KR20220142502A - 근육 특이적 핵산 조절 요소 및 이의 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 적어도 두 개의 횡격막 관련 조절 요소와 심장 및 골격근 관련 조절 요소를 포함하는, 유전자의 근육 특이적 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근과 같은 근육 세포 및/또는 조직에서의 발현을 향상시킬 수 있는 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이들 핵산 조절 요소를 함유하는 발현 카세트 및 벡터뿐만 아니라 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 근육 관련 장애의 유전자 치료, 보다 특히 횡격막, 심장 및/또는 골격근 관련 유전자 치료를 사용하는 적용 및 백신 접종 목적에 특히 유용하다.
Description
본 발명은 유전자의 근육 특이적 발현을 향상시킬 수 있는 핵산 조절 요소, 이러한 조절 요소를 사용하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 핵산 조절 요소는 횡격막, 심장 및 골격근 및 평활근, 바람직하게는 횡격막, 심장 및 골격근에서 유전자 발현을 향상시킬 수 있다. 본 발명은 이들 조절 요소를 포함하는 발현 카세트, 벡터 및 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명은 유전자 치료, 보다 특히 근육 지향적 유전자 치료를 사용하는 적용 및 백신 접종용으로 특히 유용하다.
평활근, 골격근, 심장 및/또는 횡경막의 기능을 손상시키는 유전자 결함으로 인한 많은 유전 장애가 있다(예를 들어, 폼페병, 근이영양증 등). 이러한 유전자 결함은 궁극적으로 심각한 근육 약화 및 마비 또는 생명을 위협하는 결과로 이어지는 심폐 기능 부전을 초래할 수 있다. 예를 들어, 지대 근육 이영양증 유형 2E(Limb Girdle Muscular Dystrophy Type 2E: LGMD2E)는 전 세계적으로 200,000 내지 350,000명 중 1명 꼴로 발병률을 보이는 가장 심각한 LGMD 장애 중 하나이다. 이것은 β-사르코글리칸(β-sg 또는 βsg) 유전자의 돌연변이로 인해 기능적 β-사르코글리칸 단백질이 고갈되어 발생하는 일종의 상염색체 열성 유전성 근이영양증이다. 결과적으로, LGMD2E 환자는 심각하고 광범위한 진행성 근육 소모, 골반 및 견갑대 약화, 근육 섬유증 및 힘 감소, 심근병증, 관절 질환 및 횡격막 기능 장애를 나타낸다. 표준 임상 양식이 질환 치유를 제공하지 않기 때문에 환자는 종종 심폐 기능 부전으로 사망한다. 따라서, LGMD2E에 대한 효과적인 임상 요법을 개발하는 것은 시급한 미충족된 의학적 요구를 제시한다.
유전자 치료는 지속적인 치료 반응을 얻기 위해 영향을 받은 조직에 치료 유전자를 전달하는 능력 덕분에 평활근, 골격근, 심장 및 횡격막의 기능 장애와 변성을 동시에 치료할 수 있는 전례 없는 기회를 제공한다. 그 약속에도 불구하고, 단점은 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 상대적으로 높은 바이러스 벡터 용량이 필요하여 가능한 임상 번역을 방해한다는 것이다. 보다 특히, 평활근, 골격근, 심장 및/또는 횡격막, 보다 특히 골격근, 심장 및/또는 횡경막에 대한 유전자 치료는 유전자 전달 및 유전자 발현의 제한으로 인해 상대적으로 비효율적이다. 더욱이, 치료 유전자 산물에 특이적인 면역 반응은 평활근, 골격근, 심장 및/또는 횡격막, 특히 골격근, 심장 및/또는 횡경막에 대한 유전자 치료 적용의 효율성을 축소한다.
임상 번역을 방해하고 유전자 치료에 의한 LGMD2E에 대한 효과적인 치유의 개발을 방해하는 문제는 또한 다음과 관련이 있다: (i) 영향을 받은 골격근, 심장 및 횡격막에서 치료적 이식유전자(transgene)의 불충분한 발현; (ii) 이러한 생명을 위협하는 질환에 의해 영향을 받은 주요 근육 그룹(즉, 골격근, 심장 및 횡격막)에 도달하여 골격근 약화/쇠약, 심근병증 및 횡격막 기능 장애를 포함한 상기 질병의 다양한 임상 증상을 효과적으로 치료하는 데 필요한 매우 높은 용량의 기존 벡터로 인한 잠재적 독성 및 유해한 면역 반응.
근육에 이식유전자를 전달하려는 노력은 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV) 및 플라스미드로부터 유래된 벡터에 초점을 맞추고 있다. 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)는 근육 유도 유전자 치료를 위한 가장 유망한 유전자 전달 수단이다. 근육 세포에 대한 AAV의 자연 친화성, 장기간 지속되는 이식유전자 발현, 다중 혈청형 및 최소 면역 반응으로 AAV 벡터는 근육 지향 유전자 치료에 매우 적합하다. AAV9는 심장 유전자 전달에 가장 효율적일 뿐만 아니라(Pacak et al. 2006. Circ Res. 99(4):e3-9; VandenDriessche et al. 2007. J Thromb Haemost. 5(1):16-24; Inagaki et al. 2006. Mol Ther. 2006 14(1):45-53), 골격근 유전자 전달에도 매우 적합한 벡터로 알려져 있다. AAV 벡터는 국소, 국부 및 전신 투여에 의해 골격근 심장 근육, 평활근 및 횡격막으로 전달될 수 있다.
그러나, 일부 유전자 전달 접근법의 효능 및 안전성에 대한 우려가 남아 있다. 주요 제한 요인은 불충분하고/거나 일시적인 이식유전자 발현 수준 및 원치 않는 세포 유형에서 이식유전자의 부적절한 발현이다. 특히, 항원 제시 세포(APC)에서 의도하지 않은 이식유전자 발현은 결과적으로 장기간 유전자 발현을 감소시키는 유전자 변형 세포 및/또는 치료적 이식유전자 산물에 대한 부적절한 면역 반응의 위험을 증가시키는 것으로 나타났다.
이 문제는 근육 및 횡격막 특이적 시스-조절 요소(CRE)(시스-조절 모듈(CRM)로도 지정됨)를 사용하여 유전자 발현을 증가시켜 해결되었다. 이러한 새롭고 강력한 인간 시스-조절 요소는 전체 게놈 데이터 마이닝을 통해 얻어졌으며 비표적 조직에서의 발현을 피하면서 횡격막 및/또는 심장 및 골격근에서 강력한 특이적 이식유전자 발현 수준을 산출하였다(WO 2015/110449 A1; WO 2018/178067 A1).
그러나, 환자에게 전신적으로 투여되는 높은 벡터 용량을 기반으로 한 유전자 치료 시도는 전부는 아니지만 대부분에서 발생한 잘 문서화된 간 독성과 같은 원치 않는 독성을 유발하지 않는 수준으로 벡터 용량을 더 줄여야 하기 때문에, 이러한 CRM 중 하나를 사용하여 근육, 심장 또는 횡격막에서 치료 단백질을 발현하는 것만으로는 충분치 않을 수 있다.
따라서, 근육으로의 안전하고 효율적인 유전자 전달이 당업계에서 여전히 필요하다. 예를 들어, 이상적으로는 더 낮고 따라서, 더 안전한 벡터 용량에서 치료 β-사르코글리칸 이식유전자(β-SG)의 높고 광범위한 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 발현, 바람직하게는 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 발현을 허용하는 보다 강력한 유전자 치료 벡터를 개발하여 LGMD2E에 대한 조직 표적 유전자 치료 응용의 효능과 안전성을 더욱 향상시키는 것이 필수적이다.
요약
본 발명자들은 특이적 세포 및 조직에서 예기치 않게 높은 발현을 제공하는 전사 시스-조절 요소 또는 모듈(CRE 또는 CRM)의 신규한 조합을 기반으로 하여 횡격막, 심장 및/또는 골격근과 같은 근육 세포 및 조직에서 발현을 최대화하기 위한 접근법을 개발함으로써 현재 유전자 치료 적용의 문제를 해결하였다. 이를 위해, LGMD2E에 대한 유전자 치료 전략으로서 강력한 근육 특이적 프로모터와 함께 횡격막(본원에서 Dph-CRE라고도 함) 또는 심장 및 골격(본원에서 CSk(-)CRE 또는 CSk(-)SH(-)CRE 또는 CSk(-)SH 또는 Csk(-)CRE 또는 Csk(-)SH(-)CRE 또는 Csk(-)SH 또는 CSK(-)CRE 또는 CSK(-)SH(-)CRE 또는 CSK(-)SH라고도 함)에 발현을 지시하는 CRE 요소 또는 모듈의 조합을 사용하여 인간 β-사르코글리칸 cDNA(hβsg 또는 hβSG)를 발현하는 AAV 벡터가 설계되었다. 이들 새로운 조절 요소는 이후 심장, 평활근, 골격근 및 횡격막, 바람직하게는 심장, 골격근 및 횡격막에서 예기치 않게 높은 조직 특이적 유전자 발현을 생성하는 마우스에서 생체내 검증되었다. 따라서, 이 접근법은 치료 효능을 최대화하면서 더 낮고 따라서, 더 안전한 벡터 용량의 사용을 허용한다.
따라서, 본 발명은 다음과 같은 측면을 제공한다:
측면 1: 서열 번호 2에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 서열 번호 3에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 및 서열 번호 4에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편으로부터 선택되는 적어도 2개의 횡격막 특이적 조절 요소; 및 서열 번호 1에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 근육 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소.
측면 2: 측면 1에 있어서, 서열 번호 2에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 서열 번호 3에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 및 서열 번호 1에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 3: 측면 2에 있어서, 서열 번호 5에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소; 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 4: 측면 2 또는 3에 있어서, 서열 번호 10에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 5: 측면 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 4에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 더 포함하는 핵산 조절 요소.
측면 6: 측면 1에 있어서, 서열 번호 2에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 서열 번호 4에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 및 서열 번호 1에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 7: 측면 6에 있어서, 서열 번호 6에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소; 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 8: 측면 6 또는 7에 있어서, 서열 번호 11에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 9: 측면 6 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 3에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 더 포함하는 핵산 조절 요소.
측면 10: 측면 1에 있어서, 서열 번호 3에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 서열 번호 4에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 및 서열 번호 1에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 11: 측면 10에 있어서, 서열 번호 7에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE04-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소; 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 12: 측면 10에 있어서, 서열 번호 8에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE06-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소; 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 13: 측면 10 또는 11에 있어서, 서열 번호 12에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 14: 측면 10 또는 12에 있어서, 서열 번호 13에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE06 - Dph-CRE04 - CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 15: 측면 10 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 2에 제시된 서열와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 16: 측면 10, 11, 13 또는 15 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 9에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02-CRE04-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소; 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 17: 측면 10, 11, 13, 15 또는 16 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 14에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 조절 요소.
측면 18: 근육, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근에서 유전자 발현을 향상시키기 위한, 측면 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 핵산 조절 요소의 용도, 바람직하게는 시험관내 또는 생체외 용도.
측면 19: 프로모터에 작동가능하게 연결된 측면 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 핵산 조절 요소를 포함하는 핵산 발현 카세트.
측면 20: 측면 19에 있어서, 핵산 조절 요소가 프로모터 및 이식유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 핵산 발현 카세트.
측면 21: 측면 19 또는 20에 있어서, 프로모터가 근육 특이적 프로모터, 예컨대, 다음을 포함하거나 이로 이루어진 군 중에서 선택되는 근육 특이적 프로모터인 핵산 발현 카세트: 데스민(DES) 프로모터; 합성 SPc5-12 프로모터(SPc5-12); 알파-액틴1 프로모터(ACTA1); 크레아틴 키나제, 근육(CKM) 프로모터; 4.5개의 LIM 도메인 단백질 1(FHL1) 프로모터; 알파 2 액티닌(ACTN2) 프로모터; 필라민-C(FLNC) 프로모터; 근형질/소포체 칼슘 ATPase 1(ATP2A1) 프로모터; 트로포닌 I 유형 1(TNNI1) 프로모터; 트로포닌 I 유형 2(TNNI2) 프로모터; 트로포닌 T 유형 1(TNNT1) 프로모터; 트로포닌 T 유형 3(TNNT3) 프로모터; 미오신-1(MYH1) 프로모터; 미오신-2(MYH2) 프로모터; 사르코리핀(SLN) 프로모터; 미오신 결합 단백질 C1(MYBPC1) 프로모터; 에놀라제(EN03) 프로모터; 탄산 탈수효소 3(CA3) 프로모터; 인산화 가능한 속 골격근 미오신 경쇄(MYLPF) 프로모터; 트로포미오신 1(TPM1) 프로모터; 트로포미오신 2(TPM2) 프로모터; 알파-3 사슬 트로포미오신(TPM3) 프로모터; 안키린 반복 도메인-함유 단백질 2(ANKRD2) 프로모터; 미오신 중쇄(MHC) 프로모터; 알파 미오신 중쇄 프로모터(αMHC) 프로모터; 미오신 경쇄(MLC) 프로모터; 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터; 미오신, 경쇄 1(MYL1) 프로모터; 미오신, 경쇄 2(MYL2) 프로모터; 미오글로빈(MB) 프로모터; 트로포닌 T 유형 2(TNNT2) 프로모터; 트로포닌 C 유형 2(TNNC2) 프로모터; 트로포닌 C 유형 1(TNNC1) 프로모터; 티틴-캡(TCAP) 프로모터; 미오신, 중쇄 7(MYH7) 프로모터; 알돌라제 A(ALDOA) 프로모터; dMCK 프로모터, tMCK 프로모터; MHCK7 프로모터; 미오신 중쇄 11(Myh11) 프로모터; 트랜스젤린(Tagln) 프로모터 및 액틴 알파 2 평활근(Acta2) 프로모터.
측면 22: 측면 19 내지 21 중 어느 하나 있어서, 프로모터가 서열 번호 15에 의해 정의된 바와 같은 SPc5-12 프로모터인 핵산 발현 카세트.
측면 23: 측면 19 내지 측면 21 중 어느 하나 있어서, 프로모터가 서열 번호 56에 의해 정의된 바와 같은 MHCK7 프로모터인 핵산 발현 카세트.
측면 24: 측면 19 내지 측면 21 중 어느 하나 있어서, 프로모터가 서열 번호 57에 의해 정의된 바와 같은 데스민 프로모터인 핵산 발현 카세트.
측면 25: 측면 19 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 치료 단백질을 인코딩하는 핵산 발현 카세트.
측면 26: 측면 19 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 사르코글리칸, 바람직하게는 β-사르코글리칸, 보다 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸(예를 들어, 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 코돈-최적화된 이식유전자)을 인코딩하는 핵산 발현 카세트.
측면 27: 측면 19 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 산 α-글루코시다제(GAA), 바람직하게는 인간 산 α-글루코시다제(hGAA)(예를 들어, 서열 번호 58에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 59에 제시된 코돈-최적화된 이식유전자)을 인코딩하는 핵산 발현 카세트.
측면 28: 측면 19 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 리포터 유전자, 예컨대 루시퍼라제 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 20에 제시된 이식유전자)인 핵산 발현 카세트.
측면 29: 측면 19 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 코돈 최적화된 핵산 발현 카세트.
측면 30: 측면 19 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 인트론, 바람직하게는 미세 마우스 바이러스(Minute Virus of Mouse: MVM) 인트론(서열 번호 16에 제시됨)을 추가로 포함하는 핵산 발현 카세트.
측면 31: 측면 19 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 서열 번호 17에 의해 정의된 것과 같은 합성 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는, 측핵산 발현 카세트.
측면 32: 측면 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 핵산 조절 요소, 또는 측면 19 내지 31 중 어느 하나에 따른 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터.
측면 33: 측면 32에 있어서, 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 보다 바람직하게는 AAV9 벡터 또는 AAV8 벡터인 벡터.
측면 34: 측면 19 내지 31 중 어느 하나에 따른 핵산 발현 카세트, 또는 측면 32 또는 33 중 어느 하나에 따른 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
측면 35: 의약에 사용하기 위한, 측면 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 핵산 조절 요소, 측면 19 내지 31 중 어느 하나에 따른 핵산 발현 카세트, 측면 32 또는 33 중 어느 하나에 따른 벡터, 또는 측면 34에 따른 약학적 조성물.
측면 36: 유전자 치료, 바람직하게는 근육 지향적 유전자 치료에 사용하기 위한, 측면 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 핵산 조절 요소, 측면 19 내지 31 중 어느 하나에 따른 핵산 발현 카세트, 측면 32 또는 33 중 어느 하나에 따른 벡터, 또는 측면 34에 따른 약학적 조성물. 예를 들어, 유전자 치료는 리소좀 저장 질병(예를 들어, 파브리병), 예컨대 글리코겐 저장 장애(예를 들어, 폼페병 글리코겐 저장 장애(GSD) 유형 II, 다농병, GSD 유형 IIb, GSD III 또는 GSD 3(코리병 또는 포브스병으로도 알려짐), GSD IV 또는 GSD4(안데르센병으로도 알려짐), GSD V 또는 GSD5(맥아들병으로도 알려짐), GSD VII 또는 GSD7(타루이병으로도 알려짐), GSD X 또는 GSD10, GSD XII 또는 GSD 12(알돌라제 A 결핍으로도 알려짐), GSD XIII 또는 GSD13, GSD XV 또는 GSD15) 및 점액다당류증 장애(예를 들어, 헌터 증후군, 산필리포 증후군, 뮤코폴리사카리도스(mucopolyssacharidose: MPS) I, MPS II, MPS III, MPS IIIA, MPS IIIB, MPS IIIC, MPS IV, MPS VI, MPS VII, MPS IX); 미토콘드리아 장애(예를 들어, 바르트 증후군); 이온통로병증(예를 들어, 브루가다 증후군); 대사 장애; 근세관성 근병증(MTM); 근이영양증(예를 들어 뒤시엔느(Duchenne) 근이영양증(DMD), 베커(Becker) 근이영양증(BMD)); 근긴장성 이영양증; 근긴장성 근이영양증(DM); 미요시 근병증; 선천성 후쿠야마형; 디스퍼리노퍼시(dysferlinopathy); 신경근 질환; 운동 뉴런 질환(MND)(예를 들어, 샤르코-마리-투스 질환(CMT)), 척수성 근위축증(SMA) 또는 근위축성 측삭 경화증(ALS)); 에머리 드라이퍼스(Emery-Dreifuss) 근이영양증; 안면견갑상완 근이영양증(FSHD); 선천성 근이영양증; 선천성 근병증; 지대 근이영양증(예를 들어, 지대 근이영양증 유형 2E(LGMD2E), 지대 근이영양증 유형 2D(LGMD2D), 지대 근이영양증 유형 2C(LGMD2C), 지대 근이영양증 유형 2B(LGMD2B), 지대 근이영양증 유형 2L(LGMD2L), 지대 근이영양증 유형 2A (LGMD2A)); 대사성 근병증; 근육 염증성 질환; 근무력증; 미토콘드리아 근병증; 이온 채널 이상; 핵외피 질환; 심근병증; 심장 비대; 심부전; 원위 근육병증, 혈우병(예를 들어, 혈우병 A 및 B); 당뇨병; 심혈관 질환 및 심장 질환으로부터 선택된 질병 또는 장애에 대한 것일 수 있다.
측면 37: 측면 36에 있어서, 유전자 치료가 일반적으로 근육 관련 장애를 치료하거나, 일반적으로 근병증의 증상을 완화시키거나, 일반적으로 근육 세포의 기능을 회복하기 위한 것인, 사용을 위한 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 약학적 조성물.
측면 38: 측면 36에 있어서, 유전자 치료가 심혈관 질환을 치료하기 위한 것인, 사용을 위한 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 약학적 조성물. 심혈관 질환의 비제한적인 예로서 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 관상심장질환, 관상동맥질환, 말초동맥질환, 선천성 심장질환, 울혈성 심부전, 심부전(심부전증으로도 알려짐), 심근경색증(심장마비로도 알려짐), 심장 허혈, 급성 관상동맥 증후군, 불안정형 협심증, 안정형 협심증, 심근병증, 비후성 심근병증, 확장성 심근병증, 제한성 심근병증, 브루가다 증후군, 폼페병, 다농병 및 파브리병과 같은 유전적 돌연변이로 인한 원발성 심근병증, 심장 아밀로이드증(강직 심장 증후군이라고도 함), 심근염(염증성 심근병증이라고도 함), 판막 심장 질환, 판막 협착증, 판막 부전, 심내막염, 류마티스성 심장 질환, 심막염(즉, 심낭의 염증 및/또는 감염에 의해 유발되는 질병), 심장 탐포나이드(또한 심낭 눌림증이라고도 함), 심내막염, 심장 부정맥, 고혈압, 저혈압, 혈관 협착, 판막 협착 또는 재협착을 들 수 있다.
측면 39: 지대 근이영양증, 보다 바람직하게는 지대 근이영양증 유형 2E(LGMD2E)의 치료에 사용하기 위한, 측면 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 핵산 조절 요소, 측면 19 내지 26 또는 29 내지 31 중 어느 하나에 따른 핵산 발현 카세트, 측면 32 또는 33 중 어느 하나에 따른 벡터, 또는 측면 34에 따른 약학적 조성물.
측면 40: 이식유전자가 리소좀 단백질, 바람직하게는 산 α-갈락토시다제(GAA), 알파-갈락토시다제 A 및 LAMP2로 이루어진 군으로부터 선택된 리소좀 단백질을 인코딩하는 측면 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 핵산 조절 요소; 측면 19 내지 25 또는 29 내지 31 중 어느 하나에 따른 핵산 발현 카세트; 리소좀 축적 질환의 치료에 사용하기 위한, 상기 핵산 발현 카세트를 포함하는 측면 32 또는 33 중 어느 하나에 따른 벡터; 또는 상기 핵산 발현 카세트 또는 상기 벡터를 포함하는 측면 34에 따른 약학 조성물.
측면 41: 폼페병의 치료에 사용하기 위한, 측면 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 핵산 조절 요소, 측면 19 내지 25, 27, 또는 29 내지 31 중 어느 하나에 따른 핵산 발현 카세트, 측면 32 또는 33 중 어느 하나에 따른 벡터, 또는 34 측면에 따른 약학적 조성물.
측면 42:
- 측면 19 내지 31 중 어느 하나에 따른 핵산 발현 카세트, 또는 측면 32 또는 33 중 어느 하나에 따른 벡터를 근육 세포 내로 도입하는 단계;
- 근육 세포에서 이식유전자 산물을 발현하는 단계를 포함하는,
횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 세포와 같은 근육 세포, 특히 횡격막, 심장 및/또는 골격근 세포에서 이식유전자 산물을 발현시키기 위한 방법, 바람직하게는 시험관내 또는 생체외 방법.
도 1: 핵산 조절 요소. (A) CSk-SH5(서열 번호 1). (B) Dph-CRE02(서열 번호 2). (C) Dph-CRE04(서열 번호 3). (D) Dph-CRE06(서열 번호 4). 플랭킹 서열(밑줄 친 부분)을 통해 연결된 Dph-CRE02 및 Dph-CRE04의 조합인 (E) Dph-CRE02-CRE04(서열 번호 5). (F) 플랭킹 서열(밑줄 친 부분)을 통해 연결된 Dph-CRE02 및 Dph-CRE06의 조합인 Dph-CRE02-CRE06(서열 번호 6). (G) 플랭킹 서열(밑줄 친 부분)을 통해 연결된 Dph-CRE04 및 Dph-CRE06의 조합인 Dph-CRE04-CRE06(서열 번호 7). (H) 플랭킹 서열(밑줄 친 부분)을 통해 연결된 Dph-CRE06 및 Dph-CRE04의 조합인 Dph-CRE06-CRE04(서열 번호 8). (I) 플랭킹 서열(밑줄 친 부분)을 통해 서로 연결된 Dph-CRE02, Dph-CRE04 및 Dph-CRE06의 조합인 Dph-CRE02-CRE04-CRE06(서열 번호 9). (J) Dph-CRE02-CRE04-CSk-SH5(서열 번호 10). (K) Dph-CRE02-CRE06-CSk-SH5(서열 번호 11). (L) Dph-CRE04-CRE06-CSk-SH5(서열 번호 12). (M) Dph-CRE06-CRE04-CSk-SH5(서열 번호 13). (N) Dph-CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5(서열 번호 14).
도 2: AAV 벡터의 설계. AAV 벡터는 인간 β-사르코글리칸(hβsg) 또는 루시퍼라제(Luc)를 발현하도록 설계되었다. 벡터는 코돈 최적화된(hβsgco, 서열 번호 19) 또는 코돈 최적화되지 않은 hβsg(서열 번호 18) 이식유전자를 포함한다. 벡터는 SPc5-12(서열 번호 15)로 명명된 합성 근육 프로모터를 함유한다. 벡터는 모두 미세 마우스 바이러스 인트론(MVM, 서열 번호 16) 및 합성 폴리아데닐화 부위(pA, 서열 번호 17)를 포함한다. 벡터는 5' 및 3' AAV 역 말단 반복(ITR)이 측면에 있다. 벡터는 심장 및 골격근 특이적 CRE(CSk-SH5) (A, B, A1)를 하나 이상의 횡경막 특이적 CRE(CRE02, CRE04 또는 CRE06) (CW)와 함께 포함하거나, 또는 임의의 CRE 요소(X, Y, Z)가 결실되어 있다.
도 3: 루시퍼라제 발현에 대한 CRE 조합의 효과. SPc5-12(SPc)로 지정된 합성 근육 프로모터로부터 루시페라제를 발현하는 AAV 벡터를 주사한 CB17-SCID 마우스의 비복근 및 사두근의 생물발광 분석(BLI). 벡터는 심장/골격근 CRE(CSk-SH5)를 단독으로, 또는 하나 이상의 횡격막 특이적 CRE(CRE02, CRE04 및/또는 CRE06) 및/또는 심장/골격근 CRE(CSk-SH5)와 조합하여 포함하고 있다.
도 4: 비복근(A), 사두근(B), 횡격막(C) 및 심장(D)에서 코돈 최적화된 hβsc 유전자의 발현에 대한 CRE 조합의 효과. SPc5-12 프로모터로부터 코돈 최적화된 (hβsgco)를 발현하는 AAV 벡터가 CB17-SCID에 주입되었다. 벡터에는 심장 및 골격근 특이적 CRE(CSk-SH5)가 단독으로 또는 1 또는 2개의 횡격막 특이적 CRE(Dph-CRE02, Dph-CRE04 및/또는 Dph-CRE06)와 조합하여 포함되었다. hβsgco 유전자의 발현은 정량적 실시간 역전사효소 PCR(qRT-PCR)에 의해 결정되었다.
도 5. 비복근(A), 사두근(B), 횡격막(C) 및 심장(D)에서 코돈 최적화된 h b sc 유전자의 발현에 대한 CRE 조합의 효과. SPc5-12 프로모터로부터 코돈 최적화된(hβsgco)를 발현하는 AAV 벡터가 CB17-SCID에 주입되었다. 벡터에는 무 CRE 요소(SPc), 심장 및 골격근 특이적 CRE(CSk-SH5-SPC), 2개의 횡경막 특이적 CRE와 심장 및 골격근 특이적 CRE의 조합(CRE04-CRE06-CSk-SH5) 또는 3개의 횡경막 특이적 CRE와 심장 및 골격근 관련 CRE의 조합(CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5)이 포함되었다. hβsgco 유전자의 발현은 정량적 실시간 역전사효소 PCR(qRT-PCR)에 의해 결정되었다.
도 6, 유전자 치료 처리된 Sgcb -눌(null) 마우스의 표현형 교정을 평가하기 위한 트레드밀 지구력 분석. 세 다른 그룹의 마우스에 대해 트레드밀 지구력 분석을 하였다. AAV-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA, AAV-CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA 또는 음성 대조군으로 PBS를 주사한 Sgcb-눌 마우스. 각 마우스 그룹이 실행한 평균 거리가 표시된다(n=3).
도 2: AAV 벡터의 설계. AAV 벡터는 인간 β-사르코글리칸(hβsg) 또는 루시퍼라제(Luc)를 발현하도록 설계되었다. 벡터는 코돈 최적화된(hβsgco, 서열 번호 19) 또는 코돈 최적화되지 않은 hβsg(서열 번호 18) 이식유전자를 포함한다. 벡터는 SPc5-12(서열 번호 15)로 명명된 합성 근육 프로모터를 함유한다. 벡터는 모두 미세 마우스 바이러스 인트론(MVM, 서열 번호 16) 및 합성 폴리아데닐화 부위(pA, 서열 번호 17)를 포함한다. 벡터는 5' 및 3' AAV 역 말단 반복(ITR)이 측면에 있다. 벡터는 심장 및 골격근 특이적 CRE(CSk-SH5) (A, B, A1)를 하나 이상의 횡경막 특이적 CRE(CRE02, CRE04 또는 CRE06) (CW)와 함께 포함하거나, 또는 임의의 CRE 요소(X, Y, Z)가 결실되어 있다.
도 3: 루시퍼라제 발현에 대한 CRE 조합의 효과. SPc5-12(SPc)로 지정된 합성 근육 프로모터로부터 루시페라제를 발현하는 AAV 벡터를 주사한 CB17-SCID 마우스의 비복근 및 사두근의 생물발광 분석(BLI). 벡터는 심장/골격근 CRE(CSk-SH5)를 단독으로, 또는 하나 이상의 횡격막 특이적 CRE(CRE02, CRE04 및/또는 CRE06) 및/또는 심장/골격근 CRE(CSk-SH5)와 조합하여 포함하고 있다.
도 4: 비복근(A), 사두근(B), 횡격막(C) 및 심장(D)에서 코돈 최적화된 hβsc 유전자의 발현에 대한 CRE 조합의 효과. SPc5-12 프로모터로부터 코돈 최적화된 (hβsgco)를 발현하는 AAV 벡터가 CB17-SCID에 주입되었다. 벡터에는 심장 및 골격근 특이적 CRE(CSk-SH5)가 단독으로 또는 1 또는 2개의 횡격막 특이적 CRE(Dph-CRE02, Dph-CRE04 및/또는 Dph-CRE06)와 조합하여 포함되었다. hβsgco 유전자의 발현은 정량적 실시간 역전사효소 PCR(qRT-PCR)에 의해 결정되었다.
도 5. 비복근(A), 사두근(B), 횡격막(C) 및 심장(D)에서 코돈 최적화된 h b sc 유전자의 발현에 대한 CRE 조합의 효과. SPc5-12 프로모터로부터 코돈 최적화된(hβsgco)를 발현하는 AAV 벡터가 CB17-SCID에 주입되었다. 벡터에는 무 CRE 요소(SPc), 심장 및 골격근 특이적 CRE(CSk-SH5-SPC), 2개의 횡경막 특이적 CRE와 심장 및 골격근 특이적 CRE의 조합(CRE04-CRE06-CSk-SH5) 또는 3개의 횡경막 특이적 CRE와 심장 및 골격근 관련 CRE의 조합(CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5)이 포함되었다. hβsgco 유전자의 발현은 정량적 실시간 역전사효소 PCR(qRT-PCR)에 의해 결정되었다.
도 6, 유전자 치료 처리된 Sgcb -눌(null) 마우스의 표현형 교정을 평가하기 위한 트레드밀 지구력 분석. 세 다른 그룹의 마우스에 대해 트레드밀 지구력 분석을 하였다. AAV-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA, AAV-CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA 또는 음성 대조군으로 PBS를 주사한 Sgcb-눌 마우스. 각 마우스 그룹이 실행한 평균 거리가 표시된다(n=3).
설명
본원에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 단수 및 복수 지시 대상을 모두 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "포함하는", "포함한다" 및 "~로 이루어진"은 "포함한", "포함하다" 또는 "함유하는", "함유한다"와 동의어이고, 포괄적이거나 개방형이며 추가의 인용되지 않은 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 이 용어는 또한 특허 용어에서 잘 정립된 의미를 갖는 "~로 이루어진" 및 "~로 필수적으로 이루어진"을 포함한다.
끝점에 의한 수치 범위의 인용은 인용된 끝점뿐만 아니라 각 범위 내에 포함된 모든 숫자와 분수를 포함한다.
매개변수, 양, 시간적인 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 개시된 발명에서 수행하기에 적절하다면 명시된 값 및 그로부터의 +/-10% 이하, 바람직하게는 +/-5% 이하, 보다 바람직하게는 +/-1% 이하, 보다 더 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 변동과 같이, 명시된 값 및 그로부터의 변동을 포함하도록 의도된다. "약"으로 수식된 값 자체도 구체적으로, 그리고 바람직하게 개시되어 있는 것으로 이해되어야 한다.
하나 이상의 구성원 또는 구성원 그룹의 적어도 하나의 구성원과 같이, 용어 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 그 자체로 명확하지만, 추가 예시를 통해 그 용어는 특히 상기 구성원 중 어느 하나, 또는 상기 구성원 중 2 이상, 예를 들어 상기 구성원의 ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 또는 ≥7 등 및 상기 모든 구성원까지의 언급을 포함한다. 다른 예에서, "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상을 나타낼 수 있다.
본 발명의 배경에 대한 논의는 본 발명의 맥락을 설명하기 위해 포함되었다. 이것은 언급된 자료가 청구 우선일 현재 임의의 국가에서 공개되었거나 알려진 보편적인 일반 지식의 일부임을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서가 식별 인용에 의해 참조된다. 본원에 인용된 모든 문서는 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 특히, 본원에서 구체적으로 언급된 그러한 문서의 교시 또는 섹션은 참고로서 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 기술 및 과학 용어를 포함하여 본 발명을 개시하는데 사용되는 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 추가 지침에 의해, 본 발명의 교시를 더 잘 이해하기 위해 용어 정의가 포함된다. 특정 용어가 본 발명의 특정 측면 또는 본 발명의 특정 실시양태와 관련하여 정의될 때, 그러한 함축은 본 명세서 전체에 걸쳐, 즉, 달리 정의되지 않는 한 본 발명의 다른 측면 또는 실시양태의 맥락에서도 적용되는 것을 의미한다.
다음 절에서, 본 발명의 상이한 측면 또는 실시양태가 보다 상세하게 정의된다. 이와 같이 정의된 각각의 측면 또는 실시양태는 명백하게 반대로 표시되지 않는 한 임의의 다른 측면(들) 또는 실시양태(들)와 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 "하나의 실시양태", "일 실시양태"에 대한 참조는 실시양태와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 "하나의 실시양태에서" 또는 "일 실시양태에서"라는 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니지만, 그럴 수도 있다. 또한, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시양태에서 본 개시내용으로부터 당업자에게 명백한 바와 같이 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 일부 실시양태는 다른 실시양태에 포함된 다른 특징이 아닌 일부를 포함하지만, 상이한 실시양태의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도되고, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상이한 실시양태를 형성한다. 예를 들어, 이어지는 청구범위에서, 청구된 임의의 실시양태는 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명과 관련된 일반적인 방법에 대해, 특히 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed." (Green and Sambrook, 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press), "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., 1987)를 비롯한 잘 알려진 텍스트가 참조된다.
일 측면에서, 본 발명은 적어도 2개, 예컨대 2개, 3개 이상의 횡격막 특이적 조절 요소 및 심장 및 골격근 특이적 조절 요소를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나(즉, 조절 요소는 예를 들어 클로닝 목적에 사용되는 서열을 추가로 포함할 수 있지만 표시된 서열이 조절 요소의 필수 부분을 구성함), 또는 이로 이루어진, 근육 특이적 유전자 발현의 향상, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현의 향상, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격 근육 특이적 유전자 발현의 향상을 위한 핵산 조절 요소에 관한 것으로서, 여기서 적어도 2개의 횡격막 특이적 조절 요소는 서열 번호 2와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나(즉, 조절 요소는 예를 들어 클로닝 목적으로 사용되는 서열을 추가로 포함할 수 있지만, 표시된 서열은 조절 요소의 필수 부분을 구성하며, 예를 들어 프로모터와 같은 더 큰 조절 영역의 일부를 형성하지 않는다), 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 서열 번호 3과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 및 서열 번호 4와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 심장 및 골격근 특이적 조절 요소는 서열 번호 1과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5), 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
본원에서 사용된 '조절 요소' 또는 '시스-조절 요소(CRE)' 또는 '시스-조절 모듈(CRM)' 또는 "SH"는 유전자의 전사, 특히 유전자의 조직 특이적 전사를 조절 및/또는 제어할 수 있는 전사 제어 요소, 특히 비코딩 시스-작용 전사 제어 요소를 지칭한다. 조절 요소는 적어도 하나의 전사 인자 결합 부위(TFBS), 보다 특히 조직 특이적 전사 인자에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다. 조절 요소만으로는 일반적으로 전사를 시작하기에 충분하지 않고 이를 위해서는 프로모터가 필요하다. 전형적으로, 본원에서 사용된 조절 요소는 조절 요소 없이 프로모터 단독으로부터의 유전자의 전사와 비교할 때 프로모터-구동 유전자 발현을 증가 또는 향상시킨다. 따라서, 조절 요소는 특히 인핸서 서열을 포함하지만, 전사를 향상시키는 조절 요소는 전형적인 먼 상류 인핸서 서열에 제한되지 않고 그들이 조절하는 유전자의 임의의 거리에서 또는 유전자 또는 개방 판독 프레임 자체 내에서도 발생할 수 있음을 이해해야 한다. 실제로, 전사를 조절하는 서열은 생체내에서 조절하는 유전자의 상류(예를 들어, 프로모터 영역) 또는 하류(예를 들어, 3'UTR)에 위치할 수 있고, 유전자의 바로 근처 또는 더 멀리에 위치할 수 있다는 것이 당업계에 알려져 있다. 본원에 개시된 바와 같은 조절 요소는 자연 발생 서열뿐만 아니라 이의 변이체 및 이러한 조절 요소의 조합 또는 이러한 조절 요소의 여러 카피, 즉 비-자연 발생 서열을 포함하는 조절 요소를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 조절 요소는 전사 제어에 관여하는 더 큰 서열의 일부, 예를 들어 프로모터 서열의 일부를 포함할 수 있다. 본 발명의 조절 요소는 비-자연 발생 서열이다. 본원에 개시된 조절 요소는 핵산 분자로서 제공된다.
본원에서 사용된 용어 "핵산"은 전형적으로 뉴클레오티드로 필수적으로 이루어진 임의 길이의 올리고머 또는 중합체(바람직하게는 선형 중합체)를 지칭한다. 뉴클레오티드 단위는 일반적으로 헤테로사이클릭 염기, 당 기, 및 변형 또는 치환된 포스페이트기를 포함하는 적어도 하나, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 포스페이트기를 포함한다. 헤테로사이클릭 염기는 특히 자연 발생 핵산에 널리 퍼져 있는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)과 같은 퓨린 및 피리미딘 염기, 기타 자연 발생 염기(예를 들어, 크산틴, 이노신, 하이포잔틴) 뿐만 아니라 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된(예를 들어, 메틸화된), 비천연 또는 유도체화된 염기를 포함할 수 있다. 당 기는 그 중에서도 펜토스(펜토푸라노스) 기, 예컨대 바람직하게는 자연 발생 핵산에서 흔한 리보스 및/또는 2-데옥시리보스, 또는 아라비노스, 2-데옥시아라비노스, 트레오스 또는 헥소스 당 기뿐만 아니라 변형되거나 치환된 당 기를 포함할 수 있다. 본원에서 의도된 바와 같은 핵산은 자연 발생 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 변형된 헤테로사이클릭 염기, 변형된 당 모이어티, 변형된 포스페이트기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 포스페이트기 또는 당의 변형은 안정성, 효소 분해에 대한 내성 또는 기타 유용한 특성을 개선하기 위해 도입될 수 있다. "핵산"이라는 용어는 바람직하게는 특히 hnRNA, pre-mRNA, mRNA, cDNA, 게놈 DNA, 증폭 산물, 올리고뉴클레오티드, 및 합성 (예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드를 포함하는 DNA, RNA, 및 DNA/RNA 하이브리드 분자를 포함한다. 핵산은 자연 발생, 예를 들어 자연에 존재하거나 자연으로부터 단리될 수 있거나; 또는 비-자연 발생, 예를 들어 재조합, 즉, 재조합 DNA 기술에 의해 생성되고/되거나 부분적으로 또는 전체적으로 화학적으로 또는 생화학적으로 합성될 수 있다. "핵산"은 이중 가닥, 부분적 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥인 경우, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 또한 핵산은 원형 또는 선형일 수 있다.
본원에서 사용된 "전사 인자 결합 부위", "전사 인자 결합 서열" 또는 "TFBS"는 전사 인자가 결합하는 핵산 영역의 서열을 지칭한다. TFBS의 비제한적인 예로서 TCF3 또는 E2A로도 알려진 전사 인자 3에 대한 결합 부위; NF1이라고도 알려진 핵 인자 I에 대한 결합 부위; C/EBP로도 알려진 CCAAT-인핸서-결합 단백질에 대한 결합 부위; MyoD라고도 알려진 근육 분화를 위한 결합 부위; SREBP로도 알려진 스테롤 조절 요소 결합 단백질에 대한 결합 부위; LRF로도 알려진 백혈병/림프종 관련 인자에 대한 결합 부위; p53으로도 알려진 단백질 53에 대한 결합 부위; HNF3a로도 알려진 간세포 핵 인자 3-알파에 대한 결합 부위; HNF3b로도 알려진 간세포 핵 인자 3-베타에 대한 결합 부위; HNF4로도 알려진 간세포 핵 인자 4에 대한 결합 부위; MEF2A 또는 RSRFC4로도 알려진 근세포 특이적 인핸서 인자 2A에 대한 결합 부위; PPAR-감마1/2로도 알려진 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 감마 1/2에 대한 결합 부위; SRF로도 알려진 혈청 반응 인자에 대한 결합 부위; Tal1_b 또는 Tal1-베타로도 알려진 전사 활성제 유사 단백질 1b에 대한 결합 부위; EZH2로도 알려진 제스테 동족체 2의 인핸서에 대한 결합 부위; SUZ12로도 알려진 폴리콤 억제 복합체 2 서브유닛(Polycom Repressive Complex 2 Subunit)에 대한 결합 부위; TBP로도 알려진 TATA 결합 단백질에 대한 결합 부위; FOLR2A로도 알려진 엽산 수용체 알파에 대한 결합 부위; REST로도 알려진 RE-1 침묵 전사 인자에 대한 결합 부위; TEAD4로도 알려진 TEA 도메인 전사 인자 4에 대한 결합 부위; RBBP5로도 알려진 망막모세포종-결합 단백질 5에 대한 전사 인자 결합 부위; Msx-1로도 알려진 Msh 호메오박스(Homeobox) 1에 대한 전사 인자 결합 부위; SIN3A로도 알려진 SIN3 전사 조절자 패밀리 구성원 A에 대한 전사 인자 결합 부위; JUND로도 알려진 JunD에 대한 전사 인자 결합 부위; ZZZ3으로도 알려진 징크 핑거(Zinc Finger) ZZ-형 포함 3에 대한 전사 인자 결합 부위; AREB6으로도 알려진 징크 핑거 E-박스 결합 호메오박 1에 대한 전사 인자 결합 부위; 전사 인자 E2F에 대한 전사 인자 결합 부위; ITF2로도 알려진 전사 인자 4에 대한 전사 인자 결합 부위; ER-알파로도 알려진 에스트로겐 수용체 알파에 대한 전사 인자 결합 부위; MYBL2로도 알려진 Myb 관련 단백질 B; FOXA1로도 알려진 포크헤드 박스(forkhead box) A1; FOXA2로도 알려진 포크헤드 박스 A2; TAF7로도 알려진 전사 개시 인자 TFIID 서브유닛 7; SIN3AK20; MAX로도 알려진 MAX 전사 인자; ZBTB7A로도 알려진 징크 핑거 및 BTB 도메인 함유 단백질 7A를 들 수 있다. 전사 인자 결합 부위는 Transfac®과 같은 데이터베이스에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "동일성" 및 "동일한" 등은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예를 들어 2개의 DNA 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 서열 정렬 및 서열 동일성의 결정은 예를 들어 [Altschul et al. (1990 (J Mol Biol 215: 403-10)]에 의해 최초 기술된 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool), 예컨대 Tatusova and Madden 1999(FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)에 의해 기술된 "Blast 2 서열" 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 전형적으로, 백분율 서열 동일성은 서열의 전체 길이에 대해 계산된다. 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 서열 동일성 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 의미한다.
본원에 개시된 핵산 조절 요소와 관련하여 본 출원에서 사용된 용어 "기능성 단편"은 근육 특이적 발현을 조절하는 능력을 보유하는, 즉 여전히 조직 특이성을 부여할 수 있고 (비록 같은 정도로는 아닐지라도) 유전자가 이들이 유래된 서열과 동일한 방식으로 (이식)유전자의 발현을 조절할 수 있는 상기 조절 요소 서열의 단편을 지칭한다. 기능성 단편은 바람직하게는 이들이 유래된 서열로부터 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 120개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개 또는 적어도 450개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 또한 바람직하게는, 기능성 단편은 유래된 서열에 존재하는 전사 인자 결합 부위(TFBS)를 적어도 1개, 보다 바람직하게는 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 보다 보다 바람직하게는 적어도 5개, 적어도 10개, 또는 적어도 15개 포함할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은 기능성 단편은 바람직하게는 이들이 유래된 조절 요소의 핵산 조절 능력의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 약 100%를 갖는다.
본원에서 "심장과 골격근 특이적 조절 요소" 또는 "심장 및 골격근 특이적 조절 요소"는 심장 및 골격근 특이적 발현을 향상시킬 수 있는 조절 요소를 지칭한다. 심장 및 골격근 특이적 조절 요소의 비제한적인 예는 WO 2015/110449에서 "CSk-SH"로 나타낸 조절 요소이다. 특히, 서열 번호 1과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편이 본원에서 사용된다. 실시양태에서, 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호 1과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열(본원에서 "CSk-SH5" 또는 "CSkSH5" 또는 "Csk-SH5" 또는 "CskSH5" 또는 "CSK-SH5" 또는 "CSKSH5"로도 표시됨)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소가 사용된다.
본원에서 사용된 "심장 및 골격근 특이적 발현"은 심장, 특히 심근 및 골격근에서 (이식)유전자의 우선적 또는 우세한 발현을 지칭한다. (이식)유전자 발현의 적어도 50%, 보다 특히 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 심장 및 골격근 내에서 발생할 수 있다. (이식)유전자 발현의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 심지어 1% 미만이 심장과 골격근 이외의 기관이나 조직에서 발생할 수 있다. 본 출원 전반에 걸쳐, 심장 및 골격근 특이적이 발현과 관련하여 언급되는 경우, 심근세포 및 골격근 세포 특이적 발현, 심장 근모세포 및 골격 근모세포 특이적 발현 또는 심장 및 근육 줄기/전구 세포 또는 위성 세포 특이적 발현이 또한 명시적으로 구상된다.
본원에서 사용된 용어 "심장 근육" 또는 "심근"은 심장에서 발견되는 자율적으로 조절되는 횡문근 유형을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "골격근"은 골격에 부착되어 자발적으로 조절되는 횡문근 유형을 의미한다. 골격근의 비제한적인 예는 이두근, 삼두근, 사두근, 내부 경골, 및 비복근을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "근세포"는 적절한 조건하에서 근육 특이적 표현형을 발현할 수 있도록 근육 전구 줄기/전구 세포, 위성 세포 또는 근모세포로부터 분화된 세포를 지칭한다. 말단 분화된 근세포는 서로 융합하여 근섬유의 주요 구성요소인 근관을 형성한다. "근세포"라는 용어는 또한 탈분화된 근세포를 의미한다. 상기 용어는 생체내 세포 및 세포의 1차 또는 계대배양 여부에 관계없이 생체외에서 배양된 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "근육 줄기/전구 세포", "위성 세포" 또는 "근모세포"는 분화하여 근육 세포 또는 근세포를 생성하는 중배엽의 배아 세포를 지칭한다. 상기 용어는 생체내 세포 및 세포의 1차 또는 계대배양 여부에 관계없이 생체외에서 배양된 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 "횡격막 특이적 조절 요소"는 횡격막 및 골격근 특이적 발현을 향상시킬 수 있는 조절 요소를 지칭한다. 횡격막 특이적 조절 요소의 비제한적인 예는 WO 2018/178067에서 Dph-CRE01 내지 Dph-CRE065로 나타낸 조절 요소이다. 특히, 서열 번호 2와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 서열 번호 3과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 및/또는 서열 번호 4와 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편이 본원에서 사용된다. 실시양태에서, 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 2와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소는 본원에서 "Dph-CRE02" 또는 "CRE-02" 또는 "CRE02"로도 표시되고; 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 3과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소는 본원에서 Dph-CRE04" 또는 "CRE-04" 또는 "CRE04로도 표시되고/거나; 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 4와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소는 본원에서 "Dph-CRE06" 또는 "CRE-06" 또는 "CRE06로도 표시된다.
| 서열 | 명칭 | 크기 (bp) |
존재하는 보존된 TFBS |
| 서열 번호 2 | Dph-CRE02 | 452 | EZH2, SUZ12, TBP, FOLR2A, REST TEAD4, RBBP5, Msx-1, SRF, SIN3A |
| 서열 번호 3 | Dph-CRE04 | 509 | JUND ZZZ3, AREB6, RSRFC4, MEF2A, TBP |
| 서열 번호 4 | Dph-CRE06 | 400 | E2F, ITF2, Tal-1베타, TBP, ER-알파, PPAR-감마1, PPAR-감마-2 |
| 서열 번호 1 | CSk-SH5 | 454 | HNF4, NF1, RSRFC4, CEBP, LRF, MyoD, FOLR2A, MYBL2, HNF4G, FOXA1, HNF4A, FOXA2, MEF2A, TAF7, SIN3A, CEBPB, MAX, ZBTB7 |
실시양태에서, 횡격막 특이적 조절 요소는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 2(Dph-CRE02)와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편; 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 3(Dph-CRE04)과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소; 및 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 4(Dph-CRE06)와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 두 횡격막 특이적 조절 요소의 조합이다. 보다 특히, 서열 번호 5에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 5(Dph-CRE02-CRE04)와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소; 서열 번호 6에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 6(Dph-CRE02-CRE06)과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소; 서열 번호 7에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 7(Dph-CRE04-CRE06)과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소; 서열 번호 8에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 8(Dph-CRE06-CRE04)과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소; 또는 서열 번호 9에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 9(Dph-CRE02-CRE04-CRE06)와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소가 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 "횡격막 및 골격근 특이적 발현"은 다른(즉, 비-횡격막 및 골격근) 세포 또는 조직과 비교하여 횡격막 및/또는 골격근 세포 또는 횡격막 및/또는 골격근 조직에서 (RNA 및/또는 폴리펩티드로서) (이식)유전자의 우선적 또는 우세한 발현을 지칭한다. (이식)유전자 발현의 적어도 50%, 보다 특히 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 횡격막 및/또는 골격근 세포 또는 조직 내에서 발생할 수 있다. 횡격막 및 골격근 특이적 발현은 폐, 간, 뇌, 신장 및/또는 비장과 같은 횡격막 및 골격근 이외의 다른 기관 또는 조직으로 발현된 유전자 산물의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 심지어 1% 미만의 '누출'을 수반할 수 있다.
본원에서 사용된 "근육 특이적 발현"은 다른(즉, 비-근육) 세포 또는 조직과 비교하여 근육 세포에서 (RNA 및/또는 폴리펩티드로서) (이식)유전자의 우선적 또는 우세한 발현을 지칭한다. (이식)유전자 발현의 적어도 50%, 보다 특히 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 근육 세포 또는 조직 내에서 발생할 수 있다. 근육 특이적 발현은 폐, 간, 뇌, 신장 및/또는 비장과 같은 횡격막 및 골격근 이외의 다른 기관 또는 조직으로 발현된 유전자 산물의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 심지어 1% 미만의 '누출'을 수반할 수 있다.
본 출원에서 사용된 "평활근 특이적 발현"은 다른(즉, 비-평활근)세포 또는 조직과 비교하여 평활근 세포 및 조직에서 (RNA 및/또는 폴리펩티드로서) (이식)유전자의 우선적 또는 우세한 발현을 의미한다. 특정 실시양태에 따르면, (이식)유전자 발현의 적어도 50%, 보다 특히 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 평활근 세포 또는 조직 내에서 발생한다. 특정 실시양태에 따르면, 평활근 특이적 발현은 평활근 이외의 다른 기관이나 조직으로 발현된 유전자 산물의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 심지어 1% 미만의 '누출'을 수반할 수 있다.
본 발명의 핵산 조절 요소는 본원에 개시된 2개 이상의 횡격막 특이적 조절 요소와 본원에 개시된 심장 및 골격근 특이적 조절 요소를 조합함으로써 인공 서열을 포함한다. 실험 섹션에 나타낸 바와 같이, 본원에 개시된 2개의 횡경막 특이적 조절 요소와 본원에 개시된 심장 및 골격근 특이적 조절 요소의 조합은 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근, 특히 횡격막, 심장 및 골격근에서 강력한 이식유전자 발현을 유도하였다. 보다 특히, 2개의 횡격막 특이적 조절 요소와 심장 및 골격근 특이적 조절 요소는 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 이식유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 이식유전자 발현을 향상시키기 위한 새로운 조절 요소로서 상승적으로 작용한다. 이 조합에 본원에 개시된 제3 횡격막 특이적 조절 요소의 추가는 횡격막, 심장, 평활근 및 골격근 특이적 이식유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 이식유전자 발현을 상승적인 방식으로 한층 더 증가시킬 수 있음이 추가로 밝혀졌다.
본원에서 사용된 "횡격막, 심장, 평활근 및 골격근 특이적 발현"은 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 세포 또는 조직에서 (이식)유전자의 우선적 또는 우세한 발현을 지칭한다. 특정 실시양태에 따르면, (이식)유전자 발현의 적어도 50%, 보다 특히 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 세포 및 조직 내에서 발생한다. 따라서, 특정 실시양태에 따르면, 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 이외의 기관 또는 조직에서 (이식)유전자 발현은 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 심지어 1% 미만으로 발생한다.
본원에서 사용된 "횡격막, 심장 및 골격근 특이적 발현"은 횡격막, 심장 및/또는 골격근 세포 또는 조직에서 (이식)유전자의 우선적 또는 우세한 발현을 지칭한다. 특정 실시양태에 따르면, (이식)유전자 발현의 적어도 50%, 보다 특히 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 횡격막, 심장 및/또는 골격근 세포 및 조직 내에서 발생한다. 따라서, 특정 실시양태에 따르면, 횡격막, 심장 및 골격근 이외의 기관 또는 조직에서 (이식)유전자 발현은 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 심지어 1% 미만으로 발생한다.
실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편, 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진, 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편, 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진, 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편, 바람직하게는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함한다.
실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진, 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진, 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편, 바람직하게는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함한다.
실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진, 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편, 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편; 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진, 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편, 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함한다.
적어도 2개의 횡경막 특이적 조절 요소 및 심장 및 골격근 특이적 조절 요소는 본원에 개시된 핵산 조절 요소에서 임의의 순서로 조합될 수 있다. 적어도 2개의 횡격막 특이적 조절 요소와 심장 및 골격근 특이적 조절 요소는 나란히(in tandem) 결합될 수 있거나, 조절 요소는 하나 이상의 조절 요소 사이에 하나 이상의 개입 또는 플랭킹 뉴클레오티드(예를 들어, 클로닝 목적으로 사용되는 뉴클레오티드)와 결합될 수 있다.
실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 5에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02-CRE04)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 5에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함한다.
실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 6에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02-CRE06)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 6에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함한다.
실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 7에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04-CRE06)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 7에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 9에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02-CRE04-CRE06)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 9에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02-CRE04-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다.
실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 8에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06-CRE04)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 8에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 근육 특이적 유전자 발현, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 10에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 11에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 12에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 다른 특정 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 13에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06 - Dph-CRE04 - CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 바람직하게는 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소, 또는 이의 기능성 단편을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 조절 요소는 서열 번호 14에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
본원에 개시된 핵산 조절 요소는 핵산 발현 카세트에 사용될 수 있다. 따라서, 일 측면에서 본 발명은 핵산 발현 카세트에서 본원에 기재된 바와 같은 핵산 조절 요소의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 바와 같은 핵산 조절 요소를 포함하는 핵산 발현 카세트를 제공한다. 실시양태에서, 핵산 발현 카세트는 이식유전자를 포함하지 않는다. 이러한 핵산 발현 카세트는 내인성 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산 발현 카세트는 프로모터 및 이식유전자에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 바와 같은 핵산 조절 요소를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 '핵산 발현 카세트'는 하나 이상의 원하는 세포 유형, 조직 또는 기관에서 (이식)유전자 발현을 지시하는 하나 이상의 전사 조절 요소(프로모터, 인핸서 및/또는 조절 요소, 폴리아데닐화 서열 및 인트론을 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않음)를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 전형적으로, 핵산 발현 카세트는 핵산 카세트가 삽입되는 세포에서 내인성 유전자의 발현을 지시하는 것으로 예상되지만, 이식유전자를 또한 함유할 것이다.
본원에서 사용된 용어 '작동가능하게 연결된'은 요소들이 기능적으로 연결되어 서로 상호작용할 수 있도록 다양한 핵산 분자 요소의 상호 배열을 지칭한다. 이러한 요소는 프로모터, 인핸서 및/또는 조절 요소, 폴리아데닐화 서열, 하나 이상의 인트론 및/또는 엑손, 및 발현될 관심 유전자(즉, 이식유전자)의 코딩 서열을 제한 없이 포함할 수 있다. 핵산 서열 요소는 적절하게 배향되거나 작동가능하게 연결되면 함께 작용하여 서로의 활성을 조절하고 궁극적으로 이식유전자의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 조절한다는 것은 특정 요소의 활성 수준을 증가, 감소 또는 유지하는 것을 의미한다. 다른 요소에 대한 각 요소의 위치는 각 요소의 5' 말단 및 3' 말단에 관해 표현될 수 있으며, 임의의 특정 요소 사이의 거리는 요소 사이에 있는 개재 뉴클레오티드 또는 염기쌍의 수로 언급될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 작동가능하게 연결된 것은 기능적 활성을 의미하며, 반드시 자연적인 위치 연결과 관련되는 것은 아니다. 실제로, 핵산 발현 카세트에 사용되는 경우, 조절 요소는 전형적으로 프로모터의 바로 상류에 위치할 것이나(이것은 일반적인 경우이지만 절대로 핵산 발현 카세트 내 위치의 제한 또는 배제로 해석되어서는 안 된다), 생체내의 경우일 필요는 없다. 예를 들어, 전사가 영향을 미치는 유전자의 하류에서 자연적으로 발생하는 조절 요소 서열은 프로모터의 상류에 위치하였을 때 동일한 방식으로 기능할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에 따르면, 조절 요소의 조절 또는 강화 효과는 위치 독립적이다.
본 출원에서 사용되는 용어 '프로모터'는 작동가능하게 연결된 상응하는 핵산 코딩 서열(예를 들어, 이식유전자 또는 내인성 유전자)의 전사를 직접 또는 간접적으로 조절하는 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터는 단독으로 기능하여 전사를 조절하거나, 하나 이상의 다른 조절 서열(예를 들어, 인핸서 또는 사일런서, 또는 조절 요소)과 함께 작용할 수 있다. 본 출원의 맥락에서, 프로모터는 전형적으로 (이식)유전자의 전사를 조절하기 위해 본원에 개시된 바와 같은 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 본원에 기재된 바와 같은 조절 요소가 프로모터 및 이식유전자 둘 모두에 작동가능하게 연결된 경우, 조절 요소는 (1) 생체내에서(및/또는 시험관내에서 근모세포, 근세포 또는 근육 유래 세포주, 특히 심장 및 골격 근모세포, 심장 및 골격 근세포, 또는 심장 및 골격근 유래 세포주에서) 이식유전자의 상당한 정도의 근육 특이적, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 발현을 부여할 수 있고/거나, (2) 근육, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근에서(및/또는 시험관내에서 근모세포, 근세포 또는 근육 유래 세포주, 특히 평활, 심장 및 골격 근모세포, 평활, 심장 및 골격 근세포, 또는 시험관내에서 평활, 심장 및 골격근 유래 세포주, 보다 특히 시험관내에서 골격 근모세포, 심장 및 골격 근세포, 또는 심장 및 골격근 유래 세포주에서) 이식유전자의 발현 수준을 증가시킬 수 있다.
프로모터는 상동성(즉, 핵산 발현 카세트로 형질감염되는 동물, 특히 포유동물과 동일한 종에서 유래) 또는 이종성(즉, 핵산 발현 카세트로 형질감염되는 동물, 특히 포유동물 종 이외의 공급원에서 유래)일 수 있다. 이와 같이, 프로모터의 공급원은 임의의 바이러스(예를 들어, CMV 또는 거대세포바이러스), 임의의 단세포 원핵 또는 진핵 유기체, 임의의 척추동물 또는 무척추동물 유기체, 또는 임의의 식물일 수 있거나, 심지어 합성 프로모터(즉, 비천연적으로 발생하는 서열)일 수 있지만, 단, 프로모터는 본원에 기술된 조절 요소와 조합하여 기능적이어야 한다. 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 포유동물 프로모터, 특히 뮤린 또는 인간 프로모터이다.
프로모터는 유도성 또는 구성적 프로모터일 수 있다.
본원에 개시된 핵산 조절 요소에서 근육 특이적 TFBS의 풍부성은 원칙적으로 조절 요소가 그 자체는 근육 특이적이지 않은 프로모터(예를 들어, CAG 프로모터, CMV 프로모터)로부터도 근육 특이적 발현을 지시하도록 허용한다. 따라서, 본원에 개시된 조절 요소는 임의의 프로모터와 함께 핵산 발현 카세트에서 사용될 수 있으며, 특히 프로모터는 조직 특이적, 예를 들어 근육 특이적이거나 편재하여(ubiquitously) 발현될 수 있다. 편재하여 발현되는 프로모터의 비제한적인 예는 폴리머라제 II(pol II) 프로모터, 폴리머라제 III(pol III) 프로모터(예를 들어, U6) 및 키메라 pol III 프로모터를 포함한다. 이들 프로모터는 예를 들어 비-코딩 RNA를 발현하는데 적합할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 핵산 발현 카세트는 근육 특이성, 특히 횡격막, 평활근, 심장, 및/또는 골격근 특이성, 보다 특히 횡격막, 심장 및/또는 골격근 특이성을 증가시키고/거나, 다른 조직에서의 발현 누출을 감소시키기 위해 근육 특이적 프로모터, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 특이적 프로모터, 보다 특히 횡격막, 심장 및/또는 골격근 특이적 프로모터를 포함한다.
근육 특이적 프로모터의 비제한적인 예는 데스민(DES) 프로모터; 합성 SPc5-12 프로모터(SPc5-12); 알파-액틴1 프로모터(ACTA1); 크레아틴 키나제, 근육(CKM) 프로모터; 4.5개의 LIM 도메인 단백질 1(FHL1) 프로모터; 알파 2 액티닌(ACTN2) 프로모터; 필라민-C(FLNC) 프로모터; 근형질/소포체 칼슘 ATPase 1(ATP2A1) 프로모터; 트로포닌 I 유형 1(TNNI1) 프로모터; 트로포닌 I 유형 2(TNNI2) 프로모터; 트로포닌 T 유형 1(TNNT1) 프로모터; 트로포닌 T 유형 2(TNNT2) 프로모터; 트로포닌 T 3형(TNNT3) 프로모터; 미오신-1(MYH1) 프로모터; 미오신-2(MYH2) 프로모터; 사르코리핀(SLN) 프로모터; 미오신 결합 단백질 C1(MYBPC1) 프로모터; 에놀라제(EN03) 프로모터; 탄산 탈수효소 3(CA3) 프로모터; 인산화 가능한 속 골격근 미오신 경쇄(MYLPF) 프로모터; 트로포미오신 1(TPM1) 프로모터; 트로포미오신 2(TPM2) 프로모터; 알파-3 사슬 트로포미오신(TPM3) 프로모터; 안키린 반복 도메인-함유 단백질 2(ANKRD2) 프로모터; 미오신 중쇄(MHC) 프로모터; 알파 미오신 중쇄 프로모터(αMHC) 프로모터; 미오신 경쇄(MLC) 프로모터; 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터; 미오신, 경쇄 1(MYL1) 프로모터; 미오신, 경쇄 2(MYL2) 프로모터; 미오글로빈(MB) 프로모터; 트로포닌 C 유형 1(TNNC1) 프로모터; 트로포닌 C 유형 2(TNNC2) 프로모터; 티틴-캡(TCAP) 프로모터; 미오신, 중쇄 7(MYH7) 프로모터; 알돌라제 A(ALDOA) 프로모터; 미오신 중쇄 11(Myh11) 프로모터; 트랜스젤린(Tagln) 프로모터(SM22α 프로모터로도 알려짐); 액틴 알파 2, 평활근(Acta2) 프로모터; Li et al. (1999, Nat Biotechnol. 17:241-245)에 기술된 합성 촉진제, 예컨대 Wang et al. (2008, Gene Ther, 15:1489-1499)에 기재된 바와 같이 MCK 기본 프로모터에 대한 MCK 인핸서의 이중 또는 삼중 탠덤으로 각각 구성된 SPc5-12 프로모터, dMCK 프로모터 및 tMCK 프로모터, 및 MHCK7 프로모터를 포함한다. MHCK7 프로모터는 합성 골격 및 심장 근육 특이적 프로모터이고, Salva et al. (2007. Mol Ther 15: 320-9)에 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 SPc5-12 프로모터, DES 프로모터 및 MHCK7 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 근육 특이적 프로모터이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 포유동물 근육 특이적 프로모터, 특히 뮤린 또는 인간 근육 특이적 프로모터이다.
실시양태에서, 프로모터는 합성 SPc5-12 프로모터이다. SPc5-12 프로모터는 합성 근육 특이적 프로모터이며 Li et al. (1999. Nat Biotechnol. 17:241-245)에 기재되어 있다. 실시양태에서, 프로모터는 서열 번호 15에 의해 정의된 바와 같은 SPc5-12 프로모터이다. 실시양태에서, 프로모터는 MHCK7 프로모터, 바람직하게는 서열 번호 56에 의해 정의된 바와 같은 MHCK7 프로모터이다. 실시양태에서, 프로모터는 데스민 프로모터, 바람직하게는 서열 번호 57에 의해 정의된 바와 같은 데스민 프로모터이다.
또한, 프로모터는 핵산 발현 카세트에서 이식유전자의 프로모터일 필요는 없다하더라도, 이식유전자가 그 자신의 프로모터로부터 전사되는 것이 가능하다.
핵산 발현 카세트의 길이를 최소화하기 위해, 조절 요소는 최소 프로모터, 또는 본원에 기재된 프로모터의 단축 버전에 연결될 수 있다. 본원에서 사용된 '최소 프로모터'(기본 프로모터 또는 코어 프로모터로도 지칭됨)는 여전히 발현을 유도할 수 있지만 (예를 들어, 조직 특이적) 발현 조절에 기여하는 서열의 적어도 일부가 결여된 실크기(full-size) 프로모터의 일부이다. 이 정의는 유전자 발현을 유도할 수 있지만 조직 특이적 방식으로 해당 유전자를 발현하는 능력을 상실한 (조직 특이적) 조절 요소가 결실된 프로모터와, 유전자 발현을 유도할 수 있지만(감소될 가능성이 있음) 조직 특이적 방식으로 해당 유전자를 발현하는 능력을 반드시 상실하지는 않은 (조직 특이적) 조절 요소가 결실된 프로모터를 모두 포괄한다.
본원에서 사용된 용어 '이식유전자'는 핵산 서열이 도입된 세포에서 발현되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부를 인코딩하는 특정 핵산 서열을 지칭한다. 그러나, 전형적으로 핵산 서열이 삽입되는 세포에서 특정 폴리펩티드의 양을 조절하기 위해(예를 들어, 더 낮추기 위해) 이식유전자가 RNA로 발현되는 것도 가능하다. 이러한 RNA 분자에는 RNA 간섭(shRNA, RNAi), 마이크로 RNA 조절(miR)(특이적 유전자의 발현을 제어하는 데 사용할 수 있음), 비코딩 RNA(ncRNA), 긴 비코딩 RNA(lncRNA), 가이드 RNA(gRNA), 촉매 RNA, 안티센스 RNA, RNA 앱타머 등을 통해 기능을 발휘하는 분자가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 핵산 서열이 세포 내로 도입되는 방법은 본 발명에 필수적이지 않으며, 예를 들어 게놈에 또는 에피좀 플라스미드로서의 통합을 통해 일어날 수 있다. 참고로, 이식유전자의 발현은 핵산 서열이 도입된 세포의 부분집합으로 제한될 수 있다. 용어 '이식유전자'는 (1) 세포에서 자연적으로 발견되지 않는 핵산 서열(즉, 이종 핵산 서열); (2) 도입된 세포에서 자연적으로 발견되는 핵산 서열의 돌연변이 형태인 핵산 서열; (3) 도입된 세포에서 자연적으로 발생하는 동일(즉, 상동성) 또는 유사한 핵산 서열의 추가 카피를 추가하는 역할을 하는 핵산 서열; 또는 (4) 도입된 세포에서 발현이 유도되는 침묵의 자연 발생적이거나 상동성인 핵산 서열을 포함하도록 의도된다.
이식유전자는 프로모터(및/또는 이것이 도입된 동물, 특히 포유동물, 예를 들어 핵산 발현 카세트가 유전자 치료에 사용되는 경우)에 상동성 또는 이종성일 수 있다.
이식유전자는 전장 cDNA 또는 게놈 DNA 서열, 또는 적어도 일부 생물학적 활성을 갖는 이의 임의의 단편, 서브유닛 또는 돌연변이체일 수 있다. 특히, 이식유전자는 미니유전자, 즉 이의 인트론 서열의 일부, 대부분 또는 전부가 결여된 유전자 서열일 수 있다. 따라서, 이식유전자는 선택적으로 인트론 서열을 함유할 수 있다. 선택적으로, 이식유전자는 하이브리드 핵산 서열, 즉 상동 및/또는 이종 cDNA 및/또는 게놈 DNA 단편으로부터 작제된 것일 수 있다. '돌연변이 형태'는 야생형 또는 자연 발생 서열과 상이한 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 핵산 서열을 의미하며, 즉 돌연변이 핵산 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 삽입은 아미노산/핵산 서열이 야생형 아미노산/핵산 서열과 상이한 유전자 산물(즉, 단백질 또는 핵산)을 생성할 수 있다. 이러한 돌연변이체의 제조는 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 경우에, 이식유전자는 또한 이식유전자 산물이 세포로부터 분비되도록 리더 펩티드 또는 신호 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 이식유전자는 코돈 최적화된다. 본원에서 사용된 용어 "코돈-최적화", "코돈-최적화된" 등은 예를 들어 숙주 세포 또는 유기체에서 최적의 발현을 위해 아미노산 서열의 변경없이 핵산 서열, 특히 이식유전자의 코돈 조성이 변화된 것을 지칭한다. 실험 섹션에 나타낸 바와 같이, 이식유전자의 코돈 최적화는 이식유전자의 근육 특이적, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 특이적, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 특이적 발현을 추가로 향상시킬 수 있다.
본원에 기술된 핵산 발현 카세트에 포함될 수 있는 이식유전자는 전형적으로 RNA 또는 폴리펩티드(단백질)와 같은 유전자 산물을 인코딩한다. 이식유전자는 또한 Cas 및/또는 하나 이상의 gRNA와 같은 CRISPR/Cas 시스템의 구성원을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 이식유전자는 치료 단백질을 인코딩한다.
치료 단백질은 분비성 단백질 또는 비분비성 단백질일 수 있다. 분비성 단백질, 특히 분비성 치료 단백질의 비제한적인 예는 응고 인자, 예를 들어 인자 VIII 또는 인자 IX, 인슐린, 에리트로포이에틴, 지단백질 리파제, 항체 또는 나노바디, 성장 인자, 혈관신생 인자, 사이토카인, 케모카인, 혈장 인자 등을 포함한다. 비-분비 단백질의 비제한적 예는 대사 효소(예를 들어, 타파진), 리소좀 단백질, 핵 단백질 등을 포함한다. 치료 단백질은 또한 구조 단백질일 수 있다. 구조 단백질, 특히 구조 치료 단백질의 비제한적인 예는 디스트로핀 및 사르코글리칸을 포함한다.
본 출원에서 구상되는 이식유전자의 포괄적이지 않고 비제한적인 목록은 치료적 혈관신생을 위한 혈관신생 인자(예를 들어, VEGF, PlGF, 또는 에프린, 세마포린, 슬릿(Slit) 및 네트린 또는 이들의 동족 수용체와 같은 안내 분자)를 인코딩하는 이식유전자; 응고 인자(예를 들어, 인자 VIII 또는 인자 IX)를 인코딩하는 이식유전자, 인슐린을 인코딩하는 이식유전자, 지단백질 리파제를 인코딩하는 이식유전자, 혈장 인자를 인코딩하는 이식유전자, 사이토카인, 케모카인 및/또는 성장 인자(예를 들어, 에리트로포이에틴(EPO), 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터루킨 1(IL-1), 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 3(IL-3), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 5(IL-5), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 7(IL-7), 인터루킨 8(IL-8), 인터루킨 9(IL-9), 인터루킨 10(IL-10), 인터루킨 11(IL-11), 인터루킨 12(IL-12), 케모카인(CXC 모티브) 리간드 5(CXCL5), 과립구-집락 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 줄기세포 인자(SCF)), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 단핵구 화학유인 단백질-1(MCP-1) 및 종양 괴사 인자(TNF))를 인코딩하는 이식유전자; 칼슘 처리에 관여하는 단백질을 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 사르코/소포체 Ca2+-ATPase(SERCA), 포스포람반, 칼세퀘스트린, 나트륨-칼슘 교환체, L-형 칼슘 채널, 리아노딘 수용체), 칼시뉴린을 인코딩하는 이식유전자; 마이크로디스트로핀을 인코딩하는 이식유전자; 폴리스타틴(FST)을 인코딩하는 이식유전자; 마이토튜불린(myotubularin) 1(MTM1)을 인코딩하는 이식유전자; 디스페린을 암호화하는 이식유전자; 디스트로핀을 인코딩하는 이식유전자; 대사 효소를 인코딩하는 이식유전자: 핵 단백질을 인코딩하는 이식유전자; 미토콘드리아 단백질(예를 들어, 타파진)을 암호화하는 이식유전자; 리소좀 단백질(예를 들어, 산 α-글루코시다제(GAA)(분비 또는 천연 형태로서), 알파-갈락토시다제 A, LAMP2)을 인코딩하는 이식유전자; 이온 채널(예를 들어, SCN5A)을 인코딩하는 이식유전자; 글리코겐 대사에 관여하는 효소(예를 들어, 글리코겐 합성효소(GYS2), 글리코겐 탈분지 효소(AGL), 글리코겐 분지 효소(GBE1), 근육 글리코겐 인산화효소(PYGM), 근육 포스포프럭토키나제(PKFM), 포스포글리세레이트 뮤타제(PGAM2), 알돌라제 A(ALDOA), β-에놀라제(ENO3) 또는 글리코제닌-1(GYG1))를 인코딩하는 이식유전자; 점액다당류증의 결핍 효소(예를 들어, α-L-이두로니다제, 이두로네이트 설파타제, 헤파란 설파미다제, N-아세틸글루코사미니다제, 헤파란-α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민 6-설파타제, 갈락토스-6-설파타제, β-갈락토시다제, N-아세틸갈락토사민-4-설파타제, β-글루쿠로니다제 또는 히알루로니다제)를 인코딩하는 이식유전자; 사르코글리칸(예를 들어, 알파-사르코글리칸, 베타-사르코글리칸 및 감마-사르코글리칸)을 인코딩하는 이식유전자; 아녹타민 5를 인코딩하는 이식유전자; 칼페인 3을 인코딩하는 이식유전자; 항체를 인코딩하는 이식유전자, 나노바디를 인코딩하는 이식유전자, 항바이러스 우세-음성 단백질을 인코딩하는 이식유전자; 및 이들의 이식유전자 단편, 서브유닛 또는 돌연변이체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 이식유전자는 사르코글리칸, 바람직하게는 β-사르코글리칸, 보다 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸, 예컨대 서열 번호 18에 의해 정의된 이식유전자를 인코딩한다. 추가 실시양태에서, 인간 β-사르코글리칸을 코딩하는 이식 유전자는 서열 번호 19에 의해 정의된 이식유전자와 같이 코돈 최적화된다.
특정 실시양태에서, 이식유전자는 리소좀 단백질을 인코딩하고, 바람직하게 이식유전자는 산 α-글루코시다제(GAA)(예를 들어, 분비 또는 천연 형태로서의 GAA), 알파-갈락토시다제 A 및 LAMP2로 이루어진 군으로부터 선택된 리소좀 단백질을 인코딩한다. 추가의 특정 실시양태에서, 이식유전자는 산 α-글루코시다제(GAA), 바람직하게는 서열 번호 58에 의해 정의된 이식유전자와 같이 인간 GAA를 인코딩한다. 추가 실시양태에서, 인간 GAA를 인코딩하는 이식유전자는 서열 번호 59에 의해 정의된 이식유전자와 같이 코돈-최적화된다. 이식유전자는 또한 리포터 유전자일 수 있으며, 즉 이식유전자는 루시퍼라제 효소와 같은 리포터를 인코딩한다. 특정 실시양태에서, 이식유전자는 루시퍼라제를 코딩하고, 예를 들어 이식유전자는 서열 번호 20에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
이식유전자는 또한 면역원성 단백질을 인코딩할 수 있다. 면역원성 단백질의 비제한적인 예는 병원체로부터 유래된 항원 및 에피토프를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "면역원성"은 면역 반응을 유발할 수 있는 물질 또는 조성물을 지칭한다.
전형적으로 이식유전자 산물(예를 들어, 인트론 및/또는 폴리아데닐화 서열)의 발현을 추가로 증가시키거나 안정화시키기 위해 다른 서열이 또한 본원에 개시된 핵산 발현 카세트에 포함될 수 있다.
임의의 인트론이 본원에 기재된 발현 카세트에서 이용될 수 있다. "인트론"이라는 용어는 핵 스플라이싱 장치에 의해 인식되고 스팔라이싱될 만큼 충분히 큰 전체 인트론의 임의의 부분을 포함한다. 전형적으로, 발현 카세트의 구성 및 조작을 용이하게 하는 발현 카세트의 크기를 가능한 작게 유지하기 위해 짧고 기능적인 인트론 서열이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 인트론은 발현 카세트 내의 코딩 서열에 의해 인코딩되는 단백질을 인코딩하는 유전자로부터 수득된다. 인트론은 코딩 서열에 대해 5', 코딩 서열에 대해 3', 또는 코딩 서열 내에 위치할 수 있다. 인트론 5'를 코딩 서열에 위치시키는 것의 이점은 인트론이 폴리아데닐화 신호의 기능을 간섭할 가능성을 최소화한다는 것이다. 실시양태에서, 본원에 개시된 핵산 발현 카세트는 인트론을 추가로 포함한다. 적합한 인트론의 비제한적 예는 MVM(Minute Virus of Mice) 인트론, 베타-글로빈 인트론(betaIVS-II), 인자 IX(FIX) 인트론 A, 원숭이 바이러스 40(SV40) small-t 인트론 및 베타-액틴 인트론이다. 바람직하게는, 인트론은 MVM 인트론(서열 번호 16)이다.
polyA 꼬리의 합성을 지시하는 임의의 폴리아데닐화 신호가 본원에 기재된 발현 카세트에서 유용하며, 이들의 예는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예시적인 폴리아데닐화 신호는 유인원 바이러스 40(SV40) 후기 유전자, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 최소 토끼 β-글로빈(mRBG) 유전자 및 Levitt et al. (1989, Genes Dev 3:1019-1025)에 기술된 바와 같은 합성 polyA 부위(SPA)로부터 유래된 polyA 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 폴리아데닐화 신호는 서열 번호 17에 의해 정의된 폴리아데닐화 신호이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE04)로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편, 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE06)로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(CSk-SH5)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 심장- 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 핵산 조절 요소, 바람직하게는 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열 번호 12에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5), 및 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 코돈-최적화된 이식유전자)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 핵산 조절 요소을 포함하는 핵산 발현 카세트를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이식유전자는 코돈 최적화된다. 실시양태에서, 핵산 발현 카세트는 MVM 인트론을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 핵산 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 서열 번호 17에 의해 정의된 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편, 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE04)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편, 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE06)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편, 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(CSk-SH5)로 이루어진 심장- 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 핵산 조절 요소, 바람직하게는 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열 번호 14에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5), 및 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 코돈-최적화된 이식유전자)로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 핵산 조절 요소을 포함하는 핵산 발현 카세트를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이식유전자는 코돈 최적화된다. 실시양태에서, 핵산 발현 카세트는 MVM 인트론을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 핵산 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 서열 번호 17에 의해 정의된 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 핵산 조절 요소 및 핵산 발현 카세트는 그대로 사용될 수 있거나, 전형적으로 이들은 핵산 벡터의 일부일 수 있다. 따라서, 추가 측면은 벡터, 특히 핵산 벡터에서 본원에 기재된 바와 같은 핵산 조절 요소 또는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 발현 카세트의 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 핵산 조절 요소를 포함하는 벡터를 제공한다. 추가 실시양태에서, 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 핵산 발현 카세트를 포함한다.
본 출원에서 사용된 용어 '벡터'는 cDNA 분자(이에 제한되지 않음)와 같은 다른 핵산 분자가 삽입될 수 있는 핵산 분자(삽입 핵산 분자), 예를 들어 이중 가닥 DNA를 지칭한다. 벡터는 삽입 핵산 분자를 적절한 숙주 세포로 수송하는 데 사용된다. 벡터는 삽입 핵산 분자를 전사하고, 선택적으로 전사체를 폴리펩티드로 번역하는 데 필요한 요소를 포함할 수 있다. 삽입 핵산 분자는 숙주 세포로부터 유래될 수 있거나, 상이한 세포 또는 유기체로부터 유래될 수 있다. 일단 숙주 세포에 있으면, 벡터는 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 또는 동시에 복제할 수 있고, 벡터 및 이의 삽입된 핵산 분자의 여러 카피가 생성될 수 있다. 벡터는 에피좀 벡터일 수 있거나(즉, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되지 않음), 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다. 따라서, '벡터'라는 용어는 표적 세포로의 유전자 전달을 촉진하는 유전자 전달 매개체로 정의될 수도 있다. 이 정의에는 비바이러스 및 바이러스 벡터가 모두 포함된다. 비-바이러스 벡터는 양이온성 지질, 리포솜, 나노입자, PEG, PEI, 플라스미드 벡터(예를 들어, pUC 벡터, 블루스크립트 벡터(pBS) 및 pBR322 또는 박테리아 서열(미니서클)가 결여된 이의 유도체) 트랜스포존 기반 벡터(예를 들어, PiggyBac(PB) 벡터 또는 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty: SB) 벡터) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바이러스 벡터는 바이러스에서 유래하며 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 간염 바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 그러나, 반드시 그런 것은 아니지만, 바이러스 벡터는 복제에 필수적인 바이러스 유전자가 바이러스 벡터로부터 제거되어 주어진 세포에서 증식하는 능력을 상실했기 때문에 복제-결핍이다. 그러나, 일부 바이러스 벡터는 또한 예를 들어 암 세포와 같은 주어진 세포에서 특이적으로 복제하도록 적응될 수 있으며, 전형적으로 (암) 세포 특이적 (종양)용해를 유발하는 데 사용된다. 바이로솜은 바이러스 및 비바이러스 요소를 모두 포함하는 벡터의 비제한적인 예이며, 특히 리포솜을 비활성화된 HIV 또는 인플루엔자 바이러스와 결합시킨다(Yamada et al., 2003). 또 다른 예는 양이온성 지질과 혼합된 바이러스 벡터를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 보다 바람직하게는 AAV 벡터이다. AAV 벡터는 바람직하게는 AAV 형질도입(즉, 단일 가닥에서 이중 가닥 AAV로의 변환)의 제한 단계 중 하나를 극복하기 위해 자가 상보적 이중 가닥 AAV 벡터(scAAV)로 사용되지만(McCarty, 2001, 2003; Nathwani et al., 2002, 2006, 2011; Wu et al., 2008), 단일 가닥 AAV 벡터(ssAAV)의 사용도 여기에 포함된다.
실시양태에서, 벡터는 AAV 혈청형 9(AAV9) 벡터, 보다 특히 자가-상보성 AAV9 벡터(scAAV9)이다. 실시양태에서, 벡터는 자가-상보성 AAV8 벡터(scAAV8) 또는 단일 가닥 AAV8 벡터(ssAAV8)와 같은 AAV 혈청형 8(AAV8) 벡터이다.
벡터는 AAV 캡시드가 벡터를 근육 세포에 특이적으로 지시하도록 조작된 AAV 벡터일 수 있다. 예를 들어, 벡터는 W et al. (Tulalamba W, et al. Distinct transduction of muscle tissue in mice after systemic delivery of AAVpo1 vectors. Gene Ther. (2019) https://doi.org/10.1038/s41434-019-0106-3)에 설명된 AAVpo1 벡터일 수 있다.
AAV 벡터 입자의 생산은 예를 들어 (Chahal et al. Production of adeno-associated virus (AAV) serotypes by transient transfection of HEK293 cell suspension cultures for gene delivery, Journal of Virological Methods. 196: 163-173 (2014); Grieger et al., Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Molecular Therapy. 24: 287-297 (2016); Blessing et al., Scalable Production of AAV Vectors in Orbitally Shaken HEK293 Cells. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 13: 14-26 (2019))에 기술된 바와 같이 현탁액-적합 포유동물 HEK293 세포의 일시적 형질감염, 또는 (Kotin et al. Manufacturing Clinical Grade Recombinant Adeno-Associated Virus Using Invertebrate Cell Lines. Human Gene Therapy. 28: 350-360 (2017))에 기술된 바와 같이 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)을 사용한 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf) 곤충 세포의 감염 후 정제 단계에 의해 달성될 수 있다. 정제는 (VandenDriessche et al., 2007)에 기술된 바와 같이 염화세슘(CsCl) 밀도 구배 초원심분리에 기초하거나, 크로마토그래피 기술 또는 컬럼을 사용하거나, 당업계에 공지된 면역친화성에 의할 수 있다. 벡터는 또한 비-바이러스 벡터, 바람직하게는 플라스미드, 미니서클, 또는 슬리핑 뷰티(SB) 기반 벡터 또는 piggyBac(PB) 기반 벡터와 같은 트랜스포존 기반 벡터일 수 있다.
벡터는 또한 바이러스 및 비-바이러스 요소를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 10에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - CSk-SH5)로 이루어진 핵산 조절 요소, 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터, MVM 인트론, 이식유전자, 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 서열 번호 17에 의해 정의된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식 유전자는 서열 번호 19에 제시된 이식유전자와 같이 코돈-최적화된다. 특정 실시양태에서, 상기 벡터는 서열 번호 26 또는 27을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 13에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE06 - Dph-CRE04 - CSk-SH5)로 이루어진 핵산 조절 요소, 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터, MVM 인트론, 이식유전자, 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 서열 번호 17에 의해 정의된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식 유전자는 서열 번호 19에 제시된 이식유전자와 같이 코돈-최적화된다. 특정 실시양태에서, 상기 벡터는 서열 번호 30 또는 31을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 11에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)로 이루어진 핵산 조절 요소, 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터, MVM 인트론, 이식유전자, 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 서열 번호 17에 의해 정의된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식 유전자는 서열 번호 19에 제시된 이식유전자와 같이 코돈-최적화된다. 특정 실시양태에서, 상기 벡터는 서열 번호 32 또는 33을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 12에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)로 이루어진 핵산 조절 요소, 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터, MVM 인트론, 이식유전자, 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 서열 번호 17에 의해 정의된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식 유전자는 서열 번호 19에 제시된 이식유전자와 같이 코돈-최적화된다. 특정 실시양태에서, 상기 벡터는 서열 번호 28 또는 29를 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 14에 제시된 뉴클레오티드 서열(Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)로 이루어진 핵산 조절 요소, 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터, MVM 인트론, 이식유전자, 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 서열 번호 17에 의해 정의된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식 유전자는 서열 번호 19에 제시된 이식유전자와 같이 코돈-최적화된다. 특정 실시양태에서, 상기 벡터는 서열 번호 34 또는 35를 갖는다.
본원에 개시된 핵산 발현 카세트 및 벡터는 예를 들어 근육에서 정상적으로 발현되고 활용되는 단백질(즉, 구조 단백질)을 발현하거나 근육에서 발현된 후 신체의 다른 부분으로 수송하기 위해 혈류로 내보내지는 단백질(즉, 분비성 단백질)을 발현하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 발현 카세트 및 벡터는 치료 목적, 특히 유전자 치료를 위한 치료량의 유전자 산물(예를 들어, 폴리펩티드, 특히 치료 단백질 또는 RNA)을 발현하는 데 사용될 수 있다. 원칙적으로 치료 목적을 위해 내인성 유전자의 발현을 증가시키는 것도 가능하지만 전형적으로 유전자 산물은 발현 카세트 또는 벡터 내의 이식유전자에 의해 인코딩된다. 대안적인 예에서, 본원에 개시된 발현 카세트 및 벡터는 백신 접종 목적을 위해 면역학적 양의 유전자 산물(예를 들어, 폴리펩티드, 특히 면역원성 단백질, 또는 RNA)을 발현하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 교시되는 핵산 발현 카세트 및 벡터는 약학적으로 허용되는 부형제, 즉 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 물질 및/또는 첨가제, 예를 들어 완충제, 담체, 부형제, 안정화제 등과 함께 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적 조성물은 키트 형태로 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용되는"은 당업계와 일치하며, 약학적 조성물의 다른 성분과 양립가능하고 이의 수용자에게 유해하지 않음을 의미한다.
따라서, 본 발명의 추가 측면은 본원에 기재된 핵산 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
이들 약학적 조성물의 제조를 위한 본원에 기재된 핵산 조절 요소 및 벡터의 용도가 또한 본원에 개시되어 있다.
예를 들어, 약학적 조성물은 백신일 수 있다. 백신은 면역 반응을 향상시키기 위한 하나 이상의 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 애쥬번트는 예를 들어 사포닌, 수산화알루미늄과 같은 미네랄 겔, 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, BCG(bacilli Calmette-Guerin), 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 및 합성 애쥬번트 QS-21을 제한없이 포함한다. 선택적으로, 백신은 하나 이상의 면역자극 분자를 추가로 포함할 수 있다. 면역자극 분자의 비제한적인 예는 면역자극, 면역강화 및 전염증 활성을 갖는 다양한 사이토카인, 림포카인 및 케모카인, 예컨대 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); 성장 인자(예를 들어, 과립구-대식세포(GM)-집락 자극 인자(CSF)); 및 기타 면역자극 분자, 예컨대 대식세포 염증 인자, Flt3 리간드, B7.1; B7.2 등을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 본원에 기재된 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "치료한다" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 지칭한다. 유익하거나 원하는 임상 결과에는 바람직하지 않은 임상 상태 또는 장애의 예방, 장애 발생률 감소, 장애와 관련된 증상 완화, 장애 정도의 감소, 장애의 안정화(즉, 악화되지 않는) 상태, 장애 진행의 지연 또는 서행, 장애 상태의 개선 또는 완화, 관해(부분적이든 전체적이든) - 검출 가능 여부에 관계없이 -, 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료적 치료" 또는 "요법" 등은 대상체의 신체 또는 그의 요소를 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애로부터 원하는 상태, 예컨대, 증상이 덜하거나 덜 불편한 상태(예를 들어, 증상의 완화, 상태의 개선 또는 완화), 또는 정상의 건강한 상태로의 복귀(예를 들어, 대상체의 건강, 신체적 완전성 및 신체적 웰빙 회복)로 하거나, 상기 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애에서 유지시키거나(예를 들어, 안정화 또는 악화되지 않음), 또는 상기 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애와 비교하여 더 심각하거나 더 나쁜 상태로의 진행을 예방하거나 늦추는 것이 목적인 치료를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "예방", "방지적 치료" 또는 "예방적 치료" 등은 질병 또는 장애의 발병을 예방하는 것을 포함하며, 이는 상기 질병 또는 장애를 앓기 전에 질병 또는 장애 또는 이와 관련된 증상의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 질병의 예방 또는 감소는 투여 시점에 질병 또는 장애의 명백한 증상을 앓고 있지 않은 환자에게 본원에 기재된 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 약학적 조성물의 투여를 지칭한다. "예방하는"은 또한 예를 들어 개선 기간 후에 질병 또는 장애의 재발 또는 도짐 방지를 예방하는 것을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 약학적 조성물은 유전자 치료, 특히 근육-지향적 유전자 치료, 특히 횡격막-, 평활근-, 심장- 및 골격근-지향적 유전자 치료, 보다 특히 횡격막-, 심장- 및 골격근-지향적 유전자 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다.
또한, 유전자 치료, 특히 근육-지향적 유전자 치료, 특히 근육-지향적 유전자 치료, 특히 횡격막-, 평활근-, 심장- 및 골격근-지향적 유전자 치료, 보다 특히 횡격막-, 심장- 및 골격근-지향적 유전자 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 약학적 조성물의 용도가 개시된다:
또한, 다음 단계를 포함하는, 유전자 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전자 치료, 특히 근육-지향적 유전자 치료, 특히 근육-지향적 유전자 치료, 특히 횡격막-, 평활근-, 심장- 및 골격근-지향적 유전자 치료, 보다 특히 횡격막-, 심장- 및 골격근-지향적 유전자 치료를 위한 방법이 개시된다:
- 대상체, 특히 대상체의 근육 조직 또는 세포, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 조직 또는 세포, 보다 특히 대상체의 횡격막, 심장 및/또는 골격근 조직 또는 세포에 본원에 기재된 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물의 도입 - 여기서 상기 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물은 프로모터 및 이식유전자에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 핵산 조절 요소를 포함함 -; 및
- 대상체, 특히 대상체의 근육 세포 또는 조직, 특히 횡격막, 평활근, 근육, 심장 및/또는 골격근 세포 또는 조직, 보다 특히 대상체의 횡격막, 심장 및/또는 골격근 세포 또는 조직에서 치료적 유효량의 이식유전자 산물의 발현.
이식유전자 산물은 폴리펩티드, 특히 구조 단백질, 예를 들어 디스트로핀 또는 사르코글리칸; 예컨대 응고 인자, 예를 들어 인자 IX 또는 인자 VIII, 사이토카인, 성장 인자, 항체 또는 나노바디, 케모카인, 혈장 인자, 인슐린, 에리트로포이에틴, 지단백질 리파제와 같은 분비성 단백질; 또는 핵 단백질, 대사 효소 또는 리소좀 단백질과 같은 비분비 단백질일 수 있다. 추가로, 이식유전자 산물의 비제한적 예는 이식유전자와 관련하여 위에서 개시되었으며, 제한없이 혈관신생 인자; 사이토카인 및/또는 성장 인자; 칼슘 처리에 관여하는 단백질; 리소좀 단백질; 이온 채널 항체, 나노바디, 항바이러스 우세-음성 단백질, 및 이들의 단편, 서브유닛 또는 돌연변이체; 및 효소(예를 들어, 글리코겐 대사에 관여하는 효소 및 점액다당류증에서의 결핍 효소)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이식유전자 산물은 사르코글리칸, 바람직하게는 β-사르코글리칸이다. 특정 실시양태에서, 이식유전자 산물은 리소좀 단백질, 바람직하게는 산 α-글루코시다제(GAA)(예를 들어, 분비 또는 천연 형태로서의 GAA), 알파-갈락토시다제 A 또는 LAMP2, 보다 바람직하게는 산 알파-글루코시다제(GAA)이다. 대안적으로, 이식유전자 산물은 siRNA 또는 비코딩 RNA(ncRNA)와 같은 RNA일 수 있다.
본원에 기재된 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 약학적 조성물을 사용한 유전자 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 예시적인 질병 및 장애는 다음을 포함한다:
- 글리코겐 저장 장애(예를 들어, 폼페병 글리코겐 저장 장애(GSD) 유형 II, 다농병, 글리코겐 저장 장애(GSD) 유형 IIb, GSD III 또는 GSD 3(코리병 또는 포브스병이라고도 함), GSD IV 또는 GSD4(안데르센병으로도 알려짐), GSD V 또는 GSD5(맥아들병으로도 알려짐), GSD VII 또는 GSD7(타루이병으로도 알려짐), GSD X 또는 GSD10, GSD XII 또는 GSD 12(알돌라제 A 결핍증으로도 알려짐), GSD XIII 또는 GSD13, GSD XV 또는 GSD15) 및 점액다당류증 장애(예를 들어, 헌터 증후군, 산필리포 증후군, 뮤코폴리사카리도스(mucopolyssacharidose: MPS) I, MPS II, MPS III, MPS IIIA, MPS IIIB, MPS IIIC, MPS IV, MPS VI, MPS VII, MPS IX)를 포함하는 리소좀 저장 질병(예를 들어, 파브리병);
- 미토콘드리아 장애(예를 들어, 바르트 증후군);
- 이온통로병증(예를 들어, 브루가다 증후군);
- 대사 장애;
- 근세관성 근병증(MTM);
- 근이영양증(예를 들어 뒤시엔느(Duchenne) 근이영양증(DMD), 베커(Becker) 근이영양증(BMD));
- 근긴장성 이영양증;
- 근긴장성 근이영양증(DM);
- 미요시 근병증;
- 선천성 후쿠야마형;
- 다스페리노퍼시;
- 신경근 질환;
- 운동 뉴런 질환(MND)(예를 들어, 샤르코-마리-투스 질환(CMT), 척수성 근위축증(SMA) 또는 근위축성 측삭 경화증(ALS));
- 에머리 드라이퍼스(Emery-Dreifuss) 근이영양증;
- 안면견갑상완 근이영양증(FSHD);
- 선천성 근이영양증;
- 선천성 근병증;
- 지대 근이영양증(예를 들어, 지대 근이영양증 유형 2E(LGMD2E), 지대 근이영양증 유형 2D(LGMD2D), 지대 근이영양증 유형 2C(LGMD2C), 지대 근이영양증 유형 2B(LGMD2B), 지대 근이영양증 유형 2L(LGMD2L), 지대 근이영양증 유형 2A(LGMD2A));
- 대사성 근병증;
- 근육 염증성 질환;
- 근무력증;
- 미토콘드리아 근병증;
- 이온 채널 이상;
- 핵외피 질환;
- 심근병증;
- 심장 비대;
- 심부전;
- 원위 근병증;
- 혈우병(예를 들어, 혈우병 A 및 B);
- 당뇨병; 및
- 심혈관 질환 및 심장 질환(예를 들어, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 관상심장질환, 관상동맥질환, 말초동맥질환, 선천성 심장질환, 울혈성 심부전, 심부전(심부전증으로도 알려짐), 심근경색증(심장마비로도 알려짐), 심장 허혈, 급성 관상동맥 증후군, 불안정형 협심증, 안정형 협심증, 심근병증, 비후성 심근병증, 확장성 심근병증, 제한성 심근병증, 브루가다 증후군, 폼페병, 다농병 및 파브리병과 같은 유전적 돌연변이로 인한 원발성 심근병증, 심장 아밀로이드증(강직 심장 증후군이라고도 함), 심근염(염증성 심근병증이라고도 함), 판막 심장 질환, 판막 협착증, 판막 부전, 심내막염, 류마티스성 심장 질환, 심막염(즉, 심낭의 염증 및/또는 감염에 의해 유발되는 질병), 심장 탐포나이드(또한 심낭 눌림증이라고도 함), 심내막염, 심장 부정맥, 고혈압, 저혈압, 혈관 협착, 판막 협착 또는 재협착).
또한, 많은 신경근 장애가 횡격막과 호흡기 근육의 약화로 인해 호흡 기능에 영향을 미친다(www.medscape.com/viewarticle/805299_3) Semin Respir Crit Care Med. 2002 Jun;23(3):191-200). 횡격막 질환의 원인은 다양하지만, 횡격막 기능에 직접 영향을 미치는 유전자 결함 때문일 수 있다. 특히, 종종 골격근 및/또는 심장 수준에서의 이상과 함께 횡격막의 기능에 영향을 미치는 유전자의 돌연변이로 인한 여러 유전 장애가 있다. 예를 들어, 근세관 근병증(MTM)은 근세관 유전자의 돌연변이로 인해 발생하며 골격근과 횡경막에 영향을 미친다. MTM을 앓고 있는 환자는 전형적으로 저긴장증, 전신 근육 약화 및 출생 시 호흡 부전을 나타낸다. 출생 이후 생존 기간에는 종종 급양위조루술(gastrostomy feeding) 및 기기를 사용한 인공호흡을 포함한 집중적인 지원이 필요하다. 심각한 호흡 문제로 인해, MTM으로 고통받는 환자는 전형적으로 수명이 2세를 넘지 못한다. MTM의 경우, 현재 근육-지향적 유전자 치료가 임상적으로 관련된 유일한 옵션이다. 대안적으로, 폼페병(글리코겐 저장 장애 유형 II 또는 GSD II라고도 함)은 주로 골격근, 횡격막 및 심장에 영향을 미친다. GSD II는 리소좀 저장 결함으로 이어지는 리소좀 효소 산 α-글루코시다제(GAA)의 결핍을 초래한다. GSD II 환자에서, 글리코겐은 포도당으로 효과적으로 분해되지 않는다. GSD II 환자에서 글리코겐 축적은 진행성 근육 약화와 함께 근병증을 유발한다. 의료 개입이 없으면 가장 심각한 형태의 GSD II로 고통받는 환자는 생후 1년 이내에 호흡 부전으로 사망한다. 뒤시엔느 근이영양증(DMD)과 같은 다른 근육 질환은 출생 남성 3,500명 중 약 1명꼴로 발생한다. 이 질병은 횡격막을 포함한 골격근의 점진적인 파괴로 이어지며, 가장 큰 타격을 받는 개인은 생후 30년 동안 환기 부전으로 사망한다. 다발성 근염/피부근염, 유전성 채널 장애, 미토콘드리아 뇌근병증, 산성 말타제 결핍증, 및 선천성 근병증, 불활동성 위축을 비롯한 많은 다른 근병증도 폐 기능에 영향을 미친다. 횡격막에 영향을 미치는 다른 질병에는 선천성 근이영양증(CMD), 베커 근이영양증(BMD), 안면견갑상완 근이영양증(FSHD), 지대 근이영양증(LGMD), 근긴장성 근이영양증(DM), 미요시 근이영양증, 선천성 후쿠야마형 근이영양증, 디스페리노퍼시가 포함된다. 또한 많은 신경병성 장애는 횡격막과 호흡 근육을 약화시킨다. 여기에는 근위축성 측삭 경화증, 소아마비, 소아마비 후 증후군, 케네디 증후군, 뇌졸중, 다발성 경화증, 척수성 근육 위축, 척수공동증, 신경통성 신경병증 및 운동 신경 질환이 포함된다. 상완 신경총염과 격리된 한쪽 또는 양쪽 횡격막 신경병증도 횡격막을 상당히 약화시킬 수 있다. 호흡에 영향을 미치는 말초 신경병증은 주로 길랭-바레 증후군, 포르피린증 및 중대 질환 신경병증과 같은 급성 질환이지만, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP) 및 샤르코-마리-투스병(CMT)과 같은 만성 질환도 호흡 부전을 유발할 수 있다. 람버트-이튼(Lambert-Eaton) 증후군 및 중증 근무력증과 같은 신경근 전달 장애가 종종 호흡에 영향을 미친다. 또한, 횡격막 기능 장애는 해부학적 이상(예를 들어, 아놀드-키아리(Arnold-Chiari) 기형)을 초래하는 선천적 결함 또는 부상, 외상, 감염(예를 들어, 웨스트 나일 바이러스, 보툴리누스 중독), 유기 인산염, 방사선 치료, 영양 실조, 종양 압박 또는 수술에 대한 노출의 결과로 발생하는 후천적 결함의 결과일 수 있다. 심장 수술에 사용되는 냉심 정지액이 횡격막 신경 손상의 또 다른 일반적인 원인이다. 또한 방사선 치료가 횡격막 신경에 영향을 주어 횡격막 기능 장애를 일으킬 수 있다. 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 천식과 같이 폐에 영향을 미치는 폐쇄성 기도 질환은 심각한 과팽창을 일으켜 횡격막의 불리와 약화를 초래할 수 있다. 마지막으로, 루푸스 및 갑상선 질환도 횡격막 기능 장애에 기여할 수 있다고 알려져 있다.
실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 약학적 조성물은 지대 근이영양증, 특히 지대 근육 이영양증 2E형(LGMD2E)의 치료에 사용하기 위한 것이며, 여기서 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물은 프로모터 및 β-사르코글리칸, 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 핵산 조절 요소(예를 들어 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 코돈-최적화된 이식유전자)를 포함한다.
또한, 지대 근이영양증, 특히 지대 근이영양증 유형 2E(LGMD2E) 치료용 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물의 용도가 개시되며, 여기서 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물은 프로모터 및 β-사르코글리칸, 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 핵산 조절 요소(예를 들어 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 코돈-최적화된 이식유전자)를 포함한다.
또한, 대상체에서 지대 근이영양증, 특히 지대 근이영양증 유형 2E(LGMD2E)를 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
- 대상체, 특히 대상체의 근육 조직 또는 세포, 바람직하게는 대상체의 횡격막, 평활근, 골격근 및 심장 조직 또는 세포, 보다 바람직하게는 대상체의 횡격막, 골격근 및 심장 조직 또는 세포에 본원에 기재된 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물의 도입 - 여기서 상기 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물은 프로모터 및 β-사르코글리칸, 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 코돈-최적화된 이식유전자)에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 핵산 조절 요소를 포함함 -; 및
- 대상체, 특히 대상체의 근육 조직 또는 세포, 바람직하게는 대상체의 횡격막, 평활근, 골격근 및 심장 조직 또는 세포, 보다 바람직하게는 대상체의 횡격막, 골격근 및 심장 조직 또는 세포에서 치료적 유효량의 β-사르코 글리칸, 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸의 발현.
특정 실시양태에서, 본 발명은 지대 근이영양증, 바람직하게는 지대 근이영양증 2E형(LGMD2E)의 치료에 사용하기 위한, 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터, MHCK7 프로모터 및 데스민 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터, 및 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 최적화된 이식유전자)에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 12(Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)에 제시된 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어진 조절 요소를 포함하는 핵산 발현 카세트, 상기 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터, 또는 상기 핵산 발현 카세트 또는 상기 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 지대 근이영양증, 바람직하게는 지대 근이영양증 2E형(LGMD2E)의 치료에 사용하기 위한, 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터, MHCK7 프로모터 및 데스민 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터, 및 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 최적화된 이식유전자)에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 14(Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)에 제시된 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어진 조절 요소를 포함하는 핵산 발현 카세트, 상기 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터, 또는 상기 핵산 발현 카세트 또는 상기 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 지대 근이영양증, 바람직하게는 지대 근이영양증 2E형(LGMD2E)의 치료에 사용하기 위한, 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터, MHCK7 프로모터 및 데스민 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터, 및 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 최적화된 이식유전자)에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 11(Dph-CRE02 - Dph-CRE06 - CSk-SH)에 제시된 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어진 조절 요소를 포함하는 핵산 발현 카세트, 상기 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터, 또는 상기 핵산 발현 카세트 또는 상기 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 지대 근이영양증, 바람직하게는 지대 근이영양증 2E형(LGMD2E)의 치료에 사용하기 위한, 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터, MHCK7 프로모터 및 데스민 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터, 및 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 최적화된 이식유전자)에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 13(Dph-CRE06 - Dph-CRE04 - CSk-SH5)에 제시된 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어진 조절 요소를 포함하는 핵산 발현 카세트, 상기 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터, 또는 상기 핵산 발현 카세트 또는 상기 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 지대 근이영양증, 바람직하게는 지대 근이영양증 2E형(LGMD2E)의 치료에 사용하기 위한, 프로모터, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터, MHCK7 프로모터 및 데스민 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터, 및 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 18에 제시된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 19에 제시된 최적화된 이식유전자)에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 10(Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - CSk-SH5)에 제시된 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어진 조절 요소를 포함하는 핵산 발현 카세트, 상기 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터, 또는 상기 핵산 발현 카세트 또는 상기 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 지대 근이영양증, 바람직하게는 지대 근이영양증 유형 2E(LGMD2E)의 치료에 사용하기 위한 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물의 추가 실시양태에서, 이식유전자는 코돈-최적화된다. 실시양태에서, 핵산 발현 카세트는 MVM 인트론을 추가로 포함한다. 실시양태에서 핵산 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 서열 번호 17에 의해 정의된 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
또한 본원에는 폼페병을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학 조성물이 개시되며, 여기서 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학 조성물은 프로모터 및 산 α-글루코시다제(GAA), 바람직하게는 인간 산 α-글루코시다제(hGAA)를 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 58에 기재된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 59에 기재된 코돈 최적화 이식유전자)에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 핵산 조절 요소를 포함한다.
또한 본원에는 폼페병 치료용 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학 조성물의 용도가 개시되며, 여기서 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학 조성물은 프로모터 및 산 α-글루코시다제(GAA), 바람직하게는 인간 산 α-글루코시다제(hGAA)를 인코딩하는 이식유전자(예를 들어, 서열 번호 58에 기재된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 59에 기재된 코돈 최적화 이식유전자)에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 핵산 조절 요소를 포함한다.
또한 본원에는 다음 단계를 포함하는, 대상체에서 폼페병을 치료하는 방법이 개시된다:
- 대상체, 특히 대상체의 근육 조직 또는 세포, 바람직하게는 대상체의 횡격막, 평활근, 골격근 및 심장 조직 또는 세포, 보다 바람직하게는 대상체의 횡격막, 골격근 및 심장 조직 또는 세포에 본원에 기재된 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물의 도입 - 여기서 상기 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물은 프로모터 및 α-글루코시다제(GAA), 바람직하게는 인간 산 α-글루코시다제(hGAA)에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 핵산 조절 요소(예를 들어, 서열 번호 58에 기재된 이식유전자, 바람직하게는 서열 번호 59에 기재된 코돈-최적화된 이식유전자)를 포함함 -; 및
- 대상체, 특히 대상체의 근육 조직 또는 세포, 바람직하게는 대상체의 횡격막, 평활근, 골격근 및 심장 조직 또는 세포, 보다 바람직하게는 대상체의 횡격막, 골격근 및 심장 조직 또는 세포에서 치료적 유효량의 GAA, 바람직하게는 hGAA의 발현.
유전자 치료 프로토콜은 당업계에 광범위하게 기술되어 있다. 여기에는 플라스미드(네이키드 또는 리포솜 중의)의 근육내 주사, 근육을 포함한 다양한 조직에 유체역학적 유전자 전달, 간질 주사, 기도 내 점적, 내피에의 적용, 간내 실질 및 정맥내 또는 동맥내 투여가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 표적 세포에 대한 DNA의 가용성을 향상시키기 위한 다양한 장치가 개발되었다. 간단한 접근 방식은 표적 세포를 DNA를 함유한 카테터 또는 이식 가능한 물질과 물리적으로 접촉시키는 것이다. 또 다른 접근 방식은 액체 기둥을 고압하에 표적 조직에 직접 투입하는 무바늘 제트 주입 장치를 활용하는 것이다. 이러한 전달 패러다임은 또한 벡터를 전달하는 데에도 사용할 수 있다. 표적 유전자 전달에 대한 또 다른 접근법은 핵산을 세포에 특이적으로 표적화하도록 핵산 또는 DNA-결합제가 부착된 단백질 또는 합성 리간드로 이루어진 분자 접합체의 사용이다(Cristiano et al., 1993).
본원에 기재된 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 약학적 조성물은 또한 백신, 보다 특히 예방 백신으로서 사용하기 위한 것일 수 있다.
또한, 백신의 제조, 특히 예방 백신의 제조를 위한, 본원에 기재된 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 약학적 조성물의 용도가 개시된다.
또한, 다음을 포함하는, 백신 접종을 필요로 하는 대상체의 백신 접종, 특히 예방적 백신 접종 방법이 또한 본원에 개시된다:
- 대상체, 특히 대상체의 근육, 보다 특히 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 조직 또는 세포, 보다 더 특히 대상체의 횡격막, 심장 및/또는 골격근 조직 또는 세포에 본원에 기재된 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물의 도입 - 상기 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 약학적 조성물은 프로모터 및 이식유전자에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 핵산 조절 요소를 포함함; 및
- 대상체, 특히 대상체의 근육, 보다 특히 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 조직 또는 세포, 보다 더 특히 횡격막, 대상체의 횡격막, 심장 및/또는 골격근 세포 또는 조직에서 면역학적 유효량의 이식유전자 산물의 발현.
본원에서 사용된, "치료를 필요로 하는 대상체"와 같은 어구는 언급된 질병 또는 장애의 치료로부터 이익을 얻을 대상체를 포함한다. 이러한 대상체는 제한 없이 상기 질병 또는 장애로 진단된 대상, 상기 질병 또는 장애에 걸리거나 발병할 경향이 있는 대상체 및/또는 상기 질병 또는 장애가 예방되어야 하는 대상체를 포함할 수 있다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며 동물, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물을 지칭하고, 구체적으로 인간 환자 및 인간이 아닌 포유동물을 포함한다. "포유류" 대상체는 인간, 가축, 상업용 동물, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완 동물 및 실험 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소; 영장류, 예컨대 유인원, 원숭이, 오랑우탄, 및 침팬지; 개과 동물, 예컨대 개 및 늑대; 고양이과, 예컨대 고양이, 사자 및 호랑이; 말과, 예컨대 말, 당나귀, 및 얼룩말; 식용 동물, 예컨대 소, 돼지, 및 양; 유제류, 예컨대 사슴 및 기린; 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기니피그 등을 제한없이 포함한다. 바람직한 환자 또는 대상체는 인간 대상체이다.
본원에서 사용된 '치료적 양' 또는 '치료적 유효량'은 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는데, 즉 원하는 국소 또는 전신 효과를 얻는데 효과적인 유전자 산물의 양을 지칭한다. 따라서, 이 용어는 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 찾는 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내는 유전자 산물의 양을 나타낸다. 이러한 양은 전형적으로 유전자 산물 및 질병의 중증도에 따라 다르지만, 아마도 일상적인 실험을 통해 숙련가가 결정할 수 있을 것이다.
본원에서 사용된 "면역학적 유효량"은 (이식)유전자에 의해 인코딩되는 면역원에 대한 후속 노출에 대한 대상체의 면역 반응을 향상시키기에 효과적인 (이식)유전자 산물의 양을 지칭한다. 유도된 면역 수준은, 예를 들어, 플라크 중화, 보체 고정, 효소 결합 면역흡착제 또는 미세중화 검정에 의해, 예를 들어 중화 분비 및/또는 혈청 항체의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
전형적으로, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트 또는 벡터(즉, 적어도 하나의 근육 특이적 핵산 조절 요소를 가짐)를 사용하는 경우 발현된 (이식)유전자 산물의 양은 핵산 조절 요소없이 사용되는 동일한 발현 카세트 또는 벡터보다 더 높다. 보다 특히, 발현은 핵산 조절 요소가 없는 동일한 발현 카세트 또는 벡터에 비해 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 또는 심지어는 적어도 60배 더 높다. 더욱이, 더 높은 발현이 근육, 특히 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 조직 또는 세포, 보다 특히 횡격막, 심장 및 골격근 조직 또는 세포에서 특이적으로 유지된다. 또한, 본원에 기재된 발현 카세트 및 벡터는 장기간 동안 치료량의 유전자 산물의 발현을 지시한다. 전형적으로, 치료적 발현은 적어도 20일, 적어도 50일, 적어도 100일, 적어도 200일, 또는 적어도 300일 이상, 예컨대 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 5년, 적어도 6년, 적어도 7년, 적어도 8년, 적어도 9년, 또는 심지어 적어도 10년 이상 지속되는 것이 구상된다. 유전자 산물(예를 들어, 폴리펩티드)의 발현은 예를 들어, 유전자 산물의 치료적 발현이 달성되는지 여부를 평가하기 위해 항체 기반 검정, 웨스턴 블롯 또는 ELISA 검정과 같이 당업계에서 인정하는 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다. 유전자 산물의 발현은 또한 유전자 산물의 효소적 또는 생물학적 활성을 검출하는 생물검정에서 측정될 수 있다.
또한 근육 세포, 바람직하게는 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 세포, 더 바람직하게는 횡격막, 심장 및/또는 골격근 세포를 형질감염시키거나 형질도입하기 위한 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트, 또는 벡터의 용도가 본원에 개시된다.
근육 세포, 바람직하게는 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 세포, 보다 바람직하게는 횡격막, 심장 및/또는 골격근 세포에서 이식유전자 산물을 발현하기 위한 본원에 개시된 핵산 발현 카세트 또는 벡터의 용도가 본원에 추가로 개시되며, 여기서 핵산 발현 카세트 또는 벡터는 프로모터 및 이식유전자에 작동가능하게 연결된 본원에 개시된 핵산 조절 요소를 포함한다.
근육 세포, 바람직하게는 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 세포, 보다 바람직하게는 횡격막, 심장 및/또는 골격근 세포에서 이식유전자 산물을 발현시키는 방법이 본원에 추가로 개시되며, 이는 다음 단계를 포함한다:
- 본원에 개시된 핵산 발현 카세트 또는 벡터로 근육 세포를 형질감염시키거나 형질도입하는 단계 - 상기 핵산 발현 카세트 또는 벡터는 프로모터 및 이식유전자에 작동가능하게 연결된 본원에 개시된 핵산 조절 요소를 포함함 -; 및
- 근육 세포에서 이식유전자 산물의 발현.
근육 세포의 비-바이러스 형질감염 또는 바이러스 벡터-매개 형질도입은 시험관내, 생체외 또는 생체내 절차에 의해 수행될 수 있다. 시험관내 접근법은 근육 세포, 예를 들어 대상체로부터 사전에 수확된 근육 세포, 근육 세포주 또는 예를 들어 유도 만능 줄기 세포 또는 배아 세포로부터 분화된 근육 세포의 시험관내 형질감염 또는 형질도입을 필요로 한다. 생체외 접근법은 대상체로부터 근육 세포의 수확, 시험관내 형질감염 또는 형질도입, 및 임의로 형질감염된 근육 세포를 대상체로 재도입하는 것을 필요로 한다. 생체내 접근은 본원에 개시된 핵산 발현 카세트 또는 벡터를 대상체에 투여하는 것을 필요로 한다. 바람직한 실시양태에서, 근육 세포의 형질감염은 시험관내 또는 생체 외에서 수행된다.
본원에 개시된 핵산 조절 요소, 핵산 발현 카세트 및 벡터의 사용은 유전자 치료, 예를 들어 횡격막, 평활근, 심장 및 골격근 세포로 줄기 세포의 동축 분화, 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 세포 및/또는 조직 등과 같은 근육 세포 또는 조직에서 단백질의 과발현을 위한 형질전환 모델 등을 넘어서까지 함축한다는 것이 당업자에 인정될 것이다.
본 발명이 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
데노보 컴퓨터적으로(
de novo
computationally) 설계된 조절 요소(CRE)를 포함하는 새로운 AAV 벡터의 설계 및 작제
CRE 요소(의 조합)와 조합된 합성 SPc5-12 프로모터(서열 번호 15)로부터 인간 β-사르코글리칸(hβ-sgco 또는 hβsgco)(서열 번호 19)을 인코딩하는 코돈 최적화된 이식유전자 또는 야생형 hβ-sg(wt) 유전자(서열 번호 18), 또는 루시퍼라제 리포터 유전자(Luc)(서열 번호 20)를 발현하는 AAV9 벡터를 설계하였다. 개별 CRE 요소들은 횡격막 및 골격근(본원에서 Dph-CRE로 표시) 또는 심장 및 골격근(본원에서 CSk-CRE 또는 CSk-SH로 표시)에서 높은 이식유전자 발현을 매개하는 것으로 알려져 있다. 벡터는 또한 MVM(Minute Virus of Mouse) 인트론(서열 번호 16) 및 합성 폴리아데닐화 부위(pA)(서열 번호 17)를 함유하였다.
CRE 요소가 결여된 AAV 벡터 요소를 대조군으로 작제하였다(본원에서 AAV-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA 및 AAV-SPc5-12-MVM-hβsg-pA로 표시).
도 2는 설계 및 작제된 다양한 AAV 벡터를 도시한다. 벡터는 기존의 클로닝으로 작제되었다.
요약하면, 야생형 인간 베타-사르코글리칸 유전자(hβsg)(서열 번호 18), 코돈 최적화된 hβsgco 유전자(서열 번호 19), 또는 루시퍼라제 인코딩 리포터 유전자(서열 번호 20) - 모두 5' 및 3' 말단에서 Hind III 및 BstBI 제한 부위에 의해 플랭크됨 -를 조절 요소 CSk-SH5(서열 번호 1)에 작동가능하게 연결된 SPc5-12 프로모터 하류에 클로닝하였다. 인간 베타-사르코글리칸 유전자(hβsg) 유전자를 유전자 최적화기(GeneArt, Life technologies, Germany)를 사용하여 코돈 최적화하였다.
SPc5-12 프로모터(서열 번호 15)에 작동가능하게 연결된 CSk-SH5 조절 요소(서열 번호 1)를 단일 가닥 아데노 관련 바이러스 벡터(AAVss) 백본의 맥락에서 MVM 인트론(서열 번호 16)의 상류에 클로닝하였다. 벡터는 또한 49bp 합성 폴리아데닐화 부위를 함유하였다(Levitt N et al, 1989)(서열 번호 17).
도 2A (AAV-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA), 도 2B (AAV-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsg-pA) 및 도 2A1 (AAV-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA)에 도시된 벡터가 상이한 Dph-CRE를 클로닝하기 위한 백본으로 제공되었다.
1개, 2개 또는 3개의 다이어프램 CRE(Dph-CRE)를 CSk-SH5 CRE의 상류에 클로닝하여 hβsgco 유전자를 발현하는 작제물을 생성하였다(하나의 CRE: 도 2C (AAV-CRE02-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA), 도 2D (AAV-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA), 도 2E (AAV-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA); 2개의 CRE: 도 2F (AAV-CRE02-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA), 도 2H (AAV-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA), 도 2J (AAV-CRE06-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA), 도 2L (AAV-CRE02-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA); 및 3개의CRE: 도 2N (AAV-CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA)).
유사하게, 2개 또는 3개의 다이어프램 CRE를 CSk-SH5 CRE의 상류에 클로닝하여 야생형 hβsg 유전자를 발현하는 작제물을 생성하였다(2개의 CRE: 도 2G (AAV-CRE02-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsg-pA), 도 2I (AAV-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsg-pA), 도 2K (AAV-CRE06-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsg-pA), 도 2M (AAV-CRE02-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsg-pA); 및 3개의 CRE: 도 2O (AAV-CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβsg-pA)).
또한, 2개 또는 3개의 다이어프램 CRE를 CSk-SH5 CRE의 상류에 클로닝하여 Luc 리포터 유전자를 발현하는 작제물을 생성하였다(하나의 CRE: 도 2R (AAV-CRE02-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA), 도 2Q (AAV-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA), 도 2P (AAV-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA); 2개의 CRE: 도 2S (AAV-CRE06-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA, 도 2T (AAV-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA), 도 2U (AAV-CRE02-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA), 도 2V (AAV-CRE02-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA); 및 3개의 CRE: 도 2W (AAV-CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA)).
마지막으로, CRE가 결여된 3개의 대조군 벡터, 즉 AAV-SPc5-12-MVM-hβsgco-pA (도 2Y), AAV-SPc5-12-MVM-hβsg-pA (도 2X) 및 AAV-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2Z)를 작제하였다.
실시예 2: 리포터 유전자를 통한 조절 요소의 생체내 검증
어떤 CRE 조합이 가장 효능적인지를 평가하기 위해, Spc5-12 프로모터로부터 루시퍼라제 유전자(Luc)를 발현하고 상이한 CRE 조합을 포함하는 AAV 벡터를 비교 분석을 위해 CB17-SCID 마우스에 주입하였다. 다양한 CRE 조합을 루시퍼라제 유전자 발현을 증가시키는 능력에 대해 시험하였다. 보다 구체적으로, 다음 벡터가 주입되었다:
AAV-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2Z, 서열 번호 46)
AAV- CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2A1, 서열 번호 47)
AAV-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2P, 서열 번호 36)
AAV-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2Q, 서열 번호 37)
AAV-CRE02-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2R, 서열 번호 38)
AAV-CRE06-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2S, 서열 번호 39)
AAV-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2T, 서열 번호 40)
AAV-CRE02-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2U, 서열 번호 41)
AAV-CRE02-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2V, 서열 번호 42)
AAV-CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA (도 2W, 서열 번호 43).
실험 절차
AAV 벡터 생산 및 정제
특히 본원에 참고로 포함되는 Vandendriessche et al. (2007. J Thromb Haemost 5:16-24)에 기술된 바와 같이, 관심있는 pAAV 플라스미드, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 및 AAV9 cap와 함께 AAV2 rep 유전자를 전달하는 키메라 패키징 작제물로 293T 인간 배아 신장 세포의 인산칼슘(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) 공동 형질감염에 의해 AAV9 벡터를 생성하였다.
요약하면, 형질감염 2일 후, 세포를 수확하고 등밀도 원심분리 방법을 사용하여 벡터 입자를 정제하였다. 수확된 세포를 연속적인 동결/해동 주기 및 초음파 처리에 의해 용해시키고, 벤조나제(Novagen, Madison, WI) 및 데옥시콜산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 처리한 후, 3 연속 라운드의 염화세슘(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) 밀도 구배 초원심분리를 수행하였다. AAV 벡터를 함유하는 분획을 수집하고, 둘베코 인산염 완충 염수(PBS)(Gibco, BRL) 중 1 mM MgCl2에서 농축시키고 -80℃에서 보관하였다.
ABI 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystem, Foster city, CA, USA)에서 SYBR 그린 믹스(Green mix)(SYBR 그린(Green) 염료, Taqman 중합효소, ROX 및 dNTP의 올인원 포함) 및 루시퍼라제 특이적 프라이머를 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의해 벡터 역가(바이러스 게놈(vg)/ml으로)를 결정하였다. 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 5'-CCCACCGTCGTATTCGTGAG-3'(서열 번호 48) 및 5'-TCAGGGCGATGGTTTTGTCCC-3'(서열 번호 49)였다.
적절한 cDNA를 갖고 있는 해당 AAV 벡터를 생성하는 데 사용된 각 벡터 플라스미드의 알려진 카피 수(102 -107)를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다.
동물 연구
4-5주령의 성체 CB17-SCID 마우스에 마우스당 1011 vg의 용량을 정맥내 주사하였다. 주사 후 7일 또는 10일에 전신 생물발광 분석(BLI)에 의해 루시퍼라제 활성을 평가하였다. 주사 후 15주에 코호트당 한 마리의 마우스를 희생시키고 개별 기관 BLI를 수행하여 각 개별 기관에서 루시페라제 발현 수준을 정량화하였다. 도 3은 시험된 작제물의 비복근 및 사두근에서 루시페라제 발현의 배수 차이를 나타낸다.
결과
전신 생물발광 분석은 CSk-Sh5-CRE, 및 이중 Dph-CRE 조합 CRE02 및 CRE04, CRE04 및 CRE06(임의의 순서로), 및 CRE02 및 CRE06, 또는 삼중 Dph-CRE 조합 CRE02, CRE04 및 CRE06이 CRE가 결여된 대조군 Spc5-12 프로모터와 비교하여 루시페라제 발현의 예기치 못한 불균형적인 증가를 초래하는 것을 보여주었다(데이터는 표시되지 않음). CRE 요소의 조합은 개별 CRE 요소에 비해 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 더 높은 수준으로 증가시켰다. 또한 안락사시켜 주사된 쥐의 비복근과 사두근을 해부하고 BLI를 이용하여 생물발광 활성을 조사하였다. 그 결과는 CSk-SH5-CRE를 1개의 Dph-CRE(즉, CRE-02), 2개의 Dph-CRE(즉, CRE-02 + CRE-04) 또는 3개의 Dph-CRE(즉, CRE-02 + CRE-04 + CRE-06)와 조합시킨 경우 예기치 못한 증가를 보여 전신 BLI 결과를 확인시켜 주었다(도 3).
실시예 3: 치료적 이식유전자를 통한 조절 요소의 생체내 검증
어떤 CRE 조합이 가장 효능적인지를 결정하기 위해, 상이한 CRE 조합을 포함하는 AAV 벡터를 비교 분석을 위해 CB17-SCID 마우스에 주입하였다. 상이한 CRE 조합을 코돈 최적화된 hβsg 유전자 발현에 대해 평가하였다. 보다 구체적으로, 다음 벡터가 주입되었다:
AAV-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2A, 서열 번호 21)
AAV-CRE02-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2C, 서열 번호 23)
AAV-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2D, 서열 번호 24)
AAV-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2E, 서열 번호 25)
AAV-CRE02-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2F, 서열 번호 26)
AAV-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2H, 서열 번호 28)
AAV-CRE06-CRE04-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2J, 서열 번호 30)
AAV-CRE02-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2L, 서열 번호 32)
실험 절차
AAV 벡터 생산 및 정제
AAV 벡터 생산 및 정제를 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 정량적 실시간 PCR에 의해 벡터 역가를 결정하기 위해 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 5'-AGGGATGGTTGGTTGGTGG-3'(서열 번호 50) 및 5'-GGCAGGTGCTCCAGGTAAT -3'(서열 번호 51)였다.
동물 연구
4-5주령의 성체 CB17-SCID 마우스에 마우스당 3x1011 vg의 용량을 정맥내 주사하였다. 코호트당 2-3마리의 마우스를 주사하였다. 주사 후 26일에, 코호트당 한 마리의 마우스를 희생시키고 희생된 마우스로부터 다양한 기관들을 단리하였다(사두근, 비복근, 경골, 삼두근, 이두박근, 횡격막, 심장과 같은 근육뿐만 아니라, 간, 신장, 뇌, 비장과 같은 비근육도 단리). Q-RT-PCR을 수행하여 hβsgco 유전자 발현을 정량화하였다.
mRNA 분석
제조업체의 지침(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA)에 따라 실리카-막 기반 정제 키트를 사용하여 다양한 마우스 기관에서 전체 RNA를 추출하였다. 이어서, 각 샘플로부터의 전체 RNA 200 ng을 cDNA 합성 키트(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 역전사(RT)하였다. 다음으로, 5'-CATCACAAGTGACATCGGCA-3'(서열 번호 52)를 정방향 프라이머로, 5'-TGGCAGCCCATGTTCTGGC-3'(서열 번호 53)를 역방향 프라이머(앰플리콘 217 bp)로 사용하여 ABI 7700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 정량적 (q) PCR로 전체 RNA 10 ng에 해당하는 cDNA 양을 증폭시켰다. 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'(서열 번호 54)를 정방향 프라이머로, 5'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'(서열 번호 55)를 역방향 프라이머(앰플리콘 82 bp)로 사용하여 hβsgco mRNA 수준을 내인성 뮤린 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(mGAPDH) 유전자의 mRNA 수준으로 정규화하였다. RNA 샘플을 DNA 증폭을 배제하기 위해 역전사 효소 부재 및 존재하에 증폭시켰다. 증폭된 PCR 단편의 크기를 1.8% 아가로스 겔에서 확인하였다.
결과
CSk-Sh5-CRE와 이중 Dph-CRE 조합 CRE02 및 CRE04, CRE04 및 CRE06(임의의 순서로), 및 CRE02 및 CRE06, 또는 삼중 Dph-CRE 조합 CRE02, CRE04 및 CRE06의 조합은 CSk-SH5-CRE 단독 또는 CSk-SH5-CRE와 단일 Dph-CRE의 조합에 비해 hβsgco 유전자 발현의 예기치 못한 불균형적인 증가로 이어졌다(도 4). 특정 CRE 조합은 hβsgco 유전자 발현을 향상시키는 데 다른 조합보다 더 효능적이었다.
실시예 4: 치료적 이식유전자를 통한 조절 요소의 생체내 검증
hβsgco 유전자 발현의 비교 분석을 위해 상이한 CRE 조합을 포함하는 AAV 벡터를 CB17-SCID 마우스에 주입하였다. 다음 벡터가 주입되었다:
-AAV-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2Y, 서열 번호 45) (SPc5-12)
-AAV-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2A, 서열 번호 21) (CSkSH5-SPc5-12)
-AAV-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2H, 서열 번호 28) (Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12)
-AAV-CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2N, 서열 번호 34) (Dph-CRE02-Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12)
실험 절차
실험 절차는 동물 연구 설계에서 약간의 수정을 제외하고 실시예 3에 기술된 것과 동일하다. 요약하면, 4-5주령의 성체 CB17-SCID 마우스에 마우스당 3x1011 vg의 용량을 정맥내 주사하였다. 코호트당 4-5마리의 마우스를 주사하였다. 주사 후 2개월에, 코호트당 한 마리의 마우스를 희생시키고 희생된 마우스로부터 다양한 기관들을 단리하였다(사두근, 비복근, 경골, 삼두근, 이두박근, 횡격막, 심장과 같은 근육뿐만 아니라, 간, 신장, 뇌, 비장과 같은 비근육도 단리). Q-RT-PCR을 수행하여 hβsgco 유전자 발현을 정량화하였다.
결과
표 2-4는 시험된 벡터의 비복근, 사두근 및 심장에서의 상호적인 hßSGco 발현을 나타낸다. 상대적인 hßSGco 발현을 배수 차이로 표시나타내었다.
| SPc5-12 | CSkSH5-SPc5-12 | Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | Dph-CRE02-Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | |
| SPc5-12 | 1.0 | - | - | - |
| CSkSH5-SPc5-12 | 9.1 | 1.0 | - | - |
| Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | 33.3 | 3.7 | 1.0 | - |
| Dph-CRE02-Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | 105.6 | 11.6 | 3.2 | 1.0 |
| SPc5-12 | CSkSH5-SPc5-12 | Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | Dph-CRE02-Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | |
| SPc5-12 | 1.0 | - | - | - |
| CSkSH5-SPc5-12 | 3.4 | 1.0 | - | - |
| Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | 9.8 | 2.9 | 1.0 | - |
| Dph-CRE02-Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | 58.2 | 17.0 | 5.9 | 1.0 |
| SPc5-12 | CSkSH5-SPc5-12 | Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | Dph-CRE02-Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | |
| SPc5-12 | 1.0 | - | - | - |
| CSkSH5-SPc5-12 | 7.4 | 1.0 | - | - |
| Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | 16.0 | 2.2 | 1.0 | - |
| Dph-CRE02-Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5-SpC5-12 | 30.7 | 4.2 | 1.9 | 1.0 |
도 5 및 표 2 내지 4에 나타낸 결과는 벡터가 대조군 벡터(CRE 결여, 도 5 및 표 1 내지 3에서 SPc5-12로 표시)에 비해 CRE를 포함하는 경우에는 언제나 hβsgco 유전자의 골격근 또는 심장 특이적 mRNA 발현의 유의한 증가를 나타낸다. 가장 중요하게는, CSk-SH5-CRE와 이중 Dph-CRE 조합 CRE04 및 CRE06 또는 삼중 Dph-CRE 조합 CRE02, CRE04 및 CRE06의 조합은 CRE가 결여된 대조군 Spc5-12 프로모터와 비교하여 골격근 및 심장에서 각각 약 100배 또는 30배까지로, hβsgco mRNA 발현 수준에서 예상치 못한 불균형적인 증가를 초래하였다.
실시예 5: 이식유전자의 코돈 최적화 효과의 생체내 평가
hβsg 유전자의 코돈 최적화가 코돈 최적화되지 않은 유전자와 비교할 때 hβsg 단백질 수준을 추가로 증가시킬 수 있는지 확인하기 위해, 코돈 최적화 또는 야생형 hβsg 유전자를 포함하는 세 쌍의 AAV 벡터를 나란히 비교하였다. 세 쌍의 벡터는 다음과 같다:
i) pAAV-SPc5-12-MVM-hβ-SGwt-SynthpA (도 2X, 서열 번호 44) 대 pAAV-SPc5-12-MVM- hβ-SGco-SynthpA (도 2Y; 서열 번호 45)
ii) pAAV-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβ-SGwt-SynthpA (도 2B, 서열 번호 22) 대 pAAV-CSk-SH5-SPc5-12-MVM- hβ-SGco-SynthpA (도 2A, 서열 번호 21)
iii) pAAV-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hβ-SGwt-SynthpA (도 2H, 서열 번호 28) 대 pAAV-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12 -MVM-hβ-SGco-SynthpA (도 2I, 서열 번호 29)
AAV 벡터를 생성하고, 적정하고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 4-5주령의 수컷 CB17 마우스에 주사하였다. 각 마우스에 3x1011 vg의 용량을 주사하였고; 코호트당 4~5마리의 마우스에 주사하였다. 주사 후 2개월에, 마우스를 희생시키고 희생된 마우스로부터 다양한 기관들을 단리하였다(사두근, 비복근, 경골, 삼두근, 이두근, 횡격막, 심장과 같은 근육뿐만 아니라, 간, 신장, 뇌, 비장과 같은 비근육도 단리). wt 또는 코돈-최적화된 hβsg 유전자를 인코딩하는 AAV 벡터가 주사된 마우스의 단리된 다양한 조직에서 웨스턴 블롯을 수행하였다.
실시예 6: SGCB 눌(null) 마우스에서 조절 요소의 생체내 평가
CRE 조합 Dph-CRE02-Dph-CRE04-Dph-CRE06-CSkSH5(서열 번호 14)의 치료 효능을 β-사르코글리칸-인코딩 이식유전자를 포함하는 벡터를 사용한 유전자 치료에 의해 동형 접합 사르코글리칸, 베타(디스트로핀 관련 당단백질)(Sgcb) 표적 돌연변이 마우스에서 평가하였다. 녹아웃 β-사르코글리칸이 있는 Sgcb-눌 마우스는 유형 2E 인간 지대 근이영양증에서와 같이 심각한 근이영양증이 발생하였다.
2-3일령의 신생 Sgcb-눌 수컷 마우스에 실험 벡터 AAV-CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA (도 2N, 서열 번호 34) 또는 CRE가 결여된 대조군 벡터 AAV-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA CRE (도 2Y, 서열 번호 45)를 코호트당 3마리의 마우스에 1x1011 vg의 벡터 용량으로 주사하였다.
벡터 주사 후 6개월에, 마우스를 트레드밀 지구력 분석을 통해 근육 성능을 모니터링하였다. 인산염 완충 염수(PBS)가 주사된 Sgcb-눌 마우스를 유전자 치료로 처리되지 않은 대조군으로 사용하였다. TREAD SOFTWARE에 의해 Bioseb(프랑스) 트레드밀을 사용하여 달린 거리를 측정하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.
실험 벡터 AAV-CRE02-CRE04-CRE06-CSk-SH5-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA가 주사된 마우스는 CRE가 결여된 대조군 마우스(AAV-SPc5-12-MVM-hß-SGco-pA로 표시)(평균 거리 148미터)에 비해 더 먼 거리를 달렸다(평균 거리 364미터). 실험용 벡터가 주사된 마우스는 PBS를 주입한 대조군 마우스보다 5배 더 먼 거리를 달렸다(평균 거리 71미터).
이러한 결과는 유전자 치료가 Sgcb-눌 마우스에서 효과적이었고 CRE 조합이 치료 효능을 증가시켰음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> Vrije Universiteit Brussel
<120> MUSCLE-SPECIFIC NUCLEIC ACID REGULATORY ELEMENTS AND METHODS AND
USE THEREOF
<130> VUB-085-PCT
<150> 20158057.8
<151> 2020-02-18
<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 454
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSk-SH5
<400> 1
cagtttactc accagggatt cagaggcagc actgctgaac cctgagccct tggcacatca 60
ggttggctgt cagaagtcgg cctttgtaca tacacagttc ccttgtgagg cccagctgcg 120
tgtcctagga gcggggcctc tctccacagc agagctcagc ctctcaagtg tatggacagc 180
acgggtgcct gatgggtgga tttagccatg agttgaaggt ggcttgggga gaatgagagt 240
tctagagata gggagaaggg gttgccaata ggagagtgga attcctgagc acctcgtcac 300
aggcagccga cagaacatga gccgcagggc ccaggctatt tatacctcgc ctgtcactat 360
cagggtcccc acagctcccc ccacctccag ccacacacag caggtccttt tgctctttct 420
ggtcccttct ctactcctcc ccctccctac ctaa 454
<210> 2
<211> 452
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE02
<400> 2
gacaggtgcg gttcccggag cgcaggcgca cacatgcacc caccggcgaa cgcggtgacc 60
ctcgccccac cccatcccct ccggcgggca actgggtcgg gtcaggaggg gcaaacccgc 120
tagggagaca ctccatatac ggcccggccc gcgttacctg ggaccgggcc aacccgctcc 180
ttctttggtc aacgcagggg acccgggcgg gggcccaggc cgcgaaccgg ccgagggagg 240
gggctctagt gcccaacacc caaatatggc tcgagaaggg cagcgacatt cctgcggggt 300
ggcgcggagg gaatgcccgc gggctatata aaacctgagc agagggacaa gcggccaccg 360
cagcggacag cgccaagtga agcctcgctt cccctccgcg gcgaccaggg cccgagccga 420
gagtagcagt tgtagctacc cgcccaggta gg 452
<210> 3
<211> 509
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE04
<400> 3
ccttttagag aatccacacc tgtcccagtt gctgggttcc actaccaaaa gtgaattgca 60
actattttag gagcacttaa gcacatccga aaaatgagtg attctgttct ggcccacacc 120
acatcactga tgtaccccct taaagcatgt ccctgagttc atcacagaag actgctcctc 180
ctgtgccctc cacaaggtta gaactgtcct tgtcttaggg aaaaaggaga gagagagaga 240
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagaggga caggcaccaa ctgggtaacc 300
tctgctgacc cccactctac tttaccataa gtagctccaa atccttctag aaaatctgaa 360
aggcatagcc ccatatatca gtgatataaa tagaacctgc agcaggctct ggtaaatgat 420
gactacaagg tggactggga ggcagcccgg ccttggcagg catcatcctc taaatataaa 480
gatgagtttg ttcagccttt gcagaagga 509
<210> 4
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE06
<400> 4
gggccagggg acggtggctt ctacgtgctt gggacgttcc cagccaccgt cccatgttcc 60
cggcgggggg ccagctgtcc ccaccgccag cccaactcag cacttggtca gggtatcagc 120
ttggtggggg ggcgtgagcc cagcccctgg ggcggctcag cccatacaag gccatggggc 180
tgggcgcaaa gcatgcctgg gttcagggtg ggtatggtgc gggagcaggg aggtgagagg 240
ctcagctgcc ctccagaact cctccctggg gacaacccct cccagccaat agcacagcct 300
aggtccccct atataaggcc acggctgctg gcccttcctt tgggtcagtg tcacctccag 360
gatacagaca gccccccttc agcccagccc agccaggtac 400
<210> 5
<211> 981
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE02-CRE04
<400> 5
gacaggtgcg gttcccggag cgcaggcgca cacatgcacc caccggcgaa cgcggtgacc 60
ctcgccccac cccatcccct ccggcgggca actgggtcgg gtcaggaggg gcaaacccgc 120
tagggagaca ctccatatac ggcccggccc gcgttacctg ggaccgggcc aacccgctcc 180
ttctttggtc aacgcagggg acccgggcgg gggcccaggc cgcgaaccgg ccgagggagg 240
gggctctagt gcccaacacc caaatatggc tcgagaaggg cagcgacatt cctgcggggt 300
ggcgcggagg gaatgcccgc gggctatata aaacctgagc agagggacaa gcggccaccg 360
cagcggacag cgccaagtga agcctcgctt cccctccgcg gcgaccaggg cccgagccga 420
gagtagcagt tgtagctacc cgcccaggta ggggcgcgcc gtcgacggat ccccttttag 480
agaatccaca cctgtcccag ttgctgggtt ccactaccaa aagtgaattg caactatttt 540
aggagcactt aagcacatcc gaaaaatgag tgattctgtt ctggcccaca ccacatcact 600
gatgtacccc cttaaagcat gtccctgagt tcatcacaga agactgctcc tcctgtgccc 660
tccacaaggt tagaactgtc cttgtcttag ggaaaaagga gagagagaga gagagagaga 720
gagagagaga gagagagaga gagagagagg gacaggcacc aactgggtaa cctctgctga 780
cccccactct actttaccat aagtagctcc aaatccttct agaaaatctg aaaggcatag 840
ccccatatat cagtgatata aatagaacct gcagcaggct ctggtaaatg atgactacaa 900
ggtggactgg gaggcagccc ggccttggca ggcatcatcc tctaaatata aagatgagtt 960
tgttcagcct ttgcagaagg a 981
<210> 6
<211> 872
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE02-CRE06
<400> 6
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ctcgccccac cccatcccct ccggcgggca actgggtcgg gtcaggaggg gcaaacccgc 120
tagggagaca ctccatatac ggcccggccc gcgttacctg ggaccgggcc aacccgctcc 180
ttctttggtc aacgcagggg acccgggcgg gggcccaggc cgcgaaccgg ccgagggagg 240
gggctctagt gcccaacacc caaatatggc tcgagaaggg cagcgacatt cctgcggggt 300
ggcgcggagg gaatgcccgc gggctatata aaacctgagc agagggacaa gcggccaccg 360
cagcggacag cgccaagtga agcctcgctt cccctccgcg gcgaccaggg cccgagccga 420
gagtagcagt tgtagctacc cgcccaggta ggggcgcgcc gtcgacggat ccgggccagg 480
ggacggtggc ttctacgtgc ttgggacgtt cccagccacc gtcccatgtt cccggcgggg 540
ggccagctgt ccccaccgcc agcccaactc agcacttggt cagggtatca gcttggtggg 600
ggggcgtgag cccagcccct ggggcggctc agcccataca aggccatggg gctgggcgca 660
aagcatgcct gggttcaggg tgggtatggt gcgggagcag ggaggtgaga ggctcagctg 720
ccctccagaa ctcctccctg gggacaaccc ctcccagcca atagcacagc ctaggtcccc 780
ctatataagg ccacggctgc tggcccttcc tttgggtcag tgtcacctcc aggatacaga 840
cagcccccct tcagcccagc ccagccaggt ac 872
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<212> DNA
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<220>
<223> Dph-CRE04-CRE06
<400> 7
ccttttagag aatccacacc tgtcccagtt gctgggttcc actaccaaaa gtgaattgca 60
actattttag gagcacttaa gcacatccga aaaatgagtg attctgttct ggcccacacc 120
acatcactga tgtaccccct taaagcatgt ccctgagttc atcacagaag actgctcctc 180
ctgtgccctc cacaaggtta gaactgtcct tgtcttaggg aaaaaggaga gagagagaga 240
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagaggga caggcaccaa ctgggtaacc 300
tctgctgacc cccactctac tttaccataa gtagctccaa atccttctag aaaatctgaa 360
aggcatagcc ccatatatca gtgatataaa tagaacctgc agcaggctct ggtaaatgat 420
gactacaagg tggactggga ggcagcccgg ccttggcagg catcatcctc taaatataaa 480
gatgagtttg ttcagccttt gcagaaggag gcgcgccgtc gacggatccg ggccagggga 540
cggtggcttc tacgtgcttg ggacgttccc agccaccgtc ccatgttccc ggcggggggc 600
cagctgtccc caccgccagc ccaactcagc acttggtcag ggtatcagct tggtgggggg 660
gcgtgagccc agcccctggg gcggctcagc ccatacaagg ccatggggct gggcgcaaag 720
catgcctggg ttcagggtgg gtatggtgcg ggagcaggga ggtgagaggc tcagctgccc 780
tccagaactc ctccctgggg acaacccctc ccagccaata gcacagccta ggtcccccta 840
tataaggcca cggctgctgg cccttccttt gggtcagtgt cacctccagg atacagacag 900
ccccccttca gcccagccca gccaggtac 929
<210> 8
<211> 929
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE06-CRE04
<400> 8
gggccagggg acggtggctt ctacgtgctt gggacgttcc cagccaccgt cccatgttcc 60
cggcgggggg ccagctgtcc ccaccgccag cccaactcag cacttggtca gggtatcagc 120
ttggtggggg ggcgtgagcc cagcccctgg ggcggctcag cccatacaag gccatggggc 180
tgggcgcaaa gcatgcctgg gttcagggtg ggtatggtgc gggagcaggg aggtgagagg 240
ctcagctgcc ctccagaact cctccctggg gacaacccct cccagccaat agcacagcct 300
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gatacagaca gccccccttc agcccagccc agccaggtac ggcgcgccgt cgacggatcc 420
ccttttagag aatccacacc tgtcccagtt gctgggttcc actaccaaaa gtgaattgca 480
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acatcactga tgtaccccct taaagcatgt ccctgagttc atcacagaag actgctcctc 600
ctgtgccctc cacaaggtta gaactgtcct tgtcttaggg aaaaaggaga gagagagaga 660
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagaggga caggcaccaa ctgggtaacc 720
tctgctgacc cccactctac tttaccataa gtagctccaa atccttctag aaaatctgaa 780
aggcatagcc ccatatatca gtgatataaa tagaacctgc agcaggctct ggtaaatgat 840
gactacaagg tggactggga ggcagcccgg ccttggcagg catcatcctc taaatataaa 900
gatgagtttg ttcagccttt gcagaagga 929
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<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE02-CRE04-CRE06
<400> 9
gacaggtgcg gttcccggag cgcaggcgca cacatgcacc caccggcgaa cgcggtgacc 60
ctcgccccac cccatcccct ccggcgggca actgggtcgg gtcaggaggg gcaaacccgc 120
tagggagaca ctccatatac ggcccggccc gcgttacctg ggaccgggcc aacccgctcc 180
ttctttggtc aacgcagggg acccgggcgg gggcccaggc cgcgaaccgg ccgagggagg 240
gggctctagt gcccaacacc caaatatggc tcgagaaggg cagcgacatt cctgcggggt 300
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gagtagcagt tgtagctacc cgcccaggta ggggcgcgcc cgtacggtcg acggatcccc 480
ttttagagaa tccacacctg tcccagttgc tgggttccac taccaaaagt gaattgcaac 540
tattttagga gcacttaagc acatccgaaa aatgagtgat tctgttctgg cccacaccac 600
atcactgatg taccccctta aagcatgtcc ctgagttcat cacagaagac tgctcctcct 660
gtgccctcca caaggttaga actgtccttg tcttagggaa aaaggagaga gagagagaga 720
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagggaca ggcaccaact gggtaacctc 780
tgctgacccc cactctactt taccataagt agctccaaat ccttctagaa aatctgaaag 840
gcatagcccc atatatcagt gatataaata gaacctgcag caggctctgg taaatgatga 900
ctacaaggtg gactgggagg cagcccggcc ttggcaggca tcatcctcta aatataaaga 960
tgagtttgtt cagcctttgc agaaggaggc gcgccgtcga cggatccggg ccaggggacg 1020
gtggcttcta cgtgcttggg acgttcccag ccaccgtccc atgttcccgg cggggggcca 1080
gctgtcccca ccgccagccc aactcagcac ttggtcaggg tatcagcttg gtgggggggc 1140
gtgagcccag cccctggggc ggctcagccc atacaaggcc atggggctgg gcgcaaagca 1200
tgcctgggtt cagggtgggt atggtgcggg agcagggagg tgagaggctc agctgccctc 1260
cagaactcct ccctggggac aacccctccc agccaatagc acagcctagg tccccctata 1320
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ccccttcagc ccagcccagc caggtac 1407
<210> 10
<211> 1461
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE02-CRE04-CSk-SH5
<400> 10
gacaggtgcg gttcccggag cgcaggcgca cacatgcacc caccggcgaa cgcggtgacc 60
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aggagcactt aagcacatcc gaaaaatgag tgattctgtt ctggcccaca ccacatcact 600
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tccacaaggt tagaactgtc cttgtcttag ggaaaaagga gagagagaga gagagagaga 720
gagagagaga gagagagaga gagagagagg gacaggcacc aactgggtaa cctctgctga 780
cccccactct actttaccat aagtagctcc aaatccttct agaaaatctg aaaggcatag 840
ccccatatat cagtgatata aatagaacct gcagcaggct ctggtaaatg atgactacaa 900
ggtggactgg gaggcagccc ggccttggca ggcatcatcc tctaaatata aagatgagtt 960
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gctcccccca cctccagcca cacacagcag gtccttttgc tctttctggt cccttctcta 1440
ctcctccccc tccctaccta a 1461
<210> 11
<211> 1352
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE02-CRE06-Csk-SH5
<400> 11
gacaggtgcg gttcccggag cgcaggcgca cacatgcacc caccggcgaa cgcggtgacc 60
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ctatataagg ccacggctgc tggcccttcc tttgggtcag tgtcacctcc aggatacaga 840
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ttggctgtca gaagtcggcc tttgtacata cacagttccc ttgtgaggcc cagctgcgtg 1020
tcctaggagc ggggcctctc tccacagcag agctcagcct ctcaagtgta tggacagcac 1080
gggtgcctga tgggtggatt tagccatgag ttgaaggtgg cttggggaga atgagagttc 1140
tagagatagg gagaaggggt tgccaatagg agagtggaat tcctgagcac ctcgtcacag 1200
gcagccgaca gaacatgagc cgcagggccc aggctattta tacctcgcct gtcactatca 1260
gggtccccac agctcccccc acctccagcc acacacagca ggtccttttg ctctttctgg 1320
tcccttctct actcctcccc ctccctacct aa 1352
<210> 12
<211> 1409
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE04-CRE06-Csk-SH5
<400> 12
ccttttagag aatccacacc tgtcccagtt gctgggttcc actaccaaaa gtgaattgca 60
actattttag gagcacttaa gcacatccga aaaatgagtg attctgttct ggcccacacc 120
acatcactga tgtaccccct taaagcatgt ccctgagttc atcacagaag actgctcctc 180
ctgtgccctc cacaaggtta gaactgtcct tgtcttaggg aaaaaggaga gagagagaga 240
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagaggga caggcaccaa ctgggtaacc 300
tctgctgacc cccactctac tttaccataa gtagctccaa atccttctag aaaatctgaa 360
aggcatagcc ccatatatca gtgatataaa tagaacctgc agcaggctct ggtaaatgat 420
gactacaagg tggactggga ggcagcccgg ccttggcagg catcatcctc taaatataaa 480
gatgagtttg ttcagccttt gcagaaggag gcgcgccgtc gacggatccg ggccagggga 540
cggtggcttc tacgtgcttg ggacgttccc agccaccgtc ccatgttccc ggcggggggc 600
cagctgtccc caccgccagc ccaactcagc acttggtcag ggtatcagct tggtgggggg 660
gcgtgagccc agcccctggg gcggctcagc ccatacaagg ccatggggct gggcgcaaag 720
catgcctggg ttcagggtgg gtatggtgcg ggagcaggga ggtgagaggc tcagctgccc 780
tccagaactc ctccctgggg acaacccctc ccagccaata gcacagccta ggtcccccta 840
tataaggcca cggctgctgg cccttccttt gggtcagtgt cacctccagg atacagacag 900
ccccccttca gcccagccca gccaggtacg gatccgtcga cggcgcgcca cgcgtcagtt 960
tactcaccag ggattcagag gcagcactgc tgaaccctga gcccttggca catcaggttg 1020
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<210> 13
<211> 1409
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE06-CRE04-Csk-SH5
<400> 13
gggccagggg acggtggctt ctacgtgctt gggacgttcc cagccaccgt cccatgttcc 60
cggcgggggg ccagctgtcc ccaccgccag cccaactcag cacttggtca gggtatcagc 120
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ccttttagag aatccacacc tgtcccagtt gctgggttcc actaccaaaa gtgaattgca 480
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gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagaggga caggcaccaa ctgggtaacc 720
tctgctgacc cccactctac tttaccataa gtagctccaa atccttctag aaaatctgaa 780
aggcatagcc ccatatatca gtgatataaa tagaacctgc agcaggctct ggtaaatgat 840
gactacaagg tggactggga ggcagcccgg ccttggcagg catcatcctc taaatataaa 900
gatgagtttg ttcagccttt gcagaaggag gatccgtcga cggcgcgcca cgcgtcagtt 960
tactcaccag ggattcagag gcagcactgc tgaaccctga gcccttggca catcaggttg 1020
gctgtcagaa gtcggccttt gtacatacac agttcccttg tgaggcccag ctgcgtgtcc 1080
taggagcggg gcctctctcc acagcagagc tcagcctctc aagtgtatgg acagcacggg 1140
tgcctgatgg gtggatttag ccatgagttg aaggtggctt ggggagaatg agagttctag 1200
agatagggag aaggggttgc caataggaga gtggaattcc tgagcacctc gtcacaggca 1260
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tccccacagc tccccccacc tccagccaca cacagcaggt ccttttgctc tttctggtcc 1380
cttctctact cctccccctc cctacctaa 1409
<210> 14
<211> 1893
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dph-CRE02-CRE04-CRE06-Csk-SH5
<400> 14
gacaggtgcg gttcccggag cgcaggcgca cacatgcacc caccggcgaa cgcggtgacc 60
ctcgccccac cccatcccct ccggcgggca actgggtcgg gtcaggaggg gcaaacccgc 120
tagggagaca ctccatatac ggcccggccc gcgttacctg ggaccgggcc aacccgctcc 180
ttctttggtc aacgcagggg acccgggcgg gggcccaggc cgcgaaccgg ccgagggagg 240
gggctctagt gcccaacacc caaatatggc tcgagaaggg cagcgacatt cctgcggggt 300
ggcgcggagg gaatgcccgc gggctatata aaacctgagc agagggacaa gcggccaccg 360
cagcggacag cgccaagtga agcctcgctt cccctccgcg gcgaccaggg cccgagccga 420
gagtagcagt tgtagctacc cgcccaggta ggggcgcgcc cgtacggtcg acggatcccc 480
ttttagagaa tccacacctg tcccagttgc tgggttccac taccaaaagt gaattgcaac 540
tattttagga gcacttaagc acatccgaaa aatgagtgat tctgttctgg cccacaccac 600
atcactgatg taccccctta aagcatgtcc ctgagttcat cacagaagac tgctcctcct 660
gtgccctcca caaggttaga actgtccttg tcttagggaa aaaggagaga gagagagaga 720
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagggaca ggcaccaact gggtaacctc 780
tgctgacccc cactctactt taccataagt agctccaaat ccttctagaa aatctgaaag 840
gcatagcccc atatatcagt gatataaata gaacctgcag caggctctgg taaatgatga 900
ctacaaggtg gactgggagg cagcccggcc ttggcaggca tcatcctcta aatataaaga 960
tgagtttgtt cagcctttgc agaaggaggc gcgccgtcga cggatccggg ccaggggacg 1020
gtggcttcta cgtgcttggg acgttcccag ccaccgtccc atgttcccgg cggggggcca 1080
gctgtcccca ccgccagccc aactcagcac ttggtcaggg tatcagcttg gtgggggggc 1140
gtgagcccag cccctggggc ggctcagccc atacaaggcc atggggctgg gcgcaaagca 1200
tgcctgggtt cagggtgggt atggtgcggg agcagggagg tgagaggctc agctgccctc 1260
cagaactcct ccctggggac aacccctccc agccaatagc acagcctagg tccccctata 1320
taaggccacg gctgctggcc cttcctttgg gtcagtgtca cctccaggat acagacagcc 1380
ccccttcagc ccagcccagc caggtacgga tccgtcgacc gtacgggcgc gccacgcgtc 1440
agtttactca ccagggattc agaggcagca ctgctgaacc ctgagccctt ggcacatcag 1500
gttggctgtc agaagtcggc ctttgtacat acacagttcc cttgtgaggc ccagctgcgt 1560
gtcctaggag cggggcctct ctccacagca gagctcagcc tctcaagtgt atggacagca 1620
cgggtgcctg atgggtggat ttagccatga gttgaaggtg gcttggggag aatgagagtt 1680
ctagagatag ggagaagggg ttgccaatag gagagtggaa ttcctgagca cctcgtcaca 1740
ggcagccgac agaacatgag ccgcagggcc caggctattt atacctcgcc tgtcactatc 1800
agggtcccca cagctccccc cacctccagc cacacacagc aggtcctttt gctctttctg 1860
gtcccttctc tactcctccc cctccctacc taa 1893
<210> 15
<211> 334
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spc5-12 promoter
<400> 15
tggccaccgc cttcggcacc atcctcacga cacccaaata tggcgacggg tgaggaatgg 60
tggggagtta tttttagagc ggtgaggaag gtgggcaggc agcaggtgtt ggcgctctaa 120
aaataactcc cgggagttat ttttagagcg gaggaatggt ggacacccaa atatggcgac 180
ggttcctcac ccgtcgccat atttgggtgt ccgccctcgg ccggggccgc attcctgggg 240
gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg ggccggcggc ggcccacgag 300
ctacccggag gagcgggagg cgccaagctc taga 334
<210> 16
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MVM intron
<400> 16
aagaggtaag ggtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa ttacctggag 60
cacctgcctg aaatcacttt ttttcaggtt gg 92
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pA signal
<400> 17
aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49
<210> 18
<211> 957
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
atggcggcag cggcggcggc ggctgcagaa cagcaaagtt ccaatggtcc tgtaaagaag 60
tccatgcgtg agaaggctgt tgagagaagg agtgtcaata aagagcacaa cagtaacttt 120
aaagctggat acattccgat tgatgaagat cgtctccaca aaacagggtt gagaggaaga 180
aagggcaatt tagccatctg tgtgattatc ctcttgttta tcctggctgt catcaattta 240
ataataacac ttgttatttg ggccgtgatt cgcattggac caaatggctg tgatagtatg 300
gagtttcatg aaagtggcct gcttcgattt aagcaagtat ctgacatggg agtgatccac 360
cctctttata aaagcacagt aggaggaagg cgaaatgaaa atttggtcat cactggcaac 420
aaccagccta ttgtttttca gcaagggaca acaaagctca gtgtagaaaa caacaaaact 480
tctattacaa gtgacatcgg catgcagttt tttgacccga ggactcaaaa tatcttattc 540
agcacagact atgaaactca tgagtttcat ttgccaagtg gagtgaaaag tttgaatgtt 600
caaaaggcat ctactgaaag gattaccagc aatgctacca gtgatttaaa tataaaagtt 660
gatgggcgtg ctattgtgcg tggaaatgaa ggtgtattca ttatgggcaa aaccattgaa 720
tttcacatgg gtggtaatat ggagttaaag gcggaaaaca gtatcatcct aaatggatct 780
gtgatggtca gcaccacccg cctacccagt tcctccagtg gagaccagtt gggtagtggt 840
gactgggtac gctacaagct ctgcatgtgt gctgatggga cgctcttcaa ggtgcaagta 900
accagccaga acatgggctg ccaaatctca gacaacccct gtggaaacac tcattaa 957
<210> 19
<211> 957
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized beta-sarcoglycan gene
<400> 19
atggctgctg ccgctgctgc tgcagctgaa cagcaatcta gcaacggccc cgtgaagaaa 60
tccatgcgcg agaaggccgt cgagcggaga tctgtgaaca aagagcacaa cagcaacttc 120
aaggccggct acatccccat cgacgaggac agactgcaca agacaggcct gagaggcaga 180
aagggcaatc tggccatctg cgtgatcatc ctgctgttca tcctggccgt gatcaacctg 240
atcatcaccc tggtcatctg ggccgtgatt agaatcggcc ccaacggctg cgacagcatg 300
gaatttcacg agagcggcct gctgcggttc aaacaggtgt ccgatatggg cgtgatccat 360
ccactgtaca agagcaccgt tggcggcaga agaaacgaga atctggtcat caccggcaac 420
aaccagccta tcgtgtttca gcagggcacc accaagctga gcgtggaaaa caacaagacc 480
agcatcacca gcgacatcgg catgcagttc ttcgacccca gaacacagaa catcctgttc 540
agcaccgact acgagacaca cgagttccat ctgcctagcg gcgtgaagtc cctgaatgtg 600
cagaaggcca gcaccgagag aatcaccagc aatgccacct ccgacctgaa catcaaagtg 660
gacggcagag ccatcgtgcg gggaaatgag ggcgtgttca tcatgggcaa gaccatcgag 720
ttccacatgg gcggcaacat ggaactgaag gccgagaaca gcatcatcct gaacggcagc 780
gtgatggtgt ccaccacaag actgccaagc agcagctctg gcgatcagct tggatctggc 840
gactgggtcc gatacaagct gtgtatgtgt gccgacggca ccctgttcaa ggtgcaagtg 900
acaagccaga acatgggctg ccagatcagc gacaaccctt gcggcaatac ccactga 957
<210> 20
<211> 1653
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> luciferase gene
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caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 5100
tttgctggcc ttttgctc 5118
<210> 47
<211> 5572
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV- CSK-SH5-SPc5-12-MVM-Luc-pA
<400> 47
acatgtcctg caggcagctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg 60
ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag 120
tggccaactc catcactagg ggttcctgcg gccggcgcgc cacgcgtcag tttactcacc 180
agggattcag aggcagcact gctgaaccct gagcccttgg cacatcaggt tggctgtcag 240
aagtcggcct ttgtacatac acagttccct tgtgaggccc agctgcgtgt cctaggagcg 300
gggcctctct ccacagcaga gctcagcctc tcaagtgtat ggacagcacg ggtgcctgat 360
gggtggattt agccatgagt tgaaggtggc ttggggagaa tgagagttct agagataggg 420
agaaggggtt gccaatagga gagtggaatt cctgagcacc tcgtcacagg cagccgacag 480
aacatgagcc gcagggccca ggctatttat acctcgcctg tcactatcag ggtccccaca 540
gctcccccca cctccagcca cacacagcag gtccttttgc tctttctggt cccttctcta 600
ctcctccccc tccctaccta aggtacccaa cgcgttacgt ggccaccgcc ttcggcacca 660
tcctcacgac acccaaatat ggcgacgggt gaggaatggt ggggagttat ttttagagcg 720
gtgaggaagg tgggcaggca gcaggtgttg gcgctctaaa aataactccc gggagttatt 780
tttagagcgg aggaatggtg gacacccaaa tatggcgacg gttcctcacc cgtcgccata 840
tttgggtgtc cgccctcggc cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg 900
cctcgataaa aggctccggg gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc 960
gccaagctct agatctagaa agaggtaagg gtttaaggga tggttggttg gtggggtatt 1020
aatgtttaat tacctggagc acctgcctga aatcactttt tttcaggttg gaagcttatg 1080
gaagatgcca aaaacattaa gaagggccca gcgccattct acccactcga ggacgggacc 1140
gccggcgagc agctgcacaa agccatgaag cgctacgccc tggtgcccgg caccatcgcc 1200
tttaccgacg cacatatcga ggtggacatt acctacgccg agtacttcga gatgagcgtt 1260
cggctggcag aagctatgaa gcgctatggg ctgaatacaa accatcggat cgtggtgtgc 1320
agcgagaata gcttgcagtt cttcatgccc gtgttgggtg ccctgttcat cggtgtggct 1380
gtggccccag ctaacgacat ctacaacgag cgcgagctgc tgaacagcat gggcatcagc 1440
cagcccaccg tcgtattcgt gagcaagaaa gggctgcaaa agatcctcaa cgtgcaaaag 1500
aagctaccga tcatacaaaa gatcatcatc atggatagca agaccgacta ccagggcttc 1560
caaagcatgt acaccttcgt gacttcccat ttgccacccg gcttcaacga gtacgacttc 1620
gtgcccgaga gcttcgaccg ggacaaaacc atcgccctga tcatgaacag tagtggcagt 1680
accggattgc ccaagggcgt agccctaccg caccgcaccg cttgtgtccg attcagtcat 1740
gcccgcgacc ccatcttcgg caaccagatc atccccgaca ccgctatcct cagcgtggtg 1800
ccatttcacc acggcttcgg catgttcacc acgctgggct acttgatctg cggctttcgg 1860
gtcgtgctca tgtaccgctt cgaggaggag ctattcttgc gcagcttgca agactataag 1920
attcaatctg ccctgctggt gcccacacta tttagcttct tcgctaagag cactctcatc 1980
gacaagtacg acctaagcaa cttgcacgag atcgccagcg gcggggcgcc gctcagcaag 2040
gaggtaggtg aggccgtggc caaacgcttc cacctaccag gcatccgcca gggctacggc 2100
ctgacagaaa caaccagcgc cattctgatc acccccgaag gggacgacaa gcctggcgca 2160
gtaggcaagg tggtgccctt cttcgaggct aaggtggtgg acttggacac cggtaagaca 2220
ctgggtgtga accagcgcgg cgagctgtgc gtccgtggcc ccatgatcat gagcggctac 2280
gttaacaacc ccgaggctac aaacgctctc atcgacaagg acggctggct gcacagcggc 2340
gacatcgcct actgggacga ggacgagcac ttcttcatcg tggaccggct gaagagcctg 2400
atcaaataca agggctacca ggtagcccca gccgaactgg agagcatcct gctgcaacac 2460
cccaacatct tcgacgccgg ggtcgccggc ctgcccgacg acgatgccgg cgagctgccc 2520
gccgcagtcg tcgtgctgga acacggtaaa accatgaccg agaaggagat cgtggactat 2580
gtggccagcc aggttacaac cgccaagaag ctgcgcggtg gtgttgtgtt cgtggacgag 2640
gtgcctaaag gactgaccgg caagttggac gcccgcaaga tccgcgagat tctcattaag 2700
gccaagaagg gcggcaagat cgccgtgtaa ttcgaaacgt tcggtccatc ttgagcatct 2760
gacttctggc taaataaaag atctttattt tcattagatc tgtgtgttgg ttttttgtgt 2820
gcgtcgagat ccacggccgc aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 2880
cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg 2940
ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag gggcgcctga tgcggtattt 3000
tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatacgt caaagcaacc atagtacgcg 3060
ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca 3120
cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc 3180
gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct 3240
ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat ttgggtgatg gttcacgtag tgggccatcg 3300
ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc 3360
ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcgggct attcttttga tttataaggg 3420
attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg 3480
aattttaaca aaatattaac gtttacaatt ttatggtgca ctctcagtac aatctgctct 3540
gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 3600
gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 3660
tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc 3720
ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt 3780
cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 3840
ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 3900
agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 3960
tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 4020
gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 4080
gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 4140
attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 4200
gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 4260
agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 4320
ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 4380
cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 4440
gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 4500
cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 4560
gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 4620
ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 4680
acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 4740
ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 4800
aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 4860
aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 4920
ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 4980
ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 5040
actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc 5100
caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 5160
gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 5220
ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 5280
cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 5340
cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 5400
acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 5460
ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 5520
gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tc 5572
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Luc Forward primer for titration
<400> 48
cccaccgtcg tattcgtgag 20
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Luc Reverse primer for titration
<400> 49
tcagggcgat ggttttgtcc c 21
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-sarcoglycan Forward primer for titration
<400> 50
agggatggtt ggttggtgg 19
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-sarcoglycan Reverse primer for titration
<400> 51
ggcaggtgct ccaggtaat 19
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-sarcoglycan Forward primer for RT-PCR
<400> 52
catcacaagt gacatcggca 20
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-sarcoglycan Reverse primer for RT-PCR
<400> 53
tggcagccca tgttctggc 19
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Forward primer for RT-PCR
<400> 54
tgtgtccgtc gtggatctga 20
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Reverse primer for RT-PCR
<400> 55
gcctgcttca ccaccttctt ga 22
<210> 56
<211> 798
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCK7 promoter
<400> 56
tagttcatag cccatatatg gagttccgct agaagctgca tgtctaagct agacccttca 60
gattaaaaat aactgaggta agggcctggg taggggaggt ggtgtgagac gctcctgtct 120
ctcctctatc tgcccatcgg ccctttgggg aggaggaatg tgcccaagga ctaaaaaaag 180
gccatggagc cagaggggcg agggcaacag acctttcatg ggcaaacctt ggggccctgc 240
tgtctagcat gccccactac gggtctaggc tgcccatgta aggaggcaag gcctggggac 300
acccgagatg cctggttata attaacccag acatgtggct gccccccccc ccccaacacc 360
tgctgcctct aaaaataacc ctgtccctgg tggatcccct gcatgcgaag atcttcgaac 420
aaggctgtgg gggactgagg gcaggctgta acaggcttgg gggccagggc ttatacgtgc 480
ctgggactcc caaagtatta ctgttccatg ttcccggcga agggccagct gtcccccgcc 540
agctagactc agcacttagt ttaggaacca gtgagcaagt cagcccttgg ggcagcccat 600
acaaggccat ggggctgggc aagctgcacg cctgggtccg gggtgggcac ggtgcccggg 660
caacgagctg aaagctcatc tgctctcagg ggcccctccc tggggacagc ccctcctggc 720
tagtcacacc ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc cctcattcta 780
ccaccacctc cacagcac 798
<210> 57
<211> 1426
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> desmin promoter
<400> 57
acacacctac tagtaacccc tccagctggt gatggcaggt ctagggtagg accagtgact 60
ggctcctaat cgagcactct attttcaggg tttgcattcc aaaagggtca ggtccaagag 120
ggacctggag tgccaagtgg aggtgtagag gcacggccag tacccatgga gaatggtgga 180
tgtccttagg ggttagcaag tgccgtgtgc taaggagggg gctttggagg ttgggcaggc 240
cctctgtggg gctccatttt tgtgggggtg ggggctggag cattataggg ggtgggaagt 300
gattggggct gtcaccctag ccttccttat ctgacgccca cccatgcctc ctcaggtacc 360
ccctgccccc cacagctcct ctcctgtgcc ttgtttccca gccatgcgtt ctcctctata 420
aatacccgct ctggtatttg gggttggcag ctgttgctgc cagggagatg gttgggttga 480
catgcggctc ctgacaaaac acaaacccct ggtgtgtgtg ggcgtgggtg gtgtgagtag 540
ggggatgaat cagggagggg gcgggggacc cagggggcag gagccacaca aagtctgtgc 600
gggggtggga gcgcacatag caattggaaa ctgaaagctt atcagaccct ttctggaaat 660
cagcccactg tttataaact tgaggcccca ccctcgacag taccggggag gaagagggcc 720
tgcactagtc cagagggaaa ctgaggctca gggctagctc gcccatagac atacatggca 780
ggcaggcttt ggccaggatc cctccgcctg ccaggcgtct ccctgccctc ccttcctgcc 840
tagagacccc caccctcaag cctggctggt ctttgcctga gacccaaacc tcttcgactt 900
caagagaata tttaggaaca aggtggttta gggcctttcc tgggaacagg ccttgaccct 960
ttaagaaatg acccaaagtc tctccttgac caaaaagggg accctcaaac taaagggaag 1020
cctctcttct gctgtctccc ctgaccccac tcccccccac cccaggacga ggagataacc 1080
agggctgaaa gaggcccgcc tgggggctgc agacatgctt gctgcctgcc ctggcgaagg 1140
attggcaggc ttgcccgtca caggaccccc gctggctgac tcaggggcgc aggcctcttg 1200
cgggggagct ggcctccccg cccccacggc cacgggccgc cctttcctgg caggacagcg 1260
ggatcttgca gctgtcaggg gaggggaggc gggggctgat gtcaggaggg atacaaatag 1320
tgccgacggc tgggggccct gtctcccctc gccgcatcca ctctccggcc ggccgcctgc 1380
ccgccgcctc ctccgtgcgc ccgccagcct cgcccgcgcc gtcacc 1426
<210> 58
<211> 2859
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 58
atgggagtga ggcacccgcc ctgctcccac cggctcctgg ccgtctgcgc cctcgtgtcc 60
ttggcaaccg ctgcactcct ggggcacatc ctactccatg atttcctgct ggttccccga 120
gagctgagtg gctcctcccc agtcctggag gagactcacc cagctcacca gcagggagcc 180
agcagaccag ggccccggga tgcccaggca caccccggcc gtcccagagc agtgcccaca 240
cagtgcgacg tcccccccaa cagccgcttc gattgcgccc ctgacaaggc catcacccag 300
gaacagtgcg aggcccgcgg ctgttgctac atccctgcaa agcaggggct gcagggagcc 360
cagatggggc agccctggtg cttcttccca cccagctacc ccagctacaa gctggagaac 420
ctgagctcct ctgaaatggg ctacacggcc accctgaccc gtaccacccc caccttcttc 480
cccaaggaca tcctgaccct gcggctggac gtgatgatgg agactgagaa ccgcctccac 540
ttcacgatca aagatccagc taacaggcgc tacgaggtgc ccttggagac cccgcatgtc 600
cacagccggg caccgtcccc actctacagc gtggagttct ccgaggagcc cttcggggtg 660
atcgtgcgcc ggcagctgga cggccgcgtg ctgctgaaca cgacggtggc gcccctgttc 720
tttgcggacc agttccttca gctgtccacc tcgctgccct cgcagtatat cacaggcctc 780
gccgagcacc tcagtcccct gatgctcagc accagctgga ccaggatcac cctgtggaac 840
cgggaccttg cgcccacgcc cggtgcgaac ctctacgggt ctcacccttt ctacctggcg 900
ctggaggacg gcgggtcggc acacggggtg ttcctgctaa acagcaatgc catggatgtg 960
gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac 1020
atcttcctgg gcccagagcc caagagcgtg gtgcagcagt acctggacgt tgtgggatac 1080
ccgttcatgc cgccatactg gggcctgggc ttccacctgt gccgctgggg ctactcctcc 1140
accgctatca cccgccaggt ggtggagaac atgaccaggg cccacttccc cctggacgtc 1200
cagtggaacg acctggacta catggactcc cggagggact tcacgttcaa caaggatggc 1260
ttccgggact tcccggccat ggtgcaggag ctgcaccagg gcggccggcg ctacatgatg 1320
atcgtggatc ctgccatcag cagctcgggc cctgccggga gctacaggcc ctacgacgag 1380
ggtctgcgga ggggggtttt catcaccaac gagaccggcc agccgctgat tgggaaggta 1440
tggcccgggt ccactgcctt ccccgacttc accaacccca cagccctggc ctggtgggag 1500
gacatggtgg ctgagttcca tgaccaggtg cccttcgacg gcatgtggat tgacatgaac 1560
gagccttcca acttcatcag gggctctgag gacggctgcc ccaacaatga gctggagaac 1620
ccaccctacg tgcctggggt ggttgggggg accctccagg cggccaccat ctgtgcctcc 1680
agccaccagt ttctctccac acactacaac ctgcacaacc tctacggcct gaccgaagcc 1740
atcgcctccc acagggcgct ggtgaaggct cgggggacac gcccatttgt gatctcccgc 1800
tcgacctttg ctggccacgg ccgatacgcc ggccactgga cgggggacgt gtggagctcc 1860
tgggagcagc tcgcctcctc cgtgccagaa atcctgcagt ttaacctgct gggggtgcct 1920
ctggtcgggg ccgacgtctg cggcttcctg ggcaacacct cagaggagct gtgtgtgcgc 1980
tggacccagc tgggggcctt ctaccccttc atgcggaacc acaacagcct gctcagtctg 2040
ccccaggagc cgtacagctt cagcgagccg gcccagcagg ccatgaggaa ggccctcacc 2100
ctgcgctacg cactcctccc ccacctctac acactgttcc accaggccca cgtcgcgggg 2160
gagaccgtgg cccggcccct cttcctggag ttccccaagg actctagcac ctggactgtg 2220
gaccaccagc tcctgtgggg ggaggccctg ctcatcaccc cagtgctcca ggccgggaag 2280
gccgaagtga ctggctactt ccccttgggc acatggtacg acctgcagac ggtgccagta 2340
gaggcccttg gcagcctccc acccccacct gcagctcccc gtgagccagc catccacagc 2400
gaggggcagt gggtgacgct gccggccccc ctggacacca tcaacgtcca cctccgggct 2460
gggtacatca tccccctgca gggccctggc ctcacaacca cagagtcccg ccagcagccc 2520
atggccctgg ctgtggccct gaccaagggt ggggaggccc gaggggagct gttctgggac 2580
gatggagaga gcctggaagt gctggagcga ggggcctaca cacaggtcat cttcctggcc 2640
aggaataaca cgatcgtgaa tgagctggta cgtgtgacca gtgagggagc tggcctgcag 2700
ctgcagaagg tgactgtcct gggcgtggcc acggcgcccc agcaggtcct ctccaacggt 2760
gtccctgtct ccaacttcac ctacagcccc gacaccaagg tcctggacat ctgtgtctcg 2820
ctgttgatgg gagagcagtt tctcgtcagc tggtgttag 2859
<210> 59
<211> 2859
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized human acid alpha-glucosidase gene (hGAAco)
<400> 59
atgggcgtca gacatcctcc atgttctcac agactgctgg ccgtgtgtgc tctggtgtct 60
cttgctacag ctgccctgct gggacatatc ctgctgcacg attttctgct ggtgcccaga 120
gagctgtctg gcagctctcc tgtgctggaa gaaacacacc ctgcacatca gcagggcgcc 180
tctagacctg gacctagaga tgctcaagcc catcctggca gacctagagc cgtgcctaca 240
cagtgtgacg tgccacctaa cagcagattc gactgcgccc ctgacaaggc catcacacaa 300
gagcagtgtg aagccagagg ctgctgctac attcctgcca aacaaggact gcagggcgct 360
cagatgggac agccttggtg cttcttccca ccatcttacc ccagctacaa gctggaaaac 420
ctgagcagca gcgagatggg ctacaccgcc acactgacca gaaccacacc tacattcttc 480
ccaaaggaca tcctgacact gcggctggac gtgatgatgg aaaccgagaa ccggctgcac 540
ttcaccatca aggaccccgc caatagaaga tacgaggtgc ccctggaaac ccctcacgtg 600
cactctagag ccccatctcc actgtacagc gtggaattca gcgaggaacc ctttggcgtg 660
atcgtgcgga gacagctgga tggcagagtg ctgctgaata ccacagtggc ccctctgttc 720
ttcgccgacc agtttctgca gctgagcaca agcctgccta gccagtatat cacaggcctg 780
gccgaacacc tgtctccact gatgctgagc accagctgga ccagaatcac cctgtggaac 840
agagatctgg cccctacacc tggcgccaat ctgtacggct ctcacccttt ttatctggcc 900
ctggaagatg gcggaagcgc ccacggtgtc tttctgctga acagcaacgc catggacgtg 960
gtgctgcaac catctcctgc tctgtcttgg agaagcaccg gcggcatcct ggacgtgtac 1020
atctttctgg gacccgagcc taagagcgtg gtgcagcagt atctggatgt cgtgggctac 1080
cccttcatgc ctccttattg gggcctgggc ttccacctgt gtagatgggg atacagctcc 1140
accgccatca ccagacaggt ggtggaaaac atgacccggg ctcacttccc actggatgtg 1200
cagtggaacg acctggacta catggactcc agacgggact tcacctttaa caaggacggc 1260
ttcagagact tccccgccat ggtgcaagaa ctgcatcaag gcggcagacg gtacatgatg 1320
atcgtggatc ctgccatctc ttctagcggc cctgccggaa gctacagacc ttatgatgag 1380
ggcctgagaa gaggcgtgtt catcaccaat gagacaggcc agcctctgat cggcaaagtg 1440
tggcctggaa gcaccgcctt tccagacttc accaatccaa ccgctctggc ttggtgggaa 1500
gatatggtgg ccgagttcca cgatcaggtg cccttcgatg gcatgtggat cgacatgaac 1560
gagcccagca acttcatcag gggcagcgag gatggctgcc ccaacaacga actggaaaat 1620
cctccttacg tgccaggcgt tgtcggagga acactgcagg ccgccacaat ttgtgccagc 1680
agccatcagt ttctgagcac ccactacaac ctgcacaacc tgtacggcct gaccgaggcc 1740
attgcctctc atagagccct ggttaaggcc agaggcaccc ggccttttgt gatcagcaga 1800
agcacatttg ccggccacgg cagatatgcc ggacattgga caggggacgt ttggtctagt 1860
tgggagcagc tggcctctag cgtgcccgag atcctgcagt ttaatctgct gggagtgccc 1920
ctcgtgggag ccgatgtttg tggatttctg ggcaacacct ccgaggaact gtgcgtcaga 1980
tggacacagc tgggcgcctt ctatcccttc atgagaaacc acaacagcct gctgagcctg 2040
cctcaagagc cttacagctt tagcgaaccc gcacagcagg ccatgagaaa ggccctgact 2100
ctgagatacg ctctgctgcc ccacctgtac accctgtttc atcaagctca tgtggccggc 2160
gagacagtgg ccagaccact gtttctggaa ttccccaagg acagcagcac ctggacagtg 2220
gatcatcagc tgctctgggg agaagccctg ctcattacac ctgtgctgca ggctggcaag 2280
gccgaagtga caggatactt tcccctcggc acttggtacg acctgcagac agttcctgtg 2340
gaagctctgg gatctctgcc tccacctcct gctgctccta gagagcctgc cattcactct 2400
gaaggccagt gggttacact gcccgctcca ctggacacca tcaatgtgca cctgagagcc 2460
ggctacatca tccctctgca aggccctgga ctgaccacaa ccgaaagcag acagcagcca 2520
atggctctgg ccgtggctct gacaaaaggc ggagaagcta gaggcgaact gttctgggat 2580
gacggcgaga gcctggaagt gctggaacgg ggagcctaca cacaagtgat ctttctcgcc 2640
cggaacaaca ccatcgtgaa cgaactcgtc agagtgacca gtgaaggtgc cggactgcag 2700
ctccagaaag tgacagtgct tggagtggcc acagcacccc agcaggtttt gtctaatggc 2760
gtgcccgtgt ccaacttcac atacagccct gacaccaagg tgctggacat ctgtgtgtct 2820
ctgctgatgg gcgagcagtt cctggtgtcc tggtgttga 2859
Claims (15)
- 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편, 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편, 및 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편으로부터 선택된 적어도 2개의 횡경막 특이적 조절 요소; 및 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하는, 근육 특이적 유전자 발현을 향상시키기 위한 핵산 조절 요소.
- 제1항에 있어서, 적어도 다음을 포함하는 핵산 조절 요소:
a) 서열 번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE06)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편;
b) 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CSk-SH5)로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편; 및
c1) 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE02)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편, 또는
c2) 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, Dph-CRE04)로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편, 또는
c3) c1) 및 c2)의 횡격막 특이적 조절 요소 모두. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 7(Dph-CRE04-CRE06) 또는 서열 번호 8(Dph-CRE06-CRE04)에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 및 서열 번호 1(CSk-SH5)에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 심장- 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 핵산 조절 요소.
- 제3항에 있어서, 서열 번호 9(Dph-CRE02-CRE04-CRE06)에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 횡격막 특이적 조절 요소 및 서열 번호 1(CSk-SH5)에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 심장 및 골격근 특이적 조절 요소 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 핵산 조절 요소.
- 제4항에 있어서, 서열 번호 14(Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 조절 요소.
- 근육 세포 또는 조직, 바람직하게는 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 세포 또는 조직, 보다 바람직하게는 횡격막, 심장 및/또는 골격근 세포 또는 조직에서 유전자 발현을 향상시키기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 조절 요소의 시험관내 또는 생체외 용도.
- 프로모터 및 이식유전자, 바람직하게는 코돈-최적화된 이식유전자에 작동가능하게 연결된 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 조절 요소를 포함하는 핵산 발현 카세트.
- 제7항에 있어서, 프로모터가 근육 특이적 프로모터, 바람직하게는 서열 번호 15에 의해 정의된 바와 같은 Spc5-12 프로모터인, 핵산 발현 카세트.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 이식유전자가 사르코글리칸, 바람직하게는 β-사르코글리칸, 보다 바람직하게는 인간 β-사르코글리칸을 인코딩하는, 핵산 발현 카세트.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 조절 요소가 서열 번호 14 (Dph-CRE02 - Dph-CRE04 - Dph-CRE06 - CSk-SH5)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 프로모터는 서열 번호 15에 의해 정의된 바와 같은 Spc5-12 프로모터이고, 이식유전자는 β-사르코글리칸을 인코딩하고, 바람직하게는 발현 카세트는 서열 번호 16에 제시된 바와 같은 미세 마우스 바이러스(Minute Virus of Mouse: MVM) 인트론 및 서열 번호 17에 의해 정의된 바와 같은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는, 핵산 발현 카세트.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 조절 요소, 또는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 보다 바람직하게는 AAV9 벡터.
- 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 핵산 발현 카세트, 또는 제11항에 따른 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 의약, 바람직하게는 유전자 치료, 보다 바람직하게는 근육 지향적 유전자 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 조절 요소, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 핵산 발현 카세트, 제11항에 따른 벡터, 또는 제12항에 따른 약학적 조성물.
- 지대 근이영양증(limb girdle muscular dystrophy), 바람직하게는 지대 근이영양증 유형 2E(LGMD2E)의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 조절 요소, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 핵산 발현 카세트, 제11항에 따른 벡터, 또는 제12항에 따른 약학적 조성물.
- 근육 세포, 바람직하게는 횡격막, 평활근, 심장 및/또는 골격근 세포, 보다 바람직하게는 횡격막, 심장 및/또는 골격근 세포에서 이식유전자 산물을 발현시키는 방법, 바람직하게는 시험관내 또는 생체외 방법으로서,
- 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 핵산 발현 카세트 또는 제11항에 따른 벡터를 상기 근육 세포에 도입하는 단계;
- 상기 근육 세포에서 이식유전자 산물을 발현하는 단계를 포함하는,
방법.
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