CN112779291B

CN112779291B - 构建瘦肉率高、生长快、繁殖力高且抗系列流行病的优质猪核移植供体细胞的方法及其应用

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Publication number: CN112779291B
Application number: CN202110196591.4A
Authority: CN
Inventors: 牛冬; 汪滔; 马翔; 曾为俊; 刘璐; 王磊; 程锐; 赵泽英; 段星; 陶裴裴; 黄彩云
Original assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Current assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2041-02-22
Also published as: CN112779291A

Abstract

本发明公开了构建瘦肉率高、生长快、繁殖力高且抗系列流行病的优质猪核移植供体细胞的方法及其应用。一种用于猪MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体、分别针对猪MSTN、SST、INHA、CD163、pAPN基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体质粒全序列如SEQ ID NO.2所示。本发明分别针对MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN基因的不同靶点设计了相应的gRNA表达载体，通过筛选获得具有较高编辑效率的gRNA及其表达载体。配合本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，编辑效率比原载体有了显著的提高。

Description

构建瘦肉率高、生长快、繁殖力高且抗系列流行病的优质猪核移植供体细胞的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其在构建瘦肉率高、生长快、繁殖力高且抗蓝耳病和系列腹泻病的优质猪核移植供体细胞中的应用。

背景技术

猪是我国最早驯化的家畜之一，其在历史的长河中一直是人类重要的肉料动物。中国人爱食猪肉，与千百年来的饮食文化有关。2000年以来，猪肉在我国的肉类消费占比中都超过70％，是我国最主要的消费肉类。目前我国城市瘦肉的价格已超过肥肉价格近1倍左右，具有60％以上瘦肉率的瘦肉型猪备受青睐，而瘦肉率性状尚有进一步提升的空间。另一方面，目前国内的育肥猪出栏体重为120kg左右，猪只从出生到出栏大约需要180天，如能加快猪只的生长速度就能够降低育肥猪的出栏时间。此外，如果每头母猪平均每胎能多产一头仔猪，按照每年两胎计算，我国就可以减少饲养300-400万头母猪。另外，在生猪养殖中，流行性传染病对养猪业危害极大，有时甚至是毁灭性的。猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)、传染性胃肠炎、流行性腹泻等是生猪在集约化养殖生产条件下的最常发传染性疾病，且这些疾病的致死率极高，对养猪生产造成了极大的经济损失。因此，培育瘦肉率更高、生长速度更快、繁殖力更高且抗蓝耳病和系列腹泻病的优质猪品系将能够为养猪业带来更多的经济效益。

肌抑素(Myostatin,MSTN)属TGF-β超家族,是骨骼肌生长的负调控因子,参与肌纤维增生和肥大的调控，其缺失或突变会导致双肌现象的产生。该基因的发现对于畜牧业和医学领域都有重大意义。生长抑素(Somatostatin,SST)是一种抑制垂体生长激素、促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素等激素释放的蛋白，其能够通过抑制一系列与生长有关的激素从而抑制生长。已有研究表明，抑制MSTN的表达能够一定程度增加肌肉沉积，增加猪只的瘦肉率，而抑制SST的表达则能够一定程度加快猪只的生长速度、降低料肉比。影响猪产仔数的重要因素之一是猪的排卵数，排卵数受到促卵泡素(FSH)水平的影响，而FSH的分泌受一种性腺激素即抑制素(Inhibin)的调节。Inhibin具有强烈的抑制FSH分泌的作用，其可以反馈抑制垂体前叶FSH的释放，进而抑制卵泡的生长发育。Inhibin是一种由性腺分泌的糖蛋白激素，由一个α亚基和一个β亚基构成。β亚基有两种亚型：β_A和β_B，αβ_A构成Inhibin A,αβ_B构成Inhibin B。INHA基因编码Inhibinα亚基，该亚基是抑制素发挥生理功能必不可少的。已有研究证明，抑制INHA基因的表达能够促进卵泡的发育，提高排卵率。另外，在猪的靶细胞膜上，存在着一些致病病毒或细菌的受体，这些受体可介导相应的病毒或细菌感染猪细胞。CD163已被证实是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的受体，与PRRSV互作的主要是CD163受体SRCR5结构域中的Ligand-binding pocket(LBP)，其编码区位于猪CD163的7号外显子，由于SRCR5结构域中其他部分仍具有重要生物学功能，因此仅对CD163的7号外显子进行编辑能够在破坏病毒互作区域的条件下最大限度保存CD163的生物学功能。猪氨肽酶N(pAPN)已被证实是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的特异性受体，同时也被证明是猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的受体之一，其在仔猪小肠的刷状缘上大量表达。破坏pAPN基因将使其编码的受体蛋白失活，TGEV病毒无法感染活猪，PEDV和PDCoV病毒对猪的感染性也大大降低。TGEV和PEDV属于α冠状病毒属，而PDCoV属于δ冠状病毒属，pAPN为这三种冠状病毒的共同受体。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。因此，本发明采用CRISPR/cas9技术进行了MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因的突变，并获得了五基因联合敲除的单细胞克隆，这为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育瘦肉率高、生长快、繁殖力高且抗蓝耳病和系列腹泻病的高生产性能优质猪种奠定了基础。MSTN、SST、INHA、CD163和pAPN的功能丧失，一方面能够有效提高猪的瘦肉率、生长速度和繁殖力，增加养猪业经济效益；另一方面将能够有效提高猪对蓝耳病和系列腹泻病的抵抗，降低生猪死亡率，减少养猪业损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于猪MSTN-SST-INHA-CD163-pAPN五基因编辑的CRISPR/Cas9系统。

本发明的另一目的是提供该CRISPR/Cas9系统的应用。

本发明的又一目的是提供一种重组细胞及其应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种用于猪MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体、针对猪MSTN基因的gRNA表达载体、针对猪SST基因的gRNA表达载体、针对猪INHA基因的gRNA表达载体、针对猪CD163基因的gRNA表达载体以及针对猪pAPN基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体质粒全序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的Cas9载体包含编码Cas9蛋白、EGFP和Puro抗性蛋白的核苷酸序列，其中，所述的Cas9载体还包含EF1a启动子、WPRE元件和3’LTR序列元件，优选的，所述的Cas载体的核苷酸序列从5’-3’依次为：CMV增强子、EF1a启动子、核定位信号、核定位信号、编码Cas9蛋白的核苷酸序列、核定位信号，核定位信号、编码自剪切多肽P2A的核苷酸序列、编码EGFP的核苷酸序列、编码自裂解多肽T2A的核苷酸序列、编码Puro抗性蛋白的核苷酸序列、WPRE序列元件、3’LTR序列元件和polyA信号序列元件。

为了增加Cas9载体的基因编辑能力，本发明在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhang Feng lab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(即上述pKG-GE3载体)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：

1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；

2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；

3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力；

4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；

5)插入WPRE和3’LTR等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)及改造位点如图2，质粒全序列如SEQ ID NO：2所示；pKG-GE3的主要元件有：

1)gRNA表达元件：U6 gRNA scaffold；

2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子；

3)含多个NLS的Cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因；

4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO；

5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR增强Cas9及筛选标记基因的翻译效率；

6)转录终止信号：bGHpolyA signal；

7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。

质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；

所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；

质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；

质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。

质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。

所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。

所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。

所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin抗性蛋白。

自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911-6706位核苷酸所示。

CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395-680位核苷酸所示。

EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682-890位核苷酸所示。

WPRE序列元件如SEQ ID NO：2第6722-7310位核苷酸所示。

3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382-7615位核苷酸所示。

bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647-7871位核苷酸所示。

优选的，所述的pKG-GE3质粒为环状质粒。

作为本发明的一种优选，所述的CRISPR/Cas9系统中，针对猪MSTN基因的gRNA表达载体、针对猪SST基因的gRNA表达载体、针对猪INHA基因的gRNA表达载体、针对猪CD163基因的gRNA表达载体以及针对猪pAPN基因的gRNA表达载体的载体骨架均为pKG-U6gRNA，其质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。

作为本发明的进一步优选，针对猪MSTN基因的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.18所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.15所示；针对猪SST基因的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.24所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.21所示；针对猪INHA基因的gRNA表达载体表达SEQ IDNO.30所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.27所示；针对猪CD163基因的gRNA表达载体表达SEQID NO.36所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.33所示；针对猪pAPN基因的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.42所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.39所示。

作为本发明的进一步优选，所述的针对猪MSTN基因的gRNA表达载体由SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的针对猪SST基因的gRNA表达载体由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的针对猪INHA基因的gRNA表达载体由SEQ IDNO.28和SEQ ID NO.29所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的针对猪CD163基因的gRNA表达载体由SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的针对猪pAPN基因的gRNA表达载体由SEQID NO.40和SEQ ID NO.41所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得。

本发明所述的CRISPR/Cas9系统在构建MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因突变的猪重组细胞中的应用。

一种重组细胞，其特征在于由本发明所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

本发明所述的重组细胞在构建MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因敲除的克隆猪中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。

大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本很高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。

而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、免疫学、营养代谢、疾病发病机制等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一胎多仔，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本也较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。

(2)本发明中经过实验验证改造的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。

(3)本发明分别针对MSTN基因、SST基因、INHA基因、CD163基因和pAPN基因的不同靶点gRNA设计了相应的表达载体，通过筛选获得具有较高编辑效率的gRNA及其表达载体。配合本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型，获得单靶标基因突变的概率为10％～32％，大大优于使用胚胎注射技术的基因编辑递送方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得突变的概率。

(4)利用本发明所得到的突变型单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因突变的克隆猪，并且该突变可稳定遗传。

本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应的基因编辑猪，可大大缩短基因编辑猪制作周期并节省人力、物力、财力。

附图说明

图1为质粒pX330的结构示意图。

图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。

图3为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。

图4为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。

图5为质粒pKG-GE3的结构示意图。

图6为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。

图7为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。

图8为实施例2中步骤2.3.3的测序峰图。

图9为实施例2中步骤2.4.3的测序峰图。

图10为实施例3中步骤3.1以18只猪的基因组DNA为模板采用MSTN-JDF102/MSTN-JDR429组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图11为实施例3的步骤3.4中的测序峰图。

图12为实施例4中步骤4.1以18只猪的基因组DNA为模板采用SST-JDF290/SST-JDR689组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图13为实施例4的步骤4.4中的测序峰图。

图14为实施例5中步骤5.1以18只猪的基因组DNA为模板采用INHA-E2-JDF178/INHA-E2-JDR654组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图15为实施例5的步骤5.4中的测序峰图。

图16为实施例6中步骤6.1以18只猪的基因组DNA为模板采用CD163-JDF121/CD163-JDR518组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图17为实施例6的步骤6.4中的测序峰图。

图18为实施例7中步骤7.1以18只猪的基因组DNA为模板采用APN-JDF94/APN-JDR656组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图19为实施例7的步骤7.4中的测序峰图。

图20为实施例8中步骤8.4.4以基因组DNA为模板采用MSTN-JDF102/MSTN-JDR429组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图21为实施例8中步骤8.4.4以基因组DNA为模板采用SST-JDF290/SST-JDR689组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图22为实施例8中步骤8.4.4以基因组DNA为模板采用INHA-E2-JDF178/INHA-E2-JDR654组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图23为实施例8中步骤8.4.4以基因组DNA为模板采用CD163-JDF121/CD163-JDR518组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图24为实施例8中步骤8.4.4以基因组DNA为模板采用APN-JDF94/APN-JDR656组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图25为实施例8中步骤8.4.5.1判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。

图26为实施例8中步骤8.4.5.1判定靶基因为杂合突变型的示例性测序峰图。

图27为实施例8中步骤8.4.5.1判定靶基因为双等位相同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图28为实施例8中步骤8.4.5.1判定靶基因为双等位不同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图29为实施例8中步骤8.4.5.2判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。

图30为实施例8中步骤8.4.5.2判定靶基因为杂合突变型的示例性测序峰图。

图31为实施例8中步骤8.4.5.2判定靶基因为双等位相同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图32为实施例8中步骤8.4.5.2判定靶基因为双等位不同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图33为实施例8中步骤8.4.5.3判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。

图34为实施例8中步骤8.4.5.3判定靶基因为杂合突变型的示例性测序峰图。

图35为实施例8中步骤8.4.5.3判定靶基因为双等位相同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图36为实施例8中步骤8.4.5.3判定靶基因为双等位不同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图37为实施例8中步骤8.4.5.4判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。

图38为实施例8中步骤8.4.5.4判定靶基因为杂合突变型的示例性测序峰图。

图39为实施例8中步骤8.4.5.4判定靶基因为双等位相同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图40为实施例8中步骤8.4.5.4判定靶基因为双等位不同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图41为实施例8中步骤8.4.5.5判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。

图42为实施例8中步骤8.4.5.5判定靶基因为杂合突变型的示例性测序峰图。

图43为实施例8中步骤8.4.5.5判定靶基因为双等位相同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图44为实施例8中步骤8.4.5.5判定靶基因为双等位不同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

具体实施方式

实施例1、质粒的构建

1.1 构建质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)

原始质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称质粒pX330)，序列如SEQ IDNO：1所示。质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO.1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。

质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(图5)，简称质粒pKG-GE3，核苷酸如SEQ ID NO：2所示。与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

pKG-GE3质粒构建方法如下：

(1)去除gRNA骨架中多余无效的序列

质粒pX330用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(SEQ ID NO.4)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图2)。

(2)改造启动子及增强子

对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(CMV增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(SEQ ID NO.5)，与酶切后载体pU6gRNACas9重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体(图3)。

(3)Cas9基因N端增加NLS序列

将构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO.6)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体(图4)。

(4)Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyA signal

以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyA signal的片段(SEQ ID NO.7)，与载体片段重组得到载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称pKG-GE3，质粒图谱如图5，核苷酸序列(SEQ ID NO.2)。

SEQ ID NO.2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。

1.2 构建pKG-U6gRNA载体

来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI酶切位点和sgRNA骨架序列的DNA片段，序列如SEQ ID NO.8所示)，反向插入到pUC57载体，得到pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO.3)，SEQ ID NO.3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)(图7)插入质粒pKG-U6gRNA(图6)，形成重组质粒，在细胞中重组质粒转录得到gRNA。

实施例2质粒配比优化以及质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

2.1 靶点gRNA设计及构建

2.1.1 使用Benchling对RAG1基因进行靶点gRNA设计

RAG1-g4：AGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.9)

合成针对上述RAG1基因靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

RAG1-gRNA4S：caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.10)

RAG1-gRNA4A：aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc(SEQ ID NO.11)

RAG1-gRNA4S、RAG1-gRNA4A均为单链DNA分子。

2.1.2 设计用于扩增和检测包含RAG1 gRNA靶点片段的引物

RAG1-nF126：CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA

RAG1-nR525：TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG

2.1.3 gRNA重组载体的构建及克隆

1)用限制性内切酶BbsI消化1ug pKG-U6gRNA质粒；

2)酶切的pKG-U6gRNA质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(Vazyme)纯化回收酶切产物；

3)将2.1.1所述靶点合成的2条互补DNA Oligo，通过以下退火程序形成与pKG-U6gRNA载体BbsI酶切后粘性末端互补的DNA双链，示意如图7：

95℃，5min然后以5℃/min的速率降至25℃；

4)按照以下体系启动连接反应：室温反应10min

/>

37℃反应60min；

5)转化

按照感受态细胞(Vazyme)说明书进行操作。

2.1.4 gRNA载体构建

1)将合成的RAG1-gRNA4S和RAG1-gRNA4A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)将会表达SEQ ID NO.12所示的RAG1-gRNA4。

2.1.5 gRNA载体鉴定

从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认RAG1-gRNA4载体构建成功。

2.2 猪原代成纤维细胞制备

2.2.1 取初生从江香猪耳组织0.5g，去除毛发及骨组织，75﹪酒精浸泡30-40s；

2.2.2 用含5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)的PBS洗涤5次，不含P/S的PBS洗一次；

其中5％P/S的PBS配方为：5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+95％PBS，5％、95％为体积百分比。

2.2.3 用剪刀将组织剪碎，加入5mL0.1％的胶原酶(Sigma)溶液，37℃摇床消化1h；

2.2.4 500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的10cm细胞培养皿中。

其中，细胞完全培养基的配方为：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基

(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)，15％、83％、1％、1％为体积百分比。

2.2.5 置于37℃，5％CO2(体积百分比)、5％O2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；

2.2.6 将细胞培养至长满皿底60％左右时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心4min，弃去上清，得到细胞沉淀以备下一步的细胞转染实验

2.3 质粒配比优化

2.3.1 共转染分组情况

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为1：1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为2：1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为3：1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染致猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

2.3.2 共转染操作方法

使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(Neon kit)与Neon TM transfectionsystem电转仪进行转染实验。

1)按照上述分组配制电转DNA溶液，混匀过程中注意切勿产生气泡；

2)将上述2.2.6制备得到的细胞沉淀使用1ml PBS磷酸缓冲液(Solarbio)清洗，并转移到1.5ml离心管中，600g离心6min，弃去上清，使用11μL电转基本溶液Opti-MEM重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；

3)吸取10μL细胞悬液，加入至步骤1)中的电转DNA液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；

4)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL Buffer E；

5)用电转枪吸取10μL步骤3)得到的混合液，插入点击杯内，选择电转程序(1450V10ms 3pulse)，电击转染后立即在超净台内将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL的完全培养液(15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(GibcoPenicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio))；

6)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；

7)电转后12-18h换液，36-48h用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。

2.3.3 基因编辑效率分析

提取2.3.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出第一组、第二组、第三组的编辑效率依次为9％、53％、66％，测序结果示例性峰图见图8。分析认定第三组的基因编辑效率最高，即确定gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。

2.4 质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

2.4.1 共转染分组情况

RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330，其中pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)与pX330摩尔比为3:1。

RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

2.4.2 共转染操作方法

同本实施例中2.3.2。

2.4.3 基因编辑效率分析

提取2.4.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率分别为28％、68％，测序结果示例性峰图见图9，结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。

实施例3筛选高效的MSTN基因gRNA靶点

猪MSTN基因信息：编码myostatin蛋白；位于猪15号染色体；GeneID为399534，Susscrofa。猪MSTN基因编码的蛋白质如GENBANK ACCESSION NO.NP_999600.2(linear CON12-JAN-2018)所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。基因组DNA中，猪MSTN基因具有3个外显子，其中第1外显子及其下游各200bp序列如SEQ ID NO.14所示。

3.1 MSTN基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

18只初生从江香猪，其中雌性10只(分别命名1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)、雄性8只(分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H)。

分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用引物对(引物对的靶序列包括猪MSTN基因第1外显子)进行PCR扩增，然后进行电泳。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的MSTN基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：MSTN-JDF102/MSTN-JDR429。采用MSTN-JDF102/MSTN-JDR429组成的引物对对18只猪的基因组DNA进行PCR扩增后的电泳图见图10。

MSTN-JDF102：5’-AAAAGAGGGGCTGTGTAATGC-3’；

MSTN-JDR429：5’-AAACACTGGAACAACAGTCAGC-3’。

3.2 靶点gRNA设计及构建

通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。

4个靶点分别如下：

sgRNA_MSTN-E1-g1靶点：5’-TGATGATTATCACGCTACGA-3’；

sgRNA_MSTN-E1-g2靶点：5’-TGATCAATCAGTTCCCGGAG-3’(SEQ ID NO.15)；

sgRNA_MSTN-E1-g3靶点：5’-GTGATAATCATCATCTTCCA-3’；

sgRNA_MSTN-E1-g4靶点：5’-TTTCCAGGCGAAGTTTACTG-3’。

合成的MSTN基因共4个靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

MSTN-E1-gRNA1-S：5’-caccgTGATGATTATCACGCTACGA-3’；

MSTN-E1-gRNA1-A：5’-aaacTCGTAGCGTGATAATCATCAc-3；

MSTN-E1-gRNA2-S：5’-caccgTGATCAATCAGTTCCCGGAG-3’(SEQ ID NO.16)；

MSTN-E1-gRNA2-A：5’-aaacCTCCGGGAACTGATTGATCAc-3’(SEQ ID NO.17)；

MSTN-E1-gRNA3-S：5’-caccGTGATAATCATCATCTTCCA-3’；

MSTN-E1-gRNA3-A：5’-aaacTGGAAGATGATGATTATCAC-3’；

MSTN-E1-gRNA4-S：5’-caccgTTTCCAGGCGAAGTTTACTG-3’；

MSTN-E1-gRNA4-A：5’-aaacCAGTAAACTTCGCCTGGAAAc-3’。

MSTN-E1-gRNA1-S、MSTN-E1-gRNA1-A、MSTN-E1-gRNA2-S、MSTN-E1-gRNA2-A、MSTN-E1-gRNA3-S、MSTN-E1-gRNA3-A、MSTN-E1-gRNA4-S、MSTN-E1-gRNA4-A均为单链DNA分子。

3.3 制备gRNA重组质粒

取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。

分别合成MSTN-E1-gRNA1-S和MSTN-E1-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g1)。质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g1)表达sgRNA_MSTN-E1-g1,sgRNA_MSTN-E1-g1序列如下所示:

UGAUGAUUAUCACGCUACGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成MSTN-E1-gRNA2-S和MSTN-E1-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g2)。质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g2)表达SEQ ID NO.18所示的sgRNA_MSTN-E1-g2。

UGAUCAAUCAGUUCCCGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu(SEQ ID NO.18)。

分别合成MSTN-E1-gRNA3-S和MSTN-E1-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g3)。质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g3)表达sgRNA_MSTN-E1-g3,sgRNA_MSTN-E1-g3序列如下所示:

GUGAUAAUCAUCAUCUUCCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成MSTN-E1-gRNA4-S和MSTN-E1-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g4)。质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g4)表达sgRNA_MSTN-E1-g4,sgRNA_MSTN-E1-g4序列如下所示:

UUUCCAGGCGAAGUUUACUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

3.4 MSTN基因不同靶点gRNA的编辑效率比较

从初生从江香猪(雌性，血型AO)的耳组织制备猪原代成纤维细胞。

1、共转染

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。

共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)进行转染。

2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后裂解细胞并提取基因组DNA，采用MSTN-JDF102和MSTN-JDR429组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。回收目标片段并进行测序，测序峰图见图11。利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为3％、32％、15％、19％。第五组不发生基因编辑。结果表明，第二组编辑效率最高，sgRNA_MSTN-E1-g2的靶点为最优靶点。

实施例4筛选高效的SST基因gRNA靶点

猪SST基因信息：编码somatostatin蛋白；位于猪13号染色体；GeneID为397386，Sus scrofa。猪SST基因编码的蛋白质如GENBANK ACCESSION NO.NP_001009583.1(linearCON 12-JAN-2018)所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。基因组DNA中，猪SST基因具有2个外显子，其中第1外显子及其上下游各400bp序列如SEQ ID NO.20所示。

4.1 SST基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用引物对(引物对的靶序列包括猪SST基因第1外显子)进行PCR扩增，然后进行电泳。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的SST基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：SST-JDF290/SST-JDR689。采用SST-JDF290/SST-JDR689组成的引物对对18只猪的基因组DNA进行PCR扩增后的电泳图见图12。

SST-JDF290：5’-CACGAGGGTAATGGTGCGTA-3’；

SST-JDR689：5’-GGTTAGGGGATTCGCGAGAG-3’。

4.2 靶点gRNA设计及构建

4个靶点分别如下：

sgRNA_SST-E1-g1靶点：5’-TCCATCGTCCTGGCTCTGGG-3’(SEQ ID NO.21)；

sgRNA_SST-E1-g2靶点：5’-GGGACTTCTGCAGAAACTGA-3’；

sgRNA_SST-E1-g3靶点：5’-TGACGGAGTCGGGGATCCGA-3’；

sgRNA_SST-E1-g4靶点：5’-TGCAGAAACTGACGGAGTCG-3’。

合成的SST基因共4个靶点的插入序列互补DNAOligo如下：

SST-E1-gRNA1-S：5’-caccgTCCATCGTCCTGGCTCTGGG-3’(SEQ ID NO.22)；

SST-E1-gRNA1-A：5’-aaacCCCAGAGCCAGGACGATGGAc-3’(SEQ ID NO.23)；

SST-E1-gRNA2-S：5’-caccGGGACTTCTGCAGAAACTGA-3’；

SST-E1-gRNA2-A：5’-aaacTCAGTTTCTGCAGAAGTCCC-3’；

SST-E1-gRNA3-S：5’-caccgTGACGGAGTCGGGGATCCGA-3’；

SST-E1-gRNA3-A：5’-aaacTCGGATCCCCGACTCCGTCAc-3’；

SST-E1-gRNA4-S：5’-caccgTGCAGAAACTGACGGAGTCG-3’；

SST-E1-gRNA4-A：5’-aaacCGACTCCGTCAGTTTCTGCAc-3’。

SST-E1-gRNA1-S、SST-E1-gRNA1-A、SST-E1-gRNA2-S、SST-E1-gRNA2-A、SST-E1-gRNA3-S、SST-E1-gRNA3-A、SST-E1-gRNA4-S、SST-E1-gRNA4-A均为单链DNA分子。

4.3 制备gRNA重组质粒

分别合成SST-E1-gRNA1-S和SST-E1-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g1)。质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g1)表达SEQ ID NO.24所示的sgRNA_SST-E1-g1：

UCCAUCGUCCUGGCUCUGGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu(SEQ ID NO.24)。

分别合成SST-E1-gRNA2-S和SST-E1-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g2)。质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g2)表达sgRNA_SST-E1-g2,sgRNA_SST-E1-g2序列如下所示:

GGGACUUCUGCAGAAACUGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成SST-E1-gRNA3-S和SST-E1-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g3)。质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g3)表达sgRNA_SST-E1-g3,sgRNA_SST-E1-g3序列如下所示:

UGACGGAGUCGGGGAUCCGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成SST-E1-gRNA4-S和SST-E1-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g4)。质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g4)表达sgRNA_SST-E1-g4,sgRNA_SST-E1-g4序列如下所示:

UGCAGAAACUGACGGAGUCGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

4.4 SST基因不同靶点gRNA的编辑效率比较

1、共转染

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(SST-E1-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(SST-E1-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(SST-E1-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(SST-E1-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后裂解细胞并提取基因组DNA，采用SST-JDF290和SST-JDR689组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。回收目标片段并进行测序，测序峰图见图13。利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为47％、26％、22％、11％。第五组不发生基因编辑。结果表明，第一组编辑效率最高，sgRNA_SST-E1-g1的靶点为最优靶点。

实施例5筛选高效的INHA基因gRNA靶点

猪INHA基因信息：编码inhibin subunit alpha蛋白；位于猪5号染色体；GeneID为397386，Sus scrofa。猪INHA基因编码的蛋白质如GENBANK ACCESSION NO.XP_020930352.1(linear CON 12-JAN-2018)所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。基因组DNA中，猪INHA基因具有2个外显子，其中第2外显子及其上下游各100bp序列如SEQ ID NO.26所示。

5.1 INHA基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用引物对(引物对的靶序列包括猪INHA基因第2外显子)进行PCR扩增，然后进行电泳。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的INHA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：INHA-E2-JDF178/INHA-E2-JDR654。采用INHA-E2-JDF178/INHA-E2-JDR654组成的引物对对18只猪的基因组DNA进行PCR扩增后的电泳图见图14。

INHA-E2-JDF178：5’-CTGCGCTGTCCTCTCTGTTC-3’；

INHA-E2-JDR654：5’-AGTGCTGGGTGAGAAGGTTG-3’。

5.2 靶点gRNA设计及构建

4个靶点分别如下：

sgRNA_INHA-E2-g1靶点：5’-CCTCTGCAGCAGGCGCAGCG-3’(SEQ ID NO.27)；

sgRNA_INHA-E2-g2靶点：5’-CCTGCTGCAGAGGCCCCCGG-3’；

sgRNA_INHA-E2-g3靶点：5’-GTGGCAGTCGGCGTGCACAG-3’；

sgRNA_INHA-E2-g4靶点：5’-AGATGTTGAGGGAAGCTCTG-3’。

合成的INHA基因共4个靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

INHA-E2-gRNA1-S：5’-caccgCCTCTGCAGCAGGCGCAGCG-3’(SEQ ID NO.28)；

INHA-E2-gRNA1-A：5’-aaacCGCTGCGCCTGCTGCAGAGGc-3’(SEQ ID NO.29)；

INHA-E2-gRNA2-S：5’-caccgCCTGCTGCAGAGGCCCCCGG-3’；

INHA-E2-gRNA2-A：5’-aaacCCGGGGGCCTCTGCAGCAGGc-3’；

INHA-E2-gRNA3-S：5’-caccGTGGCAGTCGGCGTGCACAG-3’；

INHA-E2-gRNA3-A：5’-aaacCTGTGCACGCCGACTGCCAC-3’；

INHA-E2-gRNA4-S：5’-caccgAGATGTTGAGGGAAGCTCTG-3’；

INHA-E2-gRNA4-A：5’-aaacCAGAGCTTCCCTCAACATCTc-3’。

INHA-E2-gRNA1-S、INHA-E2-gRNA1-A、INHA-E2-gRNA2-S、INHA-E2-gRNA2-A、INHA-E2-gRNA3-S、INHA-E2-gRNA3-A、INHA-E2-gRNA4-S、INHA-E2-gRNA4-A均为单链DNA分子。

5.3 制备gRNA重组质粒

分别合成INHA-E2-gRNA1-S和INHA-E2-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)。质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)表达SEQ ID NO.30所示的sgRNA_INHA-E2-g1:

CCUCUGCAGCAGGCGCAGCGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu(SEQ ID NO.30)。

分别合成INHA-E2-gRNA2-S和INHA-E2-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g2)。质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g2)表达sgRNA_INHA-E2-g2,sgRNA_INHA-E2-g2序列如下所示:

CCUGCUGCAGAGGCCCCCGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成INHA-E2-gRNA3-S和INHA-E2-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g3)。质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g3)表达sgRNA_INHA-E2-g3,sgRNA_INHA-E2-g3序列如下所示:

GUGGCAGUCGGCGUGCACAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成INHA-E2-gRNA4-S和INHA-E2-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g4)。质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g4)表达sgRNA_INHA-E2-g4,sgRNA_INHA-E2-g4序列如下所示:

AGAUGUUGAGGGAAGCUCUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

5.4 INHA基因不同靶点gRNA的编辑效率比较

1、共转染

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(INHA-E2-g2)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(INHA-E2-g3)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(INHA-E2-g4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后裂解细胞并提取基因组DNA，采用INHA-E2-JDF178和INHA-E2-JDR654组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。回收目标片段并进行测序，测序峰图见图15。利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为68％、5％、8％、1％。第五组不发生基因编辑。结果表明，第一组编辑效率最高，sgRNAINHA-E2-g1的靶点为最优靶点。

实施例6筛选高效的CD163基因gRNA靶点

猪CD163基因信息：编码CD163 molecule蛋白；位于猪5号染色体；GeneID为397031，Sus scrofa。猪CD163基因编码的蛋白质如GENBANK ACCESSION NO.XP_020946779.1(linear CON 12-JAN-2018)所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示。基因组DNA中，猪CD163基因具有18个外显子，其中第7外显子及其上下游各400bp序列如SEQ IDNO.32所示。

6.1 CD163基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用引物对(引物对的靶序列包括猪CD163基因第7外显子)进行PCR扩增，然后进行电泳。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的CD163基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：CD163-JDF121/CD163-JDR518。采用CD163-JDF121/CD163-JDR518组成的引物对对18只猪的基因组DNA进行PCR扩增后的电泳图见图16。

CD163-JDF121：5’-GAATCGGCTAAGCCCACTGTA-3’；

CD163-JDR518：5’-ACTGGGCAGAGTGAAAGGTG-3’。

6.2 靶点gRNA设计及构建

4个靶点分别如下：

sgRNA_CD163-E7-g1靶点：5’-GGAACTACAGTGCGGCACTG-3’；

sgRNA_CD163-E7-g2靶点：5’-GGTCGTGTTGAAGTACAACA-3’(SEQ ID NO.33)；

sgRNA_CD163-E7-g3靶点：5’-GTACAACATGGAGACACGTG-3’；

sgRNA_CD163-E7-g4靶点：5’-ACTGTGGTTTCCCTCCTGGG-3’。

合成的CD163基因共4个靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

CD163-E7-gRNA1-S：5’-caccGGAACTACAGTGCGGCACTG-3’；

CD163-E7-gRNA1-A：5’-aaacCAGTGCCGCACTGTAGTTCC-3’；

CD163-E7-gRNA2-S：5’-caccGGTCGTGTTGAAGTACAACA-3’(SEQ ID NO.34)；

CD163-E7-gRNA2-A：5’-aaacTGTTGTACTTCAACACGACC-3’(SEQ ID NO.35)；

CD163-E7-gRNA3-S：5’-caccGTACAACATGGAGACACGTG-3’；

CD163-E7-gRNA3-A：5’-aaacCACGTGTCTCCATGTTGTAC-3’；

CD163-E7-gRNA4-S：5’-caccgACTGTGGTTTCCCTCCTGGG-3’；

CD163-E7-gRNA4-A：5’-aaacCCCAGGAGGGAAACCACAGTc-3’。

CD163-E7-gRNA1-S、CD163-E7-gRNA1-A、CD163-E7-gRNA2-S、CD163-E7-gRNA2-A、CD163-E7-gRNA3-S、CD163-E7-gRNA3-A、CD163-E7-gRNA4-S、CD163-E7-gRNA4-A均为单链DNA分子。

6.3 制备gRNA重组质粒

分别合成CD163-E7-gRNA1-S和CD163-E7-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g1)。质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g1)表达sgRNA_CD163-E7-g1，sgRNA_CD163-E7-g1序列如下所示：

GGAACUACAGUGCGGCACUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成CD163-E7-gRNA2-S和CD163-E7-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g2)。质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g2)表达SEQ ID NO.36所示的sgRNA_CD163-E7-g2：

GGUCGUGUUGAAGUACAACAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu(SEQ ID NO.36)。

分别合成CD163-E7-gRNA3-S和CD163-E7-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g3)。质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g3)表达sgRNA_CD163-E7-g3，sgRNA_CD163-E7-g3序列如下所示：

GUACAACAUGGAGACACGUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成CD163-E7-gRNA4-S和CD163-E7-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g4)。质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g4)表达sgRNA_CD163-E7-g4，sgRNA_CD163-E7-g4序列如下所示：

ACUGUGGUUUCCCUCCUGGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

6.4 CD163基因不同靶点gRNA的编辑效率比较

1、共转染

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(CD163-E7-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(CD163-E7-g2)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(CD163-E7-g3)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(CD163-E7-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(CD163-E7-g4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后裂解细胞并提取基因组DNA，采用CD163-JDF121和CD163-JDR518组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。回收目标片段并进行测序，测序峰图见图17。利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为16％、34％、10％、10％。第五组不发生基因编辑。结果表明，第二组编辑效率最高，sgRNA_CD163-E7-g2的靶点为最优靶点。

实施例7筛选高效的pAPN基因gRNA靶点

猪APN基因信息：编码alanyl aminopeptidase,membrane蛋白；位于猪7号染色体；GeneID为397520，Sus scrofa。猪CD163基因编码的蛋白质如GENBANK ACCESSION NO.NP_999442.1(linear CON12-JAN-2018)所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示。基因组DNA中，猪APN基因具有2个外显子，其中第2外显子及其上下游各100bp序列如SEQ ID NO.38所示。

7.1 pAPN基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用引物对(引物对的靶序列包括猪APN基因第2外显子)进行PCR扩增，然后进行电泳。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的pAPN基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：APN-JDF94/APN-JDR656。采用APN-JDF94/APN-JDR656组成的引物对对18只猪的基因组DNA进行PCR扩增后的电泳图见图18。

APN-JDF94：5’-GAACCGGAGCAGTGTCTCTA-3’；

APN-JDR656：5’-CCCCTGGGTGGTGTAGTTGA-3’。

7.2 靶点gRNA设计及构建

4个靶点分别如下：

sgRNA_APN-E2-g1靶点：5’-GAGGATGCCCAGGATGCCCA-3’(SEQ ID NO.39)；

sgRNA_APN-E2-g2靶点：5’-CCTGGGCATCCTCCTCGGCG-3’；

sgRNA_APN-E2-g3靶点：5’-CACAGACAGAGCGATGATGG-3’；

sgRNA_APN-E2-g4靶点：5’-GCTCTGGTCCAAGGTGATGG-3’。

合成的APN基因共4个靶点的插入序列互补DNAOligo如下：

APN-E2-gRNA1-S：5’-caccGAGGATGCCCAGGATGCCCA-3’(SEQ ID NO.40)；

APN-E2-gRNA1-A：5’-aaacTGGGCATCCTGGGCATCCTC-3’(SEQ ID NO.41)；

APN-E2-gRNA2-S：5’-caccgCCTGGGCATCCTCCTCGGCG-3’；

APN-E2-gRNA2-A：5’-aaacCGCCGAGGAGGATGCCCAGGc-3’；

APN-E2-gRNA3-S：5’-caccgCACAGACAGAGCGATGATGG-3’；

APN-E2-gRNA3-A：5’-aaacCCATCATCGCTCTGTCTGTGc-3’；

APN-E2-gRNA4-S：5’-caccGCTCTGGTCCAAGGTGATGG-3’；

APN-E2-gRNA4-A：5’-aaacCCATCACCTTGGACCAGAGC-3’。

APN-E2-gRNA1-S、APN-E2-gRNA1-A、APN-E2-gRNA2-S、APN-E2-gRNA2-A、APN-E2-gRNA3-S、APN-E2-gRNA3-A、APN-E2-gRNA4-S、APN-E2-gRNA4-A均为单链DNA分子。

7.3 制备gRNA重组质粒

分别合成APN-E2-gRNA1-S和APN-E2-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g1)。质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g1)表达SEQ ID NO.42所示的sgRNA_APN-E2-g1：

GAGGAUGCCCAGGAUGCCCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu(SEQ ID NO.42)。

分别合成APN-E2-gRNA2-S和APN-E2-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g2)。质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g2)表达sgRNA_APN-E2-g2，sgRNA_APN-E2-g2序列如下所示：

CCUGGGCAUCCUCCUCGGCGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成APN-E2-gRNA3-S和APN-E2-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g3)。质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g3)表达sgRNA_APN-E2-g3，sgRNA_APN-E2-g3序列如下所示：

CACAGACAGAGCGAUGAUGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

分别合成APN-E2-gRNA4-S和APN-E2-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g4)。质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g4)表达sgRNA_APN-E2-g4，sgRNA_APN-E2-g4序列如下所示：

GCUCUGGUCCAAGGUGAUGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。

7.4 pAPN基因不同靶点gRNA的编辑效率比较

1、共转染

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(APN-E2-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(APN-E2-g2)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(APN-E2-g3)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(APN-E2-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(APN-E2-g4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后裂解细胞并提取基因组DNA，采用APN-JDF94和APN-JDR656组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。回收目标片段并进行测序，测序峰图见图19。利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为52％、15％、16％、5％。第五组不发生基因编辑。结果表明，第一组编辑效率最高，sgRNA_APN-E2-g1的靶点为最优靶点。

实施例8构建MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因联合敲除的从江香猪单细胞克隆

8.1 猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

8.2 分别针对5基因的gRNA质粒及pKG-GE3质粒共转染猪原代成纤维细胞

8.2.1 将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g2)、pKG-U6gRNA(SST-E1-g1)、pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)、pKG-U6gRNA(CD163-E7-g2)、pKG-U6gRNA(APN-E2-g1)、pKG-GE3转染至猪原代成纤维细胞。

配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.28μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-E1-g2)：0.28μg质粒pKG-U6gRNA(SST-E1-g1)：0.28μg质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)：0.28μg pKG-U6gRNA(CD163-E7-g2)：0.28μg pKG-U6gRNA(APN-E2-g1)：1.60μg质粒pKG-GE3，各质粒的摩尔比为：(3/5):(3/5):(3/5):(3/5)：(3/5)：1，即总gRNA:pKG-GE3为3：1。。

8.2.2 共转染操作方法

同实施例2中2.3.2，但不使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。

8.3 MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因联合敲除单细胞克隆株的筛选

8.3.1 将步骤8.2所得电转48h的群体细胞，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用200μL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单细胞转移到每孔含100μL完全培养基的96孔板中，每孔放置一个细胞；

8.3.2 37℃，5％CO₂、5％O₂的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单细胞克隆的孔；

8.3.3 待96孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3细胞收集在1.5mL离心管中备后续基因型测定；

8.3.4 待6孔板长至80％汇合度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。

8.4 MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因联合敲除的单细胞克隆鉴定

8.4.1 向步骤8.3.3收集在1.5mL离心管中的细胞中加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞,得到释放出基因组DNA的细胞裂解液。

KAPA2G裂解液配制体系如下：

10X extract Buffer 1μL

Enzyme 0.2μL

ddH2O 8.8μL

75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后细胞裂解液于-20℃保存；

8.4.2 采用前述针对MSTN基因E1的引物对(MSTN-JDF102/MSTN-JDR429)、针对SST基因E1的引物对(SST-JDF290/SST-JDR689)、针对INHA基因E2的引物对(INHA-E2-JDF178/INHA-E2-JDR654)、针对CD163基因E7的引物对(CD163-JDF121/CD163-JDR518)及针对pAPN基因E2的引物对(APN-JDF94/APN-JDR656)，并以上述细胞裂解液为DNA模板，分别进行PCR扩增MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN基因靶点区域，检测单细胞克隆的靶基因突变情况。MSTN基因的目的PCR产物长度为328bp，SST基因的目的PCR产物长度为400bp，INHA基因的目的PCR产物长度为477bp,CD163基因的目的PCR产物长度为398bp，pAPN基因的目的PCR产物长度为563bp；

8.4.3 使用PCR常规反应扩增MSTN、SST、INHA、CD163和pAPN基因靶点区域；

8.4.4 将PCR反应产物进行电泳，电泳结果分别如图20(MSTN)、图21(SST)、图22(INHA)、图23(CD163)和图24(pAPN)所示，泳道编号与单细胞克隆编号一致。回收PCR扩增产物并测序。

8.4.5 将测序结果分别与MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN基因靶点信息进行比对，从而判断该单细胞克隆是否为MSTN、SST、INHA、CD163和pAPN五基因联合敲除。

8.4.5.1 对于MSTN基因，编号为2、17、21、62的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型；编号为30、43的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型；编号为50、69、77、81的单细胞克隆的基因型为杂合突变型；其他编号的单细胞克隆的基因型为野生型；得到MSTN基因编辑单细胞克隆的比率为10％。

示例性的测序比对结果如图25至图28，其中图25是克隆号为1的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为野生型；图26是克隆号为69的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为杂合突变型；图27是克隆号为62的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因相同变异的纯合突变型；图28是克隆号为43的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因不同变异的纯合突变型。

通过具体序列的分析，各单细胞克隆基因型如表1：

表1 MSTN基因敲除单细胞克隆基因型鉴定

/>

/>

8.4.5.2 对于SST基因，编号为2、17、22、62、66、83、91、95、97的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型；编号为30、50、93、99的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型；编号为3、19、40、46、52、81的单细胞克隆的基因型为杂合突变型；其他编号的单细胞克隆的基因型为野生型；得到SST基因编辑单细胞克隆的比率为19％。

示例性的测序比对结果如图29至图32，其中图29是克隆号为1的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为野生型；图30是克隆号为40的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为杂合突变型；图31是克隆号为22的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因相同变异的纯合突变型；图32是克隆号为30的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因不同变异的纯合突变型。

通过具体序列的分析，各单细胞克隆基因型如表2：

表2 SST基因敲除单细胞克隆基因型鉴定

/>

/>

8.4.5.3对于INHA基因，编号为2、6、8、12、17、18、30、34、37、40、46、49、62、64、80、90、92、95、97、99的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型；编号为83、85的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型；编号为4、9、14、16、21、26、27、42、56、71的单细胞克隆的基因型为杂合突变型；其他编号的单细胞克隆的基因型为野生型；得到SST基因编辑单细胞克隆的比率为32％。

示例性的测序比对结果如图33至图36，其中图33是克隆号为1的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为野生型；图34是克隆号为26的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为杂合突变型；图35是克隆号为8的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因相同变异的纯合突变型；图36是克隆号为83的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因不同变异的纯合突变型。

通过具体序列的分析，各单细胞克隆基因型如表3：

表3 INHA基因敲除单细胞克隆基因型鉴定

/>

/>

8.4.5.4 对于CD163基因，编号为2、30、41、62、83、87的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型；编号为28、63的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型；编号为7、13、46、71的单细胞克隆的基因型为杂合突变型；其他编号的单细胞克隆的基因型为野生型；得到CD163基因编辑单细胞克隆的比率为12％。

示例性的测序比对结果如图37至图40，其中图37是克隆号为3的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为野生型；图38是克隆号为7的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为杂合突变型；图39是克隆号为2的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因相同变异的纯合突变型；图40是克隆号为28的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因不同变异的纯合突变型。

通过具体序列的分析，各单细胞克隆基因型如表4：

表4 CD163基因敲除单细胞克隆基因型鉴定

/>

/>

8.4.5.5 对于pAPN基因，编号为2、17、30、32、38、42、48、54、62、68、89、96的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型；编号为77、79、83的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型；编号为60、66、72、75、92、94、100的单细胞克隆的基因型为杂合突变型；其他编号的单细胞克隆的基因型为野生型；得到pAPN基因编辑单细胞克隆的比率为22％。

示例性的测序比对结果如图41至图44，其中图41是克隆号为1的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为野生型；图42是克隆号为60的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为杂合突变型；图43是克隆号为62的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因相同变异的纯合突变型；图44是克隆号为83的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因不同变异的纯合突变型。

通过具体序列的分析，各单细胞克隆基因型如表5：

表5 pAPN基因敲除单细胞克隆基因型鉴定

/>

/>

8.4.6 通过分析，编号为2、30、62的单细胞克隆为MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因均纯合敲除的单细胞克隆，五基因联合敲除纯合率为3％。

上述的杂合突变及纯合突变单细胞克隆株均可用来进行基因编辑猪的克隆生产。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 南京启真基因工程有限公司

<120> 构建瘦肉率高、生长快、繁殖力高且抗系列流行病的优质猪核移植供体细胞的方法及其应用

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8484

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840

ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900

agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960

aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020

ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080

gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140

agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200

ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320

ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380

caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440

caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500

gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560

caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620

ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680

gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740

ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800

gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860

cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920

caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980

gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040

gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100

caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160

cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220

cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280

caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340

gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400

cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460

ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520

gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580

ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640

cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700

gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760

catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820

cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880

cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940

gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000

gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060

cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120

cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180

cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240

cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300

gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360

caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420

cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480

ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540

cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600

ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660

gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720

cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780

cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840

gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900

cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960

cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020

tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080

taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140

acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200

agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260

ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320

cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380

ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440

taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500

ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560

cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620

gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680

caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740

cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800

caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860

cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920

ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980

aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040

tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100

tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160

gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220

cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280

gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340

ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400

caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460

ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520

tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700

ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500

ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980

ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460

tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484

<210> 2

<211> 10476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360

gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600

ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660

tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720

ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780

gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840

cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900

cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960

caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020

gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080

cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140

cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200

cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260

cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320

cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380

agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440

ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500

ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560

cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620

ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680

caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740

gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800

gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860

ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920

cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980

gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040

ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100

agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160

ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220

actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280

cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340

tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400

cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460

gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520

ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580

gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640

atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700

cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760

cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820

cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880

caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940

cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000

gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060

cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120

cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180

ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240

cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300

gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360

gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420

caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480

cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540

ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600

ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660

caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720

cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780

gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840

aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900

gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960

ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020

cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080

cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140

aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200

cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260

aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320

catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380

gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440

taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500

agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560

catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620

agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680

cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740

gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800

ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860

gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920

caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980

tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040

caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100

ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160

caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220

gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280

aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340

gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400

cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460

cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520

cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580

cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640

cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700

cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760

caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820

gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880

gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940

ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000

cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060

caggggaagt cttctaacat gcggggacgt ggaggaaaat cccggcccaa ccgagtacaa 6120

gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6180

cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240

ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300

ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360

ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6420

gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6480

ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6540

ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6600

ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660

cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720

caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780

tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840

tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900

gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960

tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020

tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080

gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140

cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200

caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260

tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320

agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380

ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7560

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620

cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 7800

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860

gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920

atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980

cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg 8040

ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100

taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160

aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220

ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280

tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggtctatt 8340

ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400

ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460

cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580

caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640

tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700

ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760

gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820

cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 9360

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 9420

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480

ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540

cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600

atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 9660

cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 9960

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476

<210> 3

<211> 3120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

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cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280

ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340

tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520

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ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640

tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700

ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880

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gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120

<210> 4

<211> 175

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 60

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 120

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataa 175

<210> 5

<211> 554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60

gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240

gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300

tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360

gggtcggcaa ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 420

tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480

tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540

caccatggac tata 554

<210> 6

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120

ggtgggtggg tccccaaaga agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga 180

caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240

cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300

catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360

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gcaagagatc ttcagcaacg agatggc 447

<210> 7

<211> 2727

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60

ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120

ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 240

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 300

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 360

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 420

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 480

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 540

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 600

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 660

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 720

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 780

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 840

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaaggg ctccggcgag ggcaggggaa 900

gtcttctaac atgcggggac gtggaggaaa atcccggccc aaccgagtac aagcccacgg 960

tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 1020

ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 1080

agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 1140

acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 1200

tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1260

agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1320

tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 1380

tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc 1440

tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 1500

cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560

ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620

cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680

tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1740

ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800

gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860

cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1920

ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1980

ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2040

cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100

gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160

gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 2220

gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 2280

agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 2340

ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400

ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460

cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520

ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2700

tggcctgcag gggcgcctga tgcggta 2727

<210> 8

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gataaacatg tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agttatggca gaactcagtg 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caccgagtta tggcagaact cagtg 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaccactga gttctgccat aactc 25

<210> 12

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aguuauggca gaacucagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 13

<211> 375

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 13

Met Gln Lys Leu Gln Ile Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile

1 5 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn

20 25 30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Met Trp Arg Gln Asn Thr

35 40 45

Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu

50 55 60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu

65 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val

85 90 95

Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

100 105 110

Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu

115 120 125

Met Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

130 135 140

Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu

145 150 155 160

Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu

165 170 175

Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu

180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val

195 200 205

Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly

210 215 220

Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr

225 230 235 240

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys

245 250 255

Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys

260 265 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val

275 280 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr

290 295 300

Lys Ala Ser Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys

305 310 315 320

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala

325 330 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr

340 345 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val

355 360 365

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

370 375

<210> 14

<211> 573

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 14

atgcaaaaac tgcaaatcta tgtttatatt tacctgttta tgctgattgt tgctggtccc 60

gtggatctga atgagaacag cgagcaaaag gaaaatgtgg aaaaagaggg gctgtgtaat 120

gcatgtatgt ggagacaaaa cactaaatct tcaagactag aagccataaa aattcaaatc 180

ctcagtaaac ttcgcctgga aacagctcct aacattagca aagatgctat aagacaactt 240

ttgcccaaag ctcctccact ccgggaactg attgatcagt acgatgtcca gagagatgac 300

agcagtgatg gctccttgga agatgatgat tatcacgcta cgacggaaac gatcattacc 360

atgcctacag agtgtaagta gtcctattag tgtatatcaa caattctgct gactgttgtt 420

ccagtgttta tgagaaacag atctattttc aggctctttt aacaagctgt tggcttgtac 480

gtaagtagga gggaaaagag tttctttttt caagatttca tgagaaataa actaatgaga 540

ctgaaagctg ctgtattatt gttttcctta gct 573

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgatcaatca gttcccggag 20

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caccgtgatc aatcagttcc cggag 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaacctccgg gaactgattg atcac 25

<210> 18

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ugaucaauca guucccggag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 19

<211> 116

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 19

Met Leu Ser Cys Arg Leu Gln Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Val

1 5 10 15

Leu Ala Leu Gly Gly Val Thr Gly Ala Pro Ser Asp Pro Arg Leu Arg

20 25 30

Gln Phe Leu Gln Lys Ser Leu Ala Ala Ala Ala Gly Lys Gln Glu Leu

35 40 45

Ala Lys Tyr Phe Leu Ala Glu Leu Leu Ser Glu Pro Asn Gln Thr Glu

50 55 60

Asn Asp Ala Leu Glu Pro Glu Asp Leu Ser Gln Ala Ala Glu Gln Asp

65 70 75 80

Glu Met Arg Leu Glu Leu Gln Arg Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met

85 90 95

Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr

100 105 110

Phe Thr Ser Cys

115

<210> 20

<211> 938

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 20

taactggtgt gcacatgtgt gagtgaaatt atggaatgtg tatgtgcata gcactgagtg 60

aatataaaaa gattgtgtag atggtgtggc acgtggggga attgtgtggg cctgtgtgca 120

ggatttattt atttcttaat aagctacttt tgattgtgta gagcctcctc tcacttcggt 180

gattgatttc acgagggtaa tggtgcgtaa aagcgctggt gagatctggg ggcgcctcct 240

agtctgacgt cagagagaga gtttaaaaag ggggagacgg tggcgagcgc acaagccgct 300

tcaggagtcg cgaggttcag agccgtcgct gctgcctgca aatcgactcc tagagtttga 360

ccaaccgcgc tctagctcgg cttctctggc cgctgccgag atgctgtcct gccgcctcca 420

gtgcgcgctg gccgcgctct ccatcgtcct ggctctgggc ggtgtcactg gcgcgccctc 480

ggatccccga ctccgtcagt ttctgcagaa gtccctggct gctgccgctg ggaagcaggt 540

aaggagactc cctcgacgcc ttctttcccc tctcgcgaat cccctaacct taccttagcc 600

ttgcccctcc tcccttgggt ggacttagga ggtggtccca aagagtatcg gtgcttttct 660

gggtccctta ggcaccaaat ctctcaggaa aactttcaaa gtccagaatt cctttttacc 720

tctttgtttt ttccctcttt gatcagcgca gtaggtcaca gttcaggtga gttctttggc 780

tttcaagaaa attctaagat ctggggaact gagctcgagg ggatgatggc atctatccgc 840

ggtgctgacc atgggaggtg ctgacccagg tgctgaaagc gcggacctct gaagcttcct 900

aagcagtacc tcccacccat gcagcagggc tgggggct 938

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tccatcgtcc tggctctggg 20

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caccgtccat cgtcctggct ctggg 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aaaccccaga gccaggacga tggac 25

<210> 24

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

uccaucgucc uggcucuggg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 25

<211> 339

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 25

Met Gly Arg Gly Asp Trp Gly Gly Pro Gly Gln Thr Leu Thr Glu Gly

1 5 10 15

Ala Gln Gly Trp Val Trp Val His Arg Trp Gln Gly Gln Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ala Ser Ala Ala Pro Leu Ala Val Gly Pro Thr Glu Trp Ala Trp

35 40 45

Leu Pro Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Cys Pro Gly Gln Gly Ala

50 55 60

Arg Cys Gly Asp Glu Pro Ala Ala Gly Glu Leu Ala Arg Glu Ala Glu

65 70 75 80

Glu Gly Leu Phe Thr Tyr Val Phe Arg Pro Ser Gln His Thr Arg Ser

85 90 95

Arg Gln Val Thr Ser Ala Gln Leu Trp Phe His Thr Gly Leu Asp Arg

100 105 110

Gln Gly Met Ala Ala Ala Asn Ser Ser Gly Pro Leu Leu Asp Leu Leu

115 120 125

Ala Leu Ser Ser Arg Gly Pro Val Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Gln

130 135 140

Ala Pro Pro Arg Trp Ala Val Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Leu Pro

145 150 155 160

Leu Leu Thr His Pro Val Leu Val Leu Leu Leu Arg Cys Pro Leu Cys

165 170 175

Ser Cys Ser Ala Arg Pro Glu Ala Thr Pro Phe Leu Val Ala His Thr

180 185 190

Arg Ala Arg Pro Pro Ser Gly Gly Glu Arg Ala Arg Arg Ser Thr Ala

195 200 205

Pro Leu Pro Trp Pro Trp Ser Pro Ala Ala Leu Arg Leu Leu Gln Arg

210 215 220

Pro Pro Glu Glu Pro Ala Val His Ala Asp Cys His Arg Ala Ser Leu

225 230 235 240

Asn Ile Ser Phe Gln Glu Leu Gly Trp Asp Arg Trp Ile Val His Pro

245 250 255

Pro Ser Phe Ile Phe His Tyr Cys His Gly Gly Cys Gly Leu Pro Thr

260 265 270

Leu Pro Asn Leu Pro Leu Ser Val Pro Gly Ala Pro Pro Thr Pro Val

275 280 285

Gln Pro Leu Leu Leu Val Pro Gly Ala Gln Pro Cys Cys Ala Ala Leu

290 295 300

Pro Gly Thr Met Arg Ser Leu Arg Val Arg Thr Thr Ser Asp Gly Gly

305 310 315 320

Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Leu Leu Thr Gln His Cys

325 330 335

Ala Cys Ile

<210> 26

<211> 1034

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 26

gcaggctcct gagtggcagc cagatcctgc ctgttgagga ggaggggtcc caggttctgc 60

cagtcagggc tgccctctcc cttccttctg cctcctgcag gtgcccgctg tggggacgag 120

ccagctgctg gagagctggc ccgggaggct gaggagggcc tcttcacata tgtattccgg 180

ccgtcccagc acacacgcag ccgccaggtg acttcagctc agctgtggtt ccacacggga 240

ctggacagac aggggatggc agccgccaat agctctgggc ccctgctgga cctgctggca 300

ctatcatcca ggggtcctgt ggctgtgccc atgtcactgg gccaggcgcc ccctcgctgg 360

gctgtgctgc acctggccgc ctctgccctc cctttgttga cccacccagt cctggtgctg 420

ctgctgcgct gtcctctctg ttcctgctca gcccggcccg aggccacccc cttcctggtg 480

gcccacactc gggccaggcc acccagcgga gggggagagg gcccgacgct ccaccgcccc 540

tctgccctgg ccttggtccc ccgccgcgct gcgcctgctg cagaggcccc cggaggaacc 600

cgctgtgcac gccgactgcc acagagcttc cctcaacatc tccttccagg agctgggctg 660

ggaccggtgg atcgtgcacc ctcccagttt catcttccac tactgtcacg ggggctgcgg 720

gctgccgacc ctgcccaacc tgcccctgtc tgtccctggg gcccccccta cccctgtcca 780

gcccctgttg ttggtgccag gggctcagcc ctgctgcgct gctctcccgg ggaccatgag 840

gtccctacgc gttcgcacca cctcggatgg aggttactct ttcaagtacg agacagtgcc 900

caaccttctc acccagcact gtgcctgcat ctaagggtgt cccgctggtg gccaagctcc 960

cacaggcacc agcctggagg aaggcagagt tcccacctcc cctttccttc cgcctctccg 1020

cctggaggct cccc 1034

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cctctgcagc aggcgcagcg 20

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

caccgcctct gcagcaggcg cagcg 25

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aaaccgctgc gcctgctgca gaggc 25

<210> 30

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccucugcagc aggcgcagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 31

<211> 1113

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 31

Met Asp Lys Leu Arg Met Val Leu His Glu Asn Ser Gly Ser Ala Asp

1 5 10 15

Phe Arg Arg Cys Ser Ala His Leu Ser Ser Phe Thr Phe Ala Val Val

20 25 30

Ala Val Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr Ser Ser Leu Gly Gly Lys Asp

35 40 45

Lys Glu Leu Arg Leu Thr Gly Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val

50 55 60

Glu Val Lys Val Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp

65 70 75 80

Asp Met Asp Val Val Ser Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Pro Thr

85 90 95

Ala Ile Lys Ala Thr Gly Trp Ala Asn Phe Ser Ala Gly Ser Gly Arg

100 105 110

Ile Trp Met Asp His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp

115 120 125

Asp Cys Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Thr His Gln Gln

130 135 140

Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser Asp Leu Glu Met Arg Leu

145 150 155 160

Val Asn Gly Gly Asn Arg Cys Leu Gly Arg Ile Glu Val Lys Phe Gln

165 170 175

Gly Arg Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Asn Ile Asn His Ala

180 185 190

Ser Val Val Cys Lys Gln Leu Glu Cys Gly Ser Ala Val Ser Phe Ser

195 200 205

Gly Ser Ala Asn Phe Gly Glu Gly Ser Gly Pro Ile Trp Phe Asp Asp

210 215 220

Leu Val Cys Asn Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asn Cys Lys His Glu

225 230 235 240

Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Asp His Ala Glu Asp Ala Gly Val Ile

245 250 255

Cys Leu Asn Gly Ala Asp Leu Lys Leu Arg Val Val Asp Gly Val Thr

260 265 270

Glu Cys Ser Gly Arg Leu Glu Val Lys Phe Gln Gly Glu Trp Gly Thr

275 280 285

Ile Cys Asp Asp Gly Trp Asp Ser Asp Asp Ala Ala Val Ala Cys Lys

290 295 300

Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Val Thr Ala Ile Gly Arg Val Asn Ala

305 310 315 320

Ser Glu Gly Thr Gly His Ile Trp Leu Asp Ser Val Ser Cys His Gly

325 330 335

His Glu Ser Ala Leu Trp Gln Cys Arg His His Glu Trp Gly Lys His

340 345 350

Tyr Cys Asn His Asn Glu Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser

355 360 365

Asp Leu Glu Leu Arg Leu Lys Gly Gly Gly Ser His Cys Ala Gly Thr

370 375 380

Val Glu Val Glu Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Val Cys Asp Arg Ser

385 390 395 400

Trp Gly Leu Lys Glu Ala Asp Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly

405 410 415

Ser Ala Leu Lys Thr Ser Tyr Gln Val Tyr Ser Lys Thr Lys Ala Thr

420 425 430

Asn Thr Trp Leu Phe Val Ser Ser Cys Asn Gly Asn Glu Thr Ser Leu

435 440 445

Trp Asp Cys Lys Asn Trp Gln Trp Gly Gly Leu Ser Cys Asp His Tyr

450 455 460

Asp Glu Ala Lys Ile Thr Cys Ser Ala His Arg Lys Pro Arg Leu Val

465 470 475 480

Gly Gly Asp Ile Pro Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Gln His Gly Asp

485 490 495

Thr Trp Gly Thr Val Cys Asp Ser Asp Phe Ser Leu Glu Ala Ala Ser

500 505 510

Val Leu Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly Thr Val Val Ser Leu Leu Gly

515 520 525

Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly Gln Ile Trp Ala Glu Glu Phe

530 535 540

Gln Cys Glu Gly His Glu Ser His Leu Ser Leu Cys Pro Val Ala Pro

545 550 555 560

Arg Pro Asp Gly Thr Cys Ser His Ser Arg Asp Val Gly Val Val Cys

565 570 575

Ser Arg Tyr Thr Gln Ile Arg Leu Val Asn Gly Lys Thr Pro Cys Glu

580 585 590

Gly Arg Val Glu Leu Asn Ile Leu Gly Ser Trp Gly Ser Leu Cys Asn

595 600 605

Ser His Trp Asp Met Glu Asp Ala His Val Leu Cys Gln Gln Leu Lys

610 615 620

Cys Gly Val Ala Leu Ser Ile Pro Gly Gly Ala Pro Phe Gly Lys Gly

625 630 635 640

Ser Glu Gln Val Trp Arg His Met Phe His Cys Thr Gly Thr Glu Lys

645 650 655

His Met Gly Asp Cys Ser Val Thr Ala Leu Gly Ala Ser Leu Cys Ser

660 665 670

Ser Gly Gln Val Ala Ser Val Ile Cys Ser Gly Asn Gln Ser Gln Thr

675 680 685

Leu Ser Pro Cys Asn Ser Ser Ser Ser Asp Pro Ser Ser Ser Ile Ile

690 695 700

Ser Glu Glu Asn Gly Val Ala Cys Ile Gly Ser Gly Gln Leu Arg Leu

705 710 715 720

Val Asp Gly Gly Gly Arg Cys Ala Gly Arg Val Glu Val Tyr His Glu

725 730 735

Gly Ser Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Ser Trp Asp Leu Asn Asp Ala

740 745 750

His Val Val Cys Lys Gln Leu Ser Cys Gly Trp Ala Ile Asn Ala Thr

755 760 765

Gly Ser Ala His Phe Gly Glu Gly Thr Gly Pro Ile Trp Leu Asp Glu

770 775 780

Ile Asn Cys Asn Gly Lys Glu Ser His Ile Trp Gln Cys His Ser His

785 790 795 800

Gly Trp Gly Arg His Asn Cys Arg His Lys Glu Asp Ala Gly Val Ile

805 810 815

Cys Ser Glu Phe Met Ser Leu Arg Leu Ile Ser Glu Asn Ser Arg Glu

820 825 830

Thr Cys Ala Gly Arg Leu Glu Val Phe Tyr Asn Gly Ala Trp Gly Ser

835 840 845

Val Gly Lys Asn Ser Met Ser Pro Ala Thr Val Gly Val Val Cys Arg

850 855 860

Gln Leu Gly Cys Ala Asp Arg Gly Asp Ile Ser Pro Ala Ser Ser Asp

865 870 875 880

Lys Thr Val Ser Arg His Met Trp Val Asp Asn Val Gln Cys Pro Lys

885 890 895

Gly Pro Asp Thr Leu Trp Gln Cys Pro Ser Ser Pro Trp Lys Lys Arg

900 905 910

Leu Ala Ser Pro Ser Glu Glu Thr Trp Ile Thr Cys Ala Asn Lys Ile

915 920 925

Arg Leu Gln Glu Gly Asn Thr Asn Cys Ser Gly Arg Val Glu Ile Trp

930 935 940

Tyr Gly Gly Ser Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Ser Trp Asp Leu Glu

945 950 955 960

Asp Ala Gln Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly Ser Ala Leu Glu

965 970 975

Ala Gly Lys Glu Ala Ala Phe Gly Gln Gly Thr Gly Pro Ile Trp Leu

980 985 990

Asn Glu Val Lys Cys Lys Gly Asn Glu Thr Ser Leu Trp Asp Cys Pro

995 1000 1005

Ala Arg Ser Trp Gly His Ser Asp Cys Gly His Lys Glu Asp Ala Ala

1010 1015 1020

Val Thr Cys Ser Glu Ile Ala Lys Ser Arg Glu Ser Leu His Ala Thr

1025 1030 1035 1040

Gly Arg Ser Ser Phe Val Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Ile Leu Leu

1045 1050 1055

Ala Cys Leu Ile Ala Phe Leu Ile Trp Thr Gln Lys Arg Arg Gln Arg

1060 1065 1070

Gln Arg Leu Ser Val Phe Ser Gly Gly Glu Asn Ser Val His Gln Ile

1075 1080 1085

Gln Tyr Arg Glu Met Asn Ser Cys Leu Lys Ala Asp Glu Thr Asp Met

1090 1095 1100

Leu Asn Pro Ser Glu Asn Ser Asn Glu

1105 1110

<210> 32

<211> 1115

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 32

tggcaaagat tgtctttaaa atctgagctc catgtcttct gctttatttc tggtgtgcct 60

ttgactccag attacagtaa atggaggact gagtataggg ctaaaaagta gagagaatgg 120

atgcatatta tctgtggtct ccaatgtgat gaatgaagta ggcaaatact caaaggaaag 180

agaaagcatg ctccaagaat tatgggttcc agaaggcaaa gtcccagaat tgtctccagg 240

gaaggacagg gaggtctaga atcggctaag cccactgtag gcagaaaaac caagaggcat 300

gaatggcttc cctttctcac ttttcactct ctggcttact cctatcatga aggaaaatat 360

tggaatcata ttctccctca ccgaaatgct attttttcag cccacaggaa acccaggctg 420

gttggagggg acattccctg ctctggtcgt gttgaagtac aacatggaga cacgtggggc 480

accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcggccagcg tgctgtgcag ggaactacag 540

tgcggcactg tggtttccct cctgggggga gctcactttg gagaaggaag tggacagatc 600

tgggctgaag aattccagtg tgaggggcac gagtcccacc tttcactctg cccagtagca 660

ccccgccctg acgggacatg tagccacagc agggacgtcg gcgtagtctg ctcaagtgag 720

acccagggaa tgtgttcact ttgttcccat gccatgaaga gggtagggtt aggtagtcac 780

agacatcttt ttaaagccct gtctccttcc aggatacaca caaatccgct tggtgaatgg 840

caagacccca tgtgaaggaa gagtggagct caacattctt gggtcctggg ggtccctctg 900

caactctcac tgggacatgg aagatgccca tgttttatgc cagcagctta aatgtggagt 960

tgccctttct atcccgggag gagcaccttt tgggaaagga agtgagcagg tctggaggca 1020

catgtttcac tgcactggga ctgagaagca catgggagat tgttccgtca ctgctctggg 1080

cgcatcactc tgttcttcag ggcaagtggc ctctg 1115

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ggtcgtgttg aagtacaaca 20

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

caccggtcgt gttgaagtac aaca 24

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

aaactgttgt acttcaacac gacc 24

<210> 36

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ggucguguug aaguacaaca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 37

<211> 963

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 37

Met Ala Lys Gly Phe Tyr Ile Ser Lys Ala Leu Gly Ile Leu Gly Ile

1 5 10 15

Leu Leu Gly Val Ala Ala Val Ala Thr Ile Ile Ala Leu Ser Val Val

20 25 30

Tyr Ala Gln Glu Lys Asn Lys Asn Ala Glu His Val Pro Gln Ala Pro

35 40 45

Thr Ser Pro Thr Ile Thr Thr Thr Ala Ala Ile Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Lys Pro Trp Asn Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Thr Leu Leu Pro Asp Ser

65 70 75 80

Tyr Phe Val Thr Leu Arg Pro Tyr Leu Thr Pro Asn Ala Asp Gly Leu

85 90 95

Tyr Ile Phe Lys Gly Lys Ser Ile Val Arg Leu Leu Cys Gln Glu Pro

100 105 110

Thr Asp Val Ile Ile Ile His Ser Lys Lys Leu Asn Tyr Thr Thr Gln

115 120 125

Gly His Met Val Val Leu Arg Gly Val Gly Asp Ser Gln Val Pro Glu

130 135 140

Ile Asp Arg Thr Glu Leu Val Glu Leu Thr Glu Tyr Leu Val Val His

145 150 155 160

Leu Lys Gly Ser Leu Gln Pro Gly His Met Tyr Glu Met Glu Ser Glu

165 170 175

Phe Gln Gly Glu Leu Ala Asp Asp Leu Ala Gly Phe Tyr Arg Ser Glu

180 185 190

Tyr Met Glu Gly Asn Val Lys Lys Val Leu Ala Thr Thr Gln Met Gln

195 200 205

Ser Thr Asp Ala Arg Lys Ser Phe Pro Cys Phe Asp Glu Pro Ala Met

210 215 220

Lys Ala Thr Phe Asn Ile Thr Leu Ile His Pro Asn Asn Leu Thr Ala

225 230 235 240

Leu Ser Asn Met Pro Pro Lys Gly Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asp

245 250 255

Pro Asn Trp Ser Val Thr Glu Phe Glu Thr Thr Pro Val Met Ser Thr

260 265 270

Tyr Leu Leu Ala Tyr Ile Val Ser Glu Phe Gln Ser Val Asn Glu Thr

275 280 285

Ala Gln Asn Gly Val Leu Ile Arg Ile Trp Ala Arg Pro Asn Ala Ile

290 295 300

Ala Glu Gly His Gly Met Tyr Ala Leu Asn Val Thr Gly Pro Ile Leu

305 310 315 320

Asn Phe Phe Ala Asn His Tyr Asn Thr Ser Tyr Pro Leu Pro Lys Ser

325 330 335

Asp Gln Ile Ala Leu Pro Asp Phe Asn Ala Gly Ala Met Glu Asn Trp

340 345 350

Gly Leu Val Thr Tyr Arg Glu Asn Ala Leu Leu Phe Asp Pro Gln Ser

355 360 365

Ser Ser Ile Ser Asn Lys Glu Arg Val Val Thr Val Ile Ala His Glu

370 375 380

Leu Ala His Gln Trp Phe Gly Asn Leu Val Thr Leu Ala Trp Trp Asn

385 390 395 400

Asp Leu Trp Leu Asn Glu Gly Phe Ala Ser Tyr Val Glu Tyr Leu Gly

405 410 415

Ala Asp His Ala Glu Pro Thr Trp Asn Leu Lys Asp Leu Ile Val Pro

420 425 430

Gly Asp Val Tyr Arg Val Met Ala Val Asp Ala Leu Ala Ser Ser His

435 440 445

Pro Leu Thr Thr Pro Ala Glu Glu Val Asn Thr Pro Ala Gln Ile Ser

450 455 460

Glu Met Phe Asp Ser Ile Ser Tyr Ser Lys Gly Ala Ser Val Ile Arg

465 470 475 480

Met Leu Ser Asn Phe Leu Thr Glu Asp Leu Phe Lys Glu Gly Leu Ala

485 490 495

Ser Tyr Leu His Ala Phe Ala Tyr Gln Asn Thr Thr Tyr Leu Asp Leu

500 505 510

Trp Glu His Leu Gln Lys Ala Val Asp Ala Gln Thr Ser Ile Arg Leu

515 520 525

Pro Asp Thr Val Arg Ala Ile Met Asp Arg Trp Thr Leu Gln Met Gly

530 535 540

Phe Pro Val Ile Thr Val Asp Thr Lys Thr Gly Asn Ile Ser Gln Lys

545 550 555 560

His Phe Leu Leu Asp Ser Glu Ser Asn Val Thr Arg Ser Ser Ala Phe

565 570 575

Asp Tyr Leu Trp Ile Val Pro Ile Ser Ser Ile Lys Asn Gly Val Met

580 585 590

Gln Asp His Tyr Trp Leu Arg Asp Val Ser Gln Ala Gln Asn Asp Leu

595 600 605

Phe Lys Thr Ala Ser Asp Asp Trp Val Leu Leu Asn Val Asn Val Thr

610 615 620

Gly Tyr Phe Gln Val Asn Tyr Asp Glu Asp Asn Trp Arg Met Ile Gln

625 630 635 640

His Gln Leu Gln Thr Asn Leu Ser Val Ile Pro Val Ile Asn Arg Ala

645 650 655

Gln Val Ile Tyr Asp Ser Phe Asn Leu Ala Thr Ala His Met Val Pro

660 665 670

Val Thr Leu Ala Leu Asp Asn Thr Leu Phe Leu Asn Gly Glu Lys Glu

675 680 685

Tyr Met Pro Trp Gln Ala Ala Leu Ser Ser Leu Ser Tyr Phe Ser Leu

690 695 700

Met Phe Asp Arg Ser Glu Val Tyr Gly Pro Met Lys Lys Tyr Leu Arg

705 710 715 720

Lys Gln Val Glu Pro Leu Phe Gln His Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn

725 730 735

Trp Thr Glu Arg Pro Glu Asn Leu Met Asp Gln Tyr Ser Glu Ile Asn

740 745 750

Ala Ile Ser Thr Ala Cys Ser Asn Gly Leu Pro Gln Cys Glu Asn Leu

755 760 765

Ala Lys Thr Leu Phe Asp Gln Trp Met Ser Asp Pro Glu Asn Asn Pro

770 775 780

Ile His Pro Asn Leu Arg Ser Thr Ile Tyr Cys Asn Ala Ile Ala Gln

785 790 795 800

Gly Gly Gln Asp Gln Trp Asp Phe Ala Trp Gly Gln Leu Gln Gln Ala

805 810 815

Gln Leu Val Asn Glu Ala Asp Lys Leu Arg Ser Ala Leu Ala Cys Ser

820 825 830

Asn Glu Val Trp Leu Leu Asn Arg Tyr Leu Gly Tyr Thr Leu Asn Pro

835 840 845

Asp Leu Ile Arg Lys Gln Asp Ala Thr Ser Thr Ile Asn Ser Ile Ala

850 855 860

Ser Asn Val Ile Gly Gln Pro Leu Ala Trp Asp Phe Val Gln Ser Asn

865 870 875 880

Trp Lys Lys Leu Phe Gln Asp Tyr Gly Gly Gly Ser Phe Ser Phe Ser

885 890 895

Asn Leu Ile Gln Gly Val Thr Arg Arg Phe Ser Ser Glu Phe Glu Leu

900 905 910

Gln Gln Leu Glu Gln Phe Lys Lys Asn Asn Met Asp Val Gly Phe Gly

915 920 925

Ser Gly Thr Arg Ala Leu Glu Gln Ala Leu Glu Lys Thr Lys Ala Asn

930 935 940

Ile Lys Trp Val Lys Glu Asn Lys Glu Val Val Leu Asn Trp Phe Ile

945 950 955 960

Glu His Ser

<210> 38

<211> 1203

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 38

ctgccacctg cccttcagcc cttggtgggc tcccaggctc ctgcagcctg taaccagacc 60

ctgtttgctc ccagcaggca cccctgagcc gcactccgca cgctgttcct gaatctcccc 120

tccagaaccg gagcagtgtc tctacccagt tcagtgacct tcgtctgtct gagccctggt 180

taatttttgc ccagtctgca ggctgtgggg ctcctcccct tcagggatat aagcctggtc 240

cgaagctgcc ctgtcccctg cccgtcctga gcctccccga gctcccttct caccctcacc 300

atggccaagg gattctacat ttccaaggcc ctgggcatcc tgggcatcct cctcggcgtg 360

gcggccgtgg ccaccatcat cgctctgtct gtggtgtacg cccaggagaa gaacaagaat 420

gccgagcatg tcccccaggc ccccacgtcg cccaccatca ccaccacagc cgccatcacc 480

ttggaccaga gcaagccgtg gaaccggtac cgcctaccca caacgctgtt gcctgattcc 540

tacaacgtga cgctgagacc ctacctcact cccaacgcgg atggcctgta catcttcaag 600

ggcaaaagca tcgtccgctt catctgccag gagcccaccg atgtcatcat catccatagc 660

aagaagctca actacaccac ccaggggcac atggtggtcc tgcggggcgt gggggactcc 720

caggtcccag agatcgacag gactgagctg gtagagctca ctgagtacct ggtggtccac 780

ctcaagggct cgctgcagcc cggccacatg tacgagatgg agagtgaatt ccagggggaa 840

cttgccgacg acctggcagg cttctaccgc agcgagtaca tggagggcaa cgtcaaaaag 900

taagtcaggt gggggcacac cctagatgct gaggcagagc tggatcctgg gggccaagga 960

agggcttgga ttcgggacct tggaaccttc tggagacttt ggctggcccg tcgctccatc 1020

cgcagctctg gtagagaagc tatctagaca atcagccctt tcccggagag cccccctaac 1080

cttagggagt caggggtgag tgatccaagt gcccccttgg gtagaaagga aaacaggctc 1140

tgaggacaga aatttgccca aggtctccca gctaattcag gggtggagcc tgcccggact 1200

ttg 1203

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gaggatgccc aggatgccca 20

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

caccgaggat gcccaggatg ccca 24

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

aaactgggca tcctgggcat cctc 24

<210> 42

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gaggaugccc aggaugccca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims

1.一种用于猪MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，包含Cas9表达载体、针对猪MSTN基因的gRNA表达载体、针对猪SST基因的gRNA表达载体、针对猪INHA基因的gRNA表达载体、针对猪CD163基因的gRNA表达载体以及针对猪pAPN基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体的质粒全序列如SEQ ID NO.2所示；所述的针对猪MSTN基因的gRNA表达载体表达 SEQ ID NO.18 所示的 gRNA，其靶点如 SEQ ID NO. 15 所示，该表达载体由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的针对猪SST基因的gRNA表达载体表达 SEQ ID NO.24 所示的gRNA，其靶点如 SEQ ID NO.21 所示，该表达载体由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的针对猪INHA基因的gRNA表达载体表达 SEQ ID NO.30 所示的 gRNA，其靶点如 SEQ ID NO.27所示，该表达载体由SEQID NO.28和SEQ ID NO.29所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的针对猪CD163基因的gRNA表达载体表达 SEQ ID NO.36 所示的 gRNA，其靶点如 SEQID NO.33 所示，该表达载体由SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；所述的针对猪pAPN基因的gRNA表达载体表达 SEQ IDNO.42 所示的 gRNA，其靶点如 SEQ ID NO.39 所示，该表达载体由SEQ ID NO.40和SEQ IDNO.41所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得; 所述的载体骨架pKG-U6gRNA，其质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统在构建MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因敲除的猪重组细胞中的应用。

3.一种敲除MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN基因的猪重组细胞，其特征在于由权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

4.权利要求3所述的重组细胞在构建MSTN、SST、INHA、CD163及pAPN五基因敲除的克隆猪中的应用。