CN114990157B - 用于构建lmna基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于构建LMNA基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。用于构建LMNA基因突变的基因编辑系统，其特征在于包含Cas9蛋白、LMNA‑T7‑gRNA1、LMNA‑T7‑gRNA3；所述的LMNA‑T7‑gRNA1的转录模板如SEQ ID NO.24所示，LMNA‑T7‑gRNA3的转录模板如SEQ ID NO.25所示；所述的基因编辑系统还包含核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的单链DNA作为Donor DNA。利用本发明所得到的靶基因突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。

Description

用于构建LMNA基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细 胞的基因编辑系统及其应用
技术领域：
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及CRISPR/Cas9系统及ssODN同源重组技术在构建LMNA基因点突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞中的应用。
背景技术：
扩张型心肌病(DCM，dilated cardiomyopathy，又称充血性心肌病)是一种原因未明的原发性心肌疾病。病征为左或右心室或双侧心室扩大，并伴有心室收缩功能减退，伴或不伴充血性心力衰竭，室性或房性心律失常多见。病情呈进行性加重，死亡可发生于疾病的任何阶段。
临床表现患者以中年人居多。起病多缓慢，有时可达10年以上。症状以充血性心力衰竭为主，其中以气短和水肿最为常见。此外，尚可有脑、肾、肺等处的栓塞。已经在30％至40％的DCM患者中发现了遗传病因，但其中只有50％与已知的致病基因变异相关。在所有DCM病例中，约有6％是由LMNA基因(定位于人1q21.2)突变引起的。Lamin A/C(层粘蛋白A和C)是LMNA基因的两个可变剪接产物，在所有体细胞中均有表达。LMNA中的突变多以组织特有的方式发生，大多数引起骨骼肌受累的心肌病。超过200种不同的LMNA突变已被证实与遗传性心肌病有关，主要是DCM，且主要以常染色体显性方式遗传，但也有报道常染色体隐性病例，已经确认可致病的点突变包括R60G、L85R、N195K、E203K、E203G、R225X、R571S、R644C等数十种。DCM在出现心室扩张的证据之前，可能与传导系统疾病有关，而LMNA突变引起的心脏传导系统疾病包括窦房结疾病、房性心律不齐、房室心脏传导阻滞和室性心律失常等。
DCM动物模型的构建将为研究及治疗人类DCM提供有力的实验工具。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，且猪体型大小和器官功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。因此，研发出人类DCM猪模型用于进行药物筛选、药效检测、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类DCM提供有力的实验手段。
基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供用于构建LMNA基因突变的基因编辑系统。
本发明的另一目的是提供基因编辑系统的应用。
本发明的又一目的是提供一种重组细胞及其应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：用于构建LMNA基因突变的基因编辑系统，包含Cas9蛋白、LMNA-T7-gRNA1、LMNA-T7-gRNA3；所述的LMNA-T7-gRNA1的转录模板如SEQ ID NO.24所示，LMNA-T7-gRNA3的转录模板如SEQ ID NO.25所示。
作为本发明的一种优选，所述的基因编辑系统，还包含核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示单链DNA作为Donor DNA。
作为本发明的一种优选，所述的Cas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4中第5701-9801位核苷酸所示。
作为本发明的进一步优选，所述的Cas9蛋白由SEQ ID NO.4所示的pKG-GE4质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后对菌体粗提、Ni-NTA琼脂糖柱纯化获得融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS，并经带his标签的重组牛肠激酶(EK)酶切该融合蛋白，最后分离纯化Cas9蛋白所得。
作为本发明的进一步优选，所述的基因编辑系统中Cas9蛋白：LMNA-T7-gRNA1：LMNA-T7-gRNA3的质量比为4:1:1。
本发明所述的基因编辑系统在制备LMNA基因突变的猪重组细胞中的应用。
一种重组细胞，由本发明所述的基因编辑系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。
本发明所述的重组细胞在构建LMNA基因突变的扩张型心肌病模型猪中的应用。
一种表达Cas9蛋白的pKG-GE4质粒，质粒全序列如SEQ ID NO.4所示。
一种Cas9蛋白，由本发明所述的pKG-GE4质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后对菌体粗提、Ni-NTA琼脂糖柱纯化获得融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS，并经带his标签的重组牛肠激酶酶切该融合蛋白，最后分离纯化Cas9蛋白所得。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。
大小鼠等啮齿类动物不论从生理、病理及体型上，均与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。灵长类动物扩繁速度慢、数量少、成本高，动物保护及伦理等方面的要求也较高。而猪就没有上述缺点，同时猪的克隆技术非常成熟，饲养及克隆成本较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。
(2)本发明所构建的pET32a-T7lac-phoA:SP-TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS-T7ter(简称pKG-GE4)载体，使用了能够高效表达目的蛋白的强启动子T7lac来进行目的蛋白的表达，用细菌周质蛋白碱性磷酸酶(phoA)的信号肽来引导目的蛋白分泌表达至细菌周质腔中，从而与细菌胞内蛋白分离，且分泌到细菌周质腔中的目的蛋白为可溶性表达。同时还采用硫氧还原蛋白TrxA与cas9蛋白融合表达，TrxA能帮助所共表达的目的蛋白形成二硫键，提高蛋白的稳定性、折叠的正确性，增加目的蛋白的溶解性及活性。为了方便目的蛋白的纯化，设计了His标签，可以通过一步法Ni柱亲和层析纯化目的蛋白，极大地简化了目的蛋白的纯化流程。同时在His标签后设计了一个肠激酶酶切位点，便于切除所融合的TrxA-His多肽片段，得到天然形式的cas9蛋白。利用带His标签的肠激酶酶切融合蛋白后，可通过一次亲和层析除去TrxA-His多肽片段及带His标签的肠激酶，得到天然形式的cas9蛋白，避免了多次纯化透析对目的蛋白的伤害和损耗。同时，本发明也在cas9的N端及C端分别设计了两个NLS位点，使cas9能更有效地进入细胞核进行基因编辑。另外，本发明选择了E.coliBL21(DE3)菌株为目的蛋白表达菌株，该菌株可高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET-32a)的外源基因。同时，对于cas9蛋白的密码子，本发明进行了密码子优化，使之完全适应表达菌株的密码子偏好，从而提高目的蛋白的表达水平。另外，本发明在细菌生长至一定数量后，再用IPTG在低温下诱导目的蛋白的表达，可避免目的蛋白过早表达对宿主菌生长的影响，低温下诱导表达也显著提高所表达的目的蛋白的可溶性。经过上述各项优化设计及实验实施，所得到的cas9蛋白活性比商品cas9蛋白有了极显著的提高。
(3)采用本发明构建并表达的Cas9高效蛋白联合体外转录的gRNA进行基因编辑，并对Cas9和gRNA的最佳摩尔配比进行了优化，配合合成的ssODN作为Donor，最终获得靶位点点突变的效率高达17.5％，远高于常规的点突变效率(<5％)。
(4)利用本发明所得到的靶基因突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。
在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得纯合突变后代的概率非常低(低于5％)，需要进行后代的杂交选育，这不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。因此，本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。
本发明为通过基因编辑手段获得扩张型心肌病猪模型奠定了坚实的基础，将有助于研究并揭示DCM发病机制，也可用于进行药物筛选、药效检测、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，进而为成功治疗人类DCM提供有力的实验手段。本发明对于扩张型心肌病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
附图说明
图1为质粒pX330的结构示意图。
图2为质粒pKG-GE3的结构示意图。
图3为质粒pKG-U6gRNA的结构图谱。
图4为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。
图5为质粒pET-32a的结构图谱。
图6为质粒pKG-GE4的结构示意图。
图7为实施例3中步骤3.3.3的电泳图。
图8为实施例3中步骤3.4.3的电泳图。
图9为实施例4中步骤4.2.3的电泳图。
图10为实施例4中步骤4.2.4的电泳图。
图11为实施例4中步骤4.6.4的电泳图。
图12为实施例5中步骤5.1.3的电泳图。
图13为实施例5中步骤5.6.3的电泳图。
图14为实施例5中步骤5.6.4判定为野生型的示例性测序峰图。
图15为实施例5中步骤5.6.4判定为杂合突变型的示例性测序峰图。
图16为实施例5中步骤5.6.4判定为双等位基因不同变异的纯合突变型示例性测序峰图。
图17为实施例5中步骤5.6.4判定为双等位基因相同变异的纯合突变型示例性测序峰图。
图18为实施例5中步骤5.6.4判定为靶标位点点突变的杂合突变型示例性测序峰图。
图19为实施例5中步骤5.6.4判定为靶标位点点突变的纯合突变型示例性测序峰图。
具体实施方式
实施例1、质粒的构建
出发质粒为pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称质粒pX330)，序列如SEQID NO.1所示，结构示意图见图1。SEQ ID NO.1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。
构建质粒pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)，序列如SEQ ID NO.2所示，结构示意图见图2。SEQ ID NO.2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO.2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。
与质粒pX330相比，所构建的质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
构建质粒pKG-U6gRNA，序列如SEQ ID NO.3所示，结构示意图见图3。SEQ ID NO.3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，示意图见图4,在细胞中重组质粒转录得到gRNA。
质粒pKG-GE4是以质粒pET-32a作为骨架进行改造而来，主要改造如下：①保留了TrxA蛋白的编码区域，可以帮助所表达的目的蛋白形成二硫键，增加目的蛋白溶解性及活性，但是在此序列之前加入碱性磷酸酶(phoA)的信号肽(SP)序列，该SP可以引导所表达的目的蛋白分泌至细菌的膜周质腔中，并可被原核周质信号肽酶酶切；②在TrxA蛋白编码序列之后增加His-Tag标签基团，可用于所表达的目的蛋白的富集；③在His-Tag标签下游增加肠激酶(EK)酶切位点DDDDK(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，纯化出的蛋白将在肠激酶作用下去除His-Tag标签和上游所融合的TrxA蛋白。④插入Cas9蛋白的编码序列，同时在该基因的上游和下游均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加后期纯化出的Cas9蛋白的核定位能力。
构建质粒pET32a-T7lac-phoA:SP-TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS-T7ter(简称质粒pKG-GE4)，序列如SEQ ID NO.4所示，结构示意图见图6。SEQ ID NO.5中，第5121-5139位核苷酸组成T7启动子，第5140-5164位核苷酸编码lac operator信号，第5209-5271位核苷酸编码phoA(碱性磷酸酶)信号肽(signal peptide，SP),第5272-5598位核苷酸编码TrxA蛋白，第5620-5637位核苷酸编码His-Tag标签，第5638-5652位核苷酸编码肠激酶酶切位点，第5656-5670位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第5701-9801位核苷酸编码spCas9蛋白(其密码子已优化为适宜在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行表达)，第9802-9849位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)，第9902-9949位核苷酸编码T7终止子。
pKG-GE4质粒构建方法如下：
(1)骨架载体的制备
质粒pET-32a(结构示意图见图5)用XbaI、XhoI酶切，回收载体片段(约5329bp左右)。
(2)全基因合成插入序列
全基因合成如SEQ ID NO.5所示插入序列，依次包含前述的phoA signal peptide序列、TrxA蛋白编码序列、His-Tag标签基团、EK酶切位点、spCas9蛋白编码序列及其两端的NLS序列，在全基因合成的N端和C端分别包含与骨架载体序列同源的25个碱基对。
(3)全基因合成插入片段与骨架载体连接
将步骤(1)回收的骨架载体和步骤(2)全基因合成的序列重组得到pET32a-T7lac-phoA:SP-TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS-T7ter载体，简称pKG-GE4，质粒图谱如图6，核苷酸序列见SEQ ID NO.4。
实施例2 pKG-GE4质粒转化E.coli BL21(DE3)表达菌株及Cas9蛋白的表达
2.1融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS的诱导表达
将鉴定正确的pKG-GE4质粒转化入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(武汉灵淼生物公司)中，涂氨苄抗性(AmpR)平板，培养过夜后，挑选单菌落，接种到含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200转/min条件下培养过夜，然后将过夜培养的菌液接种到500mL LB培养基中，接种比例为1:200，30℃、230转/min条件下培养至OD600达到1.0左右，加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导BL21(DE3)菌株表达目的蛋白，然后25℃培养12小时进行目的蛋白的低温诱导可溶性表达。4℃，10000g离心15分钟收集菌体，用PBS洗涤菌体并离心收集菌体沉淀。
2.2融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS的纯化
2.2.1融合蛋白的粗提
粗提缓冲液为20mM Tris-HCl pH 8.0，0.5M NaCl，5mM Imidazole，1mM PMSF。粗提方法：按每克湿菌加入10ml上述缓冲液，悬浮细菌，均质机破碎，1000par循环三次。然后4℃，15000g离心细菌悬液30min，收集上清，经0.22μm滤膜过滤用于下一步的亲和层析蛋白纯化。
2.2.2融合蛋白的纯化
采用Ni-NTA琼脂糖柱(金斯瑞，L00250/L00250-C)进行融合蛋白的纯化。首先用平衡液(20mM Tris-HCl pH 8.0，0.5M NaCl，5mM Imidazole)对Ni柱进行平衡，然后将上述过滤后的菌液上清上样到平衡后的Ni柱，再用平衡液洗涤Ni柱，然后用缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，0.5M NaCl，50mM Imidazole)洗去杂蛋白，最后用洗脱液(20mM Tris-HCl pH8.0，0.5M NaCl，500mM Imidazole)洗脱目的蛋白。
2.3融合蛋白(TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS)的酶切与cas9蛋白的纯化
使用Amicon超滤管(Sigma,UFC9100)将上述Ni柱纯化后的融合蛋白溶液浓缩至200μl并用25mM Tris-HCl pH 8.0稀释至1ml。然后将商品来源的带his标签的重组牛肠激酶(生工生物，C620031)加入到25mM Tris-HCl pH 8.0稀释后的融合蛋白液中，进行酶切反应。酶切用量为每50μg融合蛋白用肠激酶2个单位，酶切缓冲体系为25mM Tris-HCl pH8.0，酶切温度25℃，酶切时间16小时。
酶切结束后，将酶切后溶液与80μl的Ni-NTA树脂混匀，在室温下剧烈搅拌15min，然后7000g离心3min，上清与树脂分离，取上清即为酶切后去除TrxA-His的NLS-spCas9-NLS目的蛋白。酶切后的TrxA-His多肽片段及带His标签的肠激酶EK均结合在Ni-NTA树脂上，从而将上清中的cas9蛋白分离纯化。最后将纯化后的cas9蛋白(命名为pKG-GE4-cas9蛋白)浓缩后用50％的甘油于-80℃保存。
实施例3 pKG-GE4-Cas9与商品cas9蛋白的切割效率比较及与gRNA最佳摩尔配比摸索
3.1 TTN基因靶点gRNA设计及转录
3.1.1使用Benchling对TTN基因进行gRNA靶点设计，经预筛确定选用以下两条gRNA：
TTN-gRNA1：AGAGCACAGTCAGCCTGGCG
TTN-gRNA2：CTTCCAGAATTGGATCTCCG
3.1.2 gRNA分子不同区段序列的合成(由基因合成公司合成)
T7-gRNA1：GGCTTGTCGGACTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAGGGGGAT
T7-gRNA2：TGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTCGCCAGC
T7-gRNA3：ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTAGGAAATTAATACGACTCACTATAGG
TTN-g1T7-gRNA4：TTCTAGCTCTAAAACCGCCAGGCTGACTGTGCTCTCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
TTN-g1T7-gRNA5：CCTGGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTT
TTN-g2T7-gRNA4：TTCTAGCTCTAAAACCGGAGATCCAATTCTGGAAGCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
TTN-g2T7-gRNA5：ATCTCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTT
T7-gRNA6：AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTAT(SEQ IDNO.16)
3.1.3设计用于鉴定包含TTN gRNA靶点片段的引物
TTN-F55：TACGGAATTGGGGAGCCAGCGGA
TTN-R560：CAAAGTTAACTCTCTGTGTCT
3.1.4转录模板的扩增
TTN-T7-gRNA1转录模板序列如下所示：
GGCTTGTCGGACTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTAGGAAATTAATACGACTCACTATAGGAGAGCACAGTCAGCCTGGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT。
上述TTN-T7-gRNA1转录模板是使用T7-gRNA1、T7-gRNA2、T7-gRNA3、TTN-g1T7-gRNA4、TTN-g1T7-gRNA5、T7-gRNA6共计6条合成引物采用重叠延伸PCR扩增技术制作的，该序列中含有T7启动子，可启动相关序列的转录。扩增后将目的条带切胶后按照Fast PureGel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme，DC301)说明书进行操作，回收产物作为转录模板。TTN-T7-gRNA2转录模板序列如下所示：GGCTTGTCGGACTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTAGGAAATTAATACGACTCACTATAGGCTTCCAGAATTGGATCTCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT。
上述TTN-T7-gRNA2转录模板是使用T7-gRNA1、T7-gRNA2、T7-gRNA3、TTN-g2T7-gRNA4、TTN-g2T7-gRNA5、T7-gRNA6共计6条合成引物采用重叠延伸PCR扩增技术制作的，该序列中含有T7启动子，可启动相关序列的转录。扩增后将目的条带切胶后按照Fast PureGel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme，DC301)说明书进行操作，回收产物作为转录模板。
3.1.5 gRNA的转录
以步骤3.1.4制备的转录模板按照Transcript Aid T7 High YieldTranscription Kit(Fermentas，K0441)和MEGA clearTM Transcription Clean-Up Kit(Thermo，AM1908)说明书进行操作，所获产物即为可用于细胞电转的gRNA。
3.2猪原代成纤维细胞制备
3.2.1取刚出生从江香猪耳组织0.5g，去除毛发及骨组织，75﹪酒精浸泡30-40s；
3.2.2用含5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)的PBS洗涤5次，不含P/S的PBS洗一次；
其中5％P/S的PBS配方为：5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+95％PBS，5％、95％为体积百分比。
3.2.3用剪刀将组织剪碎，加入5mL 0.1％的胶原酶(Sigma)溶液，37℃摇床消化1h；
3.2.4 500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的10cm细胞培养皿中。
其中，细胞完全培养基的配方为：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)，15％、83％、1％、1％为体积百分比。
3.2.5置于37℃，5％CO2(体积百分比)、5％O2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；
3.2.6将细胞培养至长满皿底60％左右时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心4min，弃去上清，得到细胞沉淀，以备下一步的细胞转染实验。
3.3 Grna配比优化及pKG-GE4-Cas9蛋白和商品Cas9蛋白效果对比
3.3.1共转染分组情况
第一组：将转录的TTN-T7-gRNA1、TTN-T7-gRNA2和pKG-GE4-Cas9蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：0.5μg TTN-T7-gRNA1：0.5μg TTN-T7-gRNA2：4μg pKG-GE4-Cas9。
第二组：将转录的TTN-T7-gRNA1、TTN-T7-gRNA2和pKG-GE4-Cas9蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：0.75μg TTN-T7-gRNA1：0.75μg TTN-T7-gRNA2：4μg pKG-GE4-Cas9。
第三组：将转录的TTN-T7-gRNA1、TTN-T7-gRNA2和pKG-GE4-Cas9蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-T7-gRNA1：1μg TTN-T7-gRNA2：4μg pKG-GE4-Cas9。
第四组：将转录的TTN-T7-gRNA1、TTN-T7-gRNA2和pKG-GE4-Cas9蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1.25μg TTN-T7-gRNA1：1.25μg TTN-T7-gRNA2：4μg pKG-GE4-Cas9。
第五组：将转录的TTN-T7-gRNA1、TTN-T7-gRNA2共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-T7-gRNA1：1μg TTN-T7-gRNA2。
3.3.2共转染操作方法
使用哺乳动物细胞转染试剂盒(Neon kit)与Neon TM transfection system电转仪进行转染实验。
1)按照上述分组配制电转DNA，混匀过程中注意切勿产生气泡；
2)将3.2.6制备得到的细胞沉淀使用1ml PBS缓冲液(Solarbio)清洗，并转移到1.5ml离心管中，600g离心6min，弃去上清，使用11μL电转基本溶液Opti-MEM重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；
3)吸取10μL细胞悬液，加入至步骤1)中的电转DNA液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；
4)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL Buffer E；
5)用电转枪吸取10μL步骤3)得到的混合液，插入电击杯内，选择电转程序(1450V10ms 3pulse)，电击转染后立即将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL的完全培养液(15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio))；
6)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；
7)电转后12-18h换液，36-48h用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。
3.3.3基因编辑效率分析
提取3.3.2中收集的细胞基因组DNA，采用TTN-F55和TTN-R560组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳(见图7)。505bp条带为野生型条带(WT)，254bp左右(条带505bp理论缺失251bp)为缺失突变条带(MT)。
基因缺失突变效率＝(MT灰度/MT条带bp数)/(WT灰度/WT条带bp数+MT灰度/MT条带bp数)×100％。据此计算，第一组基因缺失突变效率为19.9％，第二组基因缺失突变效率为39.9％，第三组基因缺失突变效率为79.9％，第四组基因缺失突变效率为44.3％。
结果表明，当两个gRNA与pKG-GE4-Cas9蛋白的质量比为1：1：4，实际用量为1μg：1μg：4μg时基因编辑效率最高，确定两个gRNA与pKG-GE4-Cas9蛋白的最适用量为1μg：1μg：4μg。
3.4.1共转染分组情况
Cas9-A组：将转录的TTN-T7-gRNA1、TTN-T7-gRNA2和商品Cas9-A蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-T7-gRNA1：1μg TTN-T7-gRNA2：4μg Cas9-A。
pKG-GE4组：将转录的TTN-T7-gRNA1、TTN-T7-gRNA2和pKG-GE4-Cas9蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-T7-gRNA1：1μg TTN-T7-gRNA2：4μg pKG-GE4-Cas9。
Cas9-B组：将转录的TTN-T7-gRNA1、TTN-T7-gRNA2和商品Cas9-B蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-T7-gRNA1：1μg TTN-T7-gRNA2：4μg Cas9-B。
Control组：将转录的TTN-T7-gRNA1、TTN-T7-gRNA2共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-T7-gRNA1：1μg TTN-T7-gRNA2。
3.4.2共转染操作方法
同本实施例中步骤3.3.2。
3.4.3基因编辑效率分析
提取3.4.2中收集的细胞基因组DNA，采用TTN-F55和TTN-R560组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳(见图8)。505bp条带为野生型条带(WT)，254bp条带(条带505bp理论缺失251bp)为缺失突变条带(MT)。
基因缺失突变效率＝(MT灰度/MT条带bp数)/(WT灰度/WT条带bp数+MT灰度/MT条带bp数)×100％。据此计算，采用商品Cas9-A蛋白的基因缺失突变效率为28.5％，采用pKG-GE4-Cas9蛋白的基因缺失突变效率为85.6％，采用商品Cas9-B蛋白的基因缺失突变效率为16.6％。
结果表明，与采用商品的Cas9蛋白相比，采用本发明制备的pKG-GE4-Cas9蛋白使得基因编辑效率显著提高。
实施例4 LMNA基因靶点gRNA的筛选
4.1基因组DNA的提取
使用Vazyme公司FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(VazymeCat.DC102-01)分别进行18只猪(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)耳组织的基因组DNA的柱式提取，使用NanoDrop进行定量，-20℃保存备用。
4.2 LMNA基因预点突变位点及邻近基因组序列保守性分析
4.2.1猪LMNA基因信息
编码Lamin A/C蛋白；位于4号染色体；GeneID为100126859，Sus scrofa。猪LMNA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。基因组DNA中，猪LMNA基因具有16个外显子，而与人类DCM相关的LMNA突变研究中N195K和E203K均位于人LMNA基因第3外显子上，对应猪第7外显子(猪LMNA基因第6至第8外显子，含第6和第7内含子序列如SEQ ID NO.7所示)。
4.2.2 LMNA基因预设点突变位点外显子及邻近基因组序列PCR扩增引物设计
根据查到的猪LMNA基因组序列
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010446.5？report＝genbank& from＝93899019&to＝93927255&strand＝true)，设计引物扩增前述18只猪基因组样品LMNA基因外显子7的位点。
使用Oligo7进行引物设计，设计结果如下：
LMNA-E7gRNA-JDF1：AGTCGTTCCTGCCAGGGAGTG
LMNA-E7gRNA-JDR1：CGTCTCATGGCGGCGCTTGGT
LMNA-E7gRNA-JDF2：ACCACAGCAGGAACGCCAGTC
LMNA-E7gRNA-JDR2：TCTGCCAGCCGGCTCTCAAAC
4.2.3 LMNA基因组PCR扩增引物筛选
使用猪(雌性1、2、3)耳朵组织提取的基因组为模板，分别采用LMNA-E7gRNA-JDF1和LMNA-E7gRNA-JDR1组成的引物对或LMNA-E7gRNA-JDF2和LMNA-E7gRNA-JDR2组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，结果见图8。LMNA-E7gRNA-JDF1和LMNA-E7gRNA-JDR1组成的引物对效果更好。
4.2.4 18只猪LMNA基因片段PCR扩增
分别以18个基因组模板(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，引物LMNA-E7gRNA-JDF1/LMNA-E7gRNA-JDR1，Max酶进行LMNA基因组片段的扩增，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图9。
4.2.5 LMNA基因序列保守性分析
以上PCR扩增产物，使用扩增引物进行测序(通用生物公司测序)，将测序结果与公共数据库中的LMNA基因序列进行比对分析。根据比对结果，可采用LMNA-E7gRNA-JDF1/LMNA-E7gRNA-JDR1引物检测突变(引物本身无可能的突变位点)。
4.3 gRNA靶点设计及构建
4.3.1使用Benchling进行靶点gRNA设计
设计靶点已避开可能的突变位点，使用Benchling进行靶点gRNA设计：
https://benchling.com/
LMNA基因敲除靶点设计如下：
LMNA-E7-gRNA1：GGATGAGATGCTGCGCCGAG(SEQ ID NO.8)
LMNA-E7-gRNA2：CAGGCTGCAGACCCTGAAGG(SEQ ID NO.9)
LMNA-E7-gRNA3：GAACAGGCTGCAGACCCTGA(SEQ ID NO.10)
LMNA-E7-gRNA4：TGAGGCCAAGAAACAACTTC(SEQ ID NO.11)
合成的LMNA基因共4个靶点的插入序列互补DNA oligo如下：
LMNA-E7-gRNA1-S：caccGGATGAGATGCTGCGCCGAG(SEQ ID NO.12)
LMNA-E7-gRNA1-A：aaacCTCGGCGCAGCATCTCATCC(SEQ ID NO.13)
LMNA-E7-gRNA2-S：caccgCAGGCTGCAGACCCTGAAGG(SEQ ID NO.14)
LMNA-E7-gRNA2-A：aaacCCTTCAGGGTCTGCAGCCTGc(SEQ ID NO.15)
LMNA-E7-gRNA3-S：caccGAACAGGCTGCAGACCCTGA(SEQ ID NO.16)
LMNA-E7-gRNA3-A：aaacTCAGGGTCTGCAGCCTGTTC(SEQ ID NO.17)
LMNA-E7-gRNA4-S：caccgTGAGGCCAAGAAACAACTTC(SEQ ID NO.18)
LMNA-E7-gRNA4-A：aaacGAAGTTGTTTCTTGGCCTCAc(SEQ ID NO.19)
LMNA-E7-gRNA1-S、LMNA-E7-gRNA1-A、LMNA-E7-gRNA2-S、LMNA-E7-gRNA2-A、LMNA-E7-gRNA3-S、LMNA-E7-gRNA3-A、LMNA-E7-gRNA4-S、LMNA-E7-gRNA4-A均为单链DNA分子。
4.3.2将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法
同实施例2中2.1.4。
4.3.3 gRNA载体构建
1)将合成的LMNA-E7-gRNA1-S和LMNA-E7-gRNA1-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA1)。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA1)将会在所转染的细胞中转录出与LMNA-E7-gRNA1序列所对应的gRNA。
2)将合成的LMNA-E7-gRNA2-S和LMNA-E7-gRNA2-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA2)。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA2)将会在所转染的细胞中转录出与LMNA-E7-gRNA2序列所对应的的gRNA。
3)将合成的LMNA-E7-gRNA3-S和LMNA-E7-gRNA3-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA3)。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA3)将会在所转染的细胞中转录出与LMNA-E7-gRNA3序列所对应的gRNA。
4)将合成的LMNA-E7-gRNA4-S和LMNA-E7-gRNA4-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA4)将会在所转染的细胞中转录出与LMNA-E7-gRNA4序列所对应的gRNA。
4.3.3 gRNA载体鉴定
从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA1)、pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA2)、pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA3)和pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA4)载体均构建成功。
4.4猪原代成纤维细胞制备
同实施例3中3.2。
4.5使用构建好的gRNA质粒、质粒(pKG-GE3)共转染猪原代成纤维细胞
4.5.1共转染分组情况
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA1)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA1)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA2)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA2)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA3)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA3)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA4)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。
4.5.2共转染操作方法
同实施例3中3.3.2。
4.6 LMNA基因不同gRNA靶点的编辑效率分析
4.6.1分别向步骤4.5.2中收集在1.5mL离心管中的5组细胞加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞，得到释放出基因组DNA的细胞裂解液
KAPA2G裂解液配制体系如下：
10×extract Buffer 1μL
Enzyme 0.2μL
ddH2O 8.8μL
75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后细胞裂解液于-20℃保存；
4.6.2采用前述针对LMNA基因E7的引物对LMNA-E7gRNA-JDF1/LMNA-E7gRNA-JDR1，并以上述细胞裂解液为DNA模板，进行PCR扩增LMNA基因靶点区域，检测细胞靶基因突变情况，目的PCR产物长度为619bp；
4.6.3使用常规PCR反应扩增LMNA靶点基因；
4.6.4将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图10，将目的产物及其附近产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出LMNA-E7-gRNA1、LMNA-E7-gRNA2、LMNA-E7-gRNA3、LMNA-E7-gRNA4不同靶点的编辑效率依次为82％、39％、74％、25％。结果表明，LMNA-E7-gRNA1和LMNA-E7-gRNA3编辑效率较高。
实施例5制备LMNA基因突变的从江香猪单细胞克隆
5.1 LMNA基因高效靶点gRNA模板制备及转录
5.1.1使用实施例4中筛选的两个靶点gRNA
LMNA-E7-gRNA1：GGATGAGATGCTGCGCCGAG(SEQ ID NO.8)
LMNA-E7-gRNA3：GAACAGGCTGCAGACCCTGA(SEQ ID NO.10)
5.1.2设计靶点gRNA转录模板的不同区段序列(由基因合成公司合成)
T7-gRNA1、T7-gRNA2、T7-gRNA3、T7-gRNA6序列同实施例3中步骤3.1.2；
LMNA-g1T7-gRNA4：TTCTAGCTCTAAAACCTCGGCGCAGCATCTCATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC(SEQ ID NO.20)
LMNA-g1T7-gRNA5：CGCCGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTT(SEQ ID NO.21)
LMNA-g3T7-gRNA4：TTCTAGCTCTAAAACTCAGGGTCTGCAGCCTGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC(SEQ ID NO.22)
LMNA-g3T7-gRNA5：ACCCTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTT(SEQ ID NO.23)
5.1.3转录模板的扩增
LMNA-T7-gRNA1转录模板序列如SEQ ID NO.24所示，是使用T7-gRNA1、T7-gRNA2、T7-gRNA3、LMNA-g1T7-gRNA4、LMNA-g1T7-gRNA5、T7-gRNA6共计6条合成引物采用重叠延伸PCR扩增技术制作的，该序列中含有T7启动子，可启动相关序列的转录。扩增结果如图11所示，将目的条带切胶后按照Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme，DC301)说明书进行操作，回收产物作为转录模板。
LMNA-T7-gRNA3转录模板序列如SEQ ID NO.25所示，是使用T7-gRNA1、T7-gRNA2、T7-gRNA3、LMNA-g3T7-gRNA4、LMNA-g3T7-gRNA5、T7-gRNA6共计6条合成引物采用重叠延伸PCR扩增技术制作的，该序列中含有T7启动子，可启动相关序列的转录。扩增结果如图11所示，将目的条带切胶后按照Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme，DC301)说明书进行操作，回收产物作为转录模板。
5.1.4高效gRNA的转录
以步骤5.1.3制备的转录模板按照Transcript Aid T7 High YieldTranscription Kit(Fermentas,K0441)和MEGA clearTM Transcription Clean-Up Kit(Thermo,AM1908)说明书进行操作，所获产物即为可用于细胞电转的gRNA。
5.2合成含有LMNA突变位点的单链DNA
合成对应人LMNA N195K和E203K氨基酸突变的单链DNA作为Donor DNA，该单链DNA除靶位点突变外还含有LMNA-E7-gRNA1和LMNA-E7-gRNA3靶点PAM的同义突变，命名为LMNA-mutant-ss130，序列如SEQ ID NO.26所示。
5.3猪原代成纤维细胞制备
同实施例3中3.2。
5.4转染猪原代成纤维细胞
使用转录的LMNA-T7-gRNA1和LMNA-T7-gRNA3、pKG-GE4-Cas9蛋白、LMNA-mutant-ss130共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1.77μg LMNA-T7-gRNA1：1.77μg LMNA-E7-gRNA3：2.46μg pKG-GE4-Cas9蛋白：2μg LMNA-mutant-ss130。共转染操作方法同实施例3中3.3.2。
5.5筛选LMNA-mutant-ss130发生同源重组(HDR)的单细胞克隆株
5.5.1将步骤5.4所得电转48h的群体细胞，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用200μL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单细胞转移到每孔含100μL完全培养基的96孔板中，每孔放置一个细胞。
5.5.2 37℃、5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单细胞克隆的孔；
5.5.3待96孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3的细胞收集在1.5mL离心管中备后续基因型测定用；
5.5.4待6孔板长至80％汇合度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
5.6单细胞克隆的鉴定
5.6.1在步骤5.5.3收集在1.5mL离心管中得到的细胞中加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞，得到释放出基因组DNA的细胞裂解液。
KAPA2G裂解液配制体系如下：
10×extract Buffer 1μL
Enzyme 0.2μL
ddH2O 8.8μL
75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后细胞裂解液于-20℃保存；
5.6.2采用前述针对LMNA基因E7的引物对LMNA-E7gRNA-JDF1/LMNA-E7gRNA-JDR1，并以上述细胞裂解液为DNA模板，进行PCR扩增LMNA靶点基因，检测单细胞克隆的靶基因突变情况，目的PCR产物长度为619bp；
5.6.3将PCR产物进行电泳，电泳结果如图12，泳道编号与单细胞克隆编号一致。回收PCR扩增产物并测序。
5.6.4将测序结果与LMNA靶标位点突变序列信息进行比对，从而判断该单细胞克隆株是否为靶标位点成功突变株。
编号为1、2、6、16、19、26、32、37的单细胞克隆的基因型为野生型。编号为4、5、9、15、17、22、24、25、28、29、36、38、39的单细胞克隆的基因型为杂合突变型。编号为7、10、12、18、20、27、30、31、35的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型。编号为3、8、11、13、14、21、23、33、34、40的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型。其中，15、17的单细胞克隆为靶标位点点突变的杂合突变型，3、11、14、23、40的单细胞克隆为靶标位点点突变的纯合突变型。得到LMNA基因编辑单细胞克隆的比率为80％，得到靶标位点点突变的单细胞克隆的比率为17.5％。
示例性的测序比对结果如图13至图17，其中图13是克隆号为LMNA-ss130-1的正向测序与靶标位点突变序列的比对结果，为野生型；图14是克隆号为LMNA-ss130-9的正向测序与靶标位点突变序列的比对结果，为杂合突变型；图15是克隆号为LMNA-ss130-20的正向测序和反向测序同时与靶标位点突变序列的比对结果，为双等位基因不同变异的纯合突变型；图16是克隆号为LMNA-ss130-8的正向测序与靶标位点突变序列的比对结果，为双等位基因相同变异的纯合突变型；图17是克隆号为LMNA-ss130-15的正向测序与靶标位点突变序列的比对结果，为靶标位点点突变的杂合突变型；图18是克隆号为LMNA-ss130-3的正向测序与靶标位点突变序列的比对结果，为靶位点点突变的纯合突变型。
通过具体序列的分析，LMNA各单细胞克隆基因型如表1：
表1 LMNA基因点突变单细胞克隆的基因型测定结果
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> 用于构建LMNA基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8484
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840
ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020
ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080
gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140
agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200
ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320
ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380
caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440
caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500
gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560
caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620
ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680
gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740
ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800
gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860
cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920
caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980
gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040
gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100
caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160
cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220
cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280
caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340
gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400
cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460
ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520
gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580
ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640
cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700
gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760
catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820
cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880
cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940
gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000
gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060
cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120
cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180
cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240
cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300
gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360
caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420
cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480
ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540
cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600
ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660
gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720
cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780
cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840
gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900
cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960
cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020
tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080
taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140
acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200
agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260
ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320
cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380
ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440
taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500
ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560
cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620
gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680
caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740
cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800
caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860
cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920
ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980
aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040
tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100
tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160
gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220
cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280
gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340
ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400
caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460
ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520
tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580
tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640
tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700
ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760
atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820
gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880
ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940
atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000
tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060
tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120
tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180
gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240
agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300
cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360
agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420
ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480
caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540
ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600
cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660
tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840
tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900
atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500
ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980
ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220
gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460
tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484
<210> 2
<211> 10476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360
gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600
ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660
tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720
ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780
gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840
cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900
cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960
caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020
gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080
cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140
cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200
cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260
cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320
cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380
agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440
ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500
ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560
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ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680
caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740
gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800
gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860
ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920
cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980
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actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280
cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340
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cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460
gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520
ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580
gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640
atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700
cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760
cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820
cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880
caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940
cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000
gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060
cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120
cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180
ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240
cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300
gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360
gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420
caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480
cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540
ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600
ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660
caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720
cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780
gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840
aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900
gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960
ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020
cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080
cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140
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cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260
aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320
catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380
gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440
taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500
agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560
catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620
agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680
cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740
gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800
ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860
gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920
caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980
tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040
caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100
ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160
caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220
gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280
aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520
cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700
cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820
gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000
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ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300
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cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720
caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900
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tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080
gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320
agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380
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tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680
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ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860
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cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 8040
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ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280
tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 8340
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400
ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460
cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580
caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640
tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700
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gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880
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cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060
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cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900
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acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380
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ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476
<210> 3
<211> 3120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
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gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
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agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
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tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
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agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
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cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
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acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
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<210> 4
<211> 9974
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
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ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
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agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960
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aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080
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ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
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cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280
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tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940
ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000
aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180
acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240
cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300
cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360
gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420
cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480
gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540
tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600
atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720
gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780
tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840
cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900
tcggtatcgt cgtatcccac taccgagatg tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960
atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020
atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080
tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140
cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200
aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260
ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320
tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380
tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440
gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500
gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560
gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620
ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680
taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740
ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800
atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860
tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920
gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980
gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040
aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100
cgatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 5160
ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatgt gaaacaaagc 5220
actattgcac tggcactctt accgttactg tttacccctg tgacaaaagc catgagcgat 5280
aaaattattc acctgactga cgacagtttt gacacggatg tactcaaagc ggacggggcg 5340
atcctcgtcg atttctgggc agagtggtgc ggtccgtgca aaatgatcgc cccgattctg 5400
gatgaaatcg ctgacgaata tcagggcaaa ctgaccgttg caaaactgaa catcgatcaa 5460
aaccctggca ctgcgccgaa atatggcatc cgtggtatcc cgactctgct gctgttcaaa 5520
aacggtgaag tggcggcaac caaagtgggt gcactgtcta aaggtcagtt gaaagagttc 5580
ctcgacgcta acctggccgg ttctggttct ggccatatgc accatcatca tcatcatgac 5640
gatgacgata agatgcccaa aaagaaacga aaggtgggta tccacggagt cccagcagcc 5700
gacaaaaaat atagcatcgg cctggacatc ggtaccaaca gcgttggctg ggcagtgatc 5760
actgatgaat acaaagttcc atccaaaaaa tttaaagtac tgggcaacac cgaccgtcac 5820
tctatcaaaa aaaacctgat tggtgctctg ctgtttgaca gcggcgaaac tgctgaggct 5880
acccgtctga aacgtacggc tcgccgtcgc tacactcgtc gtaaaaaccg catctgttat 5940
ctgcaggaaa ttttctctaa cgaaatggca aaagttgatg atagcttctt tcatcgtctg 6000
gaagagagct tcctggtgga agaagataaa aaacacgaac gtcacccgat tttcggtaac 6060
attgtggatg aggttgccta ccacgagaaa tatccgacca tctaccatct gcgtaaaaaa 6120
ctggttgata gcactgacaa agcggatctg cgtctgatct acctggctct ggcacacatg 6180
atcaaattcc gtggtcactt cctgatcgaa ggtgatctga accctgataa ctccgacgtg 6240
gacaaactgt tcattcagct ggttcagacc tataaccagc tgttcgaaga aaacccgatc 6300
aacgcgtccg gtgtagacgc taaggcaatt ctgtctgcgc gtctgtctaa gtctcgtcgt 6360
ctggaaaacc tgattgcgca actgccaggt gaaaagaaaa acggcctgtt cggcaatctg 6420
atcgccctgt ccctgggtct gactccgaac tttaaatcca actttgacct ggcggaagat 6480
gccaagctgc agctgagcaa agatacctat gacgatgacc tggataacct gctggcacag 6540
atcggtgatc agtatgccga tctgttcctg gccgcgaaaa acctgtctga tgcgattctg 6600
ctgtctgata tcctgcgcgt taacactgaa attactaaag cgccgctgag cgcatccatg 6660
attaaacgtt acgatgaaca ccaccaggat ctgaccctgc tgaaagcgct ggtgcgtcag 6720
cagctgccgg aaaaatacaa ggagatcttc ttcgaccaga gcaaaaacgg ttacgcgggc 6780
tacattgatg gtggtgcatc tcaggaggaa ttctacaaat tcattaaacc gatcctggaa 6840
aaaatggatg gtactgaaga gctgctggtt aaactgaatc gtgaagatct gctgcgcaaa 6900
cagcgtacct tcgataacgg ttccatcccg catcagattc atctgggcga actgcacgct 6960
atcctgcgcc gtcaggaaga cttttatccg ttcctgaaag acaaccgtga gaaaattgaa 7020
aaaatcctga ccttccgtat tccgtactat gtaggtccgc tggcgcgtgg taactcccgt 7080
ttcgcttgga tgacccgcaa aagcgaagaa accatcaccc cgtggaattt cgaagaagtc 7140
gttgacaaag gcgcgtccgc gcagtctttc atcgaacgca tgacgaactt cgacaaaaac 7200
ctgccgaacg agaaagtgct gccgaaacac tctctgctgt acgagtactt cactgtgtac 7260
aacgaactga ccaaagtgaa atacgtcacc gaaggtatgc gtaaaccggc attcctgtcc 7320
ggtgagcaaa aaaaagcaat cgtggatctg ctgttcaaaa ccaaccgtaa agtaaccgtg 7380
aaacagctga aggaagacta tttcaagaaa atcgaatgtt ttgattctgt tgaaatctcc 7440
ggcgtggaag atcgcttcaa tgcgtccctg ggtacgtatc acgacctgct gaaaattatc 7500
aaagacaaag attttctgga caacgaggaa aacgaagaca tcctggagga tattgtactg 7560
accctgaccc tgttcgaaga ccgtgagatg atcgaagaac gcctgaaaac ctacgcccac 7620
ctgttcgatg acaaggtaat gaagcagctg aaacgtcgtc gttataccgg ctggggtcgt 7680
ctgtcccgta aactgatcaa tggcatccgt gataaacagt ctggcaaaac catcctggac 7740
ttcctgaaat ccgacggttt cgcgaatcgt aacttcatgc aactgattca tgacgattct 7800
ctgactttca aagaagacat ccagaaagca caggtttccg gccagggtga ctctctgcac 7860
gagcacattg ccaatctggc tggttctccg gctattaaaa agggtattct gcagactgtg 7920
aaagtagttg atgagctggt caaagtaatg ggccgtcaca agccggaaaa cattgtgatc 7980
gaaatggcac gtgaaaacca gacgacccag aaaggtcaga aaaactctcg tgaacgcatg 8040
aaacgtatcg aagaaggcat caaagaactg ggctctcaga tcctgaagga acaccctgta 8100
gaaaataccc agctgcagaa cgaaaagctg tatctgtatt acctgcagaa cggccgcgat 8160
atgtatgtgg accaggaact ggatatcaac cgcctgtccg attacgatgt agatcacatc 8220
gtgccgcaaa gcttcctgaa agacgacagc attgacaaca aagtactgac ccgttctgat 8280
aagaaccgtg gcaaatccga taacgtcccg tctgaagaag ttgttaaaaa aatgaaaaac 8340
tattggcgtc agctgctgaa cgcgaaactg atcacccagc gtaagttcga caatctgact 8400
aaagctgagc gcggtggtct gtccgaactg gataaagcgg gttttatcaa acgccagctg 8460
gttgaaaccc gtcagatcac gaagcacgtt gcgcagattc tggactctcg tatgaacacc 8520
aaatacgacg aaaacgacaa actgatccgc gaggttaagg ttatcaccct gaaaagcaaa 8580
ctggtatccg attttcgtaa agactttcag ttctacaaag tgcgcgaaat taacaactat 8640
caccacgctc acgatgcata tctgaatgca gttgttggca cggcgctgat caaaaagtat 8700
ccgaaactgg aatctgaatt cgtatacggc gattacaaag tgtatgacgt tcgtaagatg 8760
atcgcaaaat ccgagcagga aattggtaag gcgacggcga aatacttctt ttattccaat 8820
attatgaact ttttcaaaac cgaaatcacc ctggcgaatg gtgaaattcg taaacgcccg 8880
ctgatcgaaa ccaacggtga aactggtgaa atcgtttggg acaaaggccg cgacttcgcg 8940
accgtgcgta aagttctgtc tatgccgcaa gtgaacatcg tcaagaagac cgaagtacaa 9000
accggcggtt ttagcaaaga gagcattctg ccaaaacgta actccgacaa actgatcgcg 9060
cgcaagaaag actgggatcc gaaaaaatac ggtggtttcg attctccaac cgttgcttat 9120
tccgttctgg tggtagccaa agttgagaaa ggtaaaagca aaaaactgaa atccgtaaag 9180
gaactgctgg gtattactat catggagcgt agctccttcg aaaaaaaccc gatcgatttt 9240
ctggaagcga aaggctataa agaagtcaaa aaggacctga tcatcaaact gccaaaatac 9300
agcctgttcg agctggaaaa cggccgtaaa cgtatgctgg catctgcggg cgaactgcag 9360
aaaggcaacg agctggctct gccgtccaaa tacgtgaact ttctgtacct ggcctctcac 9420
tacgaaaaac tgaaaggttc cccggaagac aacgaacaga aacagctgtt cgtagagcag 9480
cacaaacact acctggacga gatcatcgaa cagatttctg aattttctaa acgtgtgatt 9540
ctggctgatg cgaatctgga taaagttctg tctgcctata acaagcatcg tgacaaaccg 9600
atccgcgaac aggctgagaa catcatccac ctgttcactc tgactaacct gggcgcgcca 9660
gcggctttca agtactttga taccaccatt gaccgcaagc gttacacctc cactaaagaa 9720
gtgctggacg cgactctgat ccaccagtcc atcaccggtc tgtacgagac ccgtatcgat 9780
ctgagccagc tgggcggtga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 9840
aagaaaaagt gacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata 9900
actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg 9960
aactatatcc ggat 9974
<210> 5
<211> 4694
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttaactttaa gaaggagata tacatgtgaa acaaagcact attgcactgg cactcttacc 60
gttactgttt acccctgtga caaaagccat gagcgataaa attattcacc tgactgacga 120
cagttttgac acggatgtac tcaaagcgga cggggcgatc ctcgtcgatt tctgggcaga 180
gtggtgcggt ccgtgcaaaa tgatcgcccc gattctggat gaaatcgctg acgaatatca 240
gggcaaactg accgttgcaa aactgaacat cgatcaaaac cctggcactg cgccgaaata 300
tggcatccgt ggtatcccga ctctgctgct gttcaaaaac ggtgaagtgg cggcaaccaa 360
agtgggtgca ctgtctaaag gtcagttgaa agagttcctc gacgctaacc tggccggttc 420
tggttctggc catatgcacc atcatcatca tcatgacgat gacgataaga tgcccaaaaa 480
gaaacgaaag gtgggtatcc acggagtccc agcagccgac aaaaaatata gcatcggcct 540
ggacatcggt accaacagcg ttggctgggc agtgatcact gatgaataca aagttccatc 600
caaaaaattt aaagtactgg gcaacaccga ccgtcactct atcaaaaaaa acctgattgg 660
tgctctgctg tttgacagcg gcgaaactgc tgaggctacc cgtctgaaac gtacggctcg 720
ccgtcgctac actcgtcgta aaaaccgcat ctgttatctg caggaaattt tctctaacga 780
aatggcaaaa gttgatgata gcttctttca tcgtctggaa gagagcttcc tggtggaaga 840
agataaaaaa cacgaacgtc acccgatttt cggtaacatt gtggatgagg ttgcctacca 900
cgagaaatat ccgaccatct accatctgcg taaaaaactg gttgatagca ctgacaaagc 960
ggatctgcgt ctgatctacc tggctctggc acacatgatc aaattccgtg gtcacttcct 1020
gatcgaaggt gatctgaacc ctgataactc cgacgtggac aaactgttca ttcagctggt 1080
tcagacctat aaccagctgt tcgaagaaaa cccgatcaac gcgtccggtg tagacgctaa 1140
ggcaattctg tctgcgcgtc tgtctaagtc tcgtcgtctg gaaaacctga ttgcgcaact 1200
gccaggtgaa aagaaaaacg gcctgttcgg caatctgatc gccctgtccc tgggtctgac 1260
tccgaacttt aaatccaact ttgacctggc ggaagatgcc aagctgcagc tgagcaaaga 1320
tacctatgac gatgacctgg ataacctgct ggcacagatc ggtgatcagt atgccgatct 1380
gttcctggcc gcgaaaaacc tgtctgatgc gattctgctg tctgatatcc tgcgcgttaa 1440
cactgaaatt actaaagcgc cgctgagcgc atccatgatt aaacgttacg atgaacacca 1500
ccaggatctg accctgctga aagcgctggt gcgtcagcag ctgccggaaa aatacaagga 1560
gatcttcttc gaccagagca aaaacggtta cgcgggctac attgatggtg gtgcatctca 1620
ggaggaattc tacaaattca ttaaaccgat cctggaaaaa atggatggta ctgaagagct 1680
gctggttaaa ctgaatcgtg aagatctgct gcgcaaacag cgtaccttcg ataacggttc 1740
catcccgcat cagattcatc tgggcgaact gcacgctatc ctgcgccgtc aggaagactt 1800
ttatccgttc ctgaaagaca accgtgagaa aattgaaaaa atcctgacct tccgtattcc 1860
gtactatgta ggtccgctgg cgcgtggtaa ctcccgtttc gcttggatga cccgcaaaag 1920
cgaagaaacc atcaccccgt ggaatttcga agaagtcgtt gacaaaggcg cgtccgcgca 1980
gtctttcatc gaacgcatga cgaacttcga caaaaacctg ccgaacgaga aagtgctgcc 2040
gaaacactct ctgctgtacg agtacttcac tgtgtacaac gaactgacca aagtgaaata 2100
cgtcaccgaa ggtatgcgta aaccggcatt cctgtccggt gagcaaaaaa aagcaatcgt 2160
ggatctgctg ttcaaaacca accgtaaagt aaccgtgaaa cagctgaagg aagactattt 2220
caagaaaatc gaatgttttg attctgttga aatctccggc gtggaagatc gcttcaatgc 2280
gtccctgggt acgtatcacg acctgctgaa aattatcaaa gacaaagatt ttctggacaa 2340
cgaggaaaac gaagacatcc tggaggatat tgtactgacc ctgaccctgt tcgaagaccg 2400
tgagatgatc gaagaacgcc tgaaaaccta cgcccacctg ttcgatgaca aggtaatgaa 2460
gcagctgaaa cgtcgtcgtt ataccggctg gggtcgtctg tcccgtaaac tgatcaatgg 2520
catccgtgat aaacagtctg gcaaaaccat cctggacttc ctgaaatccg acggtttcgc 2580
gaatcgtaac ttcatgcaac tgattcatga cgattctctg actttcaaag aagacatcca 2640
gaaagcacag gtttccggcc agggtgactc tctgcacgag cacattgcca atctggctgg 2700
ttctccggct attaaaaagg gtattctgca gactgtgaaa gtagttgatg agctggtcaa 2760
agtaatgggc cgtcacaagc cggaaaacat tgtgatcgaa atggcacgtg aaaaccagac 2820
gacccagaaa ggtcagaaaa actctcgtga acgcatgaaa cgtatcgaag aaggcatcaa 2880
agaactgggc tctcagatcc tgaaggaaca ccctgtagaa aatacccagc tgcagaacga 2940
aaagctgtat ctgtattacc tgcagaacgg ccgcgatatg tatgtggacc aggaactgga 3000
tatcaaccgc ctgtccgatt acgatgtaga tcacatcgtg ccgcaaagct tcctgaaaga 3060
cgacagcatt gacaacaaag tactgacccg ttctgataag aaccgtggca aatccgataa 3120
cgtcccgtct gaagaagttg ttaaaaaaat gaaaaactat tggcgtcagc tgctgaacgc 3180
gaaactgatc acccagcgta agttcgacaa tctgactaaa gctgagcgcg gtggtctgtc 3240
cgaactggat aaagcgggtt ttatcaaacg ccagctggtt gaaacccgtc agatcacgaa 3300
gcacgttgcg cagattctgg actctcgtat gaacaccaaa tacgacgaaa acgacaaact 3360
gatccgcgag gttaaggtta tcaccctgaa aagcaaactg gtatccgatt ttcgtaaaga 3420
ctttcagttc tacaaagtgc gcgaaattaa caactatcac cacgctcacg atgcatatct 3480
gaatgcagtt gttggcacgg cgctgatcaa aaagtatccg aaactggaat ctgaattcgt 3540
atacggcgat tacaaagtgt atgacgttcg taagatgatc gcaaaatccg agcaggaaat 3600
tggtaaggcg acggcgaaat acttctttta ttccaatatt atgaactttt tcaaaaccga 3660
aatcaccctg gcgaatggtg aaattcgtaa acgcccgctg atcgaaacca acggtgaaac 3720
tggtgaaatc gtttgggaca aaggccgcga cttcgcgacc gtgcgtaaag ttctgtctat 3780
gccgcaagtg aacatcgtca agaagaccga agtacaaacc ggcggtttta gcaaagagag 3840
cattctgcca aaacgtaact ccgacaaact gatcgcgcgc aagaaagact gggatccgaa 3900
aaaatacggt ggtttcgatt ctccaaccgt tgcttattcc gttctggtgg tagccaaagt 3960
tgagaaaggt aaaagcaaaa aactgaaatc cgtaaaggaa ctgctgggta ttactatcat 4020
ggagcgtagc tccttcgaaa aaaacccgat cgattttctg gaagcgaaag gctataaaga 4080
agtcaaaaag gacctgatca tcaaactgcc aaaatacagc ctgttcgagc tggaaaacgg 4140
ccgtaaacgt atgctggcat ctgcgggcga actgcagaaa ggcaacgagc tggctctgcc 4200
gtccaaatac gtgaactttc tgtacctggc ctctcactac gaaaaactga aaggttcccc 4260
ggaagacaac gaacagaaac agctgttcgt agagcagcac aaacactacc tggacgagat 4320
catcgaacag atttctgaat tttctaaacg tgtgattctg gctgatgcga atctggataa 4380
agttctgtct gcctataaca agcatcgtga caaaccgatc cgcgaacagg ctgagaacat 4440
catccacctg ttcactctga ctaacctggg cgcgccagcg gctttcaagt actttgatac 4500
caccattgac cgcaagcgtt acacctccac taaagaagtg ctggacgcga ctctgatcca 4560
ccagtccatc accggtctgt acgagacccg tatcgatctg agccagctgg gcggtgacaa 4620
aaggccggcg gccacgaaaa aggccggcca ggcaaaaaag aaaaagtgac aaagcccgaa 4680
aggaagctga gttg 4694
<210> 6
<211> 664
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 6
Met Glu Thr Pro Ser Gln Arg Arg Ala Thr Arg Ser Gly Ala Gln Ala
1 5 10 15
Ser Ser Thr Pro Leu Ser Pro Thr Arg Ile Thr Arg Leu Gln Glu Lys
20 25 30
Glu Asp Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Leu Ala Val Tyr Ile Asp Arg
35 40 45
Val Arg Ser Leu Glu Thr Glu Asn Ala Gly Leu Arg Leu Arg Ile Thr
50 55 60
Glu Ser Glu Glu Val Val Ser Arg Glu Val Ser Gly Ile Lys Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Glu Ala Glu Leu Gly Asp Ala Arg Lys Thr Leu Asp Ser Val Ala
85 90 95
Lys Glu Arg Ala Arg Leu Gln Leu Glu Leu Ser Lys Val Arg Glu Glu
100 105 110
Phe Lys Glu Leu Lys Ala Arg Asn Thr Lys Lys Glu Gly Asp Leu Met
115 120 125
Ala Ala Gln Ala Arg Leu Lys Asp Leu Glu Ala Leu Leu Asn Ser Lys
130 135 140
Glu Ala Ala Leu Ser Thr Ala Leu Ser Glu Lys Arg Thr Leu Glu Gly
145 150 155 160
Glu Leu His Asp Leu Arg Gly Gln Val Ala Lys Leu Glu Ala Ala Leu
165 170 175
Gly Glu Ala Lys Lys Gln Leu Gln Asp Glu Met Leu Arg Arg Val Asp
180 185 190
Ala Glu Asn Arg Leu Gln Thr Leu Lys Glu Glu Leu Asp Phe Gln Lys
195 200 205
Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Leu Arg Glu Thr Lys Arg Arg His Glu Thr
210 215 220
Arg Leu Val Glu Ile Asp Asn Gly Lys Gln Arg Glu Phe Glu Ser Arg
225 230 235 240
Leu Ala Asp Ala Leu Gln Glu Leu Arg Ala Gln His Glu Asp Gln Val
245 250 255
Glu Gln Tyr Lys Lys Glu Leu Glu Lys Thr Tyr Ser Ala Lys Leu Asp
260 265 270
Asn Ala Arg Gln Ser Ala Glu Arg Asn Ser Asn Leu Val Gly Ala Ala
275 280 285
His Glu Glu Leu Gln Gln Ser Arg Ile Arg Ile Asp Ser Leu Ser Ala
290 295 300
Gln Leu Ser Gln Leu Gln Lys Gln Leu Ala Ala Lys Glu Ala Lys Leu
305 310 315 320
Arg Asp Leu Glu Asp Ser Leu Ala Arg Glu Arg Asp Thr Ser Arg Arg
325 330 335
Leu Leu Ala Asp Lys Glu Arg Glu Met Ala Glu Met Arg Ala Arg Met
340 345 350
Gln Gln Gln Leu Asp Glu Tyr Gln Glu Leu Leu Asp Ile Lys Leu Ala
355 360 365
Leu Asp Met Glu Ile His Ala Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu
370 375 380
Glu Arg Leu Arg Leu Ser Pro Ser Pro Thr Ser Gln Arg Ser Arg Gly
385 390 395 400
Arg Ala Ser Ser His Ser Ser Gln Thr Gln Ser Gly Gly Ser Val Thr
405 410 415
Lys Lys Arg Lys Leu Glu Ser Ser Glu Ser Arg Ser Ser Phe Ser Gln
420 425 430
His Ala Arg Thr Ser Gly Arg Val Ala Val Glu Glu Val Asp Glu Glu
435 440 445
Gly Lys Phe Val Arg Leu Arg Asn Lys Ser Asn Glu Asp Gln Ser Met
450 455 460
Gly Asn Trp Gln Ile Lys Arg Gln Asn Gly Asp Asp Pro Leu Leu Thr
465 470 475 480
Tyr Arg Phe Pro Pro Lys Phe Thr Leu Lys Ala Gly Gln Val Val Thr
485 490 495
Ile Trp Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr His Ser Pro Pro Ala Asp Leu
500 505 510
Val Trp Lys Ser Gln Asn Thr Trp Gly Cys Gly Asn Ser Leu Arg Thr
515 520 525
Ala Leu Ile Asn Ser Thr Gly Glu Glu Val Ala Met Arg Lys Leu Val
530 535 540
Arg Ser Val Thr Met Ile Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Gly Asp Asp
545 550 555 560
Leu Leu His His His His Gly Ser His Gly Ser Ser Ser Gly Asp Pro
565 570 575
Ala Glu Tyr Asn Leu Arg Ser Arg Thr Val Leu Cys Gly Thr Cys Gly
580 585 590
Gln Pro Ala Asp Lys Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gly Ala Gln Val Gly
595 600 605
Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ser Ser Val Thr Val Thr Arg
610 615 620
Ser Tyr Arg Ser Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Phe Gly Asp Asn
625 630 635 640
Leu Val Thr Arg Ser Tyr Leu Leu Gly Asn Ser Arg Pro Arg Thr Gln
645 650 655
Ser Pro Gln Asn Cys Ser Ile Met
660
<210> 7
<211> 2938
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 7
caataccaag aaggagggag acttgatggc cgcccaggcc cggctcaagg acctggaggc 60
tctgctcaac tccaaggagg cagcactgag caccgctctc agcgagaagc gcacgctgga 120
aggcgagctg catgacctgc gaggacaagt ggccaaggtg gggcccacct gccccctgtc 180
cccctgcccc caaacaaata cacactcttc caccccaggt gctctcagga ggtacctggt 240
ctgatctgtc acatggcctt ggagccattc acgtgtccta gaattgttgt acccatccag 300
accatattgc acctcctttg ctgcccatgt ccagcagcgt gaatttagaa ggatccgtag 360
gaattcccat cgtagctcag tggttaacgg atctgactag gaaccatgag gttgcgggtt 420
caatccctgg ccccgctcag tgggttaagg atccggcatt gccgtgagct gtggtgtaag 480
ttgcagactt ggcttgggtc ctgtgttgct gtggctgtgg cgtaggccgg cagcagcagc 540
tctgattaga cccctagtct gggaacctcc atatgccatg ggtgcgaccc taaaagacaa 600
aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaggaaagaa aaaaaatcca taaaccattt ccatttaact 660
tcgcaatgaa ttgtgcctgg ccctggatcc ctcctggtct ggccctgctg tagagagctg 720
tgatctcttt ggaagatggg agaagaatat agaccatcca cagagccctg gttgtaggaa 780
gctgatggtt aatcacatat agatgcatgt tcttcttctt cttttttttt ttttttttgc 840
tttttagggt cacactcgca gcatatggaa gttcccaggc tacaccacag ccacagcaac 900
gtgggatcca agccgcatcc gtgacctaca ccacagctca cggcaatgcc agatccttaa 960
cccactgagc aaggccaggg attgagctcg aatcctcatg gataccagtc gtgtttgtta 1020
ccactgaacc atgacgggaa ctccttttat gttttttaag attcatgttc ttagtggttg 1080
gcatgtatat catgtgtatg caatggtctt tactttcaaa acactttgct atctatcctt 1140
tctcttacgt tacaagctag ggaacagaat caaagaagct ggcttgttcc caatctcact 1200
gcctcatctg cccagagcag ggccaggact agagttagtc caagggtcag gtcctgggct 1260
ctctaccccg acgaaggccc tgccaccaca gtaaactgag gagtgaccag gaaatgccag 1320
caggttgact acaaaaccaa gactgggcca tctttctccc aggtctctgc cctgccctgc 1380
agcccctccc agctgcactg cccagctcat gtttgttaag atgaagatct aagaaaagtg 1440
ctcccagaat tcccttgtgg cacagcaggt taaagatctg gtgttgtcac tgcatcggct 1500
tgggtcactg ctgtggtgta ggtttgatcc ctggcccagg aacttccaca tgctgcaagc 1560
gtggccaaac aaacaaaaca aaacaaacaa aataagaaag gagctcccct gctcaaactt 1620
tagaggctct ttttgtggca gataagggct cgcctctcca tgatccagcc cctgccttcc 1680
agcccggcca cctctgccat catgctgccc ctgctccgcc ctgtcactca gacttcagca 1740
gtactgaggc ttctgaagat cctgaagtgc acgtgtgtgc cttcatgcct cagtgccttt 1800
gcacttgctc ctgtctgccc cagcagtcac ggcggtgttc ctctccaggc cccgataacc 1860
ttgtccttca gatctgagcc tcttacaggc cttcccaccc cagacacata cttccttcct 1920
gttccttctc tactctgaac atgcttcctt tatagcaatt gctaggttgt gccaaacaga 1980
ggaggcaatt tttttttttt ttttttgtct taatggccat acagagacat atggaagttc 2040
ccgggccagg gatcaagccg agccacagct gcaatcttca tcagttacag cattgcagat 2100
ccttacctcc ctgcactgct gcaccacagc aggaacgcca gtcttttttt ttttgtcttt 2160
cttagcactg tacctaccca gagtcgttcc tgccagggag tggatcgcct tgcctctggg 2220
ggcacccaag gctctcactc ccctggacct gtttgtgcac atagagaggg atgtgttgga 2280
tgctccccat tcctcagctt ccttccagct ccgatgtcct gtgagccctc tccctgacct 2340
ctggctcctt cctctctgcc cccttcctct cagctcgagg cagccctggg tgaggccaag 2400
aaacaacttc aggatgagat gctgcgccga gtggatgccg agaacaggct gcagaccctg 2460
aaggaggagc tggacttcca gaagaacatt tacagcgagg tggggactgt gccctgagac 2520
cggaggacag acgtcagagc tggggctggg acattggctg tgtgcagagc tcccctgcct 2580
gactcccttg tactagtgga tggggagttg ggtctggggg gacggggagt ggccagccct 2640
caggttaaag gggggctcac agtggctcca ttcgcggtta ggattgggtc gggagctcag 2700
ccacctgcct gggtcccatc ctcagaggac tagttctgat tttggtttct gggtccaacc 2760
cttccaggag cttcgggaga ccaagcgccg ccatgagacg cggctggtgg agattgataa 2820
tgggaagcag cgcgagtttg agagccggct ggcagatgcc ctgcaggagc tgcgggccca 2880
gcacgaggac caggtggaac agtacaagaa ggagctggag aagacctatt ctgccaag 2938
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggatgagatg ctgcgccgag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggctgcag accctgaagg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaacaggctg cagaccctga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgaggccaag aaacaacttc 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caccggatga gatgctgcgc cgag 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaacctcggc gcagcatctc atcc 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caccgcaggc tgcagaccct gaagg 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaacccttca gggtctgcag cctgc 25
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caccgaacag gctgcagacc ctga 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaactcaggg tctgcagcct gttc 24
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caccgtgagg ccaagaaaca acttc 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaacgaagtt gtttcttggc ctcac 25
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttctagctct aaaacctcgg cgcagcatct catcccctat agtgagtcgt attaatttc 59
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgccgaggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaactt 59
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttctagctct aaaactcagg gtctgcagcc tgttccctat agtgagtcgt attaatttc 59
<210> 23
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
accctgagtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaactt 59
<210> 24
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggcttgtcgg actcttcgct attacgccag ctggcgaagg gggatgtgct gcaaggcgat 60
taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgtta ggaaattaat acgactcact 120
ataggggatg agatgctgcg ccgaggtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 180
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttt 225
<210> 25
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggcttgtcgg actcttcgct attacgccag ctggcgaagg gggatgtgct gcaaggcgat 60
taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgtta ggaaattaat acgactcact 120
atagggaaca ggctgcagac cctgagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 180
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttt 225
<210> 26
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctgggtgagg ccaagaaaca acttcaggat gagatgctgc gccgagttga tgccgagaag 60
aggctgcaga ccctgaaaga gaagctggac ttccagaaga acatttacag cgaggtgggg 120
actgtgccct 130

Claims (4)

1.用于构建LMNA基因突变的基因编辑系统，其特征在于包含Cas9蛋白、LMNA-T7-gRNA1、LMNA-T7-gRNA3；还包含核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示单链DNA作为Donor DNA；所述的LMNA-T7-gRNA1的转录模板如SEQ ID NO.24所示，LMNA-T7-gRNA3的转录模板如SEQ IDNO.25所示；所述的Cas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4中第5701-9801位核苷酸所示。
2. 根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于所述的Cas9蛋白由SEQ ID NO.4所示的pKG-GE4质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)，经IPTG诱导表达后对菌体粗提、Ni-NTA琼脂糖柱纯化获得融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS，并经带his标签的重组牛肠激酶（EK）酶切该融合蛋白，最后分离纯化Cas9蛋白所得。
3.根据权利要求2所述的基因编辑系统，其特征在于所述的基因编辑系统中Cas9蛋白：LMNA-T7-gRNA1：LMNA-T7-gRNA3的质量比为4:1:1。
4.权利要求1-3中任一项所述的基因编辑系统在制备LMNA基因突变的猪重组细胞中的应用。
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