JP7489112B2 - Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的配列改変技術 - Google Patents
Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的配列改変技術 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7489112B2 JP7489112B2 JP2021505164A JP2021505164A JP7489112B2 JP 7489112 B2 JP7489112 B2 JP 7489112B2 JP 2021505164 A JP2021505164 A JP 2021505164A JP 2021505164 A JP2021505164 A JP 2021505164A JP 7489112 B2 JP7489112 B2 JP 7489112B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna encoding
- sequence
- dna
- encoding
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title claims description 18
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 title claims description 13
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 title claims 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 397
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 211
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 188
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 153
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 153
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 128
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 104
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 85
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 73
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 73
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 73
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 57
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 57
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 56
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 25
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 16
- 230000002028 premature Effects 0.000 claims description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 claims description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 8
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 claims 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 241000069157 Miconia aeruginosa Species 0.000 claims 1
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 claims 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 57
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 32
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 32
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 30
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 29
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 23
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 21
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 21
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 21
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 21
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 241000192710 Microcystis aeruginosa Species 0.000 description 15
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108700043045 nanoluc Proteins 0.000 description 9
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 8
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 8
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 7
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 6
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 101001000998 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Proteins 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108700004205 Arabidopsis HSP18.2 Proteins 0.000 description 2
- 101100290380 Caenorhabditis elegans cel-1 gene Proteins 0.000 description 2
- -1 Cas3 Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010437 HD domains Human genes 0.000 description 2
- 108050001906 HD domains Proteins 0.000 description 2
- 101150053283 IAA9 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102100035620 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001135192 Acetohalobium arabaticum Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 241000147155 Ammonifex degensii Species 0.000 description 1
- 241000192537 Anabaena cylindrica Species 0.000 description 1
- 101100365087 Arabidopsis thaliana SCRA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100365680 Arabidopsis thaliana SGT1B gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 238000010440 CRISPR–Cas3 gene editing Methods 0.000 description 1
- 241000511679 Caldicellulosiruptor lactoaceticus Species 0.000 description 1
- 241000920564 Caldilinea aerophila Species 0.000 description 1
- 101100417900 Clostridium acetobutylicum (strain ATCC 824 / DSM 792 / JCM 1419 / LMG 5710 / VKM B-1787) rbr3A gene Proteins 0.000 description 1
- 241000973888 Crinalium Species 0.000 description 1
- 241000159506 Cyanothece Species 0.000 description 1
- 241001263141 Cylindrospermum stagnale Species 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 241001152403 Haloquadratum walsbyi Species 0.000 description 1
- 241000204930 Halorubrum lacusprofundi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 241001265502 Methanocaldococcus vulcanius Species 0.000 description 1
- 241000205263 Methanospirillum hungatei Species 0.000 description 1
- 241000074852 Microcystis aeruginosa PCC 9808 Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010068052 Mosaicism Diseases 0.000 description 1
- 241000908263 Natrialba asiatica Species 0.000 description 1
- 241000204971 Natronomonas pharaonis Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000424623 Nostoc punctiforme Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000248493 Oscillatoria acuminata Species 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101150034686 PDC gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 240000009164 Petroselinum crispum Species 0.000 description 1
- 241000122845 Phormidesmis priestleyi Species 0.000 description 1
- 241001632455 Picrophilus torridus Species 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 101150105073 SCR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100134054 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NTG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 235000002560 Solanum lycopersicum Nutrition 0.000 description 1
- 241000589887 Spirochaeta thermophila Species 0.000 description 1
- 241001464990 Stanieria Species 0.000 description 1
- 241000205098 Sulfolobus acidocaldarius Species 0.000 description 1
- 241000167564 Sulfolobus islandicus Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 241000192581 Synechocystis sp. Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 241001673931 Thermacetogenium phaeum Species 0.000 description 1
- 241000078013 Trichormus variabilis Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108091026822 U6 spliceosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010864 dual luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 108010025678 empty spiracles homeobox proteins Proteins 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000004345 fruit ripening Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000011197 perejil Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010379 pull-down assay Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 102200111112 rs397514590 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 101150068906 snr-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）タイプＩ－Ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列を特異的に改変する方法、および該方法に用いられるＣａｓ（CRISPR-associated）タンパク質およびｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）を含むキットに関する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ウイルス、プラスミドおよびその他の外来遺伝子エレメントから細菌および古細菌を保護する、細菌および古細菌に見られる獲得免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、該システムを構成しているＣａｓタンパク質および分子メカニズムの違いによって、２つのクラス、６つの異なるタイプ（Ｉ～ＶＩ）、および少なくとも１６種類のサブタイプに分類される。
タイプＩおよびＩＩシステムのメカニズムでは、ｃｒＲＮＡとＣａｓエフェクタータンパク質との複合体が、外来ＤＮＡ中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短い（典型的には３～５塩基長の）配列エレメントを認識する。タイプＩまたはＩＩ ｃｒＲＮＡとＣａｓエフェクタータンパク質との複合体は、ＰＡＭ認識後、局所的にＤＮＡ対合を崩壊してＲ－ループ構造を形成し、ｃｒＲＮＡガイドエレメントが相補的な標的鎖と塩基対を形成して非標的ＤＮＡ鎖と置き換わる。該ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ複合体による二本鎖ＤＮＡ標的の結合および巻き戻しが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ヌクレアーゼなどのタイプ特異的ＣａｓエフェクターヌクレアーゼによるＤＮＡ切断および分解に必要とされる。
ＣＲＩＳＰＲタイプＩには、種々のサブタイプが存在する。クラス１システムには、Ｃａｓｃａｄｅ（CRISPR-associated-complex for antiviral defense）と呼ばれる、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７およびＣａｓ８などの標的認識モジュールと、Ｃａｓ３などのＤＮＡ切断モジュールが存在する（非特許文献１）。ゲノム編集技術において、クラス１ ＣＲＩＳＰＲシステムは、クラス２よりも一般的ではないが、ゲノム編集ツールとして、例えば長い領域のゲノム欠失および長いｇＲＮＡ配列を包含する多様な変異プロフィールなど、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１と比べていくつかの利点を有する可能性が示唆された（非特許文献１）。今までに研究されたクラス１ タイプＩ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムでは、２－３００ｂから１００ｋｂの塩基欠失が主にＰＡＭ配列の５’上流側に生じることが報告された（非特許文献１）。
クラス１システム内のゲノム編集ツールの新たな候補を見出すために、発明者らは以前に、ＣＲＩＳＰＲクラス１タイプＩのサブタイプ：タイプＩ－Ｄ（以下、「ＴｉＤ」いう）システムをコードするＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座を同定し、該システムがＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの５つのＣａｓタンパク質を含むことを見出した（特許文献１）。しかしながら、ＴｉＤシステムがどのようにＤＮＡを分解するのかは不明であった。
Dolan, A.E. et al. Mol Cell 74, 936-950 (2019)
本発明は、ＴｉＤシステムの作用機序を解明し、それにより、ＴｉＤシステムを利用した、より効率的な標的配列改変方法を開発することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＣＲＩＳＰＲ ＴｉＤシステムは、Ｃａｓ３エフェクタータンパク質（Ｃａｓ３ｄ）を含有するが、該タンパク質はヌクレアーゼドメインを欠き、その代わり、Ｃａｓ１０ｄが典型的なヌクレアーゼドメインを有することを見出した。Ｃａｓ１０ｄは、他のＣＲＩＳＰＲシステムでは見られないＴｉＤに特有のエフェクタータンパク質である。さらに、特定の類似配列を有しない標的配列を選択することによって、ＴｉＤシステムのオフターゲット効果を減少させることができることを見出した。
したがって、本発明は、下記の態様を提供する。
［１］細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、該細胞に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、方法、
［２］細胞内の標的遺伝子の発現を抑制するための方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列である、［１］記載の方法、
［３］前記Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［１］または［２］記載の方法、
［４］前記核移行シグナルが、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナルである、［３］記載の方法、
［５］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記第一のベクターが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端側に、１個のモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されているか、あるいは２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［４］記載の方法、
［６］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記第一のベクターが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端側及び３’末端側の両方に、バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［４］記載の方法、
［７］前記第二のベクターがＣａｓ７ｄをコードするＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に、２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［５］又は［６］記載の方法、
［８］前記第一の調節エレメントおよび／または前記第二の調節エレメントが、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター又はＣＡＧキメラ合成プロモーターである、［１］～［７］のいずれか１項記載の方法、
［９］前記ベクター系が第三ないし第五のベクターをさらに含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々に第一ないし第五のベクターに含まれる、［１］～［８］のいずれか１項記載の方法、
［１０］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡが発現カセット系に含まれ、前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ及びＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、前記第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含み、かつ、前記第一の発現カセット及び前記第二の発現カセットが１つのベクターに搭載されている、［１］～［４］のいずれか１項記載の方法、
［１１］前記ｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞への導入がベクターを介して行われる、［１］～［１０］のいずれか１項記載の方法、
［１２］前記ｃｒＲＮＡがプレ成熟型ｃｒＲＮＡである、［１］～［１１］のいずれか１項記載の方法、
［１３］前記Ｃａｓ３ｄ、前記Ｃａｓ５ｄ、前記Ｃａｓ６ｄ、前記Ｃａｓ７ｄ及び前記Ｃａｓ１０ｄがＭ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のものである、［１］～［１２］のいずれか１項記載の方法、
［１４］前記細胞が真核細胞である、［１］～［１３］のいずれか１項記載の方法、
［１５］改変が塩基の欠失、挿入、又は置換である、［１］～［１４］のいずれか１項記載の方法、
［１６］改変が数キロベース～数十キロベースの欠失である、［１５］記載の方法、
［１７］細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含み、
前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、キット、
［１８］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記ベクター系が第三ないし第五のベクターをさらに含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々に第一ないし第五のベクターに含まれる、［１７］記載のキット、
［１９］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡが発現カセット系に含まれ、前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ及びＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、前記第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含む、［１７］記載のキット、
［２０］細胞内の標的ヌクレオチド配列を特異的に標的化する方法であって、該細胞に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ及びＣａｓ７ｄ、又はこれらのタンパク質をコードする核酸、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、方法、
［２１］細胞内の標的ヌクレオチド配列を特異的に改変する方法であって、該細胞に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ及びＣａｓ１０ｄ、又はこれらのタンパク質をコードする核酸、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、方法、および
［２２］前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、請求項２０又は２１記載の方法。
［１］細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、該細胞に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、方法、
［２］細胞内の標的遺伝子の発現を抑制するための方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列である、［１］記載の方法、
［３］前記Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［１］または［２］記載の方法、
［４］前記核移行シグナルが、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナルである、［３］記載の方法、
［５］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記第一のベクターが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端側に、１個のモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されているか、あるいは２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［４］記載の方法、
［６］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記第一のベクターが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端側及び３’末端側の両方に、バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［４］記載の方法、
［７］前記第二のベクターがＣａｓ７ｄをコードするＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に、２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［５］又は［６］記載の方法、
［８］前記第一の調節エレメントおよび／または前記第二の調節エレメントが、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター又はＣＡＧキメラ合成プロモーターである、［１］～［７］のいずれか１項記載の方法、
［９］前記ベクター系が第三ないし第五のベクターをさらに含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々に第一ないし第五のベクターに含まれる、［１］～［８］のいずれか１項記載の方法、
［１０］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡが発現カセット系に含まれ、前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ及びＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、前記第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含み、かつ、前記第一の発現カセット及び前記第二の発現カセットが１つのベクターに搭載されている、［１］～［４］のいずれか１項記載の方法、
［１１］前記ｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞への導入がベクターを介して行われる、［１］～［１０］のいずれか１項記載の方法、
［１２］前記ｃｒＲＮＡがプレ成熟型ｃｒＲＮＡである、［１］～［１１］のいずれか１項記載の方法、
［１３］前記Ｃａｓ３ｄ、前記Ｃａｓ５ｄ、前記Ｃａｓ６ｄ、前記Ｃａｓ７ｄ及び前記Ｃａｓ１０ｄがＭ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のものである、［１］～［１２］のいずれか１項記載の方法、
［１４］前記細胞が真核細胞である、［１］～［１３］のいずれか１項記載の方法、
［１５］改変が塩基の欠失、挿入、又は置換である、［１］～［１４］のいずれか１項記載の方法、
［１６］改変が数キロベース～数十キロベースの欠失である、［１５］記載の方法、
［１７］細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含み、
前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、キット、
［１８］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記ベクター系が第三ないし第五のベクターをさらに含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々に第一ないし第五のベクターに含まれる、［１７］記載のキット、
［１９］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡが発現カセット系に含まれ、前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ及びＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、前記第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含む、［１７］記載のキット、
［２０］細胞内の標的ヌクレオチド配列を特異的に標的化する方法であって、該細胞に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ及びＣａｓ７ｄ、又はこれらのタンパク質をコードする核酸、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、方法、
［２１］細胞内の標的ヌクレオチド配列を特異的に改変する方法であって、該細胞に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ及びＣａｓ１０ｄ、又はこれらのタンパク質をコードする核酸、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、方法、および
［２２］前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、請求項２０又は２１記載の方法。
本発明によれば、特定のＤＮＡを標的化するように操作されたＴｉＤ ｃｒＲＮＡを含むＴｉＤシステムを用いることにより、細胞、好ましくは動物および植物細胞において効率的に部位特異的変異を誘導することができる。驚くべきことに、本発明によれば、ＴｉＤシステムのＣａｓエフェクタータンパク質の発現量を向上させることができ、短い領域の挿入および／または欠失を誘導するだけでなく、数キロベースないし数十キロベースの長い領域の塩基欠失および二方向性（bi-directional）の塩基欠失も誘導することができる。さらに、ＴｉＤシステムを用いると、生じた変異トランスジェニック生物における所望の表現型が、次世代に遺伝的に伝達される。さらに、本発明の方法によれば、オフターゲット効果を抑制した、標的配列の特異的な標的化および改変がもたらされる。したがって、本発明は、ＴｉＤシステムのＣＲＩＳＰＲエフェクターモジュール経路を用いる、生物、特に真核生物のための、新規なゲノム編集ツールを提供する。
本発明で使用されるＴｉＤシステムは、具体的には、ＴｉＤ Ｃａｓタンパク質のうち、Ｃａｓエフェクタータンパク質として、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄと、ＴｉＤ ｃｒＲＮＡとを含む。ＴｉＤシステムにおいて、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄは標的認識モジュール（Ｃａｓｃａｄｅ）を構成し、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄはポリヌクレオチド切断モジュールを構成することが知られていた（特許文献１）。ＴｉＤシステムにおいて、ＴｉＤ ｃｒＲＮＡは、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を含む。上記５つのＣａｓタンパク質とＴｉＤ ｃｒＲＮＡは複合体を形成して、標的ヌクレオチド配列を標的化し、改変する。
本発明によれば、ＴｉＤシステムの新規なＣａｓエフェクタータンパク質の機能を探求した結果、驚くべきことに、切断モジュールの構成要素のうちＣａｓ１０ｄがポリヌクレオチド分解作用（ヌクレアーゼ活性）を有し、Ｃａｓ３ｄはヌクレアーゼ活性を有しないことが明らかにされた。すなわち、ＴｉＤシステムでは、ＴｉＤ ｃｒＲＮＡと標的認識モジュールとが標的ヌクレオチド配列を標的化して、ポリヌクレオチド切断モジュールを該標的ヌクレオチド配列付近に導き、Ｃａｓ１０ｄの作用により該標的ヌクレオチド配列が切断される。
したがって、本発明は、ＴｉＤシステムを標的細胞に導入することにより、該細胞中の標的ヌクレオチド配列を改変する方法（以下、「本発明の標的配列改変方法」ともいう）、および該方法に使用されるキット（以下、「本発明のキット」ともいう）を提供する。
さらに本発明では、ＴｉＤシステムのオフターゲット効果に関与する標的配列における塩基の位置を同定した。したがって、本発明は、標的ヌクレオチド配列に対して、特定の位置に変異を含む類似配列が存在しない標的配列を設計することにより、標的配列を特異的に標的化する方法および標的配列を特異的に改変する方法（以下、「本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列ターゲティング方法」および「本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法」という）を提供する。
（１）細胞
本発明において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されない。例えば、細菌、古細菌、真菌類（例えば、糸状菌、酵母等）、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、非ヒト細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞等）が挙げられる。好ましくは、真核細胞が使用される。本明細書において使用される場合、「細胞」とは、生体から単離された細胞、生体内（例えば、動物体または植物の体内）に存在する細胞、または生体（例えば、動物体、または植物体）のいずれも包含する。本発明の方法は、生体から単離された細胞、生体内に存在する細胞、または生体のいずれの細胞に適用してもよい。例えば、ヒト以外の動物の体内に存在する細胞またはヒト以外動物体に適用してもよい。
本発明において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されない。例えば、細菌、古細菌、真菌類（例えば、糸状菌、酵母等）、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、非ヒト細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞等）が挙げられる。好ましくは、真核細胞が使用される。本明細書において使用される場合、「細胞」とは、生体から単離された細胞、生体内（例えば、動物体または植物の体内）に存在する細胞、または生体（例えば、動物体、または植物体）のいずれも包含する。本発明の方法は、生体から単離された細胞、生体内に存在する細胞、または生体のいずれの細胞に適用してもよい。例えば、ヒト以外の動物の体内に存在する細胞またはヒト以外動物体に適用してもよい。
（２）Ｃａｓエフェクタータンパク質および該タンパク質をコードする核酸
本発明で使用されるＣａｓエフェクタータンパク質は、ＴｉＤのＣａｓタンパク質のうち、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄを含む。Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ Ｓｐ．、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｓｔａｇｎａｌｅ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ ｗａｌｓｂｙｉ、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｖｕｌｃａｎｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎａｔｒｉａｌｂａ ａｓｉａｔｉｃａ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ ｐｈａｒａｏｎｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｐｈｏｒｍｉｄｅｓｍｉｓ ｐｒｉｅｓｔｌｅｙｉ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ Ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ ｐｅｎｄｅｎｓなどの菌株由来のものであってもよい。上記Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ等の公開されたデータベースから入手可能である。また、メタゲノム解析などにより得られた微生物ゲノムデータからＢＬＡＳＴプログラムを利用することで、新規の微生物種からの配列取得も可能である。
本発明で使用されるＣａｓエフェクタータンパク質は、ＴｉＤのＣａｓタンパク質のうち、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄを含む。Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ Ｓｐ．、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｓｔａｇｎａｌｅ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ ｗａｌｓｂｙｉ、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｖｕｌｃａｎｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎａｔｒｉａｌｂａ ａｓｉａｔｉｃａ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ ｐｈａｒａｏｎｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｐｈｏｒｍｉｄｅｓｍｉｓ ｐｒｉｅｓｔｌｅｙｉ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ Ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｐｈａｅｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ ｐｅｎｄｅｎｓなどの菌株由来のものであってもよい。上記Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ等の公開されたデータベースから入手可能である。また、メタゲノム解析などにより得られた微生物ゲノムデータからＢＬＡＳＴプログラムを利用することで、新規の微生物種からの配列取得も可能である。
上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、例えば、アミノ酸配列情報を基に、該核酸を導入する宿主細胞における翻訳に最適化されたコドンを選択し、化学合成等により構築してもよい。宿主細胞において使用頻度の高いコドンを使用することにより、タンパク質の発現量の増加させることができる。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各Ｃａｓタンパク質またはそれらをコードする核酸は、本発明の効果が達成されるかぎりにおいて、すなわち、上記Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡとの複合体が標的配列を標的化または改変するかぎりにおいて、１以上のアミノ酸変異または１以上のヌクレオチド変異を有していてもよい。
例えば、上記Ｃａｓタンパク質の例として、限定するものではないが、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（以下、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａという）由来のＣａｓ３ｄ（配列番号１）、Ｃａｓ５ｄ（配列番号２）、Ｃａｓ６ｄ（配列番号３）、Ｃａｓ７ｄ（配列番号４）、およびＣａｓ１０ｄ（配列番号５）が挙げられる。したがって、本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。
また、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。上記のいずれかの核酸から発現するＣａｓタンパク質は、上記の他の核酸から発現するＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成した場合に標的配列を標的化または改変する能力を有するものである。
ＴｉＤシステムを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の末端に核移行シグナルをコードするヌクレオチド配列（以下、「核移行シグナル配列」という）が付加される。核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、導入対象の細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。例えば、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナル（ｂｐＮＬＳ）を使用してもよい。モノパータイト型核移行シグナルの例として、限定するものではないが、KKKKRK（配列番号６）で示される配列を含むものが挙げられる。また、バイパータイト型核移行シグナルの例として、限定するものではないが、DPKRTADGSEFESPKKKRKVEGT（配列番号７）で示される配列を含むものが挙げられる。
また、核移行シグナル配列は、２個以上をタンデムに並べてＣａｓタンパク質をコードする核酸に付加してもよい。好ましくは、２個以上の、例えば、２個又は３個のモノパータイト型核移行シグナル配列をタンデムに並べて、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に付加する。核移行シグナル配列は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の５’末端側または３’末端側、あるいは５’末端側および３’末端側の両方に付加されていてもよい。
例えば、一の態様において、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡは、５’末端側に、１個のモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されているか、あるいは２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されていてもよい。例えば、また別の態様において、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡは、５’末端側および３’末端側の両方に、バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されていてもよい。例えば、また別の態様において、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡは、５’末端および／または３’末端側に、２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されていてもよい。これらの態様は、動物細胞への導入に好ましい。
（３）ｃｒＲＮＡ
ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するリピート配列および該リピート配列に挟まれたスペーサー配列からなる１以上の構造単位（「リピート－スペーサー－リピート」）を含む。リピート配列は、好ましくは、パリンドローム様配列を含む。ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列として標的ヌクレオチド配列に結合するＲＮＡ配列（すなわち、プロトスペーサー配列）を含むことによって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的認識に寄与する。ｃｒＲＮＡのリピート配列および該リピート配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる構造を含むＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とも呼ばれる。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエフェクタータンパク質の作用によりプロセッシングされてそのリピート配列が切断され、リピート配列の部分配列と該リピート配列の部分配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる成熟型（ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡになる。プロセッシングされる前のｃｒＲＮＡはプレ成熟型（ｐｒｅ－ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡと呼ばれる。
ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するリピート配列および該リピート配列に挟まれたスペーサー配列からなる１以上の構造単位（「リピート－スペーサー－リピート」）を含む。リピート配列は、好ましくは、パリンドローム様配列を含む。ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列として標的ヌクレオチド配列に結合するＲＮＡ配列（すなわち、プロトスペーサー配列）を含むことによって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的認識に寄与する。ｃｒＲＮＡのリピート配列および該リピート配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる構造を含むＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とも呼ばれる。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエフェクタータンパク質の作用によりプロセッシングされてそのリピート配列が切断され、リピート配列の部分配列と該リピート配列の部分配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる成熟型（ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡになる。プロセッシングされる前のｃｒＲＮＡはプレ成熟型（ｐｒｅ－ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡと呼ばれる。
本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列と、該リピート配列に挟まれたプロトスペーサー配列として、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含む。本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、好ましくは、プレ成熟型ｃｒＲＮＡである。
プレ成熟型ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓｃａｄｅ（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄの複合体）に取り込まれる前にＣａｓ６ｄによるプロセッシングを受けて、成熟型ｃｒＲＮＡとなる。プレ成熟型ｃｒＲＮＡが２以上の「リピート－スペーサー－リピート」構造単位を含む場合、該プレ成熟型ｃｒＲＮＡは、２種以上のプロトスペーサー配列を含んでいてもよい。２種以上のプロトスペーサー配列を含むプレ成熟型ｃｒＲＮＡからは、２種以上の成熟型ｃｒＲＮＡが生じ、次いで、これらの成熟型ｃｒＲＮＡは個別にＣａｓｃａｄｅに取り込まれる。
ｃｒＲＮＡに含まれるプロトスペーサー配列は、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列である。「標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列」は、例えば、ＲＮＡ配列標的ヌクレオチド配列に相補的な配列、またはＲＮＡ配列標的ヌクレオチド配列に対し実質的に相補的な配列である。ここで、「実質的に相補的」とは、標的配列に対して完全に相補的ではないが、標的配列に結合できる（標的配列と塩基対を形成する）配列を包含する。ＲＮＡ配列標的ヌクレオチド配列に対し実質的に相補的な配列は、標的配列と塩基対を形成するかぎりにおいて、配列標的配列に対しミスマッチを含んでいてもよい。
ｃｒＲＮＡのリピート配列部分は、少なくとも１つのヘアピン構造を有していてもよい。例えば、プロトスペーサー配列の５’末端側にあるリピート配列部分がヘアピン構造を有し、プロトスペーサー配列の３’末端側にあるリピート配列部分は一本鎖であってもよい。本発明において、ｃｒＲＮＡは、好ましくは１つのヘアピン構造を有する。
ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列は、タイプＩ－Ｄ遺伝子群に隣接するｃｒＲＮＡ遺伝子配列領域から、タンデムリピート検索プログラムを利用して見出すことができる。タイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列は、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、上記のＣａｓエフェクタータンパク質に関して例示した細菌および古細菌由来のものであってもよい。
ｃｒＲＮＡに含まれるリピート配列の塩基長は、Ｃａｓｃａｄｅと相互作用して標的ヌクレオチド配列を標的化するという目的が達成されるかぎり、特に限定されない。例えば、プロトスペーサー配列の前後のリピート配列は各々、約１０～７０塩基長であってもよく、例えば、約３０～５０塩基長であってもよく、好ましくは約３５～４５塩基長であってもよい。
本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、約１０塩基～７０塩基長のプロトスペーサー配列を含むことができる。該ｃｒＲＮＡに含まれるプロトスペーサー配列は、好ましくは２０塩基～５０塩基、より好ましくは２５塩基～４５塩基からなる配列、さらに好ましくは３０塩基～４０塩基からなる配列、例えば、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、または３９塩基からなる配列である。標的化可能な配列が長いほど、ｃｒＲＮＡによる標的認識の配列特異性が増す。また、標的化可能な配列が長いほど、ｃｒＲＮＡと標的配列との間に形成される塩基対のＴｍ値が高くなり、標的認識の安定性が増す。従来のゲノム編集技術に用いられるＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１）ではｃｒＲＮＡが標的化できる配列の長さは約２０～２４塩基であるので、本発明では、従来法よりも配列特異性および安定性が優れている。
本発明で使用されるｃｒＲＮＡの例として、限定するものではないが、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｃｒＲＮＡのリピート配列を含むものが挙げられる。例えば、GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC（配列番号８；Ｎは、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を構成する任意のヌクレオチドである）で示される配列を含むプレ成熟型ｃｒＲＮＡが挙げられる。上記ｃｒＲＮＡの配列中、Ｎの数は１０～７０の範囲で変更してもよく、好ましくは２０～５０、より好ましくは２５～４５、さらに好ましくは３０～４０の範囲で変更してもよい。
上記ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入されてもよい。ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクターまたは発現カセットに含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結される。ベクターおよび調節配列は、例えば宿主細胞等に基づいて、当業者が適宜選択することができる。例えば、限定するものではないが、ｐｏｌ ＩＩＩ系のプロモーター（例えば、ＳＮＲ６、ＳＮＲ５２、ＳＣＲ１、ＲＰＲ１、Ｕ６、Ｈ１プロモーター等）、ｐｏｌ ＩＩ系のプロモーター、ターミネーター（例えばＴ６配列）、またはヒトＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーターを用いることができる。
上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、上記５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡのいずれかと同じベクター中または同じ発現カセット中に含まれていてもよく、または上記５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡのいずれとも別のベクター中または別の発現カセット中に含まれていてもよい。
（４）標的ヌクレオチド配列
本発明において、標的ヌクレオチド配列（本明細書において、単に「標的配列」ともいう）は、任意の核酸の配列であり、ＴｉＤシステムのプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の近傍に位置する配列を標的配列として選択することを除き、特に限定されない。標的ヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列のいずれであってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、真核生物核ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、原核生物ゲノムＤＮＡ、ファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡ等が挙げられる。本発明において、標的ヌクレオチド配列は、好ましくは、ゲノムＤＮＡ上の配列である。したがって、標的とする核酸のセンス鎖において、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流に隣接する配列を標的ヌクレオチド配列として選択する。また、標的核酸のアンチセンス鎖において、標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の５’側の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の５’側に隣接する配列から選択される。なお、本明細書において、「近傍に位置する」とは、隣接すること、および近くにあることの両方を包含する。また、本明細書において、「近傍」とは、隣接する位置または近くの位置の両方を包含する。なお、本明細書においては、特記しないかぎり、核酸のセンス鎖に基づいて記載される。
本発明において、標的ヌクレオチド配列（本明細書において、単に「標的配列」ともいう）は、任意の核酸の配列であり、ＴｉＤシステムのプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の近傍に位置する配列を標的配列として選択することを除き、特に限定されない。標的ヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列のいずれであってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、真核生物核ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、原核生物ゲノムＤＮＡ、ファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡ等が挙げられる。本発明において、標的ヌクレオチド配列は、好ましくは、ゲノムＤＮＡ上の配列である。したがって、標的とする核酸のセンス鎖において、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流に隣接する配列を標的ヌクレオチド配列として選択する。また、標的核酸のアンチセンス鎖において、標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の５’側の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の５’側に隣接する配列から選択される。なお、本明細書において、「近傍に位置する」とは、隣接すること、および近くにあることの両方を包含する。また、本明細書において、「近傍」とは、隣接する位置または近くの位置の両方を包含する。なお、本明細書においては、特記しないかぎり、核酸のセンス鎖に基づいて記載される。
ＣＲＩＳＰＲシステムの標的認識に利用されるＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムの種類によって異なる。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＴｉＤシステムを用いる発明者らの以前の研究により、ＴｉＤシステムのＰＡＭ配列は、標的とする核酸のセンス鎖において、５’－ＧＴＨ－３’（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）であり、標的核酸のアンチセンス鎖において、５’－ＨＴＧ－３’（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）であることが明らかにされた（特許文献１）。
例えば、標的ヌクレオチド配列は、上記ＰＡＭ配列の近傍に位置し、かつ、標的遺伝子のイントロン内、コーディング領域内、非コーディング領域内、または制御領域内に存在する配列であってもよい。標的遺伝子は、任意の遺伝子であり、随意に選択すればよい。
標的ヌクレオチド配列の長さは、例えば、１０～７０塩基長、好ましくは２０～５０塩基長、より好ましくは２５～４５塩基長、さらに好ましくは３０～４０塩基長の範囲である。
（５）本発明の標的配列改変方法
本発明の標的配列改変方法は、上記の５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系と、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列改変方法は、ＴｉＤシステムにより、細胞中の標的ヌクレオチド配列が特異的に切断されることを含む。本発明の標的配列改変方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。本発明において、改変には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。
本発明の標的配列改変方法は、上記の５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系と、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列改変方法は、ＴｉＤシステムにより、細胞中の標的ヌクレオチド配列が特異的に切断されることを含む。本発明の標的配列改変方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。本発明において、改変には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。
上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、ベクター系または発現カセット系に含まれる。本明細書において、「ベクター系」および「発現カセット系」とは、それぞれ、２以上のベクターを含む群（すなわち、第一のベクターおよび第二のベクターを含む群）および２以上の発現カセットを含む群（すなわち、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットを含む群）を意味する。ここで、ベクターは、対象細胞中に目的タンパク質をコードするＤＮＡを運び、該細胞中で該目的タンパク質を発現させるための発現ベクターである。発現カセットとは、目的タンパク質をコードするＤＮＡの転写を指示して該目的タンパク質の発現を可能にする核酸分子を意味する。発現カセットは、ベクターに含まれていてもよい。ベクターとしては、当該分野において一般的に使用される種々のベクターを使用することができ、特に限定されず、導入される細胞又は導入方法に応じて適宜選択することができる。例えば、限定するものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン等が挙げられる。
上記ベクターまたは発現カセットは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡのほかに、該ＤＮＡの転写を調節するための調節エレメントを含み、該ＤＮＡ配列は該調節エレメントに作動可能に連結されている。転写を調節するための調節エレメントとしては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ポリアデニル化シグナル、ポリＵ配列等が包含される。上記ベクターまたは発現カセットは、好ましくはプロモーターを含む。上記ベクターまたは発現カセットは、さらに、他の調節エレメントを含んでいてもよい。他の調節エレメントとしては、例えば、翻訳エンハンサー等が挙げられる。調節エレメントは、特に限定されず、例えば宿主細胞等に基づき当業者が適宜選択することができる。例えば、プロモーターとして、宿主が植物細胞である場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、２ｘＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げられ、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ－ＴＳプロモーター、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター、ＣＡＧキメラ合成プロモーター等が挙げられる。特に、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター、またはＣＡＧキメラ合成プロモーターは、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞へ導入するために使用される。
上記ベクター系または発現カセット系は、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含み、ここに、第一のベクターまたは第一の発現カセットは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、また、上記第二のベクターまたは第二の発現カセットは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含む。
上記５つのＣａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの２以上または全てが単一のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。ベクターまたは発現カセットの数、ならびに各ベクターまたは発現カセットに組み込むＤＮＡがコードするＣａｓタンパク質の種類および組み合わせに制限はない。上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡが一つのベクター中に含まれる場合、これらのＤＮＡ配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡを連結する順番は、いずれであってもよい。
好ましくは、上記ベクター系または発現カセット系において、第二のベクターまたは第二の発現カセットは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡであって、第一のベクターまたは第一の発現カセットに含まれていないＤＮＡを含む。
例えば、上記ベクター系または発現カセット系は、第一ないし第五のベクターまたは発現カセットを含んでいてもよく、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々の上記ベクターまたは発現カセットに含まれていてもよい。
例えば、一の態様において、ベクター系が第一ないし第五のベクターを含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々の上記ベクターに含まれていてもよい。かかる態様は、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞へ導入するために使用される。
例えば、上記ベクター系または発現カセット系において、第一のベクターまたは発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡおよびＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、第二のベクターまたは発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含んでいてもよい。
例えば、一の態様において、第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡおよびＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含み、かつ、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが１つのベクターに搭載されていてもよい。かかる態様は、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞へ導入するために使用される。
本発明の標的配列改変方法においては、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡに加えて、ドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入してもよい。ドナーポリヌクレオチドは、標的部位に導入したい改変を含む少なくとも１つのドナー配列を含む。ドナーポリヌクレオチドは、ドナー配列に加えて、該ドナー配列の両端に標的配列の上流および下流の配列と相同性の高い配列（好ましくは、標的配列の上流および下流の配列と実質的に同一の配列）を含んでいてもよい。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡであってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、当該分野で既知の技術に基づいて当業者が適宜設計することができる。
本発明の標的配列改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在しない場合、標的ヌクレオチド配列における切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復されうる。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいことが知られており、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが該切断の修復中に起こりうる。かくして、該配列は、標的配列部位において改変され、それにより、フレームシフトや未成熟終止コドンを誘発し、標的配列領域がコードしている遺伝子の発現が不活性化またはノックアウトされる。
本発明の標的配列改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在する場合、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、切断された標的ヌクレオチド配列の相同組換え修復（ＨＤＲ）により、標的配列部位に挿入されるか、または標的配列部位がドナー配列に置換される。その結果、標的配列部位に所望の改変が導入される。
上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。ドナーポリヌクレオチドを用いる場合、ドナーポリヌクレオチドもまた、当該分野で知られた種々の手段によって細胞中に導入すればよい。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系、およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。また、上記のベクター系または発現カセット系に含まれる２以上のベクターまたは発現カセットは、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。ドナーポリヌクレオチドを用いる場合、該ドナーポリヌクレオチドは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡと同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。
上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系、およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞中への導入の際、該細胞は、標的配列部位での切断に適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。ドナーポリヌクレオチドを導入する際も同様である。培養条件は、導入される細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
本発明の標的配列改変方法によれば、細胞中に導入されたＴｉＤシステムにより標的ヌクレオチド配列上の部位が切断され、該切断配列の修復時に、標的配列が改変される。例えば、本発明の標的配列改変方法は、ゲノム上の標的ヌクレオチド配列の改変のために用いることができ、該方法によりゲノム上の二本鎖ＤＮＡが切断され、標的部位が改変される。
さらに、本発明の標的配列改変方法において、標的ヌクレオチド配列として、標的遺伝子の配列の少なくとも一部の配列を選択することにより、当該標的遺伝子の発現を抑制することができる。かくして、本発明の標的配列改変方法のさらなる態様として、細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、該細胞に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
（ｉｉ）前記標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、方法が提供される。
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
（ｉｉ）前記標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、方法が提供される。
本発明の標的配列改変方法によれば、上記の５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡがベクター系または発現カセット系、すなわち、２以上のベクターまたは発現カセット中に存在していることを特徴とする。上記Ｃａｓタンパク質は、該ベクター系または発現カセット系を介して細胞中で発現することにより、同時に導入されたｃｒＲＮＡと共に作用して、標的ヌクレオチド配列を特異的かつ効率よく改変する。
好ましい一の態様において、本発明の標的配列改変方法は、上記の第一のベクターまたは発現カセットおよび第二のベクターまたは発現カセットを含むベクター系または発現カセット系であって、第二のベクターまたは第二の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡであって、第一のベクターまたは第一の発現カセットに含まれていないＤＮＡを含む、ベクター系または発現カセット系を用いる。また別の態様において、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡは、第一のベクターまたは第一の発現カセットおよび第二のベクターまたは第二の発現カセットの両方に含まれていてもよい。このように、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄをそれぞれコードする５つのＤＮＡが２以上の異なるベクターまたは発現カセットに別れて含まれる場合、該ベクターまたは発現カセットを利用するＴｉＤは、細胞中でＣａｓタンパク質のより高レベルの発現を導き、より強力な標的配列改変効果をもたらす。
例えば、本発明の標的配列改変方法は、好ましくは、５つのベクターを含むベクター系であって、上記の５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡの各々が互いに異なるベクター中に含まれているベクター系を用いる。さらに好ましくは、上記ベクターは、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーターまたはＣＡＧキメラ合成プロモーターを含む。また、本発明の方法において、好ましくは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの５’末端側には、１個のモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されているか、あるいは２個または３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている。あるいは、本発明の方法において、好ましくは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの５’末端側および３’末端側の両方には、バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている。さらに、本発明の方法において、好ましくは、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡの５’末端および／または３’末端側には、２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている。また、本発明の方法において、好ましくは、上記発現カセット系が２つの発現カセットを含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡおよびＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡが第一の発現カセットに含まれ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡ第二の発現カセットに含まれ、該第一および第二の発現カセットは１つのベクターに搭載されている。
本発明の標的配列改変方法によれば、標的配列に、数塩基から数十塩基の短鎖領域の挿入および／または欠失を導入するだけでなく、数キロベースないし数十キロベースの長鎖領域の塩基欠失も導入することができる。数キロベースないし数十キロベースとしては、限定するものではないが、例えば１０００～９００００塩基長、好ましくは２０００～８００００塩基長、より好ましくは２０００～７００００塩基長、さらに好ましくは２０００～６００００塩基長、２０００～５００００塩基長、２０００～４００００塩基長、２０００～３００００塩基長、または２０００～２００００塩基長が挙げられる。あまりに長い欠失では、標的とする遺伝子の目的以外の配列（例えば、隣接する別の遺伝子の配列）の欠失を生じたり、標的とするエキソン領域のみならず隣接する必要なエキソン配列の欠失を生じたりすることもあるが、本発明のように「数キロベースないし数十キロベース」程度の適度に長い領域の欠失であれば、目的の遺伝子の長鎖欠失のみを導入することができる。したがって、本発明の標的配列改変方法を用いれば、１つのガイドＲＮＡを設計するだけで、１遺伝子座全体を欠失させることが可能となる。また、本発明の標的配列改変方法を用いれば、動物の遺伝子のように長いイントロンが存在する場合でも、特定のエキソンを完全に欠落させることも可能である。さらに、本発明の標的配列改変方法を用いれば、隣接して存在する遺伝子群をまとめて欠落させることも可能である。
本発明の標的配列改変方法によれば、ＰＡＭ配列の上流方向または下流方向、あるいはＰＡＭ配列の上流および下流の両方（すなわち、二方向性）の塩基欠失をもたらすことができる。
（６）本発明のキット
本発明のキットは、上記の本発明の標的配列改変方法に使用するためのキットであり、上記の５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含む上記ベクター系または発現カセット系と、上記ｃｒＲＮＡまたは上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。本発明のキットの構成成分については、上記（２）～（５）に記載のとおりである。
本発明のキットは、上記の本発明の標的配列改変方法に使用するためのキットであり、上記の５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含む上記ベクター系または発現カセット系と、上記ｃｒＲＮＡまたは上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。本発明のキットの構成成分については、上記（２）～（５）に記載のとおりである。
（７）本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列ターゲティング方法
本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列ターゲティング方法は、上記標的認識モジュール（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄ）または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と、上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとを上記細胞中に導入することを含み、かつ、標的配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）することを特徴とする。さらに、標的配列が比較的短い（例えば、３０塩基長以下）場合は、ＰＡＭ配列の３’側から６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）してもよい。このような標的配列を選択することにより、ＴｉＤの標的認識モジュールによるオフターゲット効果が抑制され、より効率的かつ特異的な標的配列の標的化（ターゲティング）が実現する。本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列ターゲティング方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。本発明の標的配列ターゲティング方法によれば、ｃｒＲＮＡと、上記標的認識モジュールとｃｒＲＮＡが複合体を形成し、同時に、該ｃｒＲＮＡが標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成し、該標的認識モジュールが標的ヌクレオチド配列近傍のＰＡＭ配列を認識することにより、配列特異的に標的ヌクレオチド配列を標的化する。
本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列ターゲティング方法は、上記標的認識モジュール（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄ）または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と、上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとを上記細胞中に導入することを含み、かつ、標的配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）することを特徴とする。さらに、標的配列が比較的短い（例えば、３０塩基長以下）場合は、ＰＡＭ配列の３’側から６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）してもよい。このような標的配列を選択することにより、ＴｉＤの標的認識モジュールによるオフターゲット効果が抑制され、より効率的かつ特異的な標的配列の標的化（ターゲティング）が実現する。本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列ターゲティング方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。本発明の標的配列ターゲティング方法によれば、ｃｒＲＮＡと、上記標的認識モジュールとｃｒＲＮＡが複合体を形成し、同時に、該ｃｒＲＮＡが標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成し、該標的認識モジュールが標的ヌクレオチド配列近傍のＰＡＭ配列を認識することにより、配列特異的に標的ヌクレオチド配列を標的化する。
上記標的認識モジュールは、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄを含む単離された複合体として細胞中に導入されてもよく、またはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄの各々が単離されたタンパク質として単独で細胞中に導入されてもよい。また、上記標的認識モジュールは、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄをコードする核酸として細胞中に導入されてもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１以上のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、調節エレメントに作動可能に連結されている。上記標的認識モジュールを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡに核移行シグナル配列が付加される。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄをコードするＤＮＡの２以上または全てが単一のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡが一つのベクターまたは発現カセット中に含まれる場合、これらのＤＮＡ配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡを連結する順番は、いずれであってもよい。ベクター、発現カセット、調節エレメント、核移行シグナル配列等については、上記（５）に記載のとおりである。ｃｒＲＮＡについては、上記（３）に記載のとおりである。
上記標的認識モジュールおよびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
上記標的認識モジュールおよびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。また、上記標的認識モジュールを構成するＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらの各Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。例えば、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいてそれぞれ合成した上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄと、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいて合成したｃｒＲＮＡを、イン・ビトロにおいてインキュベートして複合体を形成させ、該複合体を細胞中に導入することができる。
上記標的認識モジュールおよびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの導入の際、細胞は、標的ヌクレオチド配列のターゲティングに適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。培養条件は、該細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
（８）本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法
本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法は、上記の５つのＣａｓタンパク質または該タンパク質をコードする核酸と、上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとを上記細胞中に導入することを含み、かつ、標的配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）することを特徴とする。さらに、標的配列が比較的短い（例えば、３０塩基長以下）場合は、ＰＡＭ配列の３’側から６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）してもよい。このような標的配列を選択することにより、ＴｉＤのオフターゲット効果が抑制され、より効率的かつ特異的な標的配列の改変が実現する。本発明において、改変には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。
本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法は、上記の５つのＣａｓタンパク質または該タンパク質をコードする核酸と、上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとを上記細胞中に導入することを含み、かつ、標的配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）することを特徴とする。さらに、標的配列が比較的短い（例えば、３０塩基長以下）場合は、ＰＡＭ配列の３’側から６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）してもよい。このような標的配列を選択することにより、ＴｉＤのオフターゲット効果が抑制され、より効率的かつ特異的な標的配列の改変が実現する。本発明において、改変には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。
本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法においては、上記のＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡに加えて、ドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入してもよい。ドナーポリヌクレオチドについては、上記（５）に記載のとおりである。
上記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄを含む単離された複合体として細胞中に導入されてもよく、またはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各々が単離されたタンパク質として単独で細胞中に導入されてもよい。あるいは、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸として細胞中に導入されてもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１以上のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、調節エレメントに作動可能に連結されている。上記細胞が真核細胞である場合、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡに核移行シグナル配列が付加される。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの２以上または全てが単一のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡが一つのベクターまたは発現カセット中に含まれる場合、これらのＤＮＡ配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡを連結する順番は、いずれであってもよい。ベクター、発現カセット、調節エレメント、核移行シグナル配列等については、上記（５）に記載のとおりである。ｃｒＲＮＡについては、上記（３）に記載のとおりである。
上記Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびドナーポリヌクレオチドの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
上記Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびドナーポリヌクレオチドは、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。また、上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼを構成するＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらの各Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。
上記Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、または上記Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびドナーポリヌクレオチドの導入の際、細胞は、標的配列部位での切断に適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。培養条件は、該細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
以下に、本発明の実施例を示した。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施の一形態として、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＴｉＤ遺伝子座由来の遺伝子群（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ）を、クローン化して用いた。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのアミノ酸配列情報（配列番号１～５）を基に、各Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡ配列を人工合成した。実施例中のＤＮＡ配列の加工および構築操作には、人工遺伝子化学合成、ＰＣＲ法、制限酵素処理、ライゲーション、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法のいずれかを用いた。また、塩基配列の決定にはサンガー法あるいは次世代シーケンス法を用いた。
＜方法＞
（１）ベクターの構築
遺伝子フラグメントのクローニングのためのＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（ＴａＫａＲａ）を用いて行た。アセンブリングのためのクローニングは、Ｑｕｉｃｋ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮＥＢ）、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、およびＭｕｌｔｉｓｉｔｅ ｇａｔｅｗａｙ Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
（１）ベクターの構築
遺伝子フラグメントのクローニングのためのＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（ＴａＫａＲａ）を用いて行た。アセンブリングのためのクローニングは、Ｑｕｉｃｋ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮＥＢ）、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、およびＭｕｌｔｉｓｉｔｅ ｇａｔｅｗａｙ Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
（１－１）哺乳動物ベクター
ヒトコドンに最適化したＣａｓエフェクター遺伝子（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ）をＮ末端のＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）（配列番号６）と共に合成し（ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標））（ＩＤＴ）、アセンブルし、ｐＥＦｓベクター（Lopez-Perrote et al,(2016), Nucleic Acids Res, 44:1909-1923. doi:10.1093/nar/gkv1527）中に別々にクローン化して、ｐＥＦｓ－ＨＡ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ、ｐＥＦｓ－Ｓｔｒｅｐｔ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄ、ｐＥＦｓ－ＦＬＡＧ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ、およびｐＥＦｓ－６ｘＨｉｓ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄを得た（単一Ｃａｓ発現ベクター）。各Ｃａｓタンパク質に融合したタグは以下のとおりである。すなわち、ＨＡ－タグをＣａｓ３ｄに、Ｓｔｒｅｐ－タグをＣａｓ５ｄに、Ｍｙｃ－タグをＣａｓ６ｄに、ＦＬＡＧ－タグをＣａｓ７ｄに、６ｘＨｉｓ－タグをＣａｓ１０ｄに付加した。さらに、すべてのＣａｓ遺伝子を、２Ａ自己切断ペプチドをコードしている配列との融合によって、オールインワンベクターｐＥＦｓ－Ａｌｌ中で組み合わせた。２Ａ自己切断ペプチドに連結することによって、ｐＥＦｓ＿Ｃａｓ３ｄ－Ｃａｓ１０ｄ発現ベクターおよびｐＥＦｓ＿Ｃａｓ６ｄ－Ｃａｓ５ｄ－Ｃａｓ７ｄ発現ベクター（２セット型ベクター）も構築した。
ヒトコドンに最適化したＣａｓエフェクター遺伝子（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ）をＮ末端のＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）（配列番号６）と共に合成し（ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標））（ＩＤＴ）、アセンブルし、ｐＥＦｓベクター（Lopez-Perrote et al,(2016), Nucleic Acids Res, 44:1909-1923. doi:10.1093/nar/gkv1527）中に別々にクローン化して、ｐＥＦｓ－ＨＡ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ、ｐＥＦｓ－Ｓｔｒｅｐｔ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄ、ｐＥＦｓ－ＦＬＡＧ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ、およびｐＥＦｓ－６ｘＨｉｓ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄを得た（単一Ｃａｓ発現ベクター）。各Ｃａｓタンパク質に融合したタグは以下のとおりである。すなわち、ＨＡ－タグをＣａｓ３ｄに、Ｓｔｒｅｐ－タグをＣａｓ５ｄに、Ｍｙｃ－タグをＣａｓ６ｄに、ＦＬＡＧ－タグをＣａｓ７ｄに、６ｘＨｉｓ－タグをＣａｓ１０ｄに付加した。さらに、すべてのＣａｓ遺伝子を、２Ａ自己切断ペプチドをコードしている配列との融合によって、オールインワンベクターｐＥＦｓ－Ａｌｌ中で組み合わせた。２Ａ自己切断ペプチドに連結することによって、ｐＥＦｓ＿Ｃａｓ３ｄ－Ｃａｓ１０ｄ発現ベクターおよびｐＥＦｓ＿Ｃａｓ６ｄ－Ｃａｓ５ｄ－Ｃａｓ７ｄ発現ベクター（２セット型ベクター）も構築した。
Ｃａｓ５ｄおよびＣａｓ６ｄを発現するための異なるプロモーターを評価するために、ｐＥＦｓ－Ｓｔｒｅｐｔ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄおよびｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄにおいてヒトＥＦｓプロモーターをＣＡＧプロモーターに置き換えて、ｐＣＡＧ－Ｓｔｒｅｐｔ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄまたはｐＣＡＧ－Ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄを得た。
バイパータイトＮＬＳ（ｂｐＮＬＳ）（配列番号７）を用いてＣａｓ－発現ベクターを構築するために、ＤＮＡフラグメント（ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ）をまず合成し（ＩＤＴ）、ｐＥＦｓベクター中にクローン化して、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓベクターを得た。ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓベクター中のＣａｓ１０ｄ遺伝子フラグメントを、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄ遺伝子フラグメントでそれぞれ置き換えて、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、およびｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓを得た。
変異Ｃａｓ１０ｄ（Ｈ１７７Ａ）発現ベクターを構築するために、ｄＣａｓ１０ｄ（Ｈ１７７Ａ）フラグメントを合成し（ＩＤＴ）、野生型Ｃａｓ１０ｄフラグメントｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓをｄＣａｓ１０ｄ（Ｈ１７７Ａ）で置換して、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ（Ｈ１７７Ａ）－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓを得た。ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳ中のＭｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓフラグメントを６ｘＨｉｓ－ｍｙｃ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳフラグメントで置換して、ｐＥＦｓ－６ｘＨｉｓ－ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳを得た。
ｃｒＲＮＡ発現ベクターのために、リピート－スペーサー－リピート配列（配列番号９）を含有するＤＮＡフラグメントを人工合成し、ｐＥＸ－Ａ２Ｊ１（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）中、ヒトＵ６プロモーター下でクローン化して、ｐＡＥＸ－ｈＵ６ｃｒＲＮＡを得た。ｐＡＥＸ－ｈＵ６ｃｒＲＮＡ＿ｍａｔｕｒｅを構築するために、２つのリピート配列を予測されたプロセスリピート配列（predicted processed repeat sequences）（配列番号１０）に置き換えた。ｇＲＮＡ配列の挿入のために、標的配列を含有する２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、制限酵素ＢｓａＩ（ＮＥＢ）を用いるＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングを用いて、ｃｒＲＮＡ発現ベクター中にクローン化した。
（１－２）ルシフェラーゼレポーターアッセイプラスミド
ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーターアッセイのために、ＮａｎｏＬＵｘｘＵＣ発現ベクターを構築した。まず、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２ ＤＮＡフラグメントを合成した（ＩＤＴ社製）。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１は、ＮａｎｏＬＵＣＴＭ（登録商標）遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）配列の最初の３５１ｂｐおよびマルチクローニングサイトを含む。ＸｂａＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の５’末端に付加した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２は、ＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端の４６５ｂｐを含む。ＸｈｏＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端に付加した。これらのフラグメントをアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＥＧｘｘＦＰベクター（ａｄｄｇｅｎｅ、＃５０７１６）中にクローン化した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ消化によって、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣベクターから除去することによって、各スプリットタイプＮＬＵｘｘＵＣレポーターを構築した。各消化ベクターをマルチクローニングサイトと共にアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２を得た。
ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーターアッセイのために、ＮａｎｏＬＵｘｘＵＣ発現ベクターを構築した。まず、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２ ＤＮＡフラグメントを合成した（ＩＤＴ社製）。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１は、ＮａｎｏＬＵＣＴＭ（登録商標）遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）配列の最初の３５１ｂｐおよびマルチクローニングサイトを含む。ＸｂａＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の５’末端に付加した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２は、ＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端の４６５ｂｐを含む。ＸｈｏＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端に付加した。これらのフラグメントをアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＥＧｘｘＦＰベクター（ａｄｄｇｅｎｅ、＃５０７１６）中にクローン化した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ消化によって、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣベクターから除去することによって、各スプリットタイプＮＬＵｘｘＵＣレポーターを構築した。各消化ベクターをマルチクローニングサイトと共にアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２を得た。
（１－３）植物ベクター
トマトコドン最適化Ｃａｓエフェクター遺伝子（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ）に対応する遺伝子フラグメントを、Ｎ末端の２ｘＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）と共に合成し（ＩＤＴ社製）、アセンブルし、ｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ製）ベクター中にクローン化した。配列を確認後、５つのＣａｓ遺伝子を２Ａ自己切断ペプチド配列を介して連結することによってリアセンブルし、Ｃａｓ遺伝子発現カセットを、ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰ（Ueta et al., 2017, Sci. Rep, 7:507. doi: 0.1038/s41598-017-00501-4）の２ｘＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＨＳＰ１８．２遺伝子ターミネーターとの間にクローン化して、ｐＥｇＰ１．２－ＴｉＤを得た。
トマトコドン最適化Ｃａｓエフェクター遺伝子（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ）に対応する遺伝子フラグメントを、Ｎ末端の２ｘＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）と共に合成し（ＩＤＴ社製）、アセンブルし、ｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ製）ベクター中にクローン化した。配列を確認後、５つのＣａｓ遺伝子を２Ａ自己切断ペプチド配列を介して連結することによってリアセンブルし、Ｃａｓ遺伝子発現カセットを、ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰ（Ueta et al., 2017, Sci. Rep, 7:507. doi: 0.1038/s41598-017-00501-4）の２ｘＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＨＳＰ１８．２遺伝子ターミネーターとの間にクローン化して、ｐＥｇＰ１．２－ＴｉＤを得た。
ｃｒＲＮＡ発現ベクターを構築するために、リピート－スペーサー－リピート配列を含有するＤＮＡフラグメントを、ｐＤＯＮＲ Ｐ３－Ｐ２中のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｕ６－２６ ｓｎＲＮＡプロモーター下にクローン化して、ｐＥ（Ｌ３－Ｌ２）ＡｔＵ６ｃｒＲＮＡを得た。ｐＥ（Ｌ３－Ｌ２）ＡｔＵ６ｃｒＲＮＡ中のＡｔＵ６プロモーター－リピート－スペーサー－リピートフラグメントをｐＥｇＰ１．２－ＴｉＤ中に再クローン化して、ｐＴｉＤＰ１．２を得た。
ｐＭＧＴｉＤＰ２０を構築するために、マルチサイトゲータウェイアセンブリングのための中間ベクターｐＥ（Ｌ１－Ｌ４）Ｐ１．２－Ｃａｓ３ｄ－Ｃａｓ６ｄ－ＧＦＰおよびｐＥ（Ｒ４－Ｒ３）Ｐｐｕｂｉ４－Ｃａｓ１０ｄ－Ｃａｓ５ｄ－Ｃａｓ７ｄを構築した。２ｘＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって駆動されるＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＧＦＰ遺伝子フラグメント、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＨＳＰ１８．２遺伝子ターミネーターをｐＤＯＮＲ Ｐ１－Ｐ４中にクローン化して、ｐＥ（Ｌ１－Ｌ４）Ｐ１．２－Ｃａｓ３ｄ－Ｃａｓ６ｄ－ＧＦＰを得た。ｐＥｇＰｕｂｉ４＿２３７－２Ａ－ＧＦＰ由来のＰ．ｃｒｉｓｐｕｍユビキチン４－２プロモーター（Ｐｐｕｂｉ４）(Ueta et al. 2017 上掲）によって駆動されるＣａｓ１０ｄ、Ｃａｓ５ｄおよびＣａｓ７ｄ遺伝子フラグメント、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓリブロース－１，５－ビホスフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット２ｂ（ｒｂｃ）ターミネーターをｐＤＯＮＲ Ｐ４ｒ－Ｐ３ｒ中にクローン化して、ｐＥ（Ｒ４－Ｒ３）Ｐｐｕｂｉ４－Ｃａｓ１０ｄ－Ｃａｓ５ｄ－Ｃａｓ７ｄを得た。ｐＥ（Ｌ１－Ｌ４）Ｐ１．２－Ｃａｓ３ｄ－Ｃａｓ６ｄ－ＧＦＰ、ｐＥ（Ｒ４－Ｒ３）Ｐｐｕｂｉ４－Ｃａｓ１０ｄ－Ｃａｓ５ｄ－Ｃａｓ７ｄ、ｐＥ（Ｌ３－Ｌ２）ＡｔＵ６ｃｒＲＮＡ、および目的のバイナリーベクターｐＴＧＷ１２を用いてマルチサイトゲータウェイＬＲ反応を行って、ｐＭＧＴｉＤＰ２０を得た。
ｇＲＮＡ配列の挿入のために、標的配列を含有する２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、制限酵素ＢｓａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ製）を用いてｐＴｉＤＰ１．２またはｐＭＧＴｉＤＰ２０のスペーサー配列中にゴールデンゲータウェイクローニングすることによって、ｇＲＮＡ発現ベクター中にクローン化した。
（２）細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胚性腎細胞株２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ，ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）を、１０％胎仔ウシ血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧｌｕｔａｌＭＡＸ（登録商標）サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で６０分、５％ＣＯ２インキュベーションで培養した。トランスフェクションの前日にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＵＳＡ）に播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨プロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。６ウェルプレートの各ウェルについて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出された全４μｇのプラスミドを用いた。変異分析のために、４８時間後にトランスフェクト細胞を回収した。
ヒト胚性腎細胞株２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ，ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）を、１０％胎仔ウシ血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧｌｕｔａｌＭＡＸ（登録商標）サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で６０分、５％ＣＯ２インキュベーションで培養した。トランスフェクションの前日にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＵＳＡ）に播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨プロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。６ウェルプレートの各ウェルについて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出された全４μｇのプラスミドを用いた。変異分析のために、４８時間後にトランスフェクト細胞を回収した。
（３）イン・ビトロ ヌクレアーゼアッセイ
イン・ビトロ ヌクレアーゼアッセイは、Sinkunas et al. (2011) EMBO J., 30, 1335-42に記載のプロトコルにいくつか修正を加えて行った。Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ製）を基質として用いた。Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄタンパク質は、Ｕｎｉｔｅｃｈ， Ｃｏ．（Ｋａｓｈｉｗａ， Ｊａｐａｎ）によって調製された。簡単に言うと、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄタンパク質を、各Ｈｉｓ－タグ付加したＣａｓタンパク質を発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 増加 １０／３００ ＧＬカラム）を用いて精製した。Ｃａｓタンパク質をバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール）中で溶出させた。ヌクレアーゼ反応は、バッファー［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール、２ｍＭ ＡＴＰ、１００μＭ ＮｉＣｌ２、１００μＭ ＣｏＣｌ２、１ｘＣｕｔ Ｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ製）、４ｎＭ Ｍ１３ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡ、０．７５μＭ Ｃａｓタンパク質］中、３７℃で３０分、１時間および２時間行った。クロロホルムを加えて反応を停止し、次いで、クロロホルム抽出を行った。水相を分離し、ゲルローディングダイＰｕｒｐｌｅ（６Ｘ）（ＮＥＢ）と混合し、次いで、１％アガロースゲル上の電気泳動に付した。ＤＮＡは、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ，ＵＳＡ）での染色によって可視化した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
イン・ビトロ ヌクレアーゼアッセイは、Sinkunas et al. (2011) EMBO J., 30, 1335-42に記載のプロトコルにいくつか修正を加えて行った。Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ製）を基質として用いた。Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄタンパク質は、Ｕｎｉｔｅｃｈ， Ｃｏ．（Ｋａｓｈｉｗａ， Ｊａｐａｎ）によって調製された。簡単に言うと、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄタンパク質を、各Ｈｉｓ－タグ付加したＣａｓタンパク質を発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 増加 １０／３００ ＧＬカラム）を用いて精製した。Ｃａｓタンパク質をバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール）中で溶出させた。ヌクレアーゼ反応は、バッファー［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール、２ｍＭ ＡＴＰ、１００μＭ ＮｉＣｌ２、１００μＭ ＣｏＣｌ２、１ｘＣｕｔ Ｓｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ製）、４ｎＭ Ｍ１３ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡ、０．７５μＭ Ｃａｓタンパク質］中、３７℃で３０分、１時間および２時間行った。クロロホルムを加えて反応を停止し、次いで、クロロホルム抽出を行った。水相を分離し、ゲルローディングダイＰｕｒｐｌｅ（６Ｘ）（ＮＥＢ）と混合し、次いで、１％アガロースゲル上の電気泳動に付した。ＤＮＡは、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ，ＵＳＡ）での染色によって可視化した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
（４）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、密度２．０ｘ１０４細胞／ウェルで播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨するプロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。９６ウェルプレートの各ウェルについて、（１）Ｆｌｕｃ遺伝子をコードするｐＧＬ４．５３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）、（２）標的ＤＮＡ フラグメントを挿入したｐＣＡＧ－ｎＬＵｘｘＵＣベクター、および（３）ＴｉＤ成分をコードしているプラスミドＤＮＡを含む全２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いた。ＮａｎｏＬｕｃおよびＦｌｕｃルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの３日後に、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ホタル（Ｆｌｕｃ）活性を内部対照として用いた。ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比を各サンプルについて計算し、非標的化ｇＲＮＡでトランスフェクトした対照サンプルのＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比と比較した。相対的ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ活性を用いて、ｇＲＮＡ活性を評価した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、密度２．０ｘ１０４細胞／ウェルで播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨するプロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。９６ウェルプレートの各ウェルについて、（１）Ｆｌｕｃ遺伝子をコードするｐＧＬ４．５３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）、（２）標的ＤＮＡ フラグメントを挿入したｐＣＡＧ－ｎＬＵｘｘＵＣベクター、および（３）ＴｉＤ成分をコードしているプラスミドＤＮＡを含む全２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いた。ＮａｎｏＬｕｃおよびＦｌｕｃルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの３日後に、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ホタル（Ｆｌｕｃ）活性を内部対照として用いた。ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比を各サンプルについて計算し、非標的化ｇＲＮＡでトランスフェクトした対照サンプルのＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比と比較した。相対的ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ活性を用いて、ｇＲＮＡ活性を評価した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
（５）ウェスタンブロッティング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート中、４μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｗｉｔｈ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｎａｋａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ， Ｊａｐａｎ）を補足したＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者のプロトコルに従って用いて、全タンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出した。核および細胞質タンパク質の単離について、ＮＥ－ＰＥＲ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート中、４μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｗｉｔｈ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｎａｋａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ， Ｊａｐａｎ）を補足したＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者のプロトコルに従って用いて、全タンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出した。核および細胞質タンパク質の単離について、ＮＥ－ＰＥＲ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
抽出したタンパク質を、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。サンプルを４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）および２．５％β－メルカプトエタノールと混合し、次いで、９５℃で５分間熱処理した。変性タンパク質をＴｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＳＤＳバッファー［０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ、１．９２Ｍグリシン、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］を含有する１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードし、１５０Ｖで６０分間のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質を２０％メタノールを含有するＴｒｉｓ－グリシン－ＳＤＳバッファー中、５０Ｖで２時間、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上に移した。ＴＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｎＭ ＮａＣｌ、２．６８ｎＭ ＫＣｌ）によって、５分で３回ブロットを洗浄し、室温にて、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ，Ｊａｐａｎ）中で６０分間ブロックした。一次抗体反応は、室温で６０分間行った。膜をＴＴＢＳで５分間３回洗浄後、二次抗体 抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＨＲＰコンジュゲート（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｎｅ中１：１００００）を膜に加えた。室温で６０分間インキュベーション後、膜をＴＴＢＳで５分間３回洗浄した。シグナルは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造者のプロトコルに従って検出した。画像は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００ ｍｉｎｉ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ＵＳＡ）を用いて得た。該実験で用いられた一次抗体は以下の通りである。抗－ＤＤＤＤＫ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ， Ｊａｐａｎ）、抗－ＨＡ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－Ｈｉｓ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－Ｍｙｃ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－Ｓｔｒｅｐ－タグｍＡｂ（１：１０００）（ＭＢＬ）、抗－β－アクチンｍＡｂ（１：１００００）（ＭＢＬ）。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
（６）免疫沈降
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６０ｍｍディッシュ上で、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、１μｇの各Ｃａｓ発現ベクター（ｐＥＦｓ－ＦＬＡＧ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ）およびｇＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした。タンパク質抽出は、Katoh et al., (2015) J. Cell Sci., 128, 2351-2362に記載のプロトコルに従って、トランスフェクションの４８時間後に行った。簡単に言うと、培地をＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｗｉｔｈ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を含有する溶解バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール）に置換し、氷上で５分間インキュベートした。細胞ライゼートをピペッティングによって混合し、１．５ｍｌチューブに移し、次いで、氷上で１５分間インキュベートした。ＦＬＡＧ－ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄタンパク質を含有するＣａｓｃａｄｅ複合体の精製は、ＤＤＤＤＫ－タグ付加したＰｒｏｔｅｉｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＢＬ）を製造者のプロトコルに従って用いて行った。得られた溶出物を、以下の抗体：抗－Ｈｉｓ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－ＤＤＤＤＫ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－β－アクチンｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＨＲＰコンジュゲート（１：１０，０００）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６０ｍｍディッシュ上で、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、１μｇの各Ｃａｓ発現ベクター（ｐＥＦｓ－ＦＬＡＧ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ）およびｇＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした。タンパク質抽出は、Katoh et al., (2015) J. Cell Sci., 128, 2351-2362に記載のプロトコルに従って、トランスフェクションの４８時間後に行った。簡単に言うと、培地をＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｗｉｔｈ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を含有する溶解バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール）に置換し、氷上で５分間インキュベートした。細胞ライゼートをピペッティングによって混合し、１．５ｍｌチューブに移し、次いで、氷上で１５分間インキュベートした。ＦＬＡＧ－ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄタンパク質を含有するＣａｓｃａｄｅ複合体の精製は、ＤＤＤＤＫ－タグ付加したＰｒｏｔｅｉｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＢＬ）を製造者のプロトコルに従って用いて行った。得られた溶出物を、以下の抗体：抗－Ｈｉｓ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－ＤＤＤＤＫ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－β－アクチンｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＨＲＰコンジュゲート（１：１０，０００）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
（７）植物形質転換
トマト植物（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ Ｌ．）ｃｖ． Ｍｉｃｒｏ－ＴｏｍおよびＡｉｌｓａ Ｃｒａｉｇを部位特異的変異誘発実験に用いた。植物は、２４℃で、１６時間４０００～６０００ｌｘ照射／８時間暗所条件下、生育チャンバー中で生育させた。トランスジェニックトマト植物は、植物用ＴｉＤベクターを用いて作成した。トマト子葉由来の葉ディスクを、ＴｉＤベクターを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＶ２２６０株で形質転換した。１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＭＳ培地上で、Ueta et al.（上掲）の方法にしたがい、トランスジェニックカルスおよびシュートを選択し、再生させた。
トマト植物（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ Ｌ．）ｃｖ． Ｍｉｃｒｏ－ＴｏｍおよびＡｉｌｓａ Ｃｒａｉｇを部位特異的変異誘発実験に用いた。植物は、２４℃で、１６時間４０００～６０００ｌｘ照射／８時間暗所条件下、生育チャンバー中で生育させた。トランスジェニックトマト植物は、植物用ＴｉＤベクターを用いて作成した。トマト子葉由来の葉ディスクを、ＴｉＤベクターを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＶ２２６０株で形質転換した。１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＭＳ培地上で、Ueta et al.（上掲）の方法にしたがい、トランスジェニックカルスおよびシュートを選択し、再生させた。
（８）長鎖ＤＮＡ領域（ｌｏｎｇ ｒａｎｇｅ）ＰＣＲによるＤＮＡ欠失分析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＤＮＡ欠失を検出するために、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲおよび長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ産物のプールのクローニングを行った。最初に、Ｇｅｎｏ Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｖｉｏｇｅｎｅ－ＢｉｏＴｅｋ， Ｔａｉｗａｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出した。次に、ネステッドＰＣＲを行って、長鎖ＤＮＡ領域を特異的に増幅した。まず、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用い、種々の長さ（３．５ｋｂ～２５ｍｂ）の標的ＤＮＡ領域を増幅するように設計された、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ用の何種類かの特異的プライマーセット（表５）を用いて、標的ＤＮＡ領域を増幅した。最初のＰＣＲ反応は、ＫＯＤ ＯＮＥ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）を用いて、下記の条件下で行った。１０秒９８℃、５秒６０℃および５０秒（アンプリコン：１５－２０ｋｂ）または１５０秒（アンプリコン：１０－１５ｋｂ）または２００秒（アンプリコン：＜１０ｋｂ）６８℃を３５サイクル。次いで、ＰＣＲ産物を１００～１０，０００倍に希釈し、ネステッドＰＣＲの鋳型として用いた。ネステッドＰＣＲは、また、上記と同じ条件下で行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）での染色によって視覚化した。ネステッドＰＣＲ産物をプールし、Ｍｏｎｏｆａｓ（登録商標）ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊａｐａｎ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の精製混合物を、Ｍｉｇｈｔｙ ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ， Ｊａｐａｎ）を用いてｐＭＤ２０－Ｔベクター中にクローン化した。ＡＡＶＳ－ｔｉｄ ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）のための１１９クローン、およびｈＥＭＸ１－ｔｉｄ ＧＴＴ＿９（－）のための２０クローンをピックアップし、Ｍ１３ ＵｎｉおよびＭ１３ ＲＶプライマーを用いてサンガー配列決定した。サンガー配列決定の結果をＢＬＡＴＮサーチおよびＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて分析して、ＤＮＡ欠失を同定した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＤＮＡ欠失を検出するために、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲおよび長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ産物のプールのクローニングを行った。最初に、Ｇｅｎｏ Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｖｉｏｇｅｎｅ－ＢｉｏＴｅｋ， Ｔａｉｗａｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出した。次に、ネステッドＰＣＲを行って、長鎖ＤＮＡ領域を特異的に増幅した。まず、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用い、種々の長さ（３．５ｋｂ～２５ｍｂ）の標的ＤＮＡ領域を増幅するように設計された、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ用の何種類かの特異的プライマーセット（表５）を用いて、標的ＤＮＡ領域を増幅した。最初のＰＣＲ反応は、ＫＯＤ ＯＮＥ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）を用いて、下記の条件下で行った。１０秒９８℃、５秒６０℃および５０秒（アンプリコン：１５－２０ｋｂ）または１５０秒（アンプリコン：１０－１５ｋｂ）または２００秒（アンプリコン：＜１０ｋｂ）６８℃を３５サイクル。次いで、ＰＣＲ産物を１００～１０，０００倍に希釈し、ネステッドＰＣＲの鋳型として用いた。ネステッドＰＣＲは、また、上記と同じ条件下で行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）での染色によって視覚化した。ネステッドＰＣＲ産物をプールし、Ｍｏｎｏｆａｓ（登録商標）ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊａｐａｎ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の精製混合物を、Ｍｉｇｈｔｙ ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ， Ｊａｐａｎ）を用いてｐＭＤ２０－Ｔベクター中にクローン化した。ＡＡＶＳ－ｔｉｄ ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）のための１１９クローン、およびｈＥＭＸ１－ｔｉｄ ＧＴＴ＿９（－）のための２０クローンをピックアップし、Ｍ１３ ＵｎｉおよびＭ１３ ＲＶプライマーを用いてサンガー配列決定した。サンガー配列決定の結果をＢＬＡＴＮサーチおよびＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて分析して、ＤＮＡ欠失を同定した。
トマト植物における長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲによる変異分析のために、ゲノムＤＮＡを独立して、ＳｌＩＡＡ９ ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）およびＧＴＴ＋ＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５（－）（＋）についてそれぞれ２０個のＴ０トランスジェニックＴｉＤトマトカルスから、ＳｌＲＩＮ ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）について３０個のＴ０カルスおよび１２個のＴ０シュートから、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｎｔ ＩＩ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）を用いて単離した。大きい欠失を分析するために、各ｇＲＮＡの標的部位を含む約５～６ｋｂｐの領域を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）および長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲのための数種類のプライマーセット（表５）を用いて、ＳｌＩＡＡ９ ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）のための最初のＰＣＲによって、およびＳｌＩＡＡ９ ＧＴＴ＋ＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５（－）（＋）およびＳｌＲＩＮ ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）のためのネステッドＰＣＲによって、下記の条件下で増幅した。１０秒９８℃、１５秒６０℃、および７分６８℃を３５サイクル。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイドで染色した。ＳｌＩＡＡ９ ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）について最初のラウンドのＰＣＲ産物をプールし、哺乳動物ＤＮＡための方法において記載したようにクローニングのために精製した。ＳｌＩＡＡ９ ＧＴＴ＋ＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５（－）（＋）およびＳｌＲＩＮ ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）トランスジェニックカルスのためのネステッドＰＣＲを行い、アガロースゲルで分離された小さいＤＮＡフラグメントだけをさらなる分析のためにゲルから抽出し、精製した。ＳｌＲＩＮ ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）トランスジェニックシュートのために、ネステッドＰＣＲを同じプライマーセットを用いて２回行い、小さいＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動後に抽出した。抽出フラグメントのクローニングは上記の通りに行った。各クローン化プラスミドをサンガーシークエンシングによって分析した。シークエンシング用のクローン数は、結果に記載するように各サンプルで異なった。
（９）短鎖ＤＮＡ領域（short range）ＰＣＲ産物における変異分析
トランスフェクトされたヒト細胞およびトランスジェニックトマトカルスおよびシュートに導入された変異を分析するために、ｇＲＮＡの標的座周辺の約４００ｂｐの領域を、上記のＰＣＲキットを用いる短鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲによって増幅した。Ｃｅｌ－１アッセイにおいて、トランスフェクトされたヒト細胞およびトランスジェニック植物由来のＰＣＲ産物をＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＩＤＴ）を用いて消化した。ＰＣＲ－ＲＦＬＰにおいて、トランスジェニックトマト植物由来のＰＣＲ産物をＡｃｃＩで消化した。変異および野生型ＤＮＡフラグメントを２～２．５％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄによって染色した。ＰＣＲアンプリコンは、また、ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）中にクローン化して、サンガー法によってその配列を決定した。オンターゲットおよびオフターゲット変異分析のためのアンプリコンディープ配列を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ－ｌａｂｅｌｌｅｄ ＰＣＲ（Ueta et al., 2017、上掲）を用いて行った。ＰＣＲ産物をＴｒｕｓｅｑ ｏｎ ｔｈｅ ＭｉＳｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， ＵＳＡ）に付した。ＭｉＳｅｑデータを、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．５．１（ＣＬＣ ｂｉｏ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて分析した。変異分析に用いられた短領域ＰＣＲ用の全プライマーは、表４に示す。
トランスフェクトされたヒト細胞およびトランスジェニックトマトカルスおよびシュートに導入された変異を分析するために、ｇＲＮＡの標的座周辺の約４００ｂｐの領域を、上記のＰＣＲキットを用いる短鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲによって増幅した。Ｃｅｌ－１アッセイにおいて、トランスフェクトされたヒト細胞およびトランスジェニック植物由来のＰＣＲ産物をＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＩＤＴ）を用いて消化した。ＰＣＲ－ＲＦＬＰにおいて、トランスジェニックトマト植物由来のＰＣＲ産物をＡｃｃＩで消化した。変異および野生型ＤＮＡフラグメントを２～２．５％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄによって染色した。ＰＣＲアンプリコンは、また、ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）中にクローン化して、サンガー法によってその配列を決定した。オンターゲットおよびオフターゲット変異分析のためのアンプリコンディープ配列を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ－ｌａｂｅｌｌｅｄ ＰＣＲ（Ueta et al., 2017、上掲）を用いて行った。ＰＣＲ産物をＴｒｕｓｅｑ ｏｎ ｔｈｅ ＭｉＳｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， ＵＳＡ）に付した。ＭｉＳｅｑデータを、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．５．１（ＣＬＣ ｂｉｏ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて分析した。変異分析に用いられた短領域ＰＣＲ用の全プライマーは、表４に示す。
実施例１：ＴｉＤシステムのヌクレアーゼモジュールの同定
Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓエフェクタータンパク質の成分、およびｃｒＲＮＡ配列をＢＬＡＳＴプラグラムを用いて評価した。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＣＣ９８０８株のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴｉＤ遺伝子座は、７．６ｋｂにわたり、８つのＣａｓ遺伝子：Ｃａｓ１ｄ、Ｃａｓ２ｄ、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ４ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、次いで３６個のリピート－スペーサー単位のアレイからなる。ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦシステムのＤＮＡ切断において機能するＨＤドメインは、Ｃａｓ３ｄには無かったが、Ｃａｓ１０ｄがそのＮ末端領域にＨＤ様ヌクレアーゼドメインを有することを見出した。該ＨＤ様ドメインがヌクレアーゼとして機能するかどうかを確認するために、イン・ビトロで合成したＣａｓ１０ｄタンパク質および基質としてＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを含有する反応ミックスにおいて、ＡＴＰおよび金属イオンＮｉ２＋およびＣｏ２＋の存在下でイン・ビトロ ヌクレアーゼアッセイを行った。その結果、Ｃａｓ１０ｄが一本鎖ＤＮＡを切断できることが示され、Ｃａｓ１０ｄがＴｉＤシステムにおいてヌクレアーゼとして作用することが示された（図１）。
Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓエフェクタータンパク質の成分、およびｃｒＲＮＡ配列をＢＬＡＳＴプラグラムを用いて評価した。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＣＣ９８０８株のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴｉＤ遺伝子座は、７．６ｋｂにわたり、８つのＣａｓ遺伝子：Ｃａｓ１ｄ、Ｃａｓ２ｄ、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ４ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、次いで３６個のリピート－スペーサー単位のアレイからなる。ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦシステムのＤＮＡ切断において機能するＨＤドメインは、Ｃａｓ３ｄには無かったが、Ｃａｓ１０ｄがそのＮ末端領域にＨＤ様ヌクレアーゼドメインを有することを見出した。該ＨＤ様ドメインがヌクレアーゼとして機能するかどうかを確認するために、イン・ビトロで合成したＣａｓ１０ｄタンパク質および基質としてＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを含有する反応ミックスにおいて、ＡＴＰおよび金属イオンＮｉ２＋およびＣｏ２＋の存在下でイン・ビトロ ヌクレアーゼアッセイを行った。その結果、Ｃａｓ１０ｄが一本鎖ＤＮＡを切断できることが示され、Ｃａｓ１０ｄがＴｉＤシステムにおいてヌクレアーゼとして作用することが示された（図１）。
実施例２：細胞中でのゲノム編集ツールとしてのＴｉＤの生物学的活性
（１）ＴｉＤのエンドヌクレアーゼ活性
各単一Ｃａｓ発現ベクターおよびｃｒＲＮＡ発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させ、プルダウンアッセイにより、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄとｃｒＲＮＡとがイン・ビボで複合体を形成することを確認した。
（１）ＴｉＤのエンドヌクレアーゼ活性
各単一Ｃａｓ発現ベクターおよびｃｒＲＮＡ発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させ、プルダウンアッセイにより、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄとｃｒＲＮＡとがイン・ビボで複合体を形成することを確認した。
上記ＴｉＤ複合体の生物学的ゲノム編集活性を評価するために、ルシフェラーゼ一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）組換えシステムを用いたルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーターアッセイを行った(図２ａ）。終止コドンによって分離される３００ｂｐ相同性アームならびにＴｉＤ標的部位を含有するヒトＡＡＶＳ１遺伝子フラグメントを含有するＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを組換えレポーターとして用いた。各単一Ｃａｓ発現ベクター、ＴｉＤ ｃｒＲＮＡ発現ベクター、および標的配列が導入されたＬＵＣレポーターベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトし、トランスフェクション後７２時間、ルミネッセンスによりエンドヌクレアーゼ切断を検出した。使用した標的配列を表２に示す。
Ｃａｓ１０ｄ ＨＤ様ドメインの機能を評価するために、野生型Ｃａｓ１０ｄおよびＨＤ様ドメイン中に変異（Ｈ１７７Ａ）を有するｄＣａｓ１０ｄを含むＴｉＤ Ｃａｓ遺伝子発現ベクターと、ｇＲＮＡ ＡＡＶＳ１ ＧＴＣ＿７０－１７０（＋）およびＡＡＶＳ１ ＧＴＣ＿１５９－１９６（＋）、および非標的ｇＲＮＡを用いるｌｕｃレポーターアッセイを行った。各単一Ｃａｓ遺伝子の発現ベクターとして、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄまたはｄＣａｓ１０ｄ（Ｈ１７７Ａ）－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、およびｐＥＦｓ－ＳＶ４０ＮＬＳ ＨＡ－Ｃａｓ３ｄ、Ｓｔｒｅｐｔ－Ｃａｓ５ｄ、Ｍｙｃ－Ｃａｓ６ｄ、またはＦＬＡＧ－Ｃａｓ７ｄをｌｕｃレポーターアッセイに用いた。結果を図２ｂに示す。
この結果により、Ｃａｓ１０ｄが実際に細胞におけるゲノム編集に利用できるヌクレアーゼ活性を有することが分かった。ＴｉＤの発現は、ｌｕｃレポーターアッセイにおいて、非標的対照よりも顕著に高い（２～４倍）活性をもたらした（図２ｂ～図２ｅ）。Ｃａｓ１０ｄまたはＣａｓ３ｄ以外のＴｉＤ Ｃａｓ遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした場合、ルシフェラーゼ活性は、非標的対照のそれに匹敵した(図２ｃ）。この結果は、ＴｉＤの活性にはＣａｓ３ｄの他にＣａｓ１０ｄが必須であることを示す。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＣＣ９８０８株のもともとのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座において、３５塩基および３６塩基の両方のプロトスペーサー配列を用いて特定のゲノムＤＮＡを標的化した。ＴｉＤ活性は、３５塩基または３６塩基ｇＲＮＡのいずれかを用いて評価し、両方のｇＲＮＡが細胞におけるゲノム編集のために機能した（図２ｄ）。また、成熟ｃｒＲＮＡまたはプレ成熟ｃｒＲＮＡのいずれかを用いてＴｉＤ活性を試験した（図２ｅ）。その結果、ＴｉＤでは、プレ成熟ｃｒＲＮＡの発現が有効であることが分かった。
（２）ＴｉＤの標的配列設計
さらに、ゲノム編集に必要とされるＴｉＤの標的ｇＲＮＡ配列における重要なヌクレオチドについて、スプリットタイプのベクターを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｌｕｃレポーターアッセイを用いて評価した。簡単に言うと、ＰＡＭ配列に隣接する３５塩基配列の各位置に変異を入れたＡＡＶＳ１＿ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）標的ｇＲＮＡを調製し、各ｇＲＮＡを用いるＴｉＤ活性をｌｕｃレポーターアッセイによって測定した。結果を図３ａに示す。その結果、ＰＡＭ配列３’側の１、６、１２、１８または２４ｎｔ位置にヌクレオチドのミスマッチがあった場合でも、ＴｉＤ活性が保持されていた。すなわち、ＰＡＭ配列３’側の１、６、１２、１８または２４ｎｔ位置の１塩基ミスマッチに対するオフターゲット変異導入の可能性が高いことが判明した。しかし、ＰＡＭ配列３’側の１、６、１２、１８または２４ｎｔ位置に加えて、１～２４ｎｔ位置にさらなる１つのミスマッチ、すなわち１～２４ｎｔ位置に２つのミスマッチを持つ標的に対しては、ＴｉＤ活性は有意に減少することが判明した（図３ｂ）。さらには、標的配列に対していずれか３つのミスマッチが見いだされた場合は、その標的に対して、ほぼ完全にＴｉＤ活性を抑制することができ、３塩基のミスマッチを含む類似配列に対するオフターゲット変異導入を抑制できることが明らかとなった（図３ｃ）。さらに、ＰＡＭ配列３’側の２４ｎｔ以降（例えば、２４～３５ｎｔ）の位置に１つまたは２つのミスマッチを持つ標的に対しては、ＴｉＤ活性が保持されていた（図３ａおよび図３ｂ）。
さらに、ゲノム編集に必要とされるＴｉＤの標的ｇＲＮＡ配列における重要なヌクレオチドについて、スプリットタイプのベクターを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｌｕｃレポーターアッセイを用いて評価した。簡単に言うと、ＰＡＭ配列に隣接する３５塩基配列の各位置に変異を入れたＡＡＶＳ１＿ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）標的ｇＲＮＡを調製し、各ｇＲＮＡを用いるＴｉＤ活性をｌｕｃレポーターアッセイによって測定した。結果を図３ａに示す。その結果、ＰＡＭ配列３’側の１、６、１２、１８または２４ｎｔ位置にヌクレオチドのミスマッチがあった場合でも、ＴｉＤ活性が保持されていた。すなわち、ＰＡＭ配列３’側の１、６、１２、１８または２４ｎｔ位置の１塩基ミスマッチに対するオフターゲット変異導入の可能性が高いことが判明した。しかし、ＰＡＭ配列３’側の１、６、１２、１８または２４ｎｔ位置に加えて、１～２４ｎｔ位置にさらなる１つのミスマッチ、すなわち１～２４ｎｔ位置に２つのミスマッチを持つ標的に対しては、ＴｉＤ活性は有意に減少することが判明した（図３ｂ）。さらには、標的配列に対していずれか３つのミスマッチが見いだされた場合は、その標的に対して、ほぼ完全にＴｉＤ活性を抑制することができ、３塩基のミスマッチを含む類似配列に対するオフターゲット変異導入を抑制できることが明らかとなった（図３ｃ）。さらに、ＰＡＭ配列３’側の２４ｎｔ以降（例えば、２４～３５ｎｔ）の位置に１つまたは２つのミスマッチを持つ標的に対しては、ＴｉＤ活性が保持されていた（図３ａおよび図３ｂ）。
さらに、ＡＡＶＳ１＿ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）の５’側から１～３０塩基配列を標的として、上記の３５塩基配列の場合と同様に、ＰＡＭ配列に隣接する３０塩基配列の各位置に変異を入れたｇＲＮＡを調製し、各ｇＲＮＡを用いるＴｉＤ活性をｌｕｃレポーターアッセイによって測定した。結果を図３ｄに示す。その結果、ＰＡＭ配列３’側の６、１２、１８、２４～３０ｎｔのいずれかの位置にヌクレオチドのミスマッチがあった場合に、ＴｉＤ活性が保持されていた。したがって、標的配列が３５塩基長である場合は、ＰＡＭ配列の３’側の１、６、１２、１８、２４～３５番目のそれぞれの位置（１６箇所）における１塩基ミスマッチがオフターゲット変異を引き起こすリスクがあるのに対して、標的配列が３０塩基長である場合は、１塩基ミスマッチによるオフターゲット変異リスクが、ＰＡＭ配列の３’側の６、１２、１８、２４～３０番目のそれぞれの位置（１０箇所）へと低減した。
（３）Ｃａｓ遺伝子へのＮＬＳの付加の効果
さらに、Ｎ末端および／またはＣ末端にモノパータイト型核ＮＬＳ（ＳＶ４０ＮＬＳ）またはバイパータイト型ＮＬＳ（ｂｐＮＬＳ）を付加した各Ｃａｓ遺伝子を含む発現カセット（図４ａ）をそれぞれ別々のベクターに搭載させ、標的配列が導入されたＬＵＣレポーターベクターと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし導入し、ｌｕｃレポーターアッセイを行った。さらに、トランスフェクト細胞の抽出液（サイトソルおよび核）から各Ｃａｓ－ＮＬＳタンパク質を各タグに対する抗体を用いて検出した（図４ｃおよび図４ｄ）。その結果、興味深いことに、ｂｐＮＬＳは、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端およびＣ末端の両方に付加することにより、Ｎ末端あるいはＣ末端に単独で付加するよりも効果的に機能した（図４ｂ）。しかし、Ｃａｓ７ｄに付加したｂｐＮＬＳは、核内で強く発現したものの（図４ｄ）、ＴｉＤ活性を破壊した（図４ｂ)。ＳＶ４０ＮＬＳは各Ｃａｓタンパク質のＮ末端への付加により効果的に機能した（図４ａ）。
さらに、Ｎ末端および／またはＣ末端にモノパータイト型核ＮＬＳ（ＳＶ４０ＮＬＳ）またはバイパータイト型ＮＬＳ（ｂｐＮＬＳ）を付加した各Ｃａｓ遺伝子を含む発現カセット（図４ａ）をそれぞれ別々のベクターに搭載させ、標的配列が導入されたＬＵＣレポーターベクターと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし導入し、ｌｕｃレポーターアッセイを行った。さらに、トランスフェクト細胞の抽出液（サイトソルおよび核）から各Ｃａｓ－ＮＬＳタンパク質を各タグに対する抗体を用いて検出した（図４ｃおよび図４ｄ）。その結果、興味深いことに、ｂｐＮＬＳは、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端およびＣ末端の両方に付加することにより、Ｎ末端あるいはＣ末端に単独で付加するよりも効果的に機能した（図４ｂ）。しかし、Ｃａｓ７ｄに付加したｂｐＮＬＳは、核内で強く発現したものの（図４ｄ）、ＴｉＤ活性を破壊した（図４ｂ)。ＳＶ４０ＮＬＳは各Ｃａｓタンパク質のＮ末端への付加により効果的に機能した（図４ａ）。
実施例３：動物細胞におけるＴｉＤ発現ベクターの最適化
ＴｉＤ ｇＲＮＡ標的に対応する内在性ゲノムＤＮＡ領域を標的とするゲノム編集を行うため、まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中におけるＣａｓタンパク質の発現レベルを再評価した。いくつかの型のＴｉＤ Ｃａｓ遺伝子発現ベクター［各Ｃａｓ遺伝子について別々の発現ベクター、３遺伝子（Ｃａｓ５－Ｃａｓ６－Ｃａｓ７）発現カセットおよび２遺伝子（Ｃａｓ３－Ｃａｓ１０）発現カセットをそれぞれ含有する２セット型ベクター、および５遺伝子（全Ｃａｓ）発現カセットを含有するオールインワン型ベクター］を構築した（図５ａ）。２セット型ベクター中のＣａｓ３およびＣａｓ１０、またはＣａｓ５、Ｃａｓ６およびＣａｓ７、およびオールインワン型ベクター中の全Ｃａｓ遺伝子は、同時に発現する単一の転写産物を生じるように、２Ａ自己切断型ペプチドを介して融合させた。各Ｃａｓ遺伝子のＮ末端には異なるタグを有するＳＶ４０ＮＬＳを付加した。上記の各Ｃａｓ発現ベクターおよび２セット型ベクターの種々の組み合わせ、またはオールインワン型ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトして、細胞中での各Ｃａｓタンパク質の発現を測定した。発現レベルは、Ｃａｓに融合させた各タグに特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングによって検出した（図５ｂ）。さらに、単一Ｃａｓ発現ベクターにおいて、ｐＥＦベクター中の翻訳伸長因子１αプロモーター、およびｐＣＡＧ中のチキンβアクチンプロモーターを用いた場合のＣａｓタンパク質発現レベルを同様に検出した（図５ｃ）。
ＴｉＤ ｇＲＮＡ標的に対応する内在性ゲノムＤＮＡ領域を標的とするゲノム編集を行うため、まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中におけるＣａｓタンパク質の発現レベルを再評価した。いくつかの型のＴｉＤ Ｃａｓ遺伝子発現ベクター［各Ｃａｓ遺伝子について別々の発現ベクター、３遺伝子（Ｃａｓ５－Ｃａｓ６－Ｃａｓ７）発現カセットおよび２遺伝子（Ｃａｓ３－Ｃａｓ１０）発現カセットをそれぞれ含有する２セット型ベクター、および５遺伝子（全Ｃａｓ）発現カセットを含有するオールインワン型ベクター］を構築した（図５ａ）。２セット型ベクター中のＣａｓ３およびＣａｓ１０、またはＣａｓ５、Ｃａｓ６およびＣａｓ７、およびオールインワン型ベクター中の全Ｃａｓ遺伝子は、同時に発現する単一の転写産物を生じるように、２Ａ自己切断型ペプチドを介して融合させた。各Ｃａｓ遺伝子のＮ末端には異なるタグを有するＳＶ４０ＮＬＳを付加した。上記の各Ｃａｓ発現ベクターおよび２セット型ベクターの種々の組み合わせ、またはオールインワン型ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトして、細胞中での各Ｃａｓタンパク質の発現を測定した。発現レベルは、Ｃａｓに融合させた各タグに特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングによって検出した（図５ｂ）。さらに、単一Ｃａｓ発現ベクターにおいて、ｐＥＦベクター中の翻訳伸長因子１αプロモーター、およびｐＣＡＧ中のチキンβアクチンプロモーターを用いた場合のＣａｓタンパク質発現レベルを同様に検出した（図５ｃ）。
その結果、上記のベクターのうち、単一Ｃａｓ遺伝子発現ベクターでのトランスフェクションが、ヒト細胞において最も高いＣａｓタンパク質発現をもたらした。また、オールインワン型ベクターよりも、それぞれ１または２以上のＣａｓ遺伝子を含む２以上のＣａｓ発現ベクター（セパレート型ベクター）を用いた方が高いＣａｓタンパク質発現をもたらすことが分かった。
実施例４：動物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ ＴｉＤにより誘導されるゲノム編集
ＴｉＤシステムにより長鎖領域欠失を誘導するか、ルシフェラーゼＳＳＡアッセイを用いて調べた。標的として、ヒトＥＭＸ１遺伝子に関してｈＥＭＸ１ ＧＴＴ９（－）、およびＡＡＶＳ遺伝子に関してＡＡＶＳ ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）を選択した。上記の標的配列をｇＲＮＡ発現ベクター中に組み込み、各単一Ｃａｓ発現ベクターと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。ｈＥＭＸ１およびＡＡＶＳ標的部位付近の５－１９ｋｂの側面に位置する数種類のプライマーセットを用いて（表５）、ＴｉＤシステムを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全ＤＮＡから、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し（図６ａ、ｂ）、クローン化し、サンガー法によって配列決定した。結果を図６ａ－ｃに示す。
ＴｉＤシステムにより長鎖領域欠失を誘導するか、ルシフェラーゼＳＳＡアッセイを用いて調べた。標的として、ヒトＥＭＸ１遺伝子に関してｈＥＭＸ１ ＧＴＴ９（－）、およびＡＡＶＳ遺伝子に関してＡＡＶＳ ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）を選択した。上記の標的配列をｇＲＮＡ発現ベクター中に組み込み、各単一Ｃａｓ発現ベクターと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。ｈＥＭＸ１およびＡＡＶＳ標的部位付近の５－１９ｋｂの側面に位置する数種類のプライマーセットを用いて（表５）、ＴｉＤシステムを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全ＤＮＡから、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し（図６ａ、ｂ）、クローン化し、サンガー法によって配列決定した。結果を図６ａ－ｃに示す。
結果は、ＴｉＤが、両標的部位で５ｋｂから１９ｋｂを超える長鎖領域欠失を導入したことを示した。興味深いことに、クローン化したＰＣＲ産物中の変異分布は標的によって異なった。すなわち、ｈＥＭＸ１ ＧＴＴ＿９（－）による変異は低モザイクを示したが、ＡＡＶＳ ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）による変異はより変化した変異配列を示した(図６ｂ、ｃ）。ＡＡＶＳ ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）範囲配列は、いくつかの特異的な特徴を共有した。すなわち、主要な長鎖領域欠失のサイズは、ランダムではなく、標的ＡＡＶＳ ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）の場合、５．２－５．５ｋｂおよび１７ｋｂ欠失としていくつかの限定を示し、主として二方向性の欠失が検出された（図６ｃ、図７ａ、ｂ）。これらの特徴は、タイプＩ－Ｅ（非特許文献１）やタイプＩＩエフェクター（Ｃａｓ９やＣｐｆ１）による変異後のものと異なっていた。また、マイクロホモロジーおよび挿入がＴｉＤ変異部位に観察された(図６ａ、図７ａ、ｂ）。クローン化ＤＮＡフラグメントにおけるＴｉＤによる長鎖領域欠失に関する変異率は、ｈＥＭＸ１ ＧＴＴ＿９（－）およびＡＡＶＳ ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）でそれぞれ、５５．０％および５７．１％であった。
実施例５：植物におけるＴｉＤによる標的変異導入
コドン最適化したＣａｓ遺伝子の発現のための植物細胞特異的プロモーターおよびｃｒＲＮＡを含むＴｉＤベクターを構築して、トマト植物中に部位特異的変異誘発を導入した。ＴｉＤベクターとして、５つのＣａｓ遺伝子を単一発現カセットに含むベクター（ｐＴｉＤＰ１．２）、および５つのＣａｓ遺伝子を２つの発現カセットに分けて含むベクター（ｐＭＧＴｉＤＰ２０）を構築した（図８ｂ）。ＴｉＤのｇＲＮＡは、トマトＩＡＡ９（ＳｌＩＡＡ９）遺伝子（単為結実に重要）およびトマトＲＩＮ（ＳｌＲＩＮ）遺伝子（果実成熟に関与）中の３５塩基配列を標的化するように設計された。ＳｌＩＡＡ９遺伝子について、ｌｕｃレポーターアッセイを行ってＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－Ａ（－）およびＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）を選択した（図８ａ）。ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）のための単一のｇＲＮＡ、およびＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－Ａ（－）およびＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－Ｂ（＋）のための複数のｇＲＮＡ（表２)の両方を更なる分析に用いた。設計されたｇＲＮＡを含有するＴｉＤベクターを、アグロバクテリウム媒介形質転換によってトマト栽培種Ｍｉｃｒｏ－ＴｏｍまたはＡｉｌｓａ Ｃｒａｉｇ中に形質転換した。トランスジェニックトマトのカルスにおけるＴｉＤによって効率よく導入された変異を、Ｃｅｌ－１、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ、およびシークエンシングによって分析した。
コドン最適化したＣａｓ遺伝子の発現のための植物細胞特異的プロモーターおよびｃｒＲＮＡを含むＴｉＤベクターを構築して、トマト植物中に部位特異的変異誘発を導入した。ＴｉＤベクターとして、５つのＣａｓ遺伝子を単一発現カセットに含むベクター（ｐＴｉＤＰ１．２）、および５つのＣａｓ遺伝子を２つの発現カセットに分けて含むベクター（ｐＭＧＴｉＤＰ２０）を構築した（図８ｂ）。ＴｉＤのｇＲＮＡは、トマトＩＡＡ９（ＳｌＩＡＡ９）遺伝子（単為結実に重要）およびトマトＲＩＮ（ＳｌＲＩＮ）遺伝子（果実成熟に関与）中の３５塩基配列を標的化するように設計された。ＳｌＩＡＡ９遺伝子について、ｌｕｃレポーターアッセイを行ってＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－Ａ（－）およびＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）を選択した（図８ａ）。ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）のための単一のｇＲＮＡ、およびＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－Ａ（－）およびＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－Ｂ（＋）のための複数のｇＲＮＡ（表２)の両方を更なる分析に用いた。設計されたｇＲＮＡを含有するＴｉＤベクターを、アグロバクテリウム媒介形質転換によってトマト栽培種Ｍｉｃｒｏ－ＴｏｍまたはＡｉｌｓａ Ｃｒａｉｇ中に形質転換した。トランスジェニックトマトのカルスにおけるＴｉＤによって効率よく導入された変異を、Ｃｅｌ－１、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ、およびシークエンシングによって分析した。
ｐＭＧＴｉＤＰ２０ベクターを用いたトマト栽培種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍのトランスジェニックトマトにおいて、長鎖領域欠失（図９、図１０ａ－ｃ）が検出された。長鎖領域欠失の向きおよび変異率は、配列分析によって決定された（図９）。トランスジェニックカルスにおいて、ＳｌＩＡＡ９ ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）によって導入されたいくつかの型の長鎖欠失がＰＣＲによって検出され、クローン化ＤＮＡの配列決定により、１つのカルス系統において、６．７％の変異率（１／１５シークエンシングクローン）を有する混合ＰＣＲ産物から二方向性の欠失（Δ２４６３ｎｔ）が同定された（＃５、図９、上左パネルレーン５）。対照的に、ＳｌＡＡ９ ＧＴＴ＋ＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－（－）（＋）およびＳｌＲＩＮ ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）を用いて、それぞれ１／２０および１／３０トランスジェニックカルスにおいて特異的欠失バンドが検出された（図９、真ん中の左パネルレーン３および下の左パネルレーン６）。これらの特異的バンドをアガロースゲルから精製し、配列分析した結果、それぞれΔ４３０５ｎｔおよびΔ４９３０ｎｔの二方向性欠失を有するこれらのクローンにおいて同じ１００％変異フラグメントが示された（図９）。また、ＳｌＲＩＮ ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）について再生トマトシュートにおける変異を分析し、トランスジェニックシュート１２個体中、４つが、長領域ＰＣＲによって特異的バンドを示した（図１０ａ）。興味深いことに、２種類の長領域欠失（Δ４９３０ｎｔおよびΔ７２５７ｎｔ）を有する同様のバンドパターンが検出され（図１０ｃ）、これにより、２対立遺伝子変異が示された。
ｐＴｉＤＰ１．２ベクターを用いたトマト栽培種Ｍｉｃｒｏ－ＴｏｍまたはＡｉｌｓａ Ｃｒａｉｇのトランスジェニックトマトにおいて、短鎖領域の挿入および／または欠失が検出された。これらのトランスジェニックシュートは、１００％変異ＤＮＡを含有していた（図１１）。これらの結果は、トマトカルスからの再生の間にトランスフェクトトマトシュートにおいて変異率が増加したことを示唆した。該シュート由来の標的ＤＮＡでのクローン化ＰＣＲ産物の配列分析は、ＴｉＤが２対立遺伝子変異をもたらしたことを示した。２対立遺伝子変異は、また、市販のトマト栽培種Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇを用いても生じた（図１１、図１２）。成熟２対立遺伝子トマト植物は、明白な典型的なＳｌＩＡＡ９破壊表現型、すなわち、単為結実および葉形態における変化を示した。ホモ接合体変異体は、Ｔ０世代から有効に単離された（図１１）。したがって、ＴｉＤによる変異植物のトランスジェニック世代における所望の表現型は、遺伝的に次世代に受け継がれることが分かった。
次に、明らかなＩＡＡ９遺伝子ノックアウト表現型を示しているトマト植物Ａｉｌｓａ ＣｒａｉｇのＴ０世代におけるオフターゲット変異を分析した。９～１１個のミスマッチを有する３つの潜在的なオフターゲット部位を選択した（図１３)。該オフターゲット部位付近のＰＣＲ産物を増幅し、次世代シークエンサー（ＭｉＳｅｑ）を用いて配列決定した。標的配列上のいくつかの塩基位置に単一ミスマッチを有する種々のｇＲＮＡを用いてｌｕｃレポーターアッセイを行い、いくつかのミスマッチ位置でＴｉＤ活性が可能であったことを示されたが（図３ａ－ｄ）、トマト植物のＴ０世代において、オフターゲット変異は皆無かそれに近かった（図１３）。
本発明のＴｉＤシステムの、種々の範囲の長い欠失を単一の標的部位に生じさせる能力は、単純かつ効果的な多重遺伝子機能スクリーニングを可能とする長領域染色体編集を可能にする。ＣＲＩＳＰＲツールボックスにおける新規なテクノロジーとして、ＴｉＤはゲノム編集における新たな可能性に通ずる。
SEQ ID NO:1; Microcystis aeruginosa Cas3d amino acid sequence
SEQ ID NO:2; Microcystis aeruginosa Cas5d amino acid sequence
SEQ ID NO:3; Microcystis aeruginosa Cas6d amino acid sequence
SEQ ID NO:4; Microcystis aeruginosa Cas7d amino acid sequence
SEQ ID NO:5; Microcystis aeruginosa Cas10d amino acid sequence
SEQ ID NO:6; Monopartite nuclear localizing signal (NLS) amino acid sequence
SEQ ID NO:7; Bipartite NLS amino acid sequence
SEQ ID NO:8; TiDcrRNA containing repeat (37b) and spacer (35b of N). N is any nucleotide constituting a sequence that forms base pairs with a target nucleotide sequence
SEQ ID NO:9; DNA fragment for pre-mature crRNA
SEQ ID NO:10; DNA fragment for mature crRNA
SEQ ID NO:47; Primer
SEQ ID NO:48; Primer
SEQ ID NO:49; Primer
SEQ ID NO:50; Primer
SEQ ID NO:51; Primer
SEQ ID NO:52; Primer
SEQ ID NO:53; Primer
SEQ ID NO:54; Primer
SEQ ID NO:55; Primer
SEQ ID NO:56; Primer
SEQ ID NO:57; Primer
SEQ ID NO:58; Primer
SEQ ID NO:59; Primer
SEQ ID NO:60; Primer
SEQ ID NO:61; Primer
SEQ ID NO:62; Primer
SEQ ID NO:63; Primer
SEQ ID NO:64; Primer
SEQ ID NO:65; Primer
SEQ ID NO:66; Primer
SEQ ID NO:67; Primer
SEQ ID NO:68; Primer
SEQ ID NO:69; Primer
SEQ ID NO:70; Primer
SEQ ID NO:71; Primer
SEQ ID NO:72; Primer
SEQ ID NO:73; Primer
SEQ ID NO:74; Primer
SEQ ID NO:75; Primer
SEQ ID NO:76; Primer
SEQ ID NO:77; Primer
SEQ ID NO:78; Primer
SEQ ID NO:79; Primer
SEQ ID NO:80; Primer
SEQ ID NO:81; Primer
SEQ ID NO:82; Primer
SEQ ID NO:83; Primer
SEQ ID NO:84; Primer
SEQ ID NO:85; Primer
SEQ ID NO:86; SlIAA9-tid gRNA on-target
SEQ ID NO:87; SlIAA9-tid gRNA off-target 1
SEQ ID NO:88; SlIAA9-tid gRNA off-target 2
SEQ ID NO:89; SlIAA9-tid gRNA off-target 3
SEQ ID NO:2; Microcystis aeruginosa Cas5d amino acid sequence
SEQ ID NO:3; Microcystis aeruginosa Cas6d amino acid sequence
SEQ ID NO:4; Microcystis aeruginosa Cas7d amino acid sequence
SEQ ID NO:5; Microcystis aeruginosa Cas10d amino acid sequence
SEQ ID NO:6; Monopartite nuclear localizing signal (NLS) amino acid sequence
SEQ ID NO:7; Bipartite NLS amino acid sequence
SEQ ID NO:8; TiDcrRNA containing repeat (37b) and spacer (35b of N). N is any nucleotide constituting a sequence that forms base pairs with a target nucleotide sequence
SEQ ID NO:9; DNA fragment for pre-mature crRNA
SEQ ID NO:10; DNA fragment for mature crRNA
SEQ ID NO:47; Primer
SEQ ID NO:48; Primer
SEQ ID NO:49; Primer
SEQ ID NO:50; Primer
SEQ ID NO:51; Primer
SEQ ID NO:52; Primer
SEQ ID NO:53; Primer
SEQ ID NO:54; Primer
SEQ ID NO:55; Primer
SEQ ID NO:56; Primer
SEQ ID NO:57; Primer
SEQ ID NO:58; Primer
SEQ ID NO:59; Primer
SEQ ID NO:60; Primer
SEQ ID NO:61; Primer
SEQ ID NO:62; Primer
SEQ ID NO:63; Primer
SEQ ID NO:64; Primer
SEQ ID NO:65; Primer
SEQ ID NO:66; Primer
SEQ ID NO:67; Primer
SEQ ID NO:68; Primer
SEQ ID NO:69; Primer
SEQ ID NO:70; Primer
SEQ ID NO:71; Primer
SEQ ID NO:72; Primer
SEQ ID NO:73; Primer
SEQ ID NO:74; Primer
SEQ ID NO:75; Primer
SEQ ID NO:76; Primer
SEQ ID NO:77; Primer
SEQ ID NO:78; Primer
SEQ ID NO:79; Primer
SEQ ID NO:80; Primer
SEQ ID NO:81; Primer
SEQ ID NO:82; Primer
SEQ ID NO:83; Primer
SEQ ID NO:84; Primer
SEQ ID NO:85; Primer
SEQ ID NO:86; SlIAA9-tid gRNA on-target
SEQ ID NO:87; SlIAA9-tid gRNA off-target 1
SEQ ID NO:88; SlIAA9-tid gRNA off-target 2
SEQ ID NO:89; SlIAA9-tid gRNA off-target 3
Claims (19)
- 細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、該細胞に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含む２以上のベクターからなり、
前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含む２以上の発現カセットからなり、
ここに、各ベクター又は各発現カセットは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する調節エレメントを含み、
前記Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に核移行シグナルをコードする配列が付加されており、ここに、前記核移行シグナルは、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナルであり、但し、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡの５’末端および／または３’末端側にはモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されており、
前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端側及び３’末端側の両方に、バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、方法（但し、ヒトの生体内における方法を除く）。 - 細胞内の標的遺伝子の発現を抑制するための方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列である、請求項１記載の方法。
- 前記バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が配列番号７に示されるアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項１又は２記載の方法。
- 前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットがＣａｓ７ｄをコードするＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に、２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
- 前記調節エレメントが、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター又はＣＡＧキメラ合成プロモーターである、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
- 前記ベクター系が第一ないし第五のベクターからなり、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々に第一ないし第五のベクターに含まれる、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
- Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡが発現カセット系に含まれ、前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ及びＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、前記第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含み、かつ、前記第一の発現カセット及び前記第二の発現カセットが１つのベクターに搭載されている、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
- 前記ｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞への導入がベクターを介して行われる、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
- 前記ｃｒＲＮＡがプレ成熟型ｃｒＲＮＡである、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
- 前記Ｃａｓ３ｄ、前記Ｃａｓ５ｄ、前記Ｃａｓ６ｄ、前記Ｃａｓ７ｄ及び前記Ｃａｓ１０ｄがＭ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のものである、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
- 改変が塩基の欠失、挿入、又は置換である、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
- 改変が数キロベース～数十キロベースの欠失である、請求項１２記載の方法。
- 細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含み、
前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含む２以上のベクターからなり、
前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含む２以上の発現カセットからなり、
ここに、各ベクター又は各発現カセットは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する調節エレメントを含み、
前記Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に核移行シグナルをコードする配列が付加されており、ここに、前記核移行シグナルは、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナルであり、但し、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡの５’末端および／または３’末端側にはモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されており、
前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端側及び３’末端側の両方に、バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、キット。 - 前記バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が配列番号７に示されるアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項１４記載のキット。
- 前記ベクター系が第一ないし第五のベクターからなり、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々に第一ないし第五のベクターに含まれる、請求項１４又は１５記載のキット。
- Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡが第一及び第二の発現カセットからなる発現カセット系に含まれ、前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ及びＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、前記第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含む、請求項１４又は１５記載のキット。
- 細胞内の標的ヌクレオチド配列を特異的に標的化する方法であって、該細胞に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ及びＣａｓ７ｄ、又はこれらのタンパク質をコードする核酸、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、１つ又は２つの塩基のみが相違している以下の類似配列：
ＰＡＭ配列の３’側から１番目の塩基が相違する類似配列、
ＰＡＭ配列の３’側から６番目の塩基が相違する類似配列、
ＰＡＭ配列の３’側から１２番目の塩基が相違する類似配列、
ＰＡＭ配列の３’側から１８番目の塩基が相違する類似配列、および
ＰＡＭ配列の３’側から２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違する類似配列
の全てが存在しないように設計される、方法（但し、ヒトの生体内における方法を除く）。 - 細胞内の標的ヌクレオチド配列を特異的に改変する方法であって、該細胞に、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質 Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ及びＣａｓ１０ｄ、又はこれらのタンパク質をコードする核酸、及び
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、１つ又は２つの塩基のみが相違している以下の類似配列：
ＰＡＭ配列の３’側から１番目の塩基が相違する類似配列、
ＰＡＭ配列の３’側から６番目の塩基が相違する類似配列、
ＰＡＭ配列の３’側から１２番目の塩基が相違する類似配列、
ＰＡＭ配列の３’側から１８番目の塩基が相違する類似配列、および
ＰＡＭ配列の３’側から２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違する類似配列
の全てが存在しないように設計される、方法（但し、ヒトの生体内における方法を除く）。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962818450P | 2019-03-14 | 2019-03-14 | |
| US62/818,450 | 2019-03-14 | ||
| PCT/JP2020/011283 WO2020184723A1 (ja) | 2019-03-14 | 2020-03-13 | Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的配列改変技術 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2020184723A1 JPWO2020184723A1 (ja) | 2020-09-17 |
| JP7489112B2 true JP7489112B2 (ja) | 2024-05-23 |
Family
ID=72426781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021505164A Active JP7489112B2 (ja) | 2019-03-14 | 2020-03-13 | Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的配列改変技術 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7489112B2 (ja) |
| WO (1) | WO2020184723A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20230374479A1 (en) | 2020-10-08 | 2023-11-23 | Tokushima University | Technique for modifying target nucleotide sequence using crispr-type i-d system |
| WO2023177310A1 (en) * | 2022-03-18 | 2023-09-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Type i-d crispr-cas systems and uses thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018225858A1 (ja) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | 国立大学法人大阪大学 | Ｄｎａが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
| WO2019039417A1 (ja) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | 国立大学法人徳島大学 | ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術 |
-
2020
- 2020-03-13 JP JP2021505164A patent/JP7489112B2/ja active Active
- 2020-03-13 WO PCT/JP2020/011283 patent/WO2020184723A1/ja active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018225858A1 (ja) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | 国立大学法人大阪大学 | Ｄｎａが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
| WO2019039417A1 (ja) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | 国立大学法人徳島大学 | ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JACKSON, Ryan N. et al.，Crystal structure of the CRISPR RNA-guided surveillance complex from Escherichia coli，Science，2014年，Vol. 345，pp. 1473-1479 |
| MULEPATI, Sabin et al.，Crystal structure of a CRISPR RNA-guided surveillance complex bound to a ssDNA target，Science，2014年，Vol. 345，pp. 1479-1484 |
| ZHAO, Hongtu et al.，Crystal structure of the RNA-guided immune surveillance Cascade complex in Escherichia coli，Nature，2014年，Vol. 515，pp. 147-150, Extended Data |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020184723A1 (ja) | 2020-09-17 |
| JPWO2020184723A1 (ja) | 2020-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12006521B2 (en) | CRISPR-associated transposases and uses thereof | |
| US11926843B2 (en) | RNA-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use | |
| CN108513579B (zh) | 新颖的rna导向性核酸酶及其用途 | |
| JP6960951B2 (ja) | 配列操作のための系、方法および最適化ガイド組成物のエンジニアリング | |
| EP3902911B1 (en) | Polypeptides useful for gene editing and methods of use | |
| US11220693B2 (en) | Method for converting monocot plant genome sequence in which nucleic acid base in targeted DNA sequence is specifically converted, and molecular complex used therein | |
| JP6715419B2 (ja) | カンピロバクター・ジェジュニｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムに由来するｒｇｅｎを使用したゲノム編集 | |
| US11788088B2 (en) | CRISPR/Cas system and method for genome editing and modulating transcription | |
| JP2021166513A (ja) | 配列操作のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ成分系、方法および組成物 | |
| US20080194029A1 (en) | Method for Increasing the Ratio of Homologous to Non-Homologous Recombination | |
| KR102626503B1 (ko) | 뉴클레오타이드 표적 인식을 이용한 표적 서열 특이적 개변 기술 | |
| JP7489112B2 (ja) | Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的配列改変技術 | |
| JP7454881B2 (ja) | Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列改変技術 | |
| KR102677877B1 (ko) | 이중나선 dna의 표적화된 변형 방법 | |
| CN115216459B (zh) | 新型crispr相关转座酶及其用途 | |
| KR20190097057A (ko) | 이중나선 dna의 표적화된 변형 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230213 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240109 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240305 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240409 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240502 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7489112 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |