CN112203697A - 编码氨基己糖苷酶alpha和beta亚基的双顺反子AAV载体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开的方面涉及双顺反子AAV核酸构建体，其包含编码氨基己糖苷酶A(HEXA)和氨基己糖苷酶(HEXB)蛋白质的转基因。在一些实施方案中，本公开提供了使用本公开所述的双顺反子核酸构建体来治疗或预防溶酶体贮积病症，如泰‑萨克斯病和桑德霍夫病的方法。

Description

编码氨基己糖苷酶alpha和beta亚基的双顺反子AAV载体及其 用途
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年4月13日提交的美国临时申请序列号62/657,243的申请日的权益，其全部内容通过引用并入本文。
联邦赞助的研究
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的国家资助号NS093941的支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease，TSD)和桑德霍夫病(Sandhoff disease，SD)是分别由HEXA或HEXB基因突变所致的氨基己糖苷酶A(HexA)缺乏引起的常染色体隐性溶酶体贮积病(LSD)。HexA缺乏导致GM2神经节苷脂储存在中枢神经系统(CNS)中，并逐渐使神经功能恶化，发育退化并最终导致过早死亡。目前，没有针对这些统称为GM2神经节苷脂贮积病的疾病的可用的治疗方法。
发明概述
本公开的方面涉及用于基因递送的重组AAV载体。本公开部分地基于以下发现：同时编码氨基己糖苷酶alpha和beta亚基的单个AAV载体允许HexA在受试者(例如患有泰-萨克斯病或桑德霍夫病的受试者)的CNS中的侵入性更低且可能更有效地表达。如实施例部分中所述，本公开的组合物包含以下结构中的两个HexA亚基(例如，编码HEXA和HEXB转录物)，所述结构已显示在体内具有功能并达到重要的治疗里程碑。
因此，在一些方面，本公开提供了分离的核酸构建体，其包含：第一表达盒，其包含在第一启动子的控制下编码氨基己糖苷酶alpha亚基(HexA)的核酸，以及第一内含子；和第二表达盒，其包含在第二启动子的控制下编码氨基己糖苷酶beta亚基(HexB)的核酸，和第二内含子。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒的侧翼是腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
在一些实施方案中，HexA包含如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，HexB包含如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一内含子位于第一启动子和编码HexA的核酸序列之间。在一些实施方案中，第一内含子是嵌合内含子。在一些实施方案中，第一启动子位于AAV ITR的近端，任选地其中第一启动子位于AAV ITR和编码HexA的核酸序列之间。在一些实施方案中，第一启动子和/或第二启动子是P2启动子。在一些实施方案中，第二内含子位于第二启动子和编码HexB的核酸序列之间。在一些实施方案中，第二内含子是嵌合内含子。在一些实施方案中，第二启动子位于AAV ITR的近端。在一些实施方案中，其中第二启动子位于AAVITR和编码HexB的核酸序列之间。
在一些实施方案中，第一表达盒包含与编码HexA的核酸序列可操作地连接的第一poly A信号(例如，poly A尾)，任选地其中第一poly A信号(例如，poly A尾)是BGH poly A信号(例如，BGH poly A尾)。在一些实施方案中，第二表达盒包含与编码HexB的核酸序列可操作地连接的第二poly A信号(例如，poly A尾)。在一些实施方案中，第二poly A信号(例如，poly A尾)是SV40 poly A信号(例如，SV40 poly A尾)。在一些实施方案中，第一poly A信号(例如，poly A尾)和第二poly A信号(例如，poly A尾)彼此相邻放置。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒以相反的方向定向(例如，第一表达盒和第二表达盒朝向彼此转录)。
在一些方面，本公开提供了分离的核酸构建体，其包含：第一表达盒，其包含编码氨基己糖苷酶alpha亚基的核酸序列；和第二表达盒，其包含编码氨基己糖苷酶beta亚基的核酸序列，其中第一表达盒和第二表达盒通过双向启动子可操作地连接。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒的侧翼是腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
在一些实施方案中，HexA包含如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，HexB包含如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，双向启动子包含至少一个鸡beta-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，双向启动子包含两个CBA启动子，其中CBA启动子以相反的方向启动第一表达盒和第二表达盒的转录(例如，第一表达盒的转录发生在相对于第二表达盒远端的方向上)。在一些实施方案中，双向启动子包含CMV增强子序列。在一些实施方案中，CMV增强子序列位于两个CBA启动子之间。
在一些实施方案中，第一表达构建体包含第一poly A信号(例如，第一poly A尾)，任选地其中第一poly A信号(例如，第一poly A尾)在AAV ITR近端。在一些实施方案中，第一表达构建体包含第二poly A信号(例如，第二poly A尾)。在一些实施方案中，第二poly A信号(例如，第二poly A尾)在AAV ITR近端。在一些实施方案中，第一和/或第二poly A信号(例如，poly A尾)各自选自SV40 poly A信号(例如，SV40 poly A尾)、兔beta-球蛋白(RBG)poly A信号(例如，RBG poly A尾)和牛生长激素(BGH)poly A信号(例如，BGH poly A尾)。
在一些方面，本公开提供了分离的核酸，其包含SEQ ID NO：3-9中所示的序列。在一些实施方案中，编码HexA蛋白和/或HexB的分离的核酸经密码子优化。
在一些方面，本公开提供了重组AAV(rAAV)，其包含：衣壳蛋白；以及以上任何一种的分离的核酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白的血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10、AAVrh1O、AAV-PHP.B和AAV-PHP.eB。
在一些实施方案中，分离的核酸包含选自下组的ITR：AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR或AAV6 ITR。
在一些实施方案中，本公开提供了包含核酸或rAAV的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。
在一些方面，本公开提供了用于治疗溶酶体贮积病的方法，该方法包括向患有或怀疑患有溶酶体贮积病的受试者施用分离的核酸或rAAV。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，溶酶体贮积病是泰-萨克斯病或桑德霍夫病。在一些实施方案中，受试者的特征在于在HEXA基因中具有突变，从而导致该受试者的氨基己糖苷酶alpha亚基功能降低(或丧失)。在一些实施方案中，受试者的特征在于在HEXB基因中具有突变，从而导致该受试者的氨基己糖苷酶beta亚基功能降低或丧失。
在一些实施方案中，通过颅内注射、脑内注射或者经由脑室系统、小脑延髓池或鞘内空间注射到CSF中施用rAAV。在一些实施方案中，在溶酶体贮积病的症状前阶段期间向受试者施用分离的核酸或rAAV。在一些实施方案中，溶酶体贮积病的症状前阶段发生在出生(例如围产期)至4周龄之间。
附图简述
图1显示同时编码氨基己糖苷酶alpha和beta亚基的双顺反子AAV载体的结构的示意图。在一些实施方案中，AAV-BiP2i-HexAB载体在AAV基因组的末端处携带两个拷贝的小启动子与小内含子(P2i)，以相反的方向驱动Hex alpha和beta亚基的表达。在一些实施方案中，AAV-BiCBA-HexAB载体携带双向CBA启动子，该双向CBA启动子是通过与中间的CMV增强子相反方向的鸡beta-肌动蛋白启动子的重复设计的。
图2A-2C显示AAV处理的Sandhoff(SD)小鼠(Hexb-/-)的行为表现随时间保持稳定。在60、90、105、120和149日龄时评估了AAV处理的SD小鼠和对照的运动协调性和表现。图2A显示使用加速转杆测试(accelerating rotarod test)(300秒内4-40rpm)的SD小鼠的表现。图2B显示使用评估掉落等待时间(latency to falling)的倒置筛网测试(invertedscreen test)的SD小鼠的表现，并且图2C显示使用评估后肢运动次数的倒置筛网测试的SD小鼠的表现。
图3显示系统性AAV处理降低了SD小鼠的整个中枢神经系统(CNS)中的GM2神经节苷脂含量。使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法，在AAV处理的SD小鼠(4x 1012vg AAV9或1x 1012vg AAV-PHP.B)中，于150日龄时测量GM2神经节苷脂含量。正常动物的CNS中的GM2神经节苷脂水平低于该方法的检测极限。
图4A-4D显示用4x 1012vg AAV9或1x 1012vg AAV-PHP.B载体处理的150日龄SD小鼠的脑中氨基己糖苷酶活性增加。图4A显示使用人工底物MUGS在大脑中的HexA酶活性。图4B显示使用人工底物MUG在大脑中的总Hex(HexA+HexB)活性。图4C显示使用MUGS在小脑中的HexA酶活性。图4D显示使用MUG在小脑中的总Hex活性。
图5显示在SD小鼠中系统性递送AAV-PHP.B-BiCBA-HexAB后，使用人工底物MUG在肝中总氨基己糖苷酶活性增加。
图6A-6B显示系统性AAV处理延长了SD小鼠的存活。用低剂量或高剂量AAV疗法对四周龄SD小鼠进行处理，并评估其存活率。图6A显示用低剂量AAV9-Bic(1x 1012vg)、AAV9-P2I(1x 1012vg)、AAV-PHP.B-Bic(3x 1011vg)、AAV-PHP.B-P2I(3x 1011vg)，载体或PBS(KO)进行处理。图6B显示用高剂量AAV9-Bic(4x 1012vg)、AAV9-P2I(4x 1012vg)、AAV-PHP.B(1x1012vg)、AAV-PHP.B-Bic-P2I(1x 1012vg)，载体或PBS(KO)进行处理。
图7显示AAV-PHP.B-BiCBA-HexAB载体的系统性递送在SD小鼠的整个脑中恢复了Hex活性。使用矢状脑切片的酶特异性组织化学染色在注射后一个月评估Hex酶活性的分布。显示了所有三个AAV处理的小鼠的切片。
图8A-8D显示数据，其表明用双顺反子AAV9对GM2小鼠进行新生儿ICV处理改善神经化学、行为和存活。图8A显示在注射AAV9-BiCB-HexAB后于1月龄时大脑[C]、小脑和脑干[Cb+BS]中的GM2神经节苷脂含量。图8B显示通过加速转杆(5分钟内4-40rpm)测试对运动表现的评估。图8C显示关于120和150日龄时倒置筛网测试(最大120秒)的数据。图8D显示Kaplan-Meier存活图。未经处理的GM2小鼠的中位存活期为129.5天。双向t检验用于比较AAV与未经处理的GM2对照之间的结果(****P＜0.0001；***P＜0.001；**P＜0.01)。
图9A至图9C显示数据，其表明AAV9-BiCB-HexAB的腰椎鞘内递送改善了运动表现并增加了GM2小鼠的存活。图9A显示使用加速转杆(5分钟内4-40rpm)测试在约6周龄时用1x1012 vg处理的GM2小鼠中运动表现随时间的评估。图9B显示关于倒置筛网测试(最大120秒)的数据。图9C显示Kaplan-Meier分析，其表明AAV处理的GM2小鼠的存活率显著增加(P＜0.0001)，其中当前中位存活期为265天，与之相比未经处理的GM2小鼠为129.5天。对数秩检验用于评估存活获益。
发明详述
腺相关病毒(AAV)介导的基因疗法是一种治疗TSD和SD的实验方法，例如，经由颅内将转基因递送至脑实质。由于HexA是αβ异二聚体，因此alpha和beta亚基两者的过表达是必要的。由于重组AAV载体的转基因大小限制(约4.7kb)，通常通过共同注射两种分开编码Hex alpha和beta亚基的载体来实现此目的。通过血流或CSF递送两种分开的载体会损害这种方法的功效，因为HexA过表达需要将细胞与两种载体共感染，并且其可能性甚至会急剧下降，因为当将载体输注到这些体液中时会被稀释。
在一些方面，本公开涉及可用于治疗溶酶体贮积症例如泰-萨克斯病或桑德霍夫病的组合物和方法。本公开部分地基于重组AAV载体(例如，分离的核酸)和重组腺相关病毒(rAAV)，其包含经配置用于在受试者的CNS中双顺反子表达多个(例如2个、3个等)治疗性转基因的表达盒。
分离的核酸
在一些方面，本公开提供了可用于在受试者的CNS中表达治疗性转基因的分离的核酸(例如，双顺反子表达构建体，如rAAV载体)。
在一些实施方案中，治疗性转基因编码与溶酶体贮积病(例如，泰-萨克斯病，桑德霍夫病)有关的一种或多种蛋白质，例如HexA蛋白、HexB蛋白或HexA和HexB蛋白。在一些实施方案中，HexA蛋白包含如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，HexB蛋白包含如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，转基因(例如，编码HexA的转基因)编码与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列至少70％(例如，至少70％、80％、90％、95％、99％等)相同的序列。在一些实施方案中，转基因(例如，编码HexB的转基因)编码与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列至少70％(例如，至少70％、80％、90％、95％、99％等)相同的序列。在一些实施方案中，转基因编码双顺反子表达构建体，其如图1所示携带两个相反定向的表达盒，AAV-BiP2i-HexAB和AAV-BiCBA-HexAB。双顺反子构建体编码的HexA和HexB蛋白的每一个可以包含分别与SEQ ID NO：1或2中所示的氨基酸序列至少70％(例如，至少70％、80％、90％、95％、99％等)相同的序列。
在一些实施方案中，转基因(例如，编码HexA的转基因)包含与SEQ ID NO：3-9的任一个(或其一部分)中所示的HexA编码核酸序列(例如，野生型HexA核酸序列，经密码子优化的HexA编码序列等)至少70％(例如，至少70％、80％、90％、95％、99％等)相同的核酸序列。在一些实施方案中，转基因(例如，编码HexB的转基因)包含与SEQ ID NO：3-9的任一个(或其一部分)中所示的HexB编码核酸序列(例如，野生型HexB核酸序列，经密码子优化的HexB编码序列等)至少70％(例如，至少70％、80％、90％、95％、99％等)相同的核酸序列。
“核酸”序列是指DNA或RNA序列。在一些实施方案中，分离了本公开的蛋白质和核酸。如本文所用，术语“分离的”意指人工生产。如本文关于核酸所使用的，术语“分离的”意指：(i)通过例如聚合酶链反应(PCR)在体外扩增；(ii)通过克隆重组产生；(iii)通过裂解和凝胶分离进行纯化；或(iv)通过例如化学合成来合成。分离的核酸是可通过本领域众所周知的重组DNA技术容易地操作的核酸。因此，认为包含在其中已知5’和3’限制性位点或已公开其聚合酶链反应(PCR)引物序列的载体中的核苷酸序列是分离的，但以其天然状态存在于其天然宿主中的核酸序列不是分离的。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不是必须的。例如，在克隆或表达载体内分离的核酸不是纯净的，因为它可能仅占其所驻留细胞中物质的很小百分比。然而，此类核酸是分离的，如该术语在本文中所使用，因为其可通过本领域普通技术人员已知的标准技术容易地操作。如本文关于蛋白质或肽所使用的，术语“分离的”是指已经从其天然环境中分离或人工生产(例如，通过化学合成，通过重组DNA技术等)的蛋白质或肽。
本发明的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(AAV)载体(rAAV载体)。在一些实施方案中，如本公开所述的分离的核酸包括包含第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)的区域(例如，第一区域)或其变体。分离的核酸(例如，重组AAV载体)可以包装到衣壳蛋白中并施用于受试者和/或递送至选定的靶细胞。“重组AAV(rAAV)载体”通常至少由转基因及其调节序列以及5’和3’AAV反向末端重复(ITR)组成。如本公开中其他地方所述，转基因可以包含编码例如蛋白质和/或表达控制序列(例如，poly-A尾)的区域。
通常，ITR序列的长度约为145bp。优选地，分子中基本上使用了编码ITR的整个序列，尽管可允许对这些序列进行某种程度的微小修饰。修饰这些ITR序列的能力在本领域技术范围内。(参见，例如，文本如Sambrook et al.，″Molecular Cloning.A LaboratoryManual″，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)；和K.Fisher etal.，J Virol.，70：520532(1996))。在本发明中采用的此类分子的一个实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选定的转基因序列和相关的调节元件的侧翼是5’和3’AAV ITR序列。AAV ITR序列可以从任何已知的AAV获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，分离的核酸(例如，rAAV载体)包含至少一种具有选自以下的血清型的ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6，及其变体。
在一些实施方案中，分离的核酸进一步包括包含第二AAV ITR的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)。在一些实施方案中，第二AAV ITR具有选自以下的血清型的ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6，及其变体。
除了上面鉴定的用于重组AAV载体的主要元件外，该载体还包括常规控制元件，其以允许其在用本发明产生的载体转染或用病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因的元件可操作地连接。如本文所用，“可操作地连接”的序列包括与感兴趣的基因连续的表达控制序列和以反式或在远端作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列两者。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强编码产物的分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然的、组成型、诱导型和/或组织特异性的启动子，在本领域中是已知的并且可以被利用。
如本文所用，当核酸序列(例如，编码序列)和调节序列以将核酸序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制下的方式共价连接时，其被认为是可操作地连接的。如果期望将核酸序列翻译成功能性蛋白质，则如果在5’调节序列中诱导启动子导致编码序列的转录，且如果两个DNA序列之间的连接的性质不(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或者(3)干扰相应的RNA转录物被翻译成蛋白质的能力，则认为两个DNA序列是可操作地连接的。因此，如果启动子区域能够影响该DNA序列的转录，使得所得的转录物可以被翻译成所期望的蛋白质或多肽，则该启动子区域将是与核酸序列可操作地连接的。类似地，当两个或多个编码区以使得它们从共同启动子的转录导致两个或更多个蛋白质的表达已在框内翻译的方式连接时，它们是可操作地连接的。在一些实施方案中，可操作地连接的编码序列产生融合蛋白。
包含转基因的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)可以位于分离的核酸的任何合适的位置。该区域可以位于核酸的任何非翻译部分，包括例如内含子，5’或3’非翻译区域等。
在一些情况下，可以期望将区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)置于编码蛋白质的核酸序列(例如，蛋白质编码序列)的第一密码子的上游。例如，该区域可以位于蛋白质编码序列的第一密码子和第一密码子上游的2000个核苷酸之间。该区域可以位于蛋白质编码序列的第一密码子和第一密码子上游的1000个核苷酸之间。该区域可以位于蛋白质编码序列的第一密码子和第一密码子上游的500个核苷酸之间。该区域可以位于蛋白质编码序列的第一密码子和第一密码子上游的250个核苷酸之间。该区域可以位于蛋白质编码序列的第一密码子和第一密码子上游的150个核苷酸之间。
在一些情况下(例如，当转基因缺乏蛋白质编码序列时)，可以期望将区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)置于转基因的poly-A信号上游。例如，该区域可以位于poly-A信号的第一碱基和第一碱基上游的2000个核苷酸之间。该区域可以位于poly-A信号的第一碱基和第一碱基上游的1000个核苷酸之间。该区域可以位于poly-A信号的第一碱基和第一碱基上游的500个核苷酸之间。该区域可以位于poly-A信号的第一碱基和第一碱基上游的250个核苷酸之间。该区域可以位于poly-A信号的第一碱基和第一碱基上游的150个核苷酸之间。该区域可以位于poly-A信号的第一碱基和第一碱基上游的100个核苷酸之间。该区域可以位于poly-A信号的第一碱基和第一碱基上游的50个核苷酸之间。该区域可以位于poly-A信号的第一碱基和第一碱基上游的20个核苷酸之间。在一些实施方案中，该区域位于启动子序列的最后一个核苷酸碱基和poly-A信号序列的第一核苷酸碱基之间。
在一些情况下，该区域可以位于转基因的poly-A信号的最后一个碱基的下游。该区域可以在poly-A信号的最后一个碱基和最后一个碱基下游2000个核苷酸的位置之间。该区域可以在poly-A信号的最后一个碱基和最后一个碱基下游1000个核苷酸的位置之间。该区域可以在poly-A信号的最后一个碱基和最后一个碱基下游500个核苷酸的位置之间。该区域可以在poly-A信号的最后一个碱基和最后一个碱基下游的250个核苷酸的位置之间。该区域可以在poly-A信号的最后一个碱基和最后一个碱基下游150个核苷酸的位置之间。
应当理解，在转基因编码超过一种多肽的情况下，每种多肽可以位于转基因内的任何合适的位置。例如，编码第一多肽的核酸可以位于转基因的内含子中，而编码第二多肽的核酸序列可以位于另一个非翻译区中(例如，在蛋白质编码序列的最后一个密码子和转基因的poly-A信号的第一碱基之间)。
“启动子”是指被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的，启动基因的特异性转录所需的DNA序列。短语“可操作地定位”、“在控制之下”或“在转录控制之下”意指启动子相对于核酸而言处于正确的位置和定向以控制RNA聚合酶起始和基因的表达。
对于编码蛋白质的核酸，通常在转基因序列之后和3’AAV ITR序列之前插入聚腺苷酸化序列。可用于本公开的rAAV构建体还可以含有内含子，其期望地位于启动子/增强子序列和转基因之间。一种可能的内含子序列衍生自SV-40，并称为SV-40T内含子序列。可以使用的另一种载体元件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列用于从单个基因转录物中产生超过一种多肽。IRES序列将用于产生含有超过一条多肽链的蛋白质。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多此类序列是可用的[参见，例如，Sambrook等人，以及其中引用的参考文献，例如，第3.18 3.26和16.17 16.27页和Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1989]。在一些实施方案中，口蹄疫病毒2A序列包括在多蛋白中；这是一种小肽(长度约18个氨基酸)，其已显示出介导多蛋白的切割(Ryan，M D et al.，EMBO，1994；4：928-933；Mattion，N M et al.，JVirology，November 1996；p.8124-8127；Furler，S et al.，Gene Therapy，2001；8：864-873；和Halpin，C et al.，The Plant Journal，1999；4：453-459)。2A序列的切割活性先前已在包括质粒和基因疗法载体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中得到证实(Ryan，M D etal.，EMBO，1994；4：928-933；Mattion，NM et al.，J Virology，November 1996；p.8124-8127；Furler，S et al.，Gene Therapy，2001；8：864-873；和Halpin，C et al.，The PlantJournal，1999；4：453-459；de Felipe，P et al.，Gene Therapy，1999；6：198-208；deFelipe，P et al.，Human Gene Therapy，2000；11：1921-1931.；和Klump，H et al.，GeneTherapy，2001；8：811-817)。
组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见，例如Boshart et al.，Cell，41：521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。在一些实施方案中，启动子是P2启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，启动子是两个CBA启动子。在一些实施方案中，启动子是由CMV增强子分开的两个CBA启动子。
诱导型启动子允许基因表达的调节，并且可以由外源供应的化合物，环境因素例如温度或特定生理状态的存在例如急性期，细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中来调节。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。已经描述了许多其他系统，并且本领域技术人员可以容易地对其进行选择。由外源供应的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-3351(1996))、四环素可阻遏系统(Gossen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992))、四环素可诱导系统(Gossen et al.，Science，268：1766-1769(1995)，还参见Harvey et al.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：512-518(1998))、RU486可诱导系统(Wang etal.，Nat.Biotech.，15：239-243(1997)和Wang et al.，Gene Ther.，4：432-441(1997))和雷帕霉素可诱导系统(Magari et al.，J.Clin.Invest.，100：2865-2872(1997))。在这种情况下可能有用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态(例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)调节的启动子。
在另一个实施方案中，将使用转基因的天然启动子。当期望转基因的表达应模拟天然表达时，天然启动子可以是优选的。当必须在时间或发育上，或以组织特异性方式或响应于特定转录刺激调节转基因的表达时，可以使用天然启动子。在进一步的实施方案中，其他天然表达控制元件，如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列也可以用于模拟天然表达。
在一些实施方案中，调节序列给予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调节序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调节序列(例如启动子、增强子等)是本领域众所周知的。示例性的组织特异性调节序列包括但不限于以下组织特异性启动子：肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、胰岛素启动子、胰高血糖素启动子、生长抑素启动子、胰多肽(PPY)启动子、突触蛋白-1(Syn)启动子、肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(DES)启动子、α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子或心肌钙蛋白T(cTnT)启动子。其他示例性启动子包括beta-肌动蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig et al.，Gene Ther.，3：1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)启动子，Arbuthnot et al.，Hum.Gene Ther.，7：1503-14(1996))、骨骨钙蛋白启动子(Stein etal.，Mol.Biol.Rep.，24：185-96(1997))；骨唾液蛋白启动子(Chen et al.，J.BoneMiner.Res.，11：654-64(1996))、CD2启动子(Hansal et al.，J.Immunol.，161：1063-8(1998)；免疫球蛋白重链启动子；T细胞受体α链启动子、神经元如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen et al.，Cell.Mol.Neurobiol.，13：503-15(1993))、神经丝轻链基因启动子(Piccioli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：5611-5(1991))和神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli et al.，Neuron，15：373-84(1995))等等，这些对于熟练技术人员是显而易见的。
本公开的方面涉及包含超过一个启动子(例如2、3、4、5个或更多个启动子)的分离的核酸。例如，在具有包含编码蛋白质的第一区域和编码蛋白质的第二区域的转基因的构建体的情况下，可以期望使用第一启动子序列(例如，与蛋白质编码区可操作地连接的第一启动子序列)来驱动第一蛋白质编码区域的表达，并用第二启动子序列(例如，与第二蛋白质编码区可操作地连接的第二启动子序列)驱动第二蛋白质编码区的表达。通常，第一启动子序列和第二启动子序列可以是相同的启动子序列或不同的启动子序列。在一些实施方案中，第一启动子序列(例如，驱动蛋白质编码区表达的启动子)是RNA聚合酶III(pol III)启动子序列。pol III启动子序列的非限制性实例包括U6和H1启动子序列。在一些实施方案中，第二启动子序列(例如，驱动第二蛋白质表达的启动子序列)是RNA聚合酶II(pol II)启动子序列。pol II启动子序列的非限制性实例包括T7、T3、SP6、RSV和巨细胞病毒启动子序列。在一些实施方案中，pol III启动子序列驱动第一蛋白质编码区的表达。在一些实施方案中，pol II启动子序列驱动第二蛋白质编码区的表达。
在一些实施方案中，核酸包含编码蛋白质的转基因。蛋白质可以是治疗性蛋白质(例如，可用于治疗或预防哺乳动物受试者中疾病状态的肽、蛋白质或多肽)或报告物蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质可用于治疗或预防溶酶体贮积病，如泰-萨克斯病或桑德霍夫病，包括但不限于氨基己糖苷酶A(HexA)和氨基己糖苷酶B(HexB)。
双顺反子核酸构建体
本发明的一些方面提供了双顺反子核酸构建体。术语“顺反子”是指足以表达基因产物的核酸盒。在一些实施方案中，顺反子是表达盒。因此，本发明的一些方面提供了包含两个或更多个顺反子，例如两个或更多个表达盒的核酸构建体。术语“表达盒”是指包含足以表达基因产物的核酸元件的核酸构建体。通常，表达盒包含编码与启动子序列可操作地连接的基因产物的核酸。编码序列可以以有义或反义定向与调节序列可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是异源启动子。如本文所用，术语“异源启动子”是指在自然界中未发现与给定编码序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，表达盒可以包含另外的元件，例如内含子、增强子、聚腺苷酸化位点、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)和/或已知影响编码序列的表达水平的其他元件。不希望受到理论的束缚，据信内含子包含在表达盒中，例如在转录起始位点和编码核酸序列，例如编码蛋白质的cDNA序列之间，会导致与不包括内含子的表达构建体相比，编码核酸和编码的基因产物的表达水平增加。
术语“内含子”是指表达盒中的核酸序列，其在初级转录物的转录后通过称为剪接的细胞过程被除去。内含子序列通常包含剪接供体和剪接受体，并且此类供体和受体位点的序列是本领域技术人员众所周知的。如本文所用，“嵌合内含子”由来自两个或更多个不同来源的核酸序列组成。
本发明的一些方面提供了双顺反子表达构建体，其包含两个或更多个处于各种结构的表达盒。
在不同的实施方案中，提供了双顺反子表达构建体，其中表达盒以不同的方式定位。例如，在一些实施方案中，提供了多顺反子表达构建体，其中第一表达盒与第二表达盒相邻定位。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒通过双向启动子可操作地连接，其中第一表达盒和第二表达盒的侧翼为腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
在不同的实施方案中，提供了双顺反子表达构建体，其中表达盒以不同方式定向。例如，在一些实施方案中，提供了双顺反子表达构建体，其包含以相反定向的第一和第二表达盒。
如本文所用与表达盒有关的术语“定向”是指给定盒或结构的方向特征。在一些实施方案中，表达盒带有编码核酸序列的5’的启动子，并且编码核酸序列的转录从有义链的5’末端延伸至3’末端，从而使其成为定向盒(例如，5’-启动子/(内含子)/编码序列-3’)。由于实际上所有表达盒在这种意义上都是定向的，因此本领域技术人员可以容易地确定给定表达盒相对于第二核酸结构，例如第二表达盒，病毒基因组，或者如果盒包含在AAV构建体中，相对于AAV ITR的定向。
例如，如果给定的核酸构建体以以下结构包含两个表达盒：
5’-启动子1/编码序列1---启动子2/编码序列2-3’，
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则表达盒处于相同的定向，箭头表示每个盒的转录方向。对于另一个实例，如果给定的核酸构建体包含有义链，所述有义链以以下结构包含两个表达盒：
5’-启动子1/编码序列1---编码序列2/启动子2-3’，
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则表达盒彼此处于相反的定向，并且如箭头所示，表达盒的转录方向是相反的。在该实例中，所示的链包含启动子2和编码序列2的反义链。
对于另一个实例，如果表达盒包含在AAV构建体中，则该盒可以处于与AAV ITR或第二表达盒相同的定向(例如，表达盒的转录沿与AAV ITR或第二表达盒的转录相同的方向进行)或相反的定向(例如，表达盒的转录以与AAV ITR或第二表达盒的转录相反的方向(例如向远端)进行)。AAV ITR是定向的。例如，图1(上)中示例的包含5’ITR的AAV构建体将与HexA表达盒表达盒处于相同的定向。在另一个实例中，图1(下)中示例的包含5’ITR的AAV构建体将与HexA表达盒表达盒处于相反的定向。
大量证据表明，与仅含有一个顺反子的表达系统相比，双顺反子表达构建体通常无法达到最佳表达水平。用包含两个或更多个启动子元件的双顺反子表达构建体达到低于标准表达水平的建议原因之一是启动子干扰现象(参见，例如，Curtin JA，Dane AP，Swanson A，Alexander IE，Ginn SL.Bidirectional promoter interference betweentwo widely used internal heterologous promoters in a late-generationlentiviral construct.Gene Ther.2008Mar；15(5)：384-90；和Martin-Duque P，JezzardS，Kaftansis L，Vassaux G.Direct comparison of the insulating properties of twogenetic elements in an adenoviral vector containing two different expressioncassettes.Hum Gene Ther.2004Oct；15(10)：995-1002；两篇参考文献均通过引用并入本文以公开启动子干扰现象)。已经提出了各种策略来克服启动子干扰的问题，例如，通过产生仅包含一个启动子来驱动由内部核糖体进入位点分隔的多个编码核酸序列的转录的双顺反子表达构建体，或通过用转录绝缘子元件将包含其自身启动子的顺反子分开。但是，所有建议的克服启动子干扰的策略都有其自身的一组问题负担。例如，多个顺反子的单启动子驱动表达通常导致顺反子的表达水平不均匀。此外，一些启动子不能有效地分离，并且分离元件与一些基因转移载体，例如一些逆转录病毒载体不相容。
在一些实施方案中，提供了双顺反子表达构建体，其允许在不使用转录绝缘子元件的情况下有效表达由第一启动子驱动的第一编码核酸序列和由第二启动子驱动的第二编码核酸序列。本文提供了此类双顺反子表达构建体的各种结构，例如，具有包含内含子的第一表达盒和包含内含子的第二表达盒的表达构建体，其中第一表达盒和第二表达盒在位于AAV ITR近端的分开的启动子的控制下，该AAV ITR在第一表达盒和第二表达盒的侧翼。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒通过双向启动子可操作地连接并且侧翼为AAV ITR。
在一些实施方案中，提供了双顺反子表达构建体，其允许有效表达两个或更多个编码核酸序列。在一些实施方案中，双顺反子表达构建体包含两个表达盒。在一些实施方案中，如本文提供的双顺反子表达构建体的第一表达盒包含RNA聚合酶II启动子，并且第二表达盒包含RNA聚合酶III启动子。在一些实施方案中，第一表达盒包含P2启动子，且第二表达盒包含P2启动子。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒通过双向启动子可操作地连接。在一些实施方案中，提供的双顺反子表达构建体是重组AAV(rAAV)构建体。
重组腺相关病毒(rAAV)
在一些方面，本公开提供了分离的腺相关病毒(AAV)。如本文关于AAV使用的，术语“分离的”是指已经人工生产或获得的AAV。分离的AAV可以使用重组方法产生。此类AAV在本文中被称为“重组AAV”。重组AAV(rAAV)优选具有组织特异性靶向能力，使得rAAV的核酸酶和/或转基因将被特异性地递送至一个或多个预定组织。AAV衣壳是确定这些组织特异性靶向能力的重要元素。因此，可以选择具有适合于靶定组织的衣壳的rAAV。
用于获得具有所期望的衣壳蛋白的重组AAV的方法是本领域众所周知的。(参见，例如US 2003/0138772)，其内容通过引用以其整体并入本文。通常，该方法涉及培养宿主细胞，该宿主细胞含有编码AAV衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；由AAV反向末端重复(ITR)和转基因组成的重组AAV载体；以及足够的辅助功能，以允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由AAV的cap基因编码的结构蛋白。AAV包含三种衣壳蛋白，病毒粒子蛋白1至3(称为VP1、VP2和VP3)，其所有均经由替代剪接从单个cap基因转录而来。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3的分子量分别为约87kDa、约72kDa和约62kDa。在一些实施方案中，在翻译时，衣壳蛋白在病毒基因组周围形成球形的60聚体蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组，递送基因组并与宿主相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有选自由下组的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10、AAVrh10和AAV.PHP.B。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有衍生自非人灵长类动物的血清型，例如AAVrh8血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有用于广泛且有效的CNS转导的血清型，例如AAV.PHP.B。在一些实施方案中，衣壳蛋白是AAV血清型9。
在宿主细胞中培养以将rAAV载体包装在AAV衣壳中的组分可以反式提供给宿主细胞。或者，可以由稳定的宿主细胞提供任何一种或多种所需的组分(例如，重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)，使用本领域技术人员已知的方法将所述稳定的宿主细胞经工程化改造以含有一种或多种所需的组分。最合适的是，此类稳定的宿主细胞将含有在诱导型启动子的控制下的所需的组分。然而，所需的组合可以在组成型启动子的控制下。在适合与转基因一起使用的调节元件的讨论中，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一个替代方案中，选择的稳定宿主细胞可以含有在组成型启动子控制下的选择的组分以及在一个或多个诱导型启动子控制下的其他选择的组分。例如，可以产生衍生自293细胞的稳定宿主细胞(其含有在组成型启动子的控制下的E1辅助功能)，但其含有在诱导型启动子的控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其他稳定的宿主细胞。
在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含编码一种或多种蛋白质(例如，HEXA和HEXB蛋白)的编码序列。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。
产生本公开的rAAV所需的重组AAV载体、rep序列、cap序列和辅助功能可以使用任何适当的遗传元件(载体)递送至包装宿主细胞。选定的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所述的那些。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y。类似地，产生rAAV病毒粒子的方法是众所周知的，并且合适方法的选择不限于本公开。参见，例如，K.Fisher et al.，J.Virol.，70：520-532(1993)和美国专利号5,478,745。
在一些实施方案中，可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)产生重组AAV。通常，通过用待包装到AAV颗粒中的AAV载体(包含侧翼为ITR元件的转基因)、AAV辅助功能载体和附属功能载体(accessory function vector)转染宿主细胞来产生重组AAV。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(例如，rep和cap)，其以反式起作用以用于高效的AAV复制和衣壳化。优选地，AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体生产而不产生任何可检测的野生型AAV病毒粒子(例如，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒粒子)。适用于本发明的载体的非限制性实例包括pHLP19，其描述于美国专利号6,001,650和pRep6cap6载体，其描述于美国专利号6,156,303，两者的全部内容通过引用并入本文。附属功能载体编码AAV依赖于其复制(例如，“附属功能”)的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于涉及AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳装配的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，如腺病毒、疱疹病毒(除单纯疱疹病毒1型以外)和痘苗病毒。
在一些方面，本公开提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞摄入外来DNA，并且当将外源DNA引入细胞膜内部时，细胞已经被“转染”。许多转染技术是本领域公知的。参见，例如，Graham et al.(1973)Virology，52：456，Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratories，NewYork，Davis et a1.(1986)Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier和Chu etal.(1981)Gene 13：197。此类技术可以用于将一种或多种外源核酸，如核苷酸整合载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞中。
“宿主细胞”是指包含或能够包含感兴趣的物质的任何细胞。通常，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可以用作AAV辅助构建体、AAV小基因质粒、附属功能载体或与重组AAV的产生相关的其他转移DNA的受体。该术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，本文所用的“宿主细胞”可以指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于自然、偶然或故意的突变，单个亲本细胞的后代在形态或基因组或总DNA补体上不一定与原始亲本完全相同。
如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群。通常，细胞系是衍生自单个祖细胞的克隆群体。在本领域中进一步已知在此类克隆群体的储存或转移期间，核型可能发生自发或诱导的变化。因此，衍生自该细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同，并且所指的细胞系包括此类变体。
如本文所用，术语“重组细胞”是指其中已引入外源DNA区段(如导致生物活性多肽的转录或生物活性核酸如RNA的产生的DNA区段)的细胞。
如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒粒子等，当其与适当的控制元件缔合时能够复制且其可以在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达媒介物，以及病毒载体。在一些实施方案中，有用的载体被认为是其中待转录的核酸区段位于启动子的转录控制下的那些载体。“启动子”是指被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的，启动基因的特异性转录所需要的DNA序列。短语“可操作地定位”、“在控制之下”或“在转录控制之下”意指启动子相对于核酸而言处于正确的位置和定向以控制RNA聚合酶的起始和基因的表达。术语“表达载体或构建体”意指含有核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如以从转录的基因产生生物活性多肽产物。用于将重组载体包装在所期望的AAV衣壳中以产生本公开的rAAV的前述方法并不意味着是限制性的，并且其他合适的方法对技术人员而言是显而易见的。
用于治疗溶酶体贮积病的方法
本公开提供了用于将转基因递送至受试者的方法。受试者可以是任何哺乳动物，例如人类、非人类灵长类、啮齿动物、狗、猫、马、猪等。在一些实施方案中，受试者是人类。方法通常包括向受试者施用有效量的分离的编码氨基己糖苷酶A(HEXA)和氨基己糖苷酶B(HEXB)蛋白质的核酸(例如，野生型HEXA和/或HEXB，经密码子优化的HEXA和/或HEXB或前述任何组合)，其能够补偿受试者的突变体HEXA和HEXB蛋白。HEXA和HEXB蛋白形成异源二聚体同工酶beta-氨基己糖苷酶A，其是人体内分解GM2神经节苷脂的溶酶体蛋白质/酶。因此，HEXA基因和/或HEXB基因中的双等位基因突变通常导致GM2神经节苷脂的毒性积累和溶酶体贮积症。
如本文所用，“溶酶体贮积症”是指遗传性代谢疾病，其特征在于由HEXA基因和/或HEXB基因中的双等位基因突变导致的细胞特别是神经元中GM2神经节苷脂的异常积聚。在一些实施方案中，受试者的特征在于在HEXA基因中具有突变，导致该受试者的beta-氨基己糖苷酶A蛋白的功能降低或丧失。在一些实施方案中，受试者的特征在于在HEXB基因中具有突变，导致该受试者的beta-氨基己糖苷酶A蛋白的功能降低或丧失。“双等位基因突变”是指基因的两个拷贝(在这种情况下是HEXA和/或HEXB)具有氨基酸序列的改变。GM2神经节苷脂在溶酶体中的逐步积聚导致神经元的破坏。在一些实施方案中，溶酶体贮积症是泰-萨克斯病(TSD)，由HEXA蛋白的功能降低或丧失引起的状况。在一些实施方案中，溶酶体贮积症是桑德霍夫病(SD)，由HEXB蛋白的功能降低或丧失引起的状况。
物质的“有效量”是足以产生所期望的效果的量。在一些实施方案中，有效量的分离的核酸是足以转染(或在rAAV介导的递送的情况下感染)受试者的靶组织的足够数量的靶细胞的量。在一些实施方案中，靶组织是中枢神经系统(CNS)组织(例如脑组织、脊髓组织、脑脊液(CSF)等)。在一些实施方案中，有效量的分离的核酸(例如，其可以经由rAAV递送)可以是足以对受试者具有治疗益处，例如，补偿由基因(例如HEXA或HEXB)的突变引起的蛋白质功能的降低或丧失，以延长受试者的寿命，改善受试者的一种或多种疾病的症状(例如TSD或SD的症状)等的量。有效量将取决于多种因素，如物种、年龄、体重、受试者的健康状况以及待靶向的组织，并且因此可以在受试者和组织之间变化，如本公开中其他地方所述。
在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸或rAAV可用于治疗溶酶体贮积病，例如泰-萨克斯病或桑德霍夫病。如本文所用，术语“治疗”是指向患有溶酶体贮积病、具有溶酶体贮积病的症状或具有对溶酶体贮积病的易感性(例如，HEXA基因、HEXB基因等中的一个或多个突变)的受试者应用或施用编码如本文所述的分离的核酸(例如，包含分离的核酸的rAAV)的组合物，其目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病的症状或溶酶体贮积病的易感性。
减轻溶酶体贮积病包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病的严重程度。减轻疾病不一定需要治愈的结果。如本文所用，“延迟”溶酶体贮积病的发展意指推迟、阻碍、减慢、减缓、稳定和/或延缓疾病的进展。该延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或所治疗的个体。“延迟”或减轻疾病发展或延迟疾病发作的方法，是与不使用此方法相比，在给定的时间范围内减少发生一种或多种疾病症状的可能性和/或在给定的时间范围内减少症状程度的方法。此类比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学上显著结果的大量受试者。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域众所周知的标准临床技术来检测和评估疾病的发展。但是，发展也指可能无法检测到的进展。为了本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，溶酶体贮积病的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
施用的方式
根据本领域已知的任何合适方法，本公开的rAAV可以以组合物的形式递送至受试者。例如，可以将优选悬浮在生理上相容的载体中(例如，在组合物中)的rAAV施用于受试者，即宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人类灵长类动物(例如猕猴)。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。
可以通过例如肌内注射或通过施用于哺乳动物受试者的血流中来将rAAV递送至哺乳动物受试者。可以通过注射入静脉、动脉或任何其他血管导管来向血液中施用。在一些实施方案中，通过隔离肢体灌注(isolated limb perfusion)的方式将rAAV施用到血流中，这是外科领域中众所周知的技术，该方法基本上使技术人员能够在施用rAAV病毒粒子之前将肢体与系统性循环隔离。隔离肢体灌注技术的一种变型(描述于在美国专利号6,177,403中)也可以被技术人员用于将病毒粒子施用到隔离的肢体的脉管系统中以潜在地增强向肌细胞或组织的转导。此外，在某些情况下，可能期望将病毒粒子递送至受试者的CNS。“CNS”意指脊椎动物的脑和脊髓的所有细胞和组织。因此，该术语包括但不限于神经元细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、脑脊液(CSF)、间质间隙(interstitial space)、骨、软骨等。可以通过注射入例如脑室区域将重组AAV直接递送至CNS，以及使用本领域已知的神经外科技术，如通过立体定向注射，用针、导管或相关装置将重组AAV直接递送至纹状体(例如纹状体的尾状核或壳核)、丘脑、脊髓和神经肌接头或小脑小叶(参见，例如，Stein et al.，J Virol73：3424-3429，1999；Davidson et al.，PNAS 97：3428-3432，2000；Davidson et al.，Nat.Genet.3：219-223，1993；和Alisky and Davidson，Hum.Gene Ther.11：2315-2329，2000)。在一些实施方案中，通过静脉内注射施用如本公开中所述的rAAV。在一些实施方案中，rAAV通过脑内注射施用rAAV。在一些实施方案中，通过鞘内注射施用rAAV。在一些实施方案中，通过纹状体内注射施用rAAV。在一些实施方案中，通过颅内注射递送rAAV。在一些实施方案中，通过小脑延髓池注射递送rAAV。在一些实施方案中，通过脑侧脑室注射递送rAAV。
本公开的方面涉及包含重组AAV的组合物，所述重组AAV包含衣壳蛋白和编码转基因的核酸，其中转基因包含编码一种或多种蛋白质的核酸序列。在一些实施方案中，每种蛋白质包含SEQ ID NO：1或2中任一个中所示的序列。在一些实施方案中，核酸进一步包含AAVITR。在一些实施方案中，rAAV包含由SEQ ID NO：3-9中任一个中所示的序列所表示的rAAV载体或其一部分。在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载体。
本公开的组合物可以单独包含rAAV，或与一种或多种其他病毒(例如，编码具有一种或多种不同转基因的第二rAAV)组合。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的rAAV，每个具有一个或多个不同的转基因。
考虑到rAAV所针对的指示，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)一起配制。其他示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。载体的选择不是本公开的限制。
任选地，除了rAAV和载体之外，本发明的组合物还可以含有其他常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、对氯苯酚和泊洛沙姆(非离子表面活性剂)，如
Figure BDA0002792868780000221
F-68。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
以足够的量施用rAAV，以转染所期望的组织的细胞并提供足够水平的基因转移和表达，而没有过度的不良影响。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至所选定的器官(例如，门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、瘤内和其他肠胃外施用途径。如果期望，可以组合施用途径。
实现特定“治疗效果”所需的rAAV病毒粒子的剂量，例如，基因组拷贝的剂量单位/每千克体重(GC/kg)，将基于几个因素而变化，包括但不限于：rAAV病毒粒子施用的途径，达到治疗效果所需的基因或RNA表达的水平，所治疗的特定疾病或病症以及基因或RNA产物的稳定性。基于上述因素以及本领域公知的其他因素，本领域技术人员可以容易地确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的rAAV病毒粒子的剂量范围。
有效量的rAAV是足以靶向感染动物，靶向所期望组织的量。在一些实施方案中，在溶酶体贮积病的症状前阶段期间，向受试者施用有效量的rAAV。在一些实施方案中，溶酶体贮积病的症状前阶段发生在出生(例如围产期)至4周龄之间。
在一些实施方案中，配制rAAV组合物以减少组合物中AAV颗粒的聚集，特别是在存在高rAAV浓度(例如约1013GC/mL或更高)的情况下。用于减少rAAV的聚集的方法在本领域中是众所周知的，并且包括例如添加表面活性剂、调节pH、调节盐浓度等(参见例如，WrightFR，et al.，Molecular Therapy(2005)12，171-178，其内容通过引用并入本文。)
药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员众所周知的，开发用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的给药和治疗方案也是众所周知的。
通常，这些配制剂可以含有至少约0.1％的活性化合物或更多，尽管活性成分的百分比理所当然地可以变化并且可以方便地在约1或2％至约70％或80％或更多的总配制剂的重量或体积之间。自然地，可以在每种治疗有用的组合物中制备活性化合物的量，使得可以在任何给定的单位剂量的化合物中获得合适的剂量。制备此类药物配制剂的领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用的途径、产品保存期限以及其他药理学考虑因素等因素，并因此可能期望各种剂量和治疗方案。
在某些情况下，期望以皮下、胰腺内、鼻内、肠胃外、静脉内、肌内、鞘内或口服、腹膜内或通过吸入递送在本文公开的适当配制的药物组合物中的基于rAAV的治疗性构建体。在一些实施方案中，如美国专利号5,543,158；5,641,515和5,399,363(各自具体地通过引用以其整体并入本文)中所述的施用模式可以用于递送rAAV。在一些实施方案中，优选的施用的方式是通过门静脉注射。
适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在许多情况下，该形式是无菌的且具有一定的流动性，以致易于注射。它必须在生产和储存条件下稳定，并且必须保存以免收微生物(如细菌和真菌)的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油。可以例如通过使用包衣如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以使可注射组合物的吸收延长。
为了施用可注射的水溶液，例如，如果需要，可以适当地缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，本领域技术人员将知道可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一剂溶解在1mL的等渗NaCl溶液中，或者添加到1000mL的皮下灌注术流体(hypodermoclysisfluid)中，或者在建议的输注部位注射(参见例如，″Remington′s PharmaceuticalSciences″15th Edition，pages 1035-1038and 1570-1580)。剂量的一些变化将根据宿主的状况必要地发生。在任何情况下，负责施用的人员将确定对于个体宿主的适当剂量。
通过将适当的溶剂中所需量的活性rAAV按需要与本文列举的多种其他成分混合，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和来自以上列举的那些的所需的其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何另外所期望的成分的粉末。
本文公开的rAAV组合物也可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并与无机酸(如例如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，如例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制后，将以与剂量配制剂相容的方式和以治疗有效的量来施用溶液。可以容易地以各种剂型例如可注射溶液、药物释放胶囊等来施用配制剂。
如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。补充活性成分也可以掺入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不产生变应性或类似不良反应的分子实体和组合物。
递送媒介物如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可以用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以配制用于递送，其被包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。
此类配制剂对于引入本文公开的核酸或rAAV构建体的药学上可接受的配制剂可能是优选的。脂质体的形成和使用是本领域技术人员通常已知的。最近，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。
脂质体已成功用于通常对通过其他规程的转染具有抗性的多种细胞类型。另外，脂质体没有基于病毒的递送系统典型的DNA长度限制。脂质体已被有效地用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入多种培养的细胞系和动物中。另外，已经完成了一些成功的临床试验，其研究了脂质体介导的药物递送的有效性。
脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV的超声处理导致形成直径在200至
Figure BDA0002792868780000251
范围内的小单层囊泡(SUV)，其核中含有水溶液。
或者，可以使用rAAV的纳米胶囊配制剂。纳米胶囊通常可以以稳定且可再现的方式截留(entrap)物质。为了避免细胞内聚合物超载引起的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物设计此类超细颗粒(尺寸约0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒。
除上述递送方法外，还设想了以下技术作为将rAAV组合物递送至宿主的替代方法。超声波导入法(Sonophoresis)(即超声(ultrasound))已作为增强药物渗透进入循环系统和通过循环系统的速率和功效的装置得以使用，并描述于美国专利号5,656,016中。预期的其他药物递送替代物是骨内注射(美国专利号5,779,708)、微芯片装置(美国专利号5,797,898)、眼科配制剂(Bourlais et al.，1998)、经皮基质(美国专利号5,770,219和5,783,208)和反馈控制的递送(美国专利号5,697,899)。
实施例
已经使用双顺反子载体的两种设计原理开发了编码氨基己糖苷酶的alpha和beta亚基(分别为HexA和HexB)两者的AAV载体(图1)。在AAV-BiP2i-HexAB(P2I)中，转基因盒以相反的定向定位，启动子从基因组末端驱动表达。另一个载体AAV-BiCBA-HexAB(Bic)使用由侧翼有最小鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子的单个CMV增强子组成的双向启动子，以从基因组中心向相反方向驱动表达。
使用AAV-PHP.B载体的短期研究证明了疗效。尽管对于小鼠中系统性CNS基因递送，AAV9的效率远不如AAV-PHP.B，但其也是具有丰富的临床经验并具有出色的安全记录的衣壳。而且，已经观察到AAV9的系统性递送在脊髓性肌萎缩(SMA)患者中介导转化治疗结果。由于这些原因，它被包括在治疗实验中，总共测试了四种载体。
用编码小鼠HexA和HexB蛋白的1x 1012vg(n＝8)或4x 1012vg(n＝14)的AAV9载体(Bic或P2I)或者3x 1011vg(n＝8)或1x 1012vg(n＝14)的AAV-PHP.B载体(Bic或P2I)系统性(尾静脉注射)处理四周龄Sandhoff小鼠(Hex-/-)。将龄期匹配的注射PBS的SD(n＝6)和野生型(n＝14)小鼠用作对照。所有分组均由相等数量的雄性和雌性组成。在150日龄或人道终点处死高剂量分组和正常对照组的小鼠的一个亚组(n＝6)，以使用生化(酶活性和GM2神经节苷脂含量)和组织学结果测度评估功效，而其余小鼠用于存活分析。当PBS处理的SD小鼠达到人道终点时(全部在150日龄之前)，将其实施安乐死。人道终点可以通过以下任意参数确定：当置于仰卧位时无法扶正自己30秒，一个后肢瘫痪或体重从峰值减轻15％以上。
实施例1：AAV处理的SD小鼠的行为表现随时间保持稳定
在60、90、105、120和149日龄时，使用转杆和倒置筛网测试评估了AAV处理的SD和对照(KO)小鼠的行为表现。AAV处理的SD小鼠的运动协调性和表现在加速转杆(图2A)和倒置筛网测试(图2B-2C)测试中直至149日龄的最后一个时间点仍与正常对照组相当。未经处理的SD小鼠的表现随时间下降，且在最后一个时间点没有动物仍存活。
实施例2：系统性AAV处理降低了SD小鼠的整个中枢神经系统中GM2神经节苷脂含量
150日龄的AAV处理的SD小鼠(高剂量)的脑、小脑、脑干和脊髓中的GM2神经节苷脂含量显著低于处于人道终点的未经处理的SD小鼠中的，并且在AAV9-Bic和两个AAV-PHP.B处理组中几乎检测不到(图3)。在AAV9-P2I处理的动物中，GM2水平保持高于背景。
实施例3：AAV处理的SD小鼠的脑和肝中氨基己糖苷酶活性增加
在大脑和小脑中的氨基己糖苷酶活性(图4A-4D)与GM2神经节苷脂含量的发现一致。AAV9-P2I处理的小鼠的脑中的酶活性始终低于其他组，但尽管如此，恢复正常HexA活性的约10％似乎足以显著降低大脑中的GM2神经节苷脂含量(图3)。如在AAV9-Bic处理的动物(图4A)中一样，将大脑中的HexA活性恢复至约20％似乎足以在很大程度上消除GM2神经节苷脂贮积(图3)。在使用人工底物MUG系统性施用AAV-PHP.Bic后，还评估了肝中的总氨基己糖苷酶(HexA、HexB、HexS)活性(图5)。在肝中，总氨基己糖苷酶活性恢复到正常的15％。
实施例4：系统性AAV处理延长了SD小鼠的存活
在低(3x 1011vg)和高剂量分组(1x 1012vg)中注射AAV-Bic载体的所有SD小鼠存活超过350天(图6A-6B)。系统性AAV9-P2I治疗在低剂量(1x 1012vg)时对存活率的影响很小，但在高剂量(4x 1012vg)时存活率增加(图6A-6B)。AAV9-P2I处理对存活的影响与CNS生化发现一致，其中GM2神经节苷脂水平相对于未经处理的对照SD小鼠降低(图3)，但仍可检测到，这与其他AAV处理组或正常分组中不同。
实施例5：系统性AAV处理恢复了整个SD小鼠的脑中的Hex活性
使用氨基己糖苷酶特异性组织化学染色对AAV-PHP.B-BiCBA-HexAB的递送后脑中氨基己糖苷酶分布的分析表明整个脑中的酶活性得以恢复(图7)，这表明该方法在一些实施方案中介导了治疗性影响。
实施例6：针对泰-萨克斯病和桑德霍夫病的AAV基因疗法的CSF递送
新生GM2小鼠(n＝31只小鼠)接受双侧注射AAV9-BiCB-HexAB(7.25x1010vg)到脑侧脑室(每侧2μl)。对照GM2小鼠(n＝8)接受双侧注射磷酸盐缓冲盐水。在一月龄时，AAV处理的GM2小鼠(n＝6)的脑中GM2神经节苷脂含量与正常动物中的含量相同，其小于年龄相匹配的未经处理的GM2小鼠水平中发现水平的0.5％(图8A)。于120日龄与未经处理的GM2小鼠相比，AAV处理的GM2小鼠在转杆(图8B)和倒置筛网(图8C)这两个任务中的运动表现显著改善，并在150日龄时保持稳定。目前，大多数经AAV处理的GM2小鼠保持存活超过400日龄，与之相比未经处理的GM2小鼠的中位存活期为129.5天(图8D)。
实施例7：在幼(young)成年GM2小鼠中通过鞘内递送将AAV9-BiCB-HexAB载体注射到CSF中
在42-45日龄GM2小鼠(n＝20)中，腰椎鞘内(LIT)注射1x1012vg AAV9-BiCB-HexAB载体导致转杆(图9A)和倒置筛网(图9B)测试中的表现改善。观察到AAV处理的GM2小鼠的中位存活期至少为265天(仅计算已经存活超过250天的小鼠)，与之相比未经处理的GM2小鼠为129.5天(图9C；P＜0.0001)。没有幼稚
Figure BDA0002792868780000271
GM2小鼠在246日龄(n＝7)和299日龄(n＝2)存活(图9C)。数据表明LIT递送的AAV9-BiCB-HexAB载体对幼成年小鼠的治疗益处。
序列
＞SEQ ID NO：1；HexA氨基酸序列
Figure BDA0002792868780000281
＞SEQ ID NO：2；HexB氨基酸序列
Figure BDA0002792868780000282
＞SEQ ID NO：3；AAV-BiCBA-HexAB核酸序列
Figure BDA0002792868780000283
Figure BDA0002792868780000291
Figure BDA0002792868780000301
Figure BDA0002792868780000311
＞SEQ ID NO：4；AAV-BiCBA-HexA：密码子优化的-HexB核酸序列
Figure BDA0002792868780000312
Figure BDA0002792868780000321
Figure BDA0002792868780000331
Figure BDA0002792868780000341
＞SEQ ID NO：5；AAV-BiCBA-HexA：密码子优化的-HexB：密码子优化的核酸序列
Figure BDA0002792868780000342
Figure BDA0002792868780000351
Figure BDA0002792868780000361
Figure BDA0002792868780000371
＞SEQ ID NO：6：P2i-mHexAB核酸序列
Figure BDA0002792868780000372
Figure BDA0002792868780000381
Figure BDA0002792868780000391
＞SEQ ID NO：7：AAV-hHexA：密码子优化的-BiCBA-hHexB核酸序列
Figure BDA0002792868780000401
Figure BDA0002792868780000411
Figure BDA0002792868780000421
＞SEQ ID NO：8：AAV-hHexA：密码子优化的-BiCBA-hHexB：密码子优化的核酸序列
Figure BDA0002792868780000422
Figure BDA0002792868780000431
Figure BDA0002792868780000441
Figure BDA0002792868780000451
＞SEQ ID NO：9：AAV-hHcxA-BiCBA-hHexB核酸序列
Figure BDA0002792868780000452
Figure BDA0002792868780000461
Figure BDA0002792868780000471
Figure BDA0002792868780000481
序列表
<110> 马萨诸塞大学
<120> 编码氨基己糖苷酶alpha和beta亚基的双顺反子AAV载体及其用途
<130> 07917-0419WO1
<150> PCT/US2019/027271
<151> 2019-04-12
<150> US 62/657,243
<151> 2018-04-13
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Met Thr Ser Ser Arg Leu Trp Phe Ser Leu Leu Leu Ala Ala Ala Phe
1 5 10 15
Ala Gly Arg Ala Thr Ala Leu Trp Pro Trp Pro Gln Asn Phe Gln Thr
20 25 30
Ser Asp Gln Arg Tyr Val Leu Tyr Pro Asn Asn Phe Gln Phe Gln Tyr
35 40 45
Asp Val Ser Ser Ala Ala Gln Pro Gly Cys Ser Val Leu Asp Glu Ala
50 55 60
Phe Gln Arg Tyr Arg Asp Leu Leu Phe Gly Ser Gly Ser Trp Pro Arg
65 70 75 80
Pro Tyr Leu Thr Gly Lys Arg His Thr Leu Glu Lys Asn Val Leu Val
85 90 95
Val Ser Val Val Thr Pro Gly Cys Asn Gln Leu Pro Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Val Glu Asn Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Asp Asp Gln Cys Leu Leu Leu
115 120 125
Ser Glu Thr Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser Gln
130 135 140
Leu Val Trp Lys Ser Ala Glu Gly Thr Phe Phe Ile Asn Lys Thr Glu
145 150 155 160
Ile Glu Asp Phe Pro Arg Phe Pro His Arg Gly Leu Leu Leu Asp Thr
165 170 175
Ser Arg His Tyr Leu Pro Leu Ser Ser Ile Leu Asp Thr Leu Asp Val
180 185 190
Met Ala Tyr Asn Lys Leu Asn Val Phe His Trp His Leu Val Asp Asp
195 200 205
Pro Ser Phe Pro Tyr Glu Ser Phe Thr Phe Pro Glu Leu Met Arg Lys
210 215 220
Gly Ser Tyr Asn Pro Val Thr His Ile Tyr Thr Ala Gln Asp Val Lys
225 230 235 240
Glu Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Ala Glu
245 250 255
Phe Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Pro Gly Ile Pro Gly
260 265 270
Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Gly Ser Glu Pro Ser Gly Thr Phe Gly
275 280 285
Pro Val Asn Pro Ser Leu Asn Asn Thr Tyr Glu Phe Met Ser Thr Phe
290 295 300
Phe Leu Glu Val Ser Ser Val Phe Pro Asp Phe Tyr Leu His Leu Gly
305 310 315 320
Gly Asp Glu Val Asp Phe Thr Cys Trp Lys Ser Asn Pro Glu Ile Gln
325 330 335
Asp Phe Met Arg Lys Lys Gly Phe Gly Glu Asp Phe Lys Gln Leu Glu
340 345 350
Ser Phe Tyr Ile Gln Thr Leu Leu Asp Ile Val Ser Ser Tyr Gly Lys
355 360 365
Gly Tyr Val Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asn Lys Val Lys Ile Gln
370 375 380
Pro Asp Thr Ile Ile Gln Val Trp Arg Glu Asp Ile Pro Val Asn Tyr
385 390 395 400
Met Lys Glu Leu Glu Leu Val Thr Lys Ala Gly Phe Arg Ala Leu Leu
405 410 415
Ser Ala Pro Trp Tyr Leu Asn Arg Ile Ser Tyr Gly Pro Asp Trp Lys
420 425 430
Asp Phe Tyr Val Val Glu Pro Leu Ala Phe Glu Gly Thr Pro Glu Gln
435 440 445
Lys Ala Leu Val Ile Gly Gly Glu Ala Cys Met Trp Gly Glu Tyr Val
450 455 460
Asp Asn Thr Asn Leu Val Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Gly Ala Val
465 470 475 480
Ala Glu Arg Leu Trp Ser Asn Lys Leu Thr Ser Asp Leu Thr Phe Ala
485 490 495
Tyr Glu Arg Leu Ser His Phe Arg Cys Glu Leu Leu Arg Arg Gly Val
500 505 510
Gln Ala Gln Pro Leu Asn Val Gly Phe Cys Glu Gln Glu Phe Glu Gln
515 520 525
Thr
<210> 2
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Met Glu Leu Cys Gly Leu Gly Leu Pro Arg Pro Pro Met Leu Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Leu Ala Leu Leu Thr Gln
20 25 30
Val Ala Leu Val Val Gln Val Ala Glu Ala Ala Arg Ala Pro Ser Val
35 40 45
Ser Ala Lys Pro Gly Pro Ala Leu Trp Pro Leu Pro Leu Ser Val Lys
50 55 60
Met Thr Pro Asn Leu Leu His Leu Ala Pro Glu Asn Phe Tyr Ile Ser
65 70 75 80
His Ser Pro Asn Ser Thr Ala Gly Pro Ser Cys Thr Leu Leu Glu Glu
85 90 95
Ala Phe Arg Arg Tyr His Gly Tyr Ile Phe Gly Phe Tyr Lys Trp His
100 105 110
His Glu Pro Ala Glu Phe Gln Ala Lys Thr Gln Val Gln Gln Leu Leu
115 120 125
Val Ser Ile Thr Leu Gln Ser Glu Cys Asp Ala Phe Pro Asn Ile Ser
130 135 140
Ser Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Leu Val Lys Glu Pro Val Ala Val Leu
145 150 155 160
Lys Ala Asn Arg Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser
165 170 175
Gln Leu Val Tyr Gln Asp Ser Tyr Gly Thr Phe Thr Ile Asn Glu Ser
180 185 190
Thr Ile Ile Asp Ser Pro Arg Phe Ser His Arg Gly Ile Leu Ile Asp
195 200 205
Thr Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Lys Ile Ile Leu Lys Thr Leu Asp
210 215 220
Ala Met Ala Phe Asn Lys Phe Asn Val Leu His Trp His Ile Val Asp
225 230 235 240
Asp Gln Ser Phe Pro Tyr Gln Ser Ile Thr Phe Pro Glu Leu Ser Asn
245 250 255
Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser His Val Tyr Thr Pro Asn Asp Val Arg
260 265 270
Met Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Pro Glu
275 280 285
Phe Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Lys Gly Gln Lys Asp
290 295 300
Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Arg Gln Asn Lys Leu Asp Ser Phe Gly
305 310 315 320
Pro Ile Asn Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Ser Phe Leu Thr Thr Phe
325 330 335
Phe Lys Glu Ile Ser Glu Val Phe Pro Asp Gln Phe Ile His Leu Gly
340 345 350
Gly Asp Glu Val Glu Phe Lys Cys Trp Glu Ser Asn Pro Lys Ile Gln
355 360 365
Asp Phe Met Arg Gln Lys Gly Phe Gly Thr Asp Phe Lys Lys Leu Glu
370 375 380
Ser Phe Tyr Ile Gln Lys Val Leu Asp Ile Ile Ala Thr Ile Asn Lys
385 390 395 400
Gly Ser Ile Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asp Lys Ala Lys Leu Ala
405 410 415
Pro Gly Thr Ile Val Glu Val Trp Lys Asp Ser Ala Tyr Pro Glu Glu
420 425 430
Leu Ser Arg Val Thr Ala Ser Gly Phe Pro Val Ile Leu Ser Ala Pro
435 440 445
Trp Tyr Leu Asp Leu Ile Ser Tyr Gly Gln Asp Trp Arg Lys Tyr Tyr
450 455 460
Lys Val Glu Pro Leu Asp Phe Gly Gly Thr Gln Lys Gln Lys Gln Leu
465 470 475 480
Phe Ile Gly Gly Glu Ala Cys Leu Trp Gly Glu Tyr Val Asp Ala Thr
485 490 495
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500 505 510
Leu Trp Ser Ser Lys Asp Val Arg Asp Met Asp Asp Ala Tyr Asp Arg
515 520 525
Leu Thr Arg His Arg Cys Arg Met Val Glu Arg Gly Ile Ala Ala Gln
530 535 540
Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Cys Asn His Glu Asn Met
545 550 555
<210> 3
<211> 7681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
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ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 300
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 360
atgtatctta tcatgtctgt cgaggcggcc gctcaggtct gctcaaattc ctgctcacag 420
aatccgacat tcaggggctg tgcctgcacg cctctcctca gcagctcgca cctgaagtgg 480
ctcagccttt cgtaagcgaa tgtcagatca gaggtcagct tgttggacca cagtctctcg 540
gccactgctc cggccctggg ccacagtcgt gggaccagat tggtgttgtc cacatactcg 600
ccccacatac atgcttcgcc cccgatgacc agagctttct gctcaggagt cccttcaaag 660
gccaggggct ccacaatgta gaaatccttc cagtctggtc catatgagat cctgttcagg 720
taccaagggg cactcagcag tgctcggaag ccagcttttg tcaccagttc cagctccttc 780
atataattga caggaatatc ctcgcgccac acttgaatga tggtatcggg ctggattttg 840
accttgttgt caaacacttc ctgccagacc acatagccct ttccgtatga actcacaatg 900
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ttccgcataa agtcctggat ctctggatta gacttccaac atgtgaaatc cacttcgtct 1020
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caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 2580
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ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 6780
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
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gctcagcctt tcgtaagcga atgtcagatc agaggtcagc ttgttggacc acagtctctc 540
ggccactgct ccggccctgg gccacagtcg tgggaccaga ttggtgttgt ccacatactc 600
gccccacata catgcttcgc ccccgatgac cagagctttc tgctcaggag tcccttcaaa 660
ggccaggggc tccacaatgt agaaatcctt ccagtctggt ccatatgaga tcctgttcag 720
gtaccaaggg gcactcagca gtgctcggaa gccagctttt gtcaccagtt ccagctcctt 780
catataattg acaggaatat cctcgcgcca cacttgaatg atggtatcgg gctggatttt 840
gaccttgttg tcaaacactt cctgccagac cacatagccc tttccgtatg aactcacaat 900
gtccagcaga gtctggatgt agaaactctc cagctgcttg aagtcttcgc cgaacccttt 960
cttccgcata aagtcctgga tctctggatt agacttccaa catgtgaaat ccacttcgtc 1020
tccgcccagg tgcagataaa agtcagggaa gacagaggac acctccagaa agaatgtaga 1080
catgaactcg taggtattgt tcagggatgg gttcacaggt ccgaaggtgc cgcttggctc 1140
actcccagag tagcaaggag tcagcagtcc gggaattcct gggccccagc tcagagtatg 1200
gccaggtgta tcgaattcag ccagcactcg aatccccctc agtcgggcat actcgatgac 1260
ttctttcacg tcctgggcgg tatagatgtg agtcacggga ttgtagctgc ccttgcgcat 1320
cagctctgga aatgtgaagc tttcgtaagg aaatgaggga tcgtcgacca gatgccagtg 1380
gaacacgttc agcttgttat aagccatcac atccagagtg tccagaatgc ttgacagggg 1440
caggtaatgt ctagatgtat ccagcagcag cccccggtgt ggaaatctag ggaagtcttc 1500
gatctcagtt ttgttgataa agaatgttcc ctcggctgac ttccagacca gctgactgaa 1560
agtctccagg cccctcagtg ccccccacac tgtttcggac agcagcagac actgatcgtc 1620
attgattgtc agggtatagt tctccacgga ttccagggtg ggcagctgat tgcagcctgg 1680
agtgaccacg ctgaccacca gcacgttttt ctccagggtg tggcgcttcc cagtcagata 1740
gggccgtggc caggacccgc ttccaaacag cagatcgcgg taccgctgga atgcctcgtc 1800
caggacgctg catcctggct gagcggcgct gctcacgtcg tactgaaact ggaaattgtt 1860
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ggttgctcgt ccagcaaatg cagcggccag cagcagggag aaccacagtc tggagctggt 1980
catggtggct ttatcgatac tagcgctaga gcttgctccc gcccgccgcg cgcttcgctt 2040
tttatagggc cgccgccgcc gccgcctcgc cataaaagga aactttcgga gcgcgccgct 2100
ctgattggct gccgccgcac ctctccgcct cgccccgccc cgcccctcgc ccccatcgct 2160
gcacaaaata attaaaaaat aaataaatac aaaattgggg gtggggaggg gggggagatg 2220
gggagagtga agcagaacgt ggcctcggat cccccgggct gcagtattaa tagtaatcaa 2280
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2340
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ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2460
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2520
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2580
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgtcgagg ccacgttctg 2640
cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta 2700
attattttgt gcagcgatgg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 2760
gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 2820
cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcaa gctcgctagc actagtaaag 2880
ccaccatgga actgtgcgga ctgggactgc ctagaccccc tatgctgctg gctctgctgc 2940
tggctaccct gctggctgct atgctggccc tgctgactca ggtggccctg gtggtccagg 3000
tcgcagaggc agctagggct ccttcagtga gcgcaaagcc aggacctgcc ctgtggccac 3060
tgccactgtc cgtgaaaatg acaccaaacc tgctgcacct ggcccccgaa aatttctaca 3120
tctcccattc tcctaacagt acagcagggc catcatgcac tctgctggag gaagccttcc 3180
ggagatacca cgggtatatt ttcggcttct acaagtggca ccatgagccc gcagaatttc 3240
aggccaaaac ccaggtgcag cagctgctgg tcagcatcac actgcagtcc gagtgtgacg 3300
ctttcccaaa tattagctcc gatgagagct acaccctgct ggtgaaggaa cccgtggctg 3360
tcctgaaagc aaacagagtc tggggcgcac tgagggggct ggagacattc tcccagctgg 3420
tgtaccagga ctcttacgga acatttacta tcaacgaatc cactatcatc gactccccta 3480
ggttttctca ccgcggcatc ctgattgata cttctcgcca ttacctgcca gtgaagatca 3540
ttctgaaaac cctggatgca atggccttca acaagtttaa tgtgctgcac tggcatatcg 3600
tcgacgatca gtctttccct taccagagta ttacatttcc agagctgagt aataaaggca 3660
gttactcact gagccacgtg tatactccaa acgacgtgag aatggtcatc gagtatgcca 3720
ggctgcgcgg aattagggtg ctgccagaat tcgatactcc cggccatacc ctgtcttggg 3780
gcaaggggca gaaagacctg ctgaccccct gctacagtcg gcagaacaag ctggattcat 3840
tcggccctat caacccaaca ctgaatacca catactcttt tctgactacc ttctttaagg 3900
agatcagtga agtgttcccc gaccagttta ttcacctggg cggggatgag gtcgaattca 3960
agtgttggga gagcaatcct aaaatccagg actttatgag acagaaggga ttcggcaccg 4020
acttcaagaa actggaatca ttctacattc agaaggtgct ggacatcatt gccacaatca 4080
acaaagggag catcgtgtgg caggaggtct ttgacgataa ggccaaactg gctcccggaa 4140
ctatcgtgga agtctggaag gatagcgcct atcctgagga actgtcacgc gtgaccgcta 4200
gcggctttcc cgtcatcctg agcgcacctt ggtacctgga cctgatttcc tatgggcagg 4260
attggcgaaa gtactataaa gtggagcccc tggacttcgg aggcacccag aagcagaaac 4320
agctgtttat cgggggagag gcctgcctgt ggggggaata cgtggatgct accaatctga 4380
caccacgact gtggcctcgg gctagcgcag tgggagagcg cctgtggtct agtaaggacg 4440
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ggggcattgc cgctcagcca ctgtatgccg ggtactgtaa tcacgaaaat atgtgactcg 4560
aggcggccgc tctagagatc tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca tcatgaagcc 4620
ccttgagcat ctgacttctg gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg 4680
gaattttttg tgtctctcac tcggcatgct ggggagagat ctgaggaacc cctagtgatg 4740
gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc 4800
gggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga 4860
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agttgcgtag cctgaatggc gaatggcgcg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg 4980
cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc 5040
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atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac 5160
ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt 5220
tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca 5280
accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt 5340
taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta 5400
caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg 5460
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ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 5760
tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 5820
ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 5880
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gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 6060
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caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 6300
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ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag 6660
acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 6720
ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 6780
gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 6840
gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 6900
ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 6960
gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 7020
ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 7080
cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 7140
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cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 7380
ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 7440
aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 7500
ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 7560
tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 7620
gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 7680
gccgattcat taatgcagct gggctgcagg gggggggggg ggggggtggg gggggggggg 7740
ggggg 7745
<210> 9
<211> 7729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 9
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctcagat ctgaattcta ccacatttgt agaggtttta 180
cttgctttaa aaaacctccc acatctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt 240
gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca 300
aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 360
aatgtatctt atcatgtctg tcgagtcagg tctgttcaaa ctcctgctca cagaagccta 420
cattgagggg ttgggcctgg acacctcgcc tcagcaactc acagcggaag tgtgacaaac 480
gttcataggc aaatgtcagg tcagatgtca acttgttgct ccacagcctt tcggcaacag 540
cccctgctct gggccagagc ctggggacca ggtttgtgtt gtccacatat tctccccaca 600
tacaagcctc tccaccaatc accagagcct tctgctcagg ggtaccttca aatgccaggg 660
gttccactat gtagaaatcc ttccagtcag ggccatagga tatacggttc aggtaccagg 720
gggcagagag aagggcccgg aagccggcct tggtgaccag ttccagctcc ttcatatagt 780
tcactggaat atcctctcgc cacacctgta tgattgtgtc tggctgaatc tttactttat 840
tatcaaacac ctcctgccac accacatagc ccttgccata agaagagacg atgtccagca 900
gcgtctggat gtagaaggac tccagctgct tgaagtcctc accgaagcct ttcttcctca 960
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gatgaagata aaaatctggg aagacagagc tgacttctaa gaagaatgtg ctcatgaact 1080
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tcagggtata attctccact gactccaaag taggaagctg gttacatcca ggtgtgacta 1680
cagagacaac caacacattc ttctccagtg tatgccgttt ccctgtgagg taaggacggg 1740
gccaagaccc ggaaccgaaa agcaggtcac gatagcgctg gaaggcctcg tcgaggactg 1800
agcagccggg ctgcgcggcc gagctgacat cgtactggaa ttgaaagttg ttcgggtaaa 1860
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aaaataaata aatacaaaat tgggggtggg gagggggggg agatggggag agtgaagcag 2220
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ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 2340
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caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 2460
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 2520
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 2580
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgt cgaggccacg ttctgcttca ctctccccat 2640
ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc 2700
gatgggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc 2760
ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag 2820
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cgggctgggg ctgccccggc cgcccatgct gctggcgctg ctgttggcga cactgctggc 2940
ggcgatgttg gcgctgctga ctcaggtggc gctggtggtg caggtggcgg aggcggctcg 3000
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ttcagatgag tcttatactt tacttgtgaa agaaccagtg gctgtcctta aggccaacag 3360
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tggaactttc accatcaatg aatccaccat tattgattct ccaaggtttt ctcacagagg 3480
aattttgatt gatacatcca gacattatct gccagttaag attattctta aaactctgga 3540
tgccatggct tttaataagt ttaatgttct tcactggcac atagttgatg accagtcttt 3600
cccatatcag agcatcactt ttcctgagtt aagcaataaa ggaagctatt ctttgtctca 3660
tgtttataca ccaaatgatg tccgtatggt gattgaatat gccagattac gaggaattcg 3720
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gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta 5280
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cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 5940
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attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 6780
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 6840
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 6900
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 6960
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 7020
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 7080
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 7140
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 7200
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagca ttgagaaagc 7260
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 7320
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 7380
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 7440
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 7500
cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 7560
tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 7620
gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 7680
agctgggctg cagggggggg gggggggggg tggggggggg ggggggggg 7729

Claims (35)

1.分离的核酸构建体，其包含
(i)第一表达盒，其包含在第一启动子的控制下编码氨基己糖苷酶alpha亚基(HEXA)的核酸，和
(ii)第二表达盒，其包含在第二启动子的控制下编码氨基己糖苷酶beta亚基(HEXB)的核酸，
其中所述第一表达盒和所述第二表达盒的侧翼是腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
2.权利要求1的分离的核酸，其中第一内含子存在于所述第一启动子和所述编码氨基己糖苷酶alpha亚基(HEXA)的核酸的序列之间。
3.权利要求1或2的分离的核酸，其中第二内含子存在于所述第二启动子和所述编码氨基己糖苷酶beta亚基(HEXB)的核酸的序列之间。
4.权利要求1至3中任一项的分离的核酸构建体，其中所述HexA包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
5.权利要求1至4中任一项的分离的核酸构建体，其中所述HexB包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
6.权利要求1至5中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第一内含子位于所述第一启动子和编码所述HexA的核酸序列之间，任选地其中所述第一内含子是嵌合内含子。
7.权利要求1至6中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第一启动子位于AAV ITR的近端，任选地其中所述第一启动子位于AAV ITR和编码HexA的核酸序列之间。
8.权利要求1至7中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第一启动子和/或所述第二启动子是P2启动子。
9.权利要求1至8中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第二内含子位于所述第二启动子和所述编码HexB的核酸序列之间，任选地其中所述第二内含子是嵌合内含子。
10.权利要求1至9中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第二启动子位于AAV ITR的近端，任选地其中所述第二启动子位于AAV ITR和编码HexB的核酸序列之间。
11.权利要求1至10中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第一表达盒包含与所述编码HexA的核酸序列可操作地连接的第一poly A信号，任选地其中所述第一poly A信号是BGH poly A信号。
12.权利要求1至11中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第二表达盒包含与所述编码HexB的核酸序列可操作地连接的第二poly A信号，任选地其中所述第二poly A尾为SV40poly A信号。
13.权利要求1至12中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第一poly A信号和所述第二poly A信号彼此相邻定位。
14.分离的核酸构建体，其包含
(i)第一表达盒，其包含编码氨基己糖苷酶alpha亚基的核酸，和
(ii)第二表达盒，其包含编码氨基己糖苷酶beta亚基的核酸，
其中所述第一表达盒和所述第二表达盒通过双向启动子可操作地连接，并且其中所述第一表达盒和所述第二表达盒的侧翼是腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
15.权利要求14的分离的核酸构建体，其中所述HexA包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
16.权利要求14或15的分离的核酸构建体，其中所述HexB包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
17.权利要求14至16中任一项的分离的核酸构建体，其中所述双向启动子包含至少一个鸡beta-肌动蛋白(CBA)启动子。
18.权利要求17的分离的核酸构建体，其中所述双向启动子包含两个CBA启动子，其中所述CBA启动子以相反的方向启动所述第一表达盒和所述第二表达盒的转录。
19.权利要求18的分离的核酸构建体，其中所述双向启动子包含CMV增强子序列，任选地其中所述CMV增强子序列位于两个CBA启动子之间。
20.权利要求14至19中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第一表达构建体包含第一poly A信号，任选地其中所述第一poly A信号位于AAV ITR的近端。
21.权利要求14至20中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第一表达构建体包含第二poly A信号，任选地其中所述第二poly A信号位于AAV ITR的近端。
22.权利要求14至21中任一项的分离的核酸构建体，其中所述第一和/或第二poly A信号各自选自SV40 poly A信号、兔beta-球蛋白(RBG)poly A信号和牛生长激素(BGH)poly A信号。
23.分离的核酸，其包含SEQ ID NO:3-9中任一项所示的序列。
24.重组AAV(rAAV)，其包含：
(i)衣壳蛋白；和
(ii)权利要求1至23中任一项的分离的核酸。
25.权利要求24的rAAV，其中所述衣壳蛋白具有选自以下的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10、AAVrh10和AAV.PHP.B。
26.权利要求24或25的rAAV，其中所述分离的核酸包含选自下组的ITR：AAV1 ITR、AAV2ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR或AAV6 ITR。
27.宿主细胞，其包含权利要求1至23中任一项的分离的核酸或权利要求22至24中任一项的rAAV。
28.权利要求27的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。
29.治疗溶酶体贮积病的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有溶酶体贮积病的受试者施用权利要求1至23中任一项的分离的核酸或权利要求24至26中任一项的rAAV。
30.权利要求29的方法，其中所述溶酶体贮积病是泰-萨克斯病或桑德霍夫病。
31.权利要求29或30的方法，其中所述受试者的特征在于在HEXA基因中具有突变，该突变导致所述受试者的氨基己糖苷酶alpha亚基的功能降低或丧失。
32.权利要求29或30的方法，其中所述受试者的特征在于在HEXB基因中具有突变，该突变导致所述受试者的氨基己糖苷酶beta亚基的功能降低或丧失。
33.权利要求29至32中任一项的方法，其中通过颅内注射、脑内注射或者经由脑室系统、小脑延髓池或鞘内空间注射到CSF中施用所述rAAV。
34.权利要求29至33中任一项的方法，其中在所述溶酶体贮积病的症状前阶段期间向所述受试者施用所述分离的核酸或所述rAAV。
35.权利要求34的方法，其中所述溶酶体贮积病的症状前阶段发生在出生(例如围产期)至4周龄之间。
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