CN112522261B

CN112522261B - 用于制备lmna基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞的crispr系统及其应用

Info

Publication number: CN112522261B
Application number: CN202011170395.1A
Authority: CN
Inventors: 牛冬; 汪滔; 陶裴裴; 曾为俊; 王磊; 程锐; 马翔; 赵泽英; 刘璐; 黄彩云
Original assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Current assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2040-10-28
Also published as: CN112522261A

Abstract

本发明公开了一种用于制备LMNA基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用。本发明提供了一种试剂盒，包括sgRNA_{LMNA‑E7‑g1}或质粒pKG‑U6gRNA(LMNA‑E7‑g1)。sgRNA_{LMNA‑E7‑g1}，的靶序列结合区如SEQ ID NO：6中第1‑20位核苷酸所示。质粒pKG‑U6gRNA(LMNA‑E7‑g1)，其转录得到sgRNA_{LMNA‑E7‑g1}。本发明还保护一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将质粒pKG‑U6gRNA(LMNA‑E7‑g1)和质粒pKG‑GE3共转染猪细胞，得到重组细胞。本发明为通过基因编辑手段获得扩张型心肌病猪模型奠定了坚实的基础，本发明对于扩张型心肌病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

Description

用于制备LMNA基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞的 CRISPR系统及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于制备LMNA基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用。

背景技术

扩张型心肌病(DCM，dilated cardiomyopathy，又称充血性心肌病)是一种原因未明的原发性心肌疾病。临床表现患者以中年人居多。起病多缓慢，有时可达10年以上。症状为左或右心室或双侧心室扩大，并伴有心室收缩功能减退，伴或不伴充血性心力衰竭，以室性或房性心律失常、气短和水肿最为常见。此外，尚可有脑、肾、肺等处的栓塞，病情呈进行性加重，死亡可发生于疾病的任何阶段。已经在30％至40％的DCM患者中发现了遗传病因，但其中只有50％与已知的致病基因变异相关。

在所有DCM病例中，约有6％是由LMNA基因(定位于人1q21.2)突变引起的。LaminA/C(层粘蛋白A和C)是LMNA基因的两个可变剪接产物，在所有体细胞中均有表达。LMNA中的突变多以组织特有的方式发生，大多数引起骨骼肌受累的心肌病。超过200种不同的LMNA突变已被证实与遗传性心肌病有关，主要是DCM，且主要以常染色体显性方式遗传，但也有报道常染色体隐性病例。DCM在出现心室扩张的证据之前，可能与传导系统疾病有关，而LMNA突变引起的心脏传导系统疾病包括窦房结疾病、房性心律不齐、房室心脏传导阻滞和室性心律失常等。目前缺乏DCM的大动物模型以进行相关机制的深入研究，开发需求迫在眉睫。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的胚胎干细胞注射到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于制备LMNA基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用。

本发明提供了一种试剂盒，包括sgRNA_LMNA-E7-g1。所述试剂盒还包括质粒pKG-GE3。

本发明还提供了一种试剂盒，包括质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)。所述试剂盒还包括质粒pKG-GE3。

本发明还保护sgRNA_LMNA-E7-g1。

本发明还保护质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)。

sgRNA_LMNA-E7-g1，即一种sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：6中第1-20位核苷酸所示。具体的，sgRNA_LMNA-E7-g1如SEQ ID NO：6所示。

质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)，即一种质粒，其转录得到sgRNA_LMNA-E7-g1。

本发明还保护sgRNA_LMNA-E7-g1在制备试剂盒中的应用。

本发明还保护质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)在制备试剂盒中的应用。

本发明还保护sgRNA_LMNA-E7-g1和质粒pKG-GE3在制备试剂盒中的应用。

本发明还保护质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3在制备试剂盒中的应用。

以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备扩张型心肌病猪模型；(c)制备扩张型心肌病猪细胞模型。所述重组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述重组细胞，即将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3共转染受体细胞得到的重组细胞。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3的摩尔配比具体可为3：1。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3的质量配比具体可为0.92μg：1.08μg。受体细胞、质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3的配比依次为约20万个受体细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。制备扩张型心肌病猪模型时，先制备所述重组细胞，然后将所述重组细胞作为核移植供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆猪，即为扩张型心肌病猪模型。还可以用扩张型心肌病猪模型制备扩张型心肌病猪细胞模型，即分离扩张型心肌病猪模型的相应细胞，即为扩张型心肌病猪细胞模型。

本发明还保护sgRNA_LMNA-E7-g1或质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)或所述试剂盒在制备重组细胞中的应用。所述重组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述重组细胞，即将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3共转染受体细胞得到的重组细胞。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3的摩尔配比具体可为3：1。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3的质量配比具体可为0.92μg：1.08μg。受体细胞、质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3的配比依次为约20万个受体细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。

本发明还保护sgRNA_LMNA-E7-g1或质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)或所述试剂盒在制备扩张型心肌病猪模型中的应用。本发明还保护sgRNA_LMNA-E7-g1或质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)或所述试剂盒在制备扩张型心肌病猪细胞模型中的应用。制备扩张型心肌病猪模型时，先制备所述重组细胞，然后将所述重组细胞作为核移植供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆猪，即为扩张型心肌病猪模型。还可以用扩张型心肌病猪模型制备扩张型心肌病猪细胞模型，即分离扩张型心肌病猪模型的相应细胞，即为扩张型心肌病猪细胞模型。

本发明还保护一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪细胞，得到重组细胞。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3的摩尔配比具体可为3：1。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3的质量配比具体可为0.92μg：1.08μg。猪细胞、质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3的配比依次为约20万个猪细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。

本发明还保护所述方法制备得到的重组细胞。

本发明还保护所述重组细胞在制备扩张型心肌病猪模型中的应用。本发明还保护所述重组细胞在制备扩张型心肌病猪细胞模型中的应用。制备扩张型心肌病猪模型时，将所述重组细胞作为核移植供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆猪，即为扩张型心肌病猪模型。还可以用扩张型心肌病猪模型制备扩张型心肌病猪细胞模型，即分离扩张型心肌病猪模型的相应细胞，即为扩张型心肌病猪细胞模型。

以上任一所述重组细胞为LMNA基因发生基因编辑的重组细胞。

以上任一所述重组细胞为LMNA基因缺陷的重组细胞。

以上任一所述重组细胞为LMNA基因发生突变的重组细胞。所述突变可为杂合突变(对应基因型为杂合突变型)或纯合突变(对应的基因型为双等位基因相同突变型或双等位基因不同突变型)。

具体来说，所述重组细胞可为如下任一：表1中编号为3、4、5、6、7、8、9、11、12、14、15、16、17、18、22、23、25、26、27、29、31、32、33、36、39、40的单克隆细胞株。

sgRNA_LMNA-E7-g1靶点：5’-GGATGAGATGCTGCGCCGAG-3’。

具体来说，所述质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNA_LMNA-E7-g1的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的。

质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；

所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；

质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；

质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。

质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。

所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。

所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。

所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。

自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911-6706位核苷酸所示。

CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395-680位核苷酸所示。

EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682-890位核苷酸所示。

WPRE序列元件如SEQ ID NO：2中第6722-7310位核苷酸所示。

3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382-7615位核苷酸所示。

bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647-7871位核苷酸所示。

质粒pKG-GE3具体如SEQ ID NO：2所示。

质粒pKG-U6gRNA中，具有SEQ ID NO：3中第2280-2637位核苷酸所示的DNA分子。

质粒pKG-U6gRNA具体如SEQ ID NO：3所示。

猪LMNA基因信息：编码prelamin-A/C；位于4号染色体；GeneID为100126859，Susscrofa。猪LMNA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：4所示。基因组DNA中，猪LMNA基因具有16个外显子，猪LMNA基因自第6外显子至第8外显子之间的区域如SEQ ID NO：5所示。

以上任一所述LMNA基因具体可为编码SEQ ID NO：4所示蛋白质的基因。以上任一所述LMNA基因具体可为具有SEQ ID NO：5所示DNA分子的基因。以上任一所述LMNA基因为猪LMNA基因。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。

大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本也高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。

而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、营养代谢、疾病发病机制方面等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一胎多仔，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本较灵长类低得多；而且猪作为人类长期以来的肉食性动物，用猪作为疾病模型动物在动物保护和伦理等方面的要求较低。

(2)采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。

(3)采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型[纯合突变(包括双等位基因相同突变和双等位基因不同突变)、杂合突变或野生型]，获得纯合突变的概率为30％～50％，大大优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得纯合突变的概率(低于5％)。

(4)利用本发明所得到的纯合突变单克隆细胞株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。

在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得纯合突变后代的概率非常低(低于5％)，需要进行后代的杂交选育，这不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。因此，本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单克隆细胞的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。

本发明为通过基因编辑手段获得扩张型心肌病猪模型奠定了坚实的基础，将有助于研究并揭示DCM发病机制，进一步的可用于进行药物筛选、药效检测、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，进而为成功治疗人类DCM提供有力的实验手段。本发明对于扩张型心肌病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

附图说明

图1为质粒pX330的结构示意图。

图2为质粒pKG-GE3的结构示意图。

图3为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。

图4为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。

图5为实施例2中以3只猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增后的电泳图。

图6为实施例2中以18只猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增后的电泳图。

图7为实施例2的步骤四中的测序峰图。

图8为实施例3中得到的单克隆细胞的靶基因PCR产物电泳图。

图9为编号LMNA-1的单克隆细胞的正向测序与野生型比对的结果。

图10为编号为LMNA-4的单克隆细胞的正向测序与野生型比对的结果。

图11为编号为LMNA-5的单克隆细胞的正向测序与野生型比对的结果。

图12为编号为LMNA-3的单克隆细胞的正向测序和反向测序同时与野生型比对的结果。

图13为质粒配比优化时的测序结果。

图14为质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较时的测序结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中构建的重组质粒，均已进行测序验证。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％Penicillin-Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37℃，5％CO₂、5％O₂的恒温培养箱。

制备猪原代成纤维细胞的方法：①取猪耳组织0.5g，除毛，然后用75﹪酒精浸泡30-40s，然后用含5％(体积比)Penicillin-Streptomycin(Gibco)的PBS缓冲液洗涤5次，然后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为10的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后重悬于完全培养液。

实施例1、质粒的制备

制备质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，如SEQ ID NO：1所示。质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，简称质粒pX330。

制备质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，如SEQ ID NO：2所示。质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称质粒pKG-GE3。

制备质粒pKG-U6gRNA，如SEQ ID NO：3所示。

质粒pX330、质粒pKG-GE3、质粒pKG-U6gRNA均为环形质粒。

质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。

质粒pKG-GE3的结构示意图见图2。SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。

与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

质粒pKG-U6gRNA的结构示意图见图3。SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，示意图见图4,在细胞中重组质粒转录得到gRNA。

实施例2、LMNA基因敲除的靶点的筛选

猪LMNA基因信息：编码prelamin-A/C；位于4号染色体；GeneID为100126859，Susscrofa。猪LMNA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：4所示。基因组DNA中，猪LMNA基因具有16个外显子，猪LMNA基因自第6外显子至第8外显子之间的区域如SEQ ID NO：5所示。SEQ ID NO：5中，第1-157位核苷酸为第6外显子，第2374-2499位核苷酸为第7外显子，第2768-2938位核苷酸为第8外显子。

一、LMNA基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

18只初生从江香猪，其中雌性10只(分别命名1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)、雄性8只(分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H)。

分别以3只猪(雌性，1、2、3)的基因组DNA为模板，分别采用LMNA-E7gRNA-JDF1和LMNA-E7gRNA-JDR1组成的引物对或LMNA-E7gRNA-JDF2和LMNA-E7gRNA-JDR2组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图5。LMNA-E7gRNA-JDF1和LMNA-E7gRNA-JDR1组成的引物对效果更好。

分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用LMNA-E7gRNA-JDF1和LMNA-E7gRNA-JDR1组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图6。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的LMNA基因序列进行比对分析。

LMNA-E7gRNA-JDF1：5’-AGTCGTTCCTGCCAGGGAGTG-3’；

LMNA-E7gRNA-JDR1：5’-CGTCTCATGGCGGCGCTTGGT-3’。

LMNA-E7gRNA-JDF2：5’-ACCACAGCAGGAACGCCAGTC-3’；

LMNA-E7gRNA-JDR2：5’-TCTGCCAGCCGGCTCTCAAAC-3’。

二、筛选靶点

通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。

4个靶点分别如下：

sgRNA_LMNA-E7-g1靶点：5’-GGATGAGATGCTGCGCCGAG-3’；

sgRNA_LMNA-E7-g2靶点：5’-CAGGCTGCAGACCCTGAAGG-3’；

sgRNA_LMNA-E7-g3靶点：5’-GAACAGGCTGCAGACCCTGA-3’；

sgRNA_LMNA-E7-g4靶点：5’-TGAGGCCAAGAAACAACTTC-3’。

三、制备重组质粒

取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。

分别合成LMNA-E7-gRNA1-S和LMNA-E7-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)表达SEQ ID NO：6所示的sgRNA_LMNA-E7-g1。

SEQ ID NO：6：

GGAUGAGAUGCUGCGCCGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

分别合成LMNA-E7-gRNA2-S和LMNA-E7-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g2)。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g2)表达SEQ ID NO：7所示的sgRNA_LMNA-E7-g2。

SEQ ID NO：7：

CAGGCUGCAGACCCUGAAGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaa aaguggcaccgagucggugcuuuu

分别合成LMNA-E7-gRNA3-S和LMNA-E7-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g3)。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g3)表达SEQ ID NO：8所示的sgRNA_LMNA-E7-g3。

SEQ ID NO：8：

GAACAGGCUGCAGACCCUGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaa aaguggcaccgagucggugcuuuu

分别合成LMNA-E7-gRNA4-S和LMNA-E7-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g4)。质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g4)表达SEQ ID NO：9所示的sgRNA_LMNA-E7-g4。

SEQ ID NO：9：

UGAGGCCAAGAAACAACUUCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

LMNA-E7-gRNA1-S：5’-caccGGATGAGATGCTGCGCCGAG-3’；

LMNA-E7-gRNA1-A：5’-aaacCTCGGCGCAGCATCTCATCC-3’；

LMNA-E7-gRNA2-S：5’-caccgCAGGCTGCAGACCCTGAAGG-3’；

LMNA-E7-gRNA2-A：5’-aaacCCTTCAGGGTCTGCAGCCTGc-3’；

LMNA-E7-gRNA3-S：5’-caccGAACAGGCTGCAGACCCTGA-3’；

LMNA-E7-gRNA3-A：5’-aaacTCAGGGTCTGCAGCCTGTTC-3’；

LMNA-E7-gRNA4-S：5’-caccgTGAGGCCAAGAAACAACTTC-3’；

LMNA-E7-gRNA4-A：5’-aaacGAAGTTGTTTCTTGGCCTCAc-3’。

LMNA-E7-gRNA1-S、LMNA-E7-gRNA1-A、LMNA-E7-gRNA2-S、LMNA-E7-gRNA2-A、LMNA-E7-gRNA3-S、LMNA-E7-gRNA3-A、LMNA-E7-gRNA4-S、LMNA-E7-gRNA4-A均为单链DNA分子。

四、不同靶点的编辑效率比较

初生从江香猪(雌性，血型AO)，制备猪原代成纤维细胞。

1、共转染

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第五组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。

共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。

2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后裂解细胞并提取基因组DNA，采用LMNA-E7gRNA-JDF1和LMNA-E7gRNA-JDR1组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，电泳图见图7。回收目标片段并进行测序，利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第四组的编辑效率依次为43％、24％、27％、15％。第五组不发生基因编辑。结果表明，第一组编辑效率最高，sgRNA_LMNA-E7-g1的靶点为最优靶点。

实施例3、利用体细胞克隆的方法制备LMNA基因编辑单克隆细胞

初生从江香猪(雌性，血型AO)，制备猪原代成纤维细胞。

1、共转染

将质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后用完全培养液洗涤，然后用完全培养液重悬，然后分别挑取各个单克隆转移到96孔板中(每个孔1个细胞，每个孔中装有100μl完全培养液)，培养2周(每2-3天更换新的完全培养液)。

4、完成步骤3后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞(每孔得到的细胞，约2/3接种到装有完全培养液的6孔板中，剩余的1/3收集在1.5mL离心管中)。

5、取步骤4的6孔板，培养直至细胞长至80％汇合度，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。

6、取步骤4的离心管，取细胞，提取基因组DNA，采用LMNA-E7gRNA-JDF1和LMNA-E7gRNA-JDR1组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。将猪原代成纤维细胞作为野生型对照。电泳图见图8。图8中的泳道编号与表1中的细胞编号一致。

7、完成步骤6后，回收PCR扩增产物并测序。

猪原代成纤维细胞的测序结果只有一种，其基因型为纯合野生型。如果某一单克隆细胞的测序结果有两种，一种与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，另一种与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为杂合型；如果某一单克隆细胞的测序结果为两种，均与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型；如果某一单克隆细胞的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型；如果某一单克隆细胞的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，该单克隆细胞的基因型为纯合野生型。

结果见表1。编号为4、6、7、9、12、15、22、23、25、26、29、31、36、39、40的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为3、8、17、18、33的单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型。编号为5、11、14、16、27、32的单克隆细胞的基因型为杂合型。得到基因编辑单克隆细胞的比率为26/40。

示例性的测序比对结果见图9至图12。图9是编号为LMNA-1的单克隆细胞的正向测序与野生型比对的结果，判定为纯合野生型。图10是编号为LMNA-4的单克隆细胞的正向测序与野生型比对的结果，判定为双等位基因相同突变型。图11是编号为LMNA-5的单克隆细胞的正向测序与野生型比对的结果，判定为杂合型。图12是编号为LMNA-3的单克隆细胞的正向测序和反向测序同时与野生型比对的结果，判定为双等位基因不同突变型。

表1

/>

实施例4、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

选择位于RAG1基因的高效gRNA靶点：

RAG1-gRNA4的靶点：5’-AGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’。

用于扩增包含靶点的片段的引物如下：

RAG1-nF126：5’-CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA-3’；

RAG1-nR525：5’-TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG-3’。

初生从江香猪(雌性，血型AO)，制备猪原代成纤维细胞。

一、制备重组质粒

取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。分别合成RAG1-4S和RAG1-4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

RAG1-4S：5’-caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’；

RAG1-4A：5’-aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc-3’。

RAG1-4S和RAG1-4A均为单链DNA分子。

二、质粒配比优化

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：1：1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：2：1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：3：1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染致猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。

电泳后回收目的条带并进行测序，测序结果见图13。

通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第三组的基因编辑效率依次为9％、53％、66％。第四组不发生基因编辑。结果表明，第三组编辑效率最高，确定单gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。

三、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

1、共转染

RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330。

RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。

通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。RAG1-B组不发生基因编辑。RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率依次为28％、68％。测序结果示例性峰图见图14。结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 南京启真基因工程有限公司

<120> 用于制备LMNA基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞的CRISPR系统及其应用

<130> GNCYX202375

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8484

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840

ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900

agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960

aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020

ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080

gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140

agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200

ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320

ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380

caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440

caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500

gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560

caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620

ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680

gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740

ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800

gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860

cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920

caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980

gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040

gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100

caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160

cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220

cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280

caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340

gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400

cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460

ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520

gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580

ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640

cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700

gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760

catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820

cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880

cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940

gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000

gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060

cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120

cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180

cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240

cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300

gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360

caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420

cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480

ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540

cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600

ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660

gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720

cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780

cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840

gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900

cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960

cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020

tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080

taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140

acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200

agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260

ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320

cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380

ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440

taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500

ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560

cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620

gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680

caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740

cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800

caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860

cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920

ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980

aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040

tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100

tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160

gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220

cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280

gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340

ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400

caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460

ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520

tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700

ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500

ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980

ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460

tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484

<210> 2

<211> 10476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360

gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600

ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660

tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720

ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780

gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840

cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900

cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960

caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020

gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080

cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140

cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200

cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260

cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320

cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380

agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440

ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500

ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560

cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620

ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680

caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740

gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800

gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860

ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920

cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980

gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040

ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100

agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160

ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220

actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280

cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340

tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400

cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460

gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520

ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580

gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640

atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700

cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760

cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820

cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880

caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940

cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000

gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060

cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120

cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180

ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240

cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300

gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360

gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420

caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480

cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540

ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600

ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660

caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720

cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780

gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840

aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900

gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960

ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020

cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080

cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140

aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200

cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260

aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320

catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380

gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440

taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500

agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560

catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620

agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680

cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740

gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800

ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860

gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920

caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980

tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040

caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100

ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160

caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220

gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280

aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340

gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400

cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460

cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520

cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580

cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640

cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700

cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760

caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820

gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880

gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940

ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000

cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060

caggggaagt cttctaacat gcggggacgt ggaggaaaat cccggcccaa ccgagtacaa 6120

gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6180

cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240

ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300

ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360

ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6420

gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6480

ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6540

ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6600

ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660

cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720

caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780

tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840

tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900

gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960

tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020

tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080

gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140

cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200

caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260

tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320

agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380

ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7560

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620

cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 7800

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860

gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920

atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980

cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg 8040

ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100

taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160

aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220

ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280

tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggtctatt 8340

ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400

ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460

cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580

caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640

tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700

ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760

gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820

cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 9360

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 9420

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480

ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540

cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600

atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 9660

cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 9960

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476

<210> 3

<211> 3120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280

ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340

tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520

gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640

tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700

ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880

ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940

gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120

<210> 4

<211> 664

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 4

Met Glu Thr Pro Ser Gln Arg Arg Ala Thr Arg Ser Gly Ala Gln Ala

1 5 10 15

Ser Ser Thr Pro Leu Ser Pro Thr Arg Ile Thr Arg Leu Gln Glu Lys

20 25 30

Glu Asp Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Leu Ala Val Tyr Ile Asp Arg

35 40 45

Val Arg Ser Leu Glu Thr Glu Asn Ala Gly Leu Arg Leu Arg Ile Thr

50 55 60

Glu Ser Glu Glu Val Val Ser Arg Glu Val Ser Gly Ile Lys Ser Ala

65 70 75 80

Tyr Glu Ala Glu Leu Gly Asp Ala Arg Lys Thr Leu Asp Ser Val Ala

85 90 95

Lys Glu Arg Ala Arg Leu Gln Leu Glu Leu Ser Lys Val Arg Glu Glu

100 105 110

Phe Lys Glu Leu Lys Ala Arg Asn Thr Lys Lys Glu Gly Asp Leu Met

115 120 125

Ala Ala Gln Ala Arg Leu Lys Asp Leu Glu Ala Leu Leu Asn Ser Lys

130 135 140

Glu Ala Ala Leu Ser Thr Ala Leu Ser Glu Lys Arg Thr Leu Glu Gly

145 150 155 160

Glu Leu His Asp Leu Arg Gly Gln Val Ala Lys Leu Glu Ala Ala Leu

165 170 175

Gly Glu Ala Lys Lys Gln Leu Gln Asp Glu Met Leu Arg Arg Val Asp

180 185 190

Ala Glu Asn Arg Leu Gln Thr Leu Lys Glu Glu Leu Asp Phe Gln Lys

195 200 205

Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Leu Arg Glu Thr Lys Arg Arg His Glu Thr

210 215 220

Arg Leu Val Glu Ile Asp Asn Gly Lys Gln Arg Glu Phe Glu Ser Arg

225 230 235 240

Leu Ala Asp Ala Leu Gln Glu Leu Arg Ala Gln His Glu Asp Gln Val

245 250 255

Glu Gln Tyr Lys Lys Glu Leu Glu Lys Thr Tyr Ser Ala Lys Leu Asp

260 265 270

Asn Ala Arg Gln Ser Ala Glu Arg Asn Ser Asn Leu Val Gly Ala Ala

275 280 285

His Glu Glu Leu Gln Gln Ser Arg Ile Arg Ile Asp Ser Leu Ser Ala

290 295 300

Gln Leu Ser Gln Leu Gln Lys Gln Leu Ala Ala Lys Glu Ala Lys Leu

305 310 315 320

Arg Asp Leu Glu Asp Ser Leu Ala Arg Glu Arg Asp Thr Ser Arg Arg

325 330 335

Leu Leu Ala Asp Lys Glu Arg Glu Met Ala Glu Met Arg Ala Arg Met

340 345 350

Gln Gln Gln Leu Asp Glu Tyr Gln Glu Leu Leu Asp Ile Lys Leu Ala

355 360 365

Leu Asp Met Glu Ile His Ala Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu

370 375 380

Glu Arg Leu Arg Leu Ser Pro Ser Pro Thr Ser Gln Arg Ser Arg Gly

385 390 395 400

Arg Ala Ser Ser His Ser Ser Gln Thr Gln Ser Gly Gly Ser Val Thr

405 410 415

Lys Lys Arg Lys Leu Glu Ser Ser Glu Ser Arg Ser Ser Phe Ser Gln

420 425 430

His Ala Arg Thr Ser Gly Arg Val Ala Val Glu Glu Val Asp Glu Glu

435 440 445

Gly Lys Phe Val Arg Leu Arg Asn Lys Ser Asn Glu Asp Gln Ser Met

450 455 460

Gly Asn Trp Gln Ile Lys Arg Gln Asn Gly Asp Asp Pro Leu Leu Thr

465 470 475 480

Tyr Arg Phe Pro Pro Lys Phe Thr Leu Lys Ala Gly Gln Val Val Thr

485 490 495

Ile Trp Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr His Ser Pro Pro Ala Asp Leu

500 505 510

Val Trp Lys Ser Gln Asn Thr Trp Gly Cys Gly Asn Ser Leu Arg Thr

515 520 525

Ala Leu Ile Asn Ser Thr Gly Glu Glu Val Ala Met Arg Lys Leu Val

530 535 540

Arg Ser Val Thr Met Ile Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Gly Asp Asp

545 550 555 560

Leu Leu His His His His Gly Ser His Gly Ser Ser Ser Gly Asp Pro

565 570 575

Ala Glu Tyr Asn Leu Arg Ser Arg Thr Val Leu Cys Gly Thr Cys Gly

580 585 590

Gln Pro Ala Asp Lys Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gly Ala Gln Val Gly

595 600 605

Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ser Ser Val Thr Val Thr Arg

610 615 620

Ser Tyr Arg Ser Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Phe Gly Asp Asn

625 630 635 640

Leu Val Thr Arg Ser Tyr Leu Leu Gly Asn Ser Arg Pro Arg Thr Gln

645 650 655

Ser Pro Gln Asn Cys Ser Ile Met

660

<210> 5

<211> 2938

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 5

caataccaag aaggagggag acttgatggc cgcccaggcc cggctcaagg acctggaggc 60

tctgctcaac tccaaggagg cagcactgag caccgctctc agcgagaagc gcacgctgga 120

aggcgagctg catgacctgc gaggacaagt ggccaaggtg gggcccacct gccccctgtc 180

cccctgcccc caaacaaata cacactcttc caccccaggt gctctcagga ggtacctggt 240

ctgatctgtc acatggcctt ggagccattc acgtgtccta gaattgttgt acccatccag 300

accatattgc acctcctttg ctgcccatgt ccagcagcgt gaatttagaa ggatccgtag 360

gaattcccat cgtagctcag tggttaacgg atctgactag gaaccatgag gttgcgggtt 420

caatccctgg ccccgctcag tgggttaagg atccggcatt gccgtgagct gtggtgtaag 480

ttgcagactt ggcttgggtc ctgtgttgct gtggctgtgg cgtaggccgg cagcagcagc 540

tctgattaga cccctagtct gggaacctcc atatgccatg ggtgcgaccc taaaagacaa 600

aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaggaaagaa aaaaaatcca taaaccattt ccatttaact 660

tcgcaatgaa ttgtgcctgg ccctggatcc ctcctggtct ggccctgctg tagagagctg 720

tgatctcttt ggaagatggg agaagaatat agaccatcca cagagccctg gttgtaggaa 780

gctgatggtt aatcacatat agatgcatgt tcttcttctt cttttttttt ttttttttgc 840

tttttagggt cacactcgca gcatatggaa gttcccaggc tacaccacag ccacagcaac 900

gtgggatcca agccgcatcc gtgacctaca ccacagctca cggcaatgcc agatccttaa 960

cccactgagc aaggccaggg attgagctcg aatcctcatg gataccagtc gtgtttgtta 1020

ccactgaacc atgacgggaa ctccttttat gttttttaag attcatgttc ttagtggttg 1080

gcatgtatat catgtgtatg caatggtctt tactttcaaa acactttgct atctatcctt 1140

tctcttacgt tacaagctag ggaacagaat caaagaagct ggcttgttcc caatctcact 1200

gcctcatctg cccagagcag ggccaggact agagttagtc caagggtcag gtcctgggct 1260

ctctaccccg acgaaggccc tgccaccaca gtaaactgag gagtgaccag gaaatgccag 1320

caggttgact acaaaaccaa gactgggcca tctttctccc aggtctctgc cctgccctgc 1380

agcccctccc agctgcactg cccagctcat gtttgttaag atgaagatct aagaaaagtg 1440

ctcccagaat tcccttgtgg cacagcaggt taaagatctg gtgttgtcac tgcatcggct 1500

tgggtcactg ctgtggtgta ggtttgatcc ctggcccagg aacttccaca tgctgcaagc 1560

gtggccaaac aaacaaaaca aaacaaacaa aataagaaag gagctcccct gctcaaactt 1620

tagaggctct ttttgtggca gataagggct cgcctctcca tgatccagcc cctgccttcc 1680

agcccggcca cctctgccat catgctgccc ctgctccgcc ctgtcactca gacttcagca 1740

gtactgaggc ttctgaagat cctgaagtgc acgtgtgtgc cttcatgcct cagtgccttt 1800

gcacttgctc ctgtctgccc cagcagtcac ggcggtgttc ctctccaggc cccgataacc 1860

ttgtccttca gatctgagcc tcttacaggc cttcccaccc cagacacata cttccttcct 1920

gttccttctc tactctgaac atgcttcctt tatagcaatt gctaggttgt gccaaacaga 1980

ggaggcaatt tttttttttt ttttttgtct taatggccat acagagacat atggaagttc 2040

ccgggccagg gatcaagccg agccacagct gcaatcttca tcagttacag cattgcagat 2100

ccttacctcc ctgcactgct gcaccacagc aggaacgcca gtcttttttt ttttgtcttt 2160

cttagcactg tacctaccca gagtcgttcc tgccagggag tggatcgcct tgcctctggg 2220

ggcacccaag gctctcactc ccctggacct gtttgtgcac atagagaggg atgtgttgga 2280

tgctccccat tcctcagctt ccttccagct ccgatgtcct gtgagccctc tccctgacct 2340

ctggctcctt cctctctgcc cccttcctct cagctcgagg cagccctggg tgaggccaag 2400

aaacaacttc aggatgagat gctgcgccga gtggatgccg agaacaggct gcagaccctg 2460

aaggaggagc tggacttcca gaagaacatt tacagcgagg tggggactgt gccctgagac 2520

cggaggacag acgtcagagc tggggctggg acattggctg tgtgcagagc tcccctgcct 2580

gactcccttg tactagtgga tggggagttg ggtctggggg gacggggagt ggccagccct 2640

caggttaaag gggggctcac agtggctcca ttcgcggtta ggattgggtc gggagctcag 2700

ccacctgcct gggtcccatc ctcagaggac tagttctgat tttggtttct gggtccaacc 2760

cttccaggag cttcgggaga ccaagcgccg ccatgagacg cggctggtgg agattgataa 2820

tgggaagcag cgcgagtttg agagccggct ggcagatgcc ctgcaggagc tgcgggccca 2880

gcacgaggac caggtggaac agtacaagaa ggagctggag aagacctatt ctgccaag 2938

<210> 6

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaugagaug cugcgccgag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 7

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caggcugcag acccugaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 8

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaacaggcug cagacccuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 9

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ugaggccaag aaacaacuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims

1.一种试剂盒，包括sgRNA_LMNA-E7-g1或质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备扩张型心肌病猪模型；(c)制备扩张型心肌病猪细胞模型；

sgRNA_LMNA-E7-g1，其靶序列结合区如SEQ ID NO：6中第1-20位核苷酸所示；

质粒pKG-U6gRNA(LMNA-E7-g1)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNA_LMNA-E7-g1的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的；

pKG-U6gRNA载体如SEQ ID NO：3所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括质粒pKG-GE3；质粒pKG-GE3如SEQ ID NO：2所示。

3.一种sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：6中第1-20位核苷酸所示。

4.一种质粒，其转录得到权利要求3所述sgRNA。

5.权利要求3所述sgRNA或权利要求4所述质粒在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备扩张型心肌病猪模型；(c)制备扩张型心肌病猪细胞模型。

6.权利要求4所述质粒和权利要求2中所述的质粒pKG-GE3在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备扩张型心肌病猪模型；(c)制备扩张型心肌病猪细胞模型。

7.权利要求3所述sgRNA或权利要求4所述质粒或权利要求1所述试剂盒或权利要求2所述试剂盒的应用，为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备扩张型心肌病猪模型；(c)制备扩张型心肌病猪细胞模型。

8.一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将权利要求4所述质粒和权利要求2中所述的质粒pKG-GE3共转染猪细胞，得到LMNA基因发生突变的重组细胞。