CN112522202B - 制备addi四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

制备addi四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112522202B
CN112522202B CN202011007025.6A CN202011007025A CN112522202B CN 112522202 B CN112522202 B CN 112522202B CN 202011007025 A CN202011007025 A CN 202011007025A CN 112522202 B CN112522202 B CN 112522202B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sgrna
plasmid
gene
dqa
il2rg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011007025.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112522202A (zh
Inventor
牛冬
汪滔
马翔
曾为俊
王磊
程锐
赵泽英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Original Assignee
Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd filed Critical Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Priority to CN202011007025.6A priority Critical patent/CN112522202B/zh
Priority to PCT/CN2020/124634 priority patent/WO2022062055A1/zh
Publication of CN112522202A publication Critical patent/CN112522202A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112522202B publication Critical patent/CN112522202B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0273—Cloned vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种制备ADDI四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒，具体涉及一种制备ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因这四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法、sgRNA组合、质粒组合和试剂盒。本发明还提供了sgRNA组合，由SEQ ID NO：11所示sgRNAADA‑g7、SEQ ID NO：21所示sgRNADQA‑gn2、SEQ ID NO：28所示sgRNADRA‑g1和SEQ ID NO：40所示sgRNAIL2RG‑g7组成。sgRNA组合可用于：制备重组细胞；制备免疫缺陷动物模型。本发明为重症免疫缺陷猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于重症免疫缺陷药物的研发具有重大应用价值。

Description

制备ADDI四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的 方法及其专用试剂盒
技术领域
本发明涉及一种制备ADDI四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒，具体涉及一种制备ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因这四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法、sgRNA组合、质粒组合和试剂盒。
背景技术
重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)是原发性免疫缺陷病中最严重的表型，是指由于遗传、发育或感染等因素导致的T细胞、B细胞和NK细胞同时出现发育、分化、增值、代谢或功能障碍。1950年，Glanzmann和Riniker首次报道了人类婴儿中的SCID病。在全球，SCID的新生儿发病率约为1/50000，该病发病年龄早，临床表现重，且死亡率高。多数SCID是由于免疫相关基因的异常造成的，而SCID的主要遗传方式包括X连锁隐性遗传和常染色体隐性遗传两种。该病发病具有一定的区域性和血缘性，且由于存在X连锁隐性遗传的特性，该病多见于男性患者。
目前，针对于SCID的治疗手段主要包括骨髓或造血干细胞移植和基因治疗。骨髓或干细胞移植是治疗SCID的最佳方案，但是寻找与患者合适配型的供体相当困难。
由常染色体隐性遗传导致的SCID，又分为核苷酸代谢相关酶缺陷和主要组织相容性复合体分子缺陷(major histocompatibility complex,MHC)引起的SCID。核苷酸代谢相关酶中的嘌呤核苷酸化酶相关基因ADA的缺陷会导致细胞内核苷酸代谢产物dATP或dGTP的大量富集，这些产物对淋巴细胞具有选择毒性作用，从而造成淋巴细胞的功能障碍、受损或死亡，进而引发SCID。主要组织相容性复合体分子缺陷导致的SCID是因6号染色体短臂的MHC异常所致，其又分为MHC I类和MHC II类缺陷。I类为TAP基因缺陷造成MHC I类分子结构不稳定所致；II类为SLA-DQA、SLA-DRA等基因缺陷造成MHC II类分子不表达或低表达所致。MHC分子的功能故障会导致T细胞无法识别抗原信号，从而引起其相关的免疫应答缺失，进而引发SCID。
X连锁隐性遗传导致的SCID是最常见的一种类型，其致病突变为编码IL-2Rγ链的IL2RG基因发生突变，从而导致IL-2Rγ链功能发生障碍。而IL-2Rγ链也被称为共有γ链(common gamma chain)，是IL-2、IL-4和IL-7等多种参与调控免疫细胞分化、发育、成熟过程的细胞因子受体与其相应配体结合后，向免疫细胞内部转导信号时所共同使用的信号转导分子。因此，共有γ链的功能障碍会导致免疫细胞的功能或发育异常，从而引发SCID。
作为大动物，猪是人类长期以来主要的肉食来源动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面的要求较低，同时猪体型大小和器官功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。另外，在进行研究生物活性大分子或细胞治疗的效果时，用异源动物进行试验将会产生免疫排斥，从而无法进行有效的动物试验。而用重症联合免疫缺陷模式动物则可避免异种间的免疫排斥问题。因此，研发出人类SCID猪模型用于进行药物(特别是生物活性分子)筛选、药效检测、疾病病理、基因及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类SCID疾病提供有力的实验手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备ADDI四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒，具体涉及一种制备ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因这四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法、sgRNA组合、质粒组合和试剂盒。
本发明提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将质粒pKG-T6gRNA(ADA-g7)、质粒pKG-T6gRNA(DQA-gn2)、质粒pKG-T6gRNA(DRA-g1)、质粒pKG-T6gRNA(IL2RG-g7)和质粒pKG-GE3共转染猪细胞，得到ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因均发生突变的重组细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
所述方法制备得到的重组细胞也属于本发明的保护范围。
具体来说，所述重组细胞可为如下任一：表1至表4中编号为6、12、29、31、45、52的单克隆细胞株。
本发明还保护所述重组细胞在制备免疫缺陷动物模型中的应用。制备免疫缺陷动物模型时，将所述重组细胞作为供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺陷动物模型。还可以用免疫缺陷动物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模型的相应细胞，作为免疫缺陷细胞模型。所述动物模型为猪模型。所述细胞模型为猪细胞模型。
本发明还提供了sgRNA组合，由sgRNAADA-g7、sgRNADQA-gn2、sgRNADRA-g1和sgRNAIL2RG-g7组成。
本发明还提供了质粒组合，由质粒pKG-T6gRNA(ADA-g7)、质粒pKG-T6gRNA(DQA-gn2)、质粒pKG-T6gRNA(DRA-g1)和质粒pKG-T6gRNA(IL2RG-g7)组成。
本发明还提供了一种试剂盒，包括所述sgRNA组合。
本发明还提供了一种试剂盒，包括所述质粒组合。所述试剂盒还包括质粒pKG-GE3。
本发明还保护所述sgRNA组合在制备试剂盒中的应用。
本发明还保护所述质粒组合在制备试剂盒中的应用。
本发明还保护所述质粒组合和质粒pKG-GE3在制备试剂盒中的应用。
以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。制备免疫缺陷动物模型时，先制备所述重组细胞，然后将所述重组细胞作为供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺陷动物模型。还可以用免疫缺陷动物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模型的相应细胞，作为免疫缺陷细胞模型。所述动物具体可为猪。所述动物模型为猪模型。所述细胞模型为猪细胞模型。所述重组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
本发明还保护以上任一所述sgRNA组合或以上任一所述质粒组合或以上任一所述试剂盒在制备重组细胞中的应用。所述重组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
本发明还保护以上任一所述sgRNA组合或以上任一所述质粒组合或以上任一所述试剂盒在制备免疫缺陷动物模型中的应用。应用时，先制备所述重组细胞，然后将所述重组细胞作为供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺陷动物模型。还可以用免疫缺陷动物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模型的相应细胞，作为免疫缺陷细胞模型。所述动物模型为猪模型。所述细胞模型为猪细胞模型。所述动物具体可为猪。所述重组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
以上任一所述重组细胞为ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因均缺陷的细胞。
以上任一所述重组细胞为ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因均发生突变的重组细胞。所述突变可为杂合突变(对应基因型为杂合突变型)或纯合突变(对应的基因型为双等位基因相同突变型或双等位基因不同突变型)。
sgRNAADA-g7靶点：5’-GGAGGGCGTGGTGTACGTGG-3’。
sgRNADQA-gn2靶点：5’-GTAGACATTTAAGCCATAGG-3’。
gRNADRA-g1靶点：5’-TCCACGTGGATATGGAAAAG-3’。
sgRNAIL2RG-g7靶点：5’-TCCCTTCAGAGAATAGATAG-3’。
所述质粒pKG-T6gRNA(ADA-g7)转录得到sgRNAADA-g7。
所述质粒pKG-T6gRNA(DQA-gn2)转录得到sgRNADQA-gn2。
所述质粒pKG-T6gRNA(DRA-g1)转录得到sgRNADRA-g1。
所述质粒pKG-T6gRNA(IL2RG-g7)转录得到sgRNAIL2RG-g7。
所述sgRNAADA-g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：11中第1-20位核苷酸所示。
所述sgRNADQA-gn2的靶序列结合区如SEQ ID NO：21中第1-20位核苷酸所示。
所述sgRNADRA-g1的靶序列结合区如SEQ ID NO：28中第1-20位核苷酸所示。
所述sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：40中第1-20位核苷酸所示。
所述sgRNAADA-g7如SEQ ID NO：11所示。
所述sgRNADQA-gn2如SEQ ID NO：21所示。
所述sgRNADRA-g1如SEQ ID NO：28所示。
所述sgRNAIL2RG-g7如SEQ ID NO：40所示。
具体来说，所述质粒pKG-T6gRNA(ADA-g7)借助限制性内切酶BbsI将sgRNAADA-g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的。
具体来说。所述质粒pKG-T6gRNA(DQA-gn2)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNADQA-gn2的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的。
具体来说，所述质粒pKG-T6gRNA(DRA-g1)借助限制性内切酶BbsI将sgRNADRA-g1的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的。
具体来说。所述质粒pKG-T6gRNA(IL2RG-g7)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的。
质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；
所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；
质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；
质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。
质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。
所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。
所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。
所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。
自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911-6706位核苷酸所示。
CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395-680位核苷酸所示。
EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682-890位核苷酸所示。
WPRE序列元件如SEQ ID NO：2中第6722-7310位核苷酸所示。
3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382-7615位核苷酸所示。
bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647-7871位核苷酸所示。
质粒pKG-GE3具体如SEQ ID NO：2所示。
质粒pKG-U6gRNA中，具有SEQ ID NO：3中第2280-2637位核苷酸所示的DNA分子。
质粒pKG-U6gRNA具体如SEQ ID NO：3所示。
猪ADA基因信息：编码adenosine deaminase；位于17号染色体；GeneID为100625920，Sus scrofa。猪ADA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：4所示。基因组DNA中，猪ADA基因具有12个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：5所示。猪ADA基因为具有sgRNAADA-g7的靶点的基因。猪ADA基因为具有SEQ ID NO：5所示区段的基因。
猪DQA基因信息：编码SLA class II histocompatibility antigen,DQhaplotype D alpha chain precurso；位于7号染色体；GeneID为100153387，Sus scrofa。猪DQA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：14所示(NCBI中的示例性序列)。基因组DNA中，猪DQA基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：15所示(本发明中江香猪的测序结果)。猪DQA基因为具有sgRNADQA-gn2的靶点的基因。猪DQA基因为具有SEQID NO：15所示区段的基因。
猪DRA基因信息：编码MHC class II DR-alpha precursor；位于7号染色体；GeneID为100135040，Sus scrofa。猪DRA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：26所示(NCBI中的示例性序列)。基因组DNA中，猪DRA基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：27所示(本发明中江香猪的测序结果)。猪DRA基因为具有sgRNADRA-g1的靶点的基因。猪DRA基因为具有SEQ ID NO：27所示区段的基因。
猪IL2RG基因信息：编码interleukin 2receptor subunit gamma；位于X染色体；GeneID为397156，Sus scrofa。猪IL2RG基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：32所示。基因组DNA中，猪IL2RG基因具有9个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：33所示。猪IL2RG基因为具有sgRNAIL2RG-g7的靶点的基因。猪DRA基因为具有SEQ ID NO：33所示区段的基因。
以上任一所述免疫缺陷具体可为重症免疫缺陷。
本发明可用于通过基因编辑手段获得重症免疫缺陷猪模型，用于进行药物筛选、药效检测、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，为今后治愈人类重症免疫缺陷打下坚实基础。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。目前未有任何大动物重症免疫缺陷模型被成功研发。大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本也很高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、营养代谢、疾病发病机制等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一窝多胎，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本较灵长类低得多；而且猪作为人类长期以来的肉食性动物，用猪作为疾病模型动物在动物保护和伦理等方面的阻力相对较小。
(2)采用本发明改造的cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体显著提高。
(3)与采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型(纯合突变包括双等位基因相同突变和双等位基因不同突变、杂合突变或野生型)，获得纯合突变的概率为10％～20％；另外，利用所得到的纯合突变单克隆细胞株进行体细胞核移植可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。
本发明为重症免疫缺陷猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于重症免疫缺陷药物的研发具有重大应用价值。
附图说明
图1为质粒pX330的结构示意图。
图2为质粒pKG-GE3的结构示意图。
图3为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。
图4为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。
图5为实施例2的步骤三中MSTN三组的电泳图。
图6为实施例2的步骤三中FNDC5三组的电泳图。
图7为实施例3的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用ADA-GT-F259/ADA-GT-R1005组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图8为实施例3的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
图9为实施例3的步骤四中的测序峰图。
图10为实施例4的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用DQA-GT-F534/DQA-GT-R1332组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图11为实施例4的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
图12为实施例4的步骤四中的测序峰图。
图13为实施例5的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用DRA-GT-F326/DRA-GT-R1192组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图14为实施例5的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
图15为实施例5的步骤四中的测序峰图。
图16为实施例6的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用IL2RG-GT-F4543/IL2RG-GT-R5180组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图17为实施例6的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
图18为实施例6的步骤四中的测序峰图。
图19为实施例7中得到的单克隆细胞的靶基因PCR产物电泳图(采用ADA-nnF229和ADA-nnR456组成的引物对)。
图20为实施例7中得到的单克隆细胞的靶基因PCR产物电泳图(采用DQA-F643和DQA-R1022组成的引物对)。
图21为实施例7中得到的单克隆细胞的靶基因PCR产物电泳图(采用DRA-F573和DRA-R968组成的引物对)。
图22为实施例7中得到的单克隆细胞的靶基因PCR产物电泳图(采用IL2RG-nF33和IL2RG-nR460组成的引物对)。
图23为表1中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
图24为表2中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
图25为表3中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
图26为表4中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％Penicillin-Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱。
实施例3至6中的8只猪均为刚出生从江香猪，其中雌性4只(分别命名1、2、3、4)、雄性4只(分别命名为A、B、C、D)。
制备猪原代成纤维细胞的方法：①取猪耳组织0.5g，除毛，然后用75﹪酒精浸泡30-40s，然后用含5％(体积比)Penicillin-Streptomycin(Gibco)的PBS缓冲液洗涤5次，然后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为9cm的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
用于实施例2至7中的猪原代成纤维细胞均获自上述命名为2的猪(雌性，血型AO)。
实施例1、质粒的制备
制备质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，如SEQ ID NO：1所示。质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，简称质粒pX330。
制备质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，如SEQ ID NO：2所示。质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称质粒pKG-GE3。
制备质粒pKG-U6gRNA，如SEQ ID NO：3所示。
质粒pX330、质粒pKG-GE3、质粒pKG-U6gRNA均为环形质粒。
质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。
质粒pKG-GE3的结构示意图见图2。SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。
与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
质粒pKG-U6gRNA的结构示意图见图3。SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，示意图见图4,在细胞中重组质粒转录得到gRNA。
实施例2、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
选择位于MSTN基因的两个gRNA靶点：
MSTN-gRNA1的靶点：5’-GCTGATTGTTGCTGGTCCCG-3’；
MSTN-gRNA2的靶点：5’-TTTCCAGGCGAAGTTTACTG-3’。
选择位于FNDC5基因的两个gRNA靶点：
FNDC5-gRNA1的靶点：5’-TGTACTCAGTGTCCTCCTCC-3’；
FNDC5-gRNA2的靶点：5’-GCTCTTCAAGACGCCTCGCG-3’。
用于扩增包含靶点的片段的引物为：
MSTN-F896：5’-TCTCTCAGACAGTGCAGGCATTA-3’；
MSTN-R1351：5’-CGTTTCCGTCGTAGCGTGATAAT-3’。
FNDC5-F209：5’-CAGTTCTCACTTGATGGCCTTGG-3’；
FNDC5-R718：5’-AGGGGTCTGGGGAGGAATGG-3’。
一、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成MSTN-1S和MSTN-1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)。
分别合成MSTN-2S和MSTN-2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)。
分别合成FNDC5-1S和FNDC5-1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)。
分别合成FNDC5-2S和FNDC5-2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)。
MSTN-1S：5’-caccGCTGATTGTTGCTGGTCCCG-3’；
MSTN-1A：5’-aaacCGGGACCAGCAACAATCAGC-3’。
MSTN-2S：5’-caccgTTTCCAGGCGAAGTTTACTG-3’；
MSTN-2A：5’-aaacCAGTAAACTTCGCCTGGAAAc-3’。
FNDC5-1S：5’-caccgTGTACTCAGTGTCCTCCTCC-3’；
FNDC5-1A：5’-aaacGGAGGAGGACACTGAGTACAc-3’。
FNDC5-2S：5’-caccGCTCTTCAAGACGCCTCGCG-3’；
FNDC5-2A：5’-aaacCGCGAGGCGTCTTGAAGAGC-3’。
二、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
1、共转染
MSTN-B组：将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)和质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)。
MSTN-330组：将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)、质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)：1.08μg质粒pX330。
MSTN-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)、质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)：质粒0.46μg pKG-U6gRNA(MSTN-2)：1.08μg质粒pKG-GE3。
FNDC5-B组：将质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)和质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)。
FNDC5-330组：将质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)、质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)：1.08μg质粒pX330。
FNDC5-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)、质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)：1.08μg质粒pKG-GE3。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用MSTN-F896和MSTN-R1351组成的引物对(MSTN的三组)进行PCR扩增，或者采用FNDC5-F209和FNDC5-R718组成的引物对(FNDC5的三组)进行PCR扩增，然后进行电泳。
MSTN的三组的结果见图5。
FNDC5的三组的结果见图6。
MSTN-330组基因缺失突变效率为27.6％，MSTN-KG组基因缺失突变效率为86.5％。FNDC5-330组基因缺失突变效率为18.6％，FNDC5-KG组基因缺失突变效率为81.7％。结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。
实施例3、ADA基因敲除的靶点的筛选
一、ADA基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
猪ADA基因信息：编码adenosine deaminase；位于17号染色体；
GeneID为100625920，Sus scrofa。猪ADA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：4所示。基因组DNA中，猪ADA基因具有12个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQID NO：5所示。
分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物ADA-GT-F259/ADA-GT-R1005组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图7。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的ADA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：ADA-nnF229/ADA-nnR456。
ADA-GT-F259：5’-GTTAAGGATCTGGTGTTGCGGTG-3’；
ADA-GT-R1005：5’-GTTCACACTCCTAGACTCCAGCC-3’。
ADA-nnF229：5’-GAGGCCGTCAAAAGGATTGC-3’；
ADA-nnR456：5’-CAAAGTCTCTCTTGGGTCAGGG-3’。
二、筛选靶点
通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到8个靶点。
8个靶点分别如下：
sgRNAADA-g1靶点：5’-AAGGATTGCCTACGAGTTTG-3’；
sgRNAADA-g2靶点：5’-TTGGAGTTGGCCAGCAGGTG-3’；
sgRNAADA-g3靶点：5’-TTTCATCTCCACAAACTCGT-3’；
sgRNAADA-g4靶点：5’-TCAGCCTGGTTCCAGGGGAT-3’；
sgRNAADA-g6靶点：5’-CCTGCTGGCCAACTCCAAAG-3’；
sgRNAADA-g7靶点：5’-GGAGGGCGTGGTGTACGTGG-3’；
sgRNAADA-g8靶点：5’-CAAGGAGGGCGTGGTGTACG-3’；
sgRNAADA-g9靶点：5’-TGTGGAGATGAAAGCCAAGG-3’。
三、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成ADA-g1S和ADA-g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(ADA-g1)。质粒pKG-U6gRNA(ADA-g1))表达SEQ ID NO：6所示的sgRNAADA-g1。
SEQ ID NO：6：
AAGGAUUGCCUACGAGUUUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成ADA-g2S和ADA-g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(ADA-g2)。质粒pKG-U6gRNA(ADA-g2)表达SEQ ID NO：7所示的sgRNAADA-g2。
SEQ ID NO：7：
UUGGAGUUGGCCAGCAGGUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成ADA-g3S和ADA-g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(ADA-g3)。质粒pKG-U6gRNA(ADA-g3)表达SEQ ID NO：8所示的sgRNAADA-g3。
SEQ ID NO：8：
UUUCAUCUCCACAAACUCGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成ADA-g4S和ADA-g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(ADA-g4)。质粒pKG-U6gRNA(ADA-g4)表达SEQ ID NO：9所示的sgRNAADA-g4。
SEQ ID NO：9：
UCAGCCUGGUUCCAGGGGAUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成ADA-g6S和ADA-g6A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8E)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(ADA-g6)。质粒pKG-U6gRNA(ADA-g6)表达SEQ ID NO：10所示的sgRNAADA-g6。
SEQ ID NO：10：
CCUGCUGGCCAACUCCAAAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成ADA-g7S和ADA-g7A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8F)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(ADA-g7)。质粒pKG-U6gRNA(ADA-g7)表达SEQ ID NO：11所示的sgRNAADA-g7。
SEQ ID NO：11：
GGAGGGCGUGGUGUACGUGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成ADA-g8S和ADA-g8A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8G)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(ADA-g8)。质粒pKG-U6gRNA(ADA-g8)表达SEQ ID NO：12所示的sgRNAADA-g8。
SEQ ID NO：12：
CAAGGAGGGCGUGGUGUACGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成ADA-g9S和ADA-g9A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8H)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(ADA-g9)。质粒pKG-U6gRNA(ADA-g9)表达SEQ ID NO：13所示的sgRNAADA-g9。
SEQ ID NO：13：
UGUGGAGAUGAAAGCCAAGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
sgRNA-ADA-1S：5’-caccgAAGGATTGCCTACGAGTTTG-3’；
sgRNA-ADA-1A：5’-aaacCAAACTCGTAGGCAATCCTTc-3’。
sgRNA-ADA-2S：5’-caccgTTGGAGTTGGCCAGCAGGTG-3’；
sgRNA-ADA-2A：5’-aaacCACCTGCTGGCCAACTCCAAc-3’。
sgRNA-ADA-3S：5’-caccgTTTCATCTCCACAAACTCGT-3’；
sgRNA-ADA-3A：5’-aaacACGAGTTTGTGGAGATGAAAc-3’。
sgRNA-ADA-4S：5’-caccgTCAGCCTGGTTCCAGGGGAT-3’；
sgRNA-ADA-4A：5’-aaacATCCCCTGGAACCAGGCTGAc-3’。
sgRNA-ADA-6S：5’-caccgCCTGCTGGCCAACTCCAAAG-3’；
sgRNA-ADA-6A：5’-aaacCTTTGGAGTTGGCCAGCAGGc-3’。
sgRNA-ADA-7S：5’-caccGGAGGGCGTGGTGTACGTGG-3’；
sgRNA-ADA-7A：5’-aaacCCACGTACACCACGCCCTCC-3’。
sgRNA-ADA-8S：5’-caccgCAAGGAGGGCGTGGTGTACG-3’；
sgRNA-ADA-8A：5’-aaacCGTACACCACGCCCTCCTTGc-3’。
sgRNA-ADA-9S：5’-caccgTGTGGAGATGAAAGCCAAGG-3’；
sgRNA-ADA-9A：5’-aaacCCTTGGCTTTCATCTCCACAc-3’。
sgRNA-ADA-1S、sgRNA-ADA-1A、sgRNA-ADA-2S、sgRNA-ADA-2A、sgRNA-ADA-3S、sgRNA-ADA-3A、sgRNA-ADA-4S、sgRNA-ADA-4A、sgRNA-ADA-6S、sgRNA-ADA-6A、sgRNA-ADA-7S、sgRNA-ADA-7A、sgRNA-ADA-8S、sgRNA-ADA-8A、sgRNA-ADA-9S、sgRNA-ADA-9A均为单链DNA分子。
四、不同靶点的编辑效率比较
1、共转染
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(ADA-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(ADA-g1)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(ADA-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(ADA-g2)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(ADA-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(ADA-g3)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(ADA-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(ADA-g4)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第五组：将质粒pKG-U6gRNA(ADA-g6)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(ADA-g6)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第六组：将质粒pKG-U6gRNA(ADA-g7)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(ADA-g7)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第七组：将质粒pKG-U6gRNA(ADA-g8)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(ADA-g8)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第八组：将质粒pKG-U6gRNA(ADA-g9)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(ADA-g9)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第九组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用ADA-nnF229和ADA-nnR456组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图9。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第九组不同靶点的编辑效率依次为19％、17％、9％、0％、2％、35％、29％、20％和0％。结果表明，第六组编辑效率最高，sgRNAADA-g7为最优靶点。
实施例4、DQA基因敲除的靶点的筛选
一、DQA基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
猪DQA基因信息：编码SLA class II histocompatibility antigen,DQhaplotype D alpha chain precurso；位于7号染色体；GeneID为100153387，Sus scrofa。猪DQA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：14所示(NCBI中的示例性序列)。基因组DNA中，猪DQA基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：15所示(本发明中从江香猪的测序结果)。
分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物DQA-GT-F534/DQA-GT-R1332组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图10。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的DQA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：DQA-F643/DQA-R1022。
DQA-GT-F534：5’-TTGCAAAGATAAGGAGGCTTCGC-3’；
DQA-GT-R1332：5’-AGCTCTTGTTTCCCTTCTGCTCA-3。
DQA-F643：5’-CAGATGAAGCCCTTGATATTTGA-3’；
DQA-R1022：5’-AGAAAGGCAGAATGATGAACACA-3’。
二、筛选靶点
通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到10个靶点。
10个靶点分别如下：
sgRNADQA-g1靶点：5’-TTAAGCCATAGGAGGCAACA-3’；
sgRNADQA-g2靶点：5’-GCCATAGGAGGCAACATGGT-3’；
sgRNADQA-g3靶点：5’-CCATGAATTTGATGGCGACG-3’；
sgRNADQA-g4靶点：5’-CCTCGTCGCCATCAAATTCA-3’；
sgRNADQA-gn1靶点：5’-CTGGTAGACATTTAAGCCAT-3’；
sgRNADQA-gn2靶点：5’-GTAGACATTTAAGCCATAGG-3’；
sgRNADQA-gn3靶点：5’-TTAAATGTCTACCAGTCTTA-3’；
sgRNADQA-gn4靶点：5’-AGACAGTCTCCTTCTTCCCC-3’；
sgRNADQA-gn5靶点：5’-TGGGGAAGAAGGAGACTGTC-3’；
sgRNADQA-gn6靶点：5’-TTGACCCACAGGGTGCACTG-3’。
三、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成DQA-g1S和DQA-g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DQA-g1)。质粒pKG-U6gRNA(DQA-g1))表达SEQ ID NO：16所示的sgRNADQA-g1。
SEQ ID NO：16：
UUAAGCCAUAGGAGGCAACAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DQA-g2S和DQA-g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DQA-g2)。质粒pKG-U6gRNA(DQA-g2)表达SEQ ID NO：17所示的sgRNADQA-g2。
SEQ ID NO：17：
GCCAUAGGAGGCAACAUGGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DQA-g3S和DQA-g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DQA-g3)。质粒pKG-U6gRNA(DQA-g3)表达SEQ ID NO：18所示的sgRNADQA-g3。
SEQ ID NO：18：
CCAUGAAUUUGAUGGCGACGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DQA-g4S和DQA-g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DQA-g4)。质粒pKG-U6gRNA(DQA-g4)表达SEQ ID NO：19所示的sgRNADQA-g4。
SEQ ID NO：19：
CCUCGUCGCCAUCAAAUUCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DQA-gn1S和DQA-gn1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11E)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn1)。质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn1)表达SEQ ID NO：20所示的sgRNADQA-gn1。
SEQ ID NO：20：
CUGGUAGACAUUUAAGCCAUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DQA-gn2S和DQA-gn2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11F)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn2)。质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn2)表达SEQ ID NO：21所示的sgRNADQA-gn2。
SEQ ID NO：21：
GUAGACAUUUAAGCCAUAGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DQA-gn3S和DQA-gn3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11G)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn3)。质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn3)表达SEQ ID NO：22所示的sgRNADQA-gn3。
SEQ ID NO：22：
UUAAAUGUCUACCAGUCUUAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DQA-gn4S和DQA-gn4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11H)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn4)。质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn4)表达SEQ ID NO：23所示的sgRNADQA-gn4。
SEQ ID NO：23：
AGACAGUCUCCUUCUUCCCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DQA-gn5S和DQA-gn5A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11I)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn5)。质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn5)表达SEQ ID NO：24所示的sgRNADQA-gn5。
SEQ ID NO：24：
UGGGGAAGAAGGAGACUGUCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DQA-gn6S和DQA-gn6A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11J)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn6)。质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn6)表达SEQ ID NO：25所示的sgRNADQA-gn6。
SEQ ID NO：25：
UUGACCCACAGGGUGCACUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
sgRNA-DQA-1S：5’-caccgTTAAGCCATAGGAGGCAACA-3’；
sgRNA-DQA-1A：5’-aaacTGTTGCCTCCTATGGCTTAAc-3’。
sgRNA-DQA-2S：5’-caccGCCATAGGAGGCAACATGGT-3’；
sgRNA-DQA-2A：5’-aaacACCATGTTGCCTCCTATGGC-3’。
sgRNA-DQA-3S：5’-caccgCCATGAATTTGATGGCGACG-3’；
sgRNA-DQA-3A：5’-aaacCGTCGCCATCAAATTCATGGc-3’。
sgRNA-DQA-4S：5’-caccgCCTCGTCGCCATCAAATTCA-3’；
sgRNA-DQA-4A：5’-aaacTGAATTTGATGGCGACGAGGc-3’。
sgRNA-DQA-n1S：5’-caccgCTGGTAGACATTTAAGCCAT-3’；
sgRNA-DQA-n1A：5’-aaacATGGCTTAAATGTCTACCAGc-3’。
sgRNA-DQA-n2S：5’-caccGTAGACATTTAAGCCATAGG-3’；
sgRNA-DQA-n2A：5’-aaacCCTATGGCTTAAATGTCTAC-3’。
sgRNA-DQA-n3S：5’-caccgTTAAATGTCTACCAGTCTTA-3’；
sgRNA-DQA-n3A：5’-aaacTAAGACTGGTAGACATTTAAc-3’。
sgRNA-DQA-n4S：5’-caccgAGACAGTCTCCTTCTTCCCC-3’；
sgRNA-DQA-n4A：5’-aaacGGGGAAGAAGGAGACTGTCTc-3’。
sgRNA-DQA-n5S：5’-caccgTGGGGAAGAAGGAGACTGTC-3’；
sgRNA-DQA-n5A：5’-aaacGACAGTCTCCTTCTTCCCCAc-3’。
sgRNA-DQA-n6S：5’-caccgTTGACCCACAGGGTGCACTG-3’；
sgRNA-DQA-n6A：5’-aaacCAGTGCACCCTGTGGGTCAAc-3’。
sgRNA-DQA-1S、sgRNA-DQA-1A、sgRNA-DQA-2S、sgRNA-DQA-2A、sgRNA-DQA-3S、sgRNA-DQA-3A、sgRNA-DQA-4S、sgRNA-DQA-4A、sgRNA-DQA-n1S、sgRNA-DQA-n1A、sgRNA-DQA-n2S、sgRNA-DQA-n2A、sgRNA-DQA-n3S、sgRNA-DQA-n3A、sgRNA-DQA-n4S、sgRNA-DQA-n4A、sgRNA-DQA-n5S、sgRNA-DQA-n5A、sgRNA-DQA-n6S、sgRNA-DQA-n6A均为单链DNA分子。
四、不同靶点的编辑效率比较
1、共转染
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(DQA-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-g1)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(DQA-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-g2)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(DQA-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-g3)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(DQA-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-g4)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第五组：将质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn1)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第六组：将质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn2)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第七组：将质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn3)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第八组：将质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn4)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第九组：将质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn5)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn5)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第十组：将质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn6)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn6)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第十一组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用DQA-F643和DQA-R1022组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图12。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第十一组不同靶点的编辑效率依次为35％、29％、11％、0％、12％、44％、11％、0％、12％、40％和0％。结果表明，第六组编辑效率最高，sgRNADQA-gn2为最优靶点。
实施例5、DRA基因敲除的靶点的筛选
一、DRA基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
猪DRA基因信息：编码MHC class II DR-alpha precursor；位于7号染色体；GeneID为100135040，Sus scrofa。猪DRA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：26所示(NCBI中的示例性序列)。基因组DNA中，猪DRA基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：27所示(本发明中从江香猪的测序结果)。
分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物DRA-GT-F326/DRA-GT-R1192组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图13。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的DRA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：DRA-F573/DRA-R968。
DRA-GT-F326：5’-TTTCACGGACAGTCACATGGAGT-3’；
DRA-GT-R1192：5’-ATACCTAGCTCTGAAATCCGCCC-3’。
DRA-F573：5’-TCATCGCCTTCTCTATTTTCCAC-3’；
DRA-R968：5’-CCCCTGGAAGGAAAAGTAAGTCA-3’。
二、筛选靶点
通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。
4个靶点分别如下：
sgRNADRA-g1靶点：5’-TCCACGTGGATATGGAAAAG-3’；
sgRNADRA-g2靶点：5’-CCCTCTTTTCCATATCCACG-3’；
sgRNADRA-g3靶点：5’-AGCTGTGGACAAAGCCAACC-3’；
sgRNADRA-g4靶点：5’-TGCACCCTGAGCCTCAAAGC-3’。
三、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成DRA-g1S和DRA-g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图14A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DRA-g1)。质粒pKG-U6gRNA(DRA-g1)表达SEQ ID NO：28所示的sgRNADRA-g1。
SEQ ID NO：28：
UCCACGUGGAUAUGGAAAAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DRA-g2S和DRA-g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图14B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DRA-g2)。质粒pKG-U6gRNA(DRA-g2)表达SEQ ID NO：29所示的sgRNADRA-g2。
SEQ ID NO：29：
CCCUCUUUUCCAUAUCCACGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DRA-g3S和DRA-g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图14C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DRA-g3)。质粒pKG-U6gRNA(DRA-g3)表达SEQ ID NO：30所示的sgRNADRA-g3。
SEQ ID NO：30：
AGCUGUGGACAAAGCCAACCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成DRA-g4S和DRA-g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图14D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(DRA-g4)。质粒pKG-U6gRNA(DRA-g4)表达SEQ ID NO：31所示的sgRNADRA-g4。
SEQ ID NO：31：
UGCACCCUGAGCCUCAAAGCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
sgRNA-DRA-1S：5’-caccgTCCACGTGGATATGGAAAAG-3’；
sgRNA-DRA-1A：5’-aaacCTTTTCCATATCCACGTGGAc-3’。
sgRNA-DRA-2S：5’-caccgCCCTCTTTTCCATATCCACG-3’；
sgRNA-DRA-2A：5’-aaacCGTGGATATGGAAAAGAGGGc-3’。
sgRNA-DRA-3S：5’-caccgAGCTGTGGACAAAGCCAACC-3’；
sgRNA-DRA-3A：5’-aaacGGTTGGCTTTGTCCACAGCTc-3’。
sgRNA-DRA-4S：5’-caccgTGCACCCTGAGCCTCAAAGC-3’；
sgRNA-DRA-4A：5’-aaacGCTTTGAGGCTCAGGGTGCAc-3’。
sgRNA-DRA-1S、sgRNA-DRA-1A、sgRNA-DRA-2S、sgRNA-DRA-2A、sgRNA-DRA-3S、sgRNA-DRA-3A、sgRNA-DRA-4S、sgRNA-DRA-4A均为单链DNA分子。
四、不同靶点的编辑效率比较
1、共转染
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(DRA-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DRA-g1)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(DRA-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DRA-g2)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(DRA-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DRA-g3)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(DRA-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(DRA-g4)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第五组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用DRA-F573和DRA-R968组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图15。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第五组不同靶点的编辑效率依次为52％、45％、24％、20％和0％。结果表明，第一组编辑效率最高，sgRNADRA-g1为最优靶点。
实施例6、IL2RG基因敲除的靶点的筛选
一、IL2RG基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
猪IL2RG基因信息：编码interleukin 2 receptor subunit gamma；位于X染色体；GeneID为397156，Sus scrofa。猪IL2RG基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：32所示。基因组DNA中，猪IL2RG基因具有9个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：33所示。
分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物IL2RG-GT-F4543/IL2RG-GT-R5180组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图16。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的IL2RG基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：IL2RG-nF33/IL2RG-nR460。
IL2RG-GT-F4543：5’-ATATAGCACAGGGGAGGGAGGAA-3’；
IL2RG-GT-R5180：5’-AGGGTGCGAAGGGTCAGATTC-3’；
IL2RG-nF33：5’-CCCAGGCTTCCCACTATATTCTC-3’；
IL2RG-nR460：5’-CCATTGGATCCCTCACTTCTTCT-3’。
二、筛选靶点
通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到9个靶点。
9个靶点分别如下：
sgRNAIL2RG-g1靶点：5’-CCTGTAGTTTTAGCGTCTGT-3’；
sgRNAIL2RG-g2靶点：5’-CAACAAATGTTTGGTAGAGG-3’；
sgRNAIL2RG-g3靶点：5’-GATGATAAAGTCCAGGAGTG-3’；
sgRNAIL2RG-g4靶点：5’-CTGGACTTTATCATCATTAG-3’；
sgRNAIL2RG-g5靶点：5’-TTGTCCAGCTCCAGGACCCA-3’；
sgRNAIL2RG-g6靶点：5’-GGCCACTATCTATTCTCTGA-3’；
sgRNAIL2RG-g7靶点：5’-TCCCTTCAGAGAATAGATAG-3’；
sgRNAIL2RG-g8靶点：5’-AACATTTGTTGTCCAGCTCC-3’；
sgRNAIL2RG-g9靶点：5’-TGTCCAGCTCCAGGACCCAC-3’。
三、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成IL2RG-g1S和IL2RG-g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g1)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g1)表达SEQ ID NO：34所示的sgRNAIL2RG-g1。
SEQ ID NO：34：
CCUGUAGUUUUAGCGUCUGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g2S和IL2RG-g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g2)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g2)表达SEQ ID NO：35所示的sgRNAIL2RG-g2。
SEQ ID NO：35：
CAACAAAUGUUUGGUAGAGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g3S和IL2RG-g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g3)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g3)表达SEQ ID NO：36所示的sgRNAIL2RG-g3。
SEQ ID NO：36：
GAUGAUAAAGUCCAGGAGUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g4S和IL2RG-g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g4)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g4)表达SEQ ID NO：37所示的sgRNAIL2RG-g4。
SEQ ID NO：37：
CUGGACUUUAUCAUCAUUAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g5S和IL2RG-g5A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17E)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g5)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g5)表达SEQ ID NO：38所示的sgRNAIL2RG-g5。
SEQ ID NO：38：
UUGUCCAGCUCCAGGACCCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g6S和IL2RG-g6A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17F)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g6)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g6)表达SEQ ID NO：39所示的sgRNAIL2RG-g6。
SEQ ID NO：39：
GGCCACUAUCUAUUCUCUGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g7S和IL2RG-g7A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17G)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)表达SEQ ID NO：40所示的sgRNAIL2RG-g7。
SEQ ID NO：40：
UCCCUUCAGAGAAUAGAUAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g8S和IL2RG-g8A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17H)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g8)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g8)表达SEQ ID NO：41所示的sgRNAIL2RG-g8。
SEQ ID NO：41：
AACAUUUGUUGUCCAGCUCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g9S和IL2RG-g9A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17I)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g9)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g9)表达SEQ ID NO：42所示的sgRNAIL2RG-g9。
SEQ ID NO：42：
UGUCCAGCUCCAGGACCCACguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
sgRNA-IL2RG-1S：5’-caccgCCTGTAGTTTTAGCGTCTGT-3’；
sgRNA-IL2RG-1A：5’-aaacACAGACGCTAAAACTACAGGc-3’。
sgRNA-IL2RG-2S：5’-caccgCAACAAATGTTTGGTAGAGG-3’；
sgRNA-IL2RG-2A：5’-aaacCCTCTACCAAACATTTGTTGc-3’。
sgRNA-IL2RG-3S：5’-caccGATGATAAAGTCCAGGAGTG-3’；
sgRNA-IL2RG-3A：5’-aaacCACTCCTGGACTTTATCATC-3’。
sgRNA-IL2RG-4S：5’-caccgCTGGACTTTATCATCATTAG-3’；
sgRNA-IL2RG-4A：5’-aaacCTAATGATGATAAAGTCCAGc-3’。
sgRNA-IL2RG-5S：5’-caccgTTGTCCAGCTCCAGGACCCA-3’；
sgRNA-IL2RG-5A：5’-aaacTGGGTCCTGGAGCTGGACAAc-3’。
sgRNA-IL2RG-6S：5’-caccgGGCCACTATCTATTCTCTGA-3’；
sgRNA-IL2RG-6A：5’-aaacTCAGAGAATAGATAGTGGCCc-3’。
sgRNA-IL2RG-7S：5’-caccgTCCCTTCAGAGAATAGATAG-3’；
sgRNA-IL2RG-7A：5’-aaacCTATCTATTCTCTGAAGGGAc-3’。
sgRNA-IL2RG-8S：5’-caccgAACATTTGTTGTCCAGCTCC-3’；
sgRNA-IL2RG-8A：5’-aaacGGAGCTGGACAACAAATGTTc-3’。
sgRNA-IL2RG-9S：5’-caccgTGTCCAGCTCCAGGACCCAC-3’；
sgRNA-IL2RG-9A：5’-aaacGTGGGTCCTGGAGCTGGACAc-3’。
sgRNA-IL2RG-1S、sgRNA-IL2RG-1A、sgRNA-IL2RG-2S、sgRNA-IL2RG-2A、sgRNA-IL2RG-3S、sgRNA-IL2RG-3A、sgRNA-IL2RG-4S、sgRNA-IL2RG-4A、sgRNA-IL2RG-5S、sgRNA-IL2RG-5A、sgRNA-IL2RG-6S、sgRNA-IL2RG-6A、sgRNA-IL2RG-7S、sgRNA-IL2RG-7A、sgRNA-IL2RG-8S、sgRNA-IL2RG-8A、sgRNA-IL2RG-9S、sgRNA-IL2RG-9A均为单链DNA分子。
四、不同靶点的编辑效率比较
1、共转染
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g1)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g2)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g3)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g4)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第五组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g5)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g5)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第六组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g6)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g6)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第七组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第八组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g8)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g8)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第九组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g9)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g9)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第十组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用IL2RG-nF33和IL2RG-nR460组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图18。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第十组不同靶点的编辑效率依次为1％、0％、3％、5％、0％、46％、65％、18％、34％和0％。结果表明，第七组编辑效率最高，sgRNAIL2RG-g7为最优靶点。
实施例7、制备ADA、DQA、DRA和IL2RG基因编辑SCID单克隆细胞
1、共转染
将质粒pKG-U6gRNA(ADA-g7)、质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn2)、质粒pKG-U6gRNA(DRA-g1)、质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.34μg质粒pKG-U6gRNA(ADA-g7)：0.34μg质粒pKG-U6gRNA(DQA-gn2)：0.34μg质粒pKG-U6gRNA(DRA-g1)：0.34μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)：1.64μg质粒pKG-GE3。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后用完全培养液洗涤，然后用完全培养液重悬，然后分别挑取各个单克隆转移到96孔板中(每个孔1个细胞，每个孔中装有200μl完全培养液)，培养2周(每2-3天更换新的完全培养液)。
4、完成步骤3后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞(每孔得到的细胞，约2/3接种到装有完全培养液的6孔板中，剩余的1/3收集在1.5mL离心管中)。
5、取步骤4的6孔板，培养直至细胞长至50％丰满度，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
6、取步骤4的离心管，取细胞，提取基因组DNA，进行PCR扩增(分别采用ADA-nnF229和ADA-nnR456组成的引物对、DQA-F643和DQA-R1022组成的引物对、DRA-F573和DRA-R968组成的引物对、IL2RG-nF33和IL2RG-nR460组成的引物对)，然后进行电泳。将猪原代成纤维细胞作为野生型对照。
采用ADA-nnF229和ADA-nnR456组成的引物对的电泳图见图19。
采用DQA-F643和DQA-R1022组成的引物对的电泳图见图20。
采用DRA-F573和DRA-R968组成的引物对的电泳图见图21。
采用IL2RG-nF33和IL2RG-nR460组成的引物对的电泳图见图22。
7、完成步骤6后，回收PCR扩增产物并测序。
猪原代成纤维细胞的测序结果只有一种，其基因型为纯合野生型。如果某一单克隆细胞的测序结果有两种，一种与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，另一种与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为杂合型；如果某一单克隆细胞的测序结果为两种，均与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型；如果某一单克隆细胞的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型；如果某一单克隆细胞的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，该单克隆细胞的基因型为纯合野生型。
ADA基因的编辑结果见表1。编号为31、43的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为45、52的单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型。编号为39的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为4、6、12、14、20、28、29、34、48、50的单克隆细胞均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断发生了基因编辑。得到的基因编辑单克隆细胞的比率为15/73。示例性的ADA的测序峰图见图23。
表1
Figure BDA0002696294600000221
Figure BDA0002696294600000231
Figure BDA0002696294600000241
DQA基因的编辑结果见表2。编号为29、31、32、45、51、69的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为39、52、61的单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型。编号为44、70、72的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为4、6、12、14、20、28、34、46、67的单克隆细胞均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断发生了基因编辑。得到的DQA基因编辑单克隆细胞的比率为21/71。示例性的DQA的测序峰图见图24。
表2
Figure BDA0002696294600000242
Figure BDA0002696294600000251
Figure BDA0002696294600000261
DRA基因的编辑结果见表3。编号为31、50的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为69的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为6、12、29、45、52的单克隆细胞均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断发生了基因编辑。DRA基因编辑单克隆细胞的比率为8/71。示例性的DRA的测序峰图见图25。
表3
Figure BDA0002696294600000262
Figure BDA0002696294600000271
Figure BDA0002696294600000281
IL2RG基因的编辑结果见表4。编号为12、61的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为43、45、50的单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型。编号为46、48、51、69、70的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为6、20、28、29、31、32、52的单克隆细胞均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断发生了基因编辑。得到的IL2RG基因编辑单克隆细胞的比率为17/72。示例性的IL2RG的测序峰图见图26。
表4
Figure BDA0002696294600000282
Figure BDA0002696294600000291
Figure BDA0002696294600000301
8、完成步骤7后，挑选IL2RG、ADA、DQA和DRA基因同时敲除的单克隆细胞。
通过分析，编号为6、12、29、31、45、52的单克隆细胞为ADA、DQA、DRA和IL2RG基因同时敲除的单克隆细胞。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> 制备ADDI四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒
<130> GNCYX201922
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8484
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840
ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020
ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080
gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140
agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200
ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320
ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380
caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440
caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500
gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560
caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620
ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680
gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740
ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800
gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860
cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920
caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980
gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040
gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100
caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160
cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220
cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280
caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340
gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400
cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460
ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520
gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580
ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640
cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700
gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760
catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820
cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880
cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940
gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000
gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060
cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120
cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180
cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240
cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300
gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360
caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420
cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480
ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540
cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600
ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660
gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720
cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780
cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840
gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900
cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960
cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020
tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080
taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140
acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200
agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260
ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320
cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380
ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440
taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500
ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560
cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620
gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680
caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740
cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800
caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860
cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920
ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980
aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040
tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100
tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160
gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220
cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280
gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340
ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400
caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460
ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520
tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580
tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640
tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700
ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760
atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820
gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880
ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940
atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000
tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060
tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120
tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180
gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240
agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300
cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360
agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420
ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480
caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540
ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600
cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660
tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840
tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900
atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500
ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980
ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220
gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460
tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484
<210> 2
<211> 10476
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360
gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600
ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660
tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720
ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780
gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840
cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900
cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960
caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020
gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080
cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140
cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200
cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260
cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320
cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380
agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440
ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500
ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560
cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620
ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680
caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740
gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800
gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860
ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920
cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980
gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040
ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100
agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160
ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220
actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280
cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340
tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400
cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460
gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520
ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580
gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640
atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700
cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760
cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820
cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880
caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940
cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000
gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060
cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120
cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180
ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240
cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300
gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360
gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420
caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480
cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540
ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600
ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660
caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720
cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780
gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840
aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900
gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960
ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020
cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080
cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140
aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200
cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260
aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320
catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380
gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440
taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500
agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560
catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620
agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680
cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740
gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800
ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860
gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920
caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980
tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040
caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100
ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160
caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220
gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280
aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520
cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700
cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820
gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060
caggggaagt cttctaacat gcggggacgt ggaggaaaat cccggcccaa ccgagtacaa 6120
gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6180
cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240
ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300
ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360
ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6420
gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6480
ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6540
ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6600
ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660
cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720
caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900
gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960
tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020
tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080
gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320
agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380
ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7560
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 7800
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860
gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920
atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg 8040
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160
aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280
tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggtctatt 8340
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400
ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460
cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580
caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640
tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060
tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300
aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 9360
gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 9420
tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600
atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 9660
cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720
ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780
cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900
tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 9960
taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020
caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200
gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260
ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320
acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380
tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476
<210> 3
<211> 3120
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280
ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340
tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400
gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460
ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520
gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640
tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700
ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760
accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820
atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880
ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940
gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000
cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060
tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120
<210> 4
<211> 364
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 4
Met Thr Gln Thr Pro Ala Phe Asp Lys Pro Lys Val Glu Leu His Val
1 5 10 15
His Leu Asp Gly Ala Ile Lys Pro Glu Thr Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg
20 25 30
Lys Arg Gly Ile Ala Leu Pro Ala Asn Thr Pro Glu Glu Leu Gln Asp
35 40 45
Val Ile Gly Met Asp Lys Pro Leu Ser Leu Pro Ala Phe Leu Ala Lys
50 55 60
Phe Asp Tyr Tyr Met Pro Ala Ile Ala Xaa Gly Leu Pro Glu Ala Val
65 70 75 80
Lys Arg Ile Ala Tyr Glu Phe Val Glu Met Lys Ala Lys Glu Gly Val
85 90 95
Val Tyr Val Glu Val Arg Tyr Ser Pro His Leu Leu Ala Asn Ser Lys
100 105 110
Val Glu Pro Ile Pro Trp Asn Gln Ala Glu Gly Asp Leu Thr Pro Asp
115 120 125
Glu Val Val Asp Leu Val Gly Gln Gly Leu Gln Glu Gly Glu Arg Asp
130 135 140
Phe Gly Val Lys Val Arg Ser Ile Leu Cys Cys Met Arg His Gln Pro
145 150 155 160
Thr Trp Ser Pro Glu Val Val Glu Leu Cys Lys Lys Tyr Arg Gln Gln
165 170 175
Thr Val Val Ala Ile Asp Leu Ala Gly Asp Glu Thr Ile Glu Gly Ser
180 185 190
Ser Leu Phe Pro Gly His Val Gln Ala Tyr Glu Glu Ala Val Lys Ser
195 200 205
Gly Val His Arg Thr Val His Ala Gly Glu Val Gly Ser Ala Glu Val
210 215 220
Val Lys Glu Ala Val Asp Thr Leu Lys Thr Glu Arg Leu Gly His Gly
225 230 235 240
Tyr His Thr Leu Glu Asp Glu Ala Leu Tyr Thr Arg Leu Arg Gln Ala
245 250 255
Asn Met His Phe Glu Val Cys Pro Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Gly Ala
260 265 270
Trp Lys Pro Gly Thr Glu His Ala Val Ile Arg Phe Lys Asn Asp Gln
275 280 285
Ala Asn Tyr Ser Leu Asn Thr Asp Asp Pro Leu Ile Phe Lys Ser Thr
290 295 300
Leu Asp Thr Asp Tyr Gln Met Thr Lys Arg Asp Met Gly Phe Thr Glu
305 310 315 320
Glu Glu Phe Lys Arg Leu Asn Ile Asn Ala Ala Lys Ser Ser Phe Leu
325 330 335
Pro Asp Asp Glu Lys Thr Glu Leu Leu Asp Leu Leu Tyr Lys Ala Tyr
340 345 350
Gly Met Pro Pro Thr Ser Ser Ala Glu His Arg Pro
355 360
<210> 5
<211> 1143
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 5
cgtggagatg gggagactgg ttagagggcg aaggtggtta gaagcacaga ggaagggccg 60
agaactggca tagagatcag aaataaagct cagtggtaat gaacctgact agtatccata 120
aagatgtggg tctgatccct ggcctgctca gtgggttaag gatctggtgt tgcggtgagc 180
tgcggtgtag gtcgcagaca cggcctggat ctggcattgc catgactgtg gtatatgctg 240
gcagctccat tttgacctct ggcctgggaa cttacatatg tcatgagtgt agtcctaaaa 300
acaaacaaaa aaattagagc caatgggact ctctatgctt ctagaatttt cttcagcaga 360
tgccaagagc tcgagactga gtaataagac tgggggccag acatgggttt gatctgccac 420
aggttgtgga cagctttgtt actcctggag ctcccaagag acttgggcag cattgtcccc 480
aacccctctt tccttctcag gggctcccgg aggccgtcaa aaggattgcc tacgagtttg 540
tggagatgaa agccaaggag ggcgtggtgt acgtggaggt gcgctacagc ccgcacctgc 600
tggccaactc caaggtggag ccgatcccct ggaaccaggc tgagtgagca accacccgga 660
gggctgtggc ggggtggccc aacccgcaac cgagcggcgg actctcagga gaccctgacc 720
caagagagac tttgatcttg ctccctgtgc tggtccacgg cctcagaaag atgggcttgg 780
ccgtcctaag ggacaggttc ccatccctca cctgggcttg cgtgttcacc ttgggtgaaa 840
gcgtttggct gcgtggccgt ccctcgtcct agatacaggg ctggagtcta ggagtgtgaa 900
cctggttatc cagtgactcc tagagggcct gtcctaaccc tgtaactgaa gtgggtctgg 960
cctattcctg ccctctctgc ccggacctca gggaggtcta agtggtacca cccgactacc 1020
ttgctccctt ctagccatga ctttgatgct tgtggacatg tgggaatctg acaccatagc 1080
agcgctctcc atcttggggc gggggatggg tttgtgtgcg acaacccccc caacacactg 1140
gga 1143
<210> 6
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
aaggauugcc uacgaguuug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 7
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
uuggaguugg ccagcaggug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 8
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
uuucaucucc acaaacucgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 9
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ucagccuggu uccaggggau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 10
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ccugcuggcc aacuccaaag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 11
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
ggagggcgug guguacgugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 12
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
caaggagggc gugguguacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 13
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
uguggagaug aaagccaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 14
<211> 254
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 14
Met Val Pro Gly Arg Val Leu Met Trp Gly Ala Leu Ala Leu Thr Thr
1 5 10 15
Val Met Ser Ala Cys Gly Gly Glu Asp Ile Ala Ala Asp His Val Ala
20 25 30
Ser Tyr Gly Leu Asn Val Tyr Gln Ser Tyr Gly Pro Ser Gly Tyr Phe
35 40 45
Thr His Glu Phe Asp Gly Asp Glu Glu Phe Tyr Val Asp Leu Glu Lys
50 55 60
Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Pro Leu Phe Ser Glu Phe Thr Ser Phe
65 70 75 80
Asp Pro Gln Gly Ala Leu Arg Asn Ile Ala Thr Leu Lys His Asn Leu
85 90 95
Asn Ile Val Thr Lys Arg Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Asn Gln Val
100 105 110
Pro Glu Val Thr Val Phe Ser Lys Ser Pro Val Ile Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Asn Thr Leu Ile Cys His Val Asp Ser Ile Phe Pro Pro Val Ile Asn
130 135 140
Ile Thr Trp Leu Lys Asn Gly His Ser Val Lys Gly Phe Ser Glu Thr
145 150 155 160
Ser Phe Leu Ser Lys Asn Asp His Ser Phe Leu Lys Ile Ser Tyr Leu
165 170 175
Thr Phe Leu Pro Ser Asp Asp Asp Phe Tyr Asp Cys Lys Val Glu His
180 185 190
Trp Gly Leu Asp Lys Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Pro Glu Ile Pro
195 200 205
Ala Pro Met Ser Glu Leu Thr Glu Thr Val Val Cys Ala Leu Gly Leu
210 215 220
Ile Val Gly Leu Val Gly Ile Val Val Gly Thr Val Phe Ile Ile Gln
225 230 235 240
Gly Leu Leu Ser Gly Gly Pro Ser Arg His Gln Gly Ser Leu
245 250
<210> 15
<211> 1249
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 15
acgattcatt gtaggagttc ccgttgtggt tcagtgggtt aagaagccaa catagagtcc 60
atgaggatga gggttcaacc cctggcctcc ctcagtgggt gaaggatctg gtgttgccac 120
gagcttcggc ataaattgca gatgctgctg ggacccagtg ttgctgtggc tgtggtgtag 180
gctggcagcc actgctccaa ctcaacccct aacccaggga acttcaacat gctgcaggtg 240
tagccccaaa aagaaaaaaa aaaaagaaga agaagaagaa ggctgattgc aaagataagg 300
aggcttcgct tcagggcctt ttaactgact gaacaactgc cagcactaag gggggaggaa 360
gcaggtgatg gggattttat ctagagactg tgccacagat gaagcccttg atatttgaaa 420
gtcaagttct cttgtcactt tgtttaatga ggttcttttc tctccctttg ttgtccacct 480
tcatgctgac cctgacctag ccgaccatgt tgcctcctat ggcttaaatg tctaccagtc 540
ttacggtccc agcggctatt atacccatga atttgatggc gacgaggaat tctacgtgga 600
cctggggaag aaggagactg tctggcagct gcctctgttt agcaaattta gaagttttga 660
cccacagggt gcactgagga acatagctac ggcaaaacat aatttgaaca tcctgattaa 720
acgttccaac aacaccgcgg ctgtcaatcg tatgtgttca tcattctgcc tttctttacc 780
cgttcacatc aggcccctct cccttcttcc ctagggatag agacccctca cccctttata 840
aaactctctc ctttccaagg agcctccaga ttttcccatg gagattgctg gaccttcatc 900
ctctcccatc ttacccatca cgtatctcca tataatgcaa agatctcttc tcccacaact 960
cccatatcac aatttttgaa tctttcaagg agaggtccca tagacctctt acccaacagc 1020
caggtcctca aaaagaaggg gacagggaca aagcagaggc cctgagcaga agggaaacaa 1080
gagctcttga accatcagac tggggaaact tggtgggagg gctcctccag gacacaatgc 1140
agaactcagg gcagaaccgt tcccataaat tttcacatca gtgctgtttt ctcaccacag 1200
aggttcctga ggtgactgtg tttcccaagt ctccagtgat gctgggtca 1249
<210> 16
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
uuaagccaua ggaggcaaca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 17
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
gccauaggag gcaacauggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 18
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
ccaugaauuu gauggcgacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 19
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
ccucgucgcc aucaaauuca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 20
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
cugguagaca uuuaagccau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 21
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
guagacauuu aagccauagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 22
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
uuaaaugucu accagucuua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 23
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
agacagucuc cuucuucccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 24
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
uggggaagaa ggagacuguc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 25
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
uugacccaca gggugcacug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 26
<211> 252
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 26
Met Thr Ile Leu Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Val Ile Thr Ile Leu
1 5 10 15
Asn Leu Gln Lys Ser Trp Ala Ile Val Glu Asn His Val Ile Ile Gln
20 25 30
Ala Glu Phe Tyr Leu Ser Pro Asp Lys Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp
35 40 45
Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Glu Lys Arg Glu Thr
50 55 60
Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe Gly His Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln
65 70 75 80
Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Leu
85 90 95
Ile Lys Arg Ser Asn Asn Thr Pro Asn Thr Asn Val Pro Pro Glu Val
100 105 110
Thr Val Leu Ser Asp Lys Pro Val Glu Leu Gly Glu Pro Asn Ile Leu
115 120 125
Ile Cys Phe Ile Asp Lys Phe Ser Pro Pro Val Val Asn Val Thr Trp
130 135 140
Leu Arg Asn Gly Ser Pro Val Thr Arg Gly Val Ser Glu Thr Val Phe
145 150 155 160
Leu Pro Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu Pro Phe
165 170 175
Met Pro Ser Thr Glu Asp Val Tyr Asp Cys Gln Val Glu His Trp Gly
180 185 190
Leu Asp Lys Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Phe Glu Ala Gln Thr Pro
195 200 205
Leu Pro Glu Thr Thr Glu Asn Thr Val Cys Ala Leu Gly Leu Ile Val
210 215 220
Ala Leu Val Gly Ile Ile Val Gly Thr Val Leu Ile Ile Lys Gly Val
225 230 235 240
Arg Lys Gly Asn Ala Thr Glu Arg Arg Gly Pro Leu
245 250
<210> 27
<211> 1246
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 27
cagtagaaaa ttgacagaac tctgtaaatc agctacaact gtaaaagtaa aaatcattat 60
atgaaaaaaa aaagtgtttc tctcttctta gagttacaaa gcatgcccgt gcttctggct 120
tgaggatatt taattcctag atcaagagaa taagagaata tttctcttag aggagctgct 180
gctggatttc taacaaggga atcatttcac ggacagtcac atggagtcca agtcttcacg 240
agactctggg ttttcagcct catttccttc atccatcctc cctacactgt ccctttgcct 300
ctgcactccc agctctgttt accatgaaca tcccttcctc aggcttcatc ttccccctca 360
tctgtaggct ccatcactct tccattccac ctggccctcc ccttcgccac ctcctgcctc 420
cacgtttgtg tctcgcatcc tgggttcttc ttcatcgcct tctctatttt ccaccctcat 480
tcctgctctt gtcttttcag agaatcacgt gatcatccag gctgagttct atctgagccc 540
tgacaaatct ggcgagttta tgtttgactt tgacggtgat gagattttcc acgtggatat 600
ggaaaagagg gagacggtct ggcgacttga agaatttgga cattttgcca gctttgaggc 660
tcagggtgca ctggccaaca tagctgtgga caaagccaac ctggaaatca tgatcaagcg 720
ctccaacaac accccgaaca ccaatggtac ctgtctctac tgcactcctg gacatgggat 780
ttagagcttt aagtagatgt tcagttcttt gcattatgtt attgtgactt acttttcctt 840
ccaggggcct aatcttgcca taaacaaacc ctaaattctc atgccaccat cccaagaacc 900
tcatgagttt gctcctttct tgctgtgctc acatcttgtc tctgccatcc actgtctctc 960
ataaagtcgt tggcctgcat ccatgccagg gggtccagaa atgaagtcct gggctatctt 1020
atcccttaag cttggtttct gtccaagggg gcggatttca gagctaggta ttatctggga 1080
ccatggcata gactccaggg cacagtgtca actgcgtttt cagccttgct gggagggtgc 1140
gagcaaatgc taaacaggga aggctaattt ccgtcacctg ttctcccagt acctccagaa 1200
gtgactgtgc tctcagacaa gcctgttgaa ctgggagagc ccaaca 1246
<210> 28
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 28
uccacgugga uauggaaaag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 29
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 29
cccucuuuuc cauauccacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 30
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 30
agcuguggac aaagccaacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 31
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 31
ugcacccuga gccucaaagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 32
<211> 368
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 32
Met Leu Lys Pro Pro Leu Pro Val Lys Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Pro Lys Val Leu Thr His Ser Gly
20 25 30
Asn Glu Asp Ile Thr Ala Asp Phe Leu Leu Leu Ser Thr Pro Pro Gly
35 40 45
Thr Leu Asn Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Lys Val Gln Cys Phe Val
50 55 60
Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Leu
65 70 75 80
Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Thr Ser Asn Asp
85 90 95
Asp Lys Val Gln Glu Cys Gly His Tyr Leu Phe Ser Glu Gly Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Trp Phe Gly Lys Glu Glu Ile Arg Leu Tyr Gln Thr Phe
115 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Asp Pro Gln
130 135 140
Thr Leu Lys Leu Gln Asp Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Ala Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu Arg Thr Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Ser Asn
165 170 175
Arg Tyr Leu Asp His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Ser Asp
180 185 190
Arg Asp Arg Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp His Arg Gln Ser Phe
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Val Asp Ala Gln Lys Leu Tyr Thr Phe Arg Val Arg
210 215 220
Ser Arg Tyr Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln Arg Trp Ser Asp Trp
225 230 235 240
Ser His Pro Ile His Trp Gly Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Leu Leu
245 250 255
Phe Ala Leu Glu Ala Val Leu Ile Pro Leu Gly Ser Met Gly Leu Ile
260 265 270
Val Gly Leu Met Cys Val Tyr Cys Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg
275 280 285
Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly
290 295 300
Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu
305 310 315 320
Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys His Val Ser Glu Ile Ser Pro
325 330 335
Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Gly Ser Pro Cys Ser Gln
340 345 350
His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr
355 360 365
<210> 33
<211> 1185
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 33
aaattttaga gtactggggg gagggcaagg ggaagggttc cctgcctagt gctgcttctt 60
cttctgacca tcatgtcttc cctttgcctc ccccacttca ttttctcccc gtcctagatt 120
tcctcctgct ctctacaccc cctgggactc tcaacgtttc cactctaccc ctcccaaagg 180
ttcagtgttt tgtgttcaat gttgagtaca tgaattgcac ttggaacagc agctctgagc 240
tccagcctac caacctaact ctgcactact ggtatgagaa gggaagaggg gatatagcac 300
aggggaggga ggaagaggcg ctgggctaga tgtgagagat tgtgtgagga ccaagaaaga 360
ggttagccag catcccaggc ttcccactat attctcgtgg ggtaagtcat aagtcagttc 420
gtaggagctg aggctggact gtggaatctg tggtattcac atttacctca ctgttattct 480
tccttgaaat ccttctctag gtacaagacc tctaatgatg ataaagtcca ggagtgtggc 540
cactatctat tctctgaagg gatcacttct ggctgttggt ttggaaaaga ggagatccgc 600
ctctaccaaa catttgttgt ccagctccag gacccacggg aacccaggag gcaggaccca 660
cagacgctaa aactacagga tctgggtaat ttggaaatgg ggagggtcaa gggatattgt 720
gggggtattg gtgtatgtag agtggtattc ttgcaccata agggtacttg ggcagaaaag 780
aagaagtgag ggatccaatg gggtcgggag gagggatcag gagcactgcc ctcaggatcc 840
tgacttgtct aggccagggg aatgaccaca cacgcacaca tatctccagt gatcccctgg 900
gcgccggcga atctgaccct tcgcaccctg agtgaatccc agctagaact cagctggagc 960
aaccgatact tggaccactg tttggagcac ctcgtgcaat accggagtga ccgggaccgc 1020
agctggactg tgagtgagtg ggaacagcag ctggggctga gcaagtgggg ataaaggatt 1080
caatcagtcc agtaggaagg cttgattccc agctcctatt ctctgcatcc tggtgcctct 1140
gcccaccttc tcccctcctt ggactccttt ctctgtcgtc accat 1185
<210> 34
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 34
ccuguaguuu uagcgucugu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 35
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 35
caacaaaugu uugguagagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 36
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 36
gaugauaaag uccaggagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 37
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 37
cuggacuuua ucaucauuag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 38
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 38
uuguccagcu ccaggaccca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 39
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 39
ggccacuauc uauucucuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 40
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 40
ucccuucaga gaauagauag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 41
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 41
aacauuuguu guccagcucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 42
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 42
uguccagcuc caggacccac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims (10)

1.一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将携带sgRNAADA-g7基因的质粒、携带sgRNADQA-gn2基因的质粒、携带sgRNADRA-g1基因的质粒、携带sgRNAIL2RG-g7基因的质粒和质粒pKG-GE3共转染猪细胞，得到ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因均发生突变的重组细胞；
将sgRNAADA-g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体，得到携带sgRNAADA-g7基因的质粒；所述sgRNAADA-g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：11中第1-20位核苷酸所示；
将sgRNADQA-gn2的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体，得到携带sgRNADQA-gn2基因的质粒；所述sgRNADQA-gn2的靶序列结合区如SEQ ID NO：21中第1-20位核苷酸所示；
将sgRNADRA-g1的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体，得到携带sgRNADRA-g1基因的质粒；所述sgRNADRA-g1的靶序列结合区如SEQ ID NO：28中第1-20位核苷酸所示；
将sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体，得到携带sgRNAIL2RG-g7基因的质粒；所述sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：40中第1-20位核苷酸所示；
所述pKG-U6gRNA载体如SEQ ID NO：3所示；
所述质粒pKG-GE3如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述方法制备得到的重组细胞。
3.权利要求2所述重组细胞在制备免疫缺陷动物模型中的应用。
4.sgRNA组合，由sgRNAADA-g7、sgRNADQA-gn2、sgRNADRA-g1和sgRNAIL2RG-g7组成；
所述sgRNAADA-g7如SEQ ID NO：11所示；
所述sgRNADQA-gn2如SEQ ID NO：21所示；
所述sgRNADRA-g1如SEQ ID NO：28所示；
所述sgRNAIL2RG-g7如SEQ ID NO：40所示。
5.质粒组合，由携带sgRNAADA-g7基因的质粒、携带sgRNADQA-gn2基因的质粒、携带sgRNADRA-g1基因的质粒和携带sgRNAIL2RG-g7基因的质粒组成；
将sgRNAADA-g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体，得到携带sgRNAADA-g7基因的质粒；所述sgRNAADA-g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：11中第1-20位核苷酸所示；
将sgRNADQA-gn2的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体，得到携带sgRNADQA-gn2基因的质粒；所述sgRNADQA-gn2的靶序列结合区如SEQ ID NO：21中第1-20位核苷酸所示；
将sgRNADRA-g1的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体，得到携带sgRNADRA-g1基因的质粒；所述sgRNADRA-g1的靶序列结合区如SEQ ID NO：28中第1-20位核苷酸所示；
将sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体，得到携带sgRNAIL2RG-g7基因的质粒；所述sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：40中第1-20位核苷酸所示。
6.一种试剂盒，包括权利要求4所述的sgRNA组合或权利要求5所述的质粒组合；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括质粒pKG-GE3；所述质粒pKG-GE3如SEQ ID NO：2所示。
8.权利要求4所述sgRNA组合或权利要求5所述质粒组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
9.权利要求5所述质粒组合和质粒pKG-GE3在制备试剂盒中的应用；所述质粒pKG-GE3如SEQ ID NO：2所示；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
10.权利要求4所述sgRNA组合或权利要求5所述质粒组合或权利要求6所述试剂盒或权利要求7所述试剂盒的应用，为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
CN202011007025.6A 2020-09-23 2020-09-23 制备addi四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒 Active CN112522202B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011007025.6A CN112522202B (zh) 2020-09-23 2020-09-23 制备addi四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒
PCT/CN2020/124634 WO2022062055A1 (zh) 2020-09-23 2020-10-29 Crispr系统及其在制备多基因联合敲除的重症免疫缺陷克隆猪核供体细胞中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011007025.6A CN112522202B (zh) 2020-09-23 2020-09-23 制备addi四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112522202A CN112522202A (zh) 2021-03-19
CN112522202B true CN112522202B (zh) 2022-04-05

Family

ID=74980247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011007025.6A Active CN112522202B (zh) 2020-09-23 2020-09-23 制备addi四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112522202B (zh)
WO (1) WO2022062055A1 (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018049980A1 (zh) * 2016-09-13 2018-03-22 苏州兰希亚生物科技有限公司 先天性免疫缺陷基因治疗载体构建方法及其用途
CN109777834A (zh) * 2019-02-25 2019-05-21 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种重度免疫缺陷猪模型及其构建方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9616090B2 (en) * 2014-07-30 2017-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
EP3245286A4 (en) * 2015-01-17 2018-07-11 Zhejiang University Modified cells evoking reduced immunogenic responses
CN107119076A (zh) * 2016-02-25 2017-09-01 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用
CN110283850A (zh) * 2018-03-19 2019-09-27 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 一种免疫缺陷裸鼠模型的制备方法及应用
CN111485002A (zh) * 2020-05-06 2020-08-04 澎立生物医药技术（上海）有限公司 一种重度免疫缺陷的转基因小鼠的制备方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018049980A1 (zh) * 2016-09-13 2018-03-22 苏州兰希亚生物科技有限公司 先天性免疫缺陷基因治疗载体构建方法及其用途
CN109777834A (zh) * 2019-02-25 2019-05-21 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种重度免疫缺陷猪模型及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mutation in a winged-helix DNA-binding motif causes atypical bare lymphocyte syndrome;Nada Nekrep et al.;《nature immunology》;20020930;第3卷(第11期);1075-1081 *
Targeted genome editing restores T cell differentiation in a humanized X-SCID pluripotent stem cell disease model;Jamal Alzubi et al.;《SCIENTIFIC REPORTS》;20170929;1-11 *
原发性免疫缺陷病分子诊断及新发原发性免疫缺陷病;毛华伟;《中国实用儿科杂志》;20170730;第32卷(第7期);491-495 *
重症联合免疫缺陷病新生儿筛查及免疫系统重建研究进展;黄淑敏等;《浙江大学学报(医学版)》;20190830;351-355 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022062055A1 (zh) 2022-03-31
CN112522202A (zh) 2021-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112779292B (zh) 构建瘦肉率高、生长快且抗蓝耳病和系列腹泻病的优质猪核移植供体细胞的方法及其应用
CN112779291B (zh) 构建瘦肉率高、生长快、繁殖力高且抗系列流行病的优质猪核移植供体细胞的方法及其应用
CN112522260B (zh) Crispr系统及其在制备ttn基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞中的应用
CN112877362A (zh) 构建高繁殖力、抗蓝耳病和系列腹泻病的优质猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN112522261B (zh) 用于制备lmna基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞的crispr系统及其应用
CN112522264B (zh) 一种导致先天性耳聋的CRISPR/Cas9系统及其在制备模型猪核供体细胞中的应用
CN113046388B (zh) 用于构建双基因联合敲除的动脉粥样硬化猪核移植供体细胞的crispr系统及其应用
CN112522313B (zh) 用于构建TPH2基因突变的抑郁症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统
CN114958762B (zh) 一种构建神经组织特异过表达人源snca的帕金森病模型猪的方法及应用
CN112522202B (zh) 制备addi四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒
CN112522258B (zh) Il2rg基因和ada基因联合敲除的重组细胞及其在制备免疫缺陷猪模型中的应用
CN112522309B (zh) 重症免疫缺陷猪源重组细胞及其制备方法和试剂盒
CN112522257B (zh) 用于制备rrip四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的系统
CN112522256B (zh) CRISPR/Cas9系统及其在构建抗肌萎缩蛋白基因缺陷的猪源重组细胞中的应用
CN112608941B (zh) 用于构建mc4r基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的crispr系统及其应用
CN112522311B (zh) 用于adcy3基因编辑的crispr系统及其在构建肥胖症猪核移植供体细胞中应用
CN112899306B (zh) Crispr系统及其在构建gabrg2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用
CN112795566B (zh) 用于构建骨质疏松症克隆猪核供体细胞系的opg基因编辑系统及其应用
CN112680444B (zh) 用于oca2基因突变的crispr系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用
CN112522255B (zh) CRISPR/Cas9系统及其在构建胰岛素受体底物基因缺陷的猪源重组细胞中的应用
CN112575033B (zh) Crispr系统及其在构建scn1a基因突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用
CN112813101B (zh) 一种构建瘦肉率高、生长快的优质猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN112680453B (zh) Crispr系统及其在构建stxbp1突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用
CN113584078B (zh) 用于双靶标基因编辑的crispr系统及其在构建抑郁症猪核移植供体细胞中的应用
CN112877359A (zh) CRISPR/cas系统及其在构建INHA突变的高繁殖力猪核移植供体细胞中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant