID NO:23)，和(iii)986K→P、987V→P和675QTQTNSPRRAR685(SEQ ID NO:24)缺失。下文公开了S蛋白的其他衍生物和片段以及本发明的各个方面。
在一些实施方案中，所施用的LV载体颗粒是整合型的(ILV)。在一些实施方案中，所施用的LV载体颗粒是非整合型的(NILV)。在一些实施方案中，NILV颗粒在整合酶编码序列中包含D64V突变。在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒是用水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型化的。
另一方面，提供了一种试剂盒。该试剂盒可适用于实践本文公开的方法。在一些实施方案中，该试剂盒包含用于向受试者的上呼吸道施用根据本公开的编码SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段的假型LV载体颗粒的剂型。在一些实施方案中，用于给药的施用器是用于雾化吸入的施用器。在一些实施方案中，用于向受试者的上呼吸道给药的施用器是用于经鼻滴注的施用器。在一些实施方案中，用于向受试者的上呼吸道给药的施用器是用于鼻腔吹入的施用器。
还提供了编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段的新型且非显而易见的假型LV载体颗粒。在一些实施方案中，将假型LV载体颗粒施用于受试者的上呼吸道。在一些实施方案中，假型LV载体颗粒诱导保护性免疫应答，从而降低在施用于受试者上呼吸道后发生SARS-CoV-2感染相关炎症的可能性。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白衍生物具有与SEQ ID NO:1至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白衍生物由具有与SEQ ID NO:2至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列表达。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白片段包含选自肽61-75(NVTWFHAIHVSGTNG(SEQ ID NO:15))、肽536-550(NKCVNFNFNGLTGTG(SEQ IDNO:16))和肽576-590(VRDPQTLEILDITPC(SEQ ID NO:17))的肽。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S衍生物或其片段包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，该修饰选自：(i)986K→P和987V→P，(ii)681PRRARS686(SEQ ID NO:22)→681PGSAGS686(SEQ ID NO:23)，和(iii)986K→P、987V→P和675QTQTNSPRRAR685(SEQ ID NO:24)缺失。在一些实施方案中，LV载体颗粒是整合型的(ILV)。在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒是非整合型的(NILV)。在一些实施方案中，NILV颗粒在整合酶编码序列中包含D64V突变。在一些实施方案中，LV载体颗粒是用水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型化的。在一些实施方案中，假型LV载体颗粒编码刺突糖蛋白或其片段或衍生物，其具有与刺突蛋白或其片段或衍生物相同的氨基酸序列，其由选自以下的载体编码：
pFlap-ieCMV-S2PΔF-WPREm(也称为pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm)(CNCM I-5537)，pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538)，pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCM I-5539)，pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCM I-5540)，pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708)，pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709)，pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCMI-5710)，pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711)，和pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712)。
还提供了选自以下的载体：pFlap-ieCMV-S2PΔF-WPREm(也称为pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm)(CNCM I-5537)，pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538)，pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCM I-5539)，pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCM I-5540)，pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708)，pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709)，pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710)，pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711)，和pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712)。
还提供了包含选自以下的载体的宿主细胞：pFlap-ieCMV-S2PΔF-WPREm(CNCM I-5537)，pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538)，pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCM I-5539)，pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCM I-5540)，pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708)，pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709)，pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCMI-5710)，pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711)，pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCMI-5712)。在一些实施方案中，载体被稳定地整合到宿主细胞基因组中，而在其他实施方案中则不是。
还提供了一种编码SARS-CoV-2刺突(S)糖蛋白或其衍生物或它们的片段的假型LV载体颗粒，其中该假型LV载体颗粒通过包括用选自以下的载体共转染宿主细胞的方法制备：pFlap-ieCMV-S2PΔF-WPREm(CNCM I-5537)，pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538)，pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCM I-5539)，pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCM I-5540)，pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708)，pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709)，pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710)，pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711)，和pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712)。
附图简要说明——这些图以彩色图提交
图1.LV诱导抗SCoV-2抗体应答。(A)注射给小鼠的LV编码的3种形式的SCoV-2蛋白(SFL、S1-S2和S1)的示意图。示出了RBD、S1/S2和S2'切割位点、融合肽(FP)、跨膜(TM)和短的胞内尾巴(short internal tail)(T)。(B)LV免疫后抗SCoV-2抗体应答的动态。C57BL/6小鼠(n＝4/组)腹腔注射1×107TU的LV::GFP(作为阴性对照)、LV::S1、LV::S1-S2或LV::SFL。在免疫后2、3、4和6周收集血清。通过ELISA评估抗SCoV-2IgG应答，并表示为平均终点稀释滴度。(C)LV::SFL免疫诱导的抗SCoV-2抗体的中和能力。在血清中和试验中评估小鼠血清以确定50％有效浓度(EC50)中和滴度。(D)不同实验组中抗体滴度与中和活性之间的相关性。通过双侧斯皮尔曼秩相关检验(two-sided Spearman rank-correlation test)确定统计显著性。NS：不显著。(E)在免疫后第3周或第4周采集的小鼠血清与生活在法兰西岛瓦卢瓦地区克雷皮(Crépy-en-Valois,Ilede France)的轻症个体队列之间，以1:40的稀释度进行头对头比较。这些患者没有就医并从COVID-19中康复。结果表示为荧光素酶活性抑制的平均值±SEM百分比。
图2.LV::SFL诱导T细胞应答。C57BL/6小鼠(n＝3)腹腔注射1×107TU的LV::SFL或阴性对照LV。(A)使用跨越整个SCoV-2(1-1273a.a.)并彼此重叠10a.a.残基的15聚体肽的16个不同的池，对免疫后2周收集的脾细胞进行IFN-γ酶联免疫斑点测定试验(ELISPOT)。SFU＝斑点形成细胞。(B)通过ELISPOT对16个阳性肽池进行解卷积，应用于从3只LV::SFL免疫小鼠或对照LV免疫小鼠中汇集的脾细胞。(C)用包含免疫抗原表位的单个肽刺激后，CD4+或CD8+T脾细胞的细胞内IFN-γ与IL-2染色。
图3.在呼吸道中表达hACE2的小鼠模型的建立。(A)在转导后2天，通过RT-PCR检测用Ad5::hACE2转导的HEK293 T细胞中hACE2的表达。NT：未转导。(B)通过蛋白质印迹法(Western Blot)检测在向C57BL/6小鼠(n＝2/组)鼻内滴注Ad5::hACE2或空白Ad5后第4天恢复的肺细胞提取物中的hACE2蛋白。(C)如通过流式细胞术在CD45+造血细胞或EpCam+上皮细胞中所评估的，向C57BL/6小鼠鼻内滴注Ad5::GFP或PBS后第4天制备的肺细胞中GFP的表达。(D)用2.5×109IGU的Ad5::hACE2、对照空白Ad5或PBS预处理的小鼠的肺病毒载量，随后在4天后鼻内接种1×105TCID50的SARS-CoV-2。在一组中，Ad5::hACE2预处理的小鼠接种等量的热灭活(heat-killed，HK)病毒，以在没有病毒复制的情况下测量输入的病毒RNA。在感染后2、4或7天(days post inoculation，dpi)时的肺匀浆中通过qRT-PCR进行病毒载量定量。红线表示检测限。(E)用不同剂量的Ad5::hACE2预处理4天后测定的肺中CD45+细胞的百分比。(F)用不同剂量的Ad5::hACE2预处理小鼠的肺病毒载量，随后在4天后鼻内接种1×105TCID50的SARS-CoV-2。病毒载量在3dpi时测定。
图4.用LV::SFL对小鼠中的SARS-CoV-2进行全身免疫的保护潜力。(A)通过单次腹腔注射LV疫苗接种，随后进行Ad5::hACE2预处理和鼻内注射SARS-CoV-2攻击的时间线。(B)在3dpi时，未接种疫苗的小鼠(PBS)、LV::SFL疫苗接种的小鼠或假接种疫苗的小鼠中的肺病毒载量。通过双尾非配对t检验评估病毒载量差异的统计显著性；*＝p＜0.0139。
图5.使用LV::SFL进行鼻内增强强力保护小鼠免受SARS-CoV-2的侵害。(A)基于LV的初免-增强策略，随后是Ad5::hACE2预处理和SARS-CoV-2攻击的时间线。(B)通过ELISA在C57BL/6小鼠血清中定量的抗SCoV-2IgG滴度，该C57BL/6小鼠在第0周腹腔注射初免，在第3周腹腔注射或鼻内注射增强(左)。滴度测定为增强前(第3周)和攻击前(第4周)的平均终点稀释度。***p<0.001，****p<0.0001；两因素方差分析，随后是Sidak多重比较检验。NS，不显著。这些血清的中和能力，表示为EC50(右)。(C)用LV::SFL初免(腹腔注射)和增强(腹腔注射或鼻内注射)的小鼠在3dpi时的肺病毒载量。假接种疫苗的小鼠接受了空LV。红线表示检测限。通过双尾非配对t检验评估病毒载量差异的统计显著性；*＝p<0.0139，***＝p<0.0088。(D)使用折叠子-三聚的SCoV-2涂层，通过ELISA在澄清的肺匀浆中测定的抗SCoV-2IgG和IgA抗体的滴度。(E)用1/5稀释度测定澄清的肺匀浆的中和活性。通过曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)评估差异的统计显著性(*＝p<0.0159)。
图6.LV::SFL疫苗减少小鼠中SARS-Co-2介导的肺部炎症。(A)用于鉴定和量化不同的肺部先天免疫细胞亚群的流式细胞术策略。通过使用对表面标志物或表面标志物的组合具有特异性的抗体分析肺部造血CD45+细胞，从而通过3种不同的途径和顺序门控来表征先天免疫细胞群。细胞群以灰色突出显示。(B)与仅接受PBS的未感染(NI)对照相比，假接种疫苗或接种LV::SFL(遵循各种初免-增强方案)的小鼠在3dpi时，每个先天免疫亚群与总肺CD45+细胞的百分比。在接种SARS-CoV-2前4天，所有小鼠都用Ad5::hACE-2进行了预处理。(C)假接种疫苗或接种LV::SFL(遵循各种初免-增强方案)的小鼠中在3dpi时细胞因子和趋化因子mRNA表达的相对log2差异倍数(fold change)。数据相对于PBS处理的、未攻击的对照(unchallenged control)进行标准化。统计显著性通过双尾非配对t检验进行评估；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001和****＝p<0.0001。
图7.经鼻接种LV::SFL强力保护黄金仓鼠免受SARS-CoV-2的侵害。(A)仓鼠中LV::SFL初免-增强/靶向免疫方案和SARS-CoV-2攻击的时间线。假接种疫苗的小鼠接受了空LV。(B)LV免疫后抗SCoV-2抗体应答的动态。在初免注射后第3周、第5周(增强前)和第6周(增强后)，从假接种疫苗或接种LV疫苗的仓鼠中收集血清。通过ELISA评估抗SCoV-2IgG应答，并表示为平均终点稀释滴度。(C)增强后/靶向EC50中和滴度，在增强后仓鼠血清中测定，并与来自无症状(AS)、轻微症状(PS)、有症状COVID-19病例(S)或住院(H)人员队列的血清进行比较。(D)接受多种方案的假接种疫苗的仓鼠或接种LV::SFL疫苗的仓鼠的体重随访。为进一步清楚起见，仅示出了达到4dpi的个体。那些在2dpi时处死的仓鼠与在0至2dpi之间同组的仓鼠具有相同的平均体重。(E)在接种LV::SFL疫苗的仓鼠中用SARS-CoV-2在2或4dpi时的肺病毒载量。通过双尾非配对t检验评估病毒载量差异的统计显著性；*＝p<0.0402，****＝p<0.0001。另请参见图S4C。(F)如在4dpi时通过qRT-PCR在总肺匀浆中测定并与未处理对照进行标准化的，接种LV::SFL疫苗的受保护的仓鼠与不受保护的假接种疫苗的仓鼠中的细胞因子和趋化因子表达的相对log2差异倍数。通过单因素方差分析评估细胞因子和趋化因子水平差异的统计显著性；*＝p<0.05，**＝p<0.01。
图8.LV::SFL疫苗减少黄金仓鼠中SARS-Co-2介导的组织病理学。动物是图6中详述的动物。(A)在假接种疫苗或接种LV::SFL疫苗(遵循各种初免-增强方案)的小鼠中，细胞因子和趋化因子mRNA表达的log2差异倍数的测定。在每次测定中，每个构建体(construct)和方案的出现顺序相同。(B)示出2dpi和4dpi的HE&S肺组织学分析。原始放大倍数：x10，比例尺：100μm。BR：支气管或细支气管。Bv：血管。箭头：单核炎性细胞浸润。星形：呼吸道上皮细胞的退行性变化。(C)热图概括每个定义参数的组织学评分的平均值，并在2dpi或4dpi时测定同组个体的平均值。
图9.NILV::SFL在黄金仓鼠全身初免和鼻内增强方案中的保护效力。(A)仓鼠的NILV::SFL初免-增强/靶向免疫方案和SARS-CoV-2攻击的时间线。(B)使用NILV::SFL进行单次(肌肉注射)注射或初免(肌肉注射)-增强(鼻内注射)免疫后血清抗SCoV-2IgG应答的图表。抗SCoV-2IgG应答以平均终点稀释滴度表示。(C)对照仓鼠或接种NILV::SFL疫苗仓鼠在4dpi时SARS-CoV-2的肺部病毒载量。通过双尾非配对t检验评估病毒载量差异的统计显著性；**＝p<0.01。(D)在仓鼠血清中测定的增强后/靶向EC50中和滴度。(E)肺组织学分析通过H&E进行。热图概括每个定义参数的组织学评分，并在4dpi时测定同组个体的平均值。(F，G)来自NILV::SFL肌肉注射-NILV::SFL鼻内注射仓鼠(F)或假肌肉注射-假鼻内注射仓鼠(G)在4dpi时的代表性全肺切片。
图10.用于产生编码SFL、S1-S2或S1抗原的LV的质粒图谱。
图11.LV编码的SFL和SΔF2P的示意图。示出了RBD、S1/S2和S2'切割位点、融合肽(FP)、跨膜结构域(TM)和短的胞内尾巴(T)，包含RRAR(SEQ ID NO:99)弗林蛋白酶切割位点的675QTNSPRRAR685(SEQ ID NO:24)序列以及K986P和V987P连续替换。
图12.单次鼻内注射LV::SΔF2P全面保护黄金仓鼠免受SARS-CoV-2的侵害。(A)仓鼠中LV::SΔF2P初免-增强疫苗接种方案和SARS-CoV-2攻击的时间线。(B)血清抗SCoV-2IgG应答以平均终点稀释滴度表示，通过ELISA测定。(C)抗SCoV-2抗体的中和能力，以EC50中和滴度表示，在LV::SΔF2P免疫仓鼠的血清和肺匀浆中测定。(D)接种LV::SΔF2P疫苗或假接种疫苗的仓鼠在4dpi时的体重下降百分比。(E)在4dpi时通过总E或Esg qRT-PCR定量的肺病毒载量。通过双尾非配对t检验评估差异的统计显著性；*＝p<0.0402，****＝p<0.0001。红线表示每次测定的检测限。
图13.在接种LV::SΔF2P疫苗的仓鼠中，感染导致的肺部炎症大大减少。(A)热图概括接种SΔF2P疫苗或假接种疫苗个体中炎症相关中介体(mediator)表达的相对log2差异倍数，通过使用从总肺匀浆中提取的RNA在4dpi时进行分析并相对于未经处理的对照样品进行标准化。热图中示出了每组六只仓鼠。(B)肺组织学H&E分析，在4dpi时所研究的。
图14.K18-hACE2IP-THV转基因小鼠的肺部和大脑对SARS-CoV-2复制的高度允许性。(A)通过qPCR对15只N1 B6.K18-hACE2IP-THV小鼠进行代表性基因分型，以确定其每个基因组的hACE2基因拷贝数。(B)在5-7周龄用0.3×105TCID50鼻内注射接种的相同小鼠的表型，并通过常规E-特异性qRT-PCR在3dpi时测定其各个器官中的病毒载量。(C)K18-hACE2IP-THV和B6.K18-ACE22Prlmn/JAX转基因小鼠的不同器官对SARS-CoV-2复制的比较允许性，如通过常规E特异性或亚基因组Esg特异性qRT-PCR在3dpi时所测定的。红线表示qRT-PCR检测限。通过曼-惠特尼检验评估差异的统计显著性(*＝p<0.01,**＝p<0.00)。(D)K18-hACE2IP-THV和B6.K18-ACE22Prlmn/JAX转基因小鼠的肺部和大脑中hACE-2mRNA的比较定量。(E)热图概括在3dpi时B6.K18-hACE2IP-THV和B6.K18-ACE22Prlmn/JAX转基因小鼠的肺部或大脑中细胞因子和趋化因子mRNA表达的log2差异倍数。数据相对于未处理的对照进行标准化。
图15.在K18-hACE2IP-THV转基因小鼠中，接种LV::SΔF2P疫苗保护肺部和中枢神经系统免受SARS-CoV-2感染。(A)K18-hACE2IP-THV小鼠的初免-增强LV::SΔF2P疫苗接种和SARS-CoV-2攻击在的时间线。(B)接种LV::SΔF2P疫苗的小鼠中抗SCoV-2抗体的血清中和能力。(C)通过使用常规E特异性或亚基因组Esg特异性qRT-PCR，在3dpi时在不同器官中测定病毒载量。红线表示qRT-PCR检测限。通过曼-惠特尼检验评估差异的统计显著性(*＝p<0.01,**＝p<0.001)。(D)确定细胞计量门控策略，以鉴定和量化接种LV::SΔF2P疫苗或假接种疫苗和SARS-CoV-2攻击的K18-hACE2IP-THV转基因小鼠肺部中在3dpi时的肺NK细胞和中性粒细胞。计算NK和中性粒细胞亚群与总肺CD45+细胞相比的百分比。(E)接种LV::SΔF2P疫苗或假接种疫苗和SARS-CoV-2攻击的K18-hACE2IP-THV转基因小鼠大脑中在3 dpi时的细胞因子和趋化因子mRNA表达的相对log2差异倍数。数据相对于未处理的对照进行标准化。通过双尾非配对t检验评估统计显著性；*＝p<0.05，**＝p<0.01)。
图16.通过鼻内注射途径接种LV::SΔF2P疫苗可全面保护CNS免受SARS-CoV-2感染。(A)B6.K18-hACE2IP-THV小鼠的各种LV::SΔF2P疫苗接种方案和SARS-CoV-2攻击的时间线。(B)由常规E特异性或亚基因组Esg特异性qRT-PCR测定的在3 dpi时大脑中的病毒载量。红线表示qRT-PCR检测限。通过曼-惠特尼检验评估差异的统计显著性(*＝p<0.01)。(C-D)在3 dpi时对从肌肉注射-鼻内注射接种LV::SΔF2P疫苗并受保护的小鼠与假接种疫苗且未受保护的小鼠的汇集的嗅球或大脑中提取的细胞进行细胞计量分析。嗅球中的(C)适应性和(D)先天免疫细胞。(E)大脑中的先天免疫细胞。
图17：编码S、S1-S2、S1、S2P、S2P3F SΔF2P的慢病毒质粒图谱
图18：在用Ad5::hACE2预处理并用SARS-CoV-2攻击的C57BL/6小鼠中，ILV::SFL或ILV::SΔF2P的保护潜力的头对头比较。如实施例1中所述，C57BL/6小鼠经肌肉注射初免并经鼻内注射增强。用鼻内注射SARS-CoV-2对动物进行攻击，并在3 dpi时测量病毒载量。结果显示，两种比较的LV携带构建体之间存在轻微差异，当通过亚基因组qRT-PCR测量复制病毒进行评估时，这种差异并不显著，甚至应消失。
图19：pFLAP K18-hACE2 WPRE的质粒图谱
图20至图24:序列pFlap-CMV-S-2019-nCoV-WPREm、pFlap-ieCMV-S2P-WPREm、pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm、pFlap-ieCMV-S2P-ΔF-WPREm、pFLAP K18-hACE2 WPRE和转基因序列。
图25.NILV::SCoV-2对Manaus P.1 SARS-CoV-2变体的全面保护能力。(A)B6.K18-hACE2IP-THV小鼠(n＝5/组)的NILV::SCoV-2肌肉注射-鼻内注射免疫和用Manaus P.1 SARS-CoV-2攻击的时间线。在3 dpi时收集大脑和肺部。(B)大脑或肺部病毒RNA含量，通过在3dpi时的常规E特异性或亚基因组Esg特异性qRT-PCR进行测定。5只假接种疫苗小鼠中的2只小鼠肺部未检测到病毒载量，而其大脑中的病毒载量较高且hACE2 mRNA表达水平与同组其他小鼠相当。(C)来自个体接种NILV::SCoV-2疫苗小鼠的血清对携带来自祖先)毒株或D614G、B1.117、B1.351或P.1变体的SCoV-2的假病毒的中和活性(EC50)。通过曼-惠特尼检验评估统计显著性(*＝p<0.05，**＝p<0.01)。红色星号(底部)表示与祖先的显著性，蓝色星号(中间)表示与D614G变体的显著性；橙色星号(顶部)表示与B1.117变体的显著性。在各自的增强时间点进行统计比较。
图26.T细胞应答，在NILV::SCoV-2-介导的抗SARS-CoV-2保护中起主要作用。(A)野生型或μMT KO小鼠(n＝5-9/组)遵循(图1A)中所示的时间线来注射LV::SCoV-2或假接种疫苗，然后在用SARS-CoV-2祖先毒株攻击前4天用Ad5::hACE2进行预处理。肺病毒RNA含量在3dpi时测定。通过曼-惠特尼检验评估差异的统计显著性(**＝p<0.01，****＝p<0.0001)。(B)NILV::SCoV-2-初免和-增强的C57BL/6WT小鼠或假接种疫苗对照中的T淋巴细胞应答，通过IFN-γELISPOT使用包含SCoV-2MHC-I限制性表位的15聚体肽进行评估。(C)用所示的SCoV-2衍生肽体外刺激后，肺CD8+T细胞的IFN-γ应答的代表性点图。(D)检测肺CD8+T中央记忆(Tcm，CD44+CD62L+CD69-)、T效应记忆(Tem，CD44+CD62L+CD69-)和T驻留记忆(Trm，CD44+CD62L+CD69-)(顶部)的细胞计量策略，以及这些亚群在LV::S肌肉注射-鼻内注射疫苗接种或假接种疫苗的小鼠中的代表性百分比。
图27.在受保护的接种NILV::SCoV-2疫苗的或未受保护的假接种疫苗的K18-hACE2IP-THV小鼠中嗅球的特征。小鼠是图2中详述的小鼠。(A-B)来自NILV::SCoV-2肌肉注射-鼻内注射疫苗接种且受保护的小鼠和未受保护的假接种疫苗的小鼠的嗅球的CD3免疫组织化学，以及这些组在3dpi时用SARS-CoV-2祖先感染的代表性结果。(C)对从同组汇集的嗅球中提取的细胞进行细胞计量分析。(D-E)由来自NILV::SCoV-2肌肉注射-鼻内注射疫苗接种且受保护的小鼠和未受保护的假接种疫苗的小鼠的嗅球测定的CD3 T细胞密度，以及这些组在3dpi时用SARS-CoV-2Manaus P.1感染的代表性结果。(F)对从同组汇集的嗅球中提取的细胞进行细胞计量分析。
图28.使用为每个相关刺突编码的LV进行初免和增强的小鼠的交叉血清中和潜力。(A)C57BL/6小鼠(n＝5/组)的腹腔注射-腹腔注射免疫的时间线。(B)显示所用血清中和试验的方案。(C)个体接种疫苗的小鼠血清对携带来自祖先毒株或D614G、B1.1.7、B1.351或P.1变体的SCoV-2的假病毒的中和活性(EC50)。
图29.K986P-V987P取代(2P)稳定刺突对(交叉)中和抗体活性的影响。(A)C57BL/6小鼠(n＝5/组)的腹腔注射-腹腔注射免疫的时间线。(B)个体接种疫苗的小鼠血清对携带来自祖先毒株或D614G、B1.1.7、B1.351或P.1变体的SCoV-2的假病毒的中和活性(EC50)。
图30-图34：序列pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm、pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm、pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm、pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm、pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm和转基因序列。
本文公开的与转基因构建体相关的序列由其如下SEQ ID No.指定：
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具体实施方式
本文所述的发明部分基于实施例中证明的有效疫苗接种策略。这些实施例证明了疫苗策略的效用，该策略在某些实施方案中基于慢病毒载体(LV)，能够诱导对SARS-CoV-2刺突糖蛋白(S)具有特异性的中和抗体，SARS-CoV-2是2019冠状病毒病(COVID-19)的病原体。在几种编码S的不同变体的LV中，编码全长膜锚定S(LV::SFL)的一种LV和编码突变预融合(任选地稳定的)形式的一种LV(例如LV::SΔF2P(也被命名为LV::S2PΔF或LV::S2PDF或LV::S2PdeltaF))在小鼠和仓鼠中引发高抗体滴度，具有体外和体内抑制病毒入侵宿主细胞的强大能力，表达人血管紧张素转换酶2(hACE2)，所述人血管紧张素转换酶2(hACE2)是SARS-CoV-2进入的受体。S特异性T细胞也在接种LV::SFL或LV::SΔF2P疫苗的个体中被大量诱导。在小鼠中以及在仓鼠中，hACE2的表达是通过5型腺病毒(Ad5)载体转导呼吸道细胞或通过LV载体载体化的hACE2转基因诱导的(B6.K18-hACE2IP-THV小鼠)，当LV::SFL或LV::SΔF2P用于全身初免，然后是鼻内粘膜增强/靶向免疫时，对肺部SARS-CoV-2复制提供了实质性或完全的保护作用。所赋予的保护作用避免了肺部炎症并防止组织损伤。此外，在大脑对SARS-CoV-2复制具有显著允许性的B6.K18-hACE2IP-THV小鼠中，保护作用被证明扩展到大脑和CNS。所呈现的结果表明，基于LV的疫苗接种策略在临床前动物模型中对SARS-CoV-2具有显著的预防效果，并且指出特别是基于LV::SFL的鼻内免疫为一种针对COVID-19的有力且有前景的疫苗方法。在所开发的转基因模型中，使用基于LV的疫苗进行全身初免后，需进行鼻内注射增强，以达到对CNS的全面保护，该模型是SARS-CoV-2感染的严格模型，具有特别高的大脑对SARS-CoV-2复制的允许性。
A.严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2刺突蛋白
本公开的各个方面包含SARS-CoV-2S蛋白。在一个优选的实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白包含以下氨基酸序列(Genbank：YP_009724390.1；SEQ ID NO:1):
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在另一个优选的实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由氨基酸序列组成(Genbank：YP_009724390.1；SEQ ID NO:1)。
需要指出的是，对于本领域技术人员而言除非在技术上似乎不适用，否则本文提供的针对SARS-CoV-2S蛋白或编码SARS-CoV-2S蛋白的多核苷酸的定义同样适用于相对于SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的序列分别定义的SARS-CoV-2S蛋白的衍生物或片段。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白包含与SEQ ID NO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。如果所获得的序列短于SEQID NO:1，则此类SARS-CoV-2S蛋白可作为SARS-CoV-2S蛋白衍生物和/或SARS-CoV-1S蛋白片段。它也可能是由与最初鉴定的分离祖先株(登录号MN908947)不同的病毒株表达的SARS-CoV-2S蛋白的序列。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由与SEQ ID NO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成。如果所获得的序列短于SEQ ID NO:1，则此类SARS-CoV-2S蛋白可作为SARS-CoV-2S蛋白衍生物和/或SARS-CoV-1S蛋白片段。它也可能是由与最初鉴定的分离祖先株(登录号MN908947)不同的病毒株表达的SARS-CoV-2S蛋白的序列。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白衍生物具有与SEQ IDNO:1至少95％相同或至少99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白衍生物或片段具有SEQ ID No.8、SEQ ID No.11、SEQ ID No.108、SEQ ID No.111、SEQID No 114、SEQ ID No 117或SEQ ID No.120的氨基酸序列，或者SARS-CoV-2S蛋白衍生物具有与S SEQ ID No.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.108、SEQ ID No.111、SEQ ID No.114、SEQ ID No.117或SEQ ID No.120至少95％相同或至少99％同一性的氨基酸序列，或者SARS-CoV-2刺突蛋白片段具有SEQ ID No.14的氨基酸序列，或者SARS-CoV-2S蛋白衍生物具有与SEQ ID No:14至少95％相同或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白包含相对于SEQ ID NO:1具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化的氨基酸序列。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白包含相对于SEQ ID NO:1具有不多于1、不多于2、不多于3、不多于4、不多于5、不多于6、不多于7、不多于8、不多于9或不多于10个氨基酸变化的氨基酸序列。如果所获得的序列短于SEQ ID NO:1，则此类SARS-CoV-2S蛋白可作为SARS-CoV-2S蛋白衍生物和/或SARS-CoV-1S蛋白片段。它也可能是由与最初鉴定的分离祖先株(登录号MN908947)不同的病毒株表达的SARS-CoV-2S蛋白的序列。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由相对于SEQ ID NO:1具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由相对于SEQ ID NO:1具有不多于1、不多于2、不多于3、不多于4、不多于5、不多于6、不多于7、不多于8、不多于9或不多于10个氨基酸变化的氨基酸序列组成，特别是在蛋白中的单个位置具有不多于10个氨基酸变化。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白带有突变，例如编码S2PΔF或S2P3F的核苷酸序列的突变。在一些实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白在该蛋白的受体结合域中包含突变。在一些实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白在残基614处带有取代，例如D614G，或包含此类取代。在一些实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白带有在所谓的变体SARS-CoV-2VUI 2020 12/01S蛋白中鉴定的突变，即通过刺突蛋白的氨基酸残基的取代或缺失而产生的突变，例如缺失69-70、缺失144、N501Y、取代A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。在一些实施方案中，SARS-CoV-2刺突蛋白带有SEQ ID No.108、SEQ ID No.111、SEQID No.114、SEQ ID No.117或SEQ ID No.120中存在的突变。
在一个优选的实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由包含Genbank:NC_045512.2(SEQID NO:2)的核苷酸21563至25384的核苷酸序列编码：
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在一个优选的实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由由Genbank:NC_045512.2(SEQ IDNO:2)的核苷酸21563至25384组成的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由与SEQ ID NO:2至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。如果具有这种限定的同一性百分比的核苷酸序列短于SEQ ID NO:2，则此类SARS-CoV-2S蛋白可作为SARS-CoV-2S蛋白衍生物和/或SARS-CoV-2S蛋白片段。它也可能是编码SARS-CoV-2S蛋白的序列，该蛋白源自与最初鉴定的分离祖先株(登录号MN908947)不同的病毒株。在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2刺突蛋白的核苷酸序列带有包含至少一个非同义突变的突变。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由带有突变的核苷酸序列编码，该突变例如是编码S2PΔF或S2P3F的核苷酸序列的突变。在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2刺突蛋白的核苷酸序列在SEQ ID No.2的序列中的位置23403处带有突变，其中密码子GGT突变，特别是被密码子GAT取代(对应于编码蛋白中的位置614处的突变，尤其对应于D614G取代)。在一些实施方案中，核苷酸序列是编码所谓变体SARS-CoV-2VUI 2020 12/01的刺突蛋白的序列，其中刺突蛋白通过核苷酸的取代或缺失而带有多个突变，其中该突变导致编码的刺突蛋白的氨基酸残基发生以下变化：缺失69-70、缺失144、取代N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由密码子优化的核苷酸序列编码，例如SEQID NO:2的密码子优化变体。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白包含K986P和V987P氨基酸取代。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白包含其中氨基酸681-686从PRRARS(SEQ IDNO:22)改变为PGSAGS(SEQ ID NO：23)的修饰。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白包含其中氨基酸675-685(QTQTNSPRRAR(SEQID NO:24))被删除的修饰。
B.编码严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白的慢病毒载体和假型慢病毒载体颗粒
在本发明的上下文中，“慢病毒载体”是指用包含顺式作用的慢病毒RNA或DNA序列并且需要以反式提供的慢病毒蛋白质(例如Gag、Pol和/或Env)的转基因转导宿主细胞的非复制载体。慢病毒载体缺乏功能性Gag、Pol和Env蛋白的表达。慢病毒载体可以以RNA或DNA分子的形式存在，这取决于所述逆转录病毒载体的产生或发展阶段。
慢病毒载体可以是重组DNA分子的形式，例如质粒。慢病毒载体可以是慢病毒载体颗粒的形式，例如慢病毒其他蛋白质复合物内的RNA分子。通常，对应于修饰或重组慢病毒颗粒的慢病毒颗粒载体包含由两个单链RNA拷贝组成的基因组。这些RNA序列可通过从插入宿主细胞基因组的双链DNA序列(前病毒载体DNA)转录获得，或者可从质粒DNA(质粒载体DNA)在转化的宿主细胞中的瞬时表达获得。
慢病毒载体颗粒可具有整合能力。因此，它们含有功能性整合酶蛋白。可替代地，慢病毒载体颗粒可具有削弱的整合能力或无整合能力。非整合载体颗粒具有一个或多个突变，这些突变消除了慢病毒载体颗粒的大部分或全部整合能力。例如，非整合载体颗粒可在由慢病毒pol基因编码的整合酶中包含导致整合能力降低的突变。相比之下，整合载体颗粒包含功能性整合酶蛋白，其不包含任何消除慢病毒载体颗粒的大部分或全部整合能力的突变。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒是整合型的(ILV)。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒是非整合型的(NILV)。
慢病毒载体源自慢病毒，特别是人类免疫缺陷病毒(HIV-1或HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)，它们被修饰以去除参与致病性的遗传决定因素并引入对获得治疗效果有用的新决定因素。优选地，慢病毒载体源自HIV-1。
此类载体基于顺式和反式作用序列的分离。为生成复制缺陷型载体，可删除反式作用序列(例如，gag、pol、tat、rev和env基因)并替换为编码转基因的表达盒。
非分裂细胞中的有效整合和复制通常需要在慢病毒基因组的中心存在两个顺式作用序列，即中央多聚嘌呤区(cPPT)和中央终止序列(CTS)。这些使得形成称为中心DNA“翼(flap)”的三链DNA结构，其作为核孔处预整合复合物脱壳的信号，并将表达盒有效地导入非分裂细胞细胞(如树突状细胞)的细胞核。
在一个实施方案中，本发明包括一种慢病毒载体，其包含中央多聚嘌呤区和中央终止序列，称为cPPT/CTS序列，如特别是欧洲专利申请EP 2 169 073中所述。
其他序列通常以顺式存在，例如参与将载体前病毒DNA序列整合到宿主细胞基因组中的长末端重复序列(LTR)。载体可以通过突变LTR序列获得，例如在所述LTR的结构域U3中(ΔU3)(Miyoshi H等人，1998年，《病毒学杂志》72(10)：8150-7；Zufferey等人，1998年，《病毒学杂志》72(12)：9873-80(Miyoshi H et al,1998,J Virol.72(10):8150-7；Zufferey et al.,1998,J Virol 72(12):9873-80))。
在一些实施方案中，载体不包含增强子。在一些实施方案中，慢病毒载体包含LTR序列，优选地具有去除3’LTR中的启动子和增强子序列的突变U3区(ΔU3)。
还可引入包装序列Ψ(psi)以帮助多核苷酸序列包封到载体颗粒中(Kessler等人，2007年，《白血病》，21(9):1859-74；Paschen等人，2004年，《癌症免疫疗法》12(6)：196-203(Kessler et al.,2007,Leukemia,21(9):1859-74；Paschen et al.,2004,CancerImmunol Immunother 12(6):196-203))。
在一些实施方案中，本发明涵盖包含慢病毒包装序列ψ(psi)的慢病毒载体。
还可在慢病毒载体多核苷酸序列中包括其他附加的功能性序列，例如转运RNA结合位点或引物结合位点(PBS)、或野生型土拨鼠转录后调节元件(WPRE)或突变型土拨鼠转录后调节元件(WPREm)，该突变是引入WPRE中蛋白X的起始密码子以避免X蛋白肽的表达的突变，这在一些实施方案中允许转基因在体内更稳定的表达。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含PBS。在一个实施方案中，本发明涵盖包含WPRE和/或IRES的慢病毒载体。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含至少一个cPPT/CTS序列、一个Ψ序列、一个(优选2个)LTR序列，以及包括在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子的转录控制下的转基因的表达盒、一个β2m启动子或一个I类MHC启动子。
还提供了产生慢病毒载体颗粒的方法和慢病毒载体颗粒。慢病毒载体颗粒(或慢病毒颗粒载体)包含与病毒蛋白相关的慢病毒载体。载体可以是整合载体(IL)(特别是用于制备如下所示的转基因小鼠)或者可以是非整合载体(NIL)，特别是用于施用于人类受试者。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码根据本文公开的任何实施方案的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO5、SEQID NO8、SEQ ID NO11、SEQ ID NO14、SEQ ID NO108、SEQ ID NO111、SEQ ID NO114、SEQ IDNO117和SEQ ID NO120的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO8、SEQ IDNO11、SEQ ID NO14、SEQ ID NO108、SEQ ID NO111、SEQ ID NO114、SEQ ID NO117和SEQ IDNO120的氨基酸序列组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由其组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列或由其组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或由其组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列或由其组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码由氨基酸序列Genbank:YP_009724390.1(SEQ ID NO:1)组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含与SEQ ID NO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。此类蛋白质S衍生物或片段的具体实施方案也包含在慢病毒载体颗粒的这些实施方案中。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117或120至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。此类蛋白质S衍生物或片段的具体实施方案也包含在慢病毒载体颗粒的这些实施方案中。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码由与SEQ ID NO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。本文公开的此类蛋白质S衍生物或片段的具体实施方案也包含在慢病毒载体颗粒的这些实施方案中。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码由与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:120至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。此类蛋白质S衍生物或片段的具体实施方案也包含在慢病毒载体颗粒的这些实施方案中。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含相对于SEQ ID NO:1具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化的氨基酸序列的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白包含相对于SEQ ID NO:1具有不多于1、不多于2、不多于3、不多于4、不多于5、不多于6、不多于7、不多于8、不多于9或不多于10个氨基酸变化的氨基酸序列。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码包含相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ IDNO:117或SEQ ID NO:120具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化的氨基酸序列的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白包含相对于SEQ ID NO:1具有不多于1、不多于2、不多于3、不多于4、不多于5、不多于6、不多于7、不多于8、不多于9或不多于10个氨基酸变化的氨基酸序列。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码由相对于SEQ ID NO:1具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化的氨基酸序列组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由相对于SEQ ID NO:1具有不多于1、不多于2、不多于3、不多于4、不多于5、不多于6、不多于7、不多于8、不多于9或不多于10个氨基酸变化的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码由相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ IDNO:117或SEQ ID NO:120具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化的氨基酸序列组成的SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白由相对于SEQ ID NO:1具有不多于1、不多于2、不多于3、不多于4、不多于5、不多于6、不多于7、不多于8、不多于9或不多于10个氨基酸变化的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码SARS-CoV-2刺突蛋白，其带有突变，例如S2PΔF(S2PdeltaF)或S2P3F蛋白衍生物中包含的突变。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码SARS-CoV-2刺突蛋白，所述刺突蛋白在残基614处带有取代、例如D614G，或包含此类取代。在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码SARS-CoV-2刺突蛋白，其带有在所谓的变体SARS-CoV-2VUI 2020 12/01S蛋白中鉴定的突变，即通过刺突蛋白的氨基酸残基的取代或缺失而产生的突变，例如缺失69-70、缺失144、N501Y、取代A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码由包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码的SARS-CoV-2S蛋白。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码SARS-CoV-2S蛋白，其由由Genbank:NC_045512.2(SEQ ID NO:2)的核苷酸21563至25384组成的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒包含与SEQ ID NO:2至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码SARS-CoV-2S蛋白，所述SARS-CoV-2S蛋白由带有相对于SEQ ID NO:2序列的突变的核苷酸序列编码，其中该突变包含至少一个非同义突变。在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码SARS-CoV-2S蛋白，其核苷酸序列在SEQID No.2序列的位置23403处带有突变，其中密码子GGT发生突变，特别是被密码子GAT取代(对应于SEQ ID No.1的编码S蛋白中的位置614处的突变，特别是D614G取代)。在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒编码所谓的变体SARS-CoV-2VUI 202012/01的刺突蛋白，其中刺突蛋白通过相对于SEQ ID No.2序列的核苷酸的取代或缺失而带有多个突变，并且其中核苷酸突变导致所编码刺突蛋白的氨基酸残基发生以下变化：缺失69-70、缺失144、取代N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒包含密码子优化的核苷酸序列，例如SEQ IDNO:2的密码子优化变体、或编码S2PΔF(S2PdeltaF)或S2P3F衍生物的核苷酸序列的密码子优化变体。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒包含编码SARS-CoV-2S蛋白的核苷酸序列，该蛋白包含K986P和V987P氨基酸取代。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒包含编码SARS-CoV-2S蛋白的核苷酸序列，该蛋白包含其中例如在LV::S2P3F中氨基酸681-686PRRARS(SEQ ID No.22)改变为PGSAGS(SEQ ID No.23)的修饰。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒包含编码SARS-CoV-2S蛋白的核苷酸序列，该蛋白包含其中例如在LV::S2PΔF(LV::S2PdeltaF)中氨基酸675-685(QTQTNSPRRAR)(SEQID No.24)被删除的修饰。
在一些实施方案中，假型慢病毒载体颗粒包含选自以下的多核苷酸：
编码SEQ ID No.13的S2PΔF(S2PdeltaF)的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.13至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，特别是在RBD中具有突变、特别是缺失的编码序列，
编码SEQ ID No.10的S2P3F的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.10至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，特别是其中所述具有与SEQ ID No.10至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列包含突变986K→P和987V→P。
编码SEQ ID No.7的S2P的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.7至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
编码SEQ ID No.2的SFL的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.2至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
编码SEQ ID No.107的S-B1.1.7的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.107至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
编码SEQ ID No.110的S-B351的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.110至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
编码SEQ ID No.113的S-B1.1.7S-B351-2P的多核苷酸，或者具有与SEQ IDNo.113至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
编码SEQ ID No.116的SFL-D614G的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.116至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，和
编码SEQ ID No.119的S-P1的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.119至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒包含HIV-1Gag和Pol蛋白。在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒包含亚型D，特别是HIV-1NDK、Gag和Pol蛋白。
根据一些实施方案，慢病毒颗粒是在用DNA质粒转化的宿主细胞中获得的。
此类DNA质粒可包含：
-细菌复制起点(例如：pUC ori)；
-抗生素抗性基因(例如：KanR)供选择；更具体地：
-慢病毒载体，其包含至少一种编码SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段的核酸，转录连接至CMV启动子。
这种方法允许产生根据本发明的重组载体颗粒，包括以下步骤：
i)用慢病毒载体转染合适的宿主细胞；
ii)用含有编码至少逆转录病毒(优选慢病毒)的结构和聚合酶(+整合酶)活性的病毒DNA序列的包装质粒载体转染所述宿主细胞；此类包装质粒记载在本领域中(Dull等人，1998年，《病毒学杂志》，72(11):8463-71；Zufferey等人，1998年，《病毒学杂志》72(12)：9873-80(Miyoshi H et al,1998,J Virol.72(10):8150-7；Zufferey et al.,1998,JVirol 72(12):9873-80))。
iii)培养所述转染的宿主细胞以获得所述慢病毒载体的表达并将其包装成慢病毒载体颗粒；和
iv)在所述培养的宿主细胞中收获由步骤iii)的表达和包装产生的慢病毒载体颗粒。
出于不同的原因，特别是对人类受试者的施用，对获得的逆转录病毒颗粒进行假型化(即，添加或替换特定的颗粒包膜蛋白)可能会有帮助。在一些实施方案中，假型化扩大了可被转导的细胞类型的范围，同时避免成为人类群体中预先存在的免疫力的靶标。
为对本发明的逆转录病毒颗粒进行假型化，可用一种或多种编码病毒包膜蛋白、优选VSV-G包膜蛋白的包膜DNA质粒进一步转染宿主细胞。
合适的宿主细胞优选是培养的人类细胞系，例如HEK细胞系，例如HEK293T细胞系。
可替代地，用于产生载体颗粒的方法在宿主细胞中进行，该宿主细胞的基因组已经用以下一种或多种组分稳定转化：慢病毒载体DNA序列、包装基因和包膜基因。此类DNA序列可被视为类似于根据本发明的前病毒载体，其包含额外的启动子以允许载体序列的转录并提高颗粒产生率。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞被进一步修饰以能够在培养基中以连续的方式产生病毒颗粒，而整个细胞不会肿胀或死亡。关于生产病毒颗粒的此类技术，可参考Strang等人，2005年，《病毒学杂志》79(3)：1165-71；Relander等人，2005年，《分子治疗》11(3)：452-9(Strang et al.,2005,J Virol 79(3):1165-71；Relander et al.,2005,MolTher 11(3):452-9)；Stewart等人，2009年，《基因治疗》，16(6):805-14(Stewart et al.,2009,Gene Ther,16(6):805-14)；和Stuart等人，2011年，《人类基因治疗》(Stuart etal.,2011,Hum gene Ther)。
本发明的一个目的包括用慢病毒颗粒载体转化的宿主细胞。
慢病毒颗粒载体可包含以下元素，如前所述：
-cPPT/CTS多核苷酸序列；和
-在β2m或MHCI启动子控制下的编码CAR的核酸，以及任选地上述附加元件之一。
优选地，慢病毒颗粒的剂量为106、2x106、5x106、107、2x107、5x107、108、2x108、5x108或109TU。
本公开提供了带有根据本公开SARS-CoV-2S蛋白的假型慢病毒载体颗粒。慢病毒载体可以是整合型的或非整合型的。慢病毒载体是带有SARS-CoV-2S蛋白的假型慢病毒载体(即“慢病毒载体颗粒”)。
本公开还提供了一种免疫原性组合物，其包含带有根据本公开的SARS-CoV-2S蛋白的慢病毒载体颗粒。本文公开的所有与慢病毒颗粒有关的实施方案均适用于免疫原性组合物的定义。
在一些实施方案中，免疫原性组合物用于预防SARS-CoV-2感染人类受试者的方法中。在一些实施方案中，免疫原性组合物用于在有暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染的风险的人类受试者中防止SARS-CoV-2复制的方法。在一些实施方案中，免疫原组合物用于预防与SARS-CoV-2感染相关的症状的发展或疾病的发展的方法中，例如在有暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV 2感染的风险的人类受试者中的COVID-19。在一些实施方案中，免疫原性组合物用于在有暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染的风险的人类受试者中预防与SARS-CoV-2感染相关的神经功能结果的发生的方法中。在一些实施方案中，免疫原性组合物用于保护有暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染的风险的人类受试者的中枢神经系统(CNS)的方法中。在一些实施方案中，在用于所公开的方法中的任何这些应用中，免疫原性组合物可作为预防剂以有效量施用给受试者，以引发抗SARS-CoV-2的免疫应答。
在一些实施方案中，免疫原组合物用于保护人类受试者免受SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的症状或疾病(COVID-19)的发展的方法中，其中所述受试者有发展为肺部和/或中枢神经系统病变的风险。特别地，人类受试者需要对中枢神经系统的免疫保护，防止SARS-CoV-2复制，因为他/她受到共存疾病、特别是影响中枢神经系统的共存疾病的影响。
本公开还提供了一种疫苗组合物，其包含带有根据本公开的SARS-CoV-2S蛋白的慢病毒载体颗粒和载体。在一些实施方案中，该疫苗降低了接种疫苗的受试者、特别是人类受试者患COVID-19的可能性。在一些实施方案中，该降低为至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，疫苗使受试者的COVID-19疾病严重程度降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，该降低为至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在一些实施方案中，疫苗提供针对SARS-Cov-2感染的保护，特别是灭菌保护。在一些实施方案中，疫苗用于本文公开的关于免疫原性组合物的方法中。
本文公开的免疫原性组合物和疫苗可根据本文公开的施用途径和施用方案进行施用，特别是根据下文C.中公开的具体实施方案，特别是根据图示的实施方案。
C.诱导和/或激活针对严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)的保护性免疫应答的方法
还提供了诱导或激活针对严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)的保护性免疫反应的方法，包括向受试者的上呼吸道施用有效量的诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答的药剂。在某些实施方案中，诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答的药剂是编码严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段的假型慢病毒载体颗粒。本文方法的公开内容同样适用于在本公开中公开的方法中使用的免疫原性组合物或在本公开中公开的方法中使用的疫苗。
在一些实施方案中，药剂通过经鼻吸入施用。
如本文所用，“施用至上呼吸道”包括导致递送至上呼吸道粘膜内层的任何类型的施用，且包括特别是经鼻施用。对上呼吸道的施用包括但不限于雾化吸入、经鼻滴注、鼻腔吹入及其所有组合。在一些实施方案中，施用是通过雾化吸入。在一些实施方案中，施用是通过经鼻滴注。在一些实施方案中，施用是通过鼻腔吹入。
在一些实施方案中，治疗过程由对上呼吸道的单次给药组成。在一些实施方案中，治疗过程包括对上呼吸道的多次给药。在一些实施方案中，治疗过程包括至少一次上呼吸道给药和至少一次呼吸道外给药。在一些实施方案中，治疗过程包括至少一次经由呼吸道外部途径的初免给药，随后是至少一次对上呼吸道的增强给药。呼吸道外给药可以是肌内、皮内或皮下给药。在一些实施方案中，治疗过程包括至少初免/增强或初免/靶向给药。在一些实施方案中，给药方案包括上呼吸道外的初免给药，例如全身(特别是肌内)给药和对上呼吸道的增强或靶向给药，或由上呼吸道外的初免给药，例如全身(特别是肌内)给药和对上呼吸道的增强或靶向给药组成。药剂的给药剂量在初免和增强/靶向给药步骤中可以相同或不同，特别是对上呼吸道的给药剂量可更高。上呼吸道给药的详情如下。
在一个特定的实施方案中，慢病毒载体颗粒是LV::SFL，特别是NILV::SFL，给药方案包括全身性的(特别是肌肉注射初免)和对上呼吸道的增强(特别是通过鼻内注射增强)。
在一个特定的实施方案中，慢病毒载体颗粒是LV::S预融合(prefusion)，特别是NILV::S预融合(prefusion)，例如LV::S2PΔF或NILV::S2PΔF，或LV::S2P3F或NI LV::S2P3F，并且给药方案包括全身性的(特别是肌肉注射初免)和对上呼吸道的增强(特别是通过鼻内注射增强)。
在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒包含选自以下的多核苷酸：
-编码SEQ ID No.13的S2PΔF(S2PdeltaF)的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.13至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，特别是在RBD中具有突变、特别是缺失的编码序列，
-编码SEQ ID No.10的S2P3F的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.10至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，特别是其中所述具有与SEQID No.10至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列包含突变986K→P和987V→P。
-编码SEQ ID No.7的S2P的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.7至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
-编码SEQ ID No.2的SFL的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.2至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
-编码SEQ ID No.107的S-B1.1.7的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.107至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
-编码SEQ ID No.110的S-B351的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.110至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
-编码SEQ ID No.113的S-B1.1.7S-B351-2P的多核苷酸，或者具有与SEQ IDNo.113至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
-编码SEQ ID No.116的SFL-D614G的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.116至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，和
-编码SEQ ID No.119的S-P1的多核苷酸，或者具有与SEQ ID No.119至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变。
在一些实施方案中，保护性免疫应答包括在受试者体内产生SARS-CoV-2中和抗体。在一些实施方案中，中和抗体包括IgG抗体。在一些实施方案中，保护性免疫应答包括在受试者体内产生SARS-CoV-2S特异性T细胞。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞包括CD4+T细胞。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞包括CD8+T细胞。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞包括肺CD8+T细胞。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞包括产生IFN-γ的T细胞。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞包含具有效应记忆(Tem)和/或驻留记忆(Trm)表型的T细胞。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S特异性T细胞被募集到嗅球。在一些实施方案中，保护性免疫应答减缓了SARS-CoV-2感染的至少一种症状的发展。在一些实施方案中，保护性免疫应答缩短了受感染受试者遭受SARS-CoV-2感染的至少一种症状的时间段。在一些实施方案中，保护性免疫应答降低了受试者发生SARS-CoV-2感染相关炎症的可能性。
在各种实施方案中，假型慢病毒载体颗粒可编码任何严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段，其在本文中公开于与慢病毒载体颗粒的描述相关的上述实施方案中。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白衍生物具有与SEQ ID NO:1至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白衍生物由具有与SEQ ID NO:2至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列表达。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白片段包含选自肽61-75(NVTWFHAIHVSGTNG(SEQ ID NO:15))、肽536-550(NKCVNFNFNGLTGTG(SEQ IDNO:16))和肽576-590(VRDPQTLEILDITPC(SEQ ID NO:17))的肽。在一些实施方案中，SARS-CoV-2S衍生物或其片段包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，该修饰选自：(i)986K→P和987V→P，(ii)681PRRARS686(SEQ ID NO:22)→681PGSAGS686(SEQ ID NO：23)，和(iii)986K→P、987V→P和675QTQTNSPRRAR685(SEQ IDNO:24)缺失。在一些实施方案中，严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段包含选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：111、SEQID NO：114、SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120的氨基酸序列或由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：111、SEQ IDNO：114、SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所施用的慢病毒载体颗粒是整合型的。在一些实施方案中，所施用的慢病毒载体颗粒是非整合型的。在一些实施方案中，所施用的非整合型慢病毒颗粒在整合酶编码序列中包含D64V突变。在一些实施方案中，所施用的慢病毒载体颗粒是用水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型化的。在一些实施方案中，慢病毒载体颗粒作为包含慢病毒载体颗粒和药学上可接受的载体的疫苗制剂施用。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含启动子，该启动子驱动严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段的高表达，并驱动足够量的表达以通过诱导的免疫应答消除。在一些实施方案中，启动子缺少增强子元件以避免插入效应。
在一些实施方案中，在给药后第4天整合到小鼠或仓鼠动物模型细胞中的慢病毒DNA的至少95％、99％、99.9％或99.99％在给药后第21天被消除。
在一些实施方案中，慢病毒颗粒的剂量为106、2x106、5x106、107、2x107、5x107、108、2x108、5x108或109TU。
慢病毒载体诱导的免疫应答可以是B细胞应答、CD4+T细胞应答和/或CD8+T细胞应答。
因此，本发明提供了可用作药物或疫苗的载体，特别是用于上呼吸道给药。
所公开的慢病毒载体能够诱导、改善B细胞应答、CD4+T细胞应答和/或CD8+T细胞应答(包括记忆CTL应答)的发生，或通常与B细胞应答、CD4+T细胞应答和/或CD8+T细胞应答(包括记忆CTL应答)的发生有关。
在一些实施方案中，慢病毒载体与佐剂、其他免疫原性组合物和/或任何其他治疗手段组合使用。
根据一些实施方案，本文定义或说明的免疫原性组合物用于在受试者的上呼吸道和/或大脑中诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答以抵抗SARS-CoV-2。
根据一些实施方案，免疫原性组合物用于通过引发B细胞和T细胞应答而诱导肺部和大脑对祖先株(ancestral)(包括选自SARS-CoV-2祖先毒株、SARS-CoV-2D614G毒株和SARS-CoV-1B1.117毒株的SARS-CoV 2)以及对新出现的SARS-CoV-2变体(例如SARS-CoV2P.1变体)的交叉保护性免疫应答。
根据一些实施方案，免疫原性组合物用于如本文所定义的用途，并且其特征在于剂型或假型慢病毒颗粒包含如本文所定义的假型慢病毒颗粒，其中所述假型慢病毒颗粒是非整合型的。
在一些实施方案中，这些免疫原性组合物用于引发针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答，其中该应答引发SARS-CoV-2S特异性T细胞，特别是包含肺CD8+T细胞和/或产生IFN-γ的T细胞的SARS-CoV-2S特异性T细胞。
根据一些实施方案，免疫原性组合物用于引发针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答，其中该应答引发包含具有效应记忆(Tem)和/或驻留记忆(Trm)表型的T细胞的CD8+T细胞。
根据一些实施方案，免疫原性组合物用于如本文所定义的用途，SARS-CoV-2S特异性T细胞被募集到嗅球。
根据一些实施方案，根据本发明使用的免疫原性组合物的特征在于，严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段包含选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：108、SEQID NO：111、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120的氨基酸序列，或由SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：108、SEQ IDNO：111、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120的氨基酸序列组成。
根据一些实施方案，免疫原性组合物用于预防或减轻受试者中SARS-CoV-2感染相关的炎症。
D.用于上呼吸道给药的剂型
本公开的免疫原性组合物可适于施用至受试者的上呼吸道的剂型提供。合适的制剂是本领域已知的。在一些实施方案中，剂型适用于雾化吸入。在一些实施方案中，该剂型适用于经鼻滴注。在一些实施方案中，经鼻剂型适用于鼻腔吹入。在一些实施方案中，剂型以单一剂量等分。在一些实施方案中，剂型以单一剂量包装。
E.试剂盒
还提供了适用于实施本文所公开的方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含用于向受试者的上呼吸道施用根据本公开的编码SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段的假型慢病毒载体颗粒的剂型，以及施用器。在一些实施方案中，施用器是用于雾化吸入的施用器。在一些实施方案中，施用器是用于经鼻滴注的施用器。在一些实施方案中，施用器是用于鼻腔吹入的施用器。各实施方案的合适实施例是本领域已知的并且可以使用。
F.慢病毒载体
还提供了新型且非显而易见的慢病毒载体和用于产生所述慢病毒载体的质粒。LV和质粒编码严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段。
已经如此描述了本发明的不同实施方案，本领域技术人员应注意，本文公开内容仅是示例性的并且可在本发明的范围内作出多种其他替代、改编和修改。因此，本发明不限于本文所示的具体实施例。
G.实施例
实施例1：在黄金仓鼠经处理表达人ACE2的黄金仓鼠和小鼠的临床前动物模型中鼻内接种抗SARS-Cov-2的LV
实施例1.1：材料和方法
1.1.1构建编码源自SCoV-2的SFL、S1-S2或S1的转移pFLAP质粒。
从pMK-RQ_S-2019-nCoV中扩增密码子优化的全长S(1-1273)序列，并插入到pFlap-ieCMV-WPREm的BamHI和XhoI位点之间。编码S1-S2(1-1211)或S1(1-681)的序列通过PCR从pFlap-ieCMV-SFL-WPREm质粒中扩增，并亚克隆到BamHI和XhoI限制位点之间的pFlap-ieCMV-WPREm中。将每个PCR产物插入到天然人ieCMV启动子和突变的WPRE(土拨鼠转录后调控元件)序列之间，其中将突变引入WPRE中蛋白质X的起始密码子以避免X蛋白肽的表达。质粒在补充有50μg/ml卡那霉素的溶原性肉汤(LB)中的大肠杆菌DH5a中扩增，使用NucleoBond Xtra Maxi EF试剂盒(Macherey Nagel)纯化，并重悬在Tris-EDTA无内毒素(TE-EF)缓冲液中过夜。用NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific)对质粒进行定量，在TE-EF缓冲液中调节至1μg/μl，等分并储存在-20℃下。质粒DNA通过(i)限制性消化的诊断检查，和(ii)对转基因插入位点附近的区域进行测序来验证。
1.1.2LV载体的产生和滴定
非复制性整合型LV载体是在人胚胎肾(HEK)-293T细胞中产生的，如前所述(Zennou等人，2020年)。6×106细胞/培养皿在DMEM中培养，并以三重方式与1ml以下物质的混合物共转染：(i)2.5μg/ml的pSD-GP-NDK包装质粒，编码密码子优化的gag-pol-tat-rre-rev，(ii)10μg/ml的VSV-G Indiana包膜质粒，以及(iii)含有125mM Ca(ClO3)2的Hepes 1X中的10μg/ml转移pFLAP质粒。在转染后48小时收集上清液，在4℃下以2500rpm离心6分钟进行澄清，然后在Hepes缓冲溶液中在37℃下以最终浓度为10U/ml的苯甲酸酶处理30分钟，该缓冲溶液含有MgCl2(2mM)最后消除残留的DNA。将LV载体等分并保存在-80℃下。为测定LV制剂的滴度，在8μM阻碍细胞增殖的阿非迪霉素(aphidicolin)(Sigma)存在下，将HEK-293T以4×105细胞/孔分布在完全DMEM中的平底6孔板中。随后用连续稀释的LV制剂转导细胞。通过使用特异性针对pFLAP质粒的正向5’-TGG AGG AGG AGA TAT GAG GG-3’(SEQ ID NO:100)和反向5’-CTG CTG CAC TAT ACC AGA CA-3’(SEQ ID NO:101)引物，在转导后第3天通过qPCR在总裂解物上将与核基因转移效率成比例的滴度测定为转导单位(TU)/ml，特异性针对宿主管家基因gadph的正向5’-TCT CCT CTG ACT TCA ACA GC-3’(SEQ ID NO:102)和反向5’-CCC TGC ACT TTT TAA GAG CC-3’(SEQ ID NO:103)引物，如别处所述(Iglesias等人，2006年)。
1.1.3小鼠研究
使用6至10周龄的雌性C57BL/6J小鼠(Janvier，Le Genest Saint Isle，法国)。购买成年(即80-90克重)雄性金色大鼠(Mesocricetus auratus)金黄仓鼠(Janvier,LeGenest Saint Isle,法国)。在免疫方案开始时，它们的重量在100至120克之间。在巴斯德研究所安全、动物护理和使用委员会批准后，根据欧洲和法国指南(指令86/609/CEE和1987年10月19日第87-848号法令)对动物进行实验，并由当地伦理委员会(CETEA#DAP20007)和高等教育与研究部APAFIS#24627-2020031117362508v1提供方案协议。通过腹腔内(i.p.)注射给小鼠接种指定TU的LV。在免疫后的不同时间点收集血清，以监测结合和中和活性。
1.1.4SARS-CoV-2接种
Ad5::hACE2预处理的小鼠或仓鼠通过腹腔注射氯胺酮(Ketamine)和甲苯噻嗪(Xylazine)的混合物麻醉，转移到PSM-III中，在PSM-III接种1×105TCID50的在VeroE6细胞中扩增的SARS-CoV-2临床分离株，由法国国家病毒呼吸研究所提供。小鼠的病毒接种物为20μl，仓鼠的病毒接种物为50μl。随后将动物饲养在巴斯德研究所BSL3动物设施的隔离器中。从感染活SARS-CoV-2的小鼠体内回收的器官和液体按照生物安全等级BSL3设施的经批准的标准操作程序进行操作。
1.1.5重组SCoV-2蛋白质变体
编码SARS-CoV-2S胞外结构域(a.a.1至1208)、S1单体(a.a.16至681)和RBD亚结构域(氨基酸331至519)(二者之前是小鼠IgK前导肽，之后是8xHis标签(SEQ ID NO:104))的稳定折叠子三聚体形式的密码子优化的核苷酸片段被合成并克隆到pcDNATM3.1/Zeo(+)表达载体(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))中。如先前所述(Lorin和Mouquet，2015年)，使用聚乙烯亚胺(PEI)沉淀法通过瞬时共转染指数式生长的FreestyleTM293-F悬浮细胞(赛默飞世尔科技公司，Waltham，MA)产生蛋白质。根据制造商的说明(赛默飞世尔科技公司)，使用NiExcel树脂通过亲和层析法纯化重组SCoV-2蛋白。在还原和非还原条件下使用NuPAGETM3-8％ Tris-Acetate凝胶(Life Technologies)进行SDS-PAGE后，使用Pierce银染试剂盒(赛默飞世尔科技公司)通过凝胶内蛋白质银染评估蛋白质纯度。使用/>透析盒(10kDa MW截止值，赛默飞世尔科技公司)对纯化的蛋白质透析出PBS过夜。使用NanoDropTMOne仪器(赛默飞世尔科技公司)测定蛋白质浓度。
1.1.6ELISA
96孔Nunc Polysorp板(Nunc，Thermo Scientific)在4℃下用100ng/孔的纯化tri-S蛋白在pH 9.6的碳酸盐缓冲液中涂覆过夜。用含有0.1％ Tween 20(PBST)的PBS洗涤后，在室温下用含有1％ Tween20和10％ FBS的PBS封闭板孔2小时。PBST洗涤后，加入含有10％ FBS的PBST中以1:100稀释的血清和4个连续1:10稀释液，并在37℃下孵育2小时。PBST洗涤后，将板用1000倍稀释的过氧化酶共轭的山羊抗小鼠IgG/IgM(英国剑桥郡JacksonImmunoResearch Europe Ltd)孵育1小时。PBST洗涤后，通过添加100μl TMB显色底物(TMB，Eurobio Scientific)显示板。孵育30分钟后，在PR3100读取器上在450nm/620nm处测量光密度。
1.1.7nAb检测
通过抑制试验评估nAb的血浆的连续稀释，该试验使用被转导稳定表达人ACE2的人胚胎肾(HEK)293-T细胞，以及带有报告萤火虫荧光素酶(luciferase firefly)基因的安全、非复制的SCoV-2假型LV颗粒，允许通过模拟天然SARS-CoV-2病毒的融合步骤来定量宿主细胞入侵(Sterlin等人)。首先，使用每种血清在DMEM中的最终体积为50μl的连续稀释液，所述稀释液包含10％热灭活FCS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，将1.5×102TU的SCoV-2假型LV在室温下在U形底板中预孵育30分钟。随后将样品转移至透明平底96孔黑色板中，每孔接受50μl中包含的2×104hACE2+HEK293-T细胞。在37℃、5％CO2下孵育2天后，通过使用带有报告基因裂解缓冲液(Promega)的荧光素酶测定系统试剂盒测量荧光素酶活性，从而测定hACE2+HEK293-T细胞通过假型LV颗粒的转导效率。为此，将上清液从培养孔中完全去除，将40μl报告基因裂解缓冲液1X和50μl荧光素酶检测试剂(萤火虫荧光素酶)依次添加到每个培养孔中。使用LB 960板读取器(Berthold)定量生物发光信号。
1.18SFL T细胞表位作图
为绘制免疫显性表位，将跨越整个刺突蛋白的肽汇集到十个汇集池(pool)中，每个池包含重叠10个氨基酸的15个氨基酸残基。合成肽购自Mimotopes(澳大利亚)。如先前所述进行IFN-g ELISpot测定(Dion等人，2013年)。这些不同组的汇集肽用于基质测定，以通过ICS绘制每个构建体诱导的表位应答。将肽以2mg/ml的浓度溶解在DMSO中，在使用前用培养基以1μg/ml和2–5μg/ml进行稀释，然后分别用于ELISpot和ICS测定。如果一式三份孔中斑点形成细胞的中位数是对照孔中观察到的至少两倍，并且在减除背景后检测到每百万个脾细胞中至少有50个斑点形成细胞，则认为ELISpot中的反应是阳性的。
1.1.9Ad5基因转移载体的生成及小鼠鼻内预处理
Ad5基因转移载体是通过使用ViraPower腺病毒无启动子网关表达试剂盒(赛默飞世尔科技公司，法国)生成的。pCMV-BamH1-Xho1-WPRE序列通过使用以下物质从pTRIPΔU3CMV质粒中进行PCR扩增：(i)正向引物，编码5’端的attB1，和(ii)反向引物，编码5'端的attB2和SV40 polyA信号序列。attb-PCR产物通过BP Clonase反应克隆到网关pDORN207供体载体中，以形成pDORN207-CMV-BamH1-Xho1-WPRE-SV40 polyA。hACE2从表达hACE2的pcDNA3.11的质粒衍生物(来自Nicolas Escriou的慷慨馈赠)中扩增，而egfp从pTRIP-ieCMV-eGFP-WPRE2中扩增。扩增的PCR产物通过BamH1和Xho1限制位点克隆到pDORN207-CMV-BamH1-Xho1-WPRE-SV40 polyA质粒中。为获得最终的Ad5质粒，将带有hACE2或gfp基因的pDORN207载体通过LR Clonase反应进一步插入pAd/PL-DESTTM载体中。
根据制造商的方案(ViraPower腺病毒无启动子网关表达试剂盒，赛默飞世尔科技公司)，通过用pAd CMV-GFP-WPPRE-SV40 polyA或pAd-CCMV-hACE2-WPRE-SV40polyA质粒转染反式互补E3的HEK-293A细胞系，随后进行载体扩增，而生成Ad5病毒颗粒。Ad5颗粒使用腺病毒-X快速Maxi纯化试剂盒进行纯化，并使用Amicon Ultra-4 10k离心过滤装置进行浓缩。将载体重新悬浮并储存在pH 7.5的补充有2.5％葡萄糖的PIPES缓冲液中，温度为-80℃。如Gallaher等人所述3，使用qRT-PCR方案滴定Ad5，该方案适用于HEK-293T细胞。
攻击前四天，在全身麻醉下，向小鼠鼻内注射重新悬浮在15μl PBS中的2.4×109IGU的Ad5::hACE2、Ad5::GFP或对照空载体，所述全身麻醉通过腹腔注射氯胺酮(Imalgene，100mg/kg)和甲苯噻嗪(Rompun，10mg/kg)的混合物获得。
1.1.10蛋白免疫印迹
通过蛋白质免疫印迹法评估hACE2在Ad5::hACE2转导小鼠肺中的表达。将肺匀浆的1×106细胞在4–12％ NuPAGE Bis-Tris蛋白凝胶(赛默飞世尔科技公司，法国)上溶解，然后转移至硝酸纤维素膜(伯乐(Biorad)，法国)。硝酸纤维素膜在0.5％ Tween PBS(PBS-T)中的5％脱脂牛奶中在室温下封闭2小时，并用1μg/mL的山羊抗hACE2初级抗体(AF933，R&D systems)探测过夜。用PBS-T进行三次间隔10分钟的洗涤后，将膜在室温下用HRP共轭的抗山羊二级抗体和HRP共轭的抗-β-肌动蛋白(ab197277，Abcam)孵育1小时。用PBS-T洗涤膜三次，然后通过ChemiDoc XRS+(Biorad，法国)上的super signal west femto最高灵敏度底物(ThermoFisher，法国)用增强化学发光可视化。PageRuler Plus预染蛋白梯用作尺寸参考(size reference)。
1.1.11肺部SARS-CoV-2病毒载量的测定
在无菌条件下取出每个肺叶的一半，并在-80℃下冷冻。使用500μl冰冷PBS中的裂解基质D(MP生物医疗公司(MP Biomedical))，以4.0m/s的速度将器官解冻并均质化20s两次。在MP Biomedical Fastprep 24组织匀浆器中进行均质化。根据制造商的程序，使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen)从70μl肺匀浆中提取颗粒病毒RNA。基本上如Corman等人所述(Corman等人，2020年)，使用SuperScriptTMIII铂一步法定量RT-PCR系统(Invitrogen)以及如表1所示的靶向SARS-CoV-2包膜(E)基因的引物和探针(Eurofins)，在逆转录和实时PCR后测定病毒载量。使用T7 RiboMAX Express大规模RNA生产系统(Promega)合成源自质粒pCI/SARS-CoV E的体外转录RNA，然后通过苯酚/氯仿提取和两次乙醇连续沉淀进行纯化。通过光密度测量测定RNA浓度，然后在含有100μg/mL tRNA载体的无RNA酶的水中将RNA稀释至109基因组当量/μL，并在-80℃下储存在一次性等分试样中。在含有10μg/ml tRNA载体的无RNA酶的水中制备该体外转录RNA的连续稀释液，并用于在每次测定中建立标准曲线。热循环条件为：(i)在55℃下逆转录10分钟，(ii)在95℃下酶失活3分钟，以及(iii)在95℃下15秒、在58℃下30秒进行变性/扩增45个循环。在ABI 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems)上分析产物。
1.1.12肺部先天免疫细胞的细胞计量分析
将来自个体小鼠的肺使用胶原酶-DNA酶-I在37℃下孵育30分钟，并使用GentleMacs均质化。细胞通过100μm孔过滤器进行过滤，并在1200rpm下离心8分钟。然后用红细胞裂解缓冲液(Sigma)处理细胞，在PBS中洗涤两次。然后按如下方式对细胞进行染色。(i)检测DC、单核细胞、肺泡和间质巨噬细胞：Near IR Live/Dead(Invitrogen)、FcγII/III受体阻断抗CD16/CD32(BD Biosciences)、BV605-抗-CD45(BD Biosciences)、PE-抗-CD11b(eBioscience)、PE-Cy7-抗-CD11c(eBioscience)、BV450-抗-CD64(BD Biosciences)、FITC-抗-CD24(BD Biosciences)、BV711-抗-CD103(BioLegend)、AF700-抗-MHC-II(BioLegend)、PerCP-Cy5.5-抗-Ly6C(eBioscience)和APC抗-Ly-6G(Miltenyi)单克隆抗体，(ii)检测中性粒细胞或嗜酸性粒细胞：Near IR DL(Invitrogen)、FcγII/III受体阻断抗CD16/CD32(BD Biosciences)、PerCP-Vio700-抗-CD45(Miltenyi)、APC-抗-CD11b(BDBiosciences)，PE-Cy7-抗-CD11c(eBioscience)、FITC-抗-CD24(BD Bio科学)、AF700-抗-MHC-II(BioLegend)、PE-抗-Ly6G(BioLegends)、BV421-抗-Siglec-F(BD BioScience)，(III)检测肥大细胞、嗜碱性粒细胞、NK：Near IR DL、BV605-抗-CD45(BD Biosciences)、PE-抗-CD11b(eBioscience)、eF450-抗-CD11c(eBioscience)、PE-Cy7-抗-CD117(BDBiosciences)、APC-抗-FcER1(BioLegend)、AF700-抗-NKp46(BD Biosciences)、FITC-抗-CR3(BioLegends)，而无FcγII/III受体阻断抗-CD16/CD32。将细胞与合适的混合物在4℃下孵育25分钟。然后将细胞在含有3％ FCS的PBS中洗涤两次，然后固定在PFA 4％中并在4℃下孵育过夜。在Attune NxT细胞仪系统(英杰(Invitrogen))中采集细胞，并通过FlowJo软件(Treestar，OR，美国)分析数据。
1.1.13qRT-PCR检测肺部炎性细胞因子和趋化因子
将肺样品添加到含有1mL TRIzol试剂的裂解基质D(MP Biomedical)中，并使用MPBiomedical Fastprep 24组织匀浆器在30秒内以6.0m/s均质化两次。根据制造商的程序，使用TRIzol试剂(赛默飞世尔科技公司，法国)提取总RNA。在20μl反应中的2.5μM的oligo(dT)18引物(SEQ ID NO:105)、0.5mM的脱氧核糖核苷酸、2.0U的RNA酶抑制剂和SuperScript IV逆转录酶(赛默飞世尔科技公司，法国)的存在下，用4μg的RNA合成cDNA。实时PCR在QuantStudioTM7Flex实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司，法国)上进行。反应一式三份进行，最终反应体积为10μl，其含有5μl iQTM Green Supermix(Biorad，法国)、4μl在DEPC水中以1:15稀释的cDNA、以及0.5μl最终浓度为0.5μM的各正向和反向引物(表2)。使用以下热曲线：在95℃下进行3分钟的单循环聚合酶激活，然后是95℃下15秒和60℃下30秒的40次扩增循环(退火-延伸步骤)。平均CT值是根据靶细胞因子/趋化因子的相对定量从技术复制计算的。计算CT细胞因子/趋化因子扩增子与参考β-珠蛋白的CT的差异，称为ΔCT，以针对核酸数量的差异进行归一化。使用比较ΔΔCT方法将实验条件的ΔCT与PBS处理的小鼠进行比较。使用2-ΔΔCT进一步计算基因表达的差异倍数。
实施例1.2：编码SARS-CoV-2刺突蛋白变体的LV诱导抗体应答
为开发能够诱导SCoV-2特异性nAb的候选疫苗，我们在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子的转录控制下，生成了LV编码的密码子优化序列：(i)全长、膜锚定形式的S(LV::SFL)，(ii)S1-S2胞外结构域，无跨膜和C端短的胞内尾巴(LV::S1-S2)，或(iii)单独的S1(LV::S1)，它们都带有RBD(图1A)，具有潜在的构象异质性。为评估这些载体诱导的体液应答，对C57BL/6小鼠(n＝4/组)通过单次腹腔注射1×107TU/小鼠的LV或编码GFP的LV作为阴性对照进行免疫。在免疫后第1、2、3、4和6周，研究血清中SCoV-2特异性抗体应答。在LV::SFL或LV::S1-S2免疫的小鼠中，早在免疫后1周就可检测到SCoV-2特异性免疫球蛋白G(IgG)，其数量在免疫后第6周呈逐渐增加趋势，平均滴度±SEM分别为(4.5±2.9)×106或(1.5±1)×106。相比之下，SCoV-2特异性IgG滴度在其LV::S1免疫对应物中低100倍，即(7.1±6.1)×104(图1B)。
然后，使用可靠的中和试验评估血清中和SARS-CoV-2的能力，该试验基于nAb介导的非复制LV颗粒替代物(用SCoV-2假型化的)对hACE2+细胞入侵的抑制(Sterlin等人)。此类SCoV-2假型LV颗粒带有报告荧光素酶基因，该基因允许定量hACE2+宿主细胞入侵，与生物流体中可能含有的nAb的中和效率成反比。对来自LV::SFL、LV::S1-S2或LV::S1免疫小鼠的血清的50％有效浓度(EC50)的分析清楚地证明，LV::SFL是诱导SCoV-2特异性nAb的最有效载体(图1C)。此外，仅在LV::SFL免疫小鼠的血清中，nAb滴度与SCoV-2特异性IgG滴度相关(p<0.0001，R2＝0.645，双侧Spearman秩相关检验)(图1E)。这些结果强烈表明，在S1-S2或S1多肽中，相关B细胞表位的构象与天然SFL的构象不同，后者代表诱导nAb能够抑制SCoV-2-hACE2相互作用和宿主细胞入侵的唯一变体。来自LV::SFL免疫小鼠的血清的中和能力与生活在瓦卢瓦地区克雷皮(Crépy en Valois)——法国最早出现的流行地区之一——的一队列轻症感染人类的血清的中和能力的比较显示出等效的中和活性平均值(图1D)。这些数据预测了LV::SFL诱导的体液应答的保护潜力。
为潜在地提高LV::S载体在诱导中和抗体时的免疫原性，我们生成了编码稳定的预融合SCoV-2的LV载体，其工程化如下：
(i)具有预期增加的稳定性、带有两个986K->P和987V->P连续氨基酸(a.a.)取代的SCoV-2。确实已经证实，向刚性脯氨酸残基的氨基酸(a.a)取代通过降低构象熵来增加蛋白质稳定性。
(ii)在弗林蛋白酶切割位点处具有681PRRARS686(SEQ ID NO:22)->681PGSAGS686(SEQ ID NO：23)氨基酸(a.a.)取代的SCoV-2，因此无法被该蛋白水解酶识别。
(iii)带有986K->P和987V->P连续氨基酸(a.a.)取代并删除包含弗林蛋白酶切割位点的675QTQTNSPRRAR685(SEQ ID NO:24)的SCoV-2。
图17A示出了pFlap-ieCMV-SFL-WPREm的质粒图谱。
pFlap-ieCMV-SFL-WPREm的核苷酸序列如图20A所示，其中将其标识为SEQ ID NO:3。编码该载体中存在的S蛋白的核苷酸序列如图20B所示，其中将其标识为SEQ ID NO:4。编码该载体中存在的S蛋白的氨基酸序列如图20C所示，其中将其标识为SEQ ID NO:5。
图17B示出了pFlap-ieCMV-S2P-WPREm的质粒图谱。
pFlap-ieCMV-S2P-WPREm的核苷酸序列如图21A所示，其中将其标识为SEQ ID NO:6。编码该载体中存在的S蛋白的核苷酸序列如图21B所示，其中将其标识为SEQ ID NO:7。编码该载体中存在的S蛋白的氨基酸序列如图21C所示，其中将其标识为SEQ ID NO:8。
图17C示出了pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm的质粒图谱。
pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm的核苷酸序列如图22A所示，其中将其标识为SEQ IDNO:9。编码该载体中存在的S蛋白的核苷酸序列如图22B所示，其中将其标识为SEQ ID NO:10。编码该载体中存在的S蛋白的氨基酸序列如图22C所示，其中将其标识为SEQ ID NO:11。
图17D示出了pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm的质粒图谱。
pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm的核苷酸序列如图23A所示，其中将其标识为SEQID NO:12。编码该载体中存在的S蛋白的核苷酸序列如图23B所示，其中将其标识为SEQ IDNO:13。编码该载体中存在的S蛋白的氨基酸序列如图23C所示，其中将其标识为SEQ ID NO:14。
根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约》，法国国家微生物保藏中心(CNCM)具有国际保藏单位的资格。CNCM位于巴斯德研究所(25-28rue du DocteurRoux，75724Paris Cedex 15，法国)。
以下材料于2020年7月15日保藏：pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm(CNCM I-5537)、pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538)、pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCM I-5539)和pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCM I-5540)。随文件附上保藏回执。
以下材料于2021年7月6日保藏在CNCM：pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708)、pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709)、pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCMI-5710)、pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711)、pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCMI-5712)。随文件附上保藏证明(deposit receipt)。
LV::SFL免疫的C57BL/6小鼠(n＝3)也显示出强的抗SCoV-2T细胞应答，如在免疫后第2周通过基于IFNγELISPOT的表位作图检测到的，该表位作图应用于用跨越全长SCoV-2的不同的15聚体肽池刺激的脾细胞(图2A)。在16个肽池的6个中检测到大量的反应性T细胞。这些阳性池的解卷积允许鉴定S:256-275(SGWTAGAAAYYVGYLQPRTF–SEQ ID No.32)、S:536-550(NKCVNFNFNGLTGTG–SEQ ID No.16)和S:576:590(VRDPQTLEILDITPC–SEQ ID No.17)免疫显性表位，产生>2000斑点形成单位(SFU)/1×106脾细胞(图2B)。通过细胞内细胞因子染色评估，这些表位引发CD8+——而非CD4+——T细胞(图2C)。这些T细胞的主要CD8+表型符合LV编码的抗原对MHC-I呈递途径的有利定向(Hu等人，2011年)。我们还鉴定了S:441-455(LDSKVGGNYNYLYRL–SEQ ID No.18)、S:671-685(CASYQTQTNSPRRAR–SEQ ID No.19)和S:991-1005(VQIDRLITGRLQSLQ–SEQ ID No.20)亚显性表位，其中产生ELISPOT检测中<2000SFU/1×106脾细胞(图2B)。
实施例1.3：使用Ad5基因递送载体建立在呼吸道中表达人ACE2的小鼠模型。
由于SCoV-2不与小鼠ACE2有效地相互作用，野生型实验室小鼠不允许SARS-CoV-2临床分离株的复制。由于在本研究进展过程中，欧洲没有hACE2转基因小鼠，为评估LV::SFL疫苗的效力，我们试图建立一种小鼠模型，其中hACE2表达在呼吸道和肺粘膜中被诱导。为此，我们生成了一种Ad5基因递送载体，该载体能够在非整合型附加体中发挥作用，即在CMV启动子的转录控制下编码hACE2的基因(Ad5::hACE2)。我们首先通过RT-PCR检查了体外Ad5::hACE2载体转导HEK293T细胞的潜力(图3A)。为实现呼吸道细胞的体内转导，我们向C57BL/6小鼠鼻内滴注了2.5×109IGU/小鼠的Ad5::hACE2。四天后，通过蛋白质免疫印迹法检测到肺细胞匀浆中的hACE2蛋白表达(图3B)。为了更深入地了解在这些条件下施用的转基因的体内表达谱，我们向C57BL/6小鼠鼻内滴注了相同剂量的Ad5::GFP报告基因载体。通过细胞计量评估，滴注后4天，GFP报告基因不仅在肺上皮EpCam+细胞中表达，而且也在肺免疫细胞中表达，如CD45泛造血标志物所追踪的(图3C)，表明这种方法允许上皮细胞的有效转导，但不限于这些细胞。
为评估此类hACE2转导的小鼠对SARS-CoV-2感染的允许性，在用Ad5::hACE2或空白对照Ad5载体进行鼻内注射预处理4天后，C57BL/6小鼠鼻内注射1×105TCID50的SARS-CoV-2临床分离株，该分离株于2020年2月由国家呼吸道感染病毒参考中心(法国巴斯德研究所)从COVID-19患者中分离出来。接种后2天(dpi)测定的肺病毒载量在Ad5::hACE2预处理小鼠中高达(4.4±1.8)×109拷贝的SARS-CoV-2RNA/小鼠，而在空白Ad5预处理小鼠中仅为(6.2±0.5)×105拷贝/小鼠，或在未预处理小鼠中为(4.0±2.9)×105拷贝/小鼠(图3D)。在4dpi时，Ad5::hACE2预处理小鼠的肺病毒载量保持不变(2.8±1.3×109拷贝/小鼠)，而在空白Ad5预处理或未处理小鼠中分别观察到肺病毒载量降至(1.7±2.3)×104或(3.9±5.1)×103拷贝/小鼠。在7dpi时，在Ad5::hACE2预处理的小鼠中，病毒载量显著降低，尽管仍可大量检测到((1.33±0.9)×106拷贝/小鼠)。
Ad5::hACE-2鼻内滴注诱导CD45+细胞向肺部募集，然而，如滴注后第4天所测定的，这种效应随着载体剂量的减少而降低。与PBS处理的对照相比，4×108IGU/小鼠的剂量未引起CD45+细胞募集(图3E)，但仍赋予SARS-CoV-2复制的完全允许性(图3F)。Ad5-hACE2预处理的小鼠对SARS-CoV-2复制的允许性以及该模型的建立为在小鼠体内评估疫苗或药物对SARS-CoV-2的效力铺平基础。
实施例1.4：评估LV::SFL对小鼠中SARS-CoV-2的保护潜力
为研究LV::SFL对SARS-CoV-2的预防作用，C57BL/6小鼠(n＝4/组)腹腔注射单剂量1×107TU/小鼠的LV::SFL或阴性对照LV(假接种)。在免疫后第6周，用Ad5::hACE2预处理小鼠，4天后，小鼠腹腔接种1×105TCID50的SARS-CoV-2(图4A)。在3dpi时，接种LV::SFL疫苗的小鼠中肺病毒载量减少了约1log10，即(3.2±2.2)×108SARS-CoV-2RNA拷贝/小鼠的平均值±SEM，而未接种或假接种疫苗的小鼠中为(1.7±0.9)×109或(2.4±1.6)×109拷贝/小鼠(图4B)。因此，单次LV::SFL注射有效地抑制了在肺部约90％的病毒复制。
为进一步提高预防效果，我们评估了初免-增强或初免-靶向方法。C57BL/6小鼠(n＝4-5/组)在第0周用腹腔注射1×107TU的LV::SFL或对照LV进行初免，随后在第3周使用以下物质进行增强：(i)通过腹腔注射途径的1×107TU的相同LV(“LV::SFL腹腔注射-腹腔注射”，初免-增强)，或(ii)通过鼻内注射途径的3×107TU(“LV::SFL腹腔注射-鼻内注射”，初免-靶向)，以将全身免疫的中介体吸引到肺粘膜(图5A)。通过腹腔注射LV::SFL的全身增强导致抗SCoV-2IgG滴度显著增加(图5B，左)。相比之下，经鼻内注射LV::SFL的粘膜靶向并未导致系统水平上抗-SCoV-2IgG滴度的统计学显著改善(图5B左)。就血清中和潜力而言，尽管在腹腔注射或鼻内注射增强后观察到增加的趋势，但差异未达到统计显著性(图5B右)。
然后用Ad5::hACE2预处理所有小鼠，并在初免后第4周用鼻内注射0.3×105TCID50的SARS-CoV-2进行攻击。在3dpi时，LV::SFL腹腔注射-腹腔注射免疫的小鼠中肺部病毒载量(即平均值±SD(2.3±3.2)×108)显著低于假接种疫苗小鼠的(13.7±7.5)×108拷贝的SARS-CoV-2RNA(图5C)，这种病毒载量的减少与单次LV::SFL施用所获得的结果相似(图5C)。最重要的是，在鼻内注射LV::SFL靶向免疫后，观察到病毒载量下降>3log10，5只小鼠中有2只具有qRT-PCR检测不到的肺部病毒载量。事实上，在部分(LV::SFL腹腔注射-腹腔注射)或完全(LV::SFL腹腔注射-鼻内注射)保护的小鼠的澄清肺匀浆中检测到抗-SCoV-2IgG。相比之下，抗SCoV-2IgA仅在全面保护的LV::SFL腹腔注射-鼻内注射小鼠中可检测到(图5D)。在LV::SFL腹腔注射-鼻内注射小鼠的澄清肺匀浆中检测到的中和活性高于LV::SFL腹腔注射-鼻内注射小鼠的中和活性(图5E)。因此，在系统水平上增加IgG同种型的NAb滴度并不能提高抗SARS-CoV-2的保护作用。然而，粘膜鼻内注射靶向免疫，有可能将免疫效应物吸引至病毒进入宿主生物体的入口点，并能够诱导局部IgA抗体，这与SARS-CoV-2复制的抑制相关。
基于COVID-19急性肺损伤中先天性免疫功能亢进的有力证据(Vabret等人，2020年)，我们研究了在未感染对照小鼠、假接种疫苗或接种LV::SFL疫苗的接种SARS-CoV-2的小鼠中肺先天免疫细胞亚群的可能变化(图6A)。在3dpi时，我们检测到不同实验组中嗜碱性粒细胞或NK细胞与总肺CD45+细胞的比例没有差异(图6B)。与之形成鲜明对比的是，我们在表现出最高肺部病毒载量的假接种疫苗小鼠中，检测到肺泡巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、Ly6C+或Ly6C-单核细胞/巨噬细胞或中性粒细胞相对于总肺CD45+细胞的比例增加。这些观察结果表明，在该小鼠模型中，肺SARS-CoV-2载量的增加与几种炎症相关的先天免疫细胞的募集相关，并且疫苗介导的抗病毒保护可抑制或避免这种炎症。这通过接种LV::SFL初免-增强/靶向疫苗的小鼠肺中细胞因子和趋化因子含量的减少得到证实，如应用于从总肺匀浆中提取的RNA的qRT-PCR所评估的(图6C)。因此，所赋予的保护也避免了与SARS-CoV-2感染相关的肺部炎症。
实施例1.5：评估LV::SFL在黄金仓鼠中抗SARS-CoV-2的保护潜力
远缘杂交的金色大鼠(Mesocricetus auratus)——所谓的黄金仓鼠——提供合适的临床前模型来研究COVID-19病理学，因为该物种的ACE2直系同源物与SCoV-2有效地相互作用，从而导致宿主细胞入侵和病毒复制(Sia等人，2020年)。因此，我们在该相关模型中研究了LV::SFL疫苗接种对SARS-CoV-2感染的预防作用。尽管整合型LV载体在很大程度上是安全的，并成功通过了1期临床试验(2011-006260-52EN)，但除了整合型LV::SFL外，我们还评估了整合酶缺陷型、非整合型LV::SFL在未来临床试验中的应用前景。
为评估按照初免-增强/靶向方案接种疫苗的预防效果，对金色大鼠(M.auratus)仓鼠(n＝6/组)：(i)腹腔注射低剂量1×106TU的整合型LV::SFL进行初免，并在第4周鼻内注射3×107TU整合型LV::SFL进行增强(“整合型-LV::SF腹腔注射-鼻内注射低”)，(ii)腹腔注射高剂量1×107TU的整合型LV::SFL进行初免，并在第4周鼻内注射3×107TU整合型LV::SFL进行增强(“整合型LV::SF腹腔注射-鼻内注射高”)，或(iii)肌肉注射(i.m.)1×108TU的非整合型LV::SFL进行初免，并在第4周肌肉注射3×107TU非整合型LV::SFL进行增强(“非整合型LV::SFL肌肉注射-鼻内注射低”)(图7A)。假疫苗接种的对照通过腹腔注射和鼻内注射途径接受相同量的空白整合型LV。在鼻内注射增强之前和之后，通过ELISA在来自不同接种疫苗组的仓鼠的血清中检测到类似的SCoV-2特异性IgG抗体(图7B)。增强/靶向后血清学检测到所有组中的中和活性，在“整合型LV::SFL腹腔注射-鼻内注射高”组中观察到最高的EC50平均值。此类水平与在人类无症状、轻微症状、有症状或健康的COVID-19接触者中检测到的水平相当(图7C)。在第5周鼻内注射0.3×105TCID50的SARS-CoV-2对所有仓鼠进行攻击。与所有接种LV::SFL疫苗组的体重无显著下降相比，假接种疫苗个体在4dpi时逐渐达到16％的体重减轻(图7D)。在2dpi时，与假接种疫苗的仓鼠相比，观察到“整合型LV::SFL腹腔注射-鼻内注射低”、“整合型LV::SFL腹腔注射-鼻内注射高”和“非整合型LV::SFL腹腔注射-鼻内注射”组的肺部病毒载量减少了约1.5至3log10(图7E、图7F)。在4dpi时，与假接种疫苗的个体相比，接种疫苗组的病毒载量减少幅度仍然更高，达到>4log10。更多的免疫学和组织病理学研究证实了在仓鼠模型中接种LV疫苗的实质性肺保护作用。(图8)。
在另一个实验中(图9A)，我们表明：(i)NILV::SFL的单次肌肉注射诱导了血清抗S抗体的高滴度(图9B)，并在肺部中启动了显著但部分的保护水平(图9C)，以及(ii)用NILV::SFL鼻内注射增强，其未提高血清NAb活性(图9D)，诱导了抗SARS-CoV-2的显著改善的保护，如在4dpi时基于qRT-PCR(图9C)的肺部病毒载量所测定的。在4dpi时，在假接种疫苗和受攻击的仓鼠中，检测到实质性肺损伤、严重的实质性炎症、肺实质实变(consolidationof pulmonary parenchyma)、细支气管上皮显著改变和细支气管上皮中度消失(图9E)。在接种NILV::SFL疫苗的仓鼠中，无论是否增强，肺部病变的严重程度明显较低(图9E、图9F、图9G)。
通过单次鼻内注射NILV::SΔF2P给药对仓鼠模型进行灭菌保护
我们在巨细胞病毒启动子的转录控制下生成了编码SCoV-2的预融合(prefusion)形式的LV。这种预融合SCoV-2变体(SΔF2P)具有675QTQTNSPRRAR685(EQ ID NO:24)序列的缺失，包含位于S1/S2亚基的边界处的多元RRAR(SEQ ID NO：99)弗林蛋白酶切割位点，并在七肽重复区1和中央螺旋之间的铰链环内，在S2中带有K986P和V987P连续脯氨酸取代(图11)。
我们还评估了在仓鼠模型中仅用NILV::SΔF2P单次鼻内注射接种疫苗的预防效果。
对仓鼠(n＝6/组)：(i)在第0周肌肉注射1×108TU的NILV::SΔF2P进行初免，并在第5周鼻内注射相同量的载体进行增强，作为阳性保护对照，(ii)在第0周鼻内单次注射1×108TU的NILV::SΔF2P进行免疫，或(iii)在第5周鼻内单次注射1×108TU的NILV::SΔF2P进行免疫(图12A)。假接种疫苗的对照在第0周和第5周通过鼻内注射接受等量的空白NILV。在第5周，前两组的血清中检测到相当的、高滴度的抗-SCoV-2IgG抗体(图12B)。在第7周，NILV::SΔF2P肌肉注射-鼻内注射组的血清抗体滴度保持较高，而“NILV::SΔF2P鼻内注射第0周”组的一些个体的血清抗体滴度略有下降。此时，在“NILV::SΔF2P鼻内注射第5周”组，检测到较低的血清抗体滴度(图12B)。尽管与其他两个接种疫苗的组相比，“NILV::SΔF2P鼻内注射第5周”仓鼠中血清中的病毒中和活性显著降低，但这些个体在其肺匀浆中具有相当的中和能力(图12C)。
在第7周，所有动物都接受了鼻内注射0.3×105TCID50的SARS-CoV-2的攻击。在接种后4天(dpi)，在接种NILV::SΔF2P疫苗的组中仅检测到2-3％的体重减轻，相比之下，假接种疫苗的仓鼠中为12％(图12D)。此时，通过qRT-PCR检测SARS-CoV-2包膜(ECoV-2)RNA所测定的，与假接种疫苗的组相比，在肌肉注射-鼻内注射组或单次鼻内注射组的接种NILV::SΔF2P疫苗的个体中观察到约2至3log10的减少(图12E)。通过检测亚基因组ECoV-2RNA(Esg)(活性病毒复制的指标)(Chandrashekar等人，2020年；Tostanoski等人，2020年；Wolfel等人，2020年)的qRT-PCR评估肺病毒载量，显示三个接种疫苗组中没有复制病毒，而假接种疫苗组中显示出平均值±SD为(1.24±0.99)×109拷贝SARS-CoV-2的Esg RNA/肺(图12E)。
在4dpi时，如通过qRT-PCR在全肺匀浆中所评估的，与假接种疫苗的仓鼠相比，在接种NILV::SΔF2P疫苗的仓鼠中检测到炎症显著减少，而与免疫方案(即在第0周或第5周给予肌肉注射-鼻内注射的初免-增强、或单次鼻内注射)无关(图13A)。组织病理学肺分析显示，在NILV::SΔF2P免疫的仓鼠中，肺损伤很少或无法检测到，而在假接种疫苗的对照中，检测到大量的实质浸润和实变，以及细支气管上皮的显著改变和消失(图13B、图13C)。
这些数据共同表明，在易感仓鼠模型中，NILV::SΔF2P的单次鼻内注射给药与全身初免和鼻内注射增强方案一样具有保护作用，赋予了抗SARS-CoV-2的消毒肺免疫，并容易预防肺部炎症和致病性组织损伤。
总之，基于一套完整的病毒学、免疫学和预期的组织病理学数据(后者正在进行中)，LV::SFL载体引发SCoV-2特异性nAb和T细胞应答，与两种相关动物模型中抗SARS-CoV-2感染的实质性保护水平相关，尤其是在粘膜鼻内注射给药时。
实施例1.6：讨论
预防策略对于控制SARS-CoV-2感染是必要的，在大流行6个月后，SARS-CoV-2感染仍在呈指数级传播，并且没有减缓的迹象。现已证明，恒河猴中的原发性感染SARS-CoV-2会导致针对再暴露的保护性免疫(Chandrashekar等人，2020年)。基于裸DNA(Yu等人，2020年)或mRNA、重组蛋白、复制或非复制病毒载体(包括腺病毒Ad5载体(Zhu等人，2020年)或明矾佐剂灭活病毒(Gao等人，2020年)的众多候选疫苗正在积极开发，以预防COVID-19。我们选择LV载体来递送编码SCoV-2抗原的基因的免疫学原理是基于对异源基因原位表达的有效性，以及该免疫平台引发的体液和细胞介导免疫的持久和复合性质的深入了解。LV的独特之处在于能够转导增殖和静息细胞(Esslinger等人，2002年；He等人，2005年)，因此LV是一种强有力的疫苗接种策略(Beignon等人，2009年；Buffa等人，2006年；Coutant等人，2012年；Gallinaro等人，2018年；Iglesias等人，2006年)，能够激发强的且持久的适应性应答。值得注意的是，与许多其他病毒载体形成鲜明对比的是，LV载体在人群中不存在预存免疫力，这与它们与水泡性口炎病毒糖蛋白包膜的伪分型有关，而人类几乎不接触水泡性口炎病毒。我们最近证明，单次注射表达寨卡病毒(Zika)包膜的LV可提供针对寨卡病毒感染的快速且持久的保护(Ku等人，2020年)。我们最近对LV与黄金标准Ad5免疫载体进行的全面系统比较也证明了LV在小鼠模型中诱导多功能和中枢记忆T细胞的卓越能力，以及在远缘杂交大鼠中更强的免疫原性(Ku等人，2021年(PMID:33357418))，强调了LV在疫苗应用中具有很大的适应性。
我们评估了LV的功效，每个LV编码S的变体之一，即全长膜锚定的(LV::SFL)、S1-S2胞外结构域、无跨膜和C端短的胞内尾巴(LV::S1-S2)或单独S1(LV::S1)。尽管这些LV中的每一种的单次给药都能够诱导高的抗SCoV-2抗体滴度，但只有LV::SFL能够诱导高功能的nAb。此类基于LV的疫苗的单次注射诱导了中和活性，平均而言，其与在表现出轻症的SARS-CoV-2患者队列中发现的中和活性相当。这一发现预测了LV::SFL载体诱导的体液应答的保护潜力。同时，早在单次LV::SFL注射后2周，在小鼠脾脏中也观察到S特异性CD4+和CD8+T细胞应答，这是针对我们在C57BL/6(H-2b)小鼠中鉴定的许多MHC-I-或MHC-II-限制性免疫原性区域可检测到的。
鉴于实验室小鼠不允许SARS-CoV-2复制并且欧洲目前无法获得hACE2转基因小鼠，我们建立了体内感染小鼠模型，其中在SARS-CoV-2接种前，hACE2表达通过鼻内注射Ad5::hACE2预处理在呼吸道中被诱导。这种方法使小鼠在很大程度上允许SARS-CoV-2在肺部复制，并允许评估疫苗或药物对这种病毒的效力。该方法也已成功用于建立人DPP4的表达，用于研究小鼠感染MERS-CoV(Zhao等人，2014年)。尽管Ad5::hACE2模型可能无法完全模拟生理ACE2表达谱，因此可能无法反映SARS-CoV-2感染的病理生理学的所有方面，但其提供了相关的模型来评估体内抗病毒药物、候选疫苗、各种突变或遗传背景对SARS-CoV-2复制的影响。通过使用低剂量的Ad5::hACE2/小鼠，在滴注后第4天未检测到特定的CD45+细胞募集，这表明在接种SARS-CoV-2之前不存在Ad5相关的炎症。
在允许SARS-CoV-2高复制率的转导小鼠模型中，在病毒接种前6周，通过单次腹腔注射给药1x 107TU的LV::SFL的接种足以抑制约1log10的病毒复制。与单次给药相比，通过全身途径进一步增强并不能提高保护率。然而，通过全身途径初免和通过粘膜途径增强可有效抑制病毒复制并避免肺部炎症。这种保护与抗SCoV-2IgG的高滴度和血清中的强中和活性相关。在LV::SFL免疫小鼠的脾脏中也检测到S特异性T细胞应答，如ELISPOT所评估的，随后用重叠的15聚体肽池刺激脾细胞。需要在适当的KO小鼠或过继性免疫细胞转移方法中进行更长期的实验，以确定导致疾病严重程度或针对SARS-CoV-2的保护的免疫途径。用基于LV的候选疫苗非常有效地诱导的nAb和细胞介导的免疫，二者协同抑制感染和病毒复制。
在采用整合型或非整合型LV::SFL的初免-增强/靶向方案后免疫的金色大鼠(Mesocricetus auratus)黄金仓鼠中，观察到对SARS-CoV-2感染的显著保护，同时粘膜炎症和肺组织损伤显著减少。对这种高敏感物种的保护结果的确认进一步有利于LV::SFL候选疫苗，特别是在其非整合型变体下，以便将来引入临床试验。
认为冠状病毒进入宿主细胞的抗体依赖性增强(ADE)是可能成为抗冠状病毒疫苗接种障碍的机制。用DNA(Yu等人，2020年)或灭活的SARS-CoV-2病毒(Gao等人，2020年)为猕猴接种疫苗后，未观察到免疫病理学恶化，但不能排除。即使在抗体滴度下降之后，也有必要进行长期观察，以排除这种假设。就MERS-CoV而言，据报道，一种特定的RBD特异性中和单克隆抗体(Mersmab1)通过模拟病毒受体人DPP4并诱导SMERS的构象重排，可体外介导MERS-CoV的ADE进入宿主细胞(Wan等人，2020年)。我们认为，很难将多克隆抗体应答及其互补位库复杂性与单克隆抗体的单一特性进行比较，单克隆抗体不能代表疫苗诱导的多克隆反应。此外，来自同一团队的非常矛盾的结果报告称，使用人源化Mersmab1的单剂量治疗可全面保护人类转基因小鼠模型免受致命的MERS攻击(Qiu等人，2016年)。因此，即使在体外某些条件下使用可促进体外细胞宿主入侵的抗体，不仅体内感染没有恶化，而且具有显著的保护作用。事实上，有必要通过大规模B细胞融合直到他们能够估计生成此类抗体的概率，以证实抗体可能在体内引起ADE。
预防性疫苗接种是针对传染病、特别是针对新出现的冠状病毒的最具成本效益且最有效的策略。我们的结果提供了强有力的证据，证明通过粘膜接种途径使用的编码SARS-CoV-2SFL蛋白的LV载体是很有前景的抗COVID-19候选疫苗。
表1.用于SARS-CoV-2病毒载量测定的引物和探针序列。
表2用于通过qRT-PCR定量小鼠细胞因子和趋化因子的引物序列
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实施例2：带有人ACE2基因的转基因小鼠的生成
迄今为止，已经提供了几种在不同的转录和表达控制序列下表达hACE2基因的不同毒株的转基因(Tg)小鼠，其中一些源自2003年SARS-CoV疫情出现时为满足需求而进行的开发。这些早期开发的Tg小鼠和进一步的模型已被评估用于研究和了解SARS-CoV的发病机制，并已显示允许病毒复制，有时允许某种程度的疾病症状或临床疾病，但在接种SARS-CoV-2的Tg小鼠中观察到的各种临床特征尚未证明适合重现感染结果的所有方面，特别是尚未充分显示在人类患者中观察到的病毒传播，特别是传播到气道和肺道以外，如传播到大脑。此外，可用的Tg小鼠尚未表现出与在人类患者中观察到的症状相同的所有一致的疾病症状。
B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠品系先前已保藏在JAX实验室(杰克逊实验室，巴尔港，缅因州)。然而，本发明人根据本发明生成的新的B6.K18-hACE2IP-THV转基因小鼠显示在SARS-CoV-2鼻内(i.n.)接种后鉴定的独特特征。事实上，除了它们的肺部对SARS-CoV-2复制和病毒传播到外周器官有很大的允许性外，B6.K18-hACE2IP-THV小鼠出乎意料地允许大量病毒在大脑中复制，这比先前可获得的B6.K18-ACE22Prlmn/JAX品系中观察到的复制范围高约4log10。这种新的小鼠模型不仅在COVID-19疫苗或COVID-19疗效的研究中具有广泛应用，而且还提供了一种阐明COVID-19免疫/神经生理病理学的实验模型。SARS-CoV-2的神经嗜性已经得到证实，并且一些COVID-19人类患者出现头痛、意识模糊、嗅觉障碍、味觉障碍、恶心和呕吐等症状(Bourgonje等人，2020年)。嗅觉跨粘膜SARS-CoV-2入侵最近也被描述为感染COVID-19的人类个体中枢神经系统的一个入口(https://doi.org/10.1038/s41593-020-00758-5)。由于冠状病毒可感染中枢神经系统(Bergmann等人，2006年)，B6.K18-hACE2IP-THV小型啮齿动物实验模型是一种非常有价值的临床前或联合临床动物模型，主要用于：(i)大脑的免疫保护研究和(ii)COVID-19衍生的神经病理学探索。
1.人角蛋白18启动子的构建
人K18启动子(GenBank:AF179904.1核苷酸90至2579)通过巢式PCR从A549细胞裂解物中扩增，如前所述(Chow等人，1997年；Koehler等人，2000年)。“i6x7”内含子(GenBank：AF179904.1核苷酸2988至3740)由Genscript合成。先前用于生成B6.K18-ACE22Prlmn/JAX品系的“K18i6x7PA”启动子包括K18启动子、hACE2基因5’处的“i6x7”内含子和3’处的增强子/polyA序列(PA)。此处使用的K18IP-ThV启动子包含hACE2基因3’处更强的野生型土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，而不是PA。与带有包含polyA序列的3’调控区的K18i6x7PA构建体相比，K18IP-ThV构建体利用了pFLAP-LV质粒的3’长末端重复序列(LTR)中已经存在的polyA序列，用于转基因。对i6x7内含子部分进行了修饰，以引入一致的5’剪接供体和3’供体位点序列。AAGGGG(SEQ ID No.97)供体位点被进一步修饰为AAGTGG(SEQ ID No.95)共有位点。基于共有序列标识(Dogan等人，2007年)，剪接受体位点(原始序列GenBankAF179904.1中的TACAATCCCTC(SEQ IDNo.82)和K18JAX中的TTTTTTTTTT(SEQ ID No.83))之前的多嘧啶被CTTTTTCCTCC(SEQ ID No.96)取代，以限制转导过程中与逆转录步骤的不相容性。此外，原始剪接受体位点CAGAT被修饰为对应于共有序列CAGGT(SEQ ID No.84)。作为构建工具，在启动子和内含子之间引入了ClaI限制位点。将构建体插入到MluI和BamHI位点之间的pFLAP质粒中。通过限制/连接将hACE2 cDNA引入BamHI和XhoI位点之间。整合型LV::K18-hACE2IP-THV按照其他地方的描述制备(Sayes等人，2018年)，并通过在4℃下以22,000rpm超速离心1小时的两个循环进行浓缩。
2.转基因
将高滴度(8.32×109TU/ml)整合型LV::K18-hACE2IP-THV显微注射到被移植到假孕B6CBAF1雌性(Charles Rivers)体内的受精卵的透明区域。通过在PCR中使用hACE2正向：5’-TCC TAA CCA GCC CCC TGT T-3’(SEQ ID No.85)和hACE2反向：5’-TGA CAA TGC CAACCA CTA TCA CT-3’(SEQ ID No.86)引物，对N0小鼠的每个基因组hACE2基因的整合和拷贝数进行了研究，该引物应用于从尾部活检制备的基因组DNA。为了后代的稳定，随后将转基因阳性雄性与WT C57BL/6雌性(Charles Rivers)杂交。通过向受精卵细胞核内显微注射整合型LV::K18-hACE2IP-THV进行转基因转移是特别有效的。在N0代，约11％获得的小鼠(即139只小鼠中的15只)在每个基因组具有至少一个转基因拷贝。将携带转基因的8只N0雄性小鼠与雌性C57BL/6WT小鼠杂交(Janvier，勒热内-圣伊勒，法国)。在N1代，约62％获得的小鼠(即147只小鼠中的91只)在每个基因组具有至少一个转基因拷贝。将携带转基因的10只N1雄性小鼠与雌性C57BL/6WT小鼠杂交。
在免疫期间，将雌性或雄性转基因小鼠放在特定无病原体条件下的单独通风的笼中。在巴斯德研究所动物设施，将小鼠转至单独过滤的笼中进行SARS-CoV-2接种。在鼻内注射之前，通过腹腔注射氯胺酮(Imalgene，80mg/kg)和甲苯噻嗪(Rompun，5mg/kg)麻醉小鼠。
3.转基因小鼠中hACE2基因拷贝数/基因组的基因分型和定量
转基因小鼠的基因组DNA(gDNA)通过苯酚-氯仿提取从尾部活检中制备。使用表3中列出的特异性引物，用SyBr Green将60ng的gDNA用作qPCR的模板。使用相同的模板并在相似的反应板中，还对小鼠PKD1(多囊性肾病1)和GAPDH进行了定量。所有样品在10μl反应中一式四份，如下所示运行：95℃下10分钟，95℃下15秒和60℃下30秒进行40次循环。为计算转基因拷贝数，应用2-ΔΔCt方法，使用PKD1作为校准物，GAPDH作为内源性对照。2-ΔΔCt提供了hACE2基因相对于PKD1基因拷贝数的差异倍数。
表3.用于基因型B6.K18-hACE2IP-THV转基因小鼠的引物序列。
4.K18-hACE2IP-THV对SARS-CoV-2复制的允许性
在来自后代的采样个体中评估N1小鼠对SARS-CoV-2复制的允许性。对每个基因组具有不同数量转基因拷贝的N1雌性进行了采样(图14A)，并评估它们对SARS-CoV-2复制的允许性(图14B)。为此，选择的小鼠在全身麻醉下鼻内接种0.3×105TCID50的BetaCoV/France/IDF0372/2020SARS-CoV-2临床分离株(Lescure等人，2000年)，由巴斯德研究所(法国，巴黎)主办的国家呼吸道病毒感染参考中心提供。小鼠的病毒接种物为20μl。随后将动物置于巴斯德研究所生物安全等级3动物设施的隔离器中。
从感染活SARS-CoV-2的动物中回收的器官按照这些设施的批准标准操作程序进行操作。
在接种后3天(dpi)，肺病毒载量平均值±SD与受纳小鼠(permissive mice)的(3.3±1.6)×1010拷贝SARS-CoV-2RNA/小鼠一样高(图14B)。请注意，每个基因组的转基因拷贝数(图14A)与SARS-CoV-2在肺部的复制率不成比例(图14B)，因此不会影响该表型。肺病毒载量高于在用编码hCAE2的腺病毒载体血清型5(Ad5::hACE2)(我们先前描述为也允许疫苗效力测定的合适模型)进行鼻内预处理的阳性对照小鼠中检测到的肺病毒载量。值得注意的是，在受纳小鼠的大脑中也检测到大量病毒载量，即(5.7±7.1)×1010拷贝的SARS-CoV-2RNA/小鼠(图14B)。在接种病毒后的这个时间点，也观察到病毒在心脏和肾脏中传播，尽管程度较轻。
5.B6.K18-ACE22Prlmn/JAX和K18-hACE2IP-THV品系在SARS-CoV-2复制允许性方面的比较
我们进一步比较评估了B6.K18-hACE2IP-THV和B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠中SARS-CoV-2在肺部和大脑中的复制以及向各个器官的传播(图14C)。B6.K18-hACE2IP-THV小鼠的肺病毒载量较低，即(2.1±2.2)×1010拷贝的SARS-CoV-2RNA/小鼠，而B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠中为(18.3±13.3)×1010拷贝。然而，B6.K18-hACE2IP-THV小鼠大脑中的病毒复制(即(7.4±7.9)×1010拷贝的SARS-CoV-2RNA/小鼠)显著高于B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠的(1.9±74.3)×108拷贝。通过特异于亚基因组ECoV-2mRNA(Esg)的qRT-PCR测量脑病毒载量，在B6.K18-hACE2IP-THV小鼠中检测到SARS-CoV-2RNA的平均值±SD为(7.55±7.74)×109拷贝，在5只B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠中有4只没有病毒复制。值得注意的是，通过特异于亚基因组ECoV-2mRNA(Esg)的qRT-PCR测量病毒载量，仅表征复制性/传染性SARS-CoV-2病毒颗粒。因此，SARS-CoV-2的高复制率和大脑中感染性病毒颗粒的高载量是新B6.K18-hACE2IP-THV品系的主要独特表型。与B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠相比，通过qRT-PCR在大脑中进行的hACE2mRNA表达的比较显示，B6.K18-hACE2IP-THV小鼠大脑中的转基因表达量高得多(图14C)。转基因株中颈SARS-CoV-2复制之间的这种实质性差异与B6.K18-hACE2IP-THV小鼠大脑中hACE2mRNA表达的显著升高相证实(图14D)。然而，B6.K18-hACE2IP-THV小鼠肺部的hACE2 mRNA表达也高于B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠，这无法解释前者中病毒复制较低。与B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠相比，在B6.K18-hACE2IP-ThV的肾脏和心脏中也观察到更高病毒载量的趋势，尽管差异未达到统计显著性(图14C)。在B6.K18-hACE2IP-ThV的肾脏和心脏中也观察到更高病毒载量的趋势，尽管差异未达到统计显著性。
与脑病毒载量相关，与B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠相比，B6.K18-hACE2IP-THV小鼠在3dpi时在大脑中通过qRT-PCR检测到高得多的炎症，这表明在B6.K18-hACE2IP-THV小鼠的中枢神经系统中的免疫/炎症症状，但在B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠中没有(图14C)。与肺病毒载量一致，如通过应用于总肺匀浆的qRT-PCR所评估的，B6.K18-hACE2IP-THV小鼠显示出比B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠更少的肺部炎症(图14E)。值得注意的是，应用于总脑匀浆的该测定在B6.K18-hACE2IP-THV小鼠中检测到显著程度的炎症，但在B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠中未检测到(图14E)。此外，B6.K18-hACE2IP-THV小鼠在3dpi至4dpi之间达到人道终点，因此比B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠更快地表现出致命的SARS-CoV-2介导的疾病{Winkler,2020#102}。
因此，SARS-CoV-2在肺部和CNS复制的很大允许性、显著的脑炎症和快速致死性疾病是这种新的B6.K18-hACE2IP-THV转基因模型的主要区别性特征。
动物研究的伦理批准
在所有实施例中，对小鼠和仓鼠的实验是根据欧洲和法国指南(指令86/609/CEE和1987年10月19日第87-848号法令)在巴斯德研究所安全、动物护理和使用委员会批准后进行的，方案协议由当地伦理委员会(CETEA#DAP20007,CETEA#DAP200058)和高等教育与研究部APAFIS#24627-2020031117362508v1提供。
实施例3：鼻内慢病毒疫苗接种对SARS-CoV-2的完全CNS和肺部预防
此处，我们生成了一种新的hACE2转基因小鼠品系，其大脑对SARS-CoV-2复制具有前所未有的允许性。通过使用这种独特的临床前动物模型，我们证明了使用这种基于LV的候选疫苗进行鼻内增强免疫的重要性，以达到对肺部以及CNS的抗SARS-CoV-2的全面保护。我们的结果表明，用非细胞病变和非炎症LV进行鼻内疫苗接种似乎是一种有效且安全的策略，可在受COVID-19影响的主要解剖部位引发消除性免疫。
方法
LV::SΔF2P的构建和产生
密码子优化的SΔF2P序列(1-1262)(SEQ ID No.14)从pMK-RQ_S-2019-nCoV中扩增，并通过BamHI和XhoI位点之间、天然人ieCMV启动子和突变的土拨鼠转录后调控元件(WPRE)序列之间的限制/连接而插入pFlap。出于安全考虑，WPRE的atg起始密码子发生突变(mWPRE)，以避免土拨鼠肝炎病毒下游截短的“X”蛋白的转录(图17)。如先前实施例1中所述，质粒进行扩增并用于产生LV。
小鼠
如实施例2中详细公开的那样生成转基因小鼠。
体液和T细胞免疫，炎症
正如最近在其他地方所详述的(Ku等人，2021年)，T脾细胞应答通过IFN-gELISPOT定量，抗S IgG或IgA抗体通过使用重组稳定SCoV-2通过ELISA检测。如最近所述(Anna等人，2020年；Sterlin等人，2020年)，通过使用SCoV-2假型LV进行NAb定量。仓鼠和小鼠的肺部和大脑中炎症中介体的qRT-PCR定量在通过TRIzol试剂提取的总RNA中进行，如实施例1中详述。
SARS-CoV-2接种
仓鼠或转基因B6.K18-hACE2IP-THV或B6.K18-ACE22Prlmn/JAX通过腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物进行麻醉，转移至生物安全柜3中，并鼻内接种0.3×105TCID50的BetaCoV/France/IDF0372/2020SARS-CoV-2临床分离株(Lescurea等人，2020年)。这种临床分离株是由van der Werf教授领导的巴斯德研究所(法国，巴黎)主办的国家呼吸道病毒感染参考中心的赠予。从中分离出该菌株的人类样品由法国巴黎比夏特医院(BichatHospital)的Lescure博士和Yazdanpanah教授提供。小鼠的病毒接种物为20μl，仓鼠的病毒接种物为50μl。动物被置于巴斯德研究所生物安全等级3动物设施的隔离器中。根据这些设施的批准标准程序对从受感染动物身上回收的器官进行操作。
器官中病毒载量的测定
无菌取出小鼠或仓鼠的器官，并立即在-80℃下冷冻。如最近所述(Ku等人)，从肺部中制备了来自循环SARS-CoV-2的RNA。简而言之，通过在MP Biomedical Fastprep24组织匀浆器中使用500μl冰冷PBS中的裂解基质M(MP Biomedic)解冻和均质化器官来制备肺匀浆。从以2000g离心10分钟的肺匀浆上清液中提取RNA。可替代地，通过添加含有1mL TRIzol试剂的裂解基质D(MP Biomedical)并使用MP Biomedical Fastprep 24组织匀浆器以6.0m/s在30秒下均质化两次，从肺部或其他器官制备总RNA。使用TRIzol试剂(ThermoFisher)提取总RNA。SARS-CoV-2E基因(Corman等人，2020年)或E亚基因组mRNA(sgmRNA)(Wolfel等人，2020年)在逆转录和实时定量PCR后使用SuperScriptTMIIIPlatinum一步法qRT-PCR系统(Invitrogen)和特异性引物和探针(Eurofins)进行定量(表4)。EsgmRNA测定的标准曲线是使用源自“T7 SARS-CoV-2E-sgmRNA”的PCR片段的体外转录RNA绘制的。使用T7 RiboMAX Express大规模RNA生产系统(Promega)合成体外转录的RNA，并通过苯酚/氯仿提取和用异丙醇和乙醇连续两次沉淀进行纯化。通过光密度测量测定RNA浓度，在含有100μg/mL tRNA载体的无RNA酶水中稀释至109基因组当量/μL，并储存在-80℃下。在含有10μg/ml tRNA载体的无RNA酶水中制备该体外转录RNA的连续稀释液，以建立每个测试的标准曲线。PCR条件是：(i)在55℃下逆转录10分钟，(ii)在95℃下酶失活3分钟，以及(iii)在95℃下15秒、在58℃下30秒进行变性/扩增45个循环。在ABI 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems)上分析PCR产物。
表4.用于通过qRT-PCR定量SARS-CoV-2载量的引物序列
免疫肺和脑细胞的细胞计量分析
肺先天免疫细胞的分离和染色已在实施例1中详细描述。汇集每组小鼠的颈淋巴结、嗅球和大脑，并用400U/ml IV型胶原酶和DNase I(Roche)在37℃下孵育30分钟。然后用玻璃匀浆器均质化颈部淋巴结和嗅球，同时用GentleMacs(Miltenyi Biotech)均质化大脑。然后，将细胞悬浮液通过100μm孔过滤器进行过滤，洗涤并在1200rpm下离心8分钟。在RT下以1360g离心25分钟后，在Percoll梯度上富集来自大脑的细胞悬浮液中的免疫细胞。从肺部回收的细胞按照最近在别处所述的方法进行染色(Ku等人，2021年)。如下所示将从大脑回收的细胞用适当的mAb混合物染色。(i)为了检测先天免疫细胞：Near IR Live/Dead(Invitrogen)、FcγII/III受体阻断抗CD16/CD32(BD Biosciences)、BV605-抗-CD45(BDBiosciences)、PE-抗-CD11b(eBioscience)、PE-Cy7-抗-CD11c(eBioscience)，(ii)为了检测NK、中性粒细胞、Ly-6C+/-单核细胞和巨噬细胞：Near IR DL(Invitrogen)、FcγII/III受体阻断抗CD16/CD32(BD Biosciences)、BV605-抗-CD45(BD Biosciences)、PE-抗-CD11b(eBioscience)、PE-Cy7-抗CD11c(eBioscience)、APC-抗-Ly6G(Miltenyi)、BV711-抗-唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(Siglec)-F(BD)、AF700-抗-NKp46(BD Biosciences)、FITC-抗-Ly6C(Abcam)(iii)为了检测适应性免疫细胞：Near IR Live/Dead(Invitrogen)、FcγII/III受体阻断抗CD16/CD32(BD Biosciences)、APC-抗-CD45(BD)、PerCP-Cy5.5-抗-CD3(eBioscience)、FITC-抗-CD4(BD Pharmingen)、BV711-抗-CD8(BD Horizon)、BV 605-抗-CD69(Biolegend)、PE-抗-CCR7(eBioSciences)和VioBlue-抗-B220(Miltenyi)。将细胞与合适的混合物在4℃下孵育25分钟，在含有3％ FCS的PBS中洗涤，并用4％多聚甲醛通过在4℃下过夜孵育进行固定。在Attune NxT流式细胞仪(Invitrogen)中采集样品，并通过FlowJo软件(Treestar，OR，美国)分析数据。
结果
新的hACE2转基因小鼠对SARS-CoV-2复制具有显著的大脑允许性
如实施例2中所公开的那样生成B6.K18-hACE2IP-THV小鼠。评估了这些小鼠对SARS-CoV-2复制的允许性，并确定对SARS-CoV-2在肺部和CNS中复制的较大允许性、显著的脑炎症和快速致死性疾病是这种新的B6.K18-hACE2IP-THV转基因模型的主要区别性特征。
LV::SΔF2P免疫的B6.K18-hACE2IP-THV小鼠肺部和大脑的全面保护
随后我们评估了LV::SΔF2P在B6.K18-hACE2IP-THV小鼠中的疫苗效力。个体(n＝6/组)在第0周肌肉注射1×107TU/小鼠的LV::SΔF2P或空LV(假接种)进行初免，然后在第3周鼻内注射相同剂量的相同载体进行增强(图15A)。然后在第5周用SARS-CoV-2攻击小鼠。在接种LV::SΔF2P疫苗的小鼠中检测到高血清中和活性，即EC50平均值±SD为5466±6792(图15B)。这种疫苗接种不仅在肺部，而且在大脑中对抗SARS-CoV-2复制提供了相当程度的保护(图15C)。值得注意的是，通过Esg qRT-PCR定量脑病毒载量，在接种LV::SΔF2P接种疫苗的小鼠中未检测到这种复制相关SARS-CoV-2RNA的拷贝，而在假接种疫苗的对照小鼠的脑中检测到(7.55±7.84)×109拷贝。
在3dpi时，肺先天免疫细胞亚群的细胞计量研究(图15D)检测到与假接种疫苗的对照相比，接种LV::SΔF2P疫苗的B6.K18-hACE2IP-THV小鼠的肺CD45+细胞中NK细胞和中性粒细胞的比例显著降低(图15B)。在3dpi时，如通过应用于脑匀浆的qRT-PCR所评估的，与假接种疫苗组相比，接种NILV::SΔF2P疫苗的B6.K18-hACE2IP-THV小鼠的IFN-、TNF-、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p40、CCL2、CCL3、CXCL9和CXCL10表达水平显著降低(图15E)。两组之间没有记录到肺部炎症的明显变化(未示出)。
因此，使用NILV::SΔF2P的肌肉注射-鼻内注射初免-增强防止SARS-CoV-2在肺部和CNS解剖区域的复制，并抑制病毒介导的肺部病理和神经炎症。
对用于B6.K18-hACE2IP-THV小鼠的大脑全面保护的鼻内增强的要求
为进一步表征LV的保护特性，在B6.K18-hACE2IP-THV小鼠中的以下实验中，与仓鼠模型相似，我们使用了非整合型LV。观察到的对大脑抗SARS-CoV-2的保护可能反映了针对此类呼吸道和嗜神经病毒进行鼻内途径的LV给药的益处。为解决这一假设，B6.K18-hACE2IP-THV小鼠接种了NILV::SΔF2P疫苗:(i)在第0周肌肉注射并在第5周鼻内注射，作为阳性对照，(ii)在第0周鼻内注射，或(iii)在第5周肌肉注射。假接种疫苗对照小鼠在第0周和第5周鼻内注射空白NILV(图16A)。然后在第7周用SARS-CoV-2攻击小鼠，并在3dpi时通过E或Esg特异性qRT-PCR测定大脑中的病毒载量(图16B)。在这个高度严格的临床前模型中，即使是高性能的，单次鼻内或肌肉注射NILV::SΔF2P也未能在每组的所有动物中诱导全面保护。仅肌肉注射初免然后鼻内注射增强对所有动物给予了全面保护，这表明鼻内注射增强对大脑的全面保护的要求。
通过细胞计数分析，NILV::SΔF2P肌肉注射-鼻内注射保护的组、假肌肉注射-鼻内注射组和未处理对照中颈部淋巴结中先天和适应性免疫细胞的组成没有变化(数据未示出)。值得注意的是，我们检测到，与未受保护的组相比，NILV::SΔF2P肌肉注射-鼻内注射保护的组的嗅球中CD8+T细胞的比例增加(图16C)。分别根据CD69或CCR7的表达，嗅球中的CD4+T细胞没有明显的活化或迁移表型。我们检测到，与NILV::SΔF2P肌肉注射-鼻内注射保护的组相比，未受保护的小鼠的嗅球中的中性粒细胞(图16D)以及大脑中的CD11b+Ly6G-Ly6C+炎性单核细胞(图16E)的数量增加，作为炎症的生物标志物和/或与活跃的病毒复制相关。
总体而言，我们在高度严格的B6.K18-hACE2IP-THV小鼠模型中生成的数据支持NILV::SΔF2P鼻内增强在免疫保护CNS免受SARS-CoV-2复制以及由此产生的浸润和神经炎症方面的优势。在鼻腔和嗅球(即病毒的进入点)中局部诱导和/或激活粘膜免疫应答是一种有效的策略。
讨论
基于LV的平台是一种针对COVID-19的有效疫苗接种方法，特别是在全身初免后进行粘膜鼻内增强时，能够在临床前动物模型中诱导针对肺部SARS-CoV-2感染的消除性免疫。我们首先证明，单次鼻内注射施用编码SCoV-2的SΔF2P预融合形式的LV与肌肉注射-鼻内注射初免-增强方案一样有效，通过病毒学、免疫学和组织病理学参数评估，对高度易感仓鼠模型的呼吸道进行全面保护。仓鼠ACE2直系同源物与SCoV-2有效地相互作用，这很容易允许SARS-CoV-2入侵宿主细胞并具有高复制率。随着SARS-CoV-2接种后体重迅速下降以及严重肺部病变的发展，该物种提供了一种敏感模型来评估候选药物或疫苗的效力，例如与仅发展为轻度COVID-19病理学的恒河猴相比(Munoz-Fontela等人，2020年；Sia等人，2020年)。事实上，在SARS-CoV-2攻击前七周或两周，单次鼻内LV给药可在这种易感模型中产生灭菌保护，这对设置即将进行的该基于LV的疫苗的临床试验是有价值的，并可为大规模疫苗接种提供显著的社会经济优势。
为进一步研究我们的候选疫苗的效力，我们使用基于LV的转基因方法生成了一个新的转基因小鼠模型(Nakagawa和Hoogenraad，2011年)。该策略中使用的ILV编码由细胞角蛋白K18启动子控制的hACE2，即Perlman团队先前用于生成B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠的相同启动子(McCray等人，2007年)，所述细胞角蛋白K18启动子含有对于慢病毒FLAP转移质粒的一些改编。然而，新的B6.K18-hACE2IP-THV小鼠具有某些区别性特征，因为它们在大脑中表达更高水平的hACE2 RNA，并显示大脑对SARS-CoV-2复制的允许性显著提升，同时在感染后<4天内出现严重的脑炎症和致命疾病的发展。这些区别性特征可由hACE2表达谱的差异产生，原因如下：(i)与裸DNA相比，ILV在染色体中的选择性插入位点，和/或(ii)土拨鼠转录后调控元件(WPRE)与苜蓿病毒翻译增强子(McCray等人，2007年)分别在B6.K18-hACE2IP-THV和B6.K18-ACE22Prlmn/JAX动物中的不同作用。其他报告的hACE2人源化小鼠在以下条件下表达转基因：(i)小鼠ACE2启动子，大脑中的无报告的hACE2 mRNA表达(Yang等人，2007年)，(ii)“肝细胞核因子3/叉头同源物4”(HFH4)启动子，即“HFH4-hACE2”C3B6小鼠，其中肺部是感染和病理学的主要部位((Jiang等人，2020年；Menachery等人，2016年)，和(iii)“CAG”混合启动子，即“AC70”C3H×C57BL/6小鼠，其中hACE2 mRNA在包括肺部和大脑在内的多个器官中表达(Tseng等人，2007年)。AC70与B6.K18-hACE2IP-THV小鼠的比较可能有助于评估这两种模型的相似性和差异。然而，我们在此处报告与B6.K18-ACE22Prlmn/JAX小鼠相比，B6.K18-hACE2IP-THV小鼠的大脑对SARS-CoV-2复制的允许性高得多。B6.K18-hACE2IP-THV小鼠模型不仅在COVID-19疫苗研究中具有广泛的应用，而且为探索COVID-19衍生的神经病理学提供了独特的啮齿动物模型。基于这些转基因小鼠的大脑对SARS-CoV-2复制和致死性疾病发展的显著允许性，可认为这种临床前模型比黄金仓鼠模型更加严格。
在这项研究中，使用高度严格的B6.K18-hACE2IP-THV小鼠证明了鼻内注射增强免疫对于通过针对SARS-CoV-2开发的基于LV的候选疫苗诱导CNS的灭菌保护的重要性。嗅球可通过局部先天免疫和适应性免疫作用来控制病毒性CNS感染(Durrant等人，2016年)，并且我们观察到，在肌肉注射-鼻内注射接种疫苗且受保护的小鼠中，CD8+T细胞在该解剖学战略区域的频率增加。在这些接种疫苗且受保护的小鼠的大脑中也证明了炎症中介体的显著减少，同时嗅球和大脑中的中性粒细胞和炎性单核细胞分别减少。
共病患者中与COVID-19相关的神经系统表现的来源可能是：(i)SARS-CoV-2对CNS的直接影响，(ii)脑血管内皮的感染，以及(iii)CNS内不受控的抗病毒免疫应答。ACE2在人类神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中表达，位于颞中回和后扣带皮层，这可解释患者大脑对SARS-CoV-2的允许性(Song等人，2020年；Hu等人，2020年)。病毒可通过神经传播或血源性途径侵入大脑(Bohmwald等人，2018年；Desforges等人，2019年，2014年)。嗅觉系统通过额叶皮层与CNS建立直接联接(Mori等人，2005年)。病毒向CNS的神经传递可能是通过嗅粘膜中的轴突运输直接侵入神经元的结果。在神经元内复制之后，病毒传播到突触并传播到接受嗅束投射的解剖学CNS区域(Koyuncu等人，2013年；Zubair等人，2020年；Berth，2009年；Koyuncu等人，2013年；Román等人，2020年)。然而，在与嗅粘膜无关的CNS区域中检测到病毒RNA表明存在另一种病毒进入CNS，包括SARS-CoV-2感染的免疫细胞穿过血脑屏障或通过CNS血管内皮的直接病毒进入途径的迁移(Meinhardt等人，2020年)。尽管处于稳定状态，但病毒无法通过完整的血脑屏障渗透到大脑中(Berth，2009年)，在细胞因子/趋化因子风暴期间大量产生的炎症中介体、特别是TNF-α和CCL2可破坏血脑屏障的完整性或增加其通透性，从而允许病毒或病毒感染的白细胞通过细胞旁路血液向大脑转运{Aghagoli，2020#77；Hu，2011#15}。无论SARS-CoV-2进入大脑的机制如何，我们提供的证据表明，通过使用NILV::SΔF2P进行鼻内增强免疫，对CNS具有抗SARS-CoV-2的全面保护。
我们在实施例1中报告了结果，证明了LV::SFL在诱导肺部对SARS-CoV-2感染的灭菌保护方面的强大预防能力。在本研究中，我们转向临床试验，使用编码稳定的SCov-2预融合SΔF2P形式的LV作为表现出接种益处的另一种形式的S蛋白。这一选择基于数据，所述数据表明了病毒包膜糖蛋白在其预融合形式下的稳定性提高了它们作为重组蛋白在亚单位疫苗工业生产中的产量，以及通过提高抗原在其最佳免疫原性特征下的可用性的基于核酸的疫苗的效力(Hsieh等人，2020年)。迄今为止，预融合稳定方法已应用于多种冠状病毒的S蛋白，包括HKU1-CoV、SARS-CoV和MERS-CoV。已证明，稳定的SMERS-CoV在临床前动物模型中引发更高的NAb应答和保护(Hsieh等人，2020年)。
单次鼻内注射给药对肺部的灭菌保护和鼻内注射增强对CNS的全面保护是最重要的优点。编码全长或稳定形式SCoV-2的非细胞病变LV和非炎症性LV，源自SARS-CoV-2的祖先或新出现的变体，提供了有前景的第二代COVID-19候选疫苗。考虑到与COVID-19相关的多种、有时严重的神经病理学表现，必须考虑到迄今为止其他疫苗策略尚未直接解决的大脑保护问题。
实施例4：NILV::SCoV-2祖先诱导的抗遗传距离遥远的P.1(所谓的Manaus，巴西或γ)的完全交叉保护
目前使用的COVID-19疫苗的一个关键问题是抗新出现的变体的保护效力。为用NILV::SCoV-2祖先候选疫苗评估该问题，B6.K18-hACE2IP-THV转基因小鼠用NILV::SCoV-2或假疫苗进行肌肉注射(第0周)初免和鼻内注射(第5周)增强(图25A)。然后在第7周用0.3×105TCID50/小鼠的P.1(所谓的Manaus，巴西或γ)SARS-CoV-2攻击小鼠，这是迄今为止描述的遗传距离最远的变体(Buss等人，2021年)。在3dpi时，对大脑和肺部病毒载量的测定表明用NILV::SCoV-2祖先进行肌肉注射-鼻内注射初免-增强诱导大脑和肺部抗这种遗传远距离P.1变体的全面交叉保护(图25B)。我们观察到，与S祖先、SD614G或SB1.117假病毒相比，接种NILV::SCoV-2祖先疫苗的小鼠血清对SB1.351或SManaus P.1假病毒的中和能力显著降低(图25C)。
尽管具有显著的保护作用，但这显著降低了保护性B细胞应答，提高了T细胞参与NILV::SCoV-2祖先介导的全面保护的可能性。为评估这种可能性，我们按照相同的方案(图25A)给C57BL/6WT或μMT KO小鼠接种疫苗。μMT KO小鼠缺乏成熟的B细胞室，因此缺乏Ig/抗体应答(Kitamura等人，1991年)。为使这些非转基因小鼠允许SARS-CoV-2复制，在SARS-CoV-2攻击前4天，用3×108IGU的编码hACE2的腺病毒载体血清型5(Ad5::hACE2)进行预处理，如我们先前所述(Ku等人，2021年)。在3dpi时肺病毒载量的测定表明，接种疫苗的WT小鼠的肺部得到了全面保护，接种疫苗的μMT KO小鼠也得到了非常显著的保护(图26A)。这一观察表明，B细胞非依赖性和抗原特异性细胞免疫(即T细胞应答)在NILV::SCoV-2介导的针对SARS-CoV-2的保护中发挥主要作用。
这符合：(i)NILV::SCoV-2祖先诱导的系统水平的强CD8+T细胞应答(图26B)，(ii)显著比例的产生IFN-γ的肺CD8+T淋巴细胞，特异于几个SCoV-2表位(图26C)，(iii)高比例的肺CD8+T细胞，所述细胞具有效应记忆(Tem)和驻留记忆(Trm)表型(图26D)，(iv)嗅球中CD8+T淋巴细胞的募集，在接种且用SARS-CoV-2祖先株(图27A-C)或SARS-CoV-2P.1变体(图27D、图27E)攻击的小鼠中可检测到。
值得注意的是，在SCoV-2祖先序列上鉴定的所有小鼠和人CD8+T细胞表位都保存在突变的SCoV-2Manaus P.1中(表5)。这些观察结果表明，NILV在通过引发显著的B细胞和T细胞应答而诱导肺部和大脑抗祖先和新出现的SARS-CoV-2变体的全面保护方面具有强大潜力。与作为NAb靶点的B细胞表位相比(Hoffmann等人，2021年)，迄今为止鉴定的T细胞表位并未受到SCoV-2新出现的变体中积累的突变的影响。
表5.SCoV-2衍生的小鼠和人类T细胞表位
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实施例5：鉴定来自SARS-CoV-2B1.351(所谓的南非或β)变体的刺突作为用于广泛保护性LV疫苗的最合适的抗原。
如实施例4所示，我们表明NILV::SCoV-2祖先在很大程度上保护了高度易感的B6.K18-hACE2IP-THV转基因小鼠抗祖先株和遗传距离最远的Manaus P.1SARS-CoV-2变体。为建立一种疗法，以进一步改进抗原，考虑使用最合适的刺突变体，该变体可最好地考虑已知变体的病毒传播动力学。
为鉴定最具交叉保护性的刺突变体，我们用编码每个目标刺突的LV对C57BL/6小鼠进行初免和增强(图28A)，并通过使用携带每个刺突的假病毒评估它们的交叉血清中和潜力(图28B)。如图28C所示，我们观察到：
(i)用LV::SCoV-2B1.1.7免疫的小鼠血清在高EC50下中和了携带SCoV-2祖先和LV::SCoV-2B1.1.7的假病毒，但对携带SCoV-2B1.351和LV::SCoV-2P.1的假病毒的中和效力较差。
(ii)用LV::SCoV-2P.1免疫的小鼠血清在高EC50下中和了携带SCoV-2P.1和LV::SCoV-2B1.351的假病毒，但对携带SCoV-2祖先和LV::SCoV-2B1.1.7的假病毒的中和效力较差。
(iii)用LV::SCoV-2B1.351免疫的小鼠血清在高EC50下不仅中和了携带SCoV-2P.1和LV::SCoV-2B1.351的假病毒，而且还中和了携带SCoV-2祖先和LV::SCoV-2B1.1.7的假病毒。
这些结果表明来自B1.351(南非或β)变体的刺突序列是中和抗体方面最具交叉反应性的免疫原。
此外，我们表明，在LV的情况下，K986P-V987P取代(2P)的刺突稳定显著提高了(交叉)中和抗体活性(图29A-C)。
因此，我们未来的主要候选抗原是来自B1.351(南非或β)变体的具有2P的全长刺突。
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<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
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His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
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Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
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Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
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Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
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Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
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Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
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Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
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Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
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Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
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Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
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Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
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Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
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Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
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Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
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Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
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Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
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Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
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Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
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Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
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Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
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Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
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Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
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Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
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Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
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Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
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<212> DNA
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
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atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
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ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
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ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
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<210> 3
<211> 10079
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 3
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<210> 4
<211> 3825
<212> DNA
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 4
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gagtgcgata tccccatcgg agccggaatc tgcgcctcct atcagaccca gaccaatagt 2040
ccacgacgag cccgaagtgt ggccagccag agcatcattg cctataccat gagcctgggc 2100
gccgagaata gcgtggccta ctccaacaac agcattgcta tccccaccaa cttcaccatc 2160
agcgtgacca ccgagatcct gccagtgtcc atgaccaaga ccagcgtgga ctgcaccatg 2220
tacatctgcg gagatagcac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg aagtttctgc 2280
acccagctga atcgcgccct gacaggcatt gccgtggaac aggataagaa cacccaagag 2340
gtgttcgccc aagtgaagca aatctacaag accccaccaa tcaaggattt cggcggcttc 2400
aatttcagcc agattctgcc cgatccaagc aagcccagca agcgcagctt catcgaggac 2460
ctgctgttca acaaagtgac actggccgac gccggattca tcaagcagta tggcgattgc 2520
ctgggcgata ttgccgcacg cgatctgatt tgcgcccaga agtttaacgg actgaccgtc 2580
ctgccaccac tgctgacaga tgagatgatc gcccagtaca caagtgccct gctggccgga 2640
accattacca gcggatggac atttggagcc ggtgccgctc tgcagattcc cttcgctatg 2700
cagatggcct accgcttcaa tggcattggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc atcggcaaga ttcaggacag cctgagtagt 2820
accgccagcg ctctgggaaa gctgcaggat gtggtcaacc agaacgctca ggccctgaac 2880
accctggtta agcagctgag cagcaacttc ggcgccatca gtagcgtgct gaacgatatc 2940
ctgagccgcc tggataaggt ggaagccgag gtgcagatcg atcgcctgat taccggacgc 3000
ctgcagtccc tgcagaccta tgtgacacag cagctgatcc gagccgccga gattcgagct 3060
agtgctaatc tggccgccac caagatgagc gaatgtgtgc tgggacagag caagcgcgtg 3120
gacttttgcg gcaagggata ccacctgatg agcttcccac agagtgctcc acacggcgtg 3180
gtgtttctgc atgtgaccta cgtgcccgct caagagaaga atttcaccac cgctccagcc 3240
atctgccacg acggaaaggc ccattttcca cgcgagggcg tgttcgttag caacggcact 3300
cattggttcg tcacccagcg caacttctac gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc 3360
ttcgtcagcg gcaactgcga cgtcgtgatc ggcattgtga acaacaccgt gtacgatcca 3420
ctgcagcccg agctggacag cttcaaagag gaactggaca agtactttaa gaaccacaca 3480
agccccgacg tggacctggg agacattagc ggaatcaacg ccagcgtggt caacatccag 3540
aaagagattg accgcctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgacctg 3600
caagaactgg gcaaatacga gcagtacatt aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc 3660
attgccggac tgattgccat cgtgatggtc accattatgc tgtgctgcat gaccagttgc 3720
tgcagctgcc tgaagggatg ctgcagttgc ggaagctgct gcaagttcga cgaggatgat 3780
agcgagccag tgctgaaggg cgtcaagctg cactacacct gataa 3825
<210> 5
<211> 1273
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 5
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 6
<211> 10079
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 6
cgcgttggga gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg 60
aatagctcag aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 120
tggggcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc 180
gggactatgg ttgctgacta attgagatgc ccgacattga ttattgacta gttggaaggg 240
ctaattcact cccaacgaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc 300
tacttccctg attagcagaa ctacacacca gggccaggga tcagatatcc actgaccttt 360
ggatggtgct acaagctagt accagttgag ccagagaagt tagaagaagc caacaaagga 420
gagaacacca gcttgttaca acctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa 480
gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acggtggccc gagagctgca 540
tccggagtac ttcaagaact gctgatatcg agcttgctac aagggacttt ccgctggggg 600
actttccagg gaggcgtggc ctgggcggga ctggggagtg gcgagccctc agatcctgca 660
tataagcagc tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg 720
gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg 780
cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc 840
ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag 900
ggaaaccaga ggagctctct cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag 960
gcgaggggcg gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga 1020
gagatgggtg cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa 1080
ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca 1140
gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac 1200
aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat 1260
ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg 1320
aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg 1380
ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat 1440
aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga 1500
gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga 1560
gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta 1620
ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat 1680
ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa 1740
agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc 1800
accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat 1860
cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc 1920
ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat 1980
aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta 2040
ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata 2100
gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg 2160
aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga 2220
tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccgaa ttcacaaatg gcagtattca 2280
tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag 2340
acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa 2400
attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccactttg gctgatacgc gtggagttcc 2460
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 2520
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 2580
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 2640
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 2700
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 2760
ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 2820
gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 2880
gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 2940
tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac 3000
gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccgcga tcggatctcg tacggccacc 3060
atgttcgtgt ttctggtgct gctgccactg gtgtccagtc agtgcgtgaa cctgaccaca 3120
cgaacacagc tgccaccagc ctacaccaat agcttcaccc gcggagtgta ctaccccgac 3180
aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcatagc acccaggatc tgtttctgcc cttcttcagc 3240
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg tccggcacca atggcaccaa gcgcttcgat 3300
aatcccgtgc tgcccttcaa cgatggcgtg tactttgcca gcaccgagaa gtccaatatc 3360
atccgcggct ggatcttcgg caccacactg gatagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 3420
aacaacgcca ccaacgtggt catcaaagtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 3480
ctgggcgtct actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt ccgcgtgtac 3540
agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc cattcctgat ggacctggaa 3600
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 3660
ttcaaaatct acagcaagca caccccaatc aacctcgtgc gcgatctgcc acagggattc 3720
agtgctctgg aacccctggt ggatctgccc atcggcatca acattacccg ctttcagaca 3780
ctgctggccc tgcaccgcag ttacttgaca ccaggcgata gcagcagtgg atggacagct 3840
ggtgccgccg cttactacgt tggatatctg cagccacgca cctttctgct gaagtacaac 3900
gagaacggca ccatcaccga cgccgtggat tgtgctctcg atcccctgag cgagacaaag 3960
tgcaccctga agtccttcac cgtcgagaag ggcatctacc agaccagcaa tttccgcgtg 4020
cagcccaccg agagcatcgt gcgcttcccc aatatcacca atctgtgccc cttcggcgag 4080
gtgttcaatg ccacacgctt tgcctccgtg tacgcctgga atcgcaagcg cattagcaac 4140
tgcgtggccg actactccgt gctgtacaat agcgccagct tcagcacctt caagtgctac 4200
ggcgtgtcac ccaccaagct gaacgacctg tgcttcacca atgtgtacgc cgacagcttc 4260
gtgatccgcg gagatgaagt gcgacagatt gccccaggcc agaccggcaa gatcgccgac 4320
tacaattaca agctgcccga cgacttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaac 4380
ctggattcca aagtcggcgg caactacaac tacctgtacc gcctgttccg caagagcaat 4440
ctgaagccct tcgagcgcga catcagcacc gaaatctacc aggccggaag caccccatgc 4500
aacggcgtgg aaggcttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggatt tcagcccaca 4560
aatggcgtgg gctaccagcc atatcgagtg gtggtgctga gcttcgaact gctgcatgct 4620
ccagctaccg tgtgcggccc caagaagagt accaacctgg tcaagaacaa atgcgtgaac 4680
ttcaacttca acggcctgac cggaaccggc gtgctgaccg agagtaacaa gaagttcctg 4740
ccattccagc agtttggccg cgacattgcc gatacaaccg atgccgttcg cgatccccag 4800
accttggaga tcctggatat taccccatgc tccttcggcg gcgtgtccgt gattacacca 4860
ggcaccaata ccagcaacca ggtggccgtt ctgtaccagg atgtgaattg cacagaggtg 4920
cccgtggcca ttcacgccga tcaattgaca ccaacatggc gcgtgtactc caccggcagc 4980
aatgtgtttc aaacccgcgc tggatgcctg attggagccg agcacgtgaa caatagctac 5040
gagtgcgata tccccatcgg agccggaatc tgcgcctcct atcagaccca gaccaatagt 5100
ccacgacgag cccgaagtgt ggccagccag agcatcattg cctataccat gagcctgggc 5160
gccgagaata gcgtggccta ctccaacaac agcattgcta tccccaccaa cttcaccatc 5220
agcgtgacca ccgagatcct gccagtgtcc atgaccaaga ccagcgtgga ctgcaccatg 5280
tacatctgcg gagatagcac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg aagtttctgc 5340
acccagctga atcgcgccct gacaggcatt gccgtggaac aggataagaa cacccaagag 5400
gtgttcgccc aagtgaagca aatctacaag accccaccaa tcaaggattt cggcggcttc 5460
aatttcagcc agattctgcc cgatccaagc aagcccagca agcgcagctt catcgaggac 5520
ctgctgttca acaaagtgac actggccgac gccggattca tcaagcagta tggcgattgc 5580
ctgggcgata ttgccgcacg cgatctgatt tgcgcccaga agtttaacgg actgaccgtc 5640
ctgccaccac tgctgacaga tgagatgatc gcccagtaca caagtgccct gctggccgga 5700
accattacca gcggatggac atttggagcc ggtgccgctc tgcagattcc cttcgctatg 5760
cagatggcct accgcttcaa tggcattggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 5820
aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc atcggcaaga ttcaggacag cctgagtagt 5880
accgccagcg ctctgggaaa gctgcaggat gtggtcaacc agaacgctca ggccctgaac 5940
accctggtta agcagctgag cagcaacttc ggcgccatca gtagcgtgct gaacgatatc 6000
ctgagccgcc tggatccacc agaagccgag gtgcagatcg atcgcctgat taccggacgc 6060
ctgcagtccc tgcagaccta tgtgacacag cagctgatcc gagccgccga gattcgagct 6120
agtgctaatc tggccgccac caagatgagc gaatgtgtgc tgggacagag caagcgcgtg 6180
gacttttgcg gcaagggata ccacctgatg agcttcccac agagtgctcc acacggcgtg 6240
gtgtttctgc atgtgaccta cgtgcccgct caagagaaga atttcaccac cgctccagcc 6300
atctgccacg acggaaaggc ccattttcca cgcgagggcg tgttcgttag caacggcact 6360
cattggttcg tcacccagcg caacttctac gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc 6420
ttcgtcagcg gcaactgcga cgtcgtgatc ggcattgtga acaacaccgt gtacgatcca 6480
ctgcagcccg agctggacag cttcaaagag gaactggaca agtactttaa gaaccacaca 6540
agccccgacg tggacctggg agacattagc ggaatcaacg ccagcgtggt caacatccag 6600
aaagagattg accgcctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgacctg 6660
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attgccggac tgattgccat cgtgatggtc accattatgc tgtgctgcat gaccagttgc 6780
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agcgagccag tgctgaaggg cgtcaagctg cactacacct gataacgagc gcgcctcgag 6900
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ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 7020
tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta 7080
tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc 7140
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ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 7260
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gcggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 7380
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 7440
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca 7500
tcgggggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta 7560
aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaagacaaga tcgtcgagag 7620
atgctgcata taagcagctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 7680
gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc 7740
cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 7800
tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagttc tagagggccc gtttaaaccc 7860
gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg 7920
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gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg 8100
cttctactgg gcggttttat ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc 8160
tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa ctggatggct ttctcgccgc caaggatctg 8220
atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga 8280
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ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg 8400
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ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt 8520
tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct 8580
gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct 8640
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ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct 9000
ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt 9060
cttctgaatt attaacgctt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 9120
cggtatttca caccgcatac aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 9180
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 9240
atgcttcaat aatagcacgt gctaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 9300
atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 9360
tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 9420
tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 9480
ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc 9540
cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 9600
ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 9660
gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 9720
tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 9780
gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 9840
ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 9900
tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 9960
ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctgggcttt 10020
tgctggcctt ttgctcacat gttcttgact cttcgcgatg tacgggccag atatacgcg 10079
<210> 7
<211> 3825
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 7
atgttcgtgt ttctggtgct gctgccactg gtgtccagtc agtgcgtgaa cctgaccaca 60
cgaacacagc tgccaccagc ctacaccaat agcttcaccc gcggagtgta ctaccccgac 120
aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcatagc acccaggatc tgtttctgcc cttcttcagc 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg tccggcacca atggcaccaa gcgcttcgat 240
aatcccgtgc tgcccttcaa cgatggcgtg tactttgcca gcaccgagaa gtccaatatc 300
atccgcggct ggatcttcgg caccacactg gatagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360
aacaacgcca ccaacgtggt catcaaagtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 420
ctgggcgtct actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt ccgcgtgtac 480
agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc cattcctgat ggacctggaa 540
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600
ttcaaaatct acagcaagca caccccaatc aacctcgtgc gcgatctgcc acagggattc 660
agtgctctgg aacccctggt ggatctgccc atcggcatca acattacccg ctttcagaca 720
ctgctggccc tgcaccgcag ttacttgaca ccaggcgata gcagcagtgg atggacagct 780
ggtgccgccg cttactacgt tggatatctg cagccacgca cctttctgct gaagtacaac 840
gagaacggca ccatcaccga cgccgtggat tgtgctctcg atcccctgag cgagacaaag 900
tgcaccctga agtccttcac cgtcgagaag ggcatctacc agaccagcaa tttccgcgtg 960
cagcccaccg agagcatcgt gcgcttcccc aatatcacca atctgtgccc cttcggcgag 1020
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ggcgtgtcac ccaccaagct gaacgacctg tgcttcacca atgtgtacgc cgacagcttc 1200
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gagtgcgata tccccatcgg agccggaatc tgcgcctcct atcagaccca gaccaatagt 2040
ccacgacgag cccgaagtgt ggccagccag agcatcattg cctataccat gagcctgggc 2100
gccgagaata gcgtggccta ctccaacaac agcattgcta tccccaccaa cttcaccatc 2160
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accattacca gcggatggac atttggagcc ggtgccgctc tgcagattcc cttcgctatg 2700
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aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc atcggcaaga ttcaggacag cctgagtagt 2820
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<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 8
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
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Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
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Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
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Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
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Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
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1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
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Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
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Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
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His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
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Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
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Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
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Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
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Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
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<210> 9
<211> 10079
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 9
cgcgttggga gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg 60
aatagctcag aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 120
tggggcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc 180
gggactatgg ttgctgacta attgagatgc ccgacattga ttattgacta gttggaaggg 240
ctaattcact cccaacgaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc 300
tacttccctg attagcagaa ctacacacca gggccaggga tcagatatcc actgaccttt 360
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tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 2580
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 2640
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 2700
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 2760
ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 2820
gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 2880
gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 2940
tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac 3000
gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccgcga tcggatctcg tacggccacc 3060
atgttcgtgt ttctggtgct gctgccactg gtgtccagtc agtgcgtgaa cctgaccaca 3120
cgaacacagc tgccaccagc ctacaccaat agcttcaccc gcggagtgta ctaccccgac 3180
aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcatagc acccaggatc tgtttctgcc cttcttcagc 3240
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg tccggcacca atggcaccaa gcgcttcgat 3300
aatcccgtgc tgcccttcaa cgatggcgtg tactttgcca gcaccgagaa gtccaatatc 3360
atccgcggct ggatcttcgg caccacactg gatagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 3420
aacaacgcca ccaacgtggt catcaaagtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 3480
ctgggcgtct actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt ccgcgtgtac 3540
agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc cattcctgat ggacctggaa 3600
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 3660
ttcaaaatct acagcaagca caccccaatc aacctcgtgc gcgatctgcc acagggattc 3720
agtgctctgg aacccctggt ggatctgccc atcggcatca acattacccg ctttcagaca 3780
ctgctggccc tgcaccgcag ttacttgaca ccaggcgata gcagcagtgg atggacagct 3840
ggtgccgccg cttactacgt tggatatctg cagccacgca cctttctgct gaagtacaac 3900
gagaacggca ccatcaccga cgccgtggat tgtgctctcg atcccctgag cgagacaaag 3960
tgcaccctga agtccttcac cgtcgagaag ggcatctacc agaccagcaa tttccgcgtg 4020
cagcccaccg agagcatcgt gcgcttcccc aatatcacca atctgtgccc cttcggcgag 4080
gtgttcaatg ccacacgctt tgcctccgtg tacgcctgga atcgcaagcg cattagcaac 4140
tgcgtggccg actactccgt gctgtacaat agcgccagct tcagcacctt caagtgctac 4200
ggcgtgtcac ccaccaagct gaacgacctg tgcttcacca atgtgtacgc cgacagcttc 4260
gtgatccgcg gagatgaagt gcgacagatt gccccaggcc agaccggcaa gatcgccgac 4320
tacaattaca agctgcccga cgacttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaac 4380
ctggattcca aagtcggcgg caactacaac tacctgtacc gcctgttccg caagagcaat 4440
ctgaagccct tcgagcgcga catcagcacc gaaatctacc aggccggaag caccccatgc 4500
aacggcgtgg aaggcttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggatt tcagcccaca 4560
aatggcgtgg gctaccagcc atatcgagtg gtggtgctga gcttcgaact gctgcatgct 4620
ccagctaccg tgtgcggccc caagaagagt accaacctgg tcaagaacaa atgcgtgaac 4680
ttcaacttca acggcctgac cggaaccggc gtgctgaccg agagtaacaa gaagttcctg 4740
ccattccagc agtttggccg cgacattgcc gatacaaccg atgccgttcg cgatccccag 4800
accttggaga tcctggatat taccccatgc tccttcggcg gcgtgtccgt gattacacca 4860
ggcaccaata ccagcaacca ggtggccgtt ctgtaccagg atgtgaattg cacagaggtg 4920
cccgtggcca ttcacgccga tcaattgaca ccaacatggc gcgtgtactc caccggcagc 4980
aatgtgtttc aaacccgcgc tggatgcctg attggagccg agcacgtgaa caatagctac 5040
gagtgcgata tccccatcgg agccggaatc tgcgcctcct atcagaccca gaccaatagt 5100
ccaggatccg ccggaagtgt ggccagccag agcatcattg cctataccat gagcctgggc 5160
gccgagaata gcgtggccta ctccaacaac agcattgcta tccccaccaa cttcaccatc 5220
agcgtgacca ccgagatcct gccagtgtcc atgaccaaga ccagcgtgga ctgcaccatg 5280
tacatctgcg gagatagcac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg aagtttctgc 5340
acccagctga atcgcgccct gacaggcatt gccgtggaac aggataagaa cacccaagag 5400
gtgttcgccc aagtgaagca aatctacaag accccaccaa tcaaggattt cggcggcttc 5460
aatttcagcc agattctgcc cgatccaagc aagcccagca agcgcagctt catcgaggac 5520
ctgctgttca acaaagtgac actggccgac gccggattca tcaagcagta tggcgattgc 5580
ctgggcgata ttgccgcacg cgatctgatt tgcgcccaga agtttaacgg actgaccgtc 5640
ctgccaccac tgctgacaga tgagatgatc gcccagtaca caagtgccct gctggccgga 5700
accattacca gcggatggac atttggagcc ggtgccgctc tgcagattcc cttcgctatg 5760
cagatggcct accgcttcaa tggcattggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 5820
aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc atcggcaaga ttcaggacag cctgagtagt 5880
accgccagcg ctctgggaaa gctgcaggat gtggtcaacc agaacgctca ggccctgaac 5940
accctggtta agcagctgag cagcaacttc ggcgccatca gtagcgtgct gaacgatatc 6000
ctgagccgcc tggatccacc agaagccgag gtgcagatcg atcgcctgat taccggacgc 6060
ctgcagtccc tgcagaccta tgtgacacag cagctgatcc gagccgccga gattcgagct 6120
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gacttttgcg gcaagggata ccacctgatg agcttcccac agagtgctcc acacggcgtg 6240
gtgtttctgc atgtgaccta cgtgcccgct caagagaaga atttcaccac cgctccagcc 6300
atctgccacg acggaaaggc ccattttcca cgcgagggcg tgttcgttag caacggcact 6360
cattggttcg tcacccagcg caacttctac gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc 6420
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ctgcagcccg agctggacag cttcaaagag gaactggaca agtactttaa gaaccacaca 6540
agccccgacg tggacctggg agacattagc ggaatcaacg ccagcgtggt caacatccag 6600
aaagagattg accgcctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgacctg 6660
caagaactgg gcaaatacga gcagtacatt aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc 6720
attgccggac tgattgccat cgtgatggtc accattatgc tgtgctgcat gaccagttgc 6780
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agcgagccag tgctgaaggg cgtcaagctg cactacacct gataacgagc gcgcctcgag 6900
aattcccgat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 6960
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tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta 7080
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ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 7260
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tcgggggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta 7560
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atgctgcata taagcagctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 7680
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cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 7800
tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagttc tagagggccc gtttaaaccc 7860
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tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 7980
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gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg 8100
cttctactgg gcggttttat ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc 8160
tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa ctggatggct ttctcgccgc caaggatctg 8220
atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga 8280
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gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga 8460
ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt 8520
tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct 8580
gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct 8640
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ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga 8820
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ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct 9000
ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt 9060
cttctgaatt attaacgctt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 9120
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tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 9420
tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 9480
ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc 9540
cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 9600
ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 9660
gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 9720
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gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 9840
ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 9900
tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 9960
ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctgggcttt 10020
tgctggcctt ttgctcacat gttcttgact cttcgcgatg tacgggccag atatacgcg 10079
<210> 10
<211> 3825
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 10
atgttcgtgt ttctggtgct gctgccactg gtgtccagtc agtgcgtgaa cctgaccaca 60
cgaacacagc tgccaccagc ctacaccaat agcttcaccc gcggagtgta ctaccccgac 120
aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcatagc acccaggatc tgtttctgcc cttcttcagc 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg tccggcacca atggcaccaa gcgcttcgat 240
aatcccgtgc tgcccttcaa cgatggcgtg tactttgcca gcaccgagaa gtccaatatc 300
atccgcggct ggatcttcgg caccacactg gatagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360
aacaacgcca ccaacgtggt catcaaagtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 420
ctgggcgtct actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt ccgcgtgtac 480
agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc cattcctgat ggacctggaa 540
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600
ttcaaaatct acagcaagca caccccaatc aacctcgtgc gcgatctgcc acagggattc 660
agtgctctgg aacccctggt ggatctgccc atcggcatca acattacccg ctttcagaca 720
ctgctggccc tgcaccgcag ttacttgaca ccaggcgata gcagcagtgg atggacagct 780
ggtgccgccg cttactacgt tggatatctg cagccacgca cctttctgct gaagtacaac 840
gagaacggca ccatcaccga cgccgtggat tgtgctctcg atcccctgag cgagacaaag 900
tgcaccctga agtccttcac cgtcgagaag ggcatctacc agaccagcaa tttccgcgtg 960
cagcccaccg agagcatcgt gcgcttcccc aatatcacca atctgtgccc cttcggcgag 1020
gtgttcaatg ccacacgctt tgcctccgtg tacgcctgga atcgcaagcg cattagcaac 1080
tgcgtggccg actactccgt gctgtacaat agcgccagct tcagcacctt caagtgctac 1140
ggcgtgtcac ccaccaagct gaacgacctg tgcttcacca atgtgtacgc cgacagcttc 1200
gtgatccgcg gagatgaagt gcgacagatt gccccaggcc agaccggcaa gatcgccgac 1260
tacaattaca agctgcccga cgacttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaac 1320
ctggattcca aagtcggcgg caactacaac tacctgtacc gcctgttccg caagagcaat 1380
ctgaagccct tcgagcgcga catcagcacc gaaatctacc aggccggaag caccccatgc 1440
aacggcgtgg aaggcttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggatt tcagcccaca 1500
aatggcgtgg gctaccagcc atatcgagtg gtggtgctga gcttcgaact gctgcatgct 1560
ccagctaccg tgtgcggccc caagaagagt accaacctgg tcaagaacaa atgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggcctgac cggaaccggc gtgctgaccg agagtaacaa gaagttcctg 1680
ccattccagc agtttggccg cgacattgcc gatacaaccg atgccgttcg cgatccccag 1740
accttggaga tcctggatat taccccatgc tccttcggcg gcgtgtccgt gattacacca 1800
ggcaccaata ccagcaacca ggtggccgtt ctgtaccagg atgtgaattg cacagaggtg 1860
cccgtggcca ttcacgccga tcaattgaca ccaacatggc gcgtgtactc caccggcagc 1920
aatgtgtttc aaacccgcgc tggatgcctg attggagccg agcacgtgaa caatagctac 1980
gagtgcgata tccccatcgg agccggaatc tgcgcctcct atcagaccca gaccaatagt 2040
ccaggatccg ccggaagtgt ggccagccag agcatcattg cctataccat gagcctgggc 2100
gccgagaata gcgtggccta ctccaacaac agcattgcta tccccaccaa cttcaccatc 2160
agcgtgacca ccgagatcct gccagtgtcc atgaccaaga ccagcgtgga ctgcaccatg 2220
tacatctgcg gagatagcac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg aagtttctgc 2280
acccagctga atcgcgccct gacaggcatt gccgtggaac aggataagaa cacccaagag 2340
gtgttcgccc aagtgaagca aatctacaag accccaccaa tcaaggattt cggcggcttc 2400
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ctgccaccac tgctgacaga tgagatgatc gcccagtaca caagtgccct gctggccgga 2640
accattacca gcggatggac atttggagcc ggtgccgctc tgcagattcc cttcgctatg 2700
cagatggcct accgcttcaa tggcattggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc atcggcaaga ttcaggacag cctgagtagt 2820
accgccagcg ctctgggaaa gctgcaggat gtggtcaacc agaacgctca ggccctgaac 2880
accctggtta agcagctgag cagcaacttc ggcgccatca gtagcgtgct gaacgatatc 2940
ctgagccgcc tggatccacc agaagccgag gtgcagatcg atcgcctgat taccggacgc 3000
ctgcagtccc tgcagaccta tgtgacacag cagctgatcc gagccgccga gattcgagct 3060
agtgctaatc tggccgccac caagatgagc gaatgtgtgc tgggacagag caagcgcgtg 3120
gacttttgcg gcaagggata ccacctgatg agcttcccac agagtgctcc acacggcgtg 3180
gtgtttctgc atgtgaccta cgtgcccgct caagagaaga atttcaccac cgctccagcc 3240
atctgccacg acggaaaggc ccattttcca cgcgagggcg tgttcgttag caacggcact 3300
cattggttcg tcacccagcg caacttctac gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc 3360
ttcgtcagcg gcaactgcga cgtcgtgatc ggcattgtga acaacaccgt gtacgatcca 3420
ctgcagcccg agctggacag cttcaaagag gaactggaca agtactttaa gaaccacaca 3480
agccccgacg tggacctggg agacattagc ggaatcaacg ccagcgtggt caacatccag 3540
aaagagattg accgcctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgacctg 3600
caagaactgg gcaaatacga gcagtacatt aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc 3660
attgccggac tgattgccat cgtgatggtc accattatgc tgtgctgcat gaccagttgc 3720
tgcagctgcc tgaagggatg ctgcagttgc ggaagctgct gcaagttcga cgaggatgat 3780
agcgagccag tgctgaaggg cgtcaagctg cactacacct gataa 3825
<210> 11
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 11
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Gly Ser Ala Gly Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
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Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
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Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
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Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
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Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
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Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
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Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
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Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
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Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
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Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
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Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
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Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
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Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
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gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac 1200
aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat 1260
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ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat 1980
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aatggcgtgg gctaccagcc atatcgagtg gtggtgctga gcttcgaact gctgcatgct 1560
ccagctaccg tgtgcggccc caagaagagt accaacctgg tcaagaacaa atgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggcctgac cggaaccggc gtgctgaccg agagtaacaa gaagttcctg 1680
ccattccagc agtttggccg cgacattgcc gatacaaccg atgccgttcg cgatccccag 1740
accttggaga tcctggatat taccccatgc tccttcggcg gcgtgtccgt gattacacca 1800
ggcaccaata ccagcaacca ggtggccgtt ctgtaccagg atgtgaattg cacagaggtg 1860
cccgtggcca ttcacgccga tcaattgaca ccaacatggc gcgtgtactc caccggcagc 1920
aatgtgtttc aaacccgcgc tggatgcctg attggagccg agcacgtgaa caatagctac 1980
gagtgcgata tccccatcgg agccggaatc tgcgcatcct atagtgtggc cagccagagc 2040
atcattgcct ataccatgag cctgggcgcc gagaatagcg tggcctactc caacaacagc 2100
attgctatcc ccaccaactt caccatcagc gtgaccaccg agatcctgcc agtgtccatg 2160
accaagacca gcgtggactg caccatgtac atctgcggag atagcaccga gtgcagcaac 2220
ctgctgctgc agtacggaag tttctgcacc cagctgaatc gcgccctgac aggcattgcc 2280
gtggaacagg ataagaacac ccaagaggtg ttcgcccaag tgaagcaaat ctacaagacc 2340
ccaccaatca aggatttcgg cggcttcaat ttcagccaga ttctgcccga tccaagcaag 2400
cccagcaagc gcagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca aagtgacact ggccgacgcc 2460
ggattcatca agcagtatgg cgattgcctg ggcgatattg ccgcacgcga tctgatttgc 2520
gcccagaagt ttaacggact gaccgtcctg ccaccactgc tgacagatga gatgatcgcc 2580
cagtacacaa gtgccctgct ggccggaacc attaccagcg gatggacatt tggagccggt 2640
gccgctctgc agattccctt cgctatgcag atggcctacc gcttcaatgg cattggcgtg 2700
acccagaatg tgctgtacga gaaccagaag ctgatcgcca accagttcaa cagcgccatc 2760
ggcaagattc aggacagcct gagtagtacc gccagcgctc tgggaaagct gcaggatgtg 2820
gtcaaccaga acgctcaggc cctgaacacc ctggttaagc agctgagcag caacttcggc 2880
gccatcagta gcgtgctgaa cgatatcctg agccgcctgg atccaccaga agccgaggtg 2940
cagatcgatc gcctgattac cggacgcctg cagtccctgc agacctatgt gacacagcag 3000
ctgatccgag ccgccgagat tcgagctagt gctaatctgg ccgccaccaa gatgagcgaa 3060
tgtgtgctgg gacagagcaa gcgcgtggac ttttgcggca agggatacca cctgatgagc 3120
ttcccacaga gtgctccaca cggcgtggtg tttctgcatg tgacctacgt gcccgctcaa 3180
gagaagaatt tcaccaccgc tccagccatc tgccacgacg gaaaggccca ttttccacgc 3240
gagggcgtgt tcgttagcaa cggcactcat tggttcgtca cccagcgcaa cttctacgag 3300
ccccagatca tcaccaccga caacaccttc gtcagcggca actgcgacgt cgtgatcggc 3360
attgtgaaca acaccgtgta cgatccactg cagcccgagc tggacagctt caaagaggaa 3420
ctggacaagt actttaagaa ccacacaagc cccgacgtgg acctgggaga cattagcgga 3480
atcaacgcca gcgtggtcaa catccagaaa gagattgacc gcctgaacga ggtggccaag 3540
aatctgaacg agagcctgat cgacctgcaa gaactgggca aatacgagca gtacattaag 3600
tggccctggt acatctggct gggcttcatt gccggactga ttgccatcgt gatggtcacc 3660
attatgctgt gctgcatgac cagttgctgc agctgcctga agggatgctg cagttgcgga 3720
agctgctgca agttcgacga ggatgatagc gagccagtgc tgaagggcgt caagctgcac 3780
tacacctgat aa 3792
<210> 14
<211> 1262
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 14
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu
675 680 685
Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro
690 695 700
Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met
705 710 715 720
Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr
725 730 735
Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu
740 745 750
Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln
755 760 765
Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys
770 775 780
Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys
785 790 795 800
Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr
805 810 815
Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp
820 825 830
Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr
835 840 845
Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser
850 855 860
Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly
865 870 875 880
Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn
885 890 895
Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile
900 905 910
Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser
915 920 925
Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn
930 935 940
Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly
945 950 955 960
Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro
965 970 975
Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser
980 985 990
Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg
995 1000 1005
Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu
1010 1015 1020
Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu
1025 1030 1035
Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His
1040 1045 1050
Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro
1055 1060 1065
Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val
1070 1075 1080
Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe
1085 1090 1095
Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly
1100 1105 1110
Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp
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Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys
1130 1135 1140
Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile
1145 1150 1155
Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1160 1165 1170
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp
1175 1180 1185
Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp
1190 1195 1200
Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met
1205 1210 1215
Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu
1220 1225 1230
Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp
1235 1240 1245
Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1250 1255 1260
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 15
Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly
1 5 10 15
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 16
Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 17
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 18
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
1 5 10 15
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 19
Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 20
Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
1 5 10 15
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 21
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Pro Arg Thr Phe
20
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 22
Pro Arg Arg Ala Arg Ser
1 5
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 23
Pro Gly Ser Ala Gly Ser
1 5
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 24
Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 11342
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 25
cgcgttggga gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg 60
aatagctcag aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 120
tggggcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc 180
gggactatgg ttgctgacta attgagatgc ccgacattga ttattgacta gttggaaggg 240
ctaattcact cccaacgaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc 300
tacttccctg attagcagaa ctacacacca gggccaggga tcagatatcc actgaccttt 360
ggatggtgct acaagctagt accagttgag ccagagaagt tagaagaagc caacaaagga 420
gagaacacca gcttgttaca acctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa 480
gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acggtggccc gagagctgca 540
tccggagtac ttcaagaact gctgatatcg agcttgctac aagggacttt ccgctggggg 600
actttccagg gaggcgtggc ctgggcggga ctggggagtg gcgagccctc agatcctgca 660
tataagcagc tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg 720
gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg 780
cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc 840
ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag 900
ggaaaccaga ggagctctct cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag 960
gcgaggggcg gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga 1020
gagatgggtg cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa 1080
ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca 1140
gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac 1200
aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat 1260
ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg 1320
aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg 1380
ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat 1440
aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga 1500
gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga 1560
gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta 1620
ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat 1680
ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa 1740
agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc 1800
accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat 1860
cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc 1920
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aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta 2040
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tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccgaa ttcacaaatg gcagtattca 2280
tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag 2340
acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa 2400
attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccactttg gctgatacgc gtatccagtg 2460
ggggaatata aaggtgaaag caggagagac ccctctgact ggaacctctt acctcccaga 2520
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caggctcagg ctctttatct gtgctctgcc tcccacctgg caggtccact ggccaggctt 2760
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gcgattctcc tgcctcagcc tcctgagtag ctgggattac aggcacacac tgtgctggtt 3420
aatttttgta tttttagtag agaaggggtg tcaccatgtt ggtcaggctg gtctcaaatt 3480
tttttttttt tttttttttt tttttgagac agagtcttgc tctgttgtct aggctggagt 3540
gcagtggcat cgaactcttg acctcaagtg atccacccgc ctcggcctcc caaagtgctt 3600
ggattacagg catgagccac tgtgcccggc gatgtgggac acattatcat ctctgtgaga 3660
gatttttggt ctcttttgtc accgcccttc tctcccagct cctagaactg ggcctggctc 3720
acagtaggtg ctgaatgcat actggttgaa ttgtaaatgc tcaggatttg tttaattaag 3780
gatgcaggaa aggtgatata ccggtgtgca gaagtcagga tgcattccct gtccaaatca 3840
cagtgttcca ctgaggcaag gcccttggga gtgaggtcgg gagaggggag ggtggtggag 3900
ggggctcaga gactgggttt gttttgggga gtctgcacct atttgctgag tgaatgtatg 3960
tgtgtgtgca tttgagagca cacctctgta tgattcgggt gtgagtgtgt gtgaggaaac 4020
gtgggcaggc gaggagtgtt tgggagccag gtgcagctgg ggtgtgagtg tgtaagcaag 4080
cagctatgag gctgggcatt gcttctcctc ctcttctcca gctcccagcc tttcttcccc 4140
gggactcctg gggctccagg atgcccccaa gatcccctcc acaagtggat aatttgggct 4200
gcaggttaag gacagctaga gggactcaca ggccattcca cccgcacacc accagacccc 4260
caaatttctt ttttcttttt tttttgagac agagtctcac tctgtcgcca ggctgcagtg 4320
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gtcatttcct gccctgaaag cagcctcgag ggccaacaac acctgctgtc cgtgtccatg 4680
cccggttggc caccccgttt ctggggggtg agcggggctt ggcagggctg cgcggagggc 4740
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acctgtggct ccggcttccg aagcggctcc ggggcggggg cggggcctca ctctgcgata 4860
taactcgggt cgcgcggctc gcgcaggccg ccaccgtcgt ccgcaaagcc tgagtcctgt 4920
cctttctctc tccccggaca gcaatcgata gggctcaggt aagtggtagg agggacctca 4980
actcccagcc ttgtctgacc ctccaattat acactccttt gcctctttcc gtcattccat 5040
aaccacccca acccctactc caccgggagg gggttgggca tacctggatt tccatccgcg 5100
cacctagcca cagggtccct aagagcagca gcagctaggc atgggagggc tctttcccag 5160
gagagagggg gaaggggaca gggttgagag ctttacagag gaagtggaca gcatggaggg 5220
aggtaaggaa aggcctgtaa agaggaggag acactggctc tggcggaatg gggactattg 5280
gagggttaag cggatgtggc taaggctgag tcatctagga gtaaacaaga ggccttcctt 5340
tgggaggagc caatccaggg tgtagggggc ccagagtgac caggtgcact agggaaaaaa 5400
tgccaggaga gggccaggaa gaggacttgt tagtagcgac tcacttctgg gcaggcaggc 5460
cagccagcta gccagcctgc tgaggcttcc caagaggggc agagtgctgg gatctgggaa 5520
tccaggaaag gagggaatgg ggtggggcta gatgaaaagg gataggtgtc cagggagagc 5580
ctctggctat tcctgggacc aggaagtttt cactaggata cataacactt tttacacact 5640
caccccaccc atccctggct ttctattcat ggaacaacct ctctcctttt tccttccagg 5700
tggatccgcc accatgtcaa gctcttcctg gctccttctc agccttgttg ctgtaactgc 5760
tgctcagtcc accattgagg aacaggccaa gacatttttg gacaagttta accacgaagc 5820
cgaagacctg ttctatcaaa gttcacttgc ttcttggaat tataacacca atattactga 5880
agagaatgtc caaaacatga ataatgctgg ggacaaatgg tctgcctttt taaaggaaca 5940
gtccacactt gcccaaatgt atccactaca agaaattcag aatctcacag tcaagcttca 6000
gctgcaggct cttcagcaaa atgggtcttc agtgctctca gaagacaaga gcaaacggtt 6060
gaacacaatt ctaaatacaa tgagcaccat ctacagtact ggaaaagttt gtaacccaga 6120
taatccacaa gaatgcttat tacttgaacc aggtttgaat gaaataatgg caaacagttt 6180
agactacaat gagaggctct gggcttggga aagctggaga tctgaggtcg gcaagcagct 6240
gaggccatta tatgaagagt atgtggtctt gaaaaatgag atggcaagag caaatcatta 6300
tgaggactat ggggattatt ggagaggaga ctatgaagta aatggggtag atggctatga 6360
ctacagccgc ggccagttga ttgaagatgt ggaacatacc tttgaagaga ttaaaccatt 6420
atatgaacat cttcatgcct atgtgagggc aaagttgatg aatgcctatc cttcctatat 6480
cagtccaatt ggatgcctcc ctgctcattt gcttggtgat atgtggggta gattttggac 6540
aaatctgtac tctttgacag ttccctttgg acagaaacca aacatagatg ttactgatgc 6600
aatggtggac caggcctggg atgcacagag aatattcaag gaggccgaga agttctttgt 6660
atctgttggt cttcctaata tgactcaagg attctgggaa aattccatgc taacggaccc 6720
aggaaatgtt cagaaagcag tctgccatcc cacagcttgg gacctgggga agggcgactt 6780
caggatcctt atgtgcacaa aggtgacaat ggacgacttc ctgacagctc atcatgagat 6840
ggggcatatc cagtatgata tggcatatgc tgcacaacct tttctgctaa gaaatggagc 6900
taatgaagga ttccatgaag ctgttgggga aatcatgtca ctttctgcag ccacacctaa 6960
gcatttaaaa tccattggtc ttctgtcacc cgattttcaa gaagacaatg aaacagaaat 7020
aaacttcctg ctcaaacaag cactcacgat tgttgggact ctgccattta cttacatgtt 7080
agagaagtgg aggtggatgg tctttaaagg ggaaattccc aaagaccagt ggatgaaaaa 7140
gtggtgggag atgaagcgag agatagttgg ggtggtggaa cctgtgcccc atgatgaaac 7200
atactgtgac cccgcatctc tgttccatgt ttctaatgat tactcattca ttcgatatta 7260
cacaaggacc ctttaccaat tccagtttca agaagcactt tgtcaagcag ctaaacatga 7320
aggccctctg cacaaatgtg acatctcaaa ctctacagaa gctggacaga aactgttcaa 7380
tatgctgagg cttggaaaat cagaaccctg gaccctagca ttggaaaatg ttgtaggagc 7440
aaagaacatg aatgtaaggc cactgctcaa ctactttgag cccttattta cctggctgaa 7500
agaccagaac aagaattctt ttgtgggatg gagtaccgac tggagtccat atgcagacca 7560
aagcatcaaa gtgaggataa gcctaaaatc agctcttgga gataaagcat atgaatggaa 7620
cgacaatgaa atgtacctgt tccgatcatc tgttgcatat gctatgaggc agtacttttt 7680
aaaagtaaaa aatcagatga ttctttttgg ggaggaggat gtgcgagtgg ctaatttgaa 7740
accaagaatc tcctttaatt tctttgtcac tgcacctaaa aatgtgtctg atatcattcc 7800
tagaactgaa gttgaaaagg ccatcaggat gtcccggagc cgtatcaatg atgctttccg 7860
tctgaatgac aacagcctag agtttctggg gatacagcca acacttggac ctcctaacca 7920
gccccctgtt tccatatggc tgattgtttt tggagttgtg atgggagtga tagtggttgg 7980
cattgtcatc ctgatcttca ctgggatcag agatcggaag aagaaaaata aagcaagaag 8040
tggagaaaat ccttatgcct ccatcgatat tagcaaagga gaaaataatc caggattcca 8100
aaacactgat gatgttcaga cctcctttta actcgagctc aagcttcgaa ttcccgataa 8160
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 8220
ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 8280
ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 8340
gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 8400
ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 8460
tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 8520
gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat ggctgctcgc 8580
ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 8640
tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 8700
ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gggaattctg 8760
cagtcgacgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt 8820
ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca agatcgtcga 8880
gagatgctgc atataagcag ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga 8940
tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct 9000
tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat 9060
ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag ttctagaggg cccgtttaaa 9120
cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 9180
ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 9240
aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 9300
acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 9360
tggcttctac tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc 9420
ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat 9480
ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat 9540
tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 9600
tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 9660
ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga 9720
cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 9780
cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 9840
cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 9900
gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 9960
gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 10020
tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga 10080
ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 10140
cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 10200
gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 10260
gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 10320
gttcttctga attattaacg cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 10380
gtgcggtatt tcacaccgca tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 10440
atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 10500
taaatgcttc aataatagca cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 10560
aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 10620
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 10680
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 10740
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 10800
gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 10860
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 10920
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 10980
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 11040
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 11100
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 11160
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 11220
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc 11280
ttttgctggc cttttgctca catgttcttg actcttcgcg atgtacgggc cagatatacg 11340
cg 11342
<210> 26
<211> 3249
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 26
atccagtggg ggaatataaa ggtgaaagca ggagagaccc ctctgactgg aacctcttac 60
ctcccagaag ccttgtatgc aaaaccagtg ggcattcatt tgtatgttat tttgcatccc 120
gtttgcctcc cagccttcag caggccccga ccctcccctg gccagcttcc accctgactg 180
ccccctggct ggctcccatt gagcactgtg ggctctcccc accattaggt gacagatcag 240
gaacaatcca ggctcaggct ctttatctgt gctctgcctc ccacctggca ggtccactgg 300
ccaggctttt ccagggtccc ttctctccca ggtctgccct actatttgtc ctccccttcc 360
ccctcagctg gtagctcgat aagaatcaat aggtccactc cagagcaaag aacacagcca 420
aatgtgtcat accaggccct gccagaaaaa cgagctgctg gagctgacaa acttgaaggc 480
caaacaccta aggttccccc caacacttca ttcagcaggg atggtcattc agcttcaggg 540
ggcaggcagc atgaaagcct ccctacctcc atccttctca cacagaggct ggggagagca 600
tcttggagga tgcagtcccc tggggccagg cttctaatcc agacagccct tacaaggggg 660
gacaggggaa ggactggctt ggagaaaagt cctagaaaag aggggagggg cactggccac 720
cagggctggg tcgctgctat gatggtccta ggagtgcctg cctgtcctct caggccccat 780
gcgatgtagg acacattact tttatttatt tatttattta ttttgagtca gagtttcgct 840
ctggttgccc aggctggagc gcgacggcac gatcttggct cactgcaacc tctgcctcct 900
gggttcaagc gattctcctg cctcagcctc ctgagtagct gggattacag gcacacactg 960
tgctggttaa tttttgtatt tttagtagag aaggggtgtc accatgttgg tcaggctggt 1020
ctcaaatttt tttttttttt tttttttttt tttgagacag agtcttgctc tgttgtctag 1080
gctggagtgc agtggcatcg aactcttgac ctcaagtgat ccacccgcct cggcctccca 1140
aagtgcttgg attacaggca tgagccactg tgcccggcga tgtgggacac attatcatct 1200
ctgtgagaga tttttggtct cttttgtcac cgcccttctc tcccagctcc tagaactggg 1260
cctggctcac agtaggtgct gaatgcatac tggttgaatt gtaaatgctc aggatttgtt 1320
taattaagga tgcaggaaag gtgatatacc ggtgtgcaga agtcaggatg cattccctgt 1380
ccaaatcaca gtgttccact gaggcaaggc ccttgggagt gaggtcggga gaggggaggg 1440
tggtggaggg ggctcagaga ctgggtttgt tttggggagt ctgcacctat ttgctgagtg 1500
aatgtatgtg tgtgtgcatt tgagagcaca cctctgtatg attcgggtgt gagtgtgtgt 1560
gaggaaacgt gggcaggcga ggagtgtttg ggagccaggt gcagctgggg tgtgagtgtg 1620
taagcaagca gctatgaggc tgggcattgc ttctcctcct cttctccagc tcccagcctt 1680
tcttccccgg gactcctggg gctccaggat gcccccaaga tcccctccac aagtggataa 1740
tttgggctgc aggttaagga cagctagagg gactcacagg ccattccacc cgcacaccac 1800
cagaccccca aatttctttt ttcttttttt tttgagacag agtctcactc tgtcgccagg 1860
ctgcagtggc gcgatctcgg ctcactgcaa cctccgcctc ccaggttcaa gcgattcccc 1920
ttcctcagcc tcccaagtag ctgagactac aggcgtgcac catcacgtcc ggctaatttt 1980
ttgtatttta gtagagaggg gtttcaccat gttggctagg atggtctcga tctcctgacc 2040
tcgtgatccg cccacctagg cctcccaaag tgctgagatt acaggcgtga gccactgcgc 2100
ccggtcaaga ctcccaaatt tcaaactcgc cagcacctcc tccacctggg ggagaagagc 2160
ataataacgt catttcctgc cctgaaagca gcctcgaggg ccaacaacac ctgctgtccg 2220
tgtccatgcc cggttggcca ccccgtttct ggggggtgag cggggcttgg cagggctgcg 2280
cggagggcgc gggggtgggg cccggggcgg agcggcccgg ggcggagggc gcgggctccg 2340
agccgtccac ctgtggctcc ggcttccgaa gcggctccgg ggcgggggcg gggcctcact 2400
ctgcgatata actcgggtcg cgcggctcgc gcaggccgcc accgtcgtcc gcaaagcctg 2460
agtcctgtcc tttctctctc cccggacagc aatcgatagg gctcaggtaa gtggtaggag 2520
ggacctcaac tcccagcctt gtctgaccct ccaattatac actcctttgc ctctttccgt 2580
cattccataa ccaccccaac ccctactcca ccgggagggg gttgggcata cctggatttc 2640
catccgcgca cctagccaca gggtccctaa gagcagcagc agctaggcat gggagggctc 2700
tttcccagga gagaggggga aggggacagg gttgagagct ttacagagga agtggacagc 2760
atggagggag gtaaggaaag gcctgtaaag aggaggagac actggctctg gcggaatggg 2820
gactattgga gggttaagcg gatgtggcta aggctgagtc atctaggagt aaacaagagg 2880
ccttcctttg ggaggagcca atccagggtg tagggggccc agagtgacca ggtgcactag 2940
ggaaaaaatg ccaggagagg gccaggaaga ggacttgtta gtagcgactc acttctgggc 3000
aggcaggcca gccagctagc cagcctgctg aggcttccca agaggggcag agtgctggga 3060
tctgggaatc caggaaagga gggaatgggg tggggctaga tgaaaaggga taggtgtcca 3120
gggagagcct ctggctattc ctgggaccag gaagttttca ctaggataca taacactttt 3180
tacacactca ccccacccat ccctggcttt ctattcatgg aacaacctct ctcctttttc 3240
cttccaggt 3249
<210> 27
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 27
aagtggtag 9
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 28
ctttttcctt ccaggt 16
<210> 29
<211> 2418
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60
attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120
tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180
aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240
caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300
cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360
aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420
tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480
aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540
gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600
gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660
cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720
catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780
tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840
ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900
gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960
cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020
aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080
tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140
tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200
catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260
attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320
aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380
tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440
aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500
gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560
taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620
aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680
ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740
gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800
aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860
aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg aatggaacga caatgaaatg 1920
tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980
cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc aagaatctcc 2040
tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100
gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct gaatgacaac 2160
agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220
atatggctga ttgtttttgg agttgtgatg ggagtgatag tggttggcat tgtcatcctg 2280
atcttcactg ggatcagaga tcggaagaag aaaaataaag caagaagtgg agaaaatcct 2340
tatgcctcca tcgatattag caaaggagaa aataatccag gattccaaaa cactgatgat 2400
gttcagacct ccttttaa 2418
<210> 30
<211> 859
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
Met Lys Arg Asp Arg Cys Pro Gly Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Trp Asp
1 5 10 15
Gln Glu Val Phe Thr Arg Ile His Asn Thr Phe Tyr Thr Leu Thr Pro
20 25 30
Pro Ile Pro Gly Phe Leu Phe Met Glu Gln Pro Leu Ser Phe Phe Leu
35 40 45
Pro Gly Gly Ser Ala Thr Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser
50 55 60
Leu Val Ala Val Thr Ala Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys
65 70 75 80
Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln
85 90 95
Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn
100 105 110
Val Gln Asn Met Asn Asn Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys
115 120 125
Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn
130 135 140
Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser
145 150 155 160
Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr
165 170 175
Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro
180 185 190
Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn
195 200 205
Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser
210 215 220
Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu
225 230 235 240
Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr
245 250 255
Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser
260 265 270
Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys
275 280 285
Pro Leu Tyr Glu His Leu His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn
290 295 300
Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu
305 310 315 320
Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr
325 330 335
Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val
340 345 350
Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe
355 360 365
Phe Val Ser Val Gly Leu Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn
370 375 380
Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro
385 390 395 400
Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr
405 410 415
Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His
420 425 430
Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn
435 440 445
Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu
450 455 460
Ser Ala Ala Thr Pro Lys His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro
465 470 475 480
Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln
485 490 495
Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys
500 505 510
Trp Arg Trp Met Val Phe Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met
515 520 525
Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro
530 535 540
Val Pro His Asp Glu Thr Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val
545 550 555 560
Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln
565 570 575
Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro
580 585 590
Leu His Lys Cys Asp Ile Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu
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Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu
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Glu Asn Val Val Gly Ala Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn
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Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser
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Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile
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Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu
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Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala
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Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly
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Glu Glu Asp Val Arg Val Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn
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Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr
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Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala
755 760 765
Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr
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Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe
785 790 795 800
Gly Val Val Met Gly Val Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe
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<212> DNA
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<221> 源（source）
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aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt 300
ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 360
ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc 420
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<211> 20
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
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20
<210> 33
<211> 263
<212> PRT
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<221> 源（source）
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1 5 10 15
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20 25 30
Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe Val
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Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala Ala
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Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val Leu
65 70 75 80
Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu Val
85 90 95
Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys Val
100 105 110
Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro Ala
115 120 125
Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala Arg
130 135 140
Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu Glu
145 150 155 160
His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala Ser
165 170 175
Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys Leu
180 185 190
Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp Cys
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Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala Thr
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Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe Leu
225 230 235 240
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260
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<211> 605
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多核苷酸"
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aattcccgat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 60
ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 120
tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta 180
tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc 240
aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt 300
ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 360
ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc 420
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ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 540
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca 600
tcggg 605
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<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
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Arg Arg Ala Arg
1
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<221> 源（source）
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tggaggagga gatatgaggg 20
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<212> DNA
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<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成启动子"
<400> 101
ctgctgcact ataccagaca 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成启动子"
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tctcctctga cttcaacagc 20
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<212> DNA
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His His His His His His His His
1 5
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tttttttttt tttttttt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
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ggcgttggga gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg 60
aatagctcag aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 120
tggggcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc 180
gggactatgg ttgctgacta attgagatgc ccgacattga ttattgacta gttggaaggg 240
ctaattcact cccaaagaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc 300
tacttccctg attagcagaa ctacacacca gggccagggg tcagatatcc actgaccttt 360
ggatggtgct acaagctagt accagttgag ccagataagg tagaagaggc caataaagga 420
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ccggagtact tcaagaactg ctgatatcga gcttgctaca agggactttc cgctggggac 600
tttccaggga ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag atcctgcata 660
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tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt 840
ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg 900
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gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga 1020
gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt 1080
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gagctagaac gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa 1200
atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag aagaacttag atcattatat 1260
aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag agataaaaga caccaaggaa 1320
gctttagaca agatagagga agagcaaaac aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc 1380
gctgatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa 1440
atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt 1500
ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc 1560
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atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac 1800
cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct ctggaacaga tttggaatca 1860
cacgacctgg atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt 1920
aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa 1980
atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt 2040
cataatgata gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt 2100
gaatagagtt aggcagggat attcaccatt atcgtttcag acccacctcc caaccccgag 2160
gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc 2220
cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta tcgccgaatt cacaaatggc agtattcatc 2280
cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac 2340
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cgtgacctgg ttccacgcca tctccggcac caatggcacc aagcgcttcg ataatcccgt 3300
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caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc attcctgatg gacctggaag gcaagcaggg 3600
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cagcaagcac accccaatca acctcgtgcg cgatctgcca cagggattca gtgctctgga 3720
acccctggtg gatctgccca tcggcatcaa cattacccgc tttcagacac tgctggccct 3780
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gtccttcacc gtcgagaagg gcatctacca gaccagcaat ttccgcgtgc agcccaccga 4020
gagcatcgtg cgcttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc 4080
cacacgcttt gcctccgtgt acgcctggaa tcgcaagcgc attagcaact gcgtggccga 4140
ctactccgtg ctgtacaata gcgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcacc 4200
caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa tgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgcgg 4260
agatgaagtg cgacagattg ccccaggcca gaccggcaag atcgccgact acaattacaa 4320
gctgcccgac gacttcaccg gctgcgtgat cgcctggaac agcaacaacc tggattccaa 4380
agtcggcggc aactacaact acctgtaccg cctgttccgc aagagcaatc tgaagccctt 4440
cgagcgcgac atcagcaccg aaatctacca ggccggaagc accccatgca acggcgtgga 4500
aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggattt cagcccacat atggcgtggg 4560
ctaccagcca tatcgagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgctc cagctaccgt 4620
gtgcggcccc aagaagagta ccaacctggt caagaacaaa tgcgtgaact tcaacttcaa 4680
cggcctgacc ggaaccggcg tgctgaccga gagtaacaag aagttcctgc cattccagca 4740
gtttggccgc gacattgacg atacaaccga tgccgttcgc gatccccaga ccttggagat 4800
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tcacgccgat caattgacac caacatggcg cgtgtactcc accggcagca atgtgtttca 4980
aacccgcgct ggatgcctga ttggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgatat 5040
ccccatcgga gccggaatct gcgcctccta tcagacccag accaatagtc accgacgagc 5100
ccgaagtgtg gccagccaga gcatcattgc ctataccatg agcctgggcg ccgagaatag 5160
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cgagatcctg ccagtgtcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg 5280
agatagcacc gagtgcagca acctgctgct gcagtacgga agtttctgca cccagctgaa 5340
tcgcgccctg acaggcattg ccgtggaaca ggataagaac acccaagagg tgttcgccca 5400
agtgaagcaa atctacaaga ccccaccaat caaggatttc ggcggcttca atttcagcca 5460
gattctgccc gatccaagca agcccagcaa gcgcagcttc atcgaggacc tgctgttcaa 5520
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ggccgccacc aagatgagcg aatgtgtgct gggacagagc aagcgcgtgg acttttgcgg 6180
caagggatac cacctgatga gcttcccaca gagtgctcca cacggcgtgg tgtttctgca 6240
tgtgacctac gtgcccgctc aagagaagaa tttcaccacc gctccagcca tctgccacga 6300
cggaaaggcc cattttccac gcgagggcgt gttcgttagc aacggcactc attggttcgt 6360
cacccagcgc aacttctacg agccccagat catcaccacc cacaacacct tcgtcagcgg 6420
caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caacaccgtg tacgatccac tgcagcccga 6480
gctggacagc ttcaaagagg aactggacaa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt 6540
ggacctggga gacattagcg gaatcaacgc cagcgtggtc aacatccaga aagagattga 6600
ccgcctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg 6660
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gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc 7320
ctttccgcgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta 7380
cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg 7440
gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc 7500
cccgcggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta 7560
aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaagacaaaa tcgtcgagag 7620
atgctgcata taagcagctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 7680
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cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 7800
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gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg 7920
tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 7980
ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 8040
gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg 8100
cttctactgg gcggttttat ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc 8160
tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg 8220
atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga 8280
acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga 8340
ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg 8400
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tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 9660
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gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 10020
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<210> 107
<211> 3813
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多核苷酸"
<400> 107
atgttcgtgt ttctggtgct gctgccactg gtgtccagtc agtgcgtgaa cctgaccaca 60
cgaacacagc tgccaccagc ctacaccaat agcttcaccc gcggagtgta ctaccccgac 120
aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcatagc acccaggatc tgtttctgcc cttcttcagc 180
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gtgctgccct tcaacgatgg cgtgtacttt gccagcaccg agaagtccaa tatcatccgc 300
ggctggatct tcggcaccac actggatagc aagacccaga gcctgctgat cgtgaacaac 360
gccaccaacg tggtcatcaa agtgtgcgag ttccagttct gcaacgaccc cttcctgggc 420
gtctaccaca agaacaacaa gagctggatg gaaagcgagt tccgcgtgta cagcagcgcc 480
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ggcaacttca agaacctgcg cgagttcgtg ttcaagaaca tcgacggcta cttcaaaatc 600
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gagagcatcg tgcgcttccc caatatcacc aatctgtgcc ccttcggcga ggtgttcaat 1020
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gactactccg tgctgtacaa tagcgccagc ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtgtca 1140
cccaccaagc tgaacgacct gtgcttcacc aatgtgtacg ccgacagctt cgtgatccgc 1200
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cagtttggcc gcgacattga cgatacaacc gatgccgttc gcgatcccca gaccttggag 1740
atcctggata ttaccccatg ctccttcggc ggcgtgtccg tgattacacc aggcaccaat 1800
accagcaacc aggtggccgt tctgtaccag ggcgtgaatt gcacagaggt gcccgtggcc 1860
attcacgccg atcaattgac accaacatgg cgcgtgtact ccaccggcag caatgtgttt 1920
caaacccgcg ctggatgcct gattggagcc gagcacgtga acaatagcta cgagtgcgat 1980
atccccatcg gagccggaat ctgcgcctcc tatcagaccc agaccaatag tcaccgacga 2040
gcccgaagtg tggccagcca gagcatcatt gcctatacca tgagcctggg cgccgagaat 2100
agcgtggcct actccaacaa cagcattgct atccccatca acttcaccat cagcgtgacc 2160
accgagatcc tgccagtgtc catgaccaag accagcgtgg actgcaccat gtacatctgc 2220
ggagatagca ccgagtgcag caacctgctg ctgcagtacg gaagtttctg cacccagctg 2280
aatcgcgccc tgacaggcat tgccgtggaa caggataaga acacccaaga ggtgttcgcc 2340
caagtgaagc aaatctacaa gaccccacca atcaaggatt tcggcggctt caatttcagc 2400
cagattctgc ccgatccaag caagcccagc aagcgcagct tcatcgagga cctgctgttc 2460
aacaaagtga cactggccga cgccggattc atcaagcagt atggcgattg cctgggcgat 2520
attgccgcac gcgatctgat ttgcgcccag aagtttaacg gactgaccgt cctgccacca 2580
ctgctgacag atgagatgat cgcccagtac acaagtgccc tgctggccgg aaccattacc 2640
agcggatgga catttggagc cggtgccgct ctgcagattc ccttcgctat gcagatggcc 2700
taccgcttca atggcattgg cgtgacccag aatgtgctgt acgagaacca gaagctgatc 2760
gccaaccagt tcaacagcgc catcggcaag attcaggaca gcctgagtag taccgccagc 2820
gctctgggaa agctgcagga tgtggtcaac cagaacgctc aggccctgaa caccctggtt 2880
aagcagctga gcagcaactt cggcgccatc agtagcgtgc tgaacgatat cctggcccgc 2940
ctggataagg tggaagccga ggtgcagatc gatcgcctga ttaccggacg cctgcagtcc 3000
ctgcagacct atgtgacaca gcagctgatc cgagccgccg agattcgagc tagtgctaat 3060
ctggccgcca ccaagatgag cgaatgtgtg ctgggacaga gcaagcgcgt ggacttttgc 3120
ggcaagggat accacctgat gagcttccca cagagtgctc cacacggcgt ggtgtttctg 3180
catgtgacct acgtgcccgc tcaagagaag aatttcacca ccgctccagc catctgccac 3240
gacggaaagg cccattttcc acgcgagggc gtgttcgtta gcaacggcac tcattggttc 3300
gtcacccagc gcaacttcta cgagccccag atcatcacca cccacaacac cttcgtcagc 3360
ggcaactgcg acgtcgtgat cggcattgtg aacaacaccg tgtacgatcc actgcagccc 3420
gagctggaca gcttcaaaga ggaactggac aagtacttta agaaccacac aagccccgac 3480
gtggacctgg gagacattag cggaatcaac gccagcgtgg tcaacatcca gaaagagatt 3540
gaccgcctga acgaggtggc caagaatctg aacgagagcc tgatcgacct gcaagaactg 3600
ggcaaatacg agcagtacat taagtggccc tggtacatct ggctgggctt cattgccgga 3660
ctgattgcca tcgtgatggt caccattatg ctgtgctgca tgaccagttg ctgcagctgc 3720
ctgaagggat gctgcagttg cggaagctgc tgcaagttcg acgaggatga tagcgagcca 3780
gtgctgaagg gcgtcaagct gcactacacc tga 3813
<210> 108
<211> 1270
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 108
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro
65 70 75 80
Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser
85 90 95
Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val
115 120 125
Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr His Lys
130 135 140
Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu
165 170 175
Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys
180 185 190
Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn
195 200 205
Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val
210 215 220
Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala
225 230 235 240
Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr
245 250 255
Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
260 265 270
Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys
275 280 285
Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr
290 295 300
Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr
305 310 315 320
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
325 330 335
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
340 345 350
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
355 360 365
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
370 375 380
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
385 390 395 400
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala
405 410 415
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
420 425 430
Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
435 440 445
Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp
450 455 460
Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
465 470 475 480
Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro
485 490 495
Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe
500 505 510
Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr
515 520 525
Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr
530 535 540
Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln
545 550 555 560
Gln Phe Gly Arg Asp Ile Asp Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro
565 570 575
Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val
580 585 590
Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu
595 600 605
Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp
610 615 620
Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe
625 630 635 640
Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser
645 650 655
Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln
660 665 670
Thr Gln Thr Asn Ser His Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser
675 680 685
Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr
690 695 700
Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Ile Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr
705 710 715 720
Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr
725 730 735
Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln
740 745 750
Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala
755 760 765
Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln
770 775 780
Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser
785 790 795 800
Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu
805 810 815
Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys
820 825 830
Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys
835 840 845
Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp
850 855 860
Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr
865 870 875 880
Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala
885 890 895
Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val
900 905 910
Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile
915 920 925
Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys
930 935 940
Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val
945 950 955 960
Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp
965 970 975
Ile Leu Ala Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg
980 985 990
Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln
995 1000 1005
Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
1010 1015 1020
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp
1025 1030 1035
Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1040 1045 1050
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln
1055 1060 1065
Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys
1070 1075 1080
Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
1085 1090 1095
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr
1100 1105 1110
Thr His Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly
1115 1120 1125
Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp
1130 1135 1140
Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser
1145 1150 1155
Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val
1160 1165 1170
Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys
1175 1180 1185
Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr
1190 1195 1200
Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile
1205 1210 1215
Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys
1220 1225 1230
Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly
1235 1240 1245
Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys
1250 1255 1260
Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 109
<211> 10077
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多核苷酸"
<400> 109
ggcgttggga gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg 60
aatagctcag aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 120
tggggcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc 180
gggactatgg ttgctgacta attgagatgc ccgacattga ttattgacta gttggaaggg 240
ctaattcact cccaaagaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc 300
tacttccctg attagcagaa ctacacacca gggccagggg tcagatatcc actgaccttt 360
ggatggtgct acaagctagt accagttgag ccagataagg tagaagaggc caataaagga 420
gagaacacca gcttgttaca ccctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa 480
gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acgtggcccg agagctgcat 540
ccggagtact tcaagaactg ctgatatcga gcttgctaca agggactttc cgctggggac 600
tttccaggga ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag atcctgcata 660
taagcagctg ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga 720
gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct 780
tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt 840
ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg 900
aaaccagagg agctctctcg acgcaggact cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc 960
gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga 1020
gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt 1080
cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg 1140
gagctagaac gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa 1200
atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag aagaacttag atcattatat 1260
aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag agataaaaga caccaaggaa 1320
gctttagaca agatagagga agagcaaaac aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc 1380
gctgatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa 1440
atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt 1500
ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc 1560
agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt 1620
gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc aacagcatct 1680
gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag 1740
atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac 1800
cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct ctggaacaga tttggaatca 1860
cacgacctgg atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt 1920
aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa 1980
atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt 2040
cataatgata gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt 2100
gaatagagtt aggcagggat attcaccatt atcgtttcag acccacctcc caaccccgag 2160
gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc 2220
cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta tcgccgaatt cacaaatggc agtattcatc 2280
cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac 2340
ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat 2400
tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccactttggc tgatacgcgt ggagttccgc 2460
gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 2520
acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 2580
tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 2640
agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 2700
atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 2760
atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 2820
tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 2880
gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 2940
cggtgggagg tctatataag cagagcttcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 3000
tccatagaag acaccgcgat cggatccaca agtttgtaca aaaaagcagg ctgccaccat 3060
gttcgtgttt ctggtgctgc tgccactggt gtccagtcag tgcgtgaact tcaccacacg 3120
aacacagctg ccaccagcct acaccaatag cttcacccgc ggagtgtact accccgacaa 3180
ggtgttccgc agcagcgtgc tgcatagcac ccaggatctg tttctgccct tcttcagcaa 3240
cgtgacctgg ttccacgcca tccacgtgtc cggcaccaat ggcaccaagc gcttcgctaa 3300
tcccgtgctg cccttcaacg atggcgtgta ctttgccagc accgagaagt ccaatatcat 3360
ccgcggctgg atcttcggca ccacactgga tagcaagacc cagagcctgc tgatcgtgaa 3420
caacgccacc aacgtggtca tcaaagtgtg cgagttccag ttctgcaacg accccttcct 3480
gggcgtctac taccacaaga acaacaagag ctggatggaa agcgagttcc gcgtgtacag 3540
cagcgccaac aactgcacct tcgagtacgt gtcccagcca ttcctgatgg acctggaagg 3600
caagcagggc aacttcaaga acctgcgcga gttcgtgttc aagaacatcg acggctactt 3660
caaaatctac agcaagcaca ccccaatcaa cctcgtgcgc ggcctgccac agggattcag 3720
tgctctggaa cccctggtgg atctgcccat cggcatcaac attacccgct ttcagacact 3780
gcaccgcagt tacttgacac caggcgatag cagcagtgga tggacagctg gtgccgccgc 3840
ttactacgtt ggatatctgc agccacgcac ctttctgctg aagtacaacg agaacggcac 3900
catcaccgac gccgtggatt gtgctctcga tcccctgagc gagacaaagt gcaccctgaa 3960
gtccttcacc gtcgagaagg gcatctacca gaccagcaat ttccgcgtgc agcccaccga 4020
gagcatcgtg cgcttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc 4080
cacacgcttt gcctccgtgt acgcctggaa tcgcaagcgc attagcaact gcgtggccga 4140
ctactccgtg ctgtacaata gcgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcacc 4200
caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa tgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgcgg 4260
agatgaagtg cgacagattg ccccaggcca gaccggcaac atcgccgact acaattacaa 4320
gctgcccgac gacttcaccg gctgcgtgat cgcctggaac agcaacaacc tggattccaa 4380
agtcggcggc aactacaact acctgtaccg cctgttccgc aagagcaatc tgaagccctt 4440
cgagcgcgac atcagcaccg aaatctacca ggccggaagc accccatgca acggcgtgaa 4500
aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggattt cagcccacat atggcgtggg 4560
ctaccagcca tatcgagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgctc cagctaccgt 4620
gtgcggcccc aagaagagta ccaacctggt caagaacaaa tgcgtgaact tcaacttcaa 4680
cggcctgacc ggaaccggcg tgctgaccga gagtaacaag aagttcctgc cattccagca 4740
gtttggccgc gacattgccg atacaaccga tgccgttcgc gatccccaga ccttggagat 4800
cctggatatt accccatgct ccttcggcgg cgtgtccgtg attacaccag gcaccaatac 4860
cagcaaccag gtggccgttc tgtaccaggg cgtgaattgc acagaggtgc ccgtggccat 4920
tcacgccgat caattgacac caacatggcg cgtgtactcc accggcagca atgtgtttca 4980
aacccgcgct ggatgcctga ttggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgatat 5040
ccccatcgga gccggaatct gcgcctccta tcagacccag accaatagtc cacgacgagc 5100
ccgaagtgtg gccagccaga gcatcattgc ctataccatg agcctgggcg tggagaatag 5160
cgtggcctac tccaacaaca gcattgctat ccccaccaac ttcaccatca gcgtgaccac 5220
cgagatcctg ccagtgtcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg 5280
agatagcacc gagtgcagca acctgctgct gcagtacgga agtttctgca cccagctgaa 5340
tcgcgccctg acaggcattg ccgtggaaca ggataagaac acccaagagg tgttcgccca 5400
agtgaagcaa atctacaaga ccccaccaat caaggatttc ggcggcttca atttcagcca 5460
gattctgccc gatccaagca agcccagcaa gcgcagcttc atcgaggacc tgctgttcaa 5520
caaagtgaca ctggccgacg ccggattcat caagcagtat ggcgattgcc tgggcgatat 5580
tgccgcacgc gatctgattt gcgcccagaa gtttaacgga ctgaccgtcc tgccaccact 5640
gctgacagat gagatgatcg cccagtacac aagtgccctg ctggccggaa ccattaccag 5700
cggatggaca tttggagccg gtgccgctct gcagattccc ttcgctatgc agatggccta 5760
ccgcttcaat ggcattggcg tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc 5820
caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat tcaggacagc ctgagtagta ccgccagcgc 5880
tctgggaaag ctgcaggatg tggtcaacca gaacgctcag gccctgaaca ccctggttaa 5940
gcagctgagc agcaacttcg gcgccatcag tagcgtgctg aacgatatcc tgagccgcct 6000
ggataaggtg gaagccgagg tgcagatcga tcgcctgatt accggacgcc tgcagtccct 6060
gcagacctat gtgacacagc agctgatccg agccgccgag attcgagcta gtgctaatct 6120
ggccgccacc aagatgagcg aatgtgtgct gggacagagc aagcgcgtgg acttttgcgg 6180
caagggatac cacctgatga gcttcccaca gagtgctcca cacggcgtgg tgtttctgca 6240
tgtgacctac gtgcccgctc aagagaagaa tttcaccacc gctccagcca tctgccacga 6300
cggaaaggcc cattttccac gcgagggcgt gttcgttagc aacggcactc attggttcgt 6360
cacccagcgc aacttctacg agccccagat catcaccacc gacaacacct tcgtcagcgg 6420
caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caacaccgtg tacgatccac tgcagcccga 6480
gctggacagc ttcaaagagg aactggacaa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt 6540
ggacctggga gacattagcg gaatcaacgc cagcgtggtc aacatccaga aagagattga 6600
ccgcctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg 6660
caaatacgag cagtacatta agtggccctg gtacatctgg ctgggcttca ttgccggact 6720
gattgccatc gtgatggtca ccattatgct gtgctgcatg accagttgct gcagctgcct 6780
gaagggatgc tgcagttgcg gaagctgctg caagttcgac gaggatgata gcgagccagt 6840
gctgaagggc gtcaagctgc actacacctg atagtaaacc cagctttctt gtacaaagtg 6900
gtctcgagtt cccgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat 6960
tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca 7020
tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc 7080
tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc 7140
tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt 7200
cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg 7260
gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc 7320
ctttccgcgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta 7380
cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg 7440
gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc 7500
cccgcggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta 7560
aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaagacaaaa tcgtcgagag 7620
atgctgcata taagcagctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 7680
gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc 7740
cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 7800
tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagttc tagagggccc gtttaaaccc 7860
gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg 7920
tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 7980
ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 8040
gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg 8100
cttctactgg gcggttttat ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc 8160
tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg 8220
atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga 8280
acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga 8340
ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg 8400
gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga 8460
ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt 8520
tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct 8580
gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct 8640
gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg 8700
agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca 8760
ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga 8820
tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt 8880
ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt 8940
ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct 9000
ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt 9060
cttctgaatt attaacgctt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 9120
cggtatttca caccgcatca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 9180
gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 9240
tgcttcaata atagcacgtg ctaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 9300
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 9360
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 9420
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 9480
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 9540
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 9600
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 9660
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 9720
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 9780
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 9840
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 9900
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 9960
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 10020
gctggccttt tgctcacatg ttcttgctgc ttcgcgatgt acgggccaga tatacgc 10077
<210> 110
<211> 3813
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽多核苷酸"
<400> 110
atgttcgtgt ttctggtgct gctgccactg gtgtccagtc agtgcgtgaa cttcaccaca 60
cgaacacagc tgccaccagc ctacaccaat agcttcaccc gcggagtgta ctaccccgac 120
aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcatagc acccaggatc tgtttctgcc cttcttcagc 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg tccggcacca atggcaccaa gcgcttcgct 240
aatcccgtgc tgcccttcaa cgatggcgtg tactttgcca gcaccgagaa gtccaatatc 300
atccgcggct ggatcttcgg caccacactg gatagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360
aacaacgcca ccaacgtggt catcaaagtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 420
ctgggcgtct actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt ccgcgtgtac 480
agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc cattcctgat ggacctggaa 540
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600
ttcaaaatct acagcaagca caccccaatc aacctcgtgc gcggcctgcc acagggattc 660
agtgctctgg aacccctggt ggatctgccc atcggcatca acattacccg ctttcagaca 720
ctgcaccgca gttacttgac accaggcgat agcagcagtg gatggacagc tggtgccgcc 780
gcttactacg ttggatatct gcagccacgc acctttctgc tgaagtacaa cgagaacggc 840
accatcaccg acgccgtgga ttgtgctctc gatcccctga gcgagacaaa gtgcaccctg 900
aagtccttca ccgtcgagaa gggcatctac cagaccagca atttccgcgt gcagcccacc 960
gagagcatcg tgcgcttccc caatatcacc aatctgtgcc ccttcggcga ggtgttcaat 1020
gccacacgct ttgcctccgt gtacgcctgg aatcgcaagc gcattagcaa ctgcgtggcc 1080
gactactccg tgctgtacaa tagcgccagc ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtgtca 1140
cccaccaagc tgaacgacct gtgcttcacc aatgtgtacg ccgacagctt cgtgatccgc 1200
ggagatgaag tgcgacagat tgccccaggc cagaccggca acatcgccga ctacaattac 1260
aagctgcccg acgacttcac cggctgcgtg atcgcctgga acagcaacaa cctggattcc 1320
aaagtcggcg gcaactacaa ctacctgtac cgcctgttcc gcaagagcaa tctgaagccc 1380
ttcgagcgcg acatcagcac cgaaatctac caggccggaa gcaccccatg caacggcgtg 1440
aaaggcttca actgctactt cccactgcag tcctacggat ttcagcccac atatggcgtg 1500
ggctaccagc catatcgagt ggtggtgctg agcttcgaac tgctgcatgc tccagctacc 1560
gtgtgcggcc ccaagaagag taccaacctg gtcaagaaca aatgcgtgaa cttcaacttc 1620
aacggcctga ccggaaccgg cgtgctgacc gagagtaaca agaagttcct gccattccag 1680
cagtttggcc gcgacattgc cgatacaacc gatgccgttc gcgatcccca gaccttggag 1740
atcctggata ttaccccatg ctccttcggc ggcgtgtccg tgattacacc aggcaccaat 1800
accagcaacc aggtggccgt tctgtaccag ggcgtgaatt gcacagaggt gcccgtggcc 1860
attcacgccg atcaattgac accaacatgg cgcgtgtact ccaccggcag caatgtgttt 1920
caaacccgcg ctggatgcct gattggagcc gagcacgtga acaatagcta cgagtgcgat 1980
atccccatcg gagccggaat ctgcgcctcc tatcagaccc agaccaatag tccacgacga 2040
gcccgaagtg tggccagcca gagcatcatt gcctatacca tgagcctggg cgtggagaat 2100
agcgtggcct actccaacaa cagcattgct atccccacca acttcaccat cagcgtgacc 2160
accgagatcc tgccagtgtc catgaccaag accagcgtgg actgcaccat gtacatctgc 2220
ggagatagca ccgagtgcag caacctgctg ctgcagtacg gaagtttctg cacccagctg 2280
aatcgcgccc tgacaggcat tgccgtggaa caggataaga acacccaaga ggtgttcgcc 2340
caagtgaagc aaatctacaa gaccccacca atcaaggatt tcggcggctt caatttcagc 2400
cagattctgc ccgatccaag caagcccagc aagcgcagct tcatcgagga cctgctgttc 2460
aacaaagtga cactggccga cgccggattc atcaagcagt atggcgattg cctgggcgat 2520
attgccgcac gcgatctgat ttgcgcccag aagtttaacg gactgaccgt cctgccacca 2580
ctgctgacag atgagatgat cgcccagtac acaagtgccc tgctggccgg aaccattacc 2640
agcggatgga catttggagc cggtgccgct ctgcagattc ccttcgctat gcagatggcc 2700
taccgcttca atggcattgg cgtgacccag aatgtgctgt acgagaacca gaagctgatc 2760
gccaaccagt tcaacagcgc catcggcaag attcaggaca gcctgagtag taccgccagc 2820
gctctgggaa agctgcagga tgtggtcaac cagaacgctc aggccctgaa caccctggtt 2880
aagcagctga gcagcaactt cggcgccatc agtagcgtgc tgaacgatat cctgagccgc 2940
ctggataagg tggaagccga ggtgcagatc gatcgcctga ttaccggacg cctgcagtcc 3000
ctgcagacct atgtgacaca gcagctgatc cgagccgccg agattcgagc tagtgctaat 3060
ctggccgcca ccaagatgag cgaatgtgtg ctgggacaga gcaagcgcgt ggacttttgc 3120
ggcaagggat accacctgat gagcttccca cagagtgctc cacacggcgt ggtgtttctg 3180
catgtgacct acgtgcccgc tcaagagaag aatttcacca ccgctccagc catctgccac 3240
gacggaaagg cccattttcc acgcgagggc gtgttcgtta gcaacggcac tcattggttc 3300
gtcacccagc gcaacttcta cgagccccag atcatcacca ccgacaacac cttcgtcagc 3360
ggcaactgcg acgtcgtgat cggcattgtg aacaacaccg tgtacgatcc actgcagccc 3420
gagctggaca gcttcaaaga ggaactggac aagtacttta agaaccacac aagccccgac 3480
gtggacctgg gagacattag cggaatcaac gccagcgtgg tcaacatcca gaaagagatt 3540
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gtgctgaagg gcgtcaagct gcactacacc tga 3813
<210> 111
<211> 1270
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 111
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Phe Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Ala
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Gly Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr
245 250 255
Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
260 265 270
Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys
275 280 285
Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr
290 295 300
Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr
305 310 315 320
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
325 330 335
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
340 345 350
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
355 360 365
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
370 375 380
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
385 390 395 400
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala
405 410 415
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
420 425 430
Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
435 440 445
Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp
450 455 460
Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
465 470 475 480
Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro
485 490 495
Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe
500 505 510
Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr
515 520 525
Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr
530 535 540
Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln
545 550 555 560
Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro
565 570 575
Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val
580 585 590
Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu
595 600 605
Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp
610 615 620
Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe
625 630 635 640
Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser
645 650 655
Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln
660 665 670
Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser
675 680 685
Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Val Glu Asn Ser Val Ala Tyr
690 695 700
Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr
705 710 715 720
Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr
725 730 735
Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln
740 745 750
Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala
755 760 765
Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln
770 775 780
Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser
785 790 795 800
Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu
805 810 815
Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys
820 825 830
Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys
835 840 845
Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp
850 855 860
Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr
865 870 875 880
Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala
885 890 895
Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val
900 905 910
Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile
915 920 925
Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys
930 935 940
Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val
945 950 955 960
Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp
965 970 975
Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg
980 985 990
Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln
995 1000 1005
Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
1010 1015 1020
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp
1025 1030 1035
Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1040 1045 1050
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln
1055 1060 1065
Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys
1070 1075 1080
Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
1085 1090 1095
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr
1100 1105 1110
Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly
1115 1120 1125
Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp
1130 1135 1140
Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser
1145 1150 1155
Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val
1160 1165 1170
Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys
1175 1180 1185
Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr
1190 1195 1200
Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile
1205 1210 1215
Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys
1220 1225 1230
Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly
1235 1240 1245
Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys
1250 1255 1260
Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 112
<211> 10096
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多核苷酸"
<400> 112
ggcgttggga gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg 60
aatagctcag aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 120
tggggcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc 180
gggactatgg ttgctgacta attgagatgc ccgacattga ttattgacta gttggaaggg 240
ctaattcact cccaaagaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc 300
tacttccctg attagcagaa ctacacacca gggccagggg tcagatatcc actgaccttt 360
ggatggtgct acaagctagt accagttgag ccagataagg tagaagaggc caataaagga 420
gagaacacca gcttgttaca ccctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa 480
gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acgtggcccg agagctgcat 540
ccggagtact tcaagaactg ctgatatcga gcttgctaca agggactttc cgctggggac 600
tttccaggga ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag atcctgcata 660
taagcagctg ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga 720
gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct 780
tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt 840
ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg 900
aaaccagagg agctctctcg acgcaggact cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc 960
gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga 1020
gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt 1080
cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg 1140
gagctagaac gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa 1200
atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag aagaacttag atcattatat 1260
aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag agataaaaga caccaaggaa 1320
gctttagaca agatagagga agagcaaaac aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc 1380
gctgatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa 1440
atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt 1500
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agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt 1620
gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc aacagcatct 1680
gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag 1740
atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac 1800
cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct ctggaacaga tttggaatca 1860
cacgacctgg atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt 1920
aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa 1980
atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt 2040
cataatgata gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt 2100
gaatagagtt aggcagggat attcaccatt atcgtttcag acccacctcc caaccccgag 2160
gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc 2220
cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta tcgccgaatt cacaaatggc agtattcatc 2280
cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac 2340
ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat 2400
tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccactttggc tgatacgcgt ggagttccgc 2460
gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 2520
acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 2580
tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 2640
agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 2700
atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 2760
atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 2820
tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 2880
gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 2940
cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc 3000
catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgcgatc ggatccacaa gtttgtacaa 3060
aaaagcaggc tgccaccatg ttcgtgtttc tggtgctgct gccactggtg tccagtcagt 3120
gcgtgaactt caccacacga acacagctgc caccagccta caccaatagc ttcacccgcg 3180
gagtgtacta ccccgacaag gtgttccgca gcagcgtgct gcatagcacc caggatctgt 3240
ttctgccctt cttcagcaac gtgacctggt tccacgccat ccacgtgtcc ggcaccaatg 3300
gcaccaagcg cttcgctaat cccgtgctgc ccttcaacga tggcgtgtac tttgccagca 3360
ccgagaagtc caatatcatc cgcggctgga tcttcggcac cacactggat agcaagaccc 3420
agagcctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtggtcat caaagtgtgc gagttccagt 3480
tctgcaacga ccccttcctg ggcgtctact accacaagaa caacaagagc tggatggaaa 3540
gcgagttccg cgtgtacagc agcgccaaca actgcacctt cgagtacgtg tcccagccat 3600
tcctgatgga cctggaaggc aagcagggca acttcaagaa cctgcgcgag ttcgtgttca 3660
agaacatcga cggctacttc aaaatctaca gcaagcacac cccaatcaac ctcgtgcgcg 3720
gcctgccaca gggattcagt gctctggaac ccctggtgga tctgcccatc ggcatcaaca 3780
ttacccgctt tcagacactg caccgcagtt acttgacacc aggcgatagc agcagtggat 3840
ggacagctgg tgccgccgct tactacgttg gatatctgca gccacgcacc tttctgctga 3900
agtacaacga gaacggcacc atcaccgacg ccgtggattg tgctctcgat cccctgagcg 3960
agacaaagtg caccctgaag tccttcaccg tcgagaaggg catctaccag accagcaatt 4020
tccgcgtgca gcccaccgag agcatcgtgc gcttccccaa tatcaccaat ctgtgcccct 4080
tcggcgaggt gttcaatgcc acacgctttg cctccgtgta cgcctggaat cgcaagcgca 4140
ttagcaactg cgtggccgac tactccgtgc tgtacaatag cgccagcttc agcaccttca 4200
agtgctacgg cgtgtcaccc accaagctga acgacctgtg cttcaccaat gtgtacgccg 4260
acagcttcgt gatccgcgga gatgaagtgc gacagattgc cccaggccag accggcaaca 4320
tcgccgacta caattacaag ctgcccgacg acttcaccgg ctgcgtgatc gcctggaaca 4380
gcaacaacct ggattccaaa gtcggcggca actacaacta cctgtaccgc ctgttccgca 4440
agagcaatct gaagcccttc gagcgcgaca tcagcaccga aatctaccag gccggaagca 4500
ccccatgcaa cggcgtgaaa ggcttcaact gctacttccc actgcagtcc tacggatttc 4560
agcccacata tggcgtgggc taccagccat atcgagtggt ggtgctgagc ttcgaactgc 4620
tgcatgctcc agctaccgtg tgcggcccca agaagagtac caacctggtc aagaacaaat 4680
gcgtgaactt caacttcaac ggcctgaccg gaaccggcgt gctgaccgag agtaacaaga 4740
agttcctgcc attccagcag tttggccgcg acattgccga tacaaccgat gccgttcgcg 4800
atccccagac cttggagatc ctggatatta ccccatgctc cttcggcggc gtgtccgtga 4860
ttacaccagg caccaatacc agcaaccagg tggccgttct gtaccagggc gtgaattgca 4920
cagaggtgcc cgtggccatt cacgccgatc aattgacacc aacatggcgc gtgtactcca 4980
ccggcagcaa tgtgtttcaa acccgcgctg gatgcctgat tggagccgag cacgtgaaca 5040
atagctacga gtgcgatatc cccatcggag ccggaatctg cgcctcctat cagacccaga 5100
ccaatagtcc acgacgagcc cgaagtgtgg ccagccagag catcattgcc tataccatga 5160
gcctgggcgt ggagaatagc gtggcctact ccaacaacag cattgctatc cccaccaact 5220
tcaccatcag cgtgaccacc gagatcctgc cagtgtccat gaccaagacc agcgtggact 5280
gcaccatgta catctgcgga gatagcaccg agtgcagcaa cctgctgctg cagtacggaa 5340
gtttctgcac ccagctgaat cgcgccctga caggcattgc cgtggaacag gataagaaca 5400
cccaagaggt gttcgcccaa gtgaagcaaa tctacaagac cccaccaatc aaggatttcg 5460
gcggcttcaa tttcagccag attctgcccg atccaagcaa gcccagcaag cgcagcttca 5520
tcgaggacct gctgttcaac aaagtgacac tggccgacgc cggattcatc aagcagtatg 5580
gcgattgcct gggcgatatt gccgcacgcg atctgatttg cgcccagaag tttaacggac 5640
tgaccgtcct gccaccactg ctgacagatg agatgatcgc ccagtacaca agtgccctgc 5700
tggccggaac cattaccagc ggatggacat ttggagccgg tgccgctctg cagattccct 5760
tcgctatgca gatggcctac cgcttcaatg gcattggcgt gacccagaat gtgctgtacg 5820
agaaccagaa gctgatcgcc aaccagttca acagcgccat cggcaagatt caggacagcc 5880
tgagtagtac cgccagcgct ctgggaaagc tgcaggatgt ggtcaaccag aacgctcagg 5940
ccctgaacac cctggttaag cagctgagca gcaacttcgg cgccatcagt agcgtgctga 6000
acgatatcct gagccgcctg gatccgccgg aagccgaggt gcagatcgat cgcctgatta 6060
ccggacgcct gcagtccctg cagacctatg tgacacagca gctgatccga gccgccgaga 6120
ttcgagctag tgctaatctg gccgccacca agatgagcga atgtgtgctg ggacagagca 6180
agcgcgtgga cttttgcggc aagggatacc acctgatgag cttcccacag agtgctccac 6240
acggcgtggt gtttctgcat gtgacctacg tgcccgctca agagaagaat ttcaccaccg 6300
ctccagccat ctgccacgac ggaaaggccc attttccacg cgagggcgtg ttcgttagca 6360
acggcactca ttggttcgtc acccagcgca acttctacga gccccagatc atcaccaccg 6420
acaacacctt cgtcagcggc aactgcgacg tcgtgatcgg cattgtgaac aacaccgtgt 6480
acgatccact gcagcccgag ctggacagct tcaaagagga actggacaag tactttaaga 6540
accacacaag ccccgacgtg gacctgggag acattagcgg aatcaacgcc agcgtggtca 6600
acatccagaa agagattgac cgcctgaacg aggtggccaa gaatctgaac gagagcctga 6660
tcgacctgca agaactgggc aaatacgagc agtacattaa gtggccctgg tacatctggc 6720
tgggcttcat tgccggactg attgccatcg tgatggtcac cattatgctg tgctgcatga 6780
ccagttgctg cagctgcctg aagggatgct gcagttgcgg aagctgctgc aagttcgacg 6840
aggatgatag cgagccagtg ctgaagggcg tcaagctgca ctacacctga tagtaaaccc 6900
agctttcttg tacaaagtgg tctcgagttc ccgataatca acctctggat tacaaaattt 6960
gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg 7020
ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt 7080
ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg 7140
tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc 7200
agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg 7260
cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt 7320
tgtcggggaa gctgacgtcc tttccgcggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc 7380
gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg 7440
gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga 7500
tctccctttg ggccgcctcc ccgcggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt 7560
agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg 7620
aagacaaaat cgtcgagaga tgctgcatat aagcagctgc tttttgcttg tactgggtct 7680
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7740
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7800
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagttct 7860
agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct 7920
gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 7980
tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 8040
ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg 8100
gatgcggtgg gctctatggc ttctactggg cggttttatg gacagcaagc gaaccggaat 8160
tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac tggatggctt 8220
tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagctc tgatcaagag acaggatgag 8280
gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg 8340
agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt 8400
tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc 8460
tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt 8520
gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag 8580
tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg 8640
ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag 8700
cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg 8760
atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcga 8820
gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca 8880
tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc 8940
gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg 9000
ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct 9060
atcgccttct tgacgagttc ttctgaatta ttaacgctta caatttcctg atgcggtatt 9120
ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatcag gtggcacttt tcggggaaat 9180
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 9240
agacaataac cctgataaat gcttcaataa tagcacgtgc taaaacttca tttttaattt 9300
aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 9360
ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 9420
ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 9480
tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 9540
cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 9600
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 9660
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 9720
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 9780
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 9840
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 9900
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 9960
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 10020
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tcttgctgct tcgcgatgta 10080
cgggccagat atacgc 10096
<210> 113
<211> 3813
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多核苷酸"
<400> 113
atgttcgtgt ttctggtgct gctgccactg gtgtccagtc agtgcgtgaa cttcaccaca 60
cgaacacagc tgccaccagc ctacaccaat agcttcaccc gcggagtgta ctaccccgac 120
aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcatagc acccaggatc tgtttctgcc cttcttcagc 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg tccggcacca atggcaccaa gcgcttcgct 240
aatcccgtgc tgcccttcaa cgatggcgtg tactttgcca gcaccgagaa gtccaatatc 300
atccgcggct ggatcttcgg caccacactg gatagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360
aacaacgcca ccaacgtggt catcaaagtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 420
ctgggcgtct actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt ccgcgtgtac 480
agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc cattcctgat ggacctggaa 540
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600
ttcaaaatct acagcaagca caccccaatc aacctcgtgc gcggcctgcc acagggattc 660
agtgctctgg aacccctggt ggatctgccc atcggcatca acattacccg ctttcagaca 720
ctgcaccgca gttacttgac accaggcgat agcagcagtg gatggacagc tggtgccgcc 780
gcttactacg ttggatatct gcagccacgc acctttctgc tgaagtacaa cgagaacggc 840
accatcaccg acgccgtgga ttgtgctctc gatcccctga gcgagacaaa gtgcaccctg 900
aagtccttca ccgtcgagaa gggcatctac cagaccagca atttccgcgt gcagcccacc 960
gagagcatcg tgcgcttccc caatatcacc aatctgtgcc ccttcggcga ggtgttcaat 1020
gccacacgct ttgcctccgt gtacgcctgg aatcgcaagc gcattagcaa ctgcgtggcc 1080
gactactccg tgctgtacaa tagcgccagc ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtgtca 1140
cccaccaagc tgaacgacct gtgcttcacc aatgtgtacg ccgacagctt cgtgatccgc 1200
ggagatgaag tgcgacagat tgccccaggc cagaccggca acatcgccga ctacaattac 1260
aagctgcccg acgacttcac cggctgcgtg atcgcctgga acagcaacaa cctggattcc 1320
aaagtcggcg gcaactacaa ctacctgtac cgcctgttcc gcaagagcaa tctgaagccc 1380
ttcgagcgcg acatcagcac cgaaatctac caggccggaa gcaccccatg caacggcgtg 1440
aaaggcttca actgctactt cccactgcag tcctacggat ttcagcccac atatggcgtg 1500
ggctaccagc catatcgagt ggtggtgctg agcttcgaac tgctgcatgc tccagctacc 1560
gtgtgcggcc ccaagaagag taccaacctg gtcaagaaca aatgcgtgaa cttcaacttc 1620
aacggcctga ccggaaccgg cgtgctgacc gagagtaaca agaagttcct gccattccag 1680
cagtttggcc gcgacattgc cgatacaacc gatgccgttc gcgatcccca gaccttggag 1740
atcctggata ttaccccatg ctccttcggc ggcgtgtccg tgattacacc aggcaccaat 1800
accagcaacc aggtggccgt tctgtaccag ggcgtgaatt gcacagaggt gcccgtggcc 1860
attcacgccg atcaattgac accaacatgg cgcgtgtact ccaccggcag caatgtgttt 1920
caaacccgcg ctggatgcct gattggagcc gagcacgtga acaatagcta cgagtgcgat 1980
atccccatcg gagccggaat ctgcgcctcc tatcagaccc agaccaatag tccacgacga 2040
gcccgaagtg tggccagcca gagcatcatt gcctatacca tgagcctggg cgtggagaat 2100
agcgtggcct actccaacaa cagcattgct atccccacca acttcaccat cagcgtgacc 2160
accgagatcc tgccagtgtc catgaccaag accagcgtgg actgcaccat gtacatctgc 2220
ggagatagca ccgagtgcag caacctgctg ctgcagtacg gaagtttctg cacccagctg 2280
aatcgcgccc tgacaggcat tgccgtggaa caggataaga acacccaaga ggtgttcgcc 2340
caagtgaagc aaatctacaa gaccccacca atcaaggatt tcggcggctt caatttcagc 2400
cagattctgc ccgatccaag caagcccagc aagcgcagct tcatcgagga cctgctgttc 2460
aacaaagtga cactggccga cgccggattc atcaagcagt atggcgattg cctgggcgat 2520
attgccgcac gcgatctgat ttgcgcccag aagtttaacg gactgaccgt cctgccacca 2580
ctgctgacag atgagatgat cgcccagtac acaagtgccc tgctggccgg aaccattacc 2640
agcggatgga catttggagc cggtgccgct ctgcagattc ccttcgctat gcagatggcc 2700
taccgcttca atggcattgg cgtgacccag aatgtgctgt acgagaacca gaagctgatc 2760
gccaaccagt tcaacagcgc catcggcaag attcaggaca gcctgagtag taccgccagc 2820
gctctgggaa agctgcagga tgtggtcaac cagaacgctc aggccctgaa caccctggtt 2880
aagcagctga gcagcaactt cggcgccatc agtagcgtgc tgaacgatat cctgagccgc 2940
ctggatccgc cggaagccga ggtgcagatc gatcgcctga ttaccggacg cctgcagtcc 3000
ctgcagacct atgtgacaca gcagctgatc cgagccgccg agattcgagc tagtgctaat 3060
ctggccgcca ccaagatgag cgaatgtgtg ctgggacaga gcaagcgcgt ggacttttgc 3120
ggcaagggat accacctgat gagcttccca cagagtgctc cacacggcgt ggtgtttctg 3180
catgtgacct acgtgcccgc tcaagagaag aatttcacca ccgctccagc catctgccac 3240
gacggaaagg cccattttcc acgcgagggc gtgttcgtta gcaacggcac tcattggttc 3300
gtcacccagc gcaacttcta cgagccccag atcatcacca ccgacaacac cttcgtcagc 3360
ggcaactgcg acgtcgtgat cggcattgtg aacaacaccg tgtacgatcc actgcagccc 3420
gagctggaca gcttcaaaga ggaactggac aagtacttta agaaccacac aagccccgac 3480
gtggacctgg gagacattag cggaatcaac gccagcgtgg tcaacatcca gaaagagatt 3540
gaccgcctga acgaggtggc caagaatctg aacgagagcc tgatcgacct gcaagaactg 3600
ggcaaatacg agcagtacat taagtggccc tggtacatct ggctgggctt cattgccgga 3660
ctgattgcca tcgtgatggt caccattatg ctgtgctgca tgaccagttg ctgcagctgc 3720
ctgaagggat gctgcagttg cggaagctgc tgcaagttcg acgaggatga tagcgagcca 3780
gtgctgaagg gcgtcaagct gcactacacc tga 3813
<210> 114
<211> 1270
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 114
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Phe Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Ala
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Gly Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr
245 250 255
Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
260 265 270
Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys
275 280 285
Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr
290 295 300
Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr
305 310 315 320
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
325 330 335
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
340 345 350
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
355 360 365
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
370 375 380
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
385 390 395 400
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala
405 410 415
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
420 425 430
Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
435 440 445
Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp
450 455 460
Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
465 470 475 480
Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro
485 490 495
Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe
500 505 510
Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr
515 520 525
Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr
530 535 540
Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln
545 550 555 560
Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro
565 570 575
Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val
580 585 590
Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu
595 600 605
Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp
610 615 620
Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe
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Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser
645 650 655
Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln
660 665 670
Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser
675 680 685
Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Val Glu Asn Ser Val Ala Tyr
690 695 700
Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr
705 710 715 720
Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr
725 730 735
Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln
740 745 750
Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala
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Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser
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Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu
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Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala
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900 905 910
Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile
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930 935 940
Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val
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980 985 990
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
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ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat 1980
aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta 2040
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gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg 2160
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attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccactttg gctgatacgc gtggagttcc 2460
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ggcgtgtcac ccaccaagct gaacgacctg tgcttcacca atgtgtacgc cgacagcttc 1200
gtgatccgcg gagatgaagt gcgacagatt gccccaggcc agaccggcaa gatcgccgac 1260
tacaattaca agctgcccga cgacttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaac 1320
ctggattcca aagtcggcgg caactacaac tacctgtacc gcctgttccg caagagcaat 1380
ctgaagccct tcgagcgcga catcagcacc gaaatctacc aggccggaag caccccatgc 1440
aacggcgtgg aaggcttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggatt tcagcccaca 1500
aatggcgtgg gctaccagcc atatcgagtg gtggtgctga gcttcgaact gctgcatgct 1560
ccagctaccg tgtgcggccc caagaagagt accaacctgg tcaagaacaa atgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggcctgac cggaaccggc gtgctgaccg agagtaacaa gaagttcctg 1680
ccattccagc agtttggccg cgacattgcc gatacaaccg atgccgttcg cgatccccag 1740
accttggaga tcctggatat taccccatgc tccttcggcg gcgtgtccgt gattacacca 1800
ggcaccaata ccagcaacca ggtggccgtt ctgtaccagg gcgtgaattg cacagaggtg 1860
cccgtggcca ttcacgccga tcaattgaca ccaacatggc gcgtgtactc caccggcagc 1920
aatgtgtttc aaacccgcgc tggatgcctg attggagccg agcacgtgaa caatagctac 1980
gagtgcgata tccccatcgg agccggaatc tgcgcctcct atcagaccca gaccaatagt 2040
ccacgacgag cccgaagtgt ggccagccag agcatcattg cctataccat gagcctgggc 2100
gccgagaata gcgtggccta ctccaacaac agcattgcta tccccaccaa cttcaccatc 2160
agcgtgacca ccgagatcct gccagtgtcc atgaccaaga ccagcgtgga ctgcaccatg 2220
tacatctgcg gagatagcac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg aagtttctgc 2280
acccagctga atcgcgccct gacaggcatt gccgtggaac aggataagaa cacccaagag 2340
gtgttcgccc aagtgaagca aatctacaag accccaccaa tcaaggattt cggcggcttc 2400
aatttcagcc agattctgcc cgatccaagc aagcccagca agcgcagctt catcgaggac 2460
ctgctgttca acaaagtgac actggccgac gccggattca tcaagcagta tggcgattgc 2520
ctgggcgata ttgccgcacg cgatctgatt tgcgcccaga agtttaacgg actgaccgtc 2580
ctgccaccac tgctgacaga tgagatgatc gcccagtaca caagtgccct gctggccgga 2640
accattacca gcggatggac atttggagcc ggtgccgctc tgcagattcc cttcgctatg 2700
cagatggcct accgcttcaa tggcattggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc atcggcaaga ttcaggacag cctgagtagt 2820
accgccagcg ctctgggaaa gctgcaggat gtggtcaacc agaacgctca ggccctgaac 2880
accctggtta agcagctgag cagcaacttc ggcgccatca gtagcgtgct gaacgatatc 2940
ctgagccgcc tggataaggt ggaagccgag gtgcagatcg atcgcctgat taccggacgc 3000
ctgcagtccc tgcagaccta tgtgacacag cagctgatcc gagccgccga gattcgagct 3060
agtgctaatc tggccgccac caagatgagc gaatgtgtgc tgggacagag caagcgcgtg 3120
gacttttgcg gcaagggata ccacctgatg agcttcccac agagtgctcc acacggcgtg 3180
gtgtttctgc atgtgaccta cgtgcccgct caagagaaga atttcaccac cgctccagcc 3240
atctgccacg acggaaaggc ccattttcca cgcgagggcg tgttcgttag caacggcact 3300
cattggttcg tcacccagcg caacttctac gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc 3360
ttcgtcagcg gcaactgcga cgtcgtgatc ggcattgtga acaacaccgt gtacgatcca 3420
ctgcagcccg agctggacag cttcaaagag gaactggaca agtactttaa gaaccacaca 3480
agccccgacg tggacctggg agacattagc ggaatcaacg ccagcgtggt caacatccag 3540
aaagagattg accgcctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgacctg 3600
caagaactgg gcaaatacga gcagtacatt aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc 3660
attgccggac tgattgccat cgtgatggtc accattatgc tgtgctgcat gaccagttgc 3720
tgcagctgcc tgaagggatg ctgcagttgc ggaagctgct gcaagttcga cgaggatgat 3780
agcgagccag tgctgaaggg cgtcaagctg cactacacct gataa 3825
<210> 117
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 117
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 118
<211> 10086
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多核苷酸"
<400> 118
ggcgttggga gctttttgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg 60
aatagctcag aggcagaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 120
tggggcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc 180
gggactatgg ttgctgacta attgagatgc ccgacattga ttattgacta gttggaaggg 240
ctaattcact cccaaagaag acaagatatc cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc 300
tacttccctg attagcagaa ctacacacca gggccagggg tcagatatcc actgaccttt 360
ggatggtgct acaagctagt accagttgag ccagataagg tagaagaggc caataaagga 420
gagaacacca gcttgttaca ccctgtgagc ctgcatggga tggatgaccc ggagagagaa 480
gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acgtggcccg agagctgcat 540
ccggagtact tcaagaactg ctgatatcga gcttgctaca agggactttc cgctggggac 600
tttccaggga ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag atcctgcata 660
taagcagctg ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga 720
gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct 780
tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt 840
ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg 900
aaaccagagg agctctctcg acgcaggact cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc 960
gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga 1020
gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt 1080
cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg 1140
gagctagaac gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa 1200
atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag aagaacttag atcattatat 1260
aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag agataaaaga caccaaggaa 1320
gctttagaca agatagagga agagcaaaac aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc 1380
gctgatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa 1440
atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt 1500
ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc 1560
agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt 1620
gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc aacagcatct 1680
gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag 1740
atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac 1800
cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct ctggaacaga tttggaatca 1860
cacgacctgg atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt 1920
aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa 1980
atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt 2040
cataatgata gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt 2100
gaatagagtt aggcagggat attcaccatt atcgtttcag acccacctcc caaccccgag 2160
gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc 2220
cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta tcgccgaatt cacaaatggc agtattcatc 2280
cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac 2340
ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat 2400
tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccactttggc tgatacgcgt ggagttccgc 2460
gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 2520
acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 2580
tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 2640
agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 2700
atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 2760
atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 2820
tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 2880
gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 2940
cggtgggagg tctatataag cagagcttcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 3000
tccatagaag acaccgcgat cggatccaca agtttgtaca aaaaagcagg ctgccaccat 3060
gttcgtgttt ctggtgctgc tgccactggt gtccagtcag tgcgtgaact tcaccaaccg 3120
aacacagctg ccatccgcct acaccaatag cttcacccgc ggagtgtact accccgacaa 3180
ggtgttccgc agcagcgtgc tgcatagcac ccaggatctg tttctgccct tcttcagcaa 3240
cgtgacctgg ttccacgcca tccacgtgtc cggcaccaat ggcaccaagc gcttcgataa 3300
tcccgtgctg cccttcaacg atggcgtgta ctttgccagc accgagaagt ccaatatcat 3360
ccgcggctgg atcttcggca ccacactgga tagcaagacc cagagcctgc tgatcgtgaa 3420
caacgccacc aacgtggtca tcaaagtgtg cgagttccag ttctgcaact accccttcct 3480
gggcgtctac taccacaaga acaacaagag ctggatggaa agcgagttcc gcgtgtacag 3540
cagcgccaac aactgcacct tcgagtacgt gtcccagcca ttcctgatgg acctggaagg 3600
caagcagggc aacttcaaga acctgtccga gttcgtgttc aagaacatcg acggctactt 3660
caaaatctac agcaagcaca ccccaatcaa cctcgtgcgc gatctgccac agggattcag 3720
tgctctggaa cccctggtgg atctgcccat cggcatcaac attacccgct ttcagacact 3780
gctggccctg caccgcagtt acttgacacc aggcgatagc agcagtggat ggacagctgg 3840
tgccgccgct tactacgttg gatatctgca gccacgcacc tttctgctga agtacaacga 3900
gaacggcacc atcaccgacg ccgtggattg tgctctcgat cccctgagcg agacaaagtg 3960
caccctgaag tccttcaccg tcgagaaggg catctaccag accagcaatt tccgcgtgca 4020
gcccaccgag agcatcgtgc gcttccccaa tatcaccaat ctgtgcccct tcggcgaggt 4080
gttcaatgcc acacgctttg cctccgtgta cgcctggaat cgcaagcgca ttagcaactg 4140
cgtggccgac tactccgtgc tgtacaatag cgccagcttc agcaccttca agtgctacgg 4200
cgtgtcaccc accaagctga acgacctgtg cttcaccaat gtgtacgccg acagcttcgt 4260
gatccgcgga gatgaagtgc gacagattgc cccaggccag accggcacca tcgccgacta 4320
caattacaag ctgcccgacg acttcaccgg ctgcgtgatc gcctggaaca gcaacaacct 4380
ggattccaaa gtcggcggca actacaacta cctgtaccgc ctgttccgca agagcaatct 4440
gaagcccttc gagcgcgaca tcagcaccga aatctaccag gccggaagca ccccatgcaa 4500
cggcgtgaaa ggcttcaact gctacttccc actgcagtcc tacggatttc agcccacata 4560
tggcgtgggc taccagccat atcgagtggt ggtgctgagc ttcgaactgc tgcatgctcc 4620
agctaccgtg tgcggcccca agaagagtac caacctggtc aagaacaaat gcgtgaactt 4680
caacttcaac ggcctgaccg gaaccggcgt gctgaccgag agtaacaaga agttcctgcc 4740
attccagcag tttggccgcg acattgccga tacaaccgat gccgttcgcg atccccagac 4800
cttggagatc ctggatatta ccccatgctc cttcggcggc gtgtccgtga ttacaccagg 4860
caccaatacc agcaaccagg tggccgttct gtaccagggc gtgaattgca cagaggtgcc 4920
cgtggccatt cacgccgatc aattgacacc aacatggcgc gtgtactcca ccggcagcaa 4980
tgtgtttcaa acccgcgctg gatgcctgat tggagccgag tacgtgaaca atagctacga 5040
gtgcgatatc cccatcggag ccggaatctg cgcctcctat cagacccaga ccaatagtcc 5100
acgacgagcc cgaagtgtgg ccagccagag catcattgcc tataccatga gcctgggcgc 5160
cgagaatagc gtggcctact ccaacaacag cattgctatc cccaccaact tcaccatcag 5220
cgtgaccacc gagatcctgc cagtgtccat gaccaagacc agcgtggact gcaccatgta 5280
catctgcgga gatagcaccg agtgcagcaa cctgctgctg cagtacggaa gtttctgcac 5340
ccagctgaat cgcgccctga caggcattgc cgtggaacag gataagaaca cccaagaggt 5400
gttcgcccaa gtgaagcaaa tctacaagac cccaccaatc aaggatttcg gcggcttcaa 5460
tttcagccag attctgcccg atccaagcaa gcccagcaag cgcagcttca tcgaggacct 5520
gctgttcaac aaagtgacac tggccgacgc cggattcatc aagcagtatg gcgattgcct 5580
gggcgatatt gccgcacgcg atctgatttg cgcccagaag tttaacggac tgaccgtcct 5640
gccaccactg ctgacagatg agatgatcgc ccagtacaca agtgccctgc tggccggaac 5700
cattaccagc ggatggacat ttggagccgg tgccgctctg cagattccct tcgctatgca 5760
gatggcctac cgcttcaatg gcattggcgt gacccagaat gtgctgtacg agaaccagaa 5820
gctgatcgcc aaccagttca acagcgccat cggcaagatt caggacagcc tgagtagtac 5880
cgccagcgct ctgggaaagc tgcaggatgt ggtcaaccag aacgctcagg ccctgaacac 5940
cctggttaag cagctgagca gcaacttcgg cgccatcagt agcgtgctga acgatatcct 6000
gagccgcctg gataaggtgg aagccgaggt gcagatcgat cgcctgatta ccggacgcct 6060
gcagtccctg cagacctatg tgacacagca gctgatccga gccgccgaga ttcgagctag 6120
tgctaatctg gccgccatca agatgagcga atgtgtgctg ggacagagca agcgcgtgga 6180
cttttgcggc aagggatacc acctgatgag cttcccacag agtgctccac acggcgtggt 6240
gtttctgcat gtgacctacg tgcccgctca agagaagaat ttcaccaccg ctccagccat 6300
ctgccacgac ggaaaggccc attttccacg cgagggcgtg ttcgttagca acggcactca 6360
ttggttcgtc acccagcgca acttctacga gccccagatc atcaccaccg acaacacctt 6420
cgtcagcggc aactgcgacg tcgtgatcgg cattgtgaac aacaccgtgt acgatccact 6480
gcagcccgag ctggacagct tcaaagagga actggacaag tactttaaga accacacaag 6540
ccccgacgtg gacctgggag acattagcgg aatcaacgcc agcgtggtca acatccagaa 6600
agagattgac cgcctgaacg aggtggccaa gaatctgaac gagagcctga tcgacctgca 6660
agaactgggc aaatacgagc agtacattaa gtggccctgg tacatctggc tgggcttcat 6720
tgccggactg attgccatcg tgatggtcac cattatgctg tgctgcatga ccagttgctg 6780
cagctgcctg aagggatgct gcagttgcgg aagctgctgc aagttcgacg aggatgatag 6840
cgagccagtg ctgaagggcg tcaagctgca ctacacctga tagtaaaccc agctttcttg 6900
tacaaagtgg tctcgagttc ccgataatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt 6960
gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc 7020
tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg 7080
gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac 7140
tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc 7200
cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc 7260
ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa 7320
gctgacgtcc tttccgcggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc 7380
cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc 7440
ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 7500
ggccgcctcc ccgcggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 7560
cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg aagacaaaat 7620
cgtcgagaga tgctgcatat aagcagctgc tttttgcttg tactgggtct ctctggttag 7680
accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat 7740
aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact 7800
agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagttct agagggcccg 7860
tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 7920
cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 7980
atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 8040
ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg 8100
gctctatggc ttctactggg cggttttatg gacagcaagc gaaccggaat tgccagctgg 8160
ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac tggatggctt tcttgccgcc 8220
aaggatctga tggcgcaggg gatcaagctc tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg 8280
catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt 8340
cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc 8400
agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact 8460
gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt 8520
gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca 8580
ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat 8640
gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg 8700
catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga 8760
agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga 8820
cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa 8880
tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga 8940
catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt 9000
cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct 9060
tgacgagttc ttctgaatta ttaacgctta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac 9120
gcatctgtgc ggtatttcac accgcatcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 9180
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 9240
cctgataaat gcttcaataa tagcacgtgc taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 9300
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 9360
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 9420
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 9480
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 9540
atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 9600
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 9660
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 9720
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 9780
tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 9840
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 9900
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 9960
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 10020
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tcttgctgct tcgcgatgta cgggccagat 10080
atacgc 10086
<210> 119
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多核苷酸"
<400> 119
atgttcgtgt ttctggtgct gctgccactg gtgtccagtc agtgcgtgaa cttcaccaac 60
cgaacacagc tgccatccgc ctacaccaat agcttcaccc gcggagtgta ctaccccgac 120
aaggtgttcc gcagcagcgt gctgcatagc acccaggatc tgtttctgcc cttcttcagc 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg tccggcacca atggcaccaa gcgcttcgat 240
aatcccgtgc tgcccttcaa cgatggcgtg tactttgcca gcaccgagaa gtccaatatc 300
atccgcggct ggatcttcgg caccacactg gatagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360
aacaacgcca ccaacgtggt catcaaagtg tgcgagttcc agttctgcaa ctaccccttc 420
ctgggcgtct actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt ccgcgtgtac 480
agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc cattcctgat ggacctggaa 540
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgtcc gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600
ttcaaaatct acagcaagca caccccaatc aacctcgtgc gcgatctgcc acagggattc 660
agtgctctgg aacccctggt ggatctgccc atcggcatca acattacccg ctttcagaca 720
ctgctggccc tgcaccgcag ttacttgaca ccaggcgata gcagcagtgg atggacagct 780
ggtgccgccg cttactacgt tggatatctg cagccacgca cctttctgct gaagtacaac 840
gagaacggca ccatcaccga cgccgtggat tgtgctctcg atcccctgag cgagacaaag 900
tgcaccctga agtccttcac cgtcgagaag ggcatctacc agaccagcaa tttccgcgtg 960
cagcccaccg agagcatcgt gcgcttcccc aatatcacca atctgtgccc cttcggcgag 1020
gtgttcaatg ccacacgctt tgcctccgtg tacgcctgga atcgcaagcg cattagcaac 1080
tgcgtggccg actactccgt gctgtacaat agcgccagct tcagcacctt caagtgctac 1140
ggcgtgtcac ccaccaagct gaacgacctg tgcttcacca atgtgtacgc cgacagcttc 1200
gtgatccgcg gagatgaagt gcgacagatt gccccaggcc agaccggcac catcgccgac 1260
tacaattaca agctgcccga cgacttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaac 1320
ctggattcca aagtcggcgg caactacaac tacctgtacc gcctgttccg caagagcaat 1380
ctgaagccct tcgagcgcga catcagcacc gaaatctacc aggccggaag caccccatgc 1440
aacggcgtga aaggcttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggatt tcagcccaca 1500
tatggcgtgg gctaccagcc atatcgagtg gtggtgctga gcttcgaact gctgcatgct 1560
ccagctaccg tgtgcggccc caagaagagt accaacctgg tcaagaacaa atgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggcctgac cggaaccggc gtgctgaccg agagtaacaa gaagttcctg 1680
ccattccagc agtttggccg cgacattgcc gatacaaccg atgccgttcg cgatccccag 1740
accttggaga tcctggatat taccccatgc tccttcggcg gcgtgtccgt gattacacca 1800
ggcaccaata ccagcaacca ggtggccgtt ctgtaccagg gcgtgaattg cacagaggtg 1860
cccgtggcca ttcacgccga tcaattgaca ccaacatggc gcgtgtactc caccggcagc 1920
aatgtgtttc aaacccgcgc tggatgcctg attggagccg agtacgtgaa caatagctac 1980
gagtgcgata tccccatcgg agccggaatc tgcgcctcct atcagaccca gaccaatagt 2040
ccacgacgag cccgaagtgt ggccagccag agcatcattg cctataccat gagcctgggc 2100
gccgagaata gcgtggccta ctccaacaac agcattgcta tccccaccaa cttcaccatc 2160
agcgtgacca ccgagatcct gccagtgtcc atgaccaaga ccagcgtgga ctgcaccatg 2220
tacatctgcg gagatagcac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg aagtttctgc 2280
acccagctga atcgcgccct gacaggcatt gccgtggaac aggataagaa cacccaagag 2340
gtgttcgccc aagtgaagca aatctacaag accccaccaa tcaaggattt cggcggcttc 2400
aatttcagcc agattctgcc cgatccaagc aagcccagca agcgcagctt catcgaggac 2460
ctgctgttca acaaagtgac actggccgac gccggattca tcaagcagta tggcgattgc 2520
ctgggcgata ttgccgcacg cgatctgatt tgcgcccaga agtttaacgg actgaccgtc 2580
ctgccaccac tgctgacaga tgagatgatc gcccagtaca caagtgccct gctggccgga 2640
accattacca gcggatggac atttggagcc ggtgccgctc tgcagattcc cttcgctatg 2700
cagatggcct accgcttcaa tggcattggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc atcggcaaga ttcaggacag cctgagtagt 2820
accgccagcg ctctgggaaa gctgcaggat gtggtcaacc agaacgctca ggccctgaac 2880
accctggtta agcagctgag cagcaacttc ggcgccatca gtagcgtgct gaacgatatc 2940
ctgagccgcc tggataaggt ggaagccgag gtgcagatcg atcgcctgat taccggacgc 3000
ctgcagtccc tgcagaccta tgtgacacag cagctgatcc gagccgccga gattcgagct 3060
agtgctaatc tggccgccat caagatgagc gaatgtgtgc tgggacagag caagcgcgtg 3120
gacttttgcg gcaagggata ccacctgatg agcttcccac agagtgctcc acacggcgtg 3180
gtgtttctgc atgtgaccta cgtgcccgct caagagaaga atttcaccac cgctccagcc 3240
atctgccacg acggaaaggc ccattttcca cgcgagggcg tgttcgttag caacggcact 3300
cattggttcg tcacccagcg caacttctac gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc 3360
ttcgtcagcg gcaactgcga cgtcgtgatc ggcattgtga acaacaccgt gtacgatcca 3420
ctgcagcccg agctggacag cttcaaagag gaactggaca agtactttaa gaaccacaca 3480
agccccgacg tggacctggg agacattagc ggaatcaacg ccagcgtggt caacatccag 3540
aaagagattg accgcctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgacctg 3600
caagaactgg gcaaatacga gcagtacatt aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc 3660
attgccggac tgattgccat cgtgatggtc accattatgc tgtgctgcat gaccagttgc 3720
tgcagctgcc tgaagggatg ctgcagttgc ggaagctgct gcaagttcga cgaggatgat 3780
agcgagccag tgctgaaggg cgtcaagctg cactacacct ga 3822
<210> 120
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> 源（source）
<223> /note="人工序列描述：合成多肽"
<400> 120
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Phe Thr Asn Arg Thr Gln Leu Pro Ser Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Tyr Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Ser Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Thr Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu Tyr Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Ile Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 121
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 122
Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala
1 5
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 123
Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile
1 5
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 124
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
1 5 10
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 125
Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
1 5
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 126
Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val
1 5
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 127
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
1 5 10
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 128
Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 129
Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu
1 5
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 130
Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu
1 5
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 131
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 132
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu
1 5
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 133
Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1 5
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 134
Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 135
Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 136
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
1 5
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 137
Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys
1 5
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 138
Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
1 5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 139
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg
1 5
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 140
Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe
1 5 10
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 141
Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1 5
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 142
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
1 5
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 143
Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe
1 5
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 144
Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
1 5
<210> 145
<211> 8
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 145
Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu
1 5
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 146
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe
1 5
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 147
Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 148
Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr
1 5
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 149
Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp
1 5
<210> 150
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 150
Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu
1 5 10 15
<210> 151
<211> 15
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 151
Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met
1 5 10 15
<210> 152
<211> 18
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 152
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
1 5 10 15
Thr Lys

Claims (64)

1.一种在受试者中诱导和/或激活针对严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)的保护性免疫应答的方法，所述方法包括向受试者的上呼吸道施用有效量的诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答的药剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答的所述药剂是编码严重急性呼吸系统综合症β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段的假型慢病毒载体颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述药剂通过雾化吸入施用。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述药剂通过经鼻滴注施用。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述药剂通过鼻腔吹入施用。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，治疗过程由对上呼吸道的单次给药组成，或者其中所述治疗过程包括对上呼吸道的多于一次的给药，特别是两次给药。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，治疗过程包括至少一次呼吸道外的初免给药，例如肌内、皮内或皮下途径，随后是至少一次上呼吸道的增强给药。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述保护性免疫应答包括在受试者中产生SARS-CoV-2中和抗体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述中和抗体包括IgG抗体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述保护性免疫应答包括在受试者中产生SARS-CoV-2S特异性T细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述SARS-CoV-2S特异性T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、或CD4+T细胞和CD8+T细胞两者。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述SARS-CoV-2S特异性T细胞包括肺CD8+T细胞。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中，所述SARS-CoV-2S特异性T细胞包括产生IFN-γ的T细胞。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中，所述CD8+T细胞包括具有效应记忆(Tem)和/或驻留记忆(Trm)表型的T细胞。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中，将所述SARS-CoV-2S特异性T细胞募集到嗅球。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述保护性免疫应答降低了受试者发生SARS-CoV-2感染相关炎症的可能性。
17.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中，所述SARS-CoV-2S蛋白具有与SEQID NO:1相同的氨基酸序列，并且所述SARS-CoV-2S蛋白衍生物具有与SEQ ID NO:1至少95％同一性的氨基酸序列。
18.根据权利要求2至17中任一项所述的方法，其中，所述SARS-CoV-2S蛋白由具有与SEQ ID NO:2相同的核苷酸序列的编码序列表达，并且所述SARS-CoV-2S蛋白衍生物由具有与SEQ ID NO:2至少80％同一性的核苷酸的编码序列表达。
19.根据权利要求2至18中任一项所述的方法，其中，所述SARS-CoV-2S蛋白衍生物或其片段包含选自肽61-75(NVTWFHAIHVSGTNG(SEQ ID NO:15))、肽536-550(NKCVNFNFNGLTGTG(SEQ ID NO:16))和肽576-590(VRDPQTLEILDITPC(SEQ ID NO:17))的肽。
20.根据权利要求2至18中任一项所述的方法，其中，所述SARS-CoV-2S衍生物或其片段包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，所述修饰选自：
(i)986K→P和987V→P，
(ii)681PRRARS686(SEQ ID NO:22)→681PGSAGS686(SEQ ID NO:23)，和
(iii)986K→P、987V→P和675QTQTNSPRRAR685(SEQ ID NO:24)缺失。
21.根据权利要求2至20中任一项所述的方法，其中，所述严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120的氨基酸序列组成。
22.根据权利要求2至21中任一项所述的方法，其中，施用的慢病毒载体颗粒是整合型的。
23.根据权利要求2至21中任一项所述的方法，其中，施用的慢病毒载体颗粒是非整合型的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述施用的非整合型慢病毒颗粒在整合酶编码序列中包含D64V突变。
25.根据权利要求2至24中任一项所述的方法，其中，施用的慢病毒载体颗粒是用水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型化的。
26.根据权利要求2至25中任一项所述的方法，其中，慢病毒载体颗粒作为包含慢病毒载体颗粒和药学上可接受的载体的疫苗制剂施用。
27.一种剂型，所述剂型用于向受试者的上呼吸道施用编码严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段的假型慢病毒载体颗粒。
28.根据权利要求27所述的剂型，其中，所述剂型用于通过雾化吸入施用。
29.根据权利要求27所述的剂型，其中，所述剂型用于通过经鼻滴注施用。
30.根据权利要求27所述的剂型，其中，所述剂型用于通过鼻腔吹入施用。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的剂型，其中，所述SARS-CoV-2S蛋白具有与SEQID NO:1相同的氨基酸序列，并且所述SARS-CoV-2S蛋白衍生物具有与SEQ ID NO:1至少95％同一性的氨基酸序列。
32.根据权利要求27至30中任一项所述的剂型，其中，所述SARS-CoV-2S蛋白由具有与SEQ ID NO:2相同的核苷酸序列的编码序列表达，并且所述SARS-CoV-2S蛋白衍生物由具有与SEQ ID NO:2至少80％同一性的核苷酸顺序的编码序列表达。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的剂型，其中，所述SARS-CoV-2S蛋白衍生物或其片段包含选自肽61-75(NVTWFHAIHVSGTNG(SEQ ID NO:15))、肽536-550(NKCVNFNFNGLTGTG(SEQ ID NO:16))和肽576-590(VRDPQTLEILDITPC(SEQ ID NO:17))的肽。
34.根据权利要求27至33中任一项所述的剂型，其中，所述SARS-CoV-2S衍生物或其片段包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸修饰，所述修饰选自：
(i)986K→P和987V→P，
(ii)681PRRARS686(SEQ ID NO:22)→681PGSAGS686(SEQ ID NO:23)，和
(iii)986K→P、987V→P和675QTQTNSPRRAR685(SEQ ID NO:24)缺失。
35.根据权利要求27至34中任一项所述的剂型，其中，所述严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120的氨基酸序列组成。
36.根据权利要求27至35中任一项所述的剂型，其中，施用的慢病毒载体颗粒是整合型的。
37.根据权利要求27至35中任一项所述的剂型，其中，施用的慢病毒载体颗粒是非整合型的。
38.根据权利要求37所述的剂型，其中，非整合型的慢病毒颗粒在整合酶编码序列中包含D64V突变。
39.根据权利要求27至38中任一项所述的剂型，其中，所述慢病毒载体颗粒是用水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型化的。
40.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求27至39中任一项所述的编码SARS-CoV-2S蛋白或其衍生物或它们的片段的假型慢病毒载体颗粒的剂型和用于向上呼吸道给药的施用器。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，其中，所述用于向上呼吸道给药的施用器是用于雾化吸入的施用器。
42.根据权利要求40所述的试剂盒，其中，所述用于向上呼吸道给药的施用器是用于经鼻滴注的施用器。
43.根据权利要求40所述的试剂盒，其中，所述用于向上呼吸道给药的施用器是用于鼻腔吹入的施用器。
44.一种载体，所述载体选自：
pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm(CNCM I-5537)，
pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538)，
pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCMI-5539)，
pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCMI-5540)，
pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708)，
pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709)，
pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710)，
pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711)，以及
pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712)。
45.一种包含权利要求38所述的载体的宿主细胞。
46.一种编码严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段的假型慢病毒载体颗粒。
47.根据权利要求46所述的假型慢病毒载体颗粒，其中所述编码的SARS-CoV-2刺突蛋白衍生物或其片段如权利要求31、32、33、34或35中任一项所定义。
48.根据权利要求46或47所述的假型慢病毒载体颗粒，其中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白选自：具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的SARS-CoV-2刺突蛋白；具有与SEQ ID NO:1至少95％同一性或至少99％同一性的氨基酸序列的SARS-CoV-2S蛋白衍生物；具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117或SEQID No:120的氨基酸序列的SARS-CoV-2刺突蛋白衍生物；具有与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117或SEQ IDNO:120至少95％同一性或至少99％同一性的氨基酸序列的SARS-CoV-2S蛋白衍生物；以及具有SEQ IDNo:14的氨基酸序列的SARS-CoV-2刺突蛋白片段，或者具有与SEQ ID No:14至少95％同一性或至少99％同一性的氨基酸序列的SARS-CoV-2S蛋白衍生物。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的假型慢病毒载体颗粒，其中，所述假型慢病毒载体颗粒如权利要求36、37、38或39中任一项所定义。
50.一种编码严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段的假型慢病毒载体颗粒，其中，所述假型慢病毒载体颗粒通过包括将宿主细胞与选自以下的载体共转染的方法制备：
pFlap-ieCMV-S2PdeltaF-WPREm(CNCM I-5537)，
pFlap-ieCMV-S2P3F-WPREm(CNCM I-5538)，
pFlap-ieCMV-S2P-WPREm(CNCMI-5539)，
pFlap-ieCMV-SFL-WPREm(CNCMI-5540)，
pFlap-ieCMV-S-B1.1.7-WPREm(CNCM I-5708)，
pFlap-ieCMV-S-B351-WPREm(CNCM I-5709)，
pFlap-ieCMV-S-B351-2P-WPREm(CNCM I-5710)，
pFlap-ieCMV-SFL-D614G-WPREm(CNCM I-5711)，以及
pFlap-ieCMV-S-P1-WPREm(CNCM I-5712)。
51.根据权利要求46至49中任一项所述的假型化慢病毒载体颗粒，其中，所述载体颗粒的基因组包含选自以下的多核苷酸：
编码SEQ ID No.13的S2PΔF(S2PdeltaF)的多核苷酸；或者具有与SEQ ID No.13至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，特别是RBD中具有突变、特别是缺失的编码序列，
编码SEQ ID No.10的S2P3F的多核苷酸；或者具有与SEQ ID No.10至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，特别是其中所述具有与SEQ ID No.10至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列包含突变986K→P和987V→P，
编码SEQ ID No.7的S2P的多核苷酸；或者具有与SEQ ID No.7至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
编码SEQ ID No.2的SFL的多核苷酸；或者具有与SEQ ID No.2至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
编码SEQ ID No.107的S-B1.1.7的多核苷酸；或者具有与SEQ ID No.107至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
编码SEQ ID No.110的S-B351的多核苷酸；或者具有与SEQ ID No.110至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
编码SEQ ID No.113的S-B1.1.7S-B351-2P的多核苷酸；或者具有与SEQ ID No.113至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，
编码SEQ ID No.116的SFL-D614G的多核苷酸；或者具有与SEQ IDNo.116至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变，和
编码SEQ ID No.119的S-P1的多核苷酸；或者具有与SEQ ID No.119至少80％同一性的核苷酸序列的编码序列，其在RBD中具有突变。
52.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含根据权利要求27至39中任一项所述的剂型或根据权利要求46至51中任一项所述的假型慢病毒颗粒。
53.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于在受试者中诱导和/或激活针对严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)的保护性免疫应答，其中所述用途包括在上呼吸道外的初免给药，特别是全身给药，尤其是肌内给药，以及对上呼吸道的增强或靶向给药的用途。
54.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于根据权利要求53的用途，其中，所述给药剂量或LV颗粒在初免和增强/靶向给药步骤中相同，或者其中所述给药剂量或LV颗粒在初免和增强/靶向给药步骤中不同，特别是对上呼吸道的给药剂量可能更高。
55.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于根据权利要求53或54的用途，其中，所述慢病毒载体颗粒是LV::SFL，特别是NILV::SFL，并且所述给药方案包括全身性的初免、特别是肌肉注射初免和对上呼吸道的增强、特别是通过鼻腔注射增强。
56.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述慢病毒载体颗粒是LV::Sprefusion，特别是NILV::Sprefusion，例如LV::S2PΔF(LV::S2deltaF)或NILV::S2PΔF(NILV::S2deltaF)，或LV::S2P3F或NILV::S2P3F，并且给药方案包括全身性的初免、特别是肌肉注射初免和对上呼吸道的增强、特别是通过鼻腔注射增强。
57.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于在受试者的上呼吸道和/或大脑中诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答。
58.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于通过引发B细胞和T细胞应答来诱导肺部和大脑对包括选自SARS-CoV-2祖先株、SARS-CoV-2D614G株和SARS-CoV-1B1.117株的SARS-CoV 2的祖先和对新出现的SARS-CoV-2变体如SARS-CoV2 P.1变体的交叉保护性免疫应答的用途。
59.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于根据权利要求53至58所述的用途，其中，所述剂型或假型慢病毒颗粒包含根据权利要求46至51中任一项所述的假型慢病毒颗粒，其中所述假型慢病毒颗粒是非整合型的。
60.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于根据权利要求53或58所述的用途，以引发针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答，其中所述应答引发SARS-CoV-2S特异性T细胞，特别是包括肺CD8+T细胞和/或产生IFN-γ的T细胞的SARS-CoV-2S特异性T细胞。
61.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于根据权利要求53至60中任一项所述的用途，以引发针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答，其中所述应答引发包含具有效应记忆(Tem)和/或驻留记忆(Trm)表型的T细胞的CD8+T细胞。
62.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于根据权利要求53至61中任一项的用途，所述SARS-CoV-2S特异性T细胞被募集到嗅球。
63.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于根据权利要求53至62中任一项所述的用途，其中所述严重急性呼吸综合征β-冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其衍生物或它们的片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120的氨基酸序列组成。
64.根据权利要求52所述的免疫原性组合物，用于根据权利要求53至63中任一项所述的用途，以预防或减轻受试者中SARS-CoV-2感染相关的炎症。
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