CN104774860A - 适于转化细胞的构建体、系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
提供了适于转化细胞的构建体、系统及其应用，其中一种适于转化细胞的构建体包含编码CaS9的核酸序列，且不包含筛选标记基因。将该适于转化细胞的构建体与本发明的包含附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中tracrRNA序列与crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框的另一种适于转化细胞的构建体配合使用，即利用这两种构建体共转染细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因的剪切修饰，并获得无标记细胞株，且切割效率高、安全高效、重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及适于转化细胞的构建体、系统及其应用，更具体地，涉及两种配合使用的适于转化细胞的构建体、适于转化细胞的系统、转化细胞的方法以及重组细胞。
背景技术
规律成簇间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）系统是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构，CRISPR含有一个与病毒或质粒同源的短重复序列，通过对外来同源的DNA作用影响病毒或质粒的复制，是原核生物的免疫系统一部分。CRISPR重复间隔阵列可以被转录成一个长的初级转录本，由于该序列包含多个重复片段，可形成多个发夹结构的二级结构，随后被加工成一个个短的CRISPRRNAs，这些RNA序列包含一段保守的重复片段和一段与外源DNA互补的可变间隔序列，也叫引导序列（guide sequence）。在CRISPR位点附近,存在一系列CRISPR相关基因(CRISPR-associated,Cas)，crRNAs可以和Cas蛋白结合，将Cas蛋白引导到靶序列周围，诱导双链切割功能，形成DNA双链断裂。依据核心元件组成和序列的差异，可以将CRISPR/Cas系统分成3类。第I型和第III型CRISPR系统，涉及到多个亚基复合体参与crRNA识别和双链切割。相比而言，第II型CRISPR系统仅包含单一的Cas9蛋白，参与crRNA介导的外源双链切割。
在II型CRISPR系统中，crRNA可以通过碱基对来连接反式活性的RNA（tracr-RNA）来形成复合RNA结构。这种复合RNA结构分子可以指导Cas9蛋白质来在特定位点引入双链DNA的断裂。而Cas9可以结合tracrRNA：crRNA复合物反过来通过指导其来结合至DNA序列上发挥作用。在这个Cas9–crRNA复合物行使功能的过程中，短间区序列邻近基序（protospacer-adjacent motif，PAM)起着识别敌我的作用，在靶序列的周围具有一些短特征序列，如NGG结构，是CAS9行使功能的重要前提。此外，tracrRNA：crRNA复合体可以通过序列融合，形成融合转录本，且可以被Cas9高效识别，这类融合RNA也叫引导RNA（guideRNA，gRNAs）。因此，Cas9-gRNA系统中，包含与靶序列完全互补的20个碱基的gRNA介导特异性识别，而Cas9的2个截然不同的活性位点(RuvC and HNH)行使位点特异性切割功能。
目前，CRISPR-Cas9系统已应用于细菌、酵母、斑马鱼、小鼠以及人类细胞基因组修饰等方面。但是，现有的CRISPR-Cas9系统在细胞基因组修饰方面效率较低，不同实验室结果差异较大；另外，细胞阳性克隆筛选常采用共转抗性表达载体或流式细胞筛选或单细胞稀释接种，这些方法具有各自的缺陷，如共转抗性表达载体筛选获得单克隆细胞纯度低、抗性基因的插入导致生物安全性问题，流式细胞筛选后细胞伤害较大，尤其对于原代细胞，单细胞稀释接种流程繁琐、细胞接种密度低导致细胞生长受抑。这些不同不足的存在影响了CRISPR-Cas9系统的广泛、高效应用。
因而，现阶段的CRISPR-Cas9系统仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种切割效率高、安全高效、重复性好、无标记基因修饰细胞的新型CRISPR-Cas9系统。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种适于转化细胞的构建体。根据本发明的实施例，该适于转化细胞的构建体包含编码CaS9的核酸序列，且不包含筛选标记基因。在本文中有时将该构建体称为“第一构建体”或“Cas9表达载体”。此外，需要说明的是，在本文中“构建体”和“载体”意义相同，可以互换使用。发明人惊奇地发现，将该适于转化细胞的构建体与本发明下述的另一种适于转化细胞的构建体，即包含附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框的适于转化细胞的构建体配合使用，即利用这两种构建体共转染细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因的剪切修饰，并获得无标记细胞株，且切割效率高、安全高效、重复性好。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了另一种适于转化细胞的构建体。根据本发明的实施例，该适于转化细胞的构建体包含：附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框。在本文中有时将该构建体称为“第二构建体”或“gRNA（附着子）表达载体”。将该适于转化细胞的构建体与前述的本发明的另一种适于转化细胞的构建体，即包含编码CaS9的核酸序列，且不包含筛选标记基因的适于转化细胞的构建体配合使用，即利用这两种构建体共转染细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因的剪切修饰，并获得无标记细胞株，且切割效率高、安全高效、重复性好。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种适于转化细胞的系统。根据本发明的实施例，该适于转化细胞的系统包括：第一构建体，所述第一构建体为前面所述的包含编码CaS9的核酸序列，且不包含筛选标记基因的适于转化细胞的构建体；以及第二构建体，所述第二构建体为前面所述的包含附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框的适于转化细胞的构建体。利用该系统转化细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因的剪切修饰，并获得无标记细胞株。并且，切割效率高、安全高效、重复性好。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种转化细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前面所述的适于转化细胞的系统转化细胞。发明人惊奇地发现，利用该方法转化细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因的剪切修饰，并获得无标记细胞株。并且，切割效率高、安全高效、重复性好。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的方法获得的。该重组细胞的特异位点被剪切而发生突变，从而能够作为疾病模型对于人类基因治疗领域意义重大，且能够有效用于家畜动物遗传改良。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例的Cas9构建载体电泳图，其中
图1（a）是Cas9分别合成的3个片段载体酶切鉴定图，
图1（b）是完整Cas9基因片段连接在T载体上的酶切鉴定图，
图1（c）是Cas9表达载体酶切鉴定图；
图2是根据本发明的一个实施例的Cas9表达载体结构示意图；
图3是根据本发明的一个实施例的GHR gRNA表达框GHR-gRNA-T载体的酶切鉴定图；
图4是根据本发明的一个实施例的GHR gRNA附着子终载体结构示意图；
图5是根据本发明的一个实施例的多个基因位点CIRSPR/附着子系统剪切活性鉴定结果，其中
图5（a）是在猪成纤维细胞中剪切活性鉴定结果，
图5（b）、（c）是在猪PK15细胞中剪切活性鉴定结果，
图5（d）是在牛成纤维细胞中剪切活性鉴定结果，
图5（e）是在小鼠hepa1-6细胞中剪切活性鉴定结果；
图6是根据本发明的一个实施例的GHR基因修饰PCR产物连接T载体测序结果；以及
图7是根据本发明的一个实施例的标记检测电泳图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
需要说明的是，本发明针对现有的CRISPR-Cas9系统面临的一些问题，通过人工合成Cas9入核蛋白和gRNA骨架，构建Cas9表达载体（即“第一构建体”）和gRNA附着子表达载体（即“第二构建体”），利用附着子表达载体的特点，构建一套新型的Cas9-gRNA共筛选系统（即本发明的适于转化细胞的系统），从而能够有效实现无标记基因组修饰细胞克隆的快速筛选和阳性克隆快速获得；同时，这一新型的Cas9-gRNA共表达共筛选系统（即本发明的适于转化细胞的系统）的切割效率显著提高。
下面结合附图，详细描述本发明的第一构建体、第二构建体、适于转化细胞的系统及其应用。
适于转化细胞的构建体
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种适于转化细胞的构建体。根据本发明的实施例，该适于转化细胞的构建体即“第一构建体”，其包含编码CaS9的核酸序列，且不包含筛选标记基因。发明人惊奇地发现，将该适于转化细胞的构建体与本发明下述的另一种适于转化细胞的构建体，即包含附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框的适于转化细胞的构建体配合使用，即利用这两种构建体共转染细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因修饰，并获得无标记细胞株。
根据本发明的实施例，所述编码CaS9的核酸序列来源于化脓性链球菌。根据本发明的一些具体示例，为了提高Cas9蛋白的表达效率，以及CaS9载体与gRNA载体的配合性，并使其更适合在哺乳动物细胞中表达，发明人对野生型化脓性链球菌的编码Cas9蛋白的核酸序列进行了优化，并在优化后的编码CaS9的3’端引入2个重复核定位序列，并进一步在Csa9核酸序列的3’端引入2个重复核定位序列，具体地，第一构建体中所包含的编码CaS9的核酸序列具有SEQ ID NO:1所示的序列：
GCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATTGGGCTCGACATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGACCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGTGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATTTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCATGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTGGTAGACAGTACCGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAGTTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAGGAGAACCCGATCAACGCATCTGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTGCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAGGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGCGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAATACTTCACAGTTTACAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACCAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTGATGAAACAGCTCAAGAGACGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGCATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTGAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGTCAGGGGGACAGTCTTCATGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTGAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGTTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCATGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTACAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTGGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAACATCATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCCACAGTGCGTAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCATCCTTCGAGAAAAACCCCATCGACTTTCTGGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTGCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAGTTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACGGCAGCGGTTCCCCCAAGAAAAAA CGCAAGGTGGAAGATCCTAAGAAAAAGCGGAAAGTGTGA(SEQ ID NO：1)，其中下划线标识的序列即为核定位序列。该SEQ ID NO：1所示核酸序列编码的Cas9蛋白即为CRISPR相关蛋白，具有进入细胞核能力，并能够高效识别gRNAs以及在gRNA引导下切割特异性双链DNA。
根据本发明的另一些实施例，该适于转化细胞的构建体即第一构建体可以进一步包括第一启动子，所述第一启动子与所述编码CaS9的核酸序列可操作地连接。根据本发明的一些具体示例，所述第一启动子为CMV启动子。该启动子可在绝大部分哺乳动物细胞中强表达目的基因，从而能够有效提高第一构建体所携带的CaS9基因的表达效率。值得指出的是，所述第一启动子不限于CMV，其他哺乳动物细胞的强启动子也同样适用于本发明。
根据本发明的一个实施例，第一构建体进一步包括复制起点、原核细胞内表达元件等适于目的基因转化表达的元件。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了另一种适于转化细胞的构建体。根据本发明的实施例，该适于转化细胞的构建体即“第二构建体”，其包含：附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框。根据本发明的实施例，将该适于转化细胞的构建体与前述的包含编码CaS9的核酸序列，且不包含筛选标记基因的适于转化细胞的构建体即第一构建体配合使用，即利用这两种构建体共转染细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因修饰，并获得无标记细胞株。
需要说明的是，所述附着子序列，能够在筛选压力下使构建体利用基因组复制系统进行复制，保证该构建体随细胞分裂进行传代，且在撤去筛选压力后，不再进行复制，随细胞传代而丢失。根据本发明的一些实施例，所述附着子序列为编码EBNA1的核酸序列。由此，能够高效实现附着子序列的功能。
此外，本发明的gRNAs表达框，即guide RNAs（gRNA）是一类人工合成的引导性RNA，具有类似于crRNA与tracrRNA形成的二元RNA结构，可以被Cas9蛋白识别，并引导Cas9蛋白进行特定位点双链DNA的断裂切割。
根据本发明的实施例，所述tracrRNA序列具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，具体如下：
GGGAGACCTAGGTCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID NO：2)。该tracrRNA序列与基因特异位点序列即crRNA序列结合形成的二元RNA结构，能够有效被Cas9蛋白识别，进而能够引导Cas9蛋白进行特定位点双链DNA的断裂切割，且切割效率非常高。
根据本发明的实施例，所述crRNA序列不受特别限制，只要能够有效识别剪切位点，即与tracrRNA序列有效结合形成能够被Cas9蛋白识别的二元RNA结构，进而能够引导Cas9蛋白对crRNA序列识别的特定位点进行双链DNA断裂切割即可。根据本发明的一些实施例，所述crRNA序列为选自GHR、CRY2、IL2RG、RAG、MSTN和BRCA1基因的至少之一的特异位点序列。根据本发明一些具体示例，本发明crRNA序列包括多个基因的多个识别位点，具体地包括猪GHR、CRY2、IL2RG、RAG、MSTN及羊和牛的MSTN，小鼠BRCA1的识别位点。根据本发明的实施例，所述crRNA序列为选自SEQ ID NO：3-38和SEQ ID NO：46-47所示的核苷酸序列的至少一组。由此，利用第二构建体能够有效实现对GHR、CRY2、IL2RG、RAG、MSTN和BRCA1基因的特异位点序列的双链DNA断裂切割。
根据本发明的实施例，第二构建体进一步包括第二启动子，所述第二启动子与所述gRNAs表达框可操作地连接。根据本发明的实施例，所述第二启动子为适于表达小片段RNA茎环结构的启动子。根据本发明的实施例，所述第二启动子为选自U6和H1启动子的至少一种，优选U6启动子。
根据本发明的实施例，第二构建体进一步包括筛选标记基因。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同载体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选接受构建体的动物细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因，优选新霉素抗性基因和氨苄青霉素的至少一种。
根据本发明的实施例，第二构建体进一步包括MCS序列。其中所述“MCS序列”即为多克隆位点。根据本发明的实施例，所述MCS序列由SEQ ID NO：44-45所示的核苷酸序列退火形成，其包含AscI、AfeI、AflII、AgeI、PacI、NotI、SwaI等酶切位点。
根据本发明的实施例，第二构建体进一步包括复制起点。
适于转化细胞的系统、转化细胞的方法及重组细胞
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种适于转化细胞的系统。根据本发明的实施例，该适于转化细胞的系统包括：第一构建体，所述第一构建体为前面所述的包含编码CaS9的核酸序列，且不包含筛选标记基因的适于转化细胞的构建体；以及第二构建体，所述第二构建体为前面所述的包含附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框的适于转化细胞的构建体。利用该系统转化细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因修饰，并获得无标记细胞株。并且，切割效率高、安全高效、重复性好。
根据本发明的实施例，所述细胞的来源不受特别限制，也即本发明的适于转化细胞的系统所适用的细胞不受特别限制。根据本发明的实施例，所述细胞来源于哺乳动物。根据本发明的一些具体示例，所述细胞来源于猪、牛、羊或小鼠。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种转化细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前面所述的适于转化细胞的系统转化细胞。发明人惊奇地发现，利用该方法转化细胞，能够有效实现对哺乳动物细胞的多种基因修饰，并获得无标记细胞株。并且，切割效率高、安全高效、重复性好。
根据本发明的实施例，利用所述第一构建体和所述第二构建体共转染所述细胞。根据本发明的一些具体示例，进行所述共转染时，所述第一构建体和所述第二构建体的比例为1：10-10：1。由此，能够有效提高共转染效率及对特异性位点的剪切效率。此外，根据本发明的一些实施例，在共转染后进一步包括对经过转染的细胞进行剪切活性鉴定。具体地，剪切活性鉴定通过以下步骤实现：对经过转染的细胞采用T7内切酶I处理后，电泳检测，并送测序，从而可以有效分析统计对各特异性位点的剪切活性效率。
根据本发明的一些实施例，将有活性的gRNA载体和Cas9载体共转染细胞后，进一步包括筛选鉴定阳性克隆。根据本发明一些具体示例，筛选鉴定阳性克隆包括：载体核转细胞后对经过转染的细胞进行新霉素筛选，并扩繁细胞克隆，提取DNA进行PCR鉴定，包括基因编辑位点和筛选标记检测。
根据本发明的实施例，所述细胞的来源不受特别限制，也即本发明的转化细胞的方法所适用的细胞不受特别限制。根据本发明的实施例，所述细胞来源于哺乳动物。根据本发明的一些具体示例，所述细胞来源于猪、牛、羊或小鼠。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的转化细胞的方法获得的。该重组细胞的特异位点被剪切而发生突变，从而能够作为疾病模型对于人类基因治疗领域意义重大，且能够有效用于家畜动物遗传改良。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
一般方法：
（1）Cas9表达载体构建（第一构建体）；
人工优化Cas9后，送商业公司合成，分成3段合成，确保序列的正确性。然后通过SacI,AflII,NeaI连接起来，并将完整的Cas9构建到pCMV-T载体。
（2）gRNA表达载体构建（第二构建体）；
合成基因编辑的特异序列，并用II型内切酶将其连接到gRNA表达框，然后将表达框通过NotI和AscI连接到附着子载体。
（3）第一构建体和第二构建体共转染细胞，进行剪切活性鉴定。活性鉴定采用T7内切酶I处理后，电泳检测，并送测序。并将本发明设计的多个基因的多个位点的活性效率进行分析统计。
（4）将有活性的gRNA载体和Cas9载体共转染细胞并筛选鉴定克隆。载体核转细胞后进行新霉素筛选，并扩繁细胞克隆，提取DNA进行PCR鉴定，包括基因编辑位点和筛选标记检测。
实施例1Cas9表达载体的构建(第一构建体)
本发明Cas9的骨架载体虽有哺乳动物表达的强启动子和polyA，却无标记基因序列，通过以下步骤改造：从商业载体pcDNA3.1(-)扩增CMV-MCS-BGPA序列，并连接到pMD18-T载体而获得，称为pCMV-T载体。
Cas9序列来自NCBI，序列号为NC_016782.1，人工优化后的序列如SEQ ID NO:1，以SacI和NeaI处分段合成，其中Cas9-1片段大小为1598bp，Cas9-2片段大小为1179bp，Cas9-3片段大小为1434bp，合成片段酶切电泳检测见图1（a）。将Cas9-2和Cas9-3依次连接到Cas9-1合成载体上：AflII和SacI酶切Cas9-2与Cas9-1连接，然后AflII和NeaI酶切Cas9-3连接到Cas9-2后面，构建完整的Cas9基因片段序列，Cas9基因目的片段大小为3.2kb。Cas9-T载体酶切检测结果见图1（b），目的条带大小为4.2kb。测序正确后，AflII和NheI酶切Cas9片段，连接到pCMV-T载体上。AflII和NheI酶切检测结果正确，如图1（c）。完整的Cas9表达载体图谱，如图2所示。其中，CMV-MCS-BGPA的扩增引物如下：
CMV-L：GTTGACATTGATTATTGACTAG(SEQ ID NO：39)，
BGPA-R：TTCTTTCCGCCTCAG(SEQ ID NO：40)。
实施例2gRNA表达载体构建（第二构建体）
gRNA骨架载体分两步改造：首先，扩增新霉素抗性基因Neo片段，并引入KpnI和HindIII酶切位点，构建到商业载体pCEP4载体，完成pEBNA-Neo载体构建。进一步在pEBNA-Neo引入MCS，以连接gRNA：合成MCS，包含AscI、AfeI、AflII、AgeI、PacI、NotI、SwaI等酶切位点，退火形成双链，连接到BstB1和BsrGI酶切pEBNA-Neo回收的8k片段上，即完成gRNA骨架载体pEBNA-mcs-Neo的构建。
合成U6-gRNA序列（不包括特异性序列），并在启动子和gRNA中间引入两个反向BsaI酶切位点，在U6-gRNA两端引入AscI和NotI酶切位点。
以GHR其中一个gRNA构建为例，BsaI酶切U6-gRNA，将合成的识别GHR1特异位点序列连接到U6-gRNA，构建完整的GHR1gRNA表达框。AscI和NotI酶切GHR1gRNA表达框，酶切结果如图3，回收403bp片段的目的条带连接到pEBNA-mcs-Neo载体，并测序验证，完成GHR1gRNA表达载体的构建，载体图谱如图4所示。其中，
Neo片段扩增引物为：
Neo-F:TAGCTAGCATGATTGAACAAGATGGA(SEQ ID NO：41)，
Neo-R:ATCTCGAGTCAGAAGAACTCGTCAAGA(SEQ ID NO：42)。
U6-gRNA合成序列片段：
GGTACCGCGGCCGCTCGCGAAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGAGACCTAGGTCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTGTACATGTACAGGCGCGCCCTCGAG(SEQ ID NO：43)。
MCS合成序列为：
mcs-1:TTGGCGCGCCAGCGCTCTTAAGCTACTACCGGTATAGCGGCCGCAGATTAATTAAGGCG(SEQ ID NO：44)，
mcs-2:CCTTAATTAATCTGCGGCCGCTATACCGGTAGTAGCTTAAGAGCGCTGGCGCGCCAAGTAC(SEQ ID NO：45)。
GHR1特异位点序列合成序列为：
GHR-CRL1：5`-ACCGACTCTGAGATGCTCTGACAG-3`(SEQ ID NO：46)，
GHR-CRR1：5`-AAAACTGTCAGAGCATCTCAGAGT-3`(SEQ ID NO：47)。
根据以上gRNA构建方法，发明人还依次构建了CRY2、IL2RG、RAG、MSTN、BRCA1基因的gRNA表达载体，其中合成各基因的特异位点序列见下表：
| 基因特异位点 | 序列（5`-3`，SEQ ID NO：） |
| CRY2-CRL1 | ACCGTGGCGAGAGTTCTTCTACAG(3) |
| CRY2-CRR1 | AAAACTGTAGAAGAACTCTCGCCA(4) |
| CRY2-CRL2 | ACCGTGGCCTGCTTCCTCACGCGG(5) |
| CRY2-CRR2 | AAAACCGCGTGAGGAAGCAGGCCA(6) |
| CRY2-CRL3 | ACCGCGGATTTCAGCGTGAATGCG(7) |
| CRY2-CRR3 | AAAACGCATTCACGCTGAAATCCG(8) |
| IL2RG-CRL1 | ACCGGGGGTGGGACTGAACCCGAG(9) |
| IL2RG-CRR1 | AAAACTCGGGTTCAGTCCCACCCC(10) |
| IL2RG-CRL2 | ACCGATGATAAAGTCCAGGAGTGG(11) |
| IL2RG-CRR2 | AAAACCACTCCTGGACTTTATCAT(12) |
| IL2RG-CRL3 | ACCGGCCACTATCTATTCTCTGAG(13) |
| IL2RG-CRR3 | AAAACTCAGAGAATAGATAGTGGC(14) |
| RAG1-CRL1 | ACCGAAAAGCAGGATTCCTCCGAG(15) |
| RAG1-CRR1 | AAAACTCGGAGGAATCCTGCTTTT(16) |
| RAG1-CRL2 | ACCGGAATTCTTTCAACACCACTG(17) |
| RAG1-CRR2 | AAAACAGTGGTGTTGAAAGAATTC(18) |
| RAG1-CRL3 | ACCGTAAAACCCAAGTCCTTTTAG(19) |
| RAG1-CRR3 | AAAACTAAAAGGACTTGGGTTTTA(20) |
| BRCA1-CRL1 | ACCGATTATTCTGAAGACCATTCG(21) |
| BRCA1-CRR1 | AAAACGAATGGTCTTCAGAATAAT(22) |
| BRCA1-CRL2 | ACCGGTCAGGGAAATAGGAGGTAG(23) |
| BRCA1-CRR2 | AAAACTACCTCCTATTTCCCTGAC(24) |
| BRCA1-CRL3 | ACCGGAGGTATGGTTTATGAGTAG(25) |
| BRCA1-CRR3 | AAAACTACTCATAAACCATACCTC(26) |
| BRCA1-CRL4 | ACCGTTTTAGTTCTTCTACCTAGG(27) |
| BRCA1-CRR4 | AAAACCTAGGTAGAAGAACTAAAA(28) |
| BRCA1-CRL5 | ACCGTACTTTGGTTTACTTTTAAG(29) |
| BRCA1-CRR5 | AAAACTTAAAAGTAAACCAAAGTA(30) |
| BRCA1-CRL6 | ACCGTTCTCATATCCAAAAATACG(31) |
| BRCA1-CRR6 | AAAACGTATTTTTGGATATGAGAA(32) |
| MSTN-CRL1 | ACCGCTTCAAAATCCACAGTTAGAG(33) |
| MSTN-CRR1 | AAAACTCTAACTGTGGATTTTGAAG(34) |
| MSTN-CRL2 | ACCGGATTTTGAAGCTTTTGGATGG(35) |
| MSTN-CRR2 | AAAACCATCCAAAAGCTTCAAAATC(36) |
| MSTN-CRL3 | ACCGGTGCACAAGATGAGTGTGAGG(37) |
| MSTN-CRR3 | AAAACCTCACACTCATCTTGTGCAC(38) |
实施例3靶位点基因编辑效果的验证与效率计算
采用脂质体转染方法将实施例1构建好的Cas9表达载体质粒和实施例2构建好的各gRNA表达载体质粒进行相应物种细胞（即各基因特异位点对应的物种细胞，如GHR1特异位点对应猪细胞）转染，转染比例为摩尔比2:1。转染72小时后，提取细胞DNA，进行PCR扩增，扩增片段包含被修饰的基因位点。将PCR产物进行变性杂交，程序为:95℃，5min；95–85℃ at-2℃/s；85–25℃ at-0.1℃/s；4℃下保存。T7内切酶I处理变性产物：37℃，30min。电泳检测靶位点基因编辑效果。并对有剪切效果的位点进行了效率计算和统计，计算方法如下：
使用Quantity One对T7验证的电泳图进行分析，可分别得到三条带的密度灰度值，根据每条条带的大小，对各灰度值做归一化处理，设未发生剪切的条带灰度值为a，剪切后的条带灰度值为b和c，则，%modification=100*（1-（1-（b+c）/(2a+b+c)）^0.5）。
本实施采用以上处理方法进行CRY2、IL2RG、RAG、MSTN、BRCA1等基因编辑效果的验证。检测结果见图5，其中NHEJ%代表剪切修复效率，图5（a）是在猪成纤维细胞中剪切活性鉴定结果，图5（b）、（c）是在猪PK15细胞中剪切活性鉴定结果，图5（d）是在牛成纤维细胞中剪切活性鉴定结果，图5（e）是在小鼠hepa1-6细胞中剪切活性鉴定结果。图5所示的结果表明，本发明设计的每个基因至少有一个位点是有剪切活性，多数基因有2个以上位点具有剪切活性。其中GHR、CRY2、IL2RG和RAG设计的位点全部都有剪切活性，而且剪切活性基本上都大于10%，甚至有些位点高达47%，这说明了本发明的基因组修饰系统具有非常高的效率。从基因物种上比较，无论是小型哺乳动物（小鼠），还是大型哺乳动物（猪，牛，羊等），本系统均具有较高的基因组修饰能力。
取GHR gRNA修饰细胞进行PCR产物连接T载体测序结果表明，GHR1和GHR2位点基因序列均发生了变异，如图6，进一步说明，本系统是快速高效获得各种动物基因组修饰细胞的有效手段。
其中，
各编辑位点检测引物如下：
GHR1位点检测引物：
GHR-F:AGGTATTGCCATGCAACCCA(SEQ ID NO：48)，
GHR-R:TCATCCAGTTTCCAAAGCCCA(SEQ ID NO：49)。
CRY2-1，CRY2-2，CRY2-3位点检测引物：
CRY2L1:GGAGCCGCCAAGTTCATAGC(SEQ ID NO：50)，
CRY2R1:CACACACCGGACAACCCATAAG(SEQ ID NO：51)。
IL2RG1位点检测引物：
IL2PL:GGAGTAAGCGCCATGTTGAAG(SEQ ID NO：52)，
IL2PR:GAGCAGGAGGAAATCTAGGACG(SEQ ID NO：53)。
IL2RG2，IL2RG3位点检测引物：
IL2PL2:CCAGCCTACCAACCTAACTCTG(SEQ ID NO：54)，
IL2PR2:CAGGGTGCGAAGGGTCAGAT(SEQ ID NO：55)。
RAG1，RAG2，RAG3位点检测引物：
RAGPL:ACTCAGTTCCGCCCCAGATG(SEQ ID NO：56)，
RAGPR:GGGAAACAGGGATAGTGGCAAG(SEQ ID NO：57)。
MSTN1，MSTN2，MSTN3位点检测引物：
MSTN-F:TACTCAAACTGGAGGAAAC(SEQ ID NO：58)，
MSTN-R:TATACTGTCGCTTGTGCTT(SEQ ID NO：59)。
BRCA1-1，BRCA1-2位点检测引物：
BRCA1-F1：GCCCTACCTAGAGACACGAACA(SEQ ID NO：60)，
BRCA1-R1:GGGGAGTAAAAACCAATCCACT(SEQ ID NO：61)。
BRCA1-4，BRCA1-5，BRCA1-6位点检测引物：
BRCA1-F2：CCCTGCTTCCAACACTTACTGA(SEQ ID NO：62)，
BRCA1-R2：CGTGCCTGCTTCTTACCTGAGT(SEQ ID NO：63)。
实例4抗性标记丢失检测
本实施例以GHR1为例，按照实施例3的共转染方法，将Cas9表达载体质粒和GHR1gRNA表达载体共转染PK15细胞，其中转染比例为2:1，然后对经过转染的细胞进行抗性标记丢失检测（该检测方法适用于其他所有的基因），具体如下：
将转染后的细胞分盘到10cm，利用800ug/ml的G418进行细胞筛选，筛选1周后，出现阳性克隆，将阳性克隆挑取到48孔板继续扩大培养，并撤去G418。扩繁到24孔培养皿后，每传代一次提取一次DNA，进行基因修饰鉴定和标记鉴定。鉴定的标记包括：EBNA1，Neo，AMP和F1ori这4个元件。
鉴定结果如图7。如图7所示，其中各元件的阳性对照是以质粒为模板进行目的片段扩增，作为标识各元件扩增条带大小。图7所示的结果表明：在GHR编辑鉴定检测为阳性的20个克隆，其中19个克隆的EBNA1元件已经丢失，18个克隆的Neo基因已经丢失，20个克隆的AMP和F1ori元件则全部丢失，由此，表明本发明的转基因系统快速、高效获得无标记基因编辑细胞系。
其中，鉴定引物如下：
F1ori-F1:GCTCCTTTCGCTTTCTTCC(SEQ ID NO：64)，
F1ori-R1:AGGGTTGAGTGTTGTTCCAGT(SEQ ID NO：65)，
Amp-F1:GCAACTTTATCCGCCTCCAT(SEQ ID NO：66)，
Amp-R1:ATTTCCGTGTCGCCCTTATT(SEQ ID NO：67)，
EBNA-F1:GGCAAATCTACTCCATCGTC(SEQ ID NO：68)，
EBNA-R1:AAAGCATCGTGGTCAAGG(SEQ ID NO：69)，
Neo-F1:AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG(SEQ ID NO：70)，
Neo-R1:AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG(SEQ ID NO：71)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种适于转化细胞的构建体，其特征在于，包含编码CaS9的核酸序列，且不包含筛选标记基因。
2.根据权利要求1所述的一种适于转化细胞的构建体，其特征在于，所述编码CaS9的核酸序列来源于化脓性链球菌，
任选地，所述编码CaS9的核酸序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种适于转化细胞的构建体，其特征在于，进一步包括第一启动子，所述第一启动子与所述编码CaS9的核酸序列可操作地连接，
任选地，所述第一启动子为CMV启动子。
4.一种适于转化细胞的构建体，其特征在于，包含：附着子序列、tracrRNA序列和crRNA序列，其中所述tracrRNA序列与所述crRNA序列可操作地连接构成gRNAs表达框。
5.根据权利要求4所述的一种适于转化细胞的构建体，其特征在于，所述附着子序列为编码EBNA1的核酸序列，
任选地，所述tracrRNA序列具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，
任选地，所述crRNA序列为选自GHR、CRY2、IL2RG、RAG、MSTN和BRCA1基因的至少之一的特异位点序列，
任选地，所述crRNA序列为选自SEQ ID NO：3-38和SEQ ID NO：46-47所示的核苷酸序列的至少一组。
6.根据权利要求4所述的一种适于转化细胞的构建体，其特征在于，进一步包括第二启动子，所述第二启动子与所述gRNAs表达框可操作地连接，
任选地，所述第二启动子为适于表达小片段RNA茎环结构的启动子，
任选地，所述第二启动子为选自U6和H1启动子的至少一种，优选U6启动子，
任选地，进一步包括筛选标记基因，
任选地，所述筛选标记基因为药物抗性基因，优选新霉素抗性基因和氨苄青霉素的至少一种，
任选地，进一步包括MCS序列，
任选地，所述MCS序列由SEQ ID NO：44-45所示的核苷酸序列退火形成，
任选地，进一步包括复制起点。
7.一种适于转化细胞的系统，其特征在于，包括：
第一构建体，所述第一构建体为权利要求1-3任一项所述的适于转化细胞的构建体；以及
第二构建体，所述第二构建体为权利要求4-6任一项所述的适于转化细胞的构建体，
任选地，所述细胞来源于哺乳动物，优选猪、牛、羊或小鼠。
8.一种转化细胞的方法，其特征在于，包括：
利用权利要求7所述的适于转化细胞的系统转化细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用所述第一构建体和所述第二构建体共转染所述细胞，
任选地，进行所述共转染时，所述第一构建体和所述第二构建体的比例为1：10-10：1，
任选地，所述细胞来源于哺乳动物，优选所述细胞来源于猪、牛、羊或小鼠。
10.一种重组细胞，其是通过权利要求8或9所述的方法获得的。
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Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| HERITABLE GENE-TARGETING WITH GRNA/CAS9 IN RATS: "Xinli Hu et al.", 《CELL RESEARCH》 * |
| LE CONG ET AL.: "Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems", 《SCIENCE》 * |
| LEI S. QI ET AL.: "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression", 《CELL》 * |
| NANNAN CHANG ET AL.: "Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos", 《CELL RESEARCH》 * |
| PRASHANT MALI ET AL.: "RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9", 《SCIENCE》 * |
| SHU KONDO AND RYU UEDA: "Highly Improved Gene Targeting by Germline-Specific Cas9 Expression in Drosophila", 《GENETICS》 * |
| WATARU FUJII ET AL.: "Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112522309A (zh) * | 2020-09-04 | 2021-03-19 | 南京启真基因工程有限公司 | 重症免疫缺陷猪源重组细胞及其制备方法和试剂盒 |
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