KR20220115943A - 재조합 활성화 유전자 1 (rag1) 중증 복합 면역결핍증 (scid) 을 치료하기 위한 조혈 줄기 세포에서의 렌티바이러스 벡터 - Google Patents
재조합 활성화 유전자 1 (rag1) 중증 복합 면역결핍증 (scid) 을 치료하기 위한 조혈 줄기 세포에서의 렌티바이러스 벡터 Download PDFInfo
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Abstract
본 명세서의 요약
특정 구체예들에서, 재조합-활성화 유전자 1 중증 복합 면역결핍증 (RAG1 SCID) 치료용 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 특정 구체예들에서, 상기 벡터는 RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 유효 단편, 그리고 상기 RAG1유전자의 내생성 프로모터의 유효 단편에 작동가능하도록 연계된 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산 구조체를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
특정 구체예들에서, 재조합-활성화 유전자 1 중증 복합 면역결핍증 (RAG1 SCID) 치료용 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 특정 구체예들에서, 상기 벡터는 RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 유효 단편, 그리고 상기 RAG1유전자의 내생성 프로모터의 유효 단편에 작동가능하도록 연계된 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산 구조체를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
Description
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배경
RAG1 중증 복합 면역결핍증 (RAG1 SCID)은 재조합-활성화 유전자 1 (RAG1)에서 돌연변이에 의해 유발되는 원발성 면역 결핍이다. RAG1 및 RAG2는 B 세포와 T 세포로 불리는 면역계 세포 (림프구)에서 활성이 있는 RAG 복합체의 두 개 소단위다. 이들 세포는 이들의 표면에 외부 침입자를 인지하고, 감염으로부터 신체를 보호하는 단백질을 보유하고 있다. 이러한 단백질은 다양한 물질을 인지할 수 있도록 다양해야 한다. 이러한 단백질들을 만들어내는 유전자들은 가변(V), 다양성(D) 및 연결(J) 세그먼트로 알려진 세그먼트들을 함유한다. 림프구 내에서 단백질을 생산하는 동안, 이러한 유전자 세그먼트들은 상이한 조합으로 재배열되어, 생성된 단백질의 가변성을 증가시킨다. 상기 RAG 복합체는 V(D)J 재조합으로 공지된 이러한 공정에 연루된다.
V(D)J 재조합 동안, 상기 RAG 복합체는 V, D 또는 J 세그먼트 옆에 있는 재조합 신호 서열(RSS)이라고 하는 DNA 섹션에 부착(결합)한다. 상기 RAG 복합체는 세그먼트와 RSS 사이의 DNA를 작은 단편으로 만들고, 이들 세그먼트가 분리되어 유전자의 다른 영역으로 이동할 수 있게 한다. B 세포와 T 세포 내에서 이러한 DNA 재배열 과정은 V, D, J 세그먼트들이 다양한 조합으로 배열되도록 서로 상이한 영역에서 여러 번 반복된다. V(D)J 재조합 후, 일생 동안 생산되는 다양한 단백질은 외부 침입자를 더 잘 인지하게 하고, 신체가 감염과 효율적으로 싸울 수 있도록 한다.
결함이 있는 RAG 복합체는 성숙한 T 세포 및 B 세포(T-B-NK+ 표현형)의 완전한 부재로 인해 중증 복합 면역결핍(SCID)을 초래한다. 환자들은 기능적 적응 면역 체계 없이 태어났으므로, 따라서 생명을 위협하는 감염에 매우 취약하다. RAG1 SCID의 추정 발생률은 1,000,000명당 ~1명꼴(모든 SCID 사례의 ~15-20%)이다.
SCID는 "버블 베이비 질환"으로 흔히 알려져 있는데, 그 이유는 병원체에 대한 노출을 피하기 위해, 조기 중재적 시술로써 멸균 환경으로 신생아의 격리가 연루되기 때문이다. 신생아 SCID 환자들은 일반적으로 생후 첫 일년 이내에 치명적인 감염에 걸린다. 일반적인 치료 표준은 HLA 일치되는 공여자로부터 동종이계 조혈 줄기 세포 이식이다. 그러나, 이 치료는 적합한 일치 공여자를 이용할 수 없고, 면역학적 합병증의 위험이 있기 때문에, 환자에게 실행가능한 옵션이 아니다.
대체 치료 요법은 생체-외 유전자 요법을 사용한 자가 조혈 줄기 세포(HSC) 이식이다. RAG1 렌티바이러스 벡터 개발에서 전-임상 시도에는 흉선에서 T-세포 발달에 있어서 차단 구제에 실패한 EFS-coRAG1-WPRE, 흉선에서 T-세포 발달에 있어서 차단 구제에 실패한 SFFV-RAG1-WPRE, 그리고 T 세포 및 B 세포의 부분적 재구성을 제공하였지만, 그러나 자가반응성 T-세포의 발달로 이어지고, 따라서 Omenn-유사 증후군 (중증 자가면역)의 진행으로 이어지게 되는 UCOE-coRAG1-WPRE가 내포된다 (가령, Pike-Overzet et al. (2011) Leukemia, 25: 1471-1483; van Til et al. (2014) J. Allergy Clin. Immunol. 133(4): 1116-1123 참고).
요약
재조합-활성화 유전자 1 중증 복합 면역결핍증 (RAG1 SCID) 치료용 신규한 렌티바이러스 벡터(들) (LVs)의 개발에 대해 본원에서 기술된다. 구체적으로, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터는 높은-수준, 계통 및 시간-제약적(temporal) 특이적 발현을 위해 RAG1 유전자좌의 내생성 요소들 (또는 이러한 요소들의 유효 단편들에 의해 조절된다.
따라서, 여기에서 고려되는 다양한 구체예에는 다음 중 하나 또는 그 이상이 내포될 수 있지만, 이에 국한될 필요는 없다:
구체예 1: 재조합-활성화 유전자 1 (RAG1) 중증 복합 면역결핍증 치료용 재조합 렌티바이러스 벡터 (LV), 전술한 벡터는 다음을 포함한다:
다음을 포함하는 발현 카세트:
RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 유효 단편을 인코딩하는 핵산;
그리고 RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 전술한 유효한 단편에 작동가능하도록 연계된 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산.
구체예 2: 구체예 1의 벡터, 이때 RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 전술한 유효 단편의 서열은 RAGpro의 서열 (서열 식별 번호:2)을 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
구체예 3: 구체예 2의 벡터, 이때 RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 전술한 유효 단편의 서열은 RAGpro의 서열 (서열 식별 번호:2)로 구성된다.
구체예 4: 구체예 1-3중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 1 (서열 식별 번호: 1) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 5: 구체예 4의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소의 서열은 서열 식별 번호: 1의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 6: 구체예 1-5중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 3 (서열 식별 번호:3) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 7: 구체예 6의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 3의 서열은 서열 식별 번호:3의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 8: 구체예 1-7중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 4 (서열 식별 번호:4) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 9: 구체예 8의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 4의 서열은 서열 식별 번호:4의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 10: 구체예 1-9중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 5 (서열 식별 번호:5) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 11: 구체예 10의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 5의 서열은 서열 식별 번호:5의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 12: 구체예 10의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 5의 서열은 서열 식별 번호:31의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 13: 구체예 1-12중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 6 (서열 식별 번호:6) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 14: 구체예 13의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 6의 서열은 서열 식별 번호:6의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 15: 구체예 1-14중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 7 (서열 식별 번호:7) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 16: 구체예 15의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 7의 서열은 서열 식별 번호:7의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 17: 구체예 1-16중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 8 (서열 식별 번호:8) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 18: 구체예 17의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 8의 서열은 서열 식별 번호:8의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 19: 구체예 1-18중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 9.1 (서열 식별 번호:9) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 20: 구체예 19의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 9.1의 서열은 서열 식별 번호:9의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 21: 구체예 19의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 9.1의 서열은 서열 식별 번호:34의 인핸서 요소 9.1 코어 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 22: 구체예 1-21중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 9.2 (서열 식별 번호:10) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 23: 구체예 22의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 9.2의 서열은 서열 식별 번호:10의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 24: 구체예 1-23중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 10 (서열 식별 번호:11) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 25: 구체예 24의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 10의 서열은 서열 식별 번호:11 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 26: 구체예 1-25중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 11 엑스트라 (서열 식별 번호: 33 ) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 27: 구체예 1-25중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 11 (서열 식별 번호:12) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 28: 구체예 27의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 11의 서열은 서열 식별 번호:12의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 29: 구체예 1-28중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 12 (서열 식별 번호:13) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 30: 구체예 29의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 12의 서열은 서열 식별 번호:13의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 31: 구체예 1-30중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 13 (서열 식별 번호:14) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 32: 구체예 31의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 13의 서열은 서열 식별 번호:14의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 33: 구체예 31의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 13의 서열은 서열 식별 번호:36의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 34: 구체예 1-33중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 14 (서열 식별 번호:15) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 35: 구체예 34의 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 확대된 RAG1 인핸서 요소 14 코어 (서열 식별 번호:32) 또는 이의 유효 단편을 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
구체예 36: 구체예 34의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 14의 서열은 서열 식별 번호:15의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 37: 구체예 1-36중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 16 (서열 식별 번호:16) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 38: 구체예 37의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 16의 서열은 서열 식별 번호:16 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 39: 구체예 1-38중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 17 (서열 식별 번호:17) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 40: 구체예 39의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 17의 서열은 서열 식별 번호:17의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 41: 구체예 1-40중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 18 (서열 식별 번호:18) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 42: 구체예 41의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 18의 서열은 서열 식별 번호:18의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 43: 구체예 41의 벡터, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 18의 서열은 서열 식별 번호:35의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
구체예 44: 구체예 1-43중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 전술한 핵산은 RAG1 cDNA 또는 코돈-최적화된 RAG1 유전자 또는 cDNA이다.
구체예 45: 구체예 44의 벡터, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산을 인코드하는 전술한 핵산은 RAG1 cDNA (서열 식별 번호:19)이다.
구체예 46: 구체예 44의 벡터, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산을 인코드하는 전술한 핵산은 코돈 최적화된 RAG1이다.
구체예 47: 구체예 46의 벡터, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 전술한 핵산의 서열은 jCAT 코돈 최적화된 RAG1, GeneArt 최적화된 RAG1, 및 IDT 최적화된 RAG1로 구성된 군에서 선택된 코돈 최적화된 RAG1이다.
구체예 48: 구체예 1-47중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 벡터는 ψ 영역 벡터 게놈 패키지 신호를 포함한다.
구체예 49: 구체예 1-48중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 벡터는 CMV 인핸서/프로모터를 포함하는 5' LTR을 포함한다.
구체예 50: 구체예 1-49중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 벡터는 Rev 응답 요소 (RRE)를 포함한다.
구체예 51: 구체예 1-50중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 벡터는 중앙 폴리퓨린 지대(tract)를 포함한다.
구체예 52: 구체예 1-51중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 벡터는 전사-후 조절 요소를 포함한다.
구체예 53: 구체예 52의 벡터, 이때 상기 전사-후 조절 요소는 변형된 Woodchuck 전사-후 조절 요소 (WPRE)이다.
구체예 54: 구체예 1-53중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 벡터는 재조합을 통해 야생형 렌티바이러스를 재구성할 능력이 없다.
구체예 55: 구체예 1-54중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 벡터는 T-세포에서 높은 발현을 보인다.
구체예 56: 구체예 1-55중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터, 이때 전술한 벡터는 B-세포에서 높은 발현을 보인다.
구체예 57: 구체예 1의 벡터, 이때 전술한 벡터는 다음으로 구성된 군에서 선택된 벡터 요소들을 포함한다: 1) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG - RAG1pro-RAG-WPRE; 2) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 - RAG1pro-RAG-WPRE; 3) E5 코어, E14 코어, E9.1 OG 큰, E12 OG - RAG1pro-RAG-WPRE; 4) E5 코어, E14 코어, E9.1 OG 큰, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 - RAG1pro-RAG-WPRE; 5) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG + 18 우측, 11 전체, 13 우측 - RAG1pro-RAG-WPRE; 6) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG + 18 전체, 11 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE; 7) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG +18 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE; 8) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 + 18 우측, 11 전체, 13 우측 - RAG1pro-RAG-WPRE; 9) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 + 18 전체, 11 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE; 그리고 10) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 +18 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE.
구체예 58: 구체예 57의 벡터, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함한다.
구체예 59: 구체예 58의 벡터는 서열 식별 번호:37의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체예 60: 구체예 57의 벡터, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함한다.
구체예 61: 구체예 58의 벡터, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호: 38 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체예 62: 구체예 57의 벡터, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 OG 큰, E12 OG - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함한다.
구체예 63: 구체예 58의 벡터, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:39의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체예 64: 구체예 57의 벡터, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 OG 큰, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함한다.
구체예 65: 구체예 58의 벡터, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:40의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체예 66: 구체예 57의 벡터, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG + 18 우측, 11 전체, 13 우측 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함한다.
구체예 67: 구체예 58의 벡터, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:41의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체예 68: 구체예 57의 벡터, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG + 18 전체, 11 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함한다.
구체예 69: 구체예 58의 벡터, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:42의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체예 70: 구체예 57의 벡터, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG +18 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함한다.
구체예 71: 구체예 58의 벡터, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:43의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체예 72: 구체예 57의 벡터, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 + 18 우측, 11 전체, 13 우측 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함한다.
구체예 73: 구체예 58의 벡터, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:44의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체예 74: 구체예 57의 벡터, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 + 18 전체, 11 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함한다.
구체예 75: 구체예 58의 벡터, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:45의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체예 76: 구체예 57의 벡터, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 +18 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함한다.
구체예 77: 구체예 58의 벡터, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:46의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체예 78: 구체예 1-77중 임의의 하나의 구체예에 따른 벡터로 형질도입된 숙주 세포.
구체예 79: 구체예 78의 숙주 세포, 이때 상기 세포는 줄기 세포다.
구체예 80: 구체예 79의 숙주 세포, 이때 전술한 세포는 골수 및/또는 제대혈 및/또는 말초 혈액에서 유래한 줄기 세포다.
구체예 81: 구체예 78의 숙주 세포, 이때 상기 세포는 인간 조혈 전구 세포다.
구체예 82: 구체예 81의 숙주 세포, 이때 상기 인간 조혈 전구 세포는 CD34+ 세포다.
구체예 83: 대상체에서 재조합-활성화 유전자 1 (RAG1) 중증 복합 면역결핍증 (RAG1 SCID)을 치료하는 방법, 전술한 방법은 다음을 포함한다:
전술한 대상체의 줄기 세포 및/또는 전구 세포에 구체예 1-77중 임의의 한 구체예에 따른 벡터를 형질도입시키고; 그리고
전술한 형질도입된 세포 또는 이로부터 유래된 세포를 전술한 대상체에게 이식시키고, 여기에서 전술한 세포들 또는 이로부터 유도체들은 전술한 RAG1 단백질을 발현시킨다.
구체예 84: 구체예 83의 방법, 이때 상기 세포는 줄기 세포다.
구체예 85: 구체예 83의 방법, 이때 전술한 세포는 골수로부터 유래된 줄기 세포다.
구체예 86: 구체예 83의 방법, 이때 상기 세포는 인간 조혈 줄기 세포 및 전구 세포다.
구체예 87: 구체예 86의 방법, 이때 상기 인간 조혈 전구 세포는 CD34+ 세포다.
구체예 88: 다음중 하나 또는 그 이상을 포함하는 재조합 핵산:
RAGpro의 서열 (서열 식별 번호:2)을 포함하거나, 또는 이로 구성된 RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 1 (서열 식별 번호: 1) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 3 (서열 식별 번호:3) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 4 (서열 식별 번호:4) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
확대된 RAG1 인핸서 요소 5 코어 (서열 식별 번호:31) 또는 이의 유효 단편,
RAG1 인핸서 요소 5 (서열 식별 번호:5) 또는 이의 유효 단편; 및/또는 RAG1 인핸서 요소 6 (서열 식별 번호:6) 또는 이의 유효 단편,
RAG1 인핸서 요소 7 (서열 식별 번호:78) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 8 (서열 식별 번호:8) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 9.1 (서열 식별 번호:9) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 9.1 코어 서열 (서열 식별 번호:34) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 9.2 (서열 식별 번호:10) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 10 (서열 식별 번호:11) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 11 엑스트라 (서열 식별 번호: 33 ) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 11 (서열 식별 번호:12) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 12 (서열 식별 번호:13) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 13 (서열 식별 번호:14) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
확대된 RAG1 인핸서 요소 14 코어 (서열 식별 번호:32) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 14 (서열 식별 번호:15) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 16 (서열 식별 번호:16) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 17 (서열 식별 번호:17) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 18 (서열 식별 번호:18) 또는 이의 유효 단편.
구체예 89: 구체예 88의 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 유전자의 내생성 프로모터(서열 식별 번호:2)의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함한다.
구체예 90: 구체예 88-89중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 1 (서열 식별 번호: 1) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 91: 구체예 88-90중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 3 (서열 식별 번호:3) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 92: 구체예 88-91중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 4 (서열 식별 번호:4) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 93: 구체예 88-92중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 확대된 RAG1 인핸서 요소 5 코어 (서열 식별 번호:31) 또는 이의 유효 단편을 포함한다.
구체예 94: 구체예 88-92중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 5 (서열 식별 번호:5) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 95: 구체예 88-94중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 6 (서열 식별 번호:6) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 96: 구체예 88-95중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 7 (서열 식별 번호:78) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 97: 구체예 88-96중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 8 (서열 식별 번호:8) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 98: 구체예 88-97중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 9.1 (서열 식별 번호:9) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 99: 구체예 88-98중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 9.2 (서열 식별 번호:10) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 100: 구체예 88-99중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 10 (서열 식별 번호:11) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 101: 구체예 88-100중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 11 (서열 식별 번호:12) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 102: 구체예 88-101중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 12 (서열 식별 번호:13) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 103: 구체예 88-102중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 13 (서열 식별 번호:14) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 104: 구체예 88-103중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 확대된 RAG1 인핸서 요소 14 코어 (서열 식별 번호:32) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 105: 구체예 88-103중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 14 (서열 식별 번호:15) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 106: 구체예 88-105중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 16 (서열 식별 번호:16) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 107: 구체예 88-106중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 17 (서열 식별 번호:17) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 108: 구체예 88-107중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 18 (서열 식별 번호:18) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
구체예 109: 구체예 88-108중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 발현 카세트를 포함한다.
구체예 110: 구체예 109의 핵산, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산을 포함한다.
구체예 111: 구체예 110의 핵산, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 전술한 핵산은 RAG1 cDNA를 포함한다.
구체예 112: 구체예 110의 핵산, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 전술한 핵산은 코돈-최적화된 RAG1 cDNA를 포함한다.
구체예 113: 구체예 110-112중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 전술한 핵산은 내생성 RAG1 프로모터 또는 이의 유효 단편에 작동가능하도록 연계된다.
구체예 114: 구체예 110-113중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 구체예 1-77중 임의의 한 항에 따른 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
구체예 115: 구체예 88-114중 임의의 하나의 구체예에 따른 핵산, 이때 전술한 핵산은 내생성 RAG1 유전자를 포함하지 않는다.
정의.
"프로모터"란 유전자 (가령, 프로모터에 작동가능하도록 연결된 유전자)의 전사를 개시하는데 요구되는 핵산에 있는 조절 서열을 지칭한다.
"인핸서"란 전사 인자라고 하는 특정 단백질에 결합될 때, 이와 연합된 유전자의 전사를 향상시키는 조절 DNA 서열을 지칭한다.
프로모터와 관련하여 사용될 때 "유효 단편(가령, RAG1 프로모터의 유효 단편)"이란 해당 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자(가령, RAG1)의 전사를 개시하기에 충분한 전장-프로모터의 단편을 지칭한다.
인핸서와 관련하여 "유효 단편" (가령, RAG1 인핸서의 유효한 단편)이란 전사 인자에 의해 결합될 때, 작동가능하게 연결된 유전자의 조절 발현을 충분하게 제공하는, 전장 인핸서의 단편을 지칭한다. 특정 구체예들에서, 상기 조절은 전장 인핸서에 의해 제공되는 발현 수준 및/또는 계통에 있어서 필적한다.
"작동가능하게 연계된"이라는 용어는 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치하는 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들면, 프로모터는 유전자의 전사를 개시하도록 허용하는 위치에 그 프로모터가 위치할 때, 해당 유전자에 작동가능하게 연계된 것이다. 인핸서는 해당 인핸서가 적절한 전사 인자에 의해 결합되어, 유전자의 발현을 조절할 수 있을 때(예를 들어, 상향조절) 해당 유전자에 작동 가능하게 연계된 것이다.
"재조합"은 단일 서열의 일부로서 함께 자연적으로 발생하지 않거나, 또는 자연 발생 서열에 대해 재배열된 부분을 포함하는 핵산 서열을 지칭하기 위해 관련 기술분야에서 그의 용법과 일관되게 사용된다. 재조합 핵산은 사람이 수작업을 포함하는 과정에 의해 생성되고 및/또는 사람의 수작업에 의해 생성된 핵산으로부터 창출된다 (예를 들어, 복제, 증폭, 전사 등의 하나 또는 그 이상의 사이클에 의해). 재조합 바이러스는 재조합 핵산을 포함하는 바이러스다. 재조합 세포는 재조합 핵산을 포함하는 세포다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 렌티바이러스 벡터" 또는 "재조합 LV"란 인간의 개입 및 조작의 결과로 LV 및 다수의 추가 단편으로부터 어셈블리된 인위적으로 생성된 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다.
"유효량"은 치료되지 않은 환자에 비교하였을 때, 질환의 증상을 개선하거나 또는 제거하기 위한 필요 제제 또는 이 제제를 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 질환의 치료요법적 처치를 위해 본원에 기술된 방법을 실행하는 데 사용되는 조성물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상의 연령, 체중 및 일반적인 건강에 따라 달라진다. 궁극적으로, 주치의 또는 수의사가 적절한 양과 투여 요법을 결정할 것이다. 이러한 양을 "유효한" 양이라고 부른다.
도면의 간단한 설명
도 1은 내생성 RAG1 인핸서 요소를 평가하기 위해 이용된 벡터를 도시한다.
도 2는 내생성 RAG1 인핸서 요소들을 평가하는데 이용된 바코드(BC)를 함유하는 벡터를 도시한다.
도 3은 바코드화되지 않은 RAG1 벡터로 형질도입된 NALM6 세포 (프레-B 세포 계통)에서의 발현 수준을 나타낸다.
도 4는 바코드화된 RAG1 벡터로 형질도입된 NALM6 세포 (프레-B 세포 계통)에서의 발현 수준을 나타낸다.
도 5는 NALM6 세포에서 싱글플렉스(singleplex) 형질도입된 바코드화된 벡터의 설정을 도시한다.
도 1은 내생성 RAG1 인핸서 요소를 평가하기 위해 이용된 벡터를 도시한다.
도 2는 내생성 RAG1 인핸서 요소들을 평가하는데 이용된 바코드(BC)를 함유하는 벡터를 도시한다.
도 3은 바코드화되지 않은 RAG1 벡터로 형질도입된 NALM6 세포 (프레-B 세포 계통)에서의 발현 수준을 나타낸다.
도 4는 바코드화된 RAG1 벡터로 형질도입된 NALM6 세포 (프레-B 세포 계통)에서의 발현 수준을 나타낸다.
도 5는 NALM6 세포에서 싱글플렉스(singleplex) 형질도입된 바코드화된 벡터의 설정을 도시한다.
상세한 설명
각종 구체예들에서, 재조합-활성화 유전자 1 중증 복합 면역결핍증 (RAG1 SCID) 치료 (또는 예방) 를 위한 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 특정 구체예들에서, 상기 벡터는 해당 벡터 크기를 줄이고, 발현 수준 및 역가를 증가시키도록 최적화된다. 추가적으로, 각종 구체예들에서, 상기 벡터, 가령, 본원에서 기술된 바와 같이, 고유의 RAG1 유전자의 발현 패턴의 개요를 나타낸다.
특히, 생물정보학적 분석 (공개적으로 사용 가능한 데이터베이스 사용: Project Encode, Ensembl, FANTOM, VISTA 인핸서 Browser, GeneHancer)은 고유의 RAG1 유전자의 내생성 조절 요소를 밝히는데 이용되었다. 18개의 추정 인핸서 요소들이 400,000개 염기쌍 원도우 내에 있는 것으로 확인되었다. 18개의 추정 인핸서 요소의 하위집단은 각각 T 세포 및 B 세포 발달 전반에 걸쳐 특정 시점에서 RAG1 발현을 담당하는 것으로 여겨지며, 이들 요소의 다양한 조합은 치료요법적으로 유효한 수준에서 고유의 RAG1 유전자의 발현 패턴을 개략적으로 설명할 수 있는 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 제공하기 위해, 발현 카세트에 통합될 수 있다.
RAG1 유전자를 조절하는 중요한 인핸서 요소를 확인하기 위해, 각 추정 인핸서 요소를 내생성 RAG1 프로모터의 상류에 클론시켜, 리포터(mCitrine)의 발현을 유도했다 (가령, 도 1 참고). 18개 요소 모두를 함유하는 벡터가 또한 클론되었다 (가령, 도 1 참고). 다른 전-임상 RAG1 벡터들을 대조군으로 사용했다. 벡터의 복제 세트는 멀티플렉싱을 허용하기 위해, 3' 비-해독 영역(3'UTR)에서 독특한 15개 뉴클레오티드 바코드를 함유하도록 재-클로닝되었다 (가령, 도 2참고). 각 벡터는 총 42개의 새로운 벡터에 대해 2개의 독특한 바코드를 포함하도록 클론되었다.
각종 구체예들에서, 확인된 조절 요소(가령, 인핸서)의 다양한 조합을 포함하는 발현 카세트 및/또는 이러한 발현 카세트를 포함하는 벡터가 제공된다. 따라서, 특정 구체예들에서, 재조합-활성화 유전자 1 (RAG1) 중증 복합 면역결핍증 치료용 재조합 렌티바이러스 벡터 (LV)가 제공되며, 여기에서 상기 벡터는 다음을 포함하는 발현 카세트를 포함한다: 1) RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 유효 단편을 인코딩하는 핵산; 그리고 2) RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 유효 단편에 작동가능하도록 연계된 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 내생성 RAG1 프로모터 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 1 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 2 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 3 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 4 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 5 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 6 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 7 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 8 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 9.1 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 9.2 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 10 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 11 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 12 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 13 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 14 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 16 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 17 또는 이의 유효 단편, 및/또는 RAG1 인핸서 18 또는 이의 유효 단편 (가령, 표 1 참고)을 포함한다.
특정 구체예들에서, RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 전술한 유효 단편의 서열은 RAGpro의 서열 (서열 식별 번호:2)을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 특정 구체예들에서, RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 전술한 유효 단편의 서열은 RAGpro의 서열 (서열 식별 번호:2)로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 1 (서열 식별 번호: 1) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소는 서열 식별 번호: 1의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 3 (서열 식별 번호:3) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 3의 서열은 서열 식별 번호:3의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 4 (서열 식별 번호:4) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 4의 서열은 서열 식별 번호:4의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 5 (서열 식별 번호:5) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 5의 서열은 서열 식별 번호:5의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 6 (서열 식별 번호:6) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 6의 서열은 서열 식별 번호:6의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 7 (서열 식별 번호:7) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 7의 서열은 서열 식별 번호:7의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 8 (서열 식별 번호:8) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 8의 서열은 서열 식별 번호:8의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 9.1 (서열 식별 번호:9) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 9.1의 서열은 서열 식별 번호:9의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 9.2 (서열 식별 번호:10) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 9.2의 서열은 서열 식별 번호:10의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 10 (서열 식별 번호:11) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 10의 서열은 서열 식별 번호:11의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 11 (서열 식별 번호:12) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 11의 서열은 서열 식별 번호:12의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 12 (서열 식별 번호:13) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 12의 서열은 서열 식별 번호:13의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 13 (서열 식별 번호:14) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 13의 서열은 서열 식별 번호:14의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 14 (서열 식별 번호:15) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 14의 서열은 서열 식별 번호:15의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 16 (서열 식별 번호:16) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 16의 서열은 서열 식별 번호:16의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 17 (서열 식별 번호:17) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 17의 서열은 서열 식별 번호:17의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, 상기 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 18 (서열 식별 번호:18) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 RAG1 인핸서 요소 18의 서열은 서열 식별 번호:18의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된다.
특정 구체예들에서, RAG1 단백질을 인코드하는 핵산은 RAG1 cDNA 또는 코돈-최적화된 RAG1 유전자 또는 cDNA이다. 특정 구체예들에서, RAG1 단백질을 인코드하는 핵산은 RAG1 cDNA (표 1에서 서열 식별 번호:19)이다. 특정 구체예들에서, RAG1 단백질을 인코드하는 핵산은 코돈 최적화된 RAG1이다. 특정 구체예들에서, RAG1 단백질을 인코드하는 핵산의 서열은 jCAT 코돈 최적화된 RAG1, GeneArt 최적화된 RAG1, 및 IDT 최적화된 RAG1로 구성된 군에서 선택된 코돈 최적화된 RAG1이다.
렌티바이러스 벡터와 관련하여 본원에 기재된 발현 카세트를 이러한 용도로 국한시킬 필요는 없다는 것도 인지될 것이며, RAG1 단백질의 발현이 필요한 경우 본질적으로 임의의 다른 구조체(가령, CRISPR 구조체)에 통합될 수 있다. 따라서, 특정 구체예들에서, 본원에 기술된 발현 카세트 구성요소들을 포함하는 핵산 구조체가 고려된다.
표 1. 본원에서 기술된 바와 같이, RAG1 SCID 치료용 렌티바이러스 벡터의 다양한 구성요소들의 핵산 서열.
각종 구체예들에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터(LV)는 예를 들어, 인슐레이터(insulator) (가령, 3'LTR에서 FB 인슐레이터)의 존재를 비롯한, 다양한 "안전성" 특징을 가질 수 있다. 추가적으로, 또는 대안으로, 특정 구체예들에서, HIV LTR은 패키지 동안 HIV TAT 단백질의 함입(inclusion)없이, 더 높은 역가 벡터를 생성하기 위해, 대체 프로모터(가령, CMV 프로모터, 가령, 서열 식별 번호:21 참고)로 치환되었다. 다른 강력한 프로모터 (가령, RSV 및 이와 유사한 것들)도 또한 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 각종 구체예들에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터에서 전형적으로 발현되는 요소들중 임의의 하나 또는 그 이상의 요소를 함유한다. 이러한 요소들에는 ψ 영역 벡터 게놈 패키지 신호(가령, 서열 식별 번호:23 참고), Rev 응답 요소 (RRE)(가령, 서열 식별 번호:24 참고), 폴리퓨린 지대 (가령, 중앙 폴리퓨린 지대(가령, 서열 식별 번호:26 참고), 3' 폴리퓨린 지대, 등등), 전사-후 조절 요소 (가령, 변형된 Woodchuck 전사-후 조절 요소 (WPRE)(가령, 서열 식별 번호:25 참고)), 인슐레이터, 및 이와 유사한 것들 (가령, 하기에서 기술된 바와 같은)이 내포되지만, 이에 국한될 필요는 없다.
각종 구체예들에서, 상기 벡터는 재조합을 통하여 야생형 렌티바이러스를 실질적으로 재구성시킬 능력이 없는 SIN 벡터다.
상기, 실시예 1에서 나타낸 바와 같이, 본원에 기술된 벡터는 세포에 높은 역가로 형질도입되고, RAG1 단백질을 인코딩하는 핵산의 높은 발현 수준을 제공하는 데 효과적인 것으로 여겨진다.
이러한 결과의 관점에서, 본원에 기술된 LVs, 예를 들어, RAG1 단백질을 인코딩하는 핵산을 발현하는 재조합 TAT-독립적 SIN LVs는 대상체 (예를 들어, 인간 및 인간이 아닌 포유동물)에서 RAG1 SCID를 효과적으로 치료하는데 이용될 수 있다. 이들 벡터는 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, RAG1 SCID를 갖는 것으로 확인된 대상체로 도입될 수 있는 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 및 전구 세포)의 변형에 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. 더욱이, 생성된 세포는 대상체 건강의 상당한 개선을 입증된 유전자삽입된(transgenic) RAG1 단백질을 충분하게 만들 것으로 여겨진다. 또한, 상기 벡터는 표적(예를 들어, 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포)의 생체내 형질도입을 달성하기 위해 대상체에게 직접 투여될 수 있고, 이로 인하여 이를 필요로 하는 대상체의 치료에 또한 영향을 미칠 수 있다고 여겨진다.
전술한 바와 같이, 각종 구체예들에서, 본원에서 기술된 LVs는 다양한 안전성 특징들을 포함할 수 있다. 예를 들면, HIV LTR은 패키지 동안 HIV TAT 단백질의 함입없이, 더 높은 역가 벡터를 생성하기 위해 CMV 프로모터로 치환되었다. 특정 구체예들에서, 인슐레이터 (가령, FB 인슐레이터)는 안전성을 위해 3'LTR에 도입될 수 있다. 상기 LVs는 또한 효율적인 형질도입과 높은 역가를 제공하도록 구성된다.
전술한 요소들은 예시적인 것이며, 이들에 국한시킬 필요가 없다는 것이 이해될 것이다. 여기에 제공된 교시의 관점에서, 이들 요소에 대한 적절한 대체는 당업자에 의해 인지될 것이고, 여기에 제공된 교시의 범위 내에서 고려될 것이다.
RAG1 코돈 최적화.
전술한 바와 같이, 각종 구체예들에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 RAG1 유전자 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 그러나, 특정 구체예들에서, RAG1 단백질을 인코딩하는 핵산이 코돈-최적화된다. 수많은 코돈 최적화 방법이 당업자에게 알려져 있다. 한 가지 예시적인 방법은 JCat(Java Codon Adaptation Tool)이다. jCAT 도구는 대부분의 서열화된 원핵생물 및 다양한 진핵생물 유전자 발현 숙주에 유전자 코돈 용도를 개작한다. 많은 도구와 달리, JCat은 고도로 발현된 유전자를 수작업으로 특정할 필요가 없으므로, 매우 빠르고 쉬운 방법이다. 코돈 적응을 위한 JCat의 추가 옵션에는 제한 효소 및 Rho-독립적인 전사 종결자에 대한 원치 않는 절단 부위의 회피가 내포된다. JCat은 그래픽으로 그리고 입력 서열과 새로이 개작된 서열에 대해 주어진 코돈 개작 지수(CAI) 값으로 출력된다. JCat 최적화는 Grote et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33(suppl 2): W526-W531)에서 기술되며, JCat 도구는 온라인에서(www.jcat.de) 이용가능하다.
또다른 코돈 최적화 도구는 GeneArt (ThermoFisher Scientific®)에서 제공된다.
또다른 코돈 최적화 도구는 IDT이다. IDT 코돈 최적화 도구는 새로운 유기체에서 각 코돈의 사용 빈도를 기반으로 코돈 사용을 재할당함으로써, 한 유기체로부터 유래된 DNA 또는 단백질 서열을 다른 유기체에서 발현하도록 최적화하기 위해 개발되었다. 예를 들면, 발린은 4가지 상이한 코돈 (GUG, GUU, GUC, 및 GUA)에 의해 인코드된다. 그러나, 인간 세포주에서, GUG 코돈이 선호적으로 이용된다 (차례로 46% 사용 대비 18, 24, 및 12%). 상기 코돈 최적화 도구는 이 정보를 고려하여, 동일한 빈도로 발린 코돈을 할당한다. 또한, 이러한 도구 알고리즘은 빈도가 10% 미만인 코돈을 제거하고, 나머지 빈도를 100%로 다시-정규화시킨다. 또한, 최적화 도구는 제조 및 하류 발현, 이를 테면, 반복부, 머리핀 및 비정상적(extreme) GC 함량을 방해할 수 있는 복잡성을 줄인다. IDT 최적화 도구는 IDT(Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa)에서 구할 수 있으며 www.idtdna.com/CodonOpt에서 찾을 수 있다.
기타 코돈 최적화 도구에는 codonw.sourceforge.net에서 찾을 수 있는 CodonW 오픈 소스 소프트웨어 프로그램과 GenScript의 OptimumGeneTM 알고리즘이 내포되지만, 이에 국한되지 않는다.
이러한 코돈 최적화는 예시이며, 이에 국한되지 않는다. 본원과 실시예 1에 제공된 교시를 사용하여, RAG1 코돈 사용은 특정 응용 분야에 쉽게 최적화될 수 있다.
TAT-독립적 및 자가 비활성화 렌티바이러스 벡터.
안전성을 추가로 개선하기 위해, 각종 구체예들에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 TAT-독립적 자가-비활성화(SIN) 배치구성을 포함한다. 따라서, 각종 구체예들에서, 야생형 LTR에 비교하여, 감소된 프로모터 활성을 갖는 LTR 영역을 본원에 기재된 LVs에서 사용하는 것이 바람직하다. 생물학적 안전성 특징을 제공하는 효과적인 "자가- 비활성화"(SIN)인 그러한 구조체가 제공될 수 있다. SIN 벡터는 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생성이 크게 감소하거나, 또는 완전히 사라진 벡터다. 이 특징으로 복제-기능있는 재조합체(RCRs)의 출현 위험이 최소화된다. 또한, 이것은 벡터 통합 부위에 인접하여 위치한 세포 코딩 서열이 비정상적으로 발현될 위험을 감소시킨다.
또한, SIN 디자인은 LTR과 이식유전자의 발현을 유도하는 프로모터 간의 간섭 가능성을 줄인다. SIN LVs는 내부 프로모터의 완전한 활성을 종종 허용할 수 있다.
SIN 디자인은 LVs의 생물학적 안전성을 증가시킨다. HIV LTR의 대부분은 U3 서열로 구성된다. 상기 U3 영역은 감염된 세포에서 그리고 세포 활성화에 대한 반응으로 HIV 게놈의 기저 및 유도된 발현을 조절하는 인핸서 및 프로모터 요소를 함유한다. 이러한 프로모터 요소들 중 몇 가지는 바이러스 복제에 필수적이다. 인핸서 요소들 중 일부는 바이러스 분리물 중에서 상당히 보존되어 있으며, 바이러스 발병의 중요한 독성 인자로 연루되어 있었다. 인핸서 요소들은 해당 바이러스의 상이한 세포 표적에서 복제 속도에 영향을 미치도록 작용할 수 있다.
바이러스 전사가 5' LTR의 U3 영역의 3' 말단에서 시작되기 때문에, 이들 서열은 바이러스 mRNA의 일부가 아니며, 3' LTR로부터 이의 사본들은 통합된 프로바이러스에서 양쪽 LTR의 생성을 위한 주형으로 작용한다. 상기 U3 영역의 3' 사본이 레트로바이러스 벡터 구조체에서 변경되면, 이 벡터 RNA는 생산자 세포의 무손상 5' LTR에서 여전히 생성되지만, 그러나 표적 세포에서는 재생될 수 없다. 이러한 벡터의 형질도입은 자손 바이러스에서 양쪽 LTR의 비활성화를 초래한다. 따라서, 레트로바이러스는 자가-비활성화(SIN)이며, 이러한 벡터는 SIN 전달 벡터로 알려져 있다.
특정 구체예들에서, 자가-비활성화는 벡터 DNA, 즉, 벡터 RNA 생산에 사용되는 DNA의 3' LTR의 U3 영역에 결실을 도입함으로써 이루어진다. RT 동안, 이러한 결실은 프로바이러스 DNA의 5' LTR로 전달된다. 일반적으로, LTR의 전사 활성을 크게 감소시키거나, 또는 모두 없애기 위해, U3 서열의 상당 부분을 제거하는 것이 바람직하며, 이로 인하여 형질도입된 세포들에서 전장 벡터 RNA의 생산을 크게 감소시키거나, 또는 사라진다. 그러나, U3, R 및 U5에 걸쳐 퍼져 있는 기능인, 바이러스 RNA의 폴리아데닐화와 관련된 LTR의 요소들은 유지되는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 특정 구체예들에서, 폴리아데닐화 결정자를 살리면서, 한편으로 LTR로부터 전사적으로 중요한 모티프들중 많은 것들을 제거하는 것이 바람직하다.
SIN 디자인은 Zufferey et al. (1998) J Virol. 72(12): 9873-9880, 및 U.S. 특허 번호: 5,994,136에서 상세하게 기술하고 있다. 본원에서 기술된 바와 같이, 그러나, 3' LTR에서 결손 범위에 제한이 있다. 첫째, U3 영역의 5' 단부는 벡터 전달에서 또다른 필수 기능을 하는데, 이는 통합에 필요하다(말단 디뉴클레오티드+att 서열). 따라서, 말단 디뉴클레오티드 및 att 서열은 U3 서열의 5' 경계를 나타낼 수 있고, 이들은 결실될 수 있다. 또한, 일부 막연하게 특정된 영역은 R 영역에서 하류 폴리아데닐화 부위의 활성에 영향을 미칠 수 있다. 3'LTR에서 U3 서열의 과도한 결실은 벡터 전사체의 폴리아데닐화를 감소시킬 수 있으며, 생산자 세포의 벡터 역가 및 표적 세포의 이식유전자 발현 모두에 악영향을 미칠 수 있다.
추가 SIN 디자인은 미국 특허 공개 번호: 2003/0039636에 설명되어 있다. 본원에서 기술된 바와 같이, 특정 구체예들에서, LTRs에서 제거된 렌티바이러스 서열은 비-렌티바이러스 레트로바이러스의 필적하는 서열로 대체되고, 이로 인하여 하이브리드 LTRs이 형성된다. 특히, LTR 내의 렌티바이러스 R 영역은 전체 또는 부분적으로, 비-렌티바이러스 레트로바이러스의 R 영역으로 대체될 수 있다. 특정 구체예들에서, 바이러스 복제를 향상시키기 위해, TAT 단백질과 상호작용하는 서열인 렌티바이러스 TAR 서열은 바람직하게는, R 영역으로부터 전체적으로 제거된다. 그런 다음, TAR 서열은 비-렌티바이러스 레트로바이러스의 R 영역의 필적되는 부분으로 대체되고, 이로 인하여 하이브리드 R 영역이 형성된다. LTRs는 렌티바이러스 U3 영역과 U5 영역의 전부 또는 일부를 제거하고, 및/또는 비-렌티바이러스 서열로 대체하도록 추가로 변형될 수 있다.
따라서, 특정 구체예들에서, SIN 배치구성은 TAR 서열의 전부 또는 일부가 결여되고, 이로 인하여 TAT에 의한 임의의 가능한 활성화가 제거된, 하이브리드 렌티바이러스 R 영역을 포함하는 레트로바이러스 LTR을 제공하고, 이때 TAR 서열 또는 이의 일부분은 비-렌티바이러스 레트로바이러스로부터의 R 영역의 필적하는 부분으로 대체되고, 이로 인하여 하이브리드 R 영역이 형성된다. 특정 구체예에서, 상기 레트로바이러스 LTR은 하이브리드 R 영역을 포함하고, 이때 상기 하이브리드 R 영역은 TAR 서열이 결여된 HIV R 영역의 일부분 (가령, US 2003/0039636에서 서 식별 번호: 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이로 구성된 일부분)와 HIV R 영역에서 TAR 서열이 결여된 필적하는 MoMSV R 영역의 일부분 (가령, 2003/0039636에서 서열 식별 번호: 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이로 구성된 일부분)을 포함한다. 또다른 특정 구체예에서, 전체 하이브리드 R 영역은 2003/0039636에서 서열 식별 번호: 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이로 구성된다.
상기 R 영역이 유래될 수 있는 적합한 렌티바이러스에는 예를 들면, HIV (HIV-1 및 HIV-2), EIV, SIV 및 FIV이 내포된다. 비-렌티바이러스 서열이 유래될 수 있는 적합한 레트로바이러스에는 예를 들면, MoMSV, MoMLV, Friend, MSCV, RSV 및 스푸마바이러스(Spumaviruses)가 내포된다. 하나의 예시적인 구체예에서, 상기 렌티바이러스는 HIV이며, 상기 비-렌티바이러스 레트로바이러스는 MoMSV이다.
US 2003/0039636에서 기술된 또다른 구체예에서, 하이브리드 R 영역을 포함하는 LTR은 좌측 (5') LTR이며, 상기 하이브리드 R 영역의 상류 프로모터 서열을 더 포함한다. 바람직한 프로모터는 비-렌티바이러스 기원이며, 예를 들면, 비-렌티바이러스 레트로바이러스의 U3 영역 (가령, MoMSV U3 영역)이 내포된다. 하나의 특정 구체예에서, 상기 U3 영역은 US 2003/0039636에서 서열 식별 번호: 12의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 좌측 (5') LTR은 상기 하이브리드 R 영역의 하류 렌티바이러스 U5 영역을 더 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 U5 영역은 게놈 통합에 필요한 HIV att 부위가 내포된 HIV U5 영역이다. 또다른 구체예에서, 상기 U5 영역은 US 2003/0039636에서 서열 식별 번호: 13의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여전히 또다른 구쳉예에서, 전체적으로 좌측 (5') 하이브리드 LTR은 US 2003/0039636에서 서열 식별 번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 예시적인 구체예에서, 하이브리드 R 영역을 포함하는 LTR은 우측 (3') LTR이며, 상기 하이브리드 R 영역의 상류 변형된 (가령, 절두된) 렌티바이러스 U3 영역을 더 포함한다. 상기 변형된 렌티바이러스 U3 영역은 att 서열을 포함할 수 있지만, 프로모터 활성을 갖는 서열은 결여되어 있고, 이로 인하여, SIN이 되며, 염색체 통합 후, 바이러스 전사는 첫 번째 복제 라운드를 넘어갈 수 없게 된다. 특정 구체예에서, 상기 하이브리드 R 영역의 상류 변형된 렌티바이러스 U3 영역은 상기 렌티바이러스 U3 att 부위까지, 이를 포함하여, 렌티바이러스 (가령, HIV)의 U3 영역의 3' 단부로 구성된다. 하나의 구체예에서, 상기 U3 영역은 US 2003/0039636에서 서열 식별 번호: 15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 우측 (3') LTR은 상기 하이브리드 R 영역의 하류 폴리아데닐화 서열을 더 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 폴리아데닐화 서열은 US 2003/0039636에서 서열 식별 번호: 16의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여전히 또다른 구쳉예에서, 상기 전체적으로 우측 (5') LTR은 US 2003/0039636에서 서열 식별 번호: 2 또는 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
따라서, HIV 기반 LV의 경우, 이러한 벡터는 벡터 역가의 상당한 감소 없이, LTR TATA 상자의 제거(예: -418에서 -18까지 삭제)를 비롯하여, 상당한 U3 결실을 용인한다는 것이 발견되었다. 이들 결실로 LTR 영역이 실질적으로 전사 불활성화되고, 이때 LTR의 전사 능력이 약 90% 또는 그 이하로 감소된다.
전달 벡터 구조체에서 상류 LTR의 일부가 구성적으로 활성인 프로모터 서열로 대체되면, Tat의 트란스-작용 기능이 불필요하게 된다는 것이 또한 입증되었다(가령, Dull et al. (1998) J Virol. 72(11): 8463-8471 참고). 더욱이, 우리는 트란스에서 rev의 발현으로 gag 및 pol만을 함유하는 gag 및 pol만을 포함하는 패키징 구조체로부터 고-역가 HIV-유래된 벡터 스톡의 생산이 허용됨을 우리는 보여준다. 이 디자인은 오로지 생산자 세포에서만 사용할 수 있는 보체에 대한 조건부 포장 기능의 발현을 만든다. 생성된 유전자 전달 시스템은 HIV-1의 9개 유전자 중 3개만 보존하고, 형질도입 입자의 생산을 위해 4개의 개별 전사 단위에 의존한다.
실시예 1에서 예시된 하나의 구체예에서, RAG1 단백질을 인코딩하는 핵산을 발현시키는 카세트는 5' LTR에서 치환된 CMV 인핸서/프로모터를 갖는 SIN 벡터다.
CMV 프로모터는 전형적으로 높은 수준의 비-조직 특이적 발현을 제공한다는 것을 인지할 것이다. 유사한 구조적 활성을 갖는 다른 프로모터에는 RSV 프로모터 및 SV40 프로모터가 내포되지만, 이에 국한되지는 않는다. 포유류 프로모터, 이를 테면, 베타-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 신장 인자 1α 프로모터, 튜불린 프로모터, 등등이 또한 사용될 수 있다.
전술한 SIN 배치구성은 예시이며, 이에 국한되지 않는다. 다수의 SIN 배치구성들이 당업자에게 알려져 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 특정 구체예에서, LTR 전사는 약 95% 내지 약 99% 감소된다. 특정 구체예들에서, LTR은 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95% 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 전사적으로 비활성화될 수 있다.
인슐레이터(insulator) 요소
특정 구체예들에서, 생물학적 안전성을 더 향상시키기 위해, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터에 인슐레이터가 삽입된다. 인슐레이터는 게놈 전체에 존재하는 DNA 서열 요소다. 인슐레이터는 염색질을 변형시키고, 영역별 유전자 발현을 변경시키는 단백질에 결합한다. 본원에 기술된 벡터에 인슐레이터를 배치시키면, 그중에서도 특히 다음을 비롯한, 다양한 잠재적 이점이 제공된다: 1) 측면 염색체에 의한 발현 변이의 위치적 영향으로부터 벡터를 보호 (즉, 방벽 활성); 그리고 2) 상기 벡터에 의한 유전자 발현의 삽입적 트랜스-활성화로부터 측면 염색체 보호 (인핸서 차단). 따라서, 인슐레이터는 게놈 또는 유전적 맥락에 내재된 유전자 또는 전사체 단위의 독립적 기능을 보존하는 데 도움이 될 수 있고, 이때 그렇지 않으면 발현이 게놈 또는 유전적 맥락 내에서 조절 신호에 의해 영향을 받는 경우가 있을 수 있다 (가령, Burgess-Beusse et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 16433; 그리고 Zhan et al. (2001) Hum. Genet., 109: 471). 현재 맥락에서, 인슐레이터는 통합 부위 영향으로부터 렌티바이러스-발현된 서열 보호에 기여할 수 있고, 이는 게놈 DNA에 존재하는 시스-작용 요소들에 의해 매개될 수 있고, 전달된 서열의 탈조절된 발현으로 이어질 수 있다. 각종 구체예들에서, 인슐레이터 서열이 LTR 중 하나 또는 양쪽 모두에 삽입되거나, 또는 세포 게놈에 통합되는 벡터 영역의 도처에 삽입된 LVs가 제공된다.
처음으로, 그리고 가장 잘 특성화된 척추동물 염색질 인슐레이터는 닭 β-글로빈 유전자좌 제어 영역 내에 위치한다. DNase-I 과민성 부위-4 (cHS4)를 함유하는 이 요소는 닭 β-글로빈 유전자좌의 5' 경계를 구성하는 것으로 보인다 (Prioleau et al. (1999) EMBO J. 18: 4035-4048). cHS4 요소를 함유하는 1.2-kb 단편은 전통적인 인슐레이터 활성을 도시하는데, 이런 활성에는 세포주에서 글로빈 유전자 프로모터와 인핸서의 상호작용을 차단하는 능력 (Chung et al. (1993) Cell, 74: 505-514), 초파리(Id.) 형질변환된 세포주 (Pikaart et al. (1998) Genes Dev. 12: 2852-2862), 및 유전자삽입된 포유류 (Wang et al. (1997) Nat. Biotechnol., 15: 239-243; Taboit-Dameron et al. (1999) Transgenic Res., 8: 223-235)에서 위치 영향으로부터 발현 카세트를 보호하는 능력이 내포된다. 이 활동의 대부분은 250-bp 단편에 함유되어 있다. 인핸서-차단 분석(Bell et al. (1999) Cell, 98: 387-396)에 연루된 아연 핑거 DNA 결합 단백질 CTCF와 상호 작용하는 49-bp cHS4 코어도 이 범위 안에 있다 (Chung et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94: 575-580).
한 가지 예시적이며, 적합한 인슐레이터는 FB (FII/BEAD-A), 77 bp 인슐레이터 요소이고, 이것은 닭 β-글로빈 5' HS4 인슐레이터의 최소 CTCF 결합 부위 인핸서-차단 성분들과 인간 T-세포 수용체 알파/델타 차단 요소 알파/델타 I(BEAD-I) 인슐레이터의 상동 영역(Ramezani et al. (2008) Stem Cell 26: 3257-3266에 기술됨)을 함유한다. FB "합성" 인슐레이터는 완전한 인핸서 차단 활성을 갖는다. 이 인슐레이터는 예시이며, 이에 국한되지 않는다. 기타 적합한 인슐레이터가 이용될 수 있는데, 여기에는 예를 들면, 전장의 닭 베타-글로빈 HS4 또는 이의 인슐레이터 하위-단편들, 안키린(ankyrin) 유전자 인슐레이터, 및 기타 합성 인슐레이터 요소들이 내포된다.
패키지 신호.
각종 구체예들에서, 본원에 기술된 벡터는 패키지 신호를 더 포함한다. "패키지 신호", "패키지 서열", 또는 "PSI 서열"은 핵산의 패키지를 지시하는데 충분한 임의의 핵산 서열이며, 이 서열은 레트로바이러스 입자로 되는 패키지 신호를 포함한다. 이 용어에는 자연 발생적 패키지 서열과 이의 조작된 변이체들이 내포된다. 렌티바이러스를 비롯한 다수의 상이한 레트로바이러스의 패키징 신호는 당업계에 공지되어 있다. 하나의 예시적인 PSI는 서열 식별 번호: 23에서 제공되지만, 이에 국한되지 않는다.
Rev 응답 요소 (RRE).
특정 구체예들에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터는 스플라이싱안된 RNA의 핵 방출을 강화시키는 Rev 응답 요소 (RRE)를 포함한다. RREs는 당업계 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다. 예시적인 RREs에는 HIV NL4-3 게놈(Genbank 수탁 번호 AF003887)의 위치 7622-8459에 위치한 RREs, 뿐만 아니라 다른 계통의 HIV 또는 기타 레트로바이러스로부터 얻은 RREs 가 포함되지만, 이에 국한되지 않는다. 이러한 서열은 Genbank 또는 URL hiv-web.lanl.gov/content/index에서 이용가능한 데이터베이스에서 쉽게 사용할 수 있다. 하나의 예시적인 RRE는 서열 식별 번호: 24에서 제공되지만, 이에 국한되지 않는다.
폴리퓨린 지대 (cPPT, 3'PPT).
각종 구체예들에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터에는 폴리퓨린 지대 (가령, 중앙 폴리퓨린 지대 (cPPT), 3' 포플리퓨린 지대 (3'PPT))가 더 내포된다. 렌티바이러스 (가령, HIV-1) 벡터 구조체로 3'PPT (가령, 서열 식별 번호: 26) 또는 중앙 폴리퓨린 지대 (cPPT)를 함유하는 단편의 삽입으로 형질도입 효능이 강화되는 것으로 알려져 있다.
발현-자극 전사-후 조절 요소 (PRE)
특정 구체예들에서, 본원에 기술된 상기 렌티바이러스 벡터 (LVs)는 임의의 다양한 전사-후 조절 요소 (PREs)를 포함할 수 있는데, 전사체 내에 이의 존재로 단백질 수준에서 이종성 핵산 (가령, RAG1)의 발현 수준이 증가된다. PREs는 특정 구체예들에서, 특히 적당한 프로모터를 갖는 렌티바이러스 구조체와 관련된 구체예에서 특히 유용할 수 있다.
PRE의 한 유형은 유전자 발현을 자극할 수 있는 발현 카세트 내에 위치한 인트론이다. 그러나, 인트론은 렌티바이러스의 생명 주기 사건들 동안 스플라이싱될 수 있다. 그런 이유로, 인트론이 PRE로 사용되는 경우, 벡터 게놈 전사체와 반대 방향으로 배치되는 것이 일반적이다.
스플라이싱 이벤트에 의존하지 않는 전사-후 조절 요소는 바이러스 생명 주기 동안 제거되지 않는 이점을 제공한다. 일부 예로써, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 전사-후 프로세싱 요소, B형 간염 바이러스 (HPRE)의 전사-후 조절 요소, 그리고 woodchuck 간염 바이러스 (WPRE)가 있다. 이들 중, WPRE는 HPRE에서 발견되지 않는 추가 시스- 작용 요소를 함유하기 때문에, 일반적으로 선호된다. 이 조절 요소는 도입유전자의 RNA 전사체에 내포되도록 벡터 내에 위치하는 것이 일반적이지만, 그러나 해당 도입유전자 해독 단위의 정지 코돈 외부에 위치한다.
WPRE는 U.S. 특허 번호 6,136,597에서 특징화되고, 기술된다. 본원에서 기술된 바와 같이, WPRE는 핵에서 세포질로 RNA의 효율적인 수송을 매개하는 RNA 방출 요소다. 이것은 시스-작용 핵산서열의 삽입에 의해 도입유전자의 발현을 향상시키고, 그래서 이 요소와 도입유전자가 단일 전사체 내에 함유되도록 한다. 센스 방향에서 WPRE의 존재로 도입유전자 발현이 최대 7-배 ~ 10-배까지 증가시키는 것으로 나타났다. 레트로바이러스 벡터는 완전한 인트론-함유 유전자 대신 cDNA의 형태로 서열을 전달하는데, 이것은 레트로바이러스 입자의 형성으로 이어지는 일련의 사건 동안, 인트론이 일반적으로 스플라이싱 아웃되기 때문이다. 인트론은 스플라이싱 기전과 일차 전사체의 상호작용을 매개한다. 스플라이싱 기전에 의한 RNAs의 프로세싱은 세포질 방출을 촉진하기 때문에, 스플라이싱과 수송 기전 사이의 커플링으로 인해 cDNAs가 종종 비효율적으로 발현된다. 따라서, 벡터 안에 WPRE (가령, 서열 식별 번호: 25)의 함입으로 도입유전자의 발현이 강화된다.
형질도입된 숙주 세포 및 세포 형질도입 방법.
본원에 기재된 재조합 렌티바이러스 벡터(LV) 및 생성된 바이러스는 이종성 핵산 서열(가령, RAG1 단백질을 인코딩하는 핵산)을 포유동물 세포 내로 전달할 수 있다. 각종 구체예들에서, 세포로 전달을 위해, 본원에서 기술된 벡터는 적합한 패키지 세포주와 병용하여 이용하거나, 또는 본 발명의 벡터를 패키지할 수 있고, 세포를 감염시킬 수 있는 복제-무능력(incompetent) 비리온을 형성하는데 필수적인 레트로바이러스 유전자 (가령, gag 및 pol)를 함유하는 다른 벡터 플라스미드와 함께, 시험관에서 세포로 공동-형질감염되는 것이 바람직하다.
특정 구체예들에서, 상기 벡터는 형질감염을 통하여 패키지 세포주로 도입된다. 상기 패키지 세포주는 상기 벡터 게놈을 함유하는 바이러스 입자를 만든다. 형질감염 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 패키징 벡터 및 트랜스퍼 벡터를 패키지 세포주로 동시 형질감염시킨 후, 상기 재조합 바이러스는 당업자가 사용하는 표준 방법에 의해 배양 배지로부터 회수되고, 적정된다. 따라서, 상기 패키지 구조체는 일반적으로 네오마이신, DHFR, 글루타민 합성효소와 같은 우성 선택 마커와 함께 또는 사용하지 않고, 인산칼슘 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공에 의해 인간 세포주에 도입될 수 있으며, 이어서 적절한 약물의 존재 하에 클론의 선별 및 클론의 단리를 시행할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 선택가능한 마커 유전자는 해당 구조체의 패키징 유전자에 물리적으로 연계될 수 있다.
패키징 기능이 적합한 패키지 세포에 의해 발현되도록 구성된 안정한 세포주는 당분야에 공지되어 있다 (가령, U.S. 특허 번호. 5,686,279 참고-패키지 세포에 대해 기술됨). 일반적으로, 바이러스 입자의 생산을 위해, 렌티바이러스 Gag 및 Pol 유전자의 발현에 대해 양립가능한 임의의 세포, 또는 그러한 발현을 지원하도록 조작될 수 있는 임의의 세포를 사용할 수 있다. 예를 들면, 생산자 세포, 이를 테면, 293T 세포 및 HT1080 세포가 사용될 수 있다.
렌티바이러스 벡터가 내부에 통합된 패키징 세포는 생산자 세포를 형성한다. 따라서, 생산자 세포는 관심대상 치료 유전자 (가령, RAG1 단백질을 인코딩하는 핵산)를 휴대하는 패키지된 감염성 바이러스 입자를 생산하거나 또는 방출시킬 수 있는 세포 또는 세포주다. 이들 세포는 유리 또는 플라스틱과 같은 표면에 부착될 때, 이들 세포가 최적으로 성장, 생존 또는 기능을 유지 기능을 하는 의미로 추가적으로 앵커리지-의존적일 수 있다. 벡터가 복제 가능한 경우, 렌티바이러스 벡터 패키지 세포주로 사용되는 앵커리지-의존적 세포주의 몇 가지 예는 HeLa 세포 또는 293 세포, 그리고 PERC.6 세포다.
따라서, 특정 구체예들에서, 유전자를 세포로 전달시키고, 그 다음 이 유전자를 해당 세포의 게놈에 통합시키는 방법이 제공되는데, 이 방법은 본원에서 기술된 렌티바이러스 벡터를 함유하는 비리온에 해당 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 세포 (가령, 조직 또는 기관의 형태)는 생체외에서 비리온에 접촉되고 (가령, 감염되고), 그 다음 해당 유전자 (가령, RAG1 단백질을 인코딩하는 핵산)가 발현될 대상체 (가령, 포유 동물, 동물 또는 인간)로 전달된다. 각종 구체예들에서, 상기 세포는 대상체에 대해 자가 조직일 수 있거나(즉, 대상체의 것), 또는 이 대상체에 대해 비-자가조직일 수 있다(즉, 동종이계 또는 이종이계). 더욱이, 본원에 기술된 벡터는 분열 세포 및 비-분열 세포 모두에 전달될 수 있기 때문에, 상기 세포들은 예를 들어, 골수 세포, 중간엽 줄기 세포 (가령, 지방 조직으로부터 수득된), 및 인간 공급원 및 동물 공급원으로부터 유래된 기타 일차 세포를 비롯하여, 매우 다양한 종으로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 상기 비리온은 대상체 또는 대상체의 국소 영역 (가령, 골수)으로 생체내로 직접 투여될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본원에서 기술된 렌티벡터는 골수, 말초 혈액 또는 배꼽 제대혈로부터 수득된 인간 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포의 형질도입, 뿐만 아니라 CD4+ T 세포, 말초 혈액 B 림프구 세포 또는 T 림프구 세포, 및 이와 유사한 것들의 형질도입에 특이 유용할 것이다. 특정 구체예들에서, 특히 바람직한 표적은 CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포다.
유전자 요법.
여전히 다른 구체예들에서, 인간 조혈 줄기 세포를 형질도입시키는 방법들이 제공된다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 전술한 렌티벡터중 하나에 의해 조혈 줄기 세포들이 내포된 인간 세포 집단에서 인간 조혈 전구 세포의 형질도입에 영향을 주는 조건 하에서 해당 벡터중 하나를 전술한 집단에 접촉시키는 것과 관련있다. 상기 줄기 세포는 궁극적인 용도에 따라 생체내 또는 시험관에서 형질도입될 수 있다. 인간 유전자 요법, 이를 테면, 인간 줄기 세포의 유전자 요법의 맥락에서, 생체 내에서 줄기 세포를 형질도입하거나, 또는 대안적으로 시험관 내에서 형질도입-후 해당 형질도입된 줄기 세포를 인간 대상체로 주입시킬 수 있다. 이 구체예의 한 측면에서, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 상기 인간 줄기 세포를 인간, 가령, RAG1 SCID 환자로부터 빼내고, 그리고 상기에서 기술된 바와 같이 형질도입시킨다. 그 다음, 상기 형질도입된 줄기 세포를 동일한 인간 또는 상이한 인간에게도 재-도입시킨다.
줄기 세포/전구 세포 유전자 요법.
각종 구체예들에서, 본원에서 기술된 렌티벡터는 골수, 말초 혈액 또는 배꼽 제대혈로부터 수득된 인간 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포(HSCs)의 형질도입, 뿐만 아니라 CD4+ T 세포, 말초 혈액 B 림프구 세포 또는 T 림프구 세포, 및 이와 유사한 것들의 형질도입에 특이 유용하다. 특정 구체예들에서, 특히 바람직한 표적은 CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포다.
세포, 예를 들면, CD34+ 세포, 수지상 세포, 말초 혈액 세포 또는 종양 세포는 생체외에서 형질도입되고, 상기 벡터 입자는 일반적으로 105 세포당 바이러스 벡터의 1 × 105 ~ 50 × 105 형질도입 단위에 해당하는 감염 다중도(MOI)가 1~50 사이인 정도의 투여분량을 사용하여 세포와 함께 항온처리된다. 여기에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 및 50 MOI에 대응하는 백터 양이 내포될 수 있다. 전형적으로, 벡터의 양은 HT-29 형질도입 단위 (TU)로 표현될 수 있다.
특정 구체예들에서, 세포-기반 요법은 줄기 세포 및/또는 조혈 전구체를 제공하고, 가령, RAG1 단백질을 인코드하는 핵산을 인코딩하는 렌티바리어스로 상기 세포를 형질도입시키고, 그리고 그 다음 이를 필요로 하는 대상체 (가령, RAG1 유전자에 돌연변이를 갖는 대상체)에게 상기 형질변환된 세포를 도입시키는 것과 관련된다.
특정 구체예들에서, 상기 방법은 세포 집단, 가령, 대상체로부터 줄기 세포를 단리하고, 임의선택적으로 조직 배양에서 이들 세포를 확장시키고, 세포 내에 존재하면 상기 렌티바이러스 벡터를 세포로 투여하여, 시험관 내에서 정상적인 RAG1 단백질이 생성되도록 하는 것과 관련된다. 그런 다음, 상기 세포들을 대상체에게 반환시키고, 예를 들어, RAG1 단백질을 생성하는 림프구 집단을 제공할 수 있다.
일부 예시적인, 그러나 이에 국한되지 않는 구체예들에서, 세포주 또는 상기 대상체 이외의 개체의 세포일 수 있는 세포 집단이 사용될 수 있다. 대상체로부터 줄기세포, 면역계 세포 등을 단리하고, 그리고 이들을 해당 대상체로 반환하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법들은 예를 들어, 화학요법을 받는 환자의 골수 이식, 말초 혈액 줄기 세포 이식 등에 사용된다.
여기에서 줄기 세포가 사용되는 경우, 이러한 세포는 골수(BM), 제대혈(CB), 이동화된 말초 혈액 줄기 세포(mPBSC) 등을 비롯한 다수의 공급에서 유래할 수 있음을 인식할 것이다. 특정 구체예들에서, 유도된 만능 줄기 세포(IPSCs)의 사용이 고려된다. 조혈 줄기 세포(HSCs)를 단리하고, 이러한 세포를 형질도입하고, 이들을 포유동물 대상체에 도입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
벡터의 직접적인 도입.
특정 구체예들에서, 본원에 기재된 벡터(들)의 직접 도입으로, 대상체의 직접 치료가 고려된다. 상기 렌티바이러스 조성물은 비경구(가령, 정맥내), 피내, 피하, 경구(가령, 흡입), 경피(국소), 경점막, 직장 및 질을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 임의의 이용가능한 경로로 전달하기 위해 제형화될 수 있다. 일반적으로 사용되는 전달 경로에는 흡입, 비경구 및 경점막 경로가 내포된다.
각종 구체예들에서, 약제학적 조성물에는 약제학적으로 수용가능한 담체와 조합된 LV가 내포될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 약학적 투여에 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물 또한 상기 조성물에 혼합될 수 있다.
일부 구체예들에서, 활성제, 즉, 본원에서 기술된 렌티바이러스 및/또는 상기 벡터와 함께 투여될 다른 제제는 신체로부터 신속하게 제거되는 것으로부터 이 화합물을 보호하는 운반체와 함께 만들어질 수 있는데, 이를 테면 임플란트 및 미소포집 운반시스템이 포함된 방출 제어 제형이 된다. 생분해가능한, 생체적합성 폴리머, 이를 테면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 및 폴리락트산이 이용될 수 있다. 이러한 조성물을 준비하는 방법은 당업계 숙련자들에게 잘 알려져 있을 것이다. 적합한 물질은 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 또한 입수할 수 있다. 리포좀은 약학적으로 허용되는 담체로 또한 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지 된 방법에 따라 제조될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 특정 세포 유형 또는 바이러스에 의해 감염된 세포를 표적으로 한다. 예를 들면, 조성물은 세포 표면 마커, 예를 들어, 감염된 세포의 표면에서 발현되는 내생성 마커 또는 바이러스 항원에 대한 단일클론성 항체를 사용하여 표적화될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여분량의 균일성을 위해 투약 단위 형태로 조성물을 제형화하는 것이 유익하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 대상체에 대한 단일 투여분량으로 적합한 물리적으로 분리된(discrete) 단위를 의미하고; 각 단위는 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 사전결정된 양의 LV를 포함한다.
단위 용량은 단일 주사로 투여할 필요는 없지만, 설정된 시간 동안 연속 주입을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 LV의 단위 투여분량은 HeLa 또는 293과 같은 세포주에서 벡터를 적정함으로써 정의된 바와 같이, 렌티벡터의 형질도입 단위(T.U.)로 간단하게 기술될 수 있다. 특정 구체예들에서, 단위 투여분량의 범위는 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 T.U.이며, 그리고 이보다 더 높은 범위일 수 있다.
약제학적 조성물은 필요에 따라, 다양한 간격과 다양한 기간에 걸쳐 투여될 수 있는데, 가령, 약 1 ~ 약 10간 동안; 약 2주 ~ 약 8주; 약 3주 내지 약 7주; 약 4주; 약 5주; 약 6주, 및 기타 기간 등에서 주당 1회 투여될 수 있다. 무기한으로 치료 조성물을 투여하는 것이 필요할 수 있다. 당업자는 특정 인자들, 예를 들어, 질환 또는 장애의 중증도, 제형, 전달 경로, 기존 치료, 해당 대상체의 전반적인 건강 및/또는 연령 및 기타 질환의 존재를 비롯한, 그러나, 이에 국한되지 않은 인자들이 이 대상체의 효과적 치료에 필요한 투여량 및 시기에 영향을 줄 수 있음을 인지할 것이다. LV를 이용한 대상체의 치료에는 단일 치료가 내포될 수 있고, 많은 경우에, 일련의 치료가 내포될 수 있다.
예시적이지만 비-제한적으로, 유전자 요법 벡터의 투여를 위한 투여분량 및 적합한 투여분량을 결정하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또한, LV의 적절한 투여분량은 특정 수령자 및 투여 방식에 따라 달라질 수 있음을 이해한다. 특정 대상체에 대한 적절한 투여분량 수준은 연령, 체중, 전반적인 건강, 대상체의 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 방출률, 기타 투여된 치료제 및 이와 유사한 것들을 비롯한, 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
특정 구체예들에서, 렌티바이러스 유전자 요법 본원에서 기술된 벡터는 예를 들어, 정맥 주사, 국소 투여 또는 정위 주사에 의해 대상체에게 전달될 수 있다 (가령, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3054 참고). 특정 구체예들에서, 벡터는 경구 또는 흡입으로 전달될 수 있고, 분해로부터 이를 보호하고, 조직 또는 세포로의 흡수를 향상시키기 위해, 캡슐화되거나 또는 그렇지 않으면 달리 조작될 수 있다. 약제학적 조제물에는 허용되는 희석제에 LV가 내포되거나, 또는 LV가 매립된 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 여기에서 벡터가 재조합 세포로부터 손상없이 생산될 수 있는 경우, 본원에 기재된 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터의 경우와 같이, 약제학적 조제물에는 벡터를 생산하는 하나 또는 그 이상의 세포들이 내포될 수 있다. 본원에서 기술된 LV를 포함하는 약제학적 조성물에는 임의선택적으로 투여 지침과 함께, 용기, 팩 또는 디스펜서에 내포될 수 있다.
전술한 조성물, 방법 및 용도는 예시를 위한 것이며, 이에 국한되는 것이 아니다. 본 명세서에 제공된 교시를 사용하여, 조성물, 방법 및 용도에 대한 다른 변형이 당업자에게 용이하게 이용가능할 것이다.
실시예 1
재조합-활성화 유전자 1 중증 복합 면역결핍증 (
RAG1
SCID) 치료용 렌티바이러스 벡터 개발
하기 설명된 실험의 목표는 재조합-활성화 유전자 1 중증 복합 면역결핍증 (RAG1 SCID) 치료용 고유의 RAG1 유전자의 내생성 조절 요소들에 의해 구동되는 신규한 렌티바이러스 벡터를 개발하는 것이었다. 구체적으로, RAG1 SCID 치료용 신규한 임상 렌티바이러스 벡터 개발을 원했다. 구체적으로, 높은-수준, 계통 및 시간-제약적 특이적 발현을 위해, RAG1 유전자좌의 내생성 요소에 의해 조절되는 렌티바이러스 벡터 개발을 원했다.
생물정보학적 분석 (공개적으로 사용 가능한 데이터베이스 사용: Project Encode, Ensembl, FANTOM, VISTA Enhancer Browser, GeneHancer)은 고유의 RAG1 유전자의 내생성 조절 요소를 밝히는데 이용되었다. 18개의 추정 인핸서 요소들이 400,000개 염기쌍 원도우 내에 있는 것으로 확인되었다. 18개의 추정 인핸서 요소의 하위집단은 각각 T 세포 및 B 세포 발달 전반에 걸쳐 특정 시점에서 RAG1 발현을 담당하는 것으로 여겨지며, 이들 요소의 다양한 조합은 치료요법적으로 유효한 수준에서 고유의 RAG1 유전자의 발현 패턴을 개략적으로 설명할 수 있는 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 제공하기 위해, 발현 카세트에 통합될 수 있다.
RAG1 유전자를 조절하는 중요한 인핸서 요소를 실험적으로 확인하기 위해, 각 추정 인핸서 요소를 내생성 RAG1 프로모터의 상류에 클론시켜, 리포터(mCitrine)의 발현을 유도했다 (가령, 도 1 참고). 18개 요소 모두를 함유하는 벡터가 또한 클론되었다 (가령, 도 1 참고). 다른 전-임상 RAG1 벡터들을 대조군으로 사용했다.
벡터의 복제 세트는 멀티플렉싱을 허용하기 위해, 3' 비-해독 영역(3'UTR)에서 독특한 15개 뉴클레오티드 바코드를 함유하도록 재-클로닝되었다 (가령, 도 2 참고). 각 벡터는 총 42개의 새로운 벡터에 대해 2개의 독특한 바코드를 포함하도록 클론되었다.
실험 계획에는 CB CD34+ HSCs를 형질도입하기 위해 42개 모든 벡터를 함유하는 풀링된 바이러스 상청액을 제공하는 것이 포함된다. 형질도입된 HSCs는 방사선 조사된 NSG 신생아에게 이식되고, 42개 모든 벡터를 함유하는 형질도입된 HSCs는 성숙한 T 세포 및 B 세포로 발달할 것이다. 이식-후 16주차 시점에 마우스를 수거할 것이며, T-세포(특히, 흉선세포) 및 B-세포 발달에 있어서 상이한 세포 단계를 수집할 것이다. RNA와 gDNA는 각 세포 집단에서 추출될 것이며; RNA 및 gDNA의 바코드는 PCR로 증폭되고, 차세대 시퀀싱으로 정량화될 것이다.
각 바코드는 공지된 인핸서 요소와 연합되어 있기 때문에, 특정 세포 집단에서 각 바코드의 상대적 풍도를 정량화시킴으로써, T-세포 및 B-세포 발달에 있어서 특정 단계를 통해 RAG의 높은 수준, 계통 및 시간-제한적 특이적 발현을 담당하는 인핸서 요소를 밝힐 수 있다.
개념 증명으로, NALM6 세포(프레(pre)-B 세포주)에 바코드화되지 않은 RAG1 벡터로 형질도입시켜, 이 벡터가 발현하는지 확인하고, 공지의 프레-B 세포 인핸서를 실증했다. 요소 #14 eRAG는 이전에 문헌에 정의된 프로(pro)-B 세포 단계에서 프레(pre)-B 세포 단계로 진행하는 데 필요한 프레-B 세포 인핸서다. 형질도입된 NALM6 세포에서 이 벡터들 각각의 발현 수준은 도 3에 나타낸다. 그런 다음, NALM6 세포 (프레 B-세포주)에 바코드화된 RAG1 벡터로 형질도입시켜, 이 바코드가 발현에 영향을 미치지 않음을 실증했다 (도 4 참고).
멀티플렉싱의 신뢰성을 확인하기 위해, 싱글플렉스 형질도입된, 바코드화된 웰이 함께 혼합된다 (도 5 참고). 유세포 분석을 통해 각 웰을 독립적으로 분석한 데이터를 개괄적으로 설명할 수 있는 지를 실증하기 위해, 혼합 세포 집단으로부터 RNA와 gDNA를 추출한다.
추가로, 바코드의 재조합이 높은 벡터 카피 수에서 일어나는지를 결정하기 위해, 증가하는 벡터 투여분량으로 42개 모든 벡터를 함유하는 풀링된 바이러스 상청액을 NALM6 세포에 형질도입하였다. 이것은 단일 멀티플렉스 형질도입된 웰이 42개의 싱글플렉스 형질도입된 웰의 데이터를 요약할 수 있는지 확인하기 위해 또한 수행되었다.
다중화된 CB CD34+ HSCs를 NSG 신생아에게 형질도입하여 T 세포 및 B 세포 발달의 서로 상이한 단계에서 계통 및 시간-제한적 특이적 인핸서를 확인했다. 21마리 마우스의 림프절 뿐만 아니라 대퇴골 및 경골로부터 골수를 채취하였고, CD45+ 세포에 대해 회수된 세포를 선별했다. B-세포 및 T-세포 수율을 결정하였다.
NSG 마우스에서 각 B-세포 발달 집단의 높은 세포 수율이 관찰되었다. T-세포 발달 단계 (매우 낮은 CD34+ Thy1, Thy2, Thy3 집단)의 낮지만, 실행가능한 수율도 관찰되었다.
각 집단으로부터 RNA와 gDNA를 수거할 수 있고, RNA를 cDNA로 변환시킬 수 있고, cDNA 및 gDNA로부터 바코드를 PCR 아웃시킬 수 있다.
아래에 설명된 바와 같이, 우리는 다음에서 다양한 구조체의 생체내 인핸서 스크린을 수행했다:
NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG) 마우스;
골수 간 흉선 (BLT) 마우스; 그리고
인공 흉선 오르가노이드 (ATOs).
NSG 마우스의 생체내 인핸서 스크린은 위에 설명되어 있다. BLT 마우스의 생체내 인핸서 스크린은 NSG 스크린과 유사했지만, 그러나 형질도입된 CD34+ 세포는 NSG 마우스 대신 BLT 마우스에 이식되었다. BLT 마우스는 인간 T-세포 발달을 촉진하기 위해 인간 태아 흉선이 이식된 변형된 NSG 마우스다.
ATOs의 인핸서 스크린은 NSG 마우스와 유사했지만, 형질도입된 세포는 마우스에 이식되는 대신 시험관 내에서 분화되었다. 간단히 말해서, 42개 모든 벡터를 함유하는 바이러스 상청액 풀을 사용하여 CB CD34+ HSPCs를 형질도입시켰다. 그런 다음, 형질도입된 세포들은 인공 흉선 오르가노이드(ATO) 시스템을 사용하여 T-세포 발달의 상이한 단계들로 분화되었다 (가령, Seet et al. (2017) Nat. Meth. 14(5): 521-530)J. 각 T-세포 발달 집단으로부터 RNA와 gDNA를 추출하였고, RNA와 gDNA에 있는 바코드를 PCR로 증폭시키고, 차세대-시퀀싱으로 정량화했다. 각 바코드는 공지된 인핸서 요소와 연합되어 있기 때문에, 특정 세포 집단에서 각 바코드의 상대적 풍도를 정량화시킴으로써, T-세포 발달에 있어서 특정 단계를 통해 RAG의 높은 수준, 계통 및 시간-제한적 특이적 발현을 담당하는 인핸서 요소를 밝힐 수 있다.
T 세포 발달의 상이한 단계들에 걸친 인핸서 스크린의 결과는 NSG 마우스, BLT 마우스 및 ATO의 3가지 상이한 모델에 걸쳐 개괄설명된다. 인핸서 요소 9와 12는 T 세포에서 RAG 발현을 위한 주요 인핸서인 것으로 보인다. 요소 9는 마우스 세포에서 기존 확인된 인핸서 요소와 상동성을 가지고 있다 (DP 단계에서 RAG1 발현에 필수임 - ASE 요소로 알려짐). 요소 12는 새로 식별된 요소다. 요소 5, 6, 11, 13, 14, 18 또한 T-세포에서 인핸서 활성을 보였다. 인핸서는 예상대로 DP 단계에서 가장 활동적이었다(TCRa 재배열 동안). 모든 인핸서는 단일 양성 CD4+/CD8+ 단계에서 제거되었다. 요소 9 단독은 DP 단계에서 UCOE보다 >8-배 더 높게 발현되었으며, 이는 MNDU3과 필적되는 발현이다. MNDU3와 UCOE는 모든 발달 단계에서 활성화되었다.
추가적으로, 인핸서 요소 14 및 요소 5는 B 세포에서 RAG1 발현에 필요한 주요 인핸서인 것으로 보인다. 요소 14는 마우스 세포(eRAG)에서 이미 문헌에서 특정된 요소와 상동성을 갖는다. 요소 5는 새로 식별된 요소다. HG1/HG2 단계에서 원소 5와 14의 발현은 정점이다. 인핸서는 NB 단계와 MB 단계에서 제거되며, 놀랍게도 형질 세포 단계에서 다시 발현을 획득한다. #5 및 #14에 대한 더 큰 요소는 예시된 요소가 WT 수준 아래인 MNDU3보다 더 낮게 발현되기 때문에, 취득이 가능하다. 19(MNDU3) 및 20(UCOE)은 B-세포 발달의 모든 단계에서 활성화된다.
위에서 설명한 인핸서 스크린의 결과는 우리의 선두 후보 벡터에 사용되었다. 우리의 선두 후보를 설계할 때, 발현이 MNDU3 (WT 수준 아래에 있음)보다 낮기 때문에, B-세포 인핸서 요소들 (요소 5 및 요소 14)에서 발현을 증가시키기를 원한다. 따라서, 발현을 증가시키기 위해 요소의 크기를 늘렸다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 인핸서 요소의 경계가 너무 좁게 특정되었고, 완전한 전사 인자 결합에 필요한 중요한 서열이 누락될 수 있을 것으로 보여진다. 새로운 경계를 요소 5 및 요소 14 "코어"라고 칭하며. 이들은 원래 요소보다 더 크다. 이 벡터는 초기 스크린에서 상실된 신규한 B-세포 인핸서도 함유하고 있었다. 이 요소는 인핸서 요소 11에 인접하여, "E11 B-세포 인핸서"로 명시한다. 또한, 발현을 유지하면서, 이 벡터의 크기를 줄이기 위해 요소 9.1의 크기를 감소시켰다. 10개의 예시적인 선두 후보 벡터가 표 2에 나와 있다.
표 2. 예시적이지만, 비-제한적인 벡터 구조체.
본 명세서에 기술된 실시예 및 구체예들은 단지 예시적인 목적이며, 그에 대한 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 이들은 본 출원 및 첨부된 청구범위의 사상 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
SEQUENCE LISTING
<110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA
KOHN, DONALD B.
WONG, RYAN L.
ROGER, HOLLIS P.
<120> LENTIVIRAL VECTORS IN HEMATOPOIETIC STEM CELLS TO TREAT
RECOMBINATION-ACTIVATING GENE 1 (RAG1) SEVERE COMBINED
IMMUNODEFICIENCY (SCID)
<130> UCLAP219WO
<150> US 62/935,022
<151> 2019-11-13
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1063
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 1
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cagggactgc gtccccgacc tgccgagagc gaaggggcgg ggggcggcgt ccctgaccgc 300
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 7
tgtactgtta gcaaattact tcccctcttg gaacctcaat ttcatcatcc gtaaaatggg 60
aacaataata aaaatacctt ttggccatta gggggagctc aaggatgact tataccccaa 120
aaggggaagg attgcttatg tggattctca gttctagtca ttggcaacgc taaagggcag 180
agctttcccc tgttgtgggc aagggtttgc acgaggggga ctggccatcc cagtt 235
<210> 8
<211> 427
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 8
ctgtggctgg gattctgcaa accacattgc tgctttgtca gctgggtccc tggtaggttc 60
tgccaatgga gggcgctaga gggagcctgg gggactggtg gagggagagg agttgggctc 120
atcctgtctt tgtccacatc acctagcata gacagctggg tccagcagca gtgttatatc 180
ccttccagta attttggtgg ttgcttctca gcattcttga gtttataggt ggagcatact 240
tgatccttgt gtgagtcccc aagagacact gggtcctatt tgtggttgct tagtcaatga 300
cttcatagct taaaagaagt gacctcggag cccttgttcc tgtatcgtac aattgcctag 360
ttcttcagtt accttcagca gtatgcattt ctcactaagt cactcattag attggctttt 420
catttcc 427
<210> 9
<211> 1559
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 9
gtgggctttg cctacagcac ctgcttctgc tttccgcatt tactgatcca ctaagtgtaa 60
gtgtgacata tagaggtctg tgttggttgt tgttttgtgt tcaaacagct gaacatctgg 120
cctctcatgt gcaggtgcac agaactcagg agaaggggtt ttaatttaag ataaaaaaaa 180
taaggatatg tgctagttgc agatgagggt ttgggtgctg gacttaagat gcttctgtgt 240
tcaaaaacaa ggatatatga gtcccttata tgtcagggac aatgtacagt gctggtcata 300
atattcattt tctgaaaatg tcttcactga cataatggct tctgatttgt catcctgaac 360
aagtctatta tattttattt agttattgtc ctcaatttgc aaggttcata aagagtttca 420
cacagatggc acccaaagtg cttatttctc attgtgctga aattaaactt gaatatgcta 480
tatatcaaat aaataatcca ttccatgcca ttaaaagagt ttagaatgag agatgaaata 540
aattttgcaa aaagtgtgcc cacatgttca ttttctccaa atagcatagt cattacattt 600
aaaaacaatc attggtcaaa atagaaagta ttaagaaaat actaagtatc aattgaggtc 660
taccacatgt tcagcaacaa cttaggtgag atgtgggagt aggaaaaagg aatactttat 720
aacatcacag agaggcagat tttggcacag ggaagagaag tcaatgcaat acctcaagga 780
acccagtggt gatctaagaa aacactagtt tgacccattg cctcaattaa gtatttacct 840
ttcatagcta agaagagaag taaatagcct ttctttatac tttctagaag ttgagctcaa 900
tgttctttcg gagagagcag gctcatctcc attatgtagc gccaatgaca aatacctgta 960
tatgtctgta tttccttggt ctgtcttgct cacctgttaa gacaccttgc tgcacaacag 1020
atggcacatg cttatcttgt ggcagtgaag agttgacatc aaaggccaag aaaaccttga 1080
aactcatcct tttcagccca caagagcagc ttctctctac cacagacgat gaaagctgga 1140
gataacaggg gcattcccac cgctgcactc tctcttgtgg ccagctgaca gttaacacag 1200
gtgggcgtga ggtgctgcct acattttgaa ggttgtctat tgatggggaa caccacctct 1260
ctgagctcag gcctctgctt tggcccgtgg agctgctgct tctgagaagt aaccaggtgg 1320
tgaatacctg cctgcttttc agaaaatccg aggtggctgt caaaacaccc actatcattc 1380
aaaggctgtc aggcaaggtg gccgtttgag gggccacttt agttcttggt ttttttcaga 1440
agtcgaattg gattgccaaa cagcttgctc aactgcctct tcccataagc tagatgggag 1500
gaaggctggg tctgtgtaac ttggggtgcg cacaactaaa gtgcataaaa agagaagga 1559
<210> 10
<211> 535
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 10
ggctttgcct acagcacctg cttctgcttt ccgcatttac tgatccacta agtgtaagtg 60
tgacatatag aggtctgtgt tggttgttgt tttgtgttca aacagctgaa catctggcct 120
ctcatgtgca ggtgcacaga actcaggaga atcttgctca cctgttaaga caccttgctg 180
cacaacagat ggcacatgct tatcttgtgg cagtgaagag ttgacatcaa aggccaagaa 240
aaccttgaaa ctcatccttt tcagcccaca agagcagctt ctctctacca cagacgatga 300
aagctggaga taacaggggc attcccaccg ctgcactctc tcttgtggcc agctgacagt 360
taacacaggt gggcgtgagg tgctgtttga ggggccactt tagttcttgg tttttttcag 420
aagtcgaatt ggattgccaa acagcttgct caactgcctc ttcccataag ctagatggga 480
ggaaggctgg gtctgtgtaa cttggggtgc gcacaactaa agtgcataaa aagag 535
<210> 11
<211> 307
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 11
attacccacc tcactattat gaagtataac atacagcgtg cacagcacag tgtctggccc 60
attgtagttg ctcaatagct tttagtgttt gcttttatga gtttgagtca tctttgtggt 120
gaggattaca gaccctgacc cctctacttg aggtagctaa agtttccctc ttgatgattt 180
aatcttggtt ggggtgagaa aaaagcaggt atcagctgtg ctattgggga tttcctaacc 240
ctttatatta ttacatgttt catcctgcct tgaggaagaa gtttaagcta cgccaatatt 300
cggggct 307
<210> 12
<211> 323
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 12
ttttttaggt ctactactct tgtgtctgaa agttgcattt tgtttgagta agttcattaa 60
gcagggacct gaaagtaaac atcaaaggtg tgctgaatca gtggtgacaa tttcatgtat 120
catatttcat aataatgttc tttcagagag cacataacat taactagcat ggagcagtgc 180
atgctccctg tatttccttc tgggggccat gattgtgaaa gtgttgcttg tgatttacca 240
gcagatattt atacacattt acttatcaca agacgttttg agtctttcat gtggagctca 300
aagccttaaa acataaaaac caa 323
<210> 13
<211> 349
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 13
ttgacaatta tttattcatt gtaaaataat cacaggaaca gcagcagtgt aggtttccct 60
acctagaggg tggtatgcag tgattctcag gcgctggttg gaaggcacag ctgagggaca 120
caaactgcca ggaagtaatg tggtaactag ccatgagctt gtggtactaa tggtggcacg 180
ggaaacaagg tctctgcttg acttttattt tcactccata acaaactcac cagatcagga 240
gcctaagggt gggtggggag ggagaagaga gaaaaaagca aagggaaagt tcaaagtgac 300
actcgctggg gctgaaaacc acactcccct gcagatgagg tccttggct 349
<210> 14
<211> 501
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 14
ctgaaaccgt ttcacctttt attagaatag agcactgagg catggcagta gccacaggaa 60
gtctgctttc ctttgaacat tgatgaagtt tgaggaaccc tttcatcctt cagttaactc 120
ctatttccaa gtgtctccat gcctatcttt ggcttgattt ctgccacttg actttttttg 180
aattccttta tcactctttt actcttttag tgatcattga cgtaggttcc tgtacttgct 240
gttgtcagaa gaagcaagtt tcagttttgg aatgtaccct gcacgcttag ttcttctttg 300
actattgtaa gccattcttc tttgtctcct ttctggctcc ctgcccccac ctttctgctc 360
cttttttctt ctattctcta aagacctttt cttttcattt actgcattaa tgcaggaagc 420
aaggcacagt ggttaggagg ataggttcta gagtcagaag gcagtgttca gatccccact 480
ctgctactta accatctgta t 501
<210> 15
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 15
aatccttgct gtgtagcctt ttgcagttat tttctgtcat gtgttagata gagaccagag 60
ggcttaacat tgttttgata cccttgcatc tggcagattg cctgtcagag gaagttggaa 120
acgaactgac cagctttatg cttccaggtg gcactgaagc cacattttca gtgccgttgt 180
tatcagtcat ttaattccct actgaatatt gagtggtgtt tttagttcac aggccatttg 240
cagtgcctt 249
<210> 16
<211> 151
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 16
tatcattatt tactgtctag ctactgcaaa cacagtttat tcagctttgc attgctaaag 60
cctggtggtg ttacaagtaa atgtgcataa gccataacca gtgctttttc gtgtatctaa 120
ttttttcagg tacaaatagc ttgaaacagt t 151
<210> 17
<211> 194
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 17
atgatttctt cttagccagt tcatggattc aacaacttct gagacttttt ctcatggctt 60
tttctgatag tcaagaatat aggcttttct ttgcccacac ggtggcacta gctgcttaga 120
aaacagtgta gctaaaatca gaaagcccgc agcagatctc ctgaaagcat ggagagtgag 180
ctgcagccga cgtt 194
<210> 18
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 enhancer element
<400> 18
aaaagtctat tttatctaat ataagcgtag ttactcctgc ttacttttgg tttccatttg 60
catggagtat ctttttccat cctttcactt ttcatctatg tgtgtctttg tagttgaagt 120
gagtttcttg tagatagcac atggttatgt cctgtttgtt tttgtccatt ccttctgtca 180
ttttattgtt ttctggttgt tttgcatttc tcttcctcgt ttctttatct cttactgttt 240
atctttgtgt ggtttgcttg gtgacaaatt ttagttactt tctctttcgc atctgtgtat 300
ctgctctact agtgggttct atacttttgt ttgttctcct gatggtagtt attgcccttt 360
ggctttcaga tatagggctc c 381
<210> 19
<211> 3132
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RAG1 cDNA
<400> 19
atggcagcct ctttcccacc caccttggga ctcagttctg ccccagatga aattcagcac 60
ccacatatta aattttcaga atggaaattt aagctgttcc gggtgagatc ctttgaaaag 120
acacctgaag aagctcaaaa ggaaaagaag gattcctttg aggggaaacc ctctctggag 180
caatctccag cagtcctgga caaggctgat ggtcagaagc cagtcccaac tcagccattg 240
ttaaaagccc accctaagtt ttcaaagaaa tttcacgaca acgagaaagc aagaggcaaa 300
gcgatccatc aagccaacct tcgacatctc tgccgcatct gtgggaattc ttttagagct 360
gatgagcaca acaggagata tccagtccat ggtcctgtgg atggtaaaac cctaggcctt 420
ttacgaaaga aggaaaagag agctacttcc tggccggacc tcattgccaa ggttttccgg 480
atcgatgtga aggcagatgt tgactcgatc caccccactg agttctgcca taactgctgg 540
agcatcatgc acaggaagtt tagcagtgcc ccatgtgagg tttacttccc gaggaacgtg 600
accatggagt ggcaccccca cacaccatcc tgtgacatct gcaacactgc ccgtcgggga 660
ctcaagagga agagtcttca gccaaacttg cagctcagca aaaaactcaa aactgtgctt 720
gaccaagcaa gacaagcccg tcagcacaag agaagagctc aggcaaggat cagcagcaag 780
gatgtcatga agaagatcgc caactgcagt aagatacatc ttagtaccaa gctccttgca 840
gtggacttcc cagagcactt tgtgaaatcc atctcctgcc agatctgtga acacattctg 900
gctgaccctg tggagaccaa ctgtaagcat gtcttttgcc gggtctgcat tctcagatgc 960
ctcaaagtca tgggcagcta ttgtccctct tgccgatatc catgcttccc tactgacctg 1020
gagagtccag tgaagtcctt tctgagcgtc ttgaattccc tgatggtgaa atgtccagca 1080
aaagagtgca atgaggaggt cagtttggaa aaatataatc accacatctc aagtcacaag 1140
gaatcaaaag agatttttgt gcacattaat aaagggggcc ggccccgcca acatcttctg 1200
tcgctgactc ggagagctca gaagcaccgg ctgagggagc tcaagctgca agtcaaagcc 1260
tttgctgaca aagaagaagg tggagatgtg aagtccgtgt gcatgacctt gttcctgctg 1320
gctctgaggg cgaggaatga gcacaggcaa gctgatgagc tggaggccat catgcaggga 1380
aagggctctg gcctgcagcc agctgtttgc ttggccatcc gtgtcaacac cttcctcagc 1440
tgcagtcagt accacaagat gtacaggact gtgaaagcca tcacagggag acagattttt 1500
cagcctttgc atgcccttcg gaatgctgag aaggtacttc tgccaggcta ccaccacttt 1560
gagtggcagc cacctctgaa gaatgtgtct tccagcactg atgttggcat tattgatggg 1620
ctgtctggac tatcatcctc tgtggatgat tacccagtgg acaccattgc aaagaggttc 1680
cgctatgatt cagctttggt gtctgctttg atggacatgg aagaagacat cttggaaggc 1740
atgagatccc aagaccttga tgattacctg aatggcccct tcactgtggt ggtgaaggag 1800
tcttgtgatg gaatgggaga cgtgagtgag aagcatggga gtgggcctgt agttccagaa 1860
aaggcagtcc gtttttcatt cacaatcatg aaaattacta ttgcccacag ctctcagaat 1920
gtgaaagtat ttgaagaagc caaacctaac tctgaactgt gttgcaagcc attgtgcctt 1980
atgctggcag atgagtctga ccacgagacg ctgactgcca tcctgagtcc tctcattgct 2040
gagagggagg ccatgaagag cagtgaatta atgcttgagc tgggaggcat tctccggact 2100
ttcaagttca tcttcagggg caccggctat gatgaaaaac ttgtgcggga agtggaaggc 2160
ctcgaggctt ctggctcagt ctacatttgt actctttgtg atgccacccg tctggaagcc 2220
tctcaaaatc ttgtcttcca ctctataacc agaagccatg ctgagaacct ggaacgttat 2280
gaggtctggc gttccaaccc ttaccatgag tctgtggaag aactgcggga tcgggtgaaa 2340
ggggtctcag ctaaaccttt cattgagaca gtcccttcca tagatgcact ccactgtgac 2400
attggcaatg cagctgagtt ctacaagatc ttccagctag agatagggga agtgtataag 2460
aatcccaatg cttccaaaga ggaaaggaaa aggtggcagg ccacactgga caagcatctc 2520
cggaagaaga tgaacctcaa accaatcatg aggatgaatg gcaactttgc caggaagctc 2580
atgaccaaag agactgtgga tgcagtttgt gagttaattc cttccgagga gaggcacgag 2640
gctctgaggg agctgatgga tctttacctg aagatgaaac cagtatggcg atcatcatgc 2700
cctgctaaag agtgcccaga atccctctgc cagtacagtt tcaattcaca gcgttttgct 2760
gagctccttt ctacgaagtt caagtatagg tatgagggaa aaatcaccaa ttattttcac 2820
aaaaccctgg cccatgttcc tgaaattatt gagagggatg gctccattgg ggcatgggca 2880
agtgagggaa atgagtctgg taacaaactg tttaggcgct tccggaaaat gaatgccagg 2940
cagtccaaat gctatgagat ggaagatgtc ctgaaacacc actggttgta cacctccaaa 3000
tacctccaga agtttatgaa tgctcataat gcattaaaaa cctctgggtt taccatgaac 3060
cctcaggcaa gcttagggga cccattaggc atagaggact ctctggaaag ccaagattca 3120
atggaatttt aa 3132
<210> 20
<211> 3132
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Codon optimized RAG1 DNA
<400> 20
atggccgcca gcttcccccc caccctgggc ctgagcagcg cccccgacga gatccagcac 60
ccccacatca agttcagcga gtggaagttc aagctgttcc gcgtgcgcag cttcgagaag 120
acccccgagg aggcccagaa ggagaagaag gacagcttcg agggcaagcc cagcctggag 180
cagagccccg ccgtgctgga caaggccgac ggccagaagc ccgtgcccac ccagcccctg 240
ctgaaggccc accccaagtt cagcaagaag ttccacgaca acgagaaggc ccgcggcaag 300
gccatccacc aggccaacct gcgccacctg tgccgcatct gcggcaacag cttccgcgcc 360
gacgagcaca accgccgcta ccccgtgcac ggccccgtgg acggcaagac cctgggcctg 420
ctgcgcaaga aggagaagcg cgccaccagc tggcccgacc tgatcgccaa ggtgttccgc 480
atcgacgtga aggccgacgt ggacagcatc caccccaccg agttctgcca caactgctgg 540
agcatcatgc accgcaagtt cagcagcgcc ccctgcgagg tgtacttccc ccgcaacgtg 600
accatggagt ggcaccccca cacccccagc tgcgacatct gcaacaccgc ccgccgcggc 660
ctgaagcgca agagcctgca gcccaacctg cagctgagca agaagctgaa gaccgtgctg 720
gaccaggccc gccaggcccg ccagcacaag cgccgcgccc aggcccgcat cagcagcaag 780
gacgtgatga agaagatcgc caactgcagc aagatccacc tgagcaccaa gctgctggcc 840
gtggacttcc ccgagcactt cgtgaagagc atcagctgcc agatctgcga gcacatcctg 900
gccgaccccg tggagaccaa ctgcaagcac gtgttctgcc gcgtgtgcat cctgcgctgc 960
ctgaaggtga tgggcagcta ctgccccagc tgccgctacc cctgcttccc caccgacctg 1020
gagagccccg tgaagagctt cctgagcgtg ctgaacagcc tgatggtgaa gtgccccgcc 1080
aaggagtgca acgaggaggt gagcctggag aagtacaacc accacatcag cagccacaag 1140
gagagcaagg agatcttcgt gcacatcaac aagggcggcc gcccccgcca gcacctgctg 1200
agcctgaccc gccgcgccca gaagcaccgc ctgcgcgagc tgaagctgca ggtgaaggcc 1260
ttcgccgaca aggaggaggg cggcgacgtg aagagcgtgt gcatgaccct gttcctgctg 1320
gccctgcgcg cccgcaacga gcaccgccag gccgacgagc tggaggccat catgcagggc 1380
aagggcagcg gcctgcagcc cgccgtgtgc ctggccatcc gcgtgaacac cttcctgagc 1440
tgcagccagt accacaagat gtaccgcacc gtgaaggcca tcaccggccg ccagatcttc 1500
cagcccctgc acgccctgcg caacgccgag aaggtgctgc tgcccggcta ccaccacttc 1560
gagtggcagc cccccctgaa gaacgtgagc agcagcaccg acgtgggcat catcgacggc 1620
ctgagcggcc tgagcagcag cgtggacgac taccccgtgg acaccatcgc caagcgcttc 1680
cgctacgaca gcgccctggt gagcgccctg atggacatgg aggaggacat cctggagggc 1740
atgcgcagcc aggacctgga cgactacctg aacggcccct tcaccgtggt ggtgaaggag 1800
agctgcgacg gcatgggcga cgtgagcgag aagcacggca gcggccccgt ggtgcccgag 1860
aaggccgtgc gcttcagctt caccatcatg aagatcacca tcgcccacag cagccagaac 1920
gtgaaggtgt tcgaggaggc caagcccaac agcgagctgt gctgcaagcc cctgtgcctg 1980
atgctggccg acgagagcga ccacgagacc ctgaccgcca tcctgagccc cctgatcgcc 2040
gagcgcgagg ccatgaagag cagcgagctg atgctggagc tgggcggcat cctgcgcacc 2100
ttcaagttca tcttccgcgg caccggctac gacgagaagc tggtgcgcga ggtggagggc 2160
ctggaggcca gcggcagcgt gtacatctgc accctgtgcg acgccacccg cctggaggcc 2220
agccagaacc tggtgttcca cagcatcacc cgcagccacg ccgagaacct ggagcgctac 2280
gaggtgtggc gcagcaaccc ctaccacgag agcgtggagg agctgcgcga ccgcgtgaag 2340
ggcgtgagcg ccaagccctt catcgagacc gtgcccagca tcgacgccct gcactgcgac 2400
atcggcaacg ccgccgagtt ctacaagatc ttccagctgg agatcggcga ggtgtacaag 2460
aaccccaacg ccagcaagga ggagcgcaag cgctggcagg ccaccctgga caagcacctg 2520
cgcaagaaga tgaacctgaa gcccatcatg cgcatgaacg gcaacttcgc ccgcaagctg 2580
atgaccaagg agaccgtgga cgccgtgtgc gagctgatcc ccagcgagga gcgccacgag 2640
gccctgcgcg agctgatgga cctgtacctg aagatgaagc ccgtgtggcg cagcagctgc 2700
cccgccaagg agtgccccga gagcctgtgc cagtacagct tcaacagcca gcgcttcgcc 2760
gagctgctga gcaccaagtt caagtaccgc tacgagggca agatcaccaa ctacttccac 2820
aagaccctgg cccacgtgcc cgagatcatc gagcgcgacg gcagcatcgg cgcctgggcc 2880
agcgagggca acgagagcgg caacaagctg ttccgccgct tccgcaagat gaacgcccgc 2940
cagagcaagt gctacgagat ggaggacgtg ctgaagcacc actggctgta caccagcaag 3000
tacctgcaga agttcatgaa cgcccacaac gccctgaaga ccagcggctt caccatgaac 3060
ccccaggcca gcctgggcga ccccctgggc atcgaggaca gcctggagag ccaggacagc 3120
atggagttct aa 3132
<210> 21
<211> 529
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CMV promoter
<400> 21
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 60
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 120
gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 180
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 240
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 300
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 360
cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 420
atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 480
ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccg 529
<210> 22
<211> 180
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Component of lentiviral vector
<400> 22
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180
<210> 23
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Packaging signal in lentiviral vector
<400> 23
tcgacgcagg actcggcttg ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt 60
gagtacgcca aaaattttga ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt 120
cagtattaag cgggggag 138
<210> 24
<211> 205
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RRE in lentiviral vector
<400> 24
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 60
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 120
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 180
gaatcctggc tgtggaaaga tacct 205
<210> 25
<211> 656
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> WPRE in lentiviral vector
<400> 25
cccatatttg ttctgttttt cttgatttgg gtatacattt aaatgttaat aaaacaaaat 60
ggtggggcaa tcatttacat ttttagggat atgtaattac tagttcaggt gtattgccac 120
aagacaaaca tgttaagaaa ctttcccgtt atttacgctc tgttcctgtt aatcaacctc 180
tggattacaa aatttgtgaa agattgactg atattcttaa ctatgttgct ccttttacgc 240
tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt acggctttcg 300
ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg 360
tccgtcaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact ggctggggca 420
ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg atcgccacgg 480
cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg ctgggcactg 540
ataattccgt ggtgttgtcg gggaagggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc 600
ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cctgga 656
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PPT in lentiviral vector
<400> 26
tttttaaaag aaaagggggg ac 22
<210> 27
<211> 233
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Component of lentiviral vector
<400> 27
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ctactgctta 120
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agc 233
<210> 28
<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SV40 origin of replication
<400> 28
atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 60
tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 120
ggcttttttg gaggcctagg 140
<210> 29
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Drug resistance gene
<400> 29
attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 60
tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 120
caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa 180
gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 240
gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 300
ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 360
cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 420
gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 480
catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc 540
gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 600
cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 660
gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 720
gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 780
gagttcttct ga 792
<210> 30
<211> 620
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Drug resistance gene
<400> 30
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 60
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 120
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 180
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 240
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 300
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 360
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 420
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 480
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 540
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 600
ggaaaaacgc cagcaacgcg 620
<210> 31
<211> 425
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Component of lentiviral vector
<400> 31
agaaaagagg gattggggcc ctctcccaac agacatgagt atttaggagt ccccagttcc 60
ggtttccaca tgacatgata tgatggtctg ttgttttcct cagggaccta gaggcagatg 120
tagacaaata gcaggtgagg aggaagggtg gtgctgagct gtaaacaaca gctgcgggct 180
gtaaacaatg gagctatatt aagaaagtcc tgcatctgca gcattcggtt caatcctgcc 240
acccactggg cgtactcctg aattgacttt ccattgtcag ctgatcagtg acagatgtga 300
aatgactcgt tacacacaca ggtcacattg ggaggattct tagacgtcat attctttggt 360
gcttcacaaa gtcttactgt ggcacatgaa atgatttcag atggtgcaca agatgatttc 420
acatg 425
<210> 32
<211> 480
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Component of lentiviral vector
<400> 32
taaatttcca tgagggtgca aagagaggct tttcccaatc tgaagaatga atttaaaatc 60
tgctgtagaa aaataccaga gagaaaaata tagaaagcag ctgtccctct taccaatttc 120
agagcaggaa aggaatttca gtagagcata aaaacagctt tctctcataa aagaaaacac 180
aacaagaaaa ataatccttg ctgtgtagcc ttttgcagtt attttctgtc atgtgttaga 240
tagagaccag agggcttaac attgttttga tacccttgca tctggcagat tgcctgtcag 300
aggaagttgg aaacgaactg accagcttta tgcttccagg tggcactgaa gccacatttt 360
cagtgccgtt gttatcagtc atttaattcc ctactgaata ttgagtggtg tttttagttc 420
acaggccatt tgcagtgcct ttctgtttcc tttttaacgt tagccacatt aagaaaaaaa 480
<210> 33
<211> 316
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Component of lentiviral vector
<400> 33
tctaggcaag tgtctctctc tctctccccc tctttttctt ttagaaaaat acttcgtgat 60
aaaaacacaa aagtatgtga atggtaattg aaaatgcatt gcttcctttt agaaacccac 120
taggatttgc ataaaccact tggctgtctg ataagtcatt atctgttctg tcagtccctg 180
gggactttta atattaggtt tatattttta tagaaaaggc aagttctaaa tttgaagatg 240
ggtattgtta aactcttcaa taatgacagt ttgtgaaact gcatgttcca aaagtccttt 300
aaaaagtcaa taaggc 316
<210> 34
<211> 868
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Component of lentiviral vector
<400> 34
gtgggctttg cctacagcac ctgcttctgc tttccgcatt tactgatcca ctaagtgtaa 60
gtgtgacata tagaggtctg tgttggttgt tgttttgtgt tcaaacagct gaacatctgg 120
cctctcatgt gcaggtgcac agaactcagg agaaggggtt ttaatttaag ataaaaaaaa 180
taaggatatg tgctagttgc agatgagggt ttgggtgctg gacttaagat gcttctgtgt 240
tcaaaaacaa ggagtcctca atttgcaagg ttcataaaga gtttcacaca gatggcaccc 300
aaagtgctta tttctcattg tgctgaaatt aaacttgaat atgctatata tcaaataaat 360
agaagtaaat agcctttctt tatactttct agaagttgag ctcaatgttc tttcggagag 420
agcaggctca tctccattat gtagcgccaa tgacaaatac ctgtatatgt ctgtatttcc 480
ttggtctgtc ttgctcacct gttaagacac cttgctgcac aacagatggc acatgcttat 540
cttgtggcag tgaagagttg acatcaaagg ccaagaaaac cttgaaactc atccttttca 600
gcccacaaga gcagcttctc tctaccacag acgatgaaag ctggagataa caggggcatt 660
cccaccgctg cactctctct tgtggccagc tgacagttaa cacaggtggg cgtgaggtgc 720
tgcctacatt ttgaaggttg tctattgatg gggaacacca cctctctgag ctcaggcctc 780
tgctttggcc cgtggagctg ctgcttctga gaagtaacca ggtggtgaat acctgcctgc 840
ttttcagaaa atccgaggtg gctgtcaa 868
<210> 35
<211> 210
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Component of lentiviral vector
<400> 35
cttctgtcat tttattgttt tctggttgtt ttgcatttct cttcctcgtt tctttatctc 60
ttactgttta tctttgtgtg gtttgcttgg tgacaaattt tagttacttt ctctttcgca 120
tctgtgtatc tgctctacta gtgggttcta tacttttgtt tgttctcctg atggtagtta 180
ttgccctttg gctttcagat atagggctcc 210
<210> 36
<211> 352
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Component of lentiviral vector
<400> 36
tggcttgatt tctgccactt gacttttttt gaattccttt atcactcttt tactctttta 60
gtgatcattg acgtaggttc ctgtacttgc tgttgtcaga agaagcaagt ttcagttttg 120
gaatgtaccc tgcacgctta gttcttcttt gactattgta agccattctt ctttgtctcc 180
tttctggctc cctgccccca cctttctgct ccttttttct tctattctct aaagaccttt 240
tcttttcatt tactgcatta atgcaggaag caaggcacag tggttaggag gataggttct 300
agagtcagaa ggcagtgttc agatccccac tctgctactt aaccatctgt at 352
<210> 37
<211> 9760
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lentiviral vector
<400> 37
cttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 600
ggggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 660
actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 720
gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag 780
cagtggcgcc cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc 840
aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg 900
ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt 960
aagcggggga gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa 1020
aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat 1080
cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc 1140
cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt 1200
gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag 1260
caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac ctggaggagg 1320
agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc 1380
attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt 1440
gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc 1500
gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa 1560
caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat 1620
caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct 1680
ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag 1740
ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag 1800
agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca 1860
agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt 1920
taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt 1980
aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2040
accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 2100
agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatctcg 2160
acggtatcgg ttaactttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag 2220
aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa 2280
aattcaaaat tttatcgatc acgagactag ccagaaaaga gggattgggg ccctctccca 2340
acagacatga gtatttagga gtccccagtt ccggtttcca catgacatga tatgatggtc 2400
tgttgttttc ctcagggacc tagaggcaga tgtagacaaa tagcaggtga ggaggaaggg 2460
tggtgctgag ctgtaaacaa cagctgcggg ctgtaaacaa tggagctata ttaagaaagt 2520
cctgcatctg cagcattcgg ttcaatcctg ccacccactg ggcgtactcc tgaattgact 2580
ttccattgtc agctgatcag tgacagatgt gaaatgactc gttacacaca caggtcacat 2640
tgggaggatt cttagacgtc atattctttg gtgcttcaca aagtcttact gtggcacatg 2700
aaatgatttc agatggtgca caagatgatt tcacatgtaa atttccatga gggtgcaaag 2760
agaggctttt cccaatctga agaatgaatt taaaatctgc tgtagaaaaa taccagagag 2820
aaaaatatag aaagcagctg tccctcttac caatttcaga gcaggaaagg aatttcagta 2880
gagcataaaa acagctttct ctcataaaag aaaacacaac aagaaaaata atccttgctg 2940
tgtagccttt tgcagttatt ttctgtcatg tgttagatag agaccagagg gcttaacatt 3000
gttttgatac ccttgcatct ggcagattgc ctgtcagagg aagttggaaa cgaactgacc 3060
agctttatgc ttccaggtgg cactgaagcc acattttcag tgccgttgtt atcagtcatt 3120
taattcccta ctgaatattg agtggtgttt ttagttcaca ggccatttgc agtgcctttc 3180
tgtttccttt ttaacgttag ccacattaag aaaaaaagtg ggctttgcct acagcacctg 3240
cttctgcttt ccgcatttac tgatccacta agtgtaagtg tgacatatag aggtctgtgt 3300
tggttgttgt tttgtgttca aacagctgaa catctggcct ctcatgtgca ggtgcacaga 3360
actcaggaga aggggtttta atttaagata aaaaaaataa ggatatgtgc tagttgcaga 3420
tgagggtttg ggtgctggac ttaagatgct tctgtgttca aaaacaagga gtcctcaatt 3480
tgcaaggttc ataaagagtt tcacacagat ggcacccaaa gtgcttattt ctcattgtgc 3540
tgaaattaaa cttgaatatg ctatatatca aataaataga agtaaatagc ctttctttat 3600
actttctaga agttgagctc aatgttcttt cggagagagc aggctcatct ccattatgta 3660
gcgccaatga caaatacctg tatatgtctg tatttccttg gtctgtcttg ctcacctgtt 3720
aagacacctt gctgcacaac agatggcaca tgcttatctt gtggcagtga agagttgaca 3780
tcaaaggcca agaaaacctt gaaactcatc cttttcagcc cacaagagca gcttctctct 3840
accacagacg atgaaagctg gagataacag gggcattccc accgctgcac tctctcttgt 3900
ggccagctga cagttaacac aggtgggcgt gaggtgctgc ctacattttg aaggttgtct 3960
attgatgggg aacaccacct ctctgagctc aggcctctgc tttggcccgt ggagctgctg 4020
cttctgagaa gtaaccaggt ggtgaatacc tgcctgcttt tcagaaaatc cgaggtggct 4080
gtcaattgac aattatttat tcattgtaaa ataatcacag gaacagcagc agtgtaggtt 4140
tccctaccta gagggtggta tgcagtgatt ctcaggcgct ggttggaagg cacagctgag 4200
ggacacaaac tgccaggaag taatgtggta actagccatg agcttgtggt actaatggtg 4260
gcacgggaaa caaggtctct gcttgacttt tattttcact ccataacaaa ctcaccagat 4320
caggagccta agggtgggtg gggagggaga agagagaaaa aagcaaaggg aaagttcaaa 4380
gtgacactcg ctggggctga aaaccacact cccctgcaga tgaggtcctt ggctctcgag 4440
ctaaagagcc aggtggcagc tggagctggg gtctcctggc ccatgattgg ctgccatcat 4500
ttgtggttag ccctccatgg tgggggaggc tgggaaggac agtggaagct gataaacagc 4560
tcagcagcat gttctgagaa acaagagggc aaggagagag cagagaacac actttgcctt 4620
ctctttggta ttgagtaata tcaaccaaat tgcagacatc tcaacacttt ggccaggcag 4680
cctgctgagc aaggtacctc agccagcatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 4740
gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 4800
ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 4860
ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccacct tcggctacgg cctgatgtgc 4920
ttcgcccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 4980
ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 5040
gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 5100
aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 5160
tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 5220
atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 5280
ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagctacc agtccgccct gagcaaagac 5340
cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 5400
ctcggcatgg acgagctgta caagtgactg caggaattcg agcatcttac cgccatttat 5460
tcccatattt gttctgtttt tcttgatttg ggtatacatt taaatgttaa taaaacaaaa 5520
tggtggggca atcatttaca tttttaggga tatgtaatta ctagttcagg tgtattgcca 5580
caagacaaac atgttaagaa actttcccgt tatttacgct ctgttcctgt taatcaacct 5640
ctggattaca aaatttgtga aagattgact gatattctta actatgttgc tccttttacg 5700
ctgtgtggat atgctgcttt aatgcctctg tatcatgcta ttgcttcccg tacggctttc 5760
gttttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt 5820
gtccgtcaac gtggcgtggt gtgctctgtg tttgctgacg caacccccac tggctggggc 5880
attgccacca cctgtcaact cctttctggg actttcgctt tccccctccc gatcgccacg 5940
gcagaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctaggtt gctgggcact 6000
gataattccg tggtgttgtc ggggaagggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt 6060
cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt 6120
cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt 6180
taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt 6240
ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 6300
tagggaacct actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg 6360
cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 6420
aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga 6480
aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 6540
gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 6600
tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc 6660
gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 6720
tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg 6780
aggaggcttt tttggaggcc tagggacgta cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac 6840
gcgcgctcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 6900
cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 6960
accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc 7020
ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 7080
gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 7140
ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 7200
ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 7260
acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 7320
actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 7380
atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 7440
aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 7500
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 7560
aaatgcttca ataatagcac ctagatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 7620
aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 7680
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agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca 1860
agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt 1920
taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt 1980
aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2040
accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 2100
agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatctcg 2160
acggtatcgg ttaactttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag 2220
aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa 2280
aattcaaaat tttatcgatc acgagactag ccagaaaaga gggattgggg ccctctccca 2340
acagacatga gtatttagga gtccccagtt ccggtttcca catgacatga tatgatggtc 2400
tgttgttttc ctcagggacc tagaggcaga tgtagacaaa tagcaggtga ggaggaaggg 2460
tggtgctgag ctgtaaacaa cagctgcggg ctgtaaacaa tggagctata ttaagaaagt 2520
cctgcatctg cagcattcgg ttcaatcctg ccacccactg ggcgtactcc tgaattgact 2580
ttccattgtc agctgatcag tgacagatgt gaaatgactc gttacacaca caggtcacat 2640
tgggaggatt cttagacgtc atattctttg gtgcttcaca aagtcttact gtggcacatg 2700
aaatgatttc agatggtgca caagatgatt tcacatgtaa atttccatga gggtgcaaag 2760
agaggctttt cccaatctga agaatgaatt taaaatctgc tgtagaaaaa taccagagag 2820
aaaaatatag aaagcagctg tccctcttac caatttcaga gcaggaaagg aatttcagta 2880
gagcataaaa acagctttct ctcataaaag aaaacacaac aagaaaaata atccttgctg 2940
tgtagccttt tgcagttatt ttctgtcatg tgttagatag agaccagagg gcttaacatt 3000
gttttgatac ccttgcatct ggcagattgc ctgtcagagg aagttggaaa cgaactgacc 3060
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taattcccta ctgaatattg agtggtgttt ttagttcaca ggccatttgc agtgcctttc 3180
tgtttccttt ttaacgttag ccacattaag aaaaaaagtg ggctttgcct acagcacctg 3240
cttctgcttt ccgcatttac tgatccacta agtgtaagtg tgacatatag aggtctgtgt 3300
tggttgttgt tttgtgttca aacagctgaa catctggcct ctcatgtgca ggtgcacaga 3360
actcaggaga aggggtttta atttaagata aaaaaaataa ggatatgtgc tagttgcaga 3420
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ccttatatgt cagggacaat gtacagtgct ggtcataata ttcattttct gaaaatgtct 3540
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tattgtcctc aatttgcaag gttcataaag agtttcacac agatggcacc caaagtgctt 3660
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catgccatta aaagagttta gaatgagaga tgaaataaat tttgcaaaaa gtgtgcccac 3780
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aggtgagatg tgggagtagg aaaaaggaat actttataac atcacagaga ggcagatttt 3960
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ttttgaaggt tgtctattga tggggaacac cacctctctg agctcaggcc tctgctttgg 4500
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gggtgcgcac aactaaagtg cataaaaaga gaaggattga caattattta ttcattgtaa 4800
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cctgagctac cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct 6060
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ctgctggaca ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt cggggaaggg 6720
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cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc tactgcttaa gcctcaataa 7020
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cctgaatggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 7740
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cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 8040
ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 8100
gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc 8160
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gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 8400
gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 8460
ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 8520
acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 8580
ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 8640
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ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 8940
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gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 9540
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 9600
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 9660
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ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag 10080
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taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg 10260
tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga 10320
ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagc tgcaagcttg 10380
gccattgcat acgttgtatc catatcataa tatgtacatt tatattggct catgtccaac 10440
attaccgcca t 10451
<210> 40
<211> 10767
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lentiviral vector
<400> 40
cttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
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actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 720
gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag 780
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aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg 900
ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt 960
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aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat 1080
cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc 1140
cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt 1200
gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag 1260
caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac ctggaggagg 1320
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gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa 1560
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ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag 1800
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ccttatatgt cagggacaat gtacagtgct ggtcataata ttcattttct gaaaatgtct 3540
tcactgacat aatggcttct gatttgtcat cctgaacaag tctattatat tttatttagt 3600
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ggcacaggga agagaagtca atgcaatacc tcaaggaacc cagtggtgat ctaagaaaac 4020
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atagcctttc tttatacttt ctagaagttg agctcaatgt tctttcggag agagcaggct 4140
catctccatt atgtagcgcc aatgacaaat acctgtatat gtctgtattt ccttggtctg 4200
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gtcattatct gttctgtcag tccctgggga cttttaatat taggtttata tttttataga 5340
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gaaactgcat gttccaaaag tcctttaaaa agtcaataag gctcgagcta aagagccagg 5460
tggcagctgg agctggggtc tcctggccca tgattggctg ccatcatttg tggttagccc 5520
tccatggtgg gggaggctgg gaaggacagt ggaagctgat aaacagctca gcagcatgtt 5580
ctgagaaaca agagggcaag gagagagcag agaacacact ttgccttctc tttggtattg 5640
agtaatatca accaaattgc agacatctca acactttggc caggcagcct gctgagcaag 5700
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tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg 5820
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ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg 6000
agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg 6060
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acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca 6240
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tgcccgacaa ccactacctg agctaccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc 6360
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ctgtttttct tgatttgggt atacatttaa atgttaataa aacaaaatgg tggggcaatc 6540
atttacattt ttagggatat gtaattacta gttcaggtgt attgccacaa gacaaacatg 6600
ttaagaaact ttcccgttat ttacgctctg ttcctgttaa tcaacctctg gattacaaaa 6660
tttgtgaaag attgactgat attcttaact atgttgctcc ttttacgctg tgtggatatg 6720
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tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc cgtcaacgtg 6840
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tgttgtcggg gaagggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc 7080
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gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacctact 7320
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tagtagttca tgtcatctta ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga 7500
gagtgagagg aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 7560
aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 7620
caatgtatct tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc taactccgcc catcccgccc 7680
ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat 7740
gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt 7800
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ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 7920
cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 7980
cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 8040
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 8100
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8160
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ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8340
tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 8400
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc 8460
ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 8520
ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 8580
atagcaccta gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt 8640
gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 8700
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ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct 8820
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ccgcatcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 9540
aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 9600
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 9660
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 9720
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 9780
atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 9840
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 9900
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 9960
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tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 10080
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 10140
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gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 10260
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 10320
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gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg 10440
cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 10500
gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 10560
ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 10620
acagctatga ccatgattac gccaagcgcg caattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc 10680
tggagctgca agcttggcca ttgcatacgt tgtatccata tcataatatg tacatttata 10740
ttggctcatg tccaacatta ccgccat 10767
<210> 41
<211> 10646
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lentiviral vector
<400> 41
cttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 600
ggggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 660
actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 720
gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag 780
cagtggcgcc cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc 840
aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg 900
ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt 960
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aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat 1080
cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc 1140
cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt 1200
gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag 1260
caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac ctggaggagg 1320
agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc 1380
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gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa 1560
caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat 1620
caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct 1680
ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag 1740
ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag 1800
agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca 1860
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cctgcatctg cagcattcgg ttcaatcctg ccacccactg ggcgtactcc tgaattgact 2580
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gagcataaaa acagctttct ctcataaaag aaaacacaac aagaaaaata atccttgctg 2940
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agctttatgc ttccaggtgg cactgaagcc acattttcag tgccgttgtt atcagtcatt 3120
taattcccta ctgaatattg agtggtgttt ttagttcaca ggccatttgc agtgcctttc 3180
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actcaggaga aggggtttta atttaagata aaaaaaataa ggatatgtgc tagttgcaga 3420
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tgcaaggttc ataaagagtt tcacacagat ggcacccaaa gtgcttattt ctcattgtgc 3540
tgaaattaaa cttgaatatg ctatatatca aataaataga agtaaatagc ctttctttat 3600
actttctaga agttgagctc aatgttcttt cggagagagc aggctcatct ccattatgta 3660
gcgccaatga caaatacctg tatatgtctg tatttccttg gtctgtcttg ctcacctgtt 3720
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tcaaaggcca agaaaacctt gaaactcatc cttttcagcc cacaagagca gcttctctct 3840
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gtgacactcg ctggggctga aaaccacact cccctgcaga tgaggtcctt ggctctcgag 4440
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tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aagacgaggc agcgcggcta 8700
tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg 8760
ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt 8820
gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat 8880
ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg 8940
atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca 9000
gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc 9060
catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc 9120
gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 9180
attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc 9240
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cgcatcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta 9420
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ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 9540
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 9600
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 9660
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 9720
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ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 9900
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ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 10020
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 10080
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 10140
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 10200
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 10260
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 10320
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tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 10500
cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct 10560
ggagctgcaa gcttggccat tgcatacgtt gtatccatat cataatatgt acatttatat 10620
tggctcatgt ccaacattac cgccat 10646
<210> 42
<211> 10465
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lentiviral vector
<400> 42
cttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 600
ggggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 660
actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 720
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aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg 900
ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt 960
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aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat 1080
cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc 1140
cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt 1200
gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag 1260
caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac ctggaggagg 1320
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attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt 1440
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ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag 1800
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agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt 1920
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cttctgcttt ccgcatttac tgatccacta agtgtaagtg tgacatatag aggtctgtgt 3300
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gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc 1500
gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa 1560
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ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag 1800
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agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt 1920
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aattcaaaat tttatcgatc acgagactag ccagaaaaga gggattgggg ccctctccca 2340
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tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc 10140
at 10142
<210> 44
<211> 10958
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lentiviral vector
<400> 44
cttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
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ttttagtgat cattgacgta ggttcctgta cttgctgttg tcagaagaag caagtttcag 5400
ttttggaatg taccctgcac gcttagttct tctttgacta ttgtaagcca ttcttctttg 5460
tctcctttct ggctccctgc ccccaccttt ctgctccttt tttcttctat tctctaaaga 5520
ccttttcttt tcatttactg cattaatgca ggaagcaagg cacagtggtt aggaggatag 5580
gttctagagt cagaaggcag tgttcagatc cccactctgc tacttaacca tctgtatgct 5640
aaagagccag gtggcagctg gagctggggt ctcctggccc atgattggct gccatcattt 5700
gtggttagcc ctccatggtg ggggaggctg ggaaggacag tggaagctga taaacagctc 5760
agcagcatgt tctgagaaac aagagggcaa ggagagagca gagaacacac tttgccttct 5820
ctttggtatt gagtaatatc aaccaaattg cagacatctc aacactttgg ccaggcagcc 5880
tgctgagcaa ggtacctcag ccagcatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt 5940
ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg 6000
cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg 6060
caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccttc ggctacggcc tgatgtgctt 6120
cgcccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg 6180
ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga 6240
ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa 6300
ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta 6360
tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat 6420
cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg 6480
ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagctaccag tccgccctga gcaaagaccc 6540
caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct 6600
cggcatggac gagctgtaca agtgactgca ggaattcgag catcttaccg ccatttattc 6660
ccatatttgt tctgtttttc ttgatttggg tatacattta aatgttaata aaacaaaatg 6720
gtggggcaat catttacatt tttagggata tgtaattact agttcaggtg tattgccaca 6780
agacaaacat gttaagaaac tttcccgtta tttacgctct gttcctgtta atcaacctct 6840
ggattacaaa atttgtgaaa gattgactga tattcttaac tatgttgctc cttttacgct 6900
gtgtggatat gctgctttaa tgcctctgta tcatgctatt gcttcccgta cggctttcgt 6960
tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt 7020
ccgtcaacgt ggcgtggtgt gctctgtgtt tgctgacgca acccccactg gctggggcat 7080
tgccaccacc tgtcaactcc tttctgggac tttcgctttc cccctcccga tcgccacggc 7140
agaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctaggttgc tgggcactga 7200
taattccgtg gtgttgtcgg ggaagggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ctggaattcg 7320
agctcggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta 7380
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gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta 7500
gggaacctac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc 7560
cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa 7620
atctctagca gtagtagttc atgtcatctt attattcagt atttataact tgcaaagaaa 7680
tgaatatcag agagtgagag gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 7740
aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 7800
tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggctctagc tatcccgccc ctaactccgc 7860
ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt 7920
tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag 7980
gaggcttttt tggaggccta gggacgtacc caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc 8040
gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 8100
taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 8160
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg 8220
cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 8280
cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 8340
ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 8400
cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 8460
ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 8520
tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 8580
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 8640
aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 8700
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 8760
atgcttcaat aatagcacct agatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa 8820
caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac 8880
tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg 8940
cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag 9000
gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt 9060
gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg 9120
tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg 9180
catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga 9240
gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag 9300
gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga cggcgaggat 9360
ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt 9420
tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg 9480
gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt 9540
tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc 9600
ttctgaatta ttaacgctta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc 9660
ggtatttcac accgcatcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 9720
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg accaaaatcc cttaacgtga 9780
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 9840
tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 9900
ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 9960
gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 10020
tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 10080
cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 10140
gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 10200
actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 10260
ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 10320
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 10380
atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 10440
tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 10500
tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 10560
aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 10620
gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 10680
gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca 10740
ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 10800
tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag 10860
ggaacaaaag ctggagctgc aagcttggcc attgcatacg ttgtatccat atcataatat 10920
gtacatttat attggctcat gtccaacatt accgccat 10958
<210> 45
<211> 10782
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lentiviral vector
<400> 45
cttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 600
ggggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 660
actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 720
gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag 780
cagtggcgcc cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc 840
aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg 900
ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt 960
aagcggggga gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa 1020
aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat 1080
cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc 1140
cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt 1200
gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag 1260
caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac ctggaggagg 1320
agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc 1380
attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt 1440
gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc 1500
gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa 1560
caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat 1620
caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct 1680
ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag 1740
ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag 1800
agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca 1860
agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt 1920
taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt 1980
aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2040
accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 2100
agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatctcg 2160
acggtatcgg ttaactttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag 2220
aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa 2280
aattcaaaat tttatcgatc acgagactag ccagaaaaga gggattgggg ccctctccca 2340
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cctgcatctg cagcattcgg ttcaatcctg ccacccactg ggcgtactcc tgaattgact 2580
ttccattgtc agctgatcag tgacagatgt gaaatgactc gttacacaca caggtcacat 2640
tgggaggatt cttagacgtc atattctttg gtgcttcaca aagtcttact gtggcacatg 2700
aaatgatttc agatggtgca caagatgatt tcacatgtaa atttccatga gggtgcaaag 2760
agaggctttt cccaatctga agaatgaatt taaaatctgc tgtagaaaaa taccagagag 2820
aaaaatatag aaagcagctg tccctcttac caatttcaga gcaggaaagg aatttcagta 2880
gagcataaaa acagctttct ctcataaaag aaaacacaac aagaaaaata atccttgctg 2940
tgtagccttt tgcagttatt ttctgtcatg tgttagatag agaccagagg gcttaacatt 3000
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agctttatgc ttccaggtgg cactgaagcc acattttcag tgccgttgtt atcagtcatt 3120
taattcccta ctgaatattg agtggtgttt ttagttcaca ggccatttgc agtgcctttc 3180
tgtttccttt ttaacgttag ccacattaag aaaaaaagtg ggctttgcct acagcacctg 3240
cttctgcttt ccgcatttac tgatccacta agtgtaagtg tgacatatag aggtctgtgt 3300
tggttgttgt tttgtgttca aacagctgaa catctggcct ctcatgtgca ggtgcacaga 3360
actcaggaga aggggtttta atttaagata aaaaaaataa ggatatgtgc tagttgcaga 3420
tgagggtttg ggtgctggac ttaagatgct tctgtgttca aaaacaagga gtcctcaatt 3480
tgcaaggttc ataaagagtt tcacacagat ggcacccaaa gtgcttattt ctcattgtgc 3540
tgaaattaaa cttgaatatg ctatatatca aataaataga agtaaatagc ctttctttat 3600
actttctaga agttgagctc aatgttcttt cggagagagc aggctcatct ccattatgta 3660
gcgccaatga caaatacctg tatatgtctg tatttccttg gtctgtcttg ctcacctgtt 3720
aagacacctt gctgcacaac agatggcaca tgcttatctt gtggcagtga agagttgaca 3780
tcaaaggcca agaaaacctt gaaactcatc cttttcagcc cacaagagca gcttctctct 3840
accacagacg atgaaagctg gagataacag gggcattccc accgctgcac tctctcttgt 3900
ggccagctga cagttaacac aggtgggcgt gaggtgctgc ctacattttg aaggttgtct 3960
attgatgggg aacaccacct ctctgagctc aggcctctgc tttggcccgt ggagctgctg 4020
cttctgagaa gtaaccaggt ggtgaatacc tgcctgcttt tcagaaaatc cgaggtggct 4080
gtcaattgac aattatttat tcattgtaaa ataatcacag gaacagcagc agtgtaggtt 4140
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caggagccta agggtgggtg gggagggaga agagagaaaa aagcaaaggg aaagttcaaa 4380
gtgacactcg ctggggctga aaaccacact cccctgcaga tgaggtcctt ggctctcgag 4440
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cttttggttt ccatttgcat ggagtatctt tttccatcct ttcacttttc atctatgtgt 4860
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acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 6300
acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta ccagtccgcc ctgagcaaag 6360
accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 6420
ctctcggcat ggacgagctg tacaagtgac tgcaggaatt cgagcatctt accgccattt 6480
attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca tttaaatgtt aataaaacaa 6540
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ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct taactatgtt gctcctttta 6720
cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc tattgcttcc cgtacggctt 6780
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cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctagg ttgctgggca 7020
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acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 8280
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 8340
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 8400
cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 8460
acaaaatatt aacgcttaca atttaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc 8520
tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 8580
ataaatgctt caataatagc acctagatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat 8640
tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 8700
tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 8760
ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga 8820
cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 8880
cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 8940
cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 9000
gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 9060
gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 9120
tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga 9180
ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 9240
cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 9300
gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 9360
gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 9420
gttcttctga attattaacg cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 9480
gtgcggtatt tcacaccgca tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 9540
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgaccaaa atcccttaac 9600
gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 9660
atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 9720
tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 9780
gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 9840
actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 9900
gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 9960
agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 10020
ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 10080
aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 10140
cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 10200
gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 10260
cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 10320
cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 10380
gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 10440
aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg 10500
actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac 10560
cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac 10620
aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gcgcgcaatt aaccctcact 10680
aaagggaaca aaagctggag ctgcaagctt ggccattgca tacgttgtat ccatatcata 10740
atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc at 10782
<210> 46
<211> 10782
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Lentiviral vector
<400> 46
cttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 600
ggggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 660
actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 720
gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag 780
cagtggcgcc cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc 840
aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg 900
ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt 960
aagcggggga gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa 1020
aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat 1080
cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc 1140
cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt 1200
gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag 1260
caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac ctggaggagg 1320
agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc 1380
attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt 1440
gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc 1500
gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa 1560
caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat 1620
caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct 1680
ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag 1740
ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag 1800
agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca 1860
agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt 1920
taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt 1980
aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2040
accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 2100
agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatctcg 2160
acggtatcgg ttaactttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag 2220
aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa 2280
aattcaaaat tttatcgatc acgagactag ccagaaaaga gggattgggg ccctctccca 2340
acagacatga gtatttagga gtccccagtt ccggtttcca catgacatga tatgatggtc 2400
tgttgttttc ctcagggacc tagaggcaga tgtagacaaa tagcaggtga ggaggaaggg 2460
tggtgctgag ctgtaaacaa cagctgcggg ctgtaaacaa tggagctata ttaagaaagt 2520
cctgcatctg cagcattcgg ttcaatcctg ccacccactg ggcgtactcc tgaattgact 2580
ttccattgtc agctgatcag tgacagatgt gaaatgactc gttacacaca caggtcacat 2640
tgggaggatt cttagacgtc atattctttg gtgcttcaca aagtcttact gtggcacatg 2700
aaatgatttc agatggtgca caagatgatt tcacatgtaa atttccatga gggtgcaaag 2760
agaggctttt cccaatctga agaatgaatt taaaatctgc tgtagaaaaa taccagagag 2820
aaaaatatag aaagcagctg tccctcttac caatttcaga gcaggaaagg aatttcagta 2880
gagcataaaa acagctttct ctcataaaag aaaacacaac aagaaaaata atccttgctg 2940
tgtagccttt tgcagttatt ttctgtcatg tgttagatag agaccagagg gcttaacatt 3000
gttttgatac ccttgcatct ggcagattgc ctgtcagagg aagttggaaa cgaactgacc 3060
agctttatgc ttccaggtgg cactgaagcc acattttcag tgccgttgtt atcagtcatt 3120
taattcccta ctgaatattg agtggtgttt ttagttcaca ggccatttgc agtgcctttc 3180
tgtttccttt ttaacgttag ccacattaag aaaaaaagtg ggctttgcct acagcacctg 3240
cttctgcttt ccgcatttac tgatccacta agtgtaagtg tgacatatag aggtctgtgt 3300
tggttgttgt tttgtgttca aacagctgaa catctggcct ctcatgtgca ggtgcacaga 3360
actcaggaga aggggtttta atttaagata aaaaaaataa ggatatgtgc tagttgcaga 3420
tgagggtttg ggtgctggac ttaagatgct tctgtgttca aaaacaagga gtcctcaatt 3480
tgcaaggttc ataaagagtt tcacacagat ggcacccaaa gtgcttattt ctcattgtgc 3540
tgaaattaaa cttgaatatg ctatatatca aataaataga agtaaatagc ctttctttat 3600
actttctaga agttgagctc aatgttcttt cggagagagc aggctcatct ccattatgta 3660
gcgccaatga caaatacctg tatatgtctg tatttccttg gtctgtcttg ctcacctgtt 3720
aagacacctt gctgcacaac agatggcaca tgcttatctt gtggcagtga agagttgaca 3780
tcaaaggcca agaaaacctt gaaactcatc cttttcagcc cacaagagca gcttctctct 3840
accacagacg atgaaagctg gagataacag gggcattccc accgctgcac tctctcttgt 3900
ggccagctga cagttaacac aggtgggcgt gaggtgctgc ctacattttg aaggttgtct 3960
attgatgggg aacaccacct ctctgagctc aggcctctgc tttggcccgt ggagctgctg 4020
cttctgagaa gtaaccaggt ggtgaatacc tgcctgcttt tcagaaaatc cgaggtggct 4080
gtcaattgac aattatttat tcattgtaaa ataatcacag gaacagcagc agtgtaggtt 4140
tccctaccta gagggtggta tgcagtgatt ctcaggcgct ggttggaagg cacagctgag 4200
ggacacaaac tgccaggaag taatgtggta actagccatg agcttgtggt actaatggtg 4260
gcacgggaaa caaggtctct gcttgacttt tattttcact ccataacaaa ctcaccagat 4320
caggagccta agggtgggtg gggagggaga agagagaaaa aagcaaaggg aaagttcaaa 4380
gtgacactcg ctggggctga aaaccacact cccctgcaga tgaggtcctt ggctctcgag 4440
tctaggcaag tgtctctctc tctctccccc tctttttctt ttagaaaaat acttcgtgat 4500
aaaaacacaa aagtatgtga atggtaattg aaaatgcatt gcttcctttt agaaacccac 4560
taggatttgc ataaaccact tggctgtctg ataagtcatt atctgttctg tcagtccctg 4620
gggactttta atattaggtt tatattttta tagaaaaggc aagttctaaa tttgaagatg 4680
ggtattgtta aactcttcaa taatgacagt ttgtgaaact gcatgttcca aaagtccttt 4740
aaaaagtcaa taaggcgaaa agtctatttt atctaatata agcgtagtta ctcctgctta 4800
cttttggttt ccatttgcat ggagtatctt tttccatcct ttcacttttc atctatgtgt 4860
gtctttgtag ttgaagtgag tttcttgtag atagcacatg gttatgtcct gtttgttttt 4920
gtccattcct tctgtcattt tattgttttc tggttgtttt gcatttctct tcctcgtttc 4980
tttatctctt actgtttatc tttgtgtggt ttgcttggtg acaaatttta gttactttct 5040
ctttcgcatc tgtgtatctg ctctactagt gggttctata cttttgtttg ttctcctgat 5100
ggtagttatt gccctttggc tttcagatat agggctcctt ttttaggtct actactcttg 5160
tgtctgaaag ttgcattttg tttgagtaag ttcattaagc agggacctga aagtaaacat 5220
caaaggtgtg ctgaatcagt ggtgacaatt tcatgtatca tatttcataa taatgttctt 5280
tcagagagca cataacatta actagcatgg agcagtgcat gctccctgta tttccttctg 5340
ggggccatga ttgtgaaagt gttgcttgtg atttaccagc agatatttat acacatttac 5400
ttatcacaag acgttttgag tctttcatgt ggagctcaaa gccttaaaac ataaaaacca 5460
agctaaagag ccaggtggca gctggagctg gggtctcctg gcccatgatt ggctgccatc 5520
atttgtggtt agccctccat ggtgggggag gctgggaagg acagtggaag ctgataaaca 5580
gctcagcagc atgttctgag aaacaagagg gcaaggagag agcagagaac acactttgcc 5640
ttctctttgg tattgagtaa tatcaaccaa attgcagaca tctcaacact ttggccaggc 5700
agcctgctga gcaaggtacc tcagccagca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 5760
gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 5820
ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 5880
ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cttcggctac ggcctgatgt 5940
gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 6000
aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 6060
ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 6120
tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg 6180
tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca 6240
acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 6300
acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta ccagtccgcc ctgagcaaag 6360
accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 6420
ctctcggcat ggacgagctg tacaagtgac tgcaggaatt cgagcatctt accgccattt 6480
attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca tttaaatgtt aataaaacaa 6540
aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat tactagttca ggtgtattgc 6600
cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg ctctgttcct gttaatcaac 6660
ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct taactatgtt gctcctttta 6720
cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc tattgcttcc cgtacggctt 6780
tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 6840
ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga cgcaaccccc actggctggg 6900
gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc tttccccctc ccgatcgcca 6960
cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctagg ttgctgggca 7020
ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc 7080
gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctggaa 7140
ttcgagctcg gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt 7200
tttaaaagaa aaggggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct 7260
ttttgcttgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta 7320
actagggaac ctactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg 7380
tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg 7440
gaaaatctct agcagtagta gttcatgtca tcttattatt cagtatttat aacttgcaaa 7500
gaaatgaata tcagagagtg agaggaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 7560
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 7620
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggctc tagctatccc gcccctaact 7680
ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 7740
atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag 7800
tgaggaggct tttttggagg cctagggacg tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt 7860
acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 7920
aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 7980
gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgggac gcgccctgta 8040
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 8100
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 8160
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 8220
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 8280
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 8340
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 8400
cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 8460
acaaaatatt aacgcttaca atttaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc 8520
tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 8580
ataaatgctt caataatagc acctagatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat 8640
tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 8700
tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 8760
ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga 8820
cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 8880
cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 8940
cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 9000
gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 9060
gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 9120
tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga 9180
ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 9240
cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 9300
gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 9360
gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 9420
gttcttctga attattaacg cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 9480
gtgcggtatt tcacaccgca tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 9540
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgaccaaa atcccttaac 9600
gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 9660
atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 9720
tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 9780
gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 9840
actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 9900
gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 9960
agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 10020
ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 10080
aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 10140
cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 10200
gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 10260
cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 10320
cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 10380
gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 10440
aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg 10500
actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac 10560
cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac 10620
aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gcgcgcaatt aaccctcact 10680
aaagggaaca aaagctggag ctgcaagctt ggccattgca tacgttgtat ccatatcata 10740
atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc at 10782
Claims (115)
- 재조합-활성화 유전자 1 (RAG1) 중증 복합 면역결핍증 치료용 재조합 렌티바이러스 벡터 (LV)에 있어서, 전술한 벡터는 다음을 포함하는, 벡터:
다음을 포함하는 발현 카세트:
RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 유효 단편을 인코드하는 핵산; 그리고
RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 전술한 유효한 단편에 작동가능하도록 연계된 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산. - 청구항 1에 있어서, 이때 RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 전술한 유효 단편의 서열은 RAGpro의 서열 (서열 식별 번호:2)을 포함하거나, 또는 이로 구성된, 벡터.
- 청구항 2에 있어서, 이때 RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 전술한 유효 단편의 서열은 RAGpro의 서열 (서열 식별 번호:2)로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 1 (서열 식별 번호: 1)의 서열 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 4에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소의 서열은 서열 식별 번호: 1의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-5중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 3 (서열 식별 번호:3) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 6에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 3의 서열은 서열 식별 번호:3의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 4 (서열 식별 번호:4) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 8에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 4의 서열은 서열 식별 번호:4의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 5 (서열 식별 번호:5) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 10에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 5의 서열은 서열 식별 번호:5의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 10에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 5의 서열은 서열 식별 번호:31의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-12중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 6 (서열 식별 번호:6) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 13에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 6의 서열은 서열 식별 번호:6의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-14중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 7 (서열 식별 번호:7) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 15에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 7의 서열은 서열 식별 번호:7 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-16중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 8 (서열 식별 번호:8) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 17에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 8의 서열은 서열 식별 번호:8의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-18중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 9.1 (서열 식별 번호:9) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 19에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 9.1의 서열은 서열 식별 번호:9의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 19에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 9.1의 서열은 서열 식별 번호:34의 인핸서 요소 9.1 코어 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-21중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 9.2 (서열 식별 번호:10) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 22에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 9.2의 서열은 서열 식별 번호:10의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-23중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 10 (서열 식별 번호:11) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 24에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 10의 서열은 서열 식별 번호:11의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-25중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 11 엑스트라 (서열 식별 번호:33) 또는 이의 유효 단편을 포함하거나, 또는 이로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-25중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 11 (서열 식별 번호:12) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 27에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 11의 서열은 서열 식별 번호:12의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-28중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 12 (서열 식별 번호:13) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 29에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 12의 서열은 서열 식별 번호:13의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-30중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 13 (서열 식별 번호:14) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 31에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 13의 서열은 서열 식별 번호:14의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 31에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 13의 서열은 서열 식별 번호:36 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-33중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 14 (서열 식별 번호:15) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 34에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 확대된 RAG1 인핸서 요소 14 코어 (서열 식별 번호:32) 또는 이의 유효 단편을 포함하거나, 또는 이로 구성된, 벡터.
- 청구항 34에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 14의 서열은 서열 식별 번호:15의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-36중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 16 (서열 식별 번호:16) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 37에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 16의 서열은 서열 식별 번호:16의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-38중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 17 (서열 식별 번호:17) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 39에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 17의 서열은 서열 식별 번호:17의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-40중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 인핸서 요소 18 (서열 식별 번호:18) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 벡터.
- 청구항 41에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 18의 서열은 서열 식별 번호:18 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 41에 있어서, 이때 전술한 RAG1 인핸서 요소 18의 서열은 서열 식별 번호:35의 서열 또는 이의 유효 단편으로 구성된, 벡터.
- 청구항 1-43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 전술한 핵산은 RAG1 cDNA 또는 코돈-최적화된 RAG1 유전자 또는 cDNA인, 벡터.
- 청구항 44에 있어서, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산을 인코드하는 전술한 핵산은 RAG1 cDNA (서열 식별 번호:19)인, 벡터.
- 청구항 44에 있어서, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산을 인코드하는 전술한 핵산은 코돈 최적화된 RAG1인, 벡터.
- 청구항 46에 있어서, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 전술한 핵산의 서열은 jCAT 코돈 최적화된 RAG1, GeneArt 최적화된 RAG1, 및 IDT 최적화된 RAG1로 구성된 군에서 선택된 코돈 최적화된 RAG1인, 벡터.
- 청구항 1-48중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 벡터는 CMV 인핸서/프로모터를 포함하는 5' LTR을 포함하는, 벡터.
- 청구항 1-49중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 벡터는 Rev 응답 요소 (RRE)를 포함하는, 벡터.
- 청구항 1-50중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 벡터는 중앙 폴리퓨린 지대를 포함하는, 벡터.
- 청구항 1-51중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 벡터는 전사-후 조절 요소를 포함하는, 벡터.
- 청구항 52에 있어서, 이때 상기 전사-후 조절 요소는 변형된 Woodchuck 전사-후 조절 요소 (WPRE)인, 벡터.
- 청구항 1-53중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 벡터 재조합을 통해 야생형 렌티바이러스를 재구성할 능력이 없는, 벡터.
- 청구항 1-54중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 벡터는 T-세포에서 높은 발현을 보인, 벡터.
- 청구항 1-55중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 벡터는 B-세포에서 높은 발현을 보인, 벡터.
- 청구항 1에 있어서, 이때 전술한 벡터는 다음으로 구성된 군에서 선택된 벡터 요소들을 포함하는, 벡터:
1) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG - RAG1pro-RAG-WPRE;
2) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 - RAG1pro-RAG-WPRE;
3) E5 코어, E14 코어, E9.1 OG 큰, E12 OG - RAG1pro-RAG-WPRE;
4) E5 코어, E14 코어, E9.1 OG 큰, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 - RAG1pro-RAG-WPRE;
5) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG + 18 우측, 11 전체, 13 우측 - RAG1pro-RAG-WPRE;
6) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG + 18 전체, 11 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE;
7) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG +18 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE;
8) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 + 18 우측, 11 전체, 13 우측 - RAG1pro-RAG-WPRE;
9) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 + 18 전체, 11 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE; 그리고
10) E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 +18 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE. - 청구항 57에 있어서, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함하는, 벡터.
- 청구항 58에 있어서, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:37의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 57에 있어서, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함하는, 벡터.
- 청구항 58에 있어서, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:38의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 57에 있어서, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 OG 큰, E12 OG - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함하는, 벡터.
- 청구항 58에 있어서, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:39의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 57에 있어서, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 OG 큰, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함하는, 벡터.
- 청구항 58에 있어서, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:40의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 57에 있어서, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG + 18 우측, 11 전체, 13 우측 - RAG1pro-RAG-WPRE를 포함하는, 벡터.
- 청구항 58에 있어서, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:41의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 57에 있어서, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG + 18 전체, 11 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 58에 있어서, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:42의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 57에 있어서, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG +18 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 58에 있어서, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:43의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 57에 있어서, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 + 18 우측, 11 전체, 13 우측 - RAG1pro-RAG-WPRE의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 58에 있어서, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 57에 있어서, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 + 18 전체, 11 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 58에 있어서, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:45의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 57에 있어서, 이때 전술한 벡터는 벡터 요소 E5 코어, E14 코어, E9.1 코어, E12 OG, E11 엑스트라 B-세포 인핸서 +18 전체 - RAG1pro-RAG-WPRE의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 58에 있어서, 이때 전술한 벡터는 서열 식별 번호:46의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
- 청구항 1-77중 임의의 한 항에 따른 벡터로 형질도입된 숙주 세포.
- 청구항 78에 있어서, 이때 상기 세포는 줄기 세포인, 숙주 세포.
- 청구항 79에 있어서, 이때 전술한 세포는 골수, 및/또는 배꼽 제대혈, 및/또는 말초 혈액으로부터 유래된 줄기 세포인, 숙주 세포.
- 청구항 78에 있어서, 이때 상기 세포는 인간 조혈 전구 세포인, 숙주 세포.
- 청구항 81에 있어서, 이때 상기 인간 조혈 전구 세포는 CD34+ 세포인, 숙주 세포.
- 대상체에서 재조합-활성화 유전자 1 (RAG1) 중증 복합 면역결핍증 (RAG1 SCID) 치료 방법에 있어서, 전술한 방법은 다음을 포함하는, 방법:
전술한 대상체의 줄기 세포 및/또는 전구 세포에 청구항 1-77중 임의의 한 항에 따른 벡터를 형질도입시키고; 그리고
전술한 형질도입된 세포 또는 이로부터 유래된 세포를 전술한 대상체에게 이식시키고, 여기에서 전술한 세포들 또는 이로부터 유도체들은 전술한 RAG1 단백질을 발현시킨다. - 청구항 83에 있어서, 이때 상기 세포는 줄기 세포인, 방법.
- 청구항 83에 있어서, 이때 전술한 세포는 골수로부터 유래된 줄기 세포인, 방법.
- 청구항 83에 있어서, 이때 상기 세포는 인간 조혈 줄기 및 전구 세포인, 방법.
- 청구항 86에 있어서, 이때 상기 인간 조혈 전구 세포는 CD34+ 세포인, 방법.
- 다음중 하나 또는 그 이상을 포함하는 재조합 핵산:
RAGpro의 서열 (서열 식별 번호:2)을 포함하거나, 또는 이로 구성된 RAG1 유전자의 내생성 프로모터의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 1 (서열 식별 번호: 1) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 3 (서열 식별 번호:3) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 4 (서열 식별 번호:4) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
확대된 RAG1 인핸서 요소 5 코어 (서열 식별 번호:31) 또는 이의 유효 단편
RAG1 인핸서 요소 5 (서열 식별 번호:5) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 6 (서열 식별 번호:6) 또는 이의 유효 단편;
RAG1 인핸서 요소 7 (서열 식별 번호:78) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 8 (서열 식별 번호:8) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 9.1 (서열 식별 번호:9) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 9.1 코어 서열 (서열 식별 번호:34) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 9.2 (서열 식별 번호:10) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 10 (서열 식별 번호:11) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 11 엑스트라 (서열 식별 번호:33) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 11 (서열 식별 번호:12) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 12 (서열 식별 번호:13) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 13 (서열 식별 번호:14) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
확대된 RAG1 인핸서 요소 14 코어 (서열 식별 번호:32) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 14 (서열 식별 번호:15) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 16 (서열 식별 번호:16) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 17 (서열 식별 번호:17) 또는 이의 유효 단편; 및/또는
RAG1 인핸서 요소 18 (서열 식별 번호:18) 또는 이의 유효 단편. - 청구항 88에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 유전자의 내생성 프로모터(서열 식별 번호:2)의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 백산.
- 청구항 88-89중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 1 (서열 식별 번호: 1) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-90중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 3 (서열 식별 번호:3) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-91중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 4 (서열 식별 번호:4) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-92중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 확대된 RAG1 인핸서 요소 5 코어 (서열 식별 번호:31) 또는 이의 유효 단편을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-92중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 5 (서열 식별 번호:5) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-94, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 6 (서열 식별 번호:6) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-95중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 7 (서열 식별 번호:78) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-96중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 8 (서열 식별 번호:8) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-97중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 9.1 (서열 식별 번호:9) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-98중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 9.2 (서열 식별 번호:10) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-99중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 10 (서열 식별 번호:11) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-100중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 11 (서열 식별 번호:12) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-101중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 12 (서열 식별 번호:13) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-102중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 13 (서열 식별 번호:14) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-103중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 확대된 RAG1 인핸서 요소 14 코어 (서열 식별 번호:32) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-103중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 14 (서열 식별 번호:15) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-105중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 16 (서열 식별 번호:16) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-106중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 17 (서열 식별 번호:17) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-107중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 RAG1 인핸서 요소 18 (서열 식별 번호:18) 또는 이의 유효 단편으로 구성된 서열을 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-108중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 발현 카세트를 포함하는, 핵산.
- 청구항 109에 있어서, 이때 전술한 발현 카세트는 RAG1 단백질을 인코드하는 핵산을 포함하는, 핵산.
- 청구항 110에 있어서, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 전술한 핵산은 RAG1 cDNA를 포함하는, 핵산.
- 청구항 110에 있어서, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 전술한 핵산은 코돈-최적화된 RAG1 cDNA를 포함하는, 핵산.
- 청구항 110-112중 임의의 한 항에 있어서, 이때 RAG1 단백질을 인코드하는 전술한 핵산은 내생성 RAG1 프로모터 또는 이의 유효 단편에 작동가능하도록 연계된, 핵산.
- 청구항 110-113중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 청구항 1-77중 임의의 한 항에 따른 렌티바이러스 벡터를 포함하는, 핵산.
- 청구항 88-114중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 핵산은 내생성 RAG1 유전자를 포함하지 않는, 핵산.
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