CN112522309B - 重症免疫缺陷猪源重组细胞及其制备方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了重症免疫缺陷猪源重组细胞及其制备方法。具体来说，本发明涉及IL2RG基因、RAG1基因和RAG2基因这三个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞，以及用于制备该重组细胞的方法，以及用于制备该重组细胞的试剂盒。本发明提供了sgRNA组合，由sgRNAIL2RG‑g7、sgRNARAG1‑g4和sgRNARAG2‑g2组成。sgRNAIL2RG‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：24中第1‑20位核苷酸所示。sgRNARAG1‑g4的靶序列结合区如SEQ ID NO：9中第1‑20位核苷酸所示。sgRNARAG2‑g2的靶序列结合区如SEQ ID NO：13中第1‑20位核苷酸所示。本发明为重症免疫缺陷猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于重症免疫缺陷药物的研发具有重大应用价值。

Description

重症免疫缺陷猪源重组细胞及其制备方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及重症免疫缺陷猪源重组细胞及其制备方法。具体来说，本发明涉及IL2RG基因、RAG1基因和RAG2基因这三个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞，以及用于制备该重组细胞的方法，以及用于制备该重组细胞的试剂盒。
背景技术
重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)是原发性免疫缺陷病中最严重的表型，是指由于遗传、发育或感染等因素导致的T细胞、B细胞和NK细胞同时出现发育、分化、增殖、代谢或功能障碍。1950年，Glanzmann和Riniker首次报道了人类婴儿中的SCID病。在全球，SCID的新生儿发病率约为1/50000，该病发病年龄早，临床表现重，且死亡率高。多数SCID是由于免疫相关基因的异常造成的，而SCID的主要遗传方式包括X连锁隐性遗传和常染色体隐性遗传两种。该病发病具有一定的区域性和血缘性，且由于存在X连锁隐性遗传的特性，该病多见于男性患者。
目前，针对于SCID的治疗手段主要包括骨髓或造血干细胞移植和基因治疗。骨髓或干细胞移植是治疗SCID的最佳方案，但是寻找与患者合适配型的供体相当困难。作为大动物，猪是人类长期以来主要的肉食来源动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面的要求较低，同时猪体型大小和器官功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。
另外，在进行研究生物活性大分子或细胞治疗的效果时，用异源动物进行试验将会产生免疫排斥，从而无法进行有效的动物试验。而用重症联合免疫缺陷模式动物则可避免异种间的免疫排斥问题。
因此，研发出人类SCID猪模型用于进行药物(特别是生物活性分子)筛选、药效检测、疾病病理、基因及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类SCID疾病提供有力的实验手段。
X连锁隐性遗传导致的SCID是最常见的一种类型，其致病突变为编码IL-2Rγ链的IL2RG基因发生突变，从而导致IL-2Rγ链功能发生障碍。而IL-2Rγ链也被称为共有γ链(common gamma chain)，是IL-2、IL-4和IL-7等多种参与调控免疫细胞分化、发育、成熟过程的细胞因子受体与其相应配体结合后，向免疫细胞内部转导信号时所共同使用的信号转导分子。因此，共有γ链的功能障碍会导致免疫细胞的功能或发育异常，从而引发SCID。由IL2RG基因突变引发的SCID占50％-60％，另有10％的SCID发病是由于RAG基因突变所致的。RAG基因突变可影响VDJ区域重排，影响T细胞和B细胞分化，干扰抗原受体形成和免疫球蛋白表达。RAG1作为RAG复合物的催化剂成分，而RAG2虽不是催化剂，但参与目前已知RAG1催化过程。因此RAG1和RAG2均与SCID密切相关。
发明内容
本发明的目的是提供重症免疫缺陷猪源重组细胞及其制备方法。具体来说，本发明涉及IL2RG基因、RAG1基因和RAG2基因这三个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞，以及用于制备该重组细胞的方法，以及用于制备该重组细胞的试剂盒。
本发明提供了一种试剂盒，包括特异sgRNA组合。
本发明还提供了一种试剂盒，包括特异质粒组合。所述试剂盒还包括质粒pKG-GE3。
本发明还保护特异sgRNA组合。
本发明还保护特异质粒组合。
以上任一所述特异sgRNA组合，由sgRNAIL2RG-g7、sgRNARAG1-g4和sgRNARAG2-g2组成。
以上任一所述质粒组合，由质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)、质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)和质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)组成。
本发明还保护以上任一所述sgRNA组合或以上任一所述质粒组合或以上任一所述试剂盒在制备重组细胞中的应用。所述重组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
本发明还保护以上任一所述sgRNA组合或以上任一所述质粒组合或以上任一所述试剂盒在制备免疫缺陷动物模型中的应用。应用时，先制备所述重组细胞，然后将所述重组细胞作为供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺陷动物模型。还可以用免疫缺陷动物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模型的相应细胞，作为免疫缺陷细胞模型。所述动物具体可为猪。所述重组细胞为猪重组细胞。所述免疫缺陷动物模型为免疫缺陷猪模型。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
本发明还保护一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)、质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)、质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪细胞，得到IL2RG基因、RAG1基因和RAG2基因均发生突变的重组细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
所述方法制备得到的重组细胞也属于本发明的保护范围。
以上任一所述重组细胞为IL2RG基因、RAG1基因和RAG2基因均缺陷的细胞。
以上任一所述重组细胞为IL2RG基因、RAG1基因和RAG2基因均发生突变的重组细胞。所述突变可为杂合突变(对应基因型为杂合突变型)或纯合突变(对应的基因型为双等位基因相同突变型或双等位基因不同突变型)。
具体来说，所述重组细胞可为如下任一：表1至表3中编号为2、16、19、26、37、48、55、58、64、66、75、79、80、83、85的单克隆细胞株。
本发明还保护所述重组细胞在制备免疫缺陷动物模型中的应用。制备免疫缺陷动物模型时，将所述重组细胞作为供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺陷动物模型。还可以用免疫缺陷动物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模型的相应细胞，作为免疫缺陷细胞模型。所述免疫缺陷动物模型为免疫缺陷猪模型。
本发明还保护所述sgRNA组合在制备试剂盒中的应用。
本发明还保护所述质粒组合在制备试剂盒中的应用。
本发明还保护所述质粒组合和质粒pKG-GE3在制备试剂盒中的应用。
以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。制备免疫缺陷动物模型时，先制备所述重组细胞，然后将所述重组细胞作为供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺陷动物模型。还可以用免疫缺陷动物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模型的相应细胞，作为免疫缺陷细胞模型。所述动物具体可为猪。所述重组细胞为猪重组细胞。所述免疫缺陷动物模型为免疫缺陷猪模型。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
sgRNAIL2RG-g7靶点：5’-TCCCTTCAGAGAATAGATAG-3’。
sgRNARAG1-g4靶点：5’-AGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’。
sgRNARAG2-g2靶点：5’-GATAACAGTTGGTAATAACA-3’。
所述sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：24中第1-20位核苷酸所示。
所述sgRNARAG1-g4的靶序列结合区如SEQ ID NO：9中第1-20位核苷酸所示。
所述sgRNARAG2-g2的靶序列结合区如SEQ ID NO：13中第1-20位核苷酸所示。
所述sgRNAIL2RG-g7如SEQ ID NO：24所示。
所述sgRNARAG1-g4如SEQ ID NO：9所示。
所述sgRNARAG2-g2如SEQ ID NO：13所示。
所述质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)转录得到sgRNAIL2RG-g7。
所述质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)转录得到sgRNARAG1-g4。
所述质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)转录得到sgRNARAG2-g2。
具体来说，所述质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)借助限制性内切酶BbsI将sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的。
具体来说，所述质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)借助限制性内切酶BbsI将sgRNARAG1-g4的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的。
具体来说。所述质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNARAG2-g2的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的。
质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；
所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；
质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；
质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。
质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。
所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。
所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。
所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。
自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911-6706位核苷酸所示。
CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395-680位核苷酸所示。
EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682-890位核苷酸所示。
WPRE序列元件如SEQ ID NO：2中第6722-7310位核苷酸所示。
3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382-7615位核苷酸所示。
bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647-7871位核苷酸所示。
质粒pKG-GE3具体如SEQ ID NO：2所示。
质粒pKG-U6gRNA中，具有SEQ ID NO：3中第2280-2637位核苷酸所示的DNA分子。
质粒pKG-U6gRNA具体如SEQ ID NO：3所示。
猪IL2RG基因信息：编码interleukin 2receptor subunit gamma；位于X染色体；GeneID为397156，Sus scrofa。猪IL2RG基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：16所示。基因组DNA中，猪IL2RG基因具有9个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：17所示。
猪RAG1基因信息：编码recombination-activating protein 1；位于2号染色体；GeneID为397506，Sus scrofa。猪RAG1基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：4所示。基因组DNA中，猪RAG1基因具有2个外显子，其中第2外显子序列如SEQ ID NO：5所示。
猪RAG2基因信息：编码recombination-activating protein 2；位于2号染色体；GeneID为100151744，Sus scrofa。猪RAG2基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：10所示。基因组DNA中，猪RAG2基因具有2个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：11所示。
以上任一所述免疫缺陷具体可为重症免疫缺陷。
本发明可用于通过基因编辑手段获得重症免疫缺陷猪模型，用于进行药物筛选、药效检测、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，为今后治愈人类重症免疫缺陷打下坚实基础。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。目前未有任何大动物杜氏肌营养不良症疾病模型被成功研发。大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本也很高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、营养代谢、疾病发病机制等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一窝多胎，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本较灵长类低得多；而且猪作为人类长期以来的肉食性动物，用猪作为疾病模型动物在动物保护和伦理等方面的阻力相对较小。
(2)采用本发明改造的cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体显著提高。
本发明为重症免疫缺陷猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于重症免疫缺陷药物的研发具有重大应用价值。
附图说明
图1为质粒pX330的结构示意图。
图2为质粒pKG-GE3的结构示意图。
图3为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。
图4为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。
图5为实施例2的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用IL2RG-GT-F4543/IL2RG-GT-R5180组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图6为实施例2的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
图7为实施例2的步骤四中的测序峰图。
图8为实施例3的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用RAG1-GT-F4699/RAG1-GT-R5306组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图9为实施例3的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
图10为实施例3的步骤四中的测序峰图。
图11为实施例4的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用RAG2-GT-F4181/RAG2-GT-R4927组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
图12为实施例4的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
图13为实施例4的步骤四中的测序峰图。
图14为表1中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
图15为表2中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
图16为表3中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
图17为实施例6的步骤三中MSTN三组的电泳图。
图18为实施例6的步骤三中FNDC5三组的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％Penicillin-Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱。
实施例2至4中的8只猪均为刚出生从江香猪，其中雌性4只(分别命名1、2、3、4)、雄性4只(分别命名为A、B、C、D)。
制备猪原代成纤维细胞的方法：①取猪耳组织0.5g，除毛，然后用75﹪酒精浸泡30-40s，然后用含5％(体积比)Penicillin-Streptomycin(Gibco)的PBS缓冲液洗涤5次，然后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为9cm的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
用于实施例2至6中的猪原代成纤维细胞均获自上述命名为2的猪(雌性，血型AO)。
实施例1、质粒的制备
制备质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，如SEQ ID NO：1所示。质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，简称质粒pX330。
制备质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，如SEQ ID NO：2所示。质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称质粒pKG-GE3。
制备质粒pKG-U6gRNA，如SEQ ID NO：3所示。
质粒pX330、质粒pKG-GE3、质粒pKG-U6gRNA均为环形质粒。
质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。
质粒pKG-GE3的结构示意图见图2。SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。
与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
质粒pKG-U6gRNA的结构示意图见图3。SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，示意图见图4,在细胞中重组质粒转录得到gRNA。
实施例2、IL2RG基因敲除的靶点的筛选
一、IL2RG基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
猪IL2RG基因信息：编码interleukin 2receptor subunit gamma；位于X染色体；GeneID为397156，Sus scrofa。猪IL2RG基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：16所示。基因组DNA中，猪IL2RG基因具有9个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：17所示。
分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物IL2RG-GT-F4543/IL2RG-GT-R5180组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图5。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的IL2RG基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：IL2RG-nF33/IL2RG-nR460。
IL2RG-GT-F4543：5’-ATATAGCACAGGGGAGGGAGGAA-3’；
IL2RG-GT-R5180：5’-AGGGTGCGAAGGGTCAGATTC-3’；
IL2RG-nF33：5’-CCCAGGCTTCCCACTATATTCTC-3’；
IL2RG-nR460：5’-CCATTGGATCCCTCACTTCTTCT-3’。
二、筛选靶点
通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到9个靶点。
9个靶点分别如下：
sgRNAIL2RG-g1靶点：5’-CCTGTAGTTTTAGCGTCTGT-3’；
sgRNAIL2RG-g2靶点：5’-CAACAAATGTTTGGTAGAGG-3’；
sgRNAIL2RG-g3靶点：5’-GATGATAAAGTCCAGGAGTG-3’；
sgRNAIL2RG-g4靶点：5’-CTGGACTTTATCATCATTAG-3’；
sgRNAIL2RG-g5靶点：5’-TTGTCCAGCTCCAGGACCCA-3’；
sgRNAIL2RG-g6靶点：5’-GGCCACTATCTATTCTCTGA-3’；
sgRNAIL2RG-g7靶点：5’-TCCCTTCAGAGAATAGATAG-3’；
sgRNAIL2RG-g8靶点：5’-AACATTTGTTGTCCAGCTCC-3’；
sgRNAIL2RG-g9靶点：5’-TGTCCAGCTCCAGGACCCAC-3’。
三、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成IL2RG-g1S和IL2RG-g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图6A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g1)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g1)表达SEQ ID NO：18所示的sgRNAIL2RG-g1。
SEQ ID NO：18：
CCUGUAGUUUUAGCGUCUGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g2S和IL2RG-g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图6B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g2)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g2)表达SEQ ID NO：19所示的sgRNAIL2RG-g2。
SEQ ID NO：19：
CAACAAAUGUUUGGUAGAGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g3S和IL2RG-g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图6C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g3)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g3)表达SEQ ID NO：20所示的sgRNAIL2RG-g3。
SEQ ID NO：20：
GAUGAUAAAGUCCAGGAGUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g4S和IL2RG-g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图6D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g4)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g4)表达SEQ ID NO：21所示的sgRNAIL2RG-g4。
SEQ ID NO：21：
CUGGACUUUAUCAUCAUUAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g5S和IL2RG-g5A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图6E)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g5)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g5)表达SEQ ID NO：22所示的sgRNAIL2RG-g5。
SEQ ID NO：22：
UUGUCCAGCUCCAGGACCCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g6S和IL2RG-g6A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图6F)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g6)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g6)表达SEQ ID NO：23所示的sgRNAIL2RG-g6。
SEQ ID NO：23：
GGCCACUAUCUAUUCUCUGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g7S和IL2RG-g7A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图6G)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)表达SEQ ID NO：24所示的sgRNAIL2RG-g7。
SEQ ID NO：24：
UCCCUUCAGAGAAUAGAUAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g8S和IL2RG-g8A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图6H)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g8)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g8)表达SEQ ID NO：25所示的sgRNAIL2RG-g8。
SEQ ID NO：25：
AACAUUUGUUGUCCAGCUCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成IL2RG-g9S和IL2RG-g9A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图6I)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g9)。质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g9)表达SEQ ID NO：26所示的sgRNAIL2RG-g9。
SEQ ID NO：26：
UGUCCAGCUCCAGGACCCACguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
sgRNA-IL2RG-1S：5’-caccgCCTGTAGTTTTAGCGTCTGT-3’；
sgRNA-IL2RG-1A：5’-aaacACAGACGCTAAAACTACAGGc-3’。
sgRNA-IL2RG-2S：5’-caccgCAACAAATGTTTGGTAGAGG-3’；
sgRNA-IL2RG-2A：5’-aaacCCTCTACCAAACATTTGTTGc-3’。
sgRNA-IL2RG-3S：5’-caccGATGATAAAGTCCAGGAGTG-3’；
sgRNA-IL2RG-3A：5’-aaacCACTCCTGGACTTTATCATC-3’。
sgRNA-IL2RG-4S：5’-caccgCTGGACTTTATCATCATTAG-3’；
sgRNA-IL2RG-4A：5’-aaacCTAATGATGATAAAGTCCAGc-3’。
sgRNA-IL2RG-5S：5’-caccgTTGTCCAGCTCCAGGACCCA-3’；
sgRNA-IL2RG-5A：5’-aaacTGGGTCCTGGAGCTGGACAAc-3’。
sgRNA-IL2RG-6S：5’-caccgGGCCACTATCTATTCTCTGA-3’；
sgRNA-IL2RG-6A：5’-aaacTCAGAGAATAGATAGTGGCCc-3’。
sgRNA-IL2RG-7S：5’-caccgTCCCTTCAGAGAATAGATAG-3’；
sgRNA-IL2RG-7A：5’-aaacCTATCTATTCTCTGAAGGGAc-3’。
sgRNA-IL2RG-8S：5’-caccgAACATTTGTTGTCCAGCTCC-3’；
sgRNA-IL2RG-8A：5’-aaacGGAGCTGGACAACAAATGTTc-3’。
sgRNA-IL2RG-9S：5’-caccgTGTCCAGCTCCAGGACCCAC-3’；
sgRNA-IL2RG-9A：5’-aaacGTGGGTCCTGGAGCTGGACAc-3’。
sgRNA-IL2RG-1S、sgRNA-IL2RG-1A、sgRNA-IL2RG-2S、sgRNA-IL2RG-2A、sgRNA-IL2RG-3S、sgRNA-IL2RG-3A、sgRNA-IL2RG-4S、sgRNA-IL2RG-4A、sgRNA-IL2RG-5S、sgRNA-IL2RG-5A、sgRNA-IL2RG-6S、sgRNA-IL2RG-6A、sgRNA-IL2RG-7S、sgRNA-IL2RG-7A、sgRNA-IL2RG-8S、sgRNA-IL2RG-8A、sgRNA-IL2RG-9S、sgRNA-IL2RG-9A均为单链DNA分子。
四、不同靶点的编辑效率比较
1、共转染
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g1)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g2)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g3)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g4)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第五组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g5)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g5)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第六组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g6)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g6)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第七组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第八组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g8)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g8)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第九组：将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g9)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g9)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第十组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用IL2RG-nF33和IL2RG-nR460组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图7。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第十组不同靶点的编辑效率依次为1％、0％、3％、5％、0％、46％、65％、18％、34％和0％。结果表明，第七组编辑效率最高，sgRNAIL2RG-g7为最优靶点。
实施例3、RAG1基因敲除的靶点的筛选
一、RAG1基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
猪RAG1基因信息：编码recombination-activating protein 1；位于2号染色体；GeneID为397506，Sus scrofa。猪RAG1基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：4所示。基因组DNA中，猪RAG1基因具有2个外显子，其中第2外显子序列如SEQ ID NO：5所示。
分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物RAG1-GT-F4699/RAG1-GT-R5306组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图8。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的RAG1基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：RAG1-nF126/RAG1-nR525。
RAG1-GT-F4699：5’-CACCTGAAAAGGCTCAAACGGAA-3’；
RAG1-GT-R5306：5’-CGCTCGGTCAATCACAGTTTTGA-3’；
RAG1-nF126：5’-CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA-3’；
RAG1-nR525：5’-TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG-3’。
二、筛选靶点
通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。
4个靶点分别如下：
sgRNARAG1-g1靶点：5’-GGGAATTCTTTCAACACCAC-3’；
sgRNARAG1-g2靶点：5’-AGAGAAGGTATCCAGTCCAC-3’；
sgRNARAG1-g3靶点：5’-AATGAGGTCTGGCCAGGACG-3’；
sgRNARAG1-g4靶点：5’-AGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’。
三、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成RAG1-g1S和RAG1-g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图9A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g1)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g1)表达SEQ ID NO：6所示的sgRNARAG1-g1。
SEQ ID NO：6：
GGGAAUUCUUUCAACACCACguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成RAG1-g2S和RAG1-g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图9B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g2)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g2)表达SEQ ID NO：7所示的sgRNARAG1-g2。
SEQ ID NO：7：
AGAGAAGGUAUCCAGUCCACguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成RAG1-g3S和RAG1-g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图9C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g3)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g3)表达SEQ ID NO：8所示的sgRNARAG1-g3。
SEQ ID NO：8：
AAUGAGGUCUGGCCAGGACGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成RAG1-g4S和RAG1-g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图9D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)表达SEQ ID NO：9所示的sgRNARAG1-g4。
SEQ ID NO：9：
AGUUAUGGCAGAACUCAGUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
sgRNA-RAG1-1S：5’-caccGGGAATTCTTTCAACACCAC-3’；
sgRNA-RAG1-1A：5’-aaacGTGGTGTTGAAAGAATTCCc-3’。
sgRNA-RAG1-2S：5’-caccgAGAGAAGGTATCCAGTCCAC-3’；
sgRNA-RAG1-2A：5’-aaacGTGGACTGGATACCTTCTCTc-3’。
sgRNA-RAG1-3S：5’-caccgAATGAGGTCTGGCCAGGACG-3’；
sgRNA-RAG1-3A：5’-aaacCGTCCTGGCCAGACCTCATTc-3’。
sgRNA-RAG1-4S：5’-caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’；
sgRNA-RAG1-4A：5’-aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc-3’。
sgRNA-RAG1-1S、sgRNA-RAG1-1A、sgRNA-RAG1-2S、sgRNA-RAG1-2A、sgRNA-RAG1-3S、sgRNA-RAG1-3A、sgRNA-RAG1-4S、sgRNA-RAG1-4A均为单链DNA分子。
四、不同靶点的编辑效率比较
1、共转染
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g1)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g2)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g3)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第五组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图10。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第五组的编辑效率依次为51％、56％、52％、77％和0％。结果表明，第四组编辑效率最高，sgRNARAG1-g4为最优靶点。
实施例4、RAG2基因敲除的靶点的筛选
一、RAG2基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
猪RAG2基因信息：编码recombination-activating protein 2；位于2号染色体；
GeneID为100151744，Sus scrofa。猪RAG2基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：10所示。基因组DNA中，猪RAG2基因具有2个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：11所示。
分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物RAG2-GT-F4181/RAG2-GT-R4927组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图11。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的RAG2基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：RAG2-nF138/RAG2-nR600。
RAG2-GT-F4181：5’-CCACGTCTTAAACTTGTCCCAGC-3’；
RAG2-GT-R4927：5’-TGAGCAGAAGGGATGTATGACCG-3’；
RAG2-nnF138：5’-GGCTTTTTATGTGTGAGGGATCT-3’；
RAG2-nnR600：5’-TTGTTCTTGCAAACCACAGACAT-3’。
二、筛选靶点
通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。
4个靶点分别如下：
sgRNARAG2-g1靶点：5’-TCACTACAGATGATAACAGT-3’；
sgRNARAG2-g2靶点：5’-GATAACAGTTGGTAATAACA-3’；
sgRNARAG2-g3靶点：5’-GTGCAGGCTTCAGTTTGAGA-3’；
sgRNARAG2-g4靶点：5’-CAAGTGGCTGGGTAGCGGAG-3’。
三、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成RAG2-g1S和RAG2-g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图12A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g1)。质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g1)表达SEQ ID NO：12所示的sgRNARAG2-g1。
SEQ ID NO：12：
UCACUACAGAUGAUAACAGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成RAG2-g2S和RAG2-g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图12B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)。质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)表达SEQ ID NO：13所示的sgRNARAG2-g2。
SEQ ID NO：13：
GAUAACAGUUGGUAAUAACAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成RAG2-g3S和RAG2-g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图12C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g3)。质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g3)表达SEQ ID NO：14所示的sgRNARAG2-g3。
SEQ ID NO：14：
GUGCAGGCUUCAGUUUGAGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成RAG2-g4S和RAG2-g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图12D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g4)。质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g4)表达SEQ ID NO：15所示的sgRNARAG2-g4。
SEQ ID NO：15：
CAAGUGGCUGGGUAGCGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
sgRNA-RAG2-1S：5’-caccgTCACTACAGATGATAACAGT-3’；
sgRNA-RAG2-1A：5’-aaacACTGTTATCATCTGTAGTGAc-3’。
sgRNA-RAG2-2S：5’-caccGATAACAGTTGGTAATAACA-3’；
sgRNA-RAG2-2A：5’-aaacTGTTATTACCAACTGTTATC-3’。
sgRNA-RAG2-3S：5’-caccGTGCAGGCTTCAGTTTGAGA-3’；
sgRNA-RAG2-3A：5’-aaacTCTCAAACTGAAGCCTGCAC-3’。
sgRNA-RAG2-4S：5’-caccgCAAGTGGCTGGGTAGCGGAG-3’；
sgRNA-RAG2-4A：5’-aaacCTCCGCTACCCAGCCACTTGc-3’。
sgRNA-RAG2-1S、sgRNA-RAG2-1A、sgRNA-RAG2-2S、sgRNA-RAG2-2A、sgRNA-RAG2-3S、sgRNA-RAG2-3A、sgRNA-RAG2-4S、sgRNA-RAG2-4A均为单链DNA分子。
四、不同靶点的编辑效率比较
1、共转染
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g1)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g3)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g4)：1.238μg质粒pKG-GE3。
第五组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG2-nF138和RAG2-nR600组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图13。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第五组不同靶点的编辑效率依次为66％、69％、34％、50％和0％。结果表明，第二组编辑效率最高，sgRNARAG2-g2为最优靶点。
实施例5、制备IL2RG、RAG1和RAG2基因编辑单克隆细胞
1、共转染
将质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)、质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)、质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)、和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.38μg质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)：0.38μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)：0.38μg质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)：1.86μg质粒pKG-GE3。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后用完全培养液洗涤，然后用完全培养液重悬，然后分别挑取各个单克隆转移到96孔板中(每个孔1个细胞，每个孔中装有200μl完全培养液)，培养2周(每2-3天更换新的完全培养液)。
4、完成步骤3后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞(每孔得到的细胞，约2/3接种到装有完全培养液的6孔板中，剩余的1/3收集在1.5mL离心管中)。
5、取步骤4的6孔板，培养直至细胞长至50％丰满度，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
6、取步骤4的离心管，取细胞，提取基因组DNA，进行PCR扩增(分别采用IL2RG-nF33和IL2RG-nR460组成的引物对、RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对、RAG2-nF138和RAG2-nR600组成的引物对)，然后进行电泳。将猪原代成纤维细胞作为野生型对照。
7、完成步骤6后，回收PCR扩增产物并测序。
猪原代成纤维细胞的测序结果只有一种，其基因型为纯合野生型。如果某一单克隆细胞的测序结果有两种，一种与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，另一种与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为杂合型；如果某一单克隆细胞的测序结果为两种，均与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型；如果某一单克隆细胞的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型；如果某一单克隆细胞的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，该单克隆细胞的基因型为纯合野生型。
IL2RG基因的编辑结果见表1。编号为26、58、64、75、83、85的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为16、48、79的单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型。编号为66的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为2、6、19、27、30、37、42、55、80的单克隆细胞均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断发生了基因编辑。得到的IL2RG基因编辑单克隆细胞的比率为19/92。示例性的IL2RG的测序峰图见图14。
表1采用IL2RG-nF33和IL2RG-nR460组成的引物对检测IL2RG基因
/>
/>
RAG1基因的编辑结果见表2。编号为6、12、19、26、27、32、37、58、64、66、81、85的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为2、16、48、75、79、80、83的单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型。编号为47的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为5、22、30、31、41、55、73的单克隆细胞均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断发生了基因编辑。得到的RAG1基因编辑单克隆细胞的比率为27/92。示例性的RAG1的测序峰图见图15。
表2采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对检测RAG1基因
/>
/>
RAG2基因的编辑结果见表3。编号为16、19、26、37、48、64、66、75、79、85的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为2、80、83的单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型。编号为5、73的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为55、58、61的单克隆细胞均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断发生了基因编辑。得到的RAG2基因编辑单克隆细胞的比率为18/92。示例性的RAG2的测序峰图见图16。
表3采用RAG2-nF138和RAG2-nR600组成的引物对检测RAG2基因
/>
/>
通过分析，编号为2、16、19、26、37、48、55、58、64、66、75、79、80、83、85的单克隆细胞为IL2RG、RAG1和RAG2基因同时敲除的单克隆细胞。
实施例6、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
选择位于MSTN基因的两个gRNA靶点：
MSTN-gRNA1的靶点：5’-GCTGATTGTTGCTGGTCCCG-3’；
MSTN-gRNA2的靶点：5’-TTTCCAGGCGAAGTTTACTG-3’。
选择位于FNDC5基因的两个gRNA靶点：
FNDC5-gRNA1的靶点：5’-TGTACTCAGTGTCCTCCTCC-3’；
FNDC5-gRNA2的靶点：5’-GCTCTTCAAGACGCCTCGCG-3’。
用于扩增包含靶点的片段的引物为：
MSTN-F896：5’-TCTCTCAGACAGTGCAGGCATTA-3’；
MSTN-R1351：5’-CGTTTCCGTCGTAGCGTGATAAT-3’。
FNDC5-F209：5’-CAGTTCTCACTTGATGGCCTTGG-3’；
FNDC5-R718：5’-AGGGGTCTGGGGAGGAATGG-3’。
一、制备重组质粒
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成MSTN-1S和MSTN-1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)。
分别合成MSTN-2S和MSTN-2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)。
分别合成FNDC5-1S和FNDC5-1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)。
分别合成FNDC5-2S和FNDC5-2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)。
MSTN-1S：5’-caccGCTGATTGTTGCTGGTCCCG-3’；
MSTN-1A：5’-aaacCGGGACCAGCAACAATCAGC-3’。
MSTN-2S：5’-caccgTTTCCAGGCGAAGTTTACTG-3’；
MSTN-2A：5’-aaacCAGTAAACTTCGCCTGGAAAc-3’。
FNDC5-1S：5’-caccgTGTACTCAGTGTCCTCCTCC-3’；
FNDC5-1A：5’-aaacGGAGGAGGACACTGAGTACAc-3’。
FNDC5-2S：5’-caccGCTCTTCAAGACGCCTCGCG-3’；
FNDC5-2A：5’-aaacCGCGAGGCGTCTTGAAGAGC-3’。
二、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
1、共转染
MSTN-B组：将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)和质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)。
MSTN-330组：将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)、质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)：1.08μg质粒pX330。
MSTN-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)、质粒pKG-U6gRNA(MSTN-2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(MSTN-1)：质粒0.46μg pKG-U6gRNA(MSTN-2)：1.08μg质粒pKG-GE3。
FNDC5-B组：将质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)和质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)。
FNDC5-330组：将质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)、质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)：1.08μg质粒pX330。
FNDC5-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)、质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-1)：0.46μg质粒pKG-U6gRNA(FNDC5-2)：1.08μg质粒pKG-GE3。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用MSTN-F896和MSTN-R1351组成的引物对(MSTN的三组)进行PCR扩增，或者采用FNDC5-F209和FNDC5-R718组成的引物对(FNDC5的三组)进行PCR扩增，然后进行电泳。
MSTN的三组的结果见图17。
FNDC5的三组的结果见图18。
MSTN-330组基因缺失突变效率为27.6％，MSTN-KG组基因缺失突变效率为86.5％。FNDC5-330组基因缺失突变效率为18.6％，FNDC5-KG组基因缺失突变效率为81.7％。结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> 重症免疫缺陷猪源重组细胞及其制备方法和试剂盒
<130> GNCYX202100
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8484
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840
ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020
ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080
gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140
agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200
ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320
ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380
caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440
caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500
gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560
caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620
ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680
gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740
ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800
gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860
cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920
caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980
gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040
gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100
caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160
cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220
cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280
caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340
gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400
cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460
ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520
gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580
ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640
cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700
gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760
catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820
cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880
cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940
gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000
gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060
cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120
cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180
cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240
cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300
gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360
caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420
cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480
ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540
cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600
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gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720
cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780
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tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300
aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 9360
gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 9420
tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600
atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 9660
cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720
ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780
cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900
tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 9960
taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020
caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200
gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260
ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320
acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380
tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476
<210> 3
<211> 3120
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
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agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
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cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280
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tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400
gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460
ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520
gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640
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accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820
atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880
ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940
gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000
cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060
tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120
<210> 4
<211> 1043
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 4
Met Ala Val Ser Leu Pro Pro Thr Leu Gly Leu Ser Ser Ala Pro Asp
1 5 10 15
Glu Ile Gln His Pro His Ile Lys Phe Ser Glu Trp Lys Phe Lys Leu
20 25 30
Phe Arg Val Arg Ser Phe Glu Lys Ala Pro Glu Lys Ala Gln Thr Glu
35 40 45
Lys Gln Asp Ser Ser Glu Gly Lys Pro Ser Leu Glu Gln Ser Pro Ala
50 55 60
Val Leu Asp Lys Pro Gly Gly Gln Lys Ser Ala Leu Pro Gln Pro Ala
65 70 75 80
Phe Lys Pro His Pro Lys Phe Leu Lys Glu Ser His Glu Asp Gly Lys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Ala Ile His Gln Ala Asn Leu Arg Arg Leu Cys Arg
100 105 110
Ile Cys Gly Asn Ser Phe Asn Thr Thr Gly His Lys Arg Arg Tyr Pro
115 120 125
Val His Gly Pro Val Asp Gly Lys Thr Gln Val Leu Leu Arg Lys Lys
130 135 140
Glu Lys Arg Ala Thr Ser Trp Pro Asp Leu Ile Ala Lys Val Phe Arg
145 150 155 160
Ile Asp Val Lys Ala Asp Val Asp Ser Ile His Pro Thr Glu Phe Cys
165 170 175
His Asn Cys Trp Ser Phe Met His Arg Lys Phe Ser Ser Thr Pro Cys
180 185 190
Glu Val Tyr Ser Pro Arg Asn Ala Thr Met Glu Trp His Pro His Thr
195 200 205
Leu Asn Cys Asp Ile Cys His Ile Ala Arg Arg Gly Leu Lys Arg Lys
210 215 220
Ser Gln Gln Pro Asn Met Gln Leu Ser Lys Lys Leu Lys Thr Val Ile
225 230 235 240
Asp Arg Ala Arg Gln Ala Arg Gln Arg Lys Arg Arg Ala Gln Ala Arg
245 250 255
Ile Ser Ser Lys Glu Leu Met Lys Lys Ile Ala Asn Cys Gly Gln Ile
260 265 270
His Leu Ser Pro Lys Leu Leu Ala Val Asp Phe Pro Ala His Phe Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Cys Gln Ile Cys Glu His Ile Leu Ala Asp Pro Val
290 295 300
Glu Thr Ser Cys Lys His Val Phe Cys Arg Ile Cys Ile Leu Arg Cys
305 310 315 320
Leu Lys Val Met Gly Ser Ser Cys Pro Ser Cys His Tyr Pro Cys Phe
325 330 335
Pro Thr Asp Leu Glu Ser Pro Val Lys Ser Phe Leu Ser Ile Leu Asn
340 345 350
Thr Leu Met Val Lys Cys Pro Ala Lys Glu Cys Asn Glu Glu Ile Ser
355 360 365
Leu Glu Lys Tyr Asn His His Ile Ser Ser His Lys Glu Ser Lys Glu
370 375 380
Thr Phe Val His Ile Asn Lys Gly Gly Arg Pro Arg Gln His Leu Leu
385 390 395 400
Ser Leu Thr Arg Arg Ala Gln Lys His Arg Leu Arg Glu Leu Lys Leu
405 410 415
Gln Val Lys Ala Phe Ala Asp Lys Glu Glu Gly Gly Asp Val Lys Ser
420 425 430
Val Cys Leu Thr Leu Phe Leu Leu Val Leu Arg Ala Arg Asn Glu His
435 440 445
Arg Gln Ala Asp Glu Leu Glu Ala Ile Met Arg Gly Gln Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Gln Pro Ala Val Cys Leu Ala Ile Arg Val Asn Thr Phe Leu Ser
465 470 475 480
Cys Ser Gln Tyr His Lys Met Tyr Arg Thr Val Lys Ala Ile Thr Gly
485 490 495
Arg Gln Ile Phe Gln Pro Leu His Ala Leu Arg Asn Ala Glu Lys Val
500 505 510
Leu Leu Pro Gly Tyr His Pro Phe Glu Trp Gln Pro Pro Leu Lys Asn
515 520 525
Val Ser Ser Ser Thr Asp Val Gly Ile Ile Asp Gly Leu Ser Gly Leu
530 535 540
Ser Ser Ser Val Asp Asp Tyr Pro Val Asp Thr Ile Ala Lys Arg Phe
545 550 555 560
Arg Tyr Asp Ser Ala Leu Val Ser Ala Leu Met Asp Met Glu Glu Asp
565 570 575
Ile Leu Glu Gly Met Arg Ala Gln Asp Leu Asp Asp Tyr Leu Asn Gly
580 585 590
Pro Phe Thr Val Val Val Lys Glu Ser Cys Asp Gly Met Gly Asp Val
595 600 605
Ser Glu Lys His Gly Ser Gly Pro Val Val Pro Glu Lys Ala Val Arg
610 615 620
Phe Ser Phe Thr Val Met Lys Ile Thr Ile Ala His Gly Ser Gln Asn
625 630 635 640
Val Lys Val Phe Glu Glu Ala Lys Pro Asn Ser Glu Leu Cys Cys Lys
645 650 655
Pro Leu Cys Leu Met Leu Ala Asp Glu Ser Asp His Glu Thr Leu Thr
660 665 670
Ala Ile Leu Ser Pro Leu Ile Ala Glu Arg Glu Ala Met Lys Ser Ser
675 680 685
Gln Leu Met Leu Glu Met Gly Gly Ile Leu Arg Thr Phe Lys Phe Ile
690 695 700
Phe Arg Gly Thr Gly Tyr Asp Glu Lys Leu Val Arg Glu Val Glu Gly
705 710 715 720
Leu Glu Ala Ser Gly Ser Val Tyr Ile Cys Thr Leu Cys Asp Ala Thr
725 730 735
Arg Leu Glu Ala Ser Gln Asn Leu Val Phe His Ser Ile Thr Arg Ser
740 745 750
His Ala Glu Asn Leu Glu Arg Tyr Glu Val Trp Arg Ser Asn Pro Tyr
755 760 765
His Glu Thr Val Asp Glu Leu Arg Asp Arg Val Lys Gly Val Ser Ala
770 775 780
Lys Pro Phe Ile Glu Thr Val Pro Ser Ile Asp Ala Leu His Cys Asp
785 790 795 800
Ile Gly Asn Ala Ala Glu Phe Tyr Lys Ile Phe Gln Leu Glu Ile Gly
805 810 815
Glu Ala Tyr Lys Asn Pro His Ala Ser Lys Glu Glu Arg Lys Arg Trp
820 825 830
Gln Ala Thr Leu Asp Lys His Leu Arg Lys Lys Met Asn Leu Lys Pro
835 840 845
Ile Met Arg Met Asn Gly Asn Phe Ala Arg Lys Leu Met Thr Lys Glu
850 855 860
Thr Val Glu Ala Val Cys Glu Leu Ile Pro Ser Glu Glu Arg His Glu
865 870 875 880
Ala Leu Arg Glu Leu Met Asp Leu Tyr Leu Lys Met Lys Pro Val Trp
885 890 895
Arg Ser Ser Cys Pro Ala Lys Glu Cys Pro Glu Ser Leu Cys Gln Tyr
900 905 910
Ser Phe Asn Ser Gln Arg Phe Ala Glu Leu Leu Ser Thr Lys Phe Lys
915 920 925
Tyr Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Asn Tyr Phe His Lys Thr Leu Ala
930 935 940
His Val Pro Glu Ile Ile Glu Arg Asp Gly Ser Ile Gly Ala Trp Ala
945 950 955 960
Ser Glu Gly Asn Glu Ser Gly Asn Lys Leu Phe Arg Arg Phe Arg Lys
965 970 975
Met Asn Ala Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Glu Met Glu Asp Val Leu Lys
980 985 990
His His Trp Leu Tyr Thr Ser Lys Tyr Leu Gln Lys Phe Met Asn Ala
995 1000 1005
His Lys Ala Phe Lys Asn Ser Gly Phe Thr Ile Asn Leu Gln Arg
1010 1015 1020
Ser Ser Gly Asp Thr Leu Asp Leu Glu Asn Ser Pro Glu Ser Gln
1025 1030 1035
Asp Leu Met Glu Phe
1040
<210> 5
<211> 3132
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 5
atggctgtct ctttgccacc cactctggga ctcagttccg ccccagatga aatccagcac 60
ccccacatta aattttcaga atggaagttt aagctattca gggtgagatc ctttgaaaag 120
gcacctgaaa aggctcaaac ggaaaagcag gattcctccg aggggaaacc ctcgctggag 180
caatctccag cagtcctgga caagcctggt ggtcagaagt cagccctgcc tcaaccagca 240
ttcaagcccc atccaaagtt tttaaaggaa tcccacgaag atgggaaagc aagagacaaa 300
gccatccacc aagccaacct gagacgtctc tgccgcatct gtgggaattc tttcaacacc 360
actgggcaca agagaaggta tccagtccac gggcctgtgg atggtaaaac ccaagtcctt 420
ttacggaaga aggaaaagag ggccacgtcc tggccagacc tcattgccaa agttttccgg 480
atcgatgtga aggcagatgt tgactcgatc caccccactg agttctgcca taactgctgg 540
agcttcatgc acaggaagtt tagcagcacc ccatgtgagg tttactcccc aaggaatgca 600
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gaccgagcga gacaagcccg tcagcgcaag aggagagctc aggccaggat cagcagcaag 780
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cgctatgact cggctctggt gtccgctctc atggacatgg aagaagacat cctggagggt 1740
atgagagccc aagaccttga cgactacctg aatggcccct tcactgtggt ggtgaaggag 1800
tcttgtgatg ggatgggaga cgtgagtgag aagcacggca gtgggccggt cgtgccggaa 1860
aaggccgttc ggttttcctt cacagtcatg aaaatcacca tcgcacacgg gtcacagaac 1920
gtgaaggtgt ttgaggaagc caagcctaac tctgaactat gctgcaagcc cttgtgcctc 1980
atgctggccg acgaatccga ccatgagacc ctgacggcca tcctgagccc tctcattgcc 2040
gagagggagg ccatgaagag cagccagcta atgctggaga tgggaggcat cctccggact 2100
ttcaagttca tcttcagggg caccggatat gatgagaaac tggtccggga agtggaaggc 2160
cttgaggctt ctggctctgt ctacatctgt actctctgtg atgccacccg cctggaagcc 2220
tctcaaaatc tggtcttcca ctccataacc agaagccacg cggagaattt ggagcgctat 2280
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ggggtctcgg ccaaaccctt cattgagacg gtgccttcca tagatgccct ccactgtgac 2400
attggcaatg cagccgagtt ctacaagatt ttccagctcg agatagggga ggcgtataag 2460
aacccccatg cctccaagga ggaaaggaag agatggcagg cgaccttgga caagcacctc 2520
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atgaccaaag agactgtgga agcagtctgt gagttaattc cctccgagga gaggcatgaa 2640
gctctgaggg aactgatgga cctttacctg aagatgaaac ccgtctggcg atcgtcatgc 2700
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atggaatttt aa 3132
<210> 6
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gggaauucuu ucaacaccac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
agagaaggua uccaguccac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 8
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
aaugaggucu ggccaggacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
aguuauggca gaacucagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 10
<211> 527
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 10
Met Ser Leu Gln Met Ile Thr Val Gly Asn Asn Met Ala Leu Ile Gln
1 5 10 15
Pro Gly Phe Ser Leu Met Asn Phe Asp Gly Gln Ile Phe Phe Phe Gly
20 25 30
Gln Lys Gly Trp Pro Lys Arg Ser Cys Pro Thr Gly Val Phe His Phe
35 40 45
Asp Val Lys His Asn His Leu Lys Leu Lys Pro Ala Leu Phe Ser Lys
50 55 60
Asp Ser Cys Tyr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Pro Ala Thr Cys Thr Phe
65 70 75 80
Lys Ser Ser Leu Glu Ser Glu Lys His Gln Tyr Ile Ile His Gly Gly
85 90 95
Lys Thr Pro Asn Asn Glu Leu Ser Asp Lys Ile Tyr Val Met Ser Val
100 105 110
Val Cys Lys Asn Asn Lys Lys Val Thr Phe Arg Cys Arg Glu Lys Asp
115 120 125
Leu Val Gly Asp Val Pro Glu Gly Arg Tyr Gly His Ser Ile Asp Val
130 135 140
Val Tyr Ser Arg Gly Lys Ser Met Gly Val Leu Phe Gly Gly Arg Ser
145 150 155 160
Tyr Ile Pro Ser Ala Gln Arg Thr Thr Glu Lys Trp Asn Ser Val Ala
165 170 175
Asp Cys Leu Pro His Ile Phe Leu Val Asp Phe Glu Phe Gly Cys Ser
180 185 190
Thr Ser Tyr Ile Leu Pro Glu Leu Gln Asp Gly Leu Ser Phe His Val
195 200 205
Ser Ile Ala Arg Asn Asp Thr Ile Tyr Ile Leu Gly Gly His Ser Leu
210 215 220
Ala Asn Asn Ile Arg Pro Ala Asn Leu Tyr Lys Ile Arg Val Asp Leu
225 230 235 240
Pro Leu Gly Ser Pro Ala Val Thr Cys Thr Val Leu Pro Gly Gly Ile
245 250 255
Ser Val Ser Ser Ala Ile Leu Thr Gln Thr Ser Ser Asp Glu Phe Val
260 265 270
Ile Val Gly Gly Tyr Gln Leu Glu Asn Gln Lys Arg Met Val Cys Asn
275 280 285
Ile Ile Ser Phe Lys Asp Asn Lys Ile Gly Ile His Glu Met Glu Thr
290 295 300
Pro Asp Trp Thr Pro Asp Ile Lys His Ser Lys Ile Trp Phe Gly Ser
305 310 315 320
Asn Met Gly Asn Gly Thr Val Phe Leu Gly Ile Pro Gly Asp Asn Lys
325 330 335
Gln Ala Leu Ser Glu Ala Phe Tyr Phe Tyr Thr Leu Lys Cys Thr Glu
340 345 350
Asp Asp Val Asn Glu Asp Gln Lys Thr Phe Thr Asn Ser Gln Thr Ser
355 360 365
Thr Glu Asp Pro Gly Asp Ser Thr Pro Phe Glu Asp Ser Glu Glu Phe
370 375 380
Cys Phe Ser Ala Glu Ala Asn Ser Phe Asp Gly Asp Asp Glu Phe Asp
385 390 395 400
Thr Tyr Asn Glu Asp Asp Glu Glu Asp Glu Ser Glu Thr Gly Tyr Trp
405 410 415
Ile Thr Cys Cys Pro Thr Cys Asp Met Asp Ile Asn Thr Trp Val Pro
420 425 430
Phe Tyr Ser Thr Glu Leu Asn Lys Pro Ala Met Ile Tyr Cys Ser His
435 440 445
Gly Asp Gly His Trp Val His Ala Gln Cys Met Asp Leu Ala Glu His
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His Val Glu Ile Ala Arg Ala Leu Gln Thr Pro Lys Arg Val Leu Pro
485 490 495
Leu Lys Lys Pro Pro Leu Lys Ser Leu His Lys Lys Gly Ser Gly Lys
500 505 510
Ile Ile Thr Pro Ala Lys Lys Ser Phe Leu Arg Arg Leu Phe Asp
515 520 525
<210> 11
<211> 2584
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 11
tctacgtcag ccattctcac ctcccattcc ctagtttttc gccttggctt ccatctagtc 60
acttcgcact cttggcgtct ttattcagag agactcttaa agacttcttt cctggggcaa 120
taaagacaaa ctctgtagcc acacatccca tagagaatgg attcctggga aatgtagttc 180
tttctgggga caagtggtta gtctttaagg gaaaaggact acagttccca gaaatctaag 240
ggaggccagt ccacgtctta aacttgtccc agctgcatgg attgtattag gcaggaaggt 300
tctgtggcgt tttctttacc cagctgcctg gatttttgct aattcaatcc cactacaagc 360
ttgtggaaca actctctttt tttaacaggc tttttatgtg tgagggatct aaacacagtg 420
attttaatga agagatatag taagttaaaa aatgtttttt aattctttca gataaaaaaa 480
gagctaccca ctgtcagaaa atgtcactac agatgataac agttggtaat aacatggcct 540
taattcagcc aggcttctca ttgatgaatt ttgatgggca aatcttcttc tttggccaaa 600
aaggctggcc caagaggtcc tgccccactg gagtttttca ttttgatgta aagcataacc 660
atctcaaact gaagcctgca cttttctcta aggattcctg ctaccttcct cctctccgct 720
acccagccac ttgcacattc aaaagcagct tagagtctga aaaacatcag tacatcatcc 780
atggagggaa aacaccaaat aatgagcttt cggataagat ttatgtcatg tctgtggttt 840
gcaagaacaa caaaaaagtt acttttcgct gcagagagaa agacttggta ggagatgttc 900
ctgaaggcag atatggtcat tccattgatg tcgtgtatag tcgagggaaa agtatgggtg 960
ttctctttgg aggacggtca tacatccctt ctgctcaaag aaccacagaa aaatggaata 1020
gtgtagctga ctgcctgccc cacattttct tggtagattt tgaatttggt tgctctacat 1080
catacattct tccagaactt caagatgggc tatcttttca tgtctccatt gccagaaatg 1140
ataccattta tattttagga ggacactcac ttgccaataa catccgtcct gccaatctat 1200
ataaaataag ggttgatctc cccctgggta gcccagctgt gacttgcaca gtcctgccag 1260
gaggaatctc tgtctccagt gcaatcctga ctcaaacgag cagtgatgaa tttgttattg 1320
ttggtggcta tcagcttgaa aatcaaaaaa gaatggtctg caacatcatc tctttcaagg 1380
acaacaagat aggaattcat gagatggaaa ctccagattg gaccccagat attaagcaca 1440
gcaagatatg gtttggaagc aacatgggaa atggaaccgt tttccttggc ataccaggag 1500
acaataaaca ggctctttca gaagcattct atttctatac attgaaatgt actgaagacg 1560
atgtgaacga agatcaaaaa acattcacaa atagtcagac atcaacagaa gatccagggg 1620
actccactcc ctttgaagac tcagaagaat tttgtttcag tgcagaagca aatagttttg 1680
atggtgatga tgaatttgac acctataacg aagatgatga ggaagatgag tctgagacgg 1740
gctactggat tacatgctgc cctacttgtg atatggatat caacacttgg gtaccatttt 1800
attcaactga gctcaacaaa cctgccatga tctactgctc tcatggagat gggcattggg 1860
tccatgccca gtgcatggat ctggcagaac acacactcat ccatctgtca gaaggaagca 1920
gcaagtatta ctgcaaggag catgtggaga tagcaagagc actgcaaacc cccaaaagag 1980
ttttaccctt aaaaaagcct ccactgaaat ccctccacaa aaaaggttct gggaaaatta 2040
ttacccctgc caagaaatcc tttcttagaa gattattcga ttagtttcac aaaagctttt 2100
ctgatccaag tgcatcaggt ttttaaacat attttcaaga atcctgacaa tgataaaaat 2160
tatattctta tttttgttat tgaaaatatc tgttttcttt tagttatatg aattaagttc 2220
cagagaaaag tcttataatg caatacaaaa tacagtcatt gtgtttagac ttatatagga 2280
cctataatat tttgaaaatt ctttactcaa aggatcttca gtgagtattt ttgatctgaa 2340
tttctttgtt caaggaatgt tcaacactga gacagtagta ataactaatg tatgcttatg 2400
tccattatat gactttcggt aacaaataat ctatagaata gttgagacaa gtttaaacag 2460
tagagaaact aagagctaaa ggaattaaag gaattctttt gcatgatgta gcaatttggt 2520
tgatgttgct tgatgctgta actccaacat ggccctttgg ttatgcccat gtacagaaaa 2580
agct 2584
<210> 12
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
ucacuacaga ugauaacagu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 13
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
gauaacaguu gguaauaaca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 14
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
gugcaggcuu caguuugaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 15
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
caaguggcug gguagcggag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 16
<211> 368
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 16
Met Leu Lys Pro Pro Leu Pro Val Lys Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Pro Lys Val Leu Thr His Ser Gly
20 25 30
Asn Glu Asp Ile Thr Ala Asp Phe Leu Leu Leu Ser Thr Pro Pro Gly
35 40 45
Thr Leu Asn Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Lys Val Gln Cys Phe Val
50 55 60
Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Leu
65 70 75 80
Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Thr Ser Asn Asp
85 90 95
Asp Lys Val Gln Glu Cys Gly His Tyr Leu Phe Ser Glu Gly Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Trp Phe Gly Lys Glu Glu Ile Arg Leu Tyr Gln Thr Phe
115 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Asp Pro Gln
130 135 140
Thr Leu Lys Leu Gln Asp Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Ala Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu Arg Thr Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Ser Asn
165 170 175
Arg Tyr Leu Asp His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Ser Asp
180 185 190
Arg Asp Arg Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp His Arg Gln Ser Phe
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Val Asp Ala Gln Lys Leu Tyr Thr Phe Arg Val Arg
210 215 220
Ser Arg Tyr Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln Arg Trp Ser Asp Trp
225 230 235 240
Ser His Pro Ile His Trp Gly Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Leu Leu
245 250 255
Phe Ala Leu Glu Ala Val Leu Ile Pro Leu Gly Ser Met Gly Leu Ile
260 265 270
Val Gly Leu Met Cys Val Tyr Cys Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg
275 280 285
Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly
290 295 300
Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu
305 310 315 320
Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys His Val Ser Glu Ile Ser Pro
325 330 335
Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Gly Ser Pro Cys Ser Gln
340 345 350
His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr
355 360 365
<210> 17
<211> 1185
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 17
aaattttaga gtactggggg gagggcaagg ggaagggttc cctgcctagt gctgcttctt 60
cttctgacca tcatgtcttc cctttgcctc ccccacttca ttttctcccc gtcctagatt 120
tcctcctgct ctctacaccc cctgggactc tcaacgtttc cactctaccc ctcccaaagg 180
ttcagtgttt tgtgttcaat gttgagtaca tgaattgcac ttggaacagc agctctgagc 240
tccagcctac caacctaact ctgcactact ggtatgagaa gggaagaggg gatatagcac 300
aggggaggga ggaagaggcg ctgggctaga tgtgagagat tgtgtgagga ccaagaaaga 360
ggttagccag catcccaggc ttcccactat attctcgtgg ggtaagtcat aagtcagttc 420
gtaggagctg aggctggact gtggaatctg tggtattcac atttacctca ctgttattct 480
tccttgaaat ccttctctag gtacaagacc tctaatgatg ataaagtcca ggagtgtggc 540
cactatctat tctctgaagg gatcacttct ggctgttggt ttggaaaaga ggagatccgc 600
ctctaccaaa catttgttgt ccagctccag gacccacggg aacccaggag gcaggaccca 660
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gggggtattg gtgtatgtag agtggtattc ttgcaccata agggtacttg ggcagaaaag 780
aagaagtgag ggatccaatg gggtcgggag gagggatcag gagcactgcc ctcaggatcc 840
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<210> 18
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
ccuguaguuu uagcgucugu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 19
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
caacaaaugu uugguagagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 20
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
gaugauaaag uccaggagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
cuggacuuua ucaucauuag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 22
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
uuguccagcu ccaggaccca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 23
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
ggccacuauc uauucucuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 24
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
ucccuucaga gaauagauag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 25
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<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
aacauuuguu guccagcucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 26
uguccagcuc caggacccac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims (8)

1.一种试剂盒，包括sgRNA组合物或质粒组合物；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型；
所述sgRNA组合物，由sgRNAIL2RG-g7、sgRNARAG1-g4和sgRNARAG2-g2组成；所述sgRNAIL2RG-g7如SEQ ID NO：24所示；所述sgRNARAG1-g4如SEQ ID NO：9所示；所述sgRNARAG2-g2如SEQ ID NO：13所示；
所述质粒组合物，由质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)、质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)和质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)组成；所述质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的，所述sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：24中第1-20位核苷酸所示；所述质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNARAG1-g4的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的，所述sgRNARAG1-g4的靶序列结合区如SEQ ID NO：9中第1-20位核苷酸所示；所述质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNARAG2-g2的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的，所述sgRNARAG2-g2的靶序列结合区如SEQ ID NO：13中第1-20位核苷酸所示；所述pKG-U6gRNA载体如SEQ ID NO：3所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括质粒pKG-GE3；所述质粒pKG-GE3如SEQ ID NO：2所示。
3.sgRNA组合物，由sgRNAIL2RG-g7、sgRNARAG1-g4和sgRNARAG2-g2组成；所述sgRNAIL2RG-g7如SEQID NO：24所示；所述sgRNARAG1-g4如SEQ ID NO：9所示；所述sgRNARAG2-g2如SEQ ID NO：13所示。
4.质粒组合物，由质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)、质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)和质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)组成；所述质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的，所述sgRNAIL2RG-g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：24中第1-20位核苷酸所示；所述质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNARAG1-g4的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的，所述sgRNARAG1-g4的靶序列结合区如SEQ ID NO：9中第1-20位核苷酸所示；所述质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNARAG2-g2的靶序列结合区的编码序列插入pKG-U6gRNA载体得到的，所述sgRNARAG2-g2的靶序列结合区如SEQ ID NO：13中第1-20位核苷酸所示；所述pKG-U6gRNA载体如SEQ ID NO：3所示。
5.权利要求3所述sgRNA组合物或权利要求4所述质粒组合物或权利要求1所述试剂盒或权利要求2所述试剂盒的应用，为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
6.一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将权利要求4中的质粒pKG-U6gRNA(IL2RG-g7)、质粒pKG-U6gRNA(RAG1-g4)、质粒pKG-U6gRNA(RAG2-g2)和权利要求2中所述的质粒pKG-GE3共转染猪细胞，得到IL2RG基因、RAG1基因和RAG2基因均发生突变的重组细胞。
7.权利要求3所述sgRNA组合物或权利要求4所述质粒组合物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
8.权利要求4所述质粒组合物和权利要求2中所述的质粒pKG-GE3在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
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