JP7454881B2 - Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列改変技術 - Google Patents
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Description
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）タイプＩ－Ｄシステムを利用した、標的ヌクレオチド配列を標的化する方法、標的ヌクレオチド配列を特異的に改変する方法、標的遺伝子の発現を抑制する方法、および該方法に用いられるＣａｓ（CRISPR-associated（CRISPR関連））タンパク質およびｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）を含む複合体ならびにキット等に関する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ウイルス、プラスミドおよびその他の外来遺伝子エレメントから細菌および古細菌を保護する、細菌および古細菌に見られる獲得免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、該システムを構成しているＣａｓタンパク質および分子メカニズムの違いによって、２つのクラス、６つの異なるタイプ（Ｉ～ＶＩ）、および少なくとも３４種類のサブタイプに分類される。
タイプＩおよびＩＩシステムのメカニズムでは、ｃｒＲＮＡとＣａｓエフェクタータンパク質との複合体が、外来ＤＮＡ中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短い（典型的には３～５塩基長の）配列エレメントを認識する。タイプＩまたはＩＩ ｃｒＲＮＡとＣａｓエフェクタータンパク質との複合体は、ＰＡＭ認識後、局所的にＤＮＡ対合を崩壊してＲ－ループ構造を形成し、ｃｒＲＮＡガイドエレメントが相補的な標的鎖と塩基対を形成して非標的ＤＮＡ鎖と置き換わる。該ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ複合体による二本鎖ＤＮＡ標的の結合および巻き戻しが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ヌクレアーゼなどのタイプ特異的ＣａｓエフェクターヌクレアーゼによるＤＮＡ切断および分解に必要とされる。
ＣＲＩＳＰＲタイプＩには、種々のサブタイプが存在する。クラス１システムには、Ｃａｓｃａｄｅ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ）と呼ばれる、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７およびＣａｓ８などの標的認識モジュールと、Ｃａｓ３などのＤＮＡ切断モジュールが存在する（非特許文献１、非特許文献２）。ゲノム編集技術において、クラス１ ＣＲＩＳＰＲシステムは、クラス２よりも一般的ではないが、ゲノム編集ツールとして、例えば長い領域のゲノム欠失および長いｇＲＮＡ配列を包含する多様な変異プロフィールなど、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１と比べていくつかの利点を有する可能性が示唆された（非特許文献１、特許文献１）。今までに研究されたクラス１ ＣＲＩＳＰＲ ｔｙｐｅ Ｉ－Ｅシステムでは、２－３００ｂから１００ｋｂの塩基欠失が主にＰＡＭ配列の５’上流側に生じることが報告された（非特許文献３）。
今までに研究されたクラス１ ＣＲＩＳＰＲ ｔｙｐｅ Ｉ－Ｅシステムは、６つのＣａｓタンパク質（Ｃａｓ３ｅ、Ｃａｓ５ｅ、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ７ｅ、Ｃａｓ８ｅおよびＣａｓ１１ｅ）と標的化を行うｃｒＲＮＡから構成される。ここでＣａｓ８ｅおよびＣａｓ１１ｅはそれぞれラージサブユニット（large subunit）およびスモールサブユニット（small subunit）と呼ばれ、Ｃａｓタンパク質複合体と標的ＤＮＡとの結合を安定に保持するサポートタンパク質の機能を持っていると考えられている（非特許文献１）。
一方、発明者らは以前に、ＣＲＩＳＰＲクラス１タイプＩのサブタイプ：ＣＲＩＳＰＲ ｔｙｐｅ Ｉ－Ｄ（以下、「ＴｉＤ」という）システムをコードするＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座を同定し、該システムがＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの５つのＣａｓタンパク質および標的化を行うｃｒＲＮＡによってゲノム編集が実現できることを見出した（特許文献１、特許文献２）。ここで、ＴｉＤ遺伝子座には、ＣＲＩＳＰＲ ｔｙｐｅ Ｉ－ＥシステムのスモールサブユニットであるＣａｓ１１ｅに相当する遺伝子は見出されなかった。
近年、ＭｃＢｒｉｄｅらは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３株のＴｉＤ遺伝子座の解析を行い、Ｃａｓ１０ｄ遺伝子座の遺伝子内部にリボソーム結合部位（ＲＢＳ）および翻訳開始コドンが存在し、一つのストップコドンを共通にして、Ｃａｓ１０ｄ遺伝子座から２つのタンパク質、Ｃａｓ１０ｄおよびＣａｓ１１ｄが翻訳されていること示した（非特許文献４）。しかしながら、現在に至るまで、Ｃａｓ１１ｄが標的配列改変技術に果たす機能は見出されていない。
Ｍａｋａｒｏｖａ Ｋ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３， ７２２－７３６（２０１５）図
Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ，１６８，９４６-９４６（２０１７）
Ｄｏｌａｎ， Ａ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７４， ９３６－９５０ （２０１９）
ＭｃＢｒｉｄｅ， Ｔ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ｂｉｏＲｘｉｖ， ｄｏｉ： ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０４．１８．０４５６８２（２０２０）
本発明は、ＴｉＤによる標的配列標的化および改変効率を向上させることを目的とした。
発明者らは、鋭意研究の結果、驚くべきことに、これまで報告されていたＴｉＤシステムを構成する５種のＣａｓタンパク質の発現に加え、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端領域を含む部分アミノ酸配列を含むポリペプチドを別途発現させることによって、標的ヌクレオチド配列を高効率で改変できることを見出した。かくして本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の態様を提供する。
［１］標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法。
［２］標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、細胞中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法。
［３］標的遺伝子の転写を制御する方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列である、上記［１］または［２］記載の方法。
［４］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［１］～［３］のいずれか１項記載の方法。
［５］前記細胞が真核細胞である、上記［１］～［４］のいずれか１項記載の方法。
［６］改変が塩基の欠失、挿入、又は置換である、上記［２］～［５］のいずれか１項記載の方法。
［７］（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ
を含む複合体。
［８］Ｃａｓ３ｄをさらに含む、上記［７］記載の複合体。
［９］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［７］または［８］記載の複合体。
［１０］（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡまたは該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含むベクター。
［１１］Ｃａｓ３ｄをコードする核酸をさらに含む、上記［１０］記載のベクター。
［１２］前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の核酸、または前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の核酸およびＣａｓ３ｄをコードする核酸が１つまたは２以上のベクターに含まれる、上記［１０］または［１１］記載の発現ベクター。
［１３］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［１１］または［１２］記載のベクター。
［１４］上記［７］～［９］のいずれか１項記載の複合体をコードするＤＮＡ分子。
［１５］標的ヌクレオチド配列を標的化するためのキットであって、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含むキット。
［１６］標的ヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
をキット。
［１７］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［１５］または［１６］記載のキット。
［１８］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の標的化において標的化効率を改善する方法であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を用いることを含む方法。
［１９］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の改変において改変効率を改善する方法であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を用いることを含む方法。
［２０］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の標的化において標的化効率を改善するための組成物であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物。
［２１］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の改変において改変効率を改善するための組成物であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物。
［２２］細胞中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された細胞の製造方法。
［２３］上記［２２］に記載の方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された植物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された植物の製造方法。
［２４］上記［２２］に記載の方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物の製造方法。
［２５］標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を接触させることを含む方法。
［２６］標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を接触させことを含む方法。
［１］標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法。
［２］標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、細胞中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法。
［３］標的遺伝子の転写を制御する方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列である、上記［１］または［２］記載の方法。
［４］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［１］～［３］のいずれか１項記載の方法。
［５］前記細胞が真核細胞である、上記［１］～［４］のいずれか１項記載の方法。
［６］改変が塩基の欠失、挿入、又は置換である、上記［２］～［５］のいずれか１項記載の方法。
［７］（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ
を含む複合体。
［８］Ｃａｓ３ｄをさらに含む、上記［７］記載の複合体。
［９］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［７］または［８］記載の複合体。
［１０］（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡまたは該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含むベクター。
［１１］Ｃａｓ３ｄをコードする核酸をさらに含む、上記［１０］記載のベクター。
［１２］前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の核酸、または前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の核酸およびＣａｓ３ｄをコードする核酸が１つまたは２以上のベクターに含まれる、上記［１０］または［１１］記載の発現ベクター。
［１３］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［１１］または［１２］記載のベクター。
［１４］上記［７］～［９］のいずれか１項記載の複合体をコードするＤＮＡ分子。
［１５］標的ヌクレオチド配列を標的化するためのキットであって、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含むキット。
［１６］標的ヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
をキット。
［１７］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［１５］または［１６］記載のキット。
［１８］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の標的化において標的化効率を改善する方法であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を用いることを含む方法。
［１９］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の改変において改変効率を改善する方法であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を用いることを含む方法。
［２０］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の標的化において標的化効率を改善するための組成物であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物。
［２１］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の改変において改変効率を改善するための組成物であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物。
［２２］細胞中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された細胞の製造方法。
［２３］上記［２２］に記載の方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された植物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された植物の製造方法。
［２４］上記［２２］に記載の方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物の製造方法。
［２５］標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を接触させることを含む方法。
［２６］標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を接触させことを含む方法。
本発明によれば、特定のＤＮＡを標的化するように操作されたＴｉＤ ｃｒＲＮＡを含むＴｉＤシステムを用いることにより、細胞、好ましくは動物および植物細胞において効率的に部位特異的変異を誘導することができる。驚くべきことに、本発明によれば、ＴｉＤシステムのＣａｓエフェクタータンパク質であるＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄに加えて、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列（以下、「Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒ」ともいう）を発現させることで、ＴｉＤシステムによる標的配列の標的化および改変の効率を数倍上昇させることができる。さらに、本発明の技術を用いれば、標的配列近傍の変異様式として、より長い欠失を生じさせる。
ＴｉＤシステムは、具体的には、ＴｉＤ Ｃａｓタンパク質のうち、Ｃａｓエフェクタータンパク質として、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄと、ＴｉＤ ｃｒＲＮＡとを含む。ＴｉＤシステムにおいて、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄは標的認識モジュール（Ｃａｓｃａｄｅ）を構成し、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄはポリヌクレオチド切断モジュールを構成することが知られていた（特許文献１）。さらに、発明者らの以前の研究により、切断モジュールの構成要素のうちＣａｓ１０ｄがポリヌクレオチド分解作用（ヌクレアーゼ活性）を有し、Ｃａｓ３ｄはヌクレアーゼ活性を有しないことが明らかにされた。すなわち、ＴｉＤシステムでは、ＴｉＤ ｃｒＲＮＡと標的認識モジュールとが標的ヌクレオチド配列を標的化してポリヌクレオチド切断モジュールを該標的ヌクレオチド配列付近に導き、Ｃａｓ１０ｄの作用により該標的ヌクレオチド配列が切断される。ＴｉＤシステムにおいて、ＴｉＤ ｃｒＲＮＡは、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列（例えば、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列）を含む。
本発明は、ＴｉＤシステムを利用した標的ヌクレオチド配列を標的化する方法（以下、「本発明の標的配列ターゲティング方法」ともいう）、標的ヌクレオチド配列を改変する方法（以下、「本発明の標的配列改変方法」ともいう）、および標的遺伝子の発現を制御する方法（以下、「本発明の標的遺伝子発現制御方法」ともいう）を提供する。さらに、本発明は、これらの方法に使用される、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡを含む複合体（以下、「本発明の複合体」ともいう）、および該複合体をコードする核酸分子を含むベクター（以下、「本発明のベクター」ともいう）およびキット（以下、「本発明のキット」ともいう）を提供する。
とりわけ本発明は、ＴｉＤシステムにおける上記Ｃａｓタンパク質の他に、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドを用いることを特徴とする。興味深いことに、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端側配列にはＣａｓ１１ｅと共通のα－ヘリックス領域が保存されていることが分かった（実施例１）。Ｃａｓ１０ｄのＣ末端がＣａｓ１１ｅの機能を果たしていると考えられ、それ故、ＴｉＤでは、ＣＲＩＳＰＲ ｔｙｐｅ Ｉ－ＥのようにＣａｓ１１ｅの発現は必要とされないと考えられた。しかしながら、驚くべきことに、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドを発現させることにより、ＴｉＤシステムの効果が改善されることが分かった。したがって、本発明はさらに、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドを用いることにより、ＴｉＤシステムを利用した標的ヌクレオチド配列の標的化および改変の効率を改善する方法、ならびにＣａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドを含む、ＴｉＤシステムを利用した標的ヌクレオチド配列の標的化および改変の効率を改善する組成物を提供する。
（１）細胞
本発明において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されない。例えば、細菌、古細菌、真菌類（例えば、糸状菌、酵母等）、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、哺乳類動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞等）が挙げられる。好ましくは、真核細胞が使用される。本明細書において使用される場合、「細胞」とは、生体から単離された細胞、生体内（例えば、動物体または植物の体内）に存在している細胞、生体（例えば、動物体、または植物体）、または培養細胞のいずれも包含する。本発明の方法は、生体から単離された細胞、生体内に存在する細胞、または生体のいずれの器官および組織に由来する細胞に適用してもよい。例えば、ヒト以外の動物の体内に存在する細胞またはヒト以外動物体に適用してもよい。例えば、動物細胞には、限定するものではないが、生殖細胞、受精卵、胚細胞、幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞等も含む）、体細胞などが包含される。例えば、植物細胞には、限定するものではないが、生殖細胞、受精卵、胚細胞、体細胞などが包含され、プロトプラストを用いてもよい。
本発明において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されない。例えば、細菌、古細菌、真菌類（例えば、糸状菌、酵母等）、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、哺乳類動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞等）が挙げられる。好ましくは、真核細胞が使用される。本明細書において使用される場合、「細胞」とは、生体から単離された細胞、生体内（例えば、動物体または植物の体内）に存在している細胞、生体（例えば、動物体、または植物体）、または培養細胞のいずれも包含する。本発明の方法は、生体から単離された細胞、生体内に存在する細胞、または生体のいずれの器官および組織に由来する細胞に適用してもよい。例えば、ヒト以外の動物の体内に存在する細胞またはヒト以外動物体に適用してもよい。例えば、動物細胞には、限定するものではないが、生殖細胞、受精卵、胚細胞、幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞等も含む）、体細胞などが包含される。例えば、植物細胞には、限定するものではないが、生殖細胞、受精卵、胚細胞、体細胞などが包含され、プロトプラストを用いてもよい。
（２）Ｃａｓエフェクタータンパク質および該タンパク質をコードする核酸
本発明で使用されるＣａｓエフェクタータンパク質は、ＴｉＤのＣａｓタンパク質のうち、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄである。Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ Ｓｐ．、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｓｔａｇｎａｌｅ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ ｗａｌｓｂｙｉ、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｖｕｌｃａｎｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎａｔｒｉａｌｂａ ａｓｉａｔｉｃａ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ ｐｈａｒａｏｎｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｐｈｏｒｍｉｄｅｓｍｉｓ ｐｒｉｅｓｔｌｅｙｉ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ Ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ ｐｅｎｄｅｎｓ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ｐａｒｉｅｔｉｎａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｌａｕｅｅｎｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ．、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．などの菌株由来のものであってもよい。本発明において、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、２種以上の菌種由来のものであってもよく、または同じ菌種由来のものであってもよい。好ましくは同じ菌種由来のものが用いられる。上記Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ等の公開されたデータベースから入手可能である。また、メタゲノム解析などにより得られた微生物ゲノムデータからＢＬＡＳＴプログラムを利用することで、新規の微生物種からの配列取得も可能である。
本発明で使用されるＣａｓエフェクタータンパク質は、ＴｉＤのＣａｓタンパク質のうち、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄである。Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ Ｓｐ．、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｓｔａｇｎａｌｅ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ ｗａｌｓｂｙｉ、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｖｕｌｃａｎｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎａｔｒｉａｌｂａ ａｓｉａｔｉｃａ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ ｐｈａｒａｏｎｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｐｈｏｒｍｉｄｅｓｍｉｓ ｐｒｉｅｓｔｌｅｙｉ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ Ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ ｐｅｎｄｅｎｓ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ｐａｒｉｅｔｉｎａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｌａｕｅｅｎｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ．、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．などの菌株由来のものであってもよい。本発明において、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、２種以上の菌種由来のものであってもよく、または同じ菌種由来のものであってもよい。好ましくは同じ菌種由来のものが用いられる。上記Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ等の公開されたデータベースから入手可能である。また、メタゲノム解析などにより得られた微生物ゲノムデータからＢＬＡＳＴプログラムを利用することで、新規の微生物種からの配列取得も可能である。
上記Ｃａｓタンパク質は、既知の方法によって得ることができ、例えば、アミノ酸配列情報を基に化学合成するか、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を適当なベクター等を介して細胞中に導入し、該細胞中で産生させてもよい。上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、既知の方法によって得ることができ、例えば、アミノ酸配列情報を基に、該核酸を導入する宿主細胞における翻訳に最適化されたコドンを選択し、化学合成等により構築してもよい。宿主細胞において使用頻度の高いコドンを使用することにより、タンパク質の発現量の増加させることができる。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
Ｃａｓ１０ｄは、Ｎ末端領域にＨＤ（ヒスチジン－アスパラギン酸）ドメインを有し、該ドメインがＤＮＡ切断において機能することが知られている（特許文献２）。また、本発明において、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端側には複数のα－ヘリックス領域が存在することが見出された（実施例１）。したがって、本発明においてＣａｓ１０ｄは、少なくともＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチドであればよい。例えば、限定するものではないが、Ｃａｓ１０ｄは、全長Ｃａｓ１０ｄタンパク質、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインからＣ末端側の１以上のα－ヘリックス領域を含むポリペプチド、またはＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含み、かつＣ末端側の１以上のα－ヘリックス領域を欠くポリペプチドであってもよい。Ｃａｓ１０ｄは、Ｃ末端側の全てのα－ヘリックス領域を欠いていてもよい。本明細書において、「Ｃａｓ１０ｄ」なる語は、全長Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、および上記のようなＮ末端側のＨＤドメインを含むＣａｓ１０ｄフラグメントのいずれも包含する。
Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各Ｃａｓタンパク質またはそれらをコードする核酸は、上記Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡとの複合体が標的配列を標的化または改変するかぎりにおいて、１以上の、例えば１～数個のアミノ酸変異、または１以上の、例えば１～数個のヌクレオチド変異を有していてもよい。本明細書において「数個」とは、２～１０個程度をいい、例えば３、４、５、６、７、８または９個をいう。本明細書において、「変異」とは、天然配列と比べたアミノ酸またはヌクレオチドの欠失、置換、挿入または付加を包含する。
例えば、上記Ｃａｓタンパク質の例として、限定するものではないが、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（以下、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａという）由来のＣａｓ３ｄ（配列番号１）、Ｃａｓ５ｄ（配列番号２）、Ｃａｓ６ｄ（配列番号３）、Ｃａｓ７ｄ（配列番号４）、およびＣａｓ１０ｄ（配列番号５）が挙げられる。したがって、本発明に用いられるＣａｓ３ｄの例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、Ｃａｓ５ｄの例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、Ｃａｓ６ｄの例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、Ｃａｓ７ｄの例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、およびＣａｓ１０ｄの例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ３ｄの例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｃａｓ５ｄの例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｃａｓ６ｄの例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｃａｓ７ｄの例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、およびＣａｓ１０ｄの例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
また、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。上記のいずれかのＣａｓタンパク質は、上記の他のＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成した場合に標的配列を標的化または改変する能力を有するものである。
ＴｉＤシステムを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、Ｃａｓタンパク質の末端に核移行シグナルを付加してもよい。核移行シグナルは、当該分野で公知であり、導入対象の細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。また、核移行シグナルは、２個以上をタンデムに並べてＣａｓタンパク質に付加してもよい。また、核移行シグナルは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端側またはＣ末端側のいずれか、あるいは両方に付加されていてもよい。
本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。
また、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。上記のいずれかの核酸から発現するＣａｓタンパク質は、上記の他の核酸から発現するＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成した場合に標的配列を標的化または改変する能力を有するものである。
ＴｉＤシステムを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の末端に核移行シグナルをコードするヌクレオチド配列が付加してもよい。核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、導入対象の細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。また、核移行シグナル配列は、２個以上をタンデムに並べてＣａｓタンパク質をコードする核酸に付加してもよい。また、核移行シグナル配列は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の５’末端側または３’末端側のいずれか、あるいは両方に付加されていてもよい。
（３）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列（Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒ）を含むポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸
本発明において、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列（Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒ）は、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端側の１以上のα－ヘリックス領域を含む配列である。また、本発明において、Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチド（以下、「Ｃａｓ１１ｄ」ともいう）は、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まない。
本発明において、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列（Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒ）は、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端側の１以上のα－ヘリックス領域を含む配列である。また、本発明において、Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチド（以下、「Ｃａｓ１１ｄ」ともいう）は、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まない。
Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒの配列長は、本発明の効果が達成されるかぎりにおいて、すなわち、ＴｉＤシステムによる標的ヌクレオチド配列の効率的な標的化および改変が達成されるかぎりにおいて特に限定されないが、例えば、約１００アミノ酸長～約４００アミノ酸長、好ましくは約１２０アミノ酸長～約２７０アミノ酸長、より好ましくは約１３０アミノ酸長～約１８０アミノ酸長、さらに好ましくは約１３５アミノ酸長～約１７０アミノ酸長であってもよい。例えば、Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒとして、Ｃａｓ１０ｄの全長アミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸長～約４００アミノ酸長、好ましくは約１２０アミノ酸長～約２７０アミノ酸長、より好ましくは約１３０アミノ酸長～約１８０アミノ酸長、さらに好ましくは約１３５アミノ酸長～約１７０アミノ酸長を用いることができ、また例えば、Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒをコードする核酸として、Ｃａｓ１０ｄ遺伝子のストップコドンから５’側上流の約０．３ｋｂ配列長～約１．２ｋｂ配列長、好ましくは約０．３６ｋｂ配列長～約０．８１ｋｂ配列長、より好ましくは約０．３９ｋｂ配列長～約０．５４ｋｂ配列長、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ配列長～約０．５１ｋｂ配列長を用いることができる。したがって、Ｃａｓ１１ｄは、例えば、Ｃａｓ１０ｄの全長アミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸を含む。Ｃａｓ１１ｄの好ましい例として、Ｃａｓ１０ｄの全長アミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸からなるポリペプチドが挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸は、例えば、Ｃａｓ１０ｄ遺伝子のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂを含む。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の好ましい例として、Ｃａｓ１０ｄ遺伝子のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂからなる核酸が挙げられる。但し、Ｃａｓ１１ｄは、全長Ｃａｓ１０ｄではない。
Ｃａｓ１１ｄおよびＣａｓ１１ｄをコードする核酸は、既知の方法によって得ることができる。例えば、Ｃａｓ１１ｄは、アミノ酸配列情報を基に化学合成するか、またはＣａｓ１１ｄをコードする核酸を適当なベクター等を介して細胞中に導入し、該細胞中で産生させてもよい。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸は、例えば、アミノ酸配列情報を基に、該核酸を導入する宿主細胞における翻訳に最適化されたコドンを選択し、化学合成等により構築してもよい。宿主細胞において使用頻度の高いコドンを使用することにより、タンパク質の発現量の増加させることができる。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
Ｃａｓ１１ｄまたはＣａｓ１１ｄをコードする核酸は、本発明の効果が達成されるかぎりにおいて、すなわち、Ｃａｓ１１ｄと上記Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡとの複合体が標的配列の効率的な標的化および改変をもたらすかぎりにおいて、１以上の、例えば１～数個のアミノ酸変異、または１以上の、例えば１～数個のヌクレオチド変異を有していてもよい。
例えば、Ｃａｓ１１ｄの例として、限定するものではないが、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣａｓ１０ｄ（配列番号５）由来のＣａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチドが挙げられる。したがって、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄの例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄの例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸からなるポリペプチドが挙げられる。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ１１ｄの一例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列の９９７位～１１５６位のアミノ酸からなる配列（配列番号６）を含むポリペプチドが挙げられ、さらに好ましくは、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
さらに、Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ＰＣＣ６３０３ （Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ｐａｒｉｅｔｉｎａ）、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ＰＣＣ７４２４ （Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｌａｕｅｅｎｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ． ＰＣＣ７４２８、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ ＰＣＣ７４１８、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ． ＮＩＥＳ－２１１１、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ． ＰＣＣ７１１６、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３由来のＣａｓ１１ｄの例として、それぞれ配列番号８～１９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。さらに好ましくは、配列番号８～１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。本発明において、Ｃａｓ１１ｄは、上記Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、および／またはＣａｓ１０ｄ）と異なる菌種または同じ菌種由来のＣａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒを含んでいてもよい。好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質のいずれかと同じ菌株由来のＣａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチドがＣａｓ１１ｄとして用いられる。
また、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄのさらなる例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸からなる配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄのさらなる例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸からなる配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。Ｃａｓ１１ｄのまたさらなる例として、配列番号６、配列番号８～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。Ｃａｓ１１ｄの好ましい例として、配列番号６、配列番号８～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。上記のいずれのＣａｓ１１ｄも、上記のＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成した場合に標的配列の効率的な標的化および改変をもたらす能力を有するものである。
ＴｉＤシステムを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、Ｃａｓ１１ｄの末端に核移行シグナルを付加してもよい。核移行シグナルは、当該分野で公知であり、導入対象の細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。また、核移行シグナルは、２個以上をタンデムに並べてＣａｓ１１ｄに付加してもよい。また、核移行シグナルは、Ｃａｓ１１ｄのＮ末端側またはＣ末端側のいずれか、あるいは両方に付加されていてもよい。
本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂを含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂを含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂからなる核酸が挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の一例として、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられ、さらに好ましくは、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられ、またさらに好ましくは、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の他の例として、配列番号８～１９で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられ、さらに好ましくは、配列番号８～１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられ、またさらに好ましくは、配列番号８～１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。
また、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸のさらなる例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂからなる配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂからなる配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂからなる配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の他の例として、配列番号６、配列番号８～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸のまた別の例として、配列番号６、配列番号８～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸のまた別の例として、配列番号６、配列番号８～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。上記のいずれの核酸から発現するＣａｓ１１ｄポリペプチドも、上記のＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成した場合に標的配列の効率的な標的化および改変をもたらす能力を有するものである。
ＴｉＤシステムを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の末端に核移行シグナルをコードするヌクレオチド配列が付加してもよい。核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、導入対象の細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。また、核移行シグナル配列は、２個以上をタンデムに並べてＣａｓ１１ｄをコードする核酸に付加してもよい。また、核移行シグナル配列は、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の５’末端側または３’末端側のいずれか、あるいは両方に付加されていてもよい。
（４）ｃｒＲＮＡ
ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するリピート配列および該リピート配列に挟まれたスペーサー配列からなる１以上の構造単位（「リピート－スペーサー－リピート」）を含む。リピート配列は、好ましくは、パリンドローム様配列を含む。ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列として標的ヌクレオチド配列に結合するＲＮＡ配列（すなわち、プロトスペーサー配列）を含むことによって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的認識に寄与する。ｃｒＲＮＡのリピート配列および該リピート配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる構造を含むＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とも呼ばれる。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエフェクタータンパク質の作用によりプロセッシングされてそのリピート配列が切断され、リピート配列の部分配列と該リピート配列の部分配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる成熟型（ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡになる。プロセッシングされる前のｃｒＲＮＡはプレ成熟型（ｐｒｅ－ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡと呼ばれる。
ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するリピート配列および該リピート配列に挟まれたスペーサー配列からなる１以上の構造単位（「リピート－スペーサー－リピート」）を含む。リピート配列は、好ましくは、パリンドローム様配列を含む。ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列として標的ヌクレオチド配列に結合するＲＮＡ配列（すなわち、プロトスペーサー配列）を含むことによって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的認識に寄与する。ｃｒＲＮＡのリピート配列および該リピート配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる構造を含むＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とも呼ばれる。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエフェクタータンパク質の作用によりプロセッシングされてそのリピート配列が切断され、リピート配列の部分配列と該リピート配列の部分配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる成熟型（ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡになる。プロセッシングされる前のｃｒＲＮＡはプレ成熟型（ｐｒｅ－ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡと呼ばれる。
本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列と、該リピート配列に挟まれたプロトスペーサー配列として、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含む。本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、好ましくは、プレ成熟型ｃｒＲＮＡである。
プレ成熟型ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓｃａｄｅ（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄの複合体）に取り込まれる前にＣａｓ６ｄによるプロセッシングを受けて、成熟型ｃｒＲＮＡとなる。プレ成熟型ｃｒＲＮＡが２以上の「リピート－スペーサー－リピート」構造単位を含む場合、該プレ成熟型ｃｒＲＮＡは、２種以上のプロトスペーサー配列を含んでいてもよい。２種以上のプロトスペーサー配列を含むプレ成熟型ｃｒＲＮＡからは、２種以上の成熟型ｃｒＲＮＡが生じ、次いで、これらの成熟型ｃｒＲＮＡは個別にＣａｓｃａｄｅに取り込まれる。
ｃｒＲＮＡに含まれるプロトスペーサー配列は、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列である。「標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列」は、例えば、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列、または標的ヌクレオチド配列に対し実質的に相補的な配列である。ここで、「実質的に相補的」とは、標的配列に対して完全に相補的ではないが、標的配列に結合できる（標的配列と塩基対を形成する）配列を包含する。標的ヌクレオチド配列に対し実質的に相補的な配列は、標的配列と塩基対を形成するかぎりにおいて、標的配列に対しミスマッチを含んでいてもよい。
ｃｒＲＮＡのリピート配列部分は、少なくとも１つのヘアピン構造を有していてもよい。例えば、プロトスペーサー配列の５’末端側にあるリピート配列部分がヘアピン構造を有し、プロトスペーサー配列の３’末端側にあるリピート配列部分は一本鎖であってもよい。本発明において、ｃｒＲＮＡは、好ましくは１つのヘアピン構造を有する。
ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列は、タイプＩ－Ｄ遺伝子群に隣接するｃｒＲＮＡ遺伝子配列領域から、タンデムリピート検索プログラムを利用して見出すことができる。タイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列は、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、上記のＣａｓエフェクタータンパク質に関して例示した細菌および古細菌由来のものであってもよい。
ｃｒＲＮＡに含まれるリピート配列の塩基長は、Ｃａｓｃａｄｅと相互作用して標的ヌクレオチド配列を標的化するという目的が達成されるかぎり、特に限定されない。例えば、プロトスペーサー配列の前後のリピート配列は各々、約１０～７０塩基長であってもよく、例えば、約３０～５０塩基長であってもよく、好ましくは約３５～４５塩基長であってもよい。
本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、約１０塩基～７０塩基長のプロトスペーサー配列を含むことができる。該ｃｒＲＮＡに含まれるプロトスペーサー配列は、好ましくは２０塩基～５０塩基、より好ましくは２５塩基～４５塩基からなる配列、さらに好ましくは３０塩基～４０塩基からなる配列、例えば、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、または３９塩基からなる配列である。標的化可能な配列が長いほど、ｃｒＲＮＡによる標的認識の配列特異性が増す。また、標的化可能な配列が長いほど、ｃｒＲＮＡと標的配列との間に形成される塩基対のＴｍ値が高くなり、標的認識の安定性が増す。従来のゲノム編集技術に用いられるＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１）ではｃｒＲＮＡが標的化できる配列の長さは約２０～２４塩基であるので、本発明では、従来法よりも配列特異性および安定性が優れている。
本発明で使用されるｃｒＲＮＡの例として、限定するものではないが、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｃｒＲＮＡのリピート配列を含むものが挙げられる。例えば、GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC（配列番号７；Ｎは標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を構成する任意のヌクレオチドである）で示される配列を含むプレ成熟型ｃｒＲＮＡが挙げられる。上記ｃｒＲＮＡの配列中、Ｎの数は１０～７０の範囲で変更してもよく、好ましくは２０～５０、より好ましくは２５～４５、さらに好ましくは３０～４０の範囲で変更してもよい。
上記ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入されてもよい。ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクターまたは発現カセットに含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結される。ベクターおよび調節配列は、例えば宿主細胞等に基づいて、当業者が適宜選択することができる。例えば、限定するものではないが、ｐｏｌ ＩＩＩ系のプロモーター（例えば、ＳＮＲ６、ＳＮＲ５２、ＳＣＲ１、ＲＰＲ１、Ｕ６、Ｈ１プロモーター等）、ｐｏｌ ＩＩ系のプロモーター、ターミネーター（例えばＴ６配列）、またはヒトＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーターを用いることができる。
上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄポリペプチドをコードする核酸のいずれかと同じベクター中または同じ発現カセット中に含まれていてもよく、または上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄポリペプチドをコードする核酸のいずれとも別のベクター中または別の発現カセット中に含まれていてもよい。
（５）標的ヌクレオチド配列
本発明において、標的ヌクレオチド配列（本明細書において、単に「標的配列」ともいう）は、任意の核酸の配列であり、ＴｉＤシステムのプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の近傍に位置する配列を標的配列として選択することを除き、特に限定されない。該核酸は、生体内または細胞内における核酸、または生体または細胞から単離された核酸であってもよい。標的ヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列のいずれであってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、真核生物核ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、原核生物ゲノムＤＮＡ、ファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡ等が挙げられる。本発明において、標的ヌクレオチド配列は、好ましくは、ゲノムＤＮＡ上の配列である。したがって、標的とする核酸のセンス鎖において、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流に隣接する配列を標的ヌクレオチド配列として選択する。また、標的核酸のアンチセンス鎖において、標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の５’側の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の５’側に隣接する配列から選択される。なお、本明細書において、「近傍に位置する」とは、隣接すること、および近くにあることの両方を包含する。また、本明細書において、「近傍」とは、隣接する位置または近くの位置の両方を包含する。なお、本明細書においては、特記しないかぎり、核酸のセンス鎖に基づいて記載される。
本発明において、標的ヌクレオチド配列（本明細書において、単に「標的配列」ともいう）は、任意の核酸の配列であり、ＴｉＤシステムのプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の近傍に位置する配列を標的配列として選択することを除き、特に限定されない。該核酸は、生体内または細胞内における核酸、または生体または細胞から単離された核酸であってもよい。標的ヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列のいずれであってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、真核生物核ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、原核生物ゲノムＤＮＡ、ファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡ等が挙げられる。本発明において、標的ヌクレオチド配列は、好ましくは、ゲノムＤＮＡ上の配列である。したがって、標的とする核酸のセンス鎖において、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流に隣接する配列を標的ヌクレオチド配列として選択する。また、標的核酸のアンチセンス鎖において、標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の５’側の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の５’側に隣接する配列から選択される。なお、本明細書において、「近傍に位置する」とは、隣接すること、および近くにあることの両方を包含する。また、本明細書において、「近傍」とは、隣接する位置または近くの位置の両方を包含する。なお、本明細書においては、特記しないかぎり、核酸のセンス鎖に基づいて記載される。
ＣＲＩＳＰＲシステムの標的認識に利用されるＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムの種類によって異なる。例えば、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むいくつかの菌株由来のＴｉＤシステムのＰＡＭ配列は、標的とする核酸のセンス鎖において、５’－ＧＴＨ－３’（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）であり、標的核酸のアンチセンス鎖において、５’－ＨＴＧ－３’（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）である（特許文献１）。
例えば、標的ヌクレオチド配列は、上記ＰＡＭ配列の近傍に位置し、かつ、標的遺伝子のイントロン内、コーディング領域内、非コーディング領域内、または制御領域内に存在する配列であってもよい。標的遺伝子は、任意の遺伝子であり、随意に選択すればよい。
標的ヌクレオチド配列の長さは、例えば、１０～７０塩基長、好ましくは２０～５０塩基長、より好ましくは２５～４５塩基長、さらに好ましくは３０～４０塩基長の範囲である。
（６）本発明の標的配列ターゲティング方法
本発明の標的配列ターゲティング方法は、ＴｉＤのＣａｓエフェクタータンパク質のうちＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄと、Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチド（Ｃａｓ１１ｄ）と、ｃｒＲＮＡとを細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列ターゲティング方法は、（ｉ）Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、（ｉｉ）Ｃａｓ１１ｄポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列ターゲティング方法は、イン・ビトロ、イン・ビボ、またはエクス・ビボのいずれで行ってもよい。また、本発明の標的配列ターゲティング方法は、単離された核酸の標的ヌクレオチド配列に適用することもでき、この場合、該方法は、上記（ｉ）のＣａｓタンパク質、上記（ｉｉ）のＣａｓ１１ｄポリペプチドおよび上記（ｉｉｉ）のｃｒＲＮＡを、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触させることを含む。
本発明の標的配列ターゲティング方法は、ＴｉＤのＣａｓエフェクタータンパク質のうちＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄと、Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチド（Ｃａｓ１１ｄ）と、ｃｒＲＮＡとを細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列ターゲティング方法は、（ｉ）Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、（ｉｉ）Ｃａｓ１１ｄポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列ターゲティング方法は、イン・ビトロ、イン・ビボ、またはエクス・ビボのいずれで行ってもよい。また、本発明の標的配列ターゲティング方法は、単離された核酸の標的ヌクレオチド配列に適用することもでき、この場合、該方法は、上記（ｉ）のＣａｓタンパク質、上記（ｉｉ）のＣａｓ１１ｄポリペプチドおよび上記（ｉｉｉ）のｃｒＲＮＡを、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触させることを含む。
本発明の標的配列ターゲティング方法において、上記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのうち２以上を含む単離された複合体、例えば４つを含む単離された複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよく、またはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各々が単離されたタンパク質として単独で細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。また、本発明の標的配列ターゲティング方法において、上記Ｃａｓタンパク質は、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸として細胞中に導入してもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
本発明の標的配列ターゲティング方法において、Ｃａｓ１１ｄは、上記Ｃａｓタンパク質との複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触されてもよく、またはＣａｓ１１ｄは単離されたポリペプチドとして単独で細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。また、本発明の標的配列ターゲティング方法において、Ｃａｓ１１ｄは、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸として細胞中に導入してもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸は、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該核酸配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結されている。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、およびＣａｓ１１ｄを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸配列に核移行シグナル配列が付加される。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄＣａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸の２以上または全てが単一のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。ベクターまたは発現カセットの数、ならびに各ベクターまたは発現カセットに組み込む核酸の種類および組み合わせに制限はない。上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする２以上の核酸が一つのベクターまたは発現カセット中に含まれる場合、これらの核酸配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする２以上の核酸を連結する順番は、いずれであってもよい。
上記ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入されてもよい。上記ｃｒＲＮＡはまた、上記Ｃａｓタンパク質および／またはＣａｓ１１ｄとの複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該ＲＮＡまたはＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結される。ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および／またはＣａｓ１１ｄをコードする核酸と同じベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。
ベクターは、対象細胞中に目的タンパク質をコードする核酸を運び、該細胞中で該目的タンパク質を発現させるための発現ベクターである。発現カセットとは、目的タンパク質をコードする核酸の転写および／または翻訳を指示して該目的タンパク質の発現を可能にする核酸分子を意味する。発現カセットは、ベクターに含まれていてもよい。ベクターとしては、当該分野において一般的に使用される種々のベクターを使用することができ、特に限定されず、導入される細胞又は導入方法に応じて適宜選択することができる。例えば、限定するものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン等が挙げられる。
上記調節配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ポリアデニル化シグナル、ポリＵ配列、翻訳エンハンサー等が挙げられる。調節配列は、特に限定されず、宿主細胞等に基づき当業者が適宜選択することができる。例えば、プロモーターとしては、宿主が植物細胞である場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、２ｘＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げられ、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ－ＴＳプロモーター、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター、ＣＡＧキメラ合成プロモーター等が挙げられる。
上記核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを導入する細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。例えば、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナルを使用してもよい。
上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡ、またはこれらをコードする核酸は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。また、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、またはこれらの各Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。例えば、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいてそれぞれ合成した上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、およびＣａｓ１１ｄと、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいて合成したｃｒＲＮＡを、イン・ビトロにおいてインキュベートして複合体を形成させ、該複合体を細胞中に導入することができる。
上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡの導入の際、細胞は、標的ヌクレオチド配列のターゲティングに適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。培養条件は、導入される細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
本発明の標的配列ターゲティング方法において、上記Ｃａｓタンパク質と機能性ポリペプチドとを含む融合タンパク質を用いてもよい。この場合、上記Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡの作用により機能性ポリペプチドが細胞中の標的ヌクレオチド配列に誘導され、該機能性ポリペプチドの作用により該標的ヌクレオチド配列が改変または修飾される。したがって、本発明はさらに、上記融合タンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触することを含む、標的ヌクレオチド配列の改変または修飾方法を提供する。機能性ポリペプチドは、標的配列に対して何らかの機能を示すポリペプチドである。機能性ポリペプチドとしては、例えば、限定するものではないが、制限酵素、転写因子、ＤＮＡメチル化酵素、ヒストンアセチル化酵素、蛍光タンパク質、ならびに、ポリヌクレオチド切断モジュールとして制限酵素のヌクレオチド切断モジュール、遺伝子発現調節モジュールとして、転写因子の転写活性化モジュールおよび転写抑制モジュール、エピゲノム修飾モジュールとして、ＤＮＡメチル化酵素のメチル化モジュールおよびヒストンアセチル化酵素のアセチル化モジュール、塩基置換を誘発させるモジュールとしてシトシンデアミナーゼおよびアデニンデアミナーゼなどが挙げられる。蛍光タンパク質としては、例えば、ＧＦＰが挙げられる。
本発明の標的配列ターゲティング方法によれば、Ｃａｓ１１ｄの存在により、効率よく標的配列を標的化することができる。
（７）本発明の標的配列改変方法
本発明の標的配列改変方法は、Ｃａｓエフェクタータンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄと、Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチド（Ｃａｓ１１ｄ）と、ｃｒＲＮＡとを細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列改変方法は、細胞中に、（ｉ）Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、（ｉｉ）Ｃａｓ１１ｄポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列改変方法は、本発明の標的配列ターゲティング方法により標的化したヌクレオチド配列を、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄの作用により切断することを含む。本発明の標的配列改変方法は、イン・ビトロ、イン・ビボ、またはエクス・ビボのいずれで行ってもよい。本発明において、改変には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。また、本発明の標的配列改変方法は、単離された核酸の標的ヌクレオチド配列に適用することもでき、この場合、該方法は、上記（ｉ）のＣａｓタンパク質、上記（ｉｉ）のＣａｓ１１ｄポリペプチドおよび上記（ｉｉｉ）のｃｒＲＮＡを、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触させることを含む。本発明の標的配列改変方法は、単離された核酸の標的ヌクレオチド配列に適用する場合、好ましくは、標的ヌクレオチド配列の切断方法が提供される。
本発明の標的配列改変方法は、Ｃａｓエフェクタータンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄと、Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチド（Ｃａｓ１１ｄ）と、ｃｒＲＮＡとを細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列改変方法は、細胞中に、（ｉ）Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、（ｉｉ）Ｃａｓ１１ｄポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列改変方法は、本発明の標的配列ターゲティング方法により標的化したヌクレオチド配列を、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄの作用により切断することを含む。本発明の標的配列改変方法は、イン・ビトロ、イン・ビボ、またはエクス・ビボのいずれで行ってもよい。本発明において、改変には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。また、本発明の標的配列改変方法は、単離された核酸の標的ヌクレオチド配列に適用することもでき、この場合、該方法は、上記（ｉ）のＣａｓタンパク質、上記（ｉｉ）のＣａｓ１１ｄポリペプチドおよび上記（ｉｉｉ）のｃｒＲＮＡを、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触させることを含む。本発明の標的配列改変方法は、単離された核酸の標的ヌクレオチド配列に適用する場合、好ましくは、標的ヌクレオチド配列の切断方法が提供される。
本発明の標的配列改変方法において、上記Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、これら５つのＣａｓタンパク質のうち２以上を含む単離された複合体、例えば５つを含む単離された複合体、またはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄを含む単離された複合体および／またはＣａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄを含む単離された複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよく、あるいはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各々が単離されたタンパク質として単独で細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。あるいは、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸として細胞中に導入されてもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
本発明の標的配列改変方法において、Ｃａｓ１１ｄは、上記Ｃａｓタンパク質との複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよく、またはＣａｓ１１ｄは単離されたポリペプチドとして単独で細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。また、本発明の標的配列改変方法において、Ｃａｓ１１ｄは、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸として細胞中に導入されてもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸は、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該核酸配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結されている。導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸に核移行シグナル配列が付加される。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄ、ならびにＣａｓ１１ｄをコードする核酸の２以上または全てが単一のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。ベクターまたは発現カセットの数、ならびに各ベクターまたは発現カセットに組み込む核酸の種類および組み合わせに制限はない。上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする２以上の核酸が一つのベクターまたは発現カセット中に含まれる場合、これらの核酸配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする２以上の核酸を連結する順番は、いずれであってもよい。
上記ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入されてもよい。上記ｃｒＲＮＡはまた、上記Ｃａｓタンパク質および／またはＣａｓ１１ｄとの複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該ＲＮＡまたはＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結される。ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および／またはＣａｓ１１ｄをコードする核酸と同じベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。
ベクターとしては、当該分野において一般的に使用される種々のベクターを使用することができ、特に限定されず、導入される細胞又は導入方法に応じて適宜選択することができる。例えば、限定するものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン等が挙げられる。
上記調節配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ポリアデニル化シグナル、ポリＵ配列、翻訳エンハンサー等が挙げられる。調節配列は、特に限定されず、宿主細胞等に基づき当業者が適宜選択することができる。例えば、プロモーターとしては、宿主が植物細胞である場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、２ｘＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げられ、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ－ＴＳプロモーター、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター、ＣＡＧキメラ合成プロモーター等が挙げられる。
上記核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを導入する細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。例えば、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナルを使用してもよい。
本発明の標的配列改変方法においては、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡに加えて、ドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。ドナーポリヌクレオチドは、標的部位に導入したい改変を含む少なくとも１つのドナー配列を含む。ドナーポリヌクレオチドは、ドナー配列に加えて、該ドナー配列の両端に標的配列の上流および下流の配列と相同性の高い配列（好ましくは、標的配列の上流および下流の配列と実質的に同一の配列）を含んでいてもよい。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡであってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、当該分野で既知の技術に基づいて当業者が適宜設計することができる。
本発明の標的配列改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在しない場合、標的ヌクレオチド配列における切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復されうる。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいことが知られており、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが該切断の修復中に起こりうる。かくして、該配列は、標的配列部位において改変され、それにより、フレームシフトや未成熟終止コドンを誘発し、標的配列領域がコードしている遺伝子の発現が不活性化またはノックアウトされうる。
本発明の標的配列改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在する場合、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、切断された標的ヌクレオチド配列の相同組換え修復（ＨＤＲ）により、標的配列部位に挿入されるか、または標的配列部位がドナー配列に置換される。その結果、標的配列部位に所望の改変が導入される。
上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。ドナーポリヌクレオチドを用いる場合、ドナーポリヌクレオチドもまた、当該分野で知られた種々の手段によって細胞中に導入すればよい。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡ、またはこれらをコードする核酸、あるいは上記Ｃａｓタンパク質等の複合体は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。ドナーポリヌクレオチドを用いる場合は、該ドナーポリヌクレオチドもまた、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡ、またはこれらをコードする核酸、あるいは上記Ｃａｓタンパク質等の複合体と同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。
上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡの導入の際、細胞は、標的配列部位での切断に適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。ドナーポリヌクレオチドを導入する際も同様である。培養条件は、導入される細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
本発明の標的配列改変方法によれば、細胞中に導入されたＴｉＤシステムにより標的ヌクレオチド配列上の部位が切断され、該切断配列の修復時に、標的配列が改変される。例えば、本発明の標的配列改変方法は、ゲノム上の標的ヌクレオチド配列の改変のために用いることができ、該方法によりゲノム上の二本鎖ＤＮＡが切断され、標的部位が改変される。かくして、本発明の標的配列改変方法によれば、標的配列が改変された細胞が製造される。さらに、標的配列が改変された細胞が植物細胞である場合、該細胞から標的配列が改変された植物を製造することもできる。該植物には、植物体、組織、器官（例えば、根、茎、葉など）、繁殖材料（例えば、種子、塊茎など）、子孫植物、クローン植物等が包含される。例えば、該標的配列が改変された植物細胞から植物体を再生することにより、標的配列が改変された植物体を製造することができる。植物細胞からの植物体の再生は、当該分野で既知の方法によって実施することができる。該植物体からさらに、標的配列が改変された組織、器官、繁殖材料、子孫植物、クローン等を得ることもできる。また、本発明の標的配列改変方法を用いて標的配列が改変された動物細胞を製造し、該動物細胞を用いて標的配列が改変された動物を製造することもできる。該動物には、動物個体、組織、器官、子孫、クローン動物等も包含される。動物は、好ましくは非ヒト動物である。動物細胞から動物を製造する方法として、当該分野で既知の方法を用いることができる。動物細胞としては、例えば、生殖細胞、受精卵、または多能性幹細胞が用いられる。例えば、本発明のＴｉＤシステムを受精卵に導入し、該受精卵を非ヒト動物の子宮に移植し、仔を得ることによって、標的配列が改変された動物個体を製造してもよい。該動物個体からはさらに、標的配列が改変された組織、器官、子孫、クローン等を得ることもできる。
本発明の標的配列改変方法によれば、標的配列に、数塩基から数十塩基の短鎖領域の挿入および／または欠失を導入するだけでなく、数キロベースないし数十キロベースの長鎖領域の塩基欠失も導入することができる。数キロベースないし数十キロベースとしては、限定するものではないが、例えば１０００～９００００塩基長、好ましくは２０００～８００００塩基長、より好ましくは２０００～７００００塩基長、さらに好ましくは２０００～６００００塩基長、２０００～５００００塩基長、２０００～４００００塩基長、２０００～３００００塩基長、または２０００～２００００塩基長が挙げられる。したがって、本発明の標的配列改変方法を用いれば、１つのガイドＲＮＡを設計するだけで、１遺伝子座全体を欠失させることが可能となる。また、本発明の標的配列改変方法を用いれば、動物の遺伝子のように長いイントロンが存在する場合でも、特定のエキソンを完全に欠落させることも可能である。さらに、本発明の標的配列改変方法を用いれば、隣接して存在する遺伝子群をまとめて欠落させることも可能である。
本発明の標的配列改変方法によれば、ＰＡＭ配列の上流方向または下流方向、あるいはＰＡＭ配列の上流および下流の両方（すなわち、二方向性）の塩基欠失をもたらすことができる。
（８）本発明の標的遺伝子発現制御方法
さらに、本発明の標的配列ターゲティング方法または標的配列改変方法において、標的ヌクレオチド配列として、標的遺伝子の配列または標的遺伝子の転写調節配列（例えば、転写因子結合配列、プロモーター配列、エンハンサー配列など）の少なくとも一部の配列を選択することにより、標的遺伝子の転写を抑制し、それにより当該標的遺伝子の発現を抑制することができる。また、本発明の標的配列ターゲティング方法において、標的ヌクレオチド配列として標的遺伝子の転写調節配列の少なくとも一部の配列を選択し、Ｃａｓタンパク質と遺伝子発現調節モジュール（例えば、転写因子の転写活性化モジュールまたは転写抑制モジュール）とを含む融合タンパク質を用いることにより、当該標的遺伝子の転写を制御（活性化または不活性化）し、それにより標的遺伝子の発現を制御（増幅または抑制）することができる。かくして、本発明は、標的遺伝子発現制御方法を提供する。
さらに、本発明の標的配列ターゲティング方法または標的配列改変方法において、標的ヌクレオチド配列として、標的遺伝子の配列または標的遺伝子の転写調節配列（例えば、転写因子結合配列、プロモーター配列、エンハンサー配列など）の少なくとも一部の配列を選択することにより、標的遺伝子の転写を抑制し、それにより当該標的遺伝子の発現を抑制することができる。また、本発明の標的配列ターゲティング方法において、標的ヌクレオチド配列として標的遺伝子の転写調節配列の少なくとも一部の配列を選択し、Ｃａｓタンパク質と遺伝子発現調節モジュール（例えば、転写因子の転写活性化モジュールまたは転写抑制モジュール）とを含む融合タンパク質を用いることにより、当該標的遺伝子の転写を制御（活性化または不活性化）し、それにより標的遺伝子の発現を制御（増幅または抑制）することができる。かくして、本発明は、標的遺伝子発現制御方法を提供する。
本発明の標的遺伝子発現制御方法では、標的ヌクレオチド配列として、標的遺伝子の配列または転写調節配列の少なくとも一部の配列が選択され、該配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡを使用する。本発明の標的遺伝子発現制御方法は、本発明の標的配列ターゲティング方法においてヌクレオチド配列を標的化する際に、Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡとの複合体が標的配列に結合することにより、該標的遺伝子の転写が抑制されることを含む。この場合、標的遺伝子配列は切断されないが、上記Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡとの複合体が標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該標的遺伝子領域の機能または該遺伝子の転写もしくは発現が阻害される。あるいは、本発明の標的遺伝子発現制御方法は、本発明の標的配列改変方法においてヌクレオチド配列を標的化および切断することにより、該標的遺伝子の転写が抑制されることを含む。本発明の標的遺伝子発現制御方法は、イン・ビトロ、イン・ビボまたはエクス・ビボのいずれで行ってもよい。
上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡ、それらの細胞中への導入方法、および導入時および導入後の細胞培養等については、上記「（６）本発明の標的配列ターゲティング方法」および「（７）本発明の標的配列改変方法」において記載したのと同様である。
（９）本発明の複合体
本発明の複合体は、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む。本発明は、特に、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体、およびＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体を提供する。さらに、本発明では、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄおよび機能性ポリペプチドを含む融合タンパク質と、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体も提供される。さらに、上記複合体をコードするＤＮＡ分子も提供される。本発明の複合体は、本発明の標的配列ターゲティング方法、標的配列改変方法、および標的遺伝子発現制御方法に使用することができる。例えば、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄを含む複合体、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体を細胞に導入して、該細胞内で該複合体を機能させることにより、該細胞のゲノム上の標的配列を改変することができる。また、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄを含む複合体、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを含む複合体を細胞に導入して、該細胞内で該複合体を機能させることにより、該細胞中の標的配列を標的化することができ、また、標的遺伝子の発現を制御することができる。
本発明の複合体は、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む。本発明は、特に、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体、およびＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体を提供する。さらに、本発明では、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄおよび機能性ポリペプチドを含む融合タンパク質と、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体も提供される。さらに、上記複合体をコードするＤＮＡ分子も提供される。本発明の複合体は、本発明の標的配列ターゲティング方法、標的配列改変方法、および標的遺伝子発現制御方法に使用することができる。例えば、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄを含む複合体、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体を細胞に導入して、該細胞内で該複合体を機能させることにより、該細胞のゲノム上の標的配列を改変することができる。また、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄを含む複合体、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを含む複合体を細胞に導入して、該細胞内で該複合体を機能させることにより、該細胞中の標的配列を標的化することができ、また、標的遺伝子の発現を制御することができる。
本発明の複合体は、常法により、イン・ビトロ、イン・ビボまたはエクス・ビボで製造することができる。例えば、上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸、およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞中に導入し、該細胞内で複合体を形成させてもよい。
本発明の複合体の例として、限定するものではないが、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣａｓ５ｄ（配列番号２）、Ｃａｓ６ｄ（配列番号３）、Ｃａｓ７ｄ（配列番号４）およびＣａｓ１０ｄ（配列番号５）と、Ｃａｓ１１ｄ（配列番号６）と、GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC（配列番号７；Ｎは、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を構成する任意のヌクレオチドである）で示される配列からなるｃｒＲＮＡとを含む複合体、およびＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣａｓ５ｄ（配列番号２）、Ｃａｓ６ｄ（配列番号３）、Ｃａｓ７ｄ（配列番号４）、Ｃａｓ３ｄ（配列番号１）およびＣａｓ１０ｄ（配列番号５）と、Ｃａｓ１１ｄ（配列番号６）と、GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC（配列番号７；Ｎは、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を構成する任意のヌクレオチドである）で示される配列からなるｃｒＲＮＡとを含む複合体が挙げられる。上記ｃｒＲＮＡの配列中、Ｎの数は１０～７０の範囲で変更してもよく、好ましくは２０～５０、より好ましくは２５～４５、さらに好ましくは３０～４０、またさらに好ましくは３２～３７の範囲で変更してもよい。
（１０）本発明の発現ベクター
本発明はさらに、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄをコードする核酸、上記Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたは上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクター、ならびに上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄをコードする核酸、上記Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたは上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄをコードする核酸、上記Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたは上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクター、ならびに上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄをコードする核酸、上記Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたは上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。
本発明のベクターは、上記「（６）本発明の標的配列ターゲティング方法」、「（７）本発明の標的配列改変方法」、および「（８）本発明の標的遺伝子発現制御方法」に記載したような、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを細胞中に導入するためのベクターである。該ベクターの導入後、該細胞中で上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを発現する。本発明のベクターは、また、上記ｃｒＲＮＡに含まれる標的配列を、制限部位を含む任意の配列に替えたベクターであってもよい。このようなベクターは、該任意の配列部位に所望の標的ヌクレオチド配列を組み込んで使用される。該任意の配列としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄの遺伝子座にあるスペーサー配列またはその一部であってもよい。
各Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸、およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは同じベクター中に含まれていてもよく、または２以上のベクターに別れて含まれていてもよい。
（１１）本発明のキット
本発明のキットは、上記した本発明の標的配列ターゲティング方法、標的配列改変方法、および標的遺伝子発現制御方法に使用するためのキットであり、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、Ｃａｓ１１ｄまたはＣａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含むか、あるいは上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄまたはこれらのタンパク質をコードする核酸、Ｃａｓ１１ｄまたはＣａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸、および／またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡはベクター系または発現カセット系に含まれていてもよい。本発明のキットの構成成分については、上記（２）～（７）に記載のとおりである。
本発明のキットは、上記した本発明の標的配列ターゲティング方法、標的配列改変方法、および標的遺伝子発現制御方法に使用するためのキットであり、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、Ｃａｓ１１ｄまたはＣａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含むか、あるいは上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄまたはこれらのタンパク質をコードする核酸、Ｃａｓ１１ｄまたはＣａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸、および／またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡはベクター系または発現カセット系に含まれていてもよい。本発明のキットの構成成分については、上記（２）～（７）に記載のとおりである。
さらに、Ｃａｓ１１ｄを用いることを特徴とする、ＴｉＤシステムを利用した標的ヌクレオチド配列の標的化および改変の効率を改善する方法、ならびにＣａｓ１１ｄを含む、ＴｉＤシステムを利用した標的ヌクレオチド配列の標的化および改変の効率を改善する組成物が提供される。上記方法において、Ｃａｓ１１ｄは標的配列を含む細胞中に導入される。上記方法および組成物の実施および構成成分等については、上記（１）～（７）に記載のとおりである。
以下に、本発明の実施例を示した。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施の一形態として、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＴｉＤ遺伝子座由来の遺伝子群（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ）を、クローン化して用いた。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのアミノ酸配列情報（配列番号１～５）を基に、各Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡ配列を人工合成した。実施例中のＤＮＡ配列の加工および構築操作には、人工遺伝子化学合成、ＰＣＲ法、制限酵素処理、ライゲーション、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法のいずれかを用いた。また、塩基配列の決定にはサンガー法あるいは次世代シーケンス法を用いた。
Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒ配列については、Ｃａｓ１０ｄのストップコドンより５’上流の４８３塩基の領域をクローン化して用いた。
標的配列については、以下を用いた。ＰＡＭはＧＴＣである。
ＡＡＶＳ１＿ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）： ｃｃｔａｇｔｇｇｃｃｃｃａｃｔｇｔｇｇｇｇｔｇｇａｇｇｇｇａｃａｇａｔ（配列番号２０）
ＡＡＶＳ１＿ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）： ｃｃｔａｇｔｇｇｃｃｃｃａｃｔｇｔｇｇｇｇｔｇｇａｇｇｇｇａｃａｇａｔ（配列番号２０）
＜方法＞
（１）ベクターの構築
遺伝子フラグメントのクローニングのためのＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（ＴａＫａＲａ）を用いて行た。アセンブリングのためのクローニングは、Ｑｕｉｃｋ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮＥＢ）、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、およびＭｕｌｔｉｓｉｔｅ ｇａｔｅｗａｙ Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
（１）ベクターの構築
遺伝子フラグメントのクローニングのためのＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（ＴａＫａＲａ）を用いて行た。アセンブリングのためのクローニングは、Ｑｕｉｃｋ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮＥＢ）、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、およびＭｕｌｔｉｓｉｔｅ ｇａｔｅｗａｙ Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
（１－１）哺乳動物ベクター
ヒトコドンに最適化したＣａｓエフェクター遺伝子（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ）、およびＣａｓ１１ｄをＮ末端のＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）（配列番号２１：ＫＫＫＫＲＫ）と共に合成し（ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標））（ＩＤＴ）、アセンブルし、ｐＥＦｓベクター（Lopez-Perrote et al,(2016), Nucleic Acids Res, 44:1909-1923. doi:10.1093/nar/gkv1527）中に別々にクローン化して、単一Ｃａｓ発現ベクター ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ、およびｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ１１ｄを得た。各Ｃａｓタンパク質にはｍｙｃタグを融合した。
ヒトコドンに最適化したＣａｓエフェクター遺伝子（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ）、およびＣａｓ１１ｄをＮ末端のＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）（配列番号２１：ＫＫＫＫＲＫ）と共に合成し（ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標））（ＩＤＴ）、アセンブルし、ｐＥＦｓベクター（Lopez-Perrote et al,(2016), Nucleic Acids Res, 44:1909-1923. doi:10.1093/nar/gkv1527）中に別々にクローン化して、単一Ｃａｓ発現ベクター ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ、およびｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ１１ｄを得た。各Ｃａｓタンパク質にはｍｙｃタグを融合した。
ｃｒＲＮＡ発現ベクターのために、リピート－スペーサー－リピート配列（配列番号２２）を含有するＤＮＡフラグメントを人工合成し、ｐＥＸ－Ａ２Ｊ１（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）中、ヒトＵ６プロモーター下でクローン化して、ｐＡＥＸ－ｈＵ６ｃｒＲＮＡを得た。ｇＲＮＡ配列の挿入のために、標的配列を含有する２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、制限酵素ＢｓａＩ（ＮＥＢ）を用いるＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングを用いて、ｃｒＲＮＡ発現ベクター中にクローン化した。
（１－２）ルシフェラーゼレポーターアッセイプラスミド
ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーターアッセイのために、ＮａｎｏＬＵｘｘＵＣ発現ベクターを構築した。まず、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２ ＤＮＡフラグメントを合成した（ＩＤＴ社製）。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１は、ＮａｎｏＬＵＣＴＭ（登録商標）遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）配列の最初の３５１ｂｐおよびマルチクローニングサイトを含む。ＸｂａＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の５’末端に付加した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２は、ＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端の４６５ｂｐを含む。ＸｈｏＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端に付加した。これらのフラグメントをアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＥＧｘｘＦＰベクター（ａｄｄｇｅｎｅ、＃５０７１６）中にクローン化した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ消化によって、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣベクターからそれぞれ除去することによって、各スプリットタイプＮＬＵｘｘＵＣレポーターを構築した。各消化ベクターをマルチクローニングサイトと共にアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２を得た。
ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーターアッセイのために、ＮａｎｏＬＵｘｘＵＣ発現ベクターを構築した。まず、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２ ＤＮＡフラグメントを合成した（ＩＤＴ社製）。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１は、ＮａｎｏＬＵＣＴＭ（登録商標）遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）配列の最初の３５１ｂｐおよびマルチクローニングサイトを含む。ＸｂａＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の５’末端に付加した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２は、ＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端の４６５ｂｐを含む。ＸｈｏＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端に付加した。これらのフラグメントをアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＥＧｘｘＦＰベクター（ａｄｄｇｅｎｅ、＃５０７１６）中にクローン化した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ消化によって、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣベクターからそれぞれ除去することによって、各スプリットタイプＮＬＵｘｘＵＣレポーターを構築した。各消化ベクターをマルチクローニングサイトと共にアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２を得た。
（２）細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胚性腎細胞株２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ，ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）を、１０％胎仔ウシ血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧｌｕｔａｌＭＡＸ（登録商標）サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で６０分、５％ＣＯ２インキュベーションで培養した。トランスフェクションの前日にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＵＳＡ）に播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨プロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。６ウェルプレートの各ウェルについて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出された全４μｇのプラスミドを用いた。変異分析のために、４８時間後にトランスフェクト細胞を回収した。
ヒト胚性腎細胞株２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ，ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）を、１０％胎仔ウシ血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧｌｕｔａｌＭＡＸ（登録商標）サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で６０分、５％ＣＯ２インキュベーションで培養した。トランスフェクションの前日にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＵＳＡ）に播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨プロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。６ウェルプレートの各ウェルについて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出された全４μｇのプラスミドを用いた。変異分析のために、４８時間後にトランスフェクト細胞を回収した。
（３）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、密度２．０ｘ１０４細胞／ウェルで播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨するプロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。９６ウェルプレートの各ウェルについて、（１）Ｆｌｕｃ遺伝子をコードするｐＧＬ４．５３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）、（２）標的ＤＮＡフラグメントの挿入により中断されたｐＣＡＧ－ｎＬＵｘｘＵＣベクター、および（３）ＴｉＤ成分をコードしているプラスミドＤＮＡを含む全２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いた。ＮａｎｏＬｕｃおよびＦｌｕｃルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの３日後に、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ホタル（Ｆｌｕｃ）活性を内部対照として用いた。ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比を各サンプルについて計算し、非標的化ｇＲＮＡでトランスフェクトした対照サンプルのＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比と比較した。相対的ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ活性を用いて、ｇＲＮＡ活性を評価した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、密度２．０ｘ１０４細胞／ウェルで播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨するプロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。９６ウェルプレートの各ウェルについて、（１）Ｆｌｕｃ遺伝子をコードするｐＧＬ４．５３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）、（２）標的ＤＮＡフラグメントの挿入により中断されたｐＣＡＧ－ｎＬＵｘｘＵＣベクター、および（３）ＴｉＤ成分をコードしているプラスミドＤＮＡを含む全２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いた。ＮａｎｏＬｕｃおよびＦｌｕｃルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの３日後に、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ホタル（Ｆｌｕｃ）活性を内部対照として用いた。ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比を各サンプルについて計算し、非標的化ｇＲＮＡでトランスフェクトした対照サンプルのＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比と比較した。相対的ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ活性を用いて、ｇＲＮＡ活性を評価した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
（４）長鎖ＤＮＡ領域（ｌｏｎｇ ｒａｎｇｅ）ＰＣＲによるＤＮＡ欠失分析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＤＮＡ欠失を検出するために、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲおよび長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ産物のプールのクローニングを行った。最初に、Ｇｅｎｏ Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｖｉｏｇｅｎｅ－ＢｉｏＴｅｋ， Ｔａｉｗａｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出した。次に、ネステッドＰＣＲを行って、長鎖ＤＮＡ領域を特異的に増幅した。まず、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用い、種々の長さ（１０ｋｂ～１９ｋｂ）の標的ＤＮＡ領域を増幅するように設計された、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ用の特異的プライマーセットを用いて、標的ＤＮＡ領域を増幅した。最初のＰＣＲ反応は、ＫＯＤ ＯＮＥ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）を用いて、下記の条件下で行った。１０秒９８℃、５秒６０℃および５０秒（アンプリコン：１５－２０ｋｂ）または１５０秒（アンプリコン：１０－１５ｋｂ）または２００秒（アンプリコン：＜１０ｋｂ）６８℃を３５サイクル。次いで、ＰＣＲ産物を１００～１０，０００倍に希釈し、ネステッドＰＣＲの鋳型として用いた。ネステッドＰＣＲは、また、上記と同じ条件下で行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）での染色によって視覚化した。ネステッドＰＣＲ産物をプールし、Ｍｏｎｏｆａｓ（登録商標）ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊａｐａｎ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の精製混合物を、Ｍｉｇｈｔｙ ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ， Ｊａｐａｎ）を用いてｐＭＤ２０－Ｔベクター中にクローン化した。クローンをピックアップし、Ｍ１３ ＵｎｉおよびＭ１３ ＲＶプライマーを用いてサンガー配列決定した。サンガー配列決定の結果をＢＬＡＴＮサーチおよびＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて分析して、ＤＮＡ欠失を同定した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＤＮＡ欠失を検出するために、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲおよび長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ産物のプールのクローニングを行った。最初に、Ｇｅｎｏ Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｖｉｏｇｅｎｅ－ＢｉｏＴｅｋ， Ｔａｉｗａｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出した。次に、ネステッドＰＣＲを行って、長鎖ＤＮＡ領域を特異的に増幅した。まず、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用い、種々の長さ（１０ｋｂ～１９ｋｂ）の標的ＤＮＡ領域を増幅するように設計された、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ用の特異的プライマーセットを用いて、標的ＤＮＡ領域を増幅した。最初のＰＣＲ反応は、ＫＯＤ ＯＮＥ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）を用いて、下記の条件下で行った。１０秒９８℃、５秒６０℃および５０秒（アンプリコン：１５－２０ｋｂ）または１５０秒（アンプリコン：１０－１５ｋｂ）または２００秒（アンプリコン：＜１０ｋｂ）６８℃を３５サイクル。次いで、ＰＣＲ産物を１００～１０，０００倍に希釈し、ネステッドＰＣＲの鋳型として用いた。ネステッドＰＣＲは、また、上記と同じ条件下で行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）での染色によって視覚化した。ネステッドＰＣＲ産物をプールし、Ｍｏｎｏｆａｓ（登録商標）ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊａｐａｎ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の精製混合物を、Ｍｉｇｈｔｙ ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ， Ｊａｐａｎ）を用いてｐＭＤ２０－Ｔベクター中にクローン化した。クローンをピックアップし、Ｍ１３ ＵｎｉおよびＭ１３ ＲＶプライマーを用いてサンガー配列決定した。サンガー配列決定の結果をＢＬＡＴＮサーチおよびＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて分析して、ＤＮＡ欠失を同定した。
実施例１：Ｃａｓ１０ｄ配列中のＣａｓ１１ｅ様配列（Ｃａｓ１１ｄ）の同定
Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓエフェクタータンパク質のうち、Ｃａｓ１０ｄ配列についてＣＬＡＳＴＡＬ Ｗプログラムを用いて、ＣＲＩＳＰＲ ｔｙｐｅ Ｉ－ＥのＣａｓ１１ｅ配列（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｉｍｉ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ （Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ） ＰＣＣ７４２４、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｆｒａｎｋｉａ ａｌｎｉ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｓｅｔａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ由来）とのアラインメント解析を行ったところ、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端領域にはＣａｓ１１ｅに特徴的なα－ヘリックス領域が数カ所保存されていることが見出された（図１）。さらに、各種ｔｙｐｅ Ｉ－Ｄ Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ＰＣＣ６３０３ （Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ｐａｒｉｅｔｉｎａ）、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ＰＣＣ７４２４ （Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｌａｕｅｅｎｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ． ＰＣＣ７４２８、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ ＰＣＣ７４１８、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ． ＮＩＥＳ－２１１１、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ． ＰＣＣ７１１６、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３由来）をＣａｓ１１ｅとアラインメント解析により比較した。
Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓエフェクタータンパク質のうち、Ｃａｓ１０ｄ配列についてＣＬＡＳＴＡＬ Ｗプログラムを用いて、ＣＲＩＳＰＲ ｔｙｐｅ Ｉ－ＥのＣａｓ１１ｅ配列（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｉｍｉ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ （Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ） ＰＣＣ７４２４、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｆｒａｎｋｉａ ａｌｎｉ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｓｅｔａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ由来）とのアラインメント解析を行ったところ、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端領域にはＣａｓ１１ｅに特徴的なα－ヘリックス領域が数カ所保存されていることが見出された（図１）。さらに、各種ｔｙｐｅ Ｉ－Ｄ Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ＰＣＣ６３０３ （Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ｐａｒｉｅｔｉｎａ）、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ＰＣＣ７４２４ （Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｌａｕｅｅｎｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ． ＰＣＣ７４２８、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ ＰＣＣ７４１８、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ． ＮＩＥＳ－２１１１、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ． ＰＣＣ７１１６、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３由来）をＣａｓ１１ｅとアラインメント解析により比較した。
実施例２：Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒ（Ｃａｓ１１ｄ）の発現が細胞中でのゲノム編集活性に及ぼす影響の解析
Ｃａｓ１１ｄの発現が真核生物におけるＴｉＤのゲノム編集活性に及ぼす影響を解析するため、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＣ９８０８株のＣａｓ１０ｄ遺伝子から、Ｃａｓ１１ｄ配列に相当すると考えられる遺伝子配列領域（Ｃａｓ１０ｄ遺伝子のストップコドンより４８３ｂ上流まで）をクローン化し動物細胞発現ベクターを構築し、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターとした。Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ及びｇＲＮＡの各発現ベクターと共に、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターを同時にＨＥＫ２９３細胞に導入し、Ｌｕｃレポーターアッセイによりゲノム編集活性を解析した。終止コドンによって分離される３００ｂｐ相同性アームならびにＴｉＤ標的部位を含有するヒトＡＡＶＳ１遺伝子フラグメントを含有するＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを組換えレポーターとして用いた。各単一Ｃａｓ発現ベクター、ＴｉＤ ｃｒＲＮＡ発現ベクター、および標的配列が導入されたＬＵＣレポーターベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトし、トランスフェクション後７２時間、ルミネッセンスによりエンドヌクレアーゼ切断を検出した。
Ｃａｓ１１ｄの発現が真核生物におけるＴｉＤのゲノム編集活性に及ぼす影響を解析するため、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＣ９８０８株のＣａｓ１０ｄ遺伝子から、Ｃａｓ１１ｄ配列に相当すると考えられる遺伝子配列領域（Ｃａｓ１０ｄ遺伝子のストップコドンより４８３ｂ上流まで）をクローン化し動物細胞発現ベクターを構築し、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターとした。Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ及びｇＲＮＡの各発現ベクターと共に、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターを同時にＨＥＫ２９３細胞に導入し、Ｌｕｃレポーターアッセイによりゲノム編集活性を解析した。終止コドンによって分離される３００ｂｐ相同性アームならびにＴｉＤ標的部位を含有するヒトＡＡＶＳ１遺伝子フラグメントを含有するＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを組換えレポーターとして用いた。各単一Ｃａｓ発現ベクター、ＴｉＤ ｃｒＲＮＡ発現ベクター、および標的配列が導入されたＬＵＣレポーターベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトし、トランスフェクション後７２時間、ルミネッセンスによりエンドヌクレアーゼ切断を検出した。
その結果、Ｃａｓ１１ｄを別途発現させる事によって、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ及びｃｒＲＮＡの各発現ベクターによるゲノム編集活性と比較し、２．５倍の活性上昇が示された（図２）。また、標的化に用いるｃｒＲＮＡ長について、短縮形である３０塩基長の標的配列（配列番号２３：５’－ＣＣＴＡＧＴＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡ－３’）を標的とするｃｒＲＮＡの場合でもＣａｓ１１ｄの発現効果が認められた（図２）。
実施例３：Ｃａｓ１０ｄ Ｃ－ｔｅｒ（Ｃａｓ１１ｄ）の発現による、ヒトゲノム編集の解析
Ｃａｓ１１ｄの発現効果として、ヒトゲノム上の標的にどのような変異が誘導されるか解析した。Ｌｕｃレポーターアッセイに用いたヒトＡＡＶＳ遺伝子の標的化ｇＲＮＡ ＡＡＶＳ ＧＴＣ＿７０－１０７（３５ｂ）を組み込んだｇＲＮＡ発現ベクターおよび各単一Ｃａｓ発現ベクターと共に、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。ＡＡＶＳ標的部位付近を含む１０－１９ｋｂを増幅するプライマーセットを用いて、ＴｉＤベクター導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全ＤＮＡから、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物をクローン化し、サンガー法によって配列決定した。
Ｃａｓ１１ｄの発現効果として、ヒトゲノム上の標的にどのような変異が誘導されるか解析した。Ｌｕｃレポーターアッセイに用いたヒトＡＡＶＳ遺伝子の標的化ｇＲＮＡ ＡＡＶＳ ＧＴＣ＿７０－１０７（３５ｂ）を組み込んだｇＲＮＡ発現ベクターおよび各単一Ｃａｓ発現ベクターと共に、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。ＡＡＶＳ標的部位付近を含む１０－１９ｋｂを増幅するプライマーセットを用いて、ＴｉＤベクター導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全ＤＮＡから、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物をクローン化し、サンガー法によって配列決定した。
プライマーとして、Ｆ１（配列番号２４：５’－ＣＴＴＡＧＣＡＴＡＡＴＧＴＣＣＴＣＡＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＣ－３’）およびＲ１（配列番号２５：５’－ＧＡＴＡＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧ－３’）、ならびにプライマーＦ２（配列番号２６：５’－ＧＧＧＴＣＣＡＡＧＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＡＴＣＣ－３’）およびＲ２（配列番号２７：５’－ＡＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＴＡＡＡＣＡＡＣＡＴＡＣＡＴＣ－３’）を用いた。
まず図３Ａに示すプライマーＦ１およびＲ１を用いてＰＣＲを行い得られた増幅ＤＮＡを、これを１ｓｔ－ＰＣＲ産物とした。次に１ｓｔ－ＰＣＲ産物を２０倍～５０倍希釈し、図３Ａに示すプライマーＦ２およびＲ２を用いてＰＣＲを行い、電気泳動解析を行った。結果を図３Ｂに示す。レーン１はＴｉＤを発現させない野生型ＨＥＫ２９３細胞由来ＤＮＡを用いたＰＣＲ産物である。レーン２および３はＣａｓ１１ｄ発現ベクターを含まないＴｉＤを導入した実験の結果であり、レーン２は標的配列の代わりに非特異的な配列（配列番号２８：５’－ＡＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＴＧＣＣＣＣＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＴ－３’）に対応する配列を含むｇＲＮＡ用い、レーン３は標的配列ＡＡＶＳ ＧＴＣ＿７０－１０７（３５ｂ）に対応する配列を含むｇＲＮＡを用いた結果である。レーン４および５はＣａｓ１１ｄ発現ベクターを含むＴｉＤを導入した実験の結果であり、レーン４は、標的配列の代わりに非特異的な配列に対応する配列を含むｇＲＮＡを用い、レーン５はＡＡＶＳ ＧＴＣ＿７０－１０７（３５ｂ）に対応する配列を含むｇＲＮＡを用いた結果である。
その結果、ＴｉＤの導入により、標的部位で６ｋｂを超える長鎖領域欠失が生じた。興味深いことに、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターを導入した実験区では、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターを含まない実験区に比べ、より長い欠失が生じることがシーケンス解析の結果から明らかとなった（図３Ｃ，Ｄ）。
SEQ ID NO:1; Microcystis aeruginosa Cas3d amino acid sequence
SEQ ID NO:2; Microcystis aeruginosa Cas5d amino acid sequence
SEQ ID NO:3; Microcystis aeruginosa Cas6d amino acid sequence
SEQ ID NO:4; Microcystis aeruginosa Cas7d amino acid sequence
SEQ ID NO:5; Microcystis aeruginosa Cas10d amino acid sequence
SEQ ID NO:6; Microcystis aeruginosa Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:7; TiDcrRNA containing repeat (37b) and spacer (35b of N). N is any nucleotide constituting a sequence that forms base pairs with a target nucleotide sequence
SEQ ID NO:8; Anabaena cylindrica Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:9; Calothrix PCC6303 (Calothrix parietina) Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:10; Crinalium epipsammum Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:11; Cyanothece PCC7424 (Gloeothece citriformis) Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:12; Gloeobacter kilaueensis Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:13; Gloeocapsa sp. PCC7428 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:14; Halothece PCC7418 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:15; Methanospirillum hungatei Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:16; Nostoc sp. NIES-2111 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:17; Rivularia sp. PCC7116 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:18; Stanieria cyanosphaera Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:19; Synechocystis sp. PCC6803 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:20; Target sequence (35b)
SEQ ID NO:21; Monopartite nuclear localizing signal (NLS) amino acid sequence
SEQ ID NO:22; DNA fragment for pre-mature crRNA
SEQ ID NO:23; Target sequence (30b)
SEQ ID NO:24; Primer F1
SEQ ID NO:25; Primer R1
SEQ ID NO:26; Primer F2
SEQ ID NO:27; Primer R2
SEQ ID NO:28; Non-specific sequence
SEQ ID NO:29; Escherichia coli Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:30; Acetobacter pasteurianus Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:31; Acidimicrobium ferrooxidans Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:32; Amycolatopsis mediterranei Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:33; Bifidobacterium animalis Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:34; Cellulomonas fimi Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:35; Coriobacterium glomerans Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:36; Cyanothece (Gloeothece citriformis) PCC7424 Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:37; Desulfococcus oleovorans Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:38; Erwinia amylovora Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:39; Frankia alni Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:40; Geobacter sulfurreducens Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:41; Kitasatospora setae Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:42; Lactobacillus fermentum Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:2; Microcystis aeruginosa Cas5d amino acid sequence
SEQ ID NO:3; Microcystis aeruginosa Cas6d amino acid sequence
SEQ ID NO:4; Microcystis aeruginosa Cas7d amino acid sequence
SEQ ID NO:5; Microcystis aeruginosa Cas10d amino acid sequence
SEQ ID NO:6; Microcystis aeruginosa Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:7; TiDcrRNA containing repeat (37b) and spacer (35b of N). N is any nucleotide constituting a sequence that forms base pairs with a target nucleotide sequence
SEQ ID NO:8; Anabaena cylindrica Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:9; Calothrix PCC6303 (Calothrix parietina) Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:10; Crinalium epipsammum Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:11; Cyanothece PCC7424 (Gloeothece citriformis) Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:12; Gloeobacter kilaueensis Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:13; Gloeocapsa sp. PCC7428 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:14; Halothece PCC7418 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:15; Methanospirillum hungatei Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:16; Nostoc sp. NIES-2111 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:17; Rivularia sp. PCC7116 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:18; Stanieria cyanosphaera Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:19; Synechocystis sp. PCC6803 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:20; Target sequence (35b)
SEQ ID NO:21; Monopartite nuclear localizing signal (NLS) amino acid sequence
SEQ ID NO:22; DNA fragment for pre-mature crRNA
SEQ ID NO:23; Target sequence (30b)
SEQ ID NO:24; Primer F1
SEQ ID NO:25; Primer R1
SEQ ID NO:26; Primer F2
SEQ ID NO:27; Primer R2
SEQ ID NO:28; Non-specific sequence
SEQ ID NO:29; Escherichia coli Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:30; Acetobacter pasteurianus Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:31; Acidimicrobium ferrooxidans Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:32; Amycolatopsis mediterranei Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:33; Bifidobacterium animalis Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:34; Cellulomonas fimi Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:35; Coriobacterium glomerans Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:36; Cyanothece (Gloeothece citriformis) PCC7424 Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:37; Desulfococcus oleovorans Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:38; Erwinia amylovora Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:39; Frankia alni Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:40; Geobacter sulfurreducens Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:41; Kitasatospora setae Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:42; Lactobacillus fermentum Cas11e amino acid sequence
Claims (23)
- 標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞（但し、ヒトの生殖細胞、ヒトの受精卵、およびヒトの胚細胞を除く）中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法、
但し、ヒトの生体内における方法を除く。 - 標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、細胞（但し、ヒトの生殖細胞、ヒトの受精卵、およびヒトの胚細胞を除く）中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法、
但し、ヒトの生体内における方法を除く。 - 改変が塩基の欠失、挿入、又は置換である、請求項２記載の方法。
- 標的遺伝子の転写を制御する方法であって、細胞（但し、ヒトの生殖細胞、ヒトの受精卵、およびヒトの胚細胞を除く）中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法、
但し、ヒトの生体内における方法を除く。 - 標的遺伝子の転写を制御する方法であって、細胞（但し、ヒトの生殖細胞、ヒトの受精卵、およびヒトの胚細胞を除く）中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法、
但し、ヒトの生体内における方法を除く。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
- （ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ
を含む複合体。 - Ｃａｓ３ｄをさらに含む、請求項７記載の複合体。
- （ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡまたは該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含むベクター。 - Ｃａｓ３ｄをコードする核酸をさらに含む、請求項９記載のベクター。
- （ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端側から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡまたは該ｃｒＲＮＡをコードする核酸、または
前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の核酸およびＣａｓ３ｄをコードする核酸
が２以上のベクターに含まれる、該２つ以上のベクターを含む組成物。 - 請求項７または８記載の複合体をコードするＤＮＡ分子。
- 標的ヌクレオチド配列を標的化するためのキットであって、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含むキット。 - 標的ヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含むキット。 - ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを細胞（但し、ヒトの生殖細胞、ヒトの受精卵、およびヒトの胚細胞を除く）に導入することを含む標的ヌクレオチド配列の標的化において標的化効率を改善する方法であって、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を用いることを含む方法、
但し、ヒトの生体内における方法を除く。 - ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを細胞（但し、ヒトの生殖細胞、ヒトの受精卵、およびヒトの胚細胞を除く）に導入することを含む標的ヌクレオチド配列の改変において改変効率を改善する方法であって、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を用いることを含む方法、
但し、ヒトの生体内における方法を除く。 - ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の標的化において標的化効率を改善するための組成物であって、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物。
- ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の改変において改変効率を改善するための組成物であって、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物。
- 細胞（但し、ヒトの生殖細胞、ヒトの受精卵、およびヒトの胚細胞を除く）中に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された細胞の製造方法、
但し、ヒトの生体内における方法を除く。 - 請求項１９に記載の方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された植物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された植物の製造方法。
- 請求項１９に記載の方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物の製造方法。
- 標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を接触させることを含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、
（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列からなるポリペプチドであって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端から１３５～１７０アミノ酸を含むポリペプチド、および
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を接触させことを含む方法。
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