JP6715419B2 - カンピロバクター・ジェジュニcrispr/casシステムに由来するrgenを使用したゲノム編集 - Google Patents
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Description
技術的課題
ここで記載されるとおり、ストレプトコッカス・ピオゲネス以外の細菌からのRGENの開発への集中的かつ徹底した研究は、カンピロバクター・ジェジュニ(C.ジェジュニ)に由来するCasタンパク質が特異的にNNNNRYAC配列を認識し、当該配列が目的のDNAの標的化においてPAMとして使用され得るという発見をもたらした。さらに、ガイドRNAは、DNAの最適化のために操作され得、これにより効率的な目的のDNAのゲノム編集、転写調節、および分離をもたらす。
したがって、一側面において、本発明は、配列番号1のPAM配列を含むDNA配列を標的化するための方法を提供し、当該方法は、配列番号1のPAM配列を認識するCasタンパク質か、または当該Casタンパク質をコードする核酸を細胞中へ導入することを含む。
上記のとおり、いくつかの実施態様において、CRISPR/Casシステムは、標的DNAを標的化するために効果的に使用され得、これにより目的のDNAのゲノム編集、転写調節、および単離を達成する。
本発明の一実施態様は、細胞中にCasタンパク質またはそれをコードする核酸を導入することを含む、目的のDNA配列を標的化するための方法を提供する。
以下の例は、ここで提供される本開示のいくつかの側面を説明する目的のために提供され、それらは本開示の範囲を何らかに限定するものとして解釈されるべきではない。
例1:C.ジェジュニCRISPR/Cas9を使用したゲノム編集
本発明者は、C.ジェジュニからRGENを単離することに成功した。ゲノム編集に関するC.ジェジュニCRISPR/CAS9に由来するRGENの特性を同定するために、ヒトコドンについて最適化されたC.ジェジュニCAS9遺伝子が合成され(表1)、次いで当該遺伝子が哺乳動物の発現ベクター中へ挿入されて、HAタグが付されたNLSに連結されたCas遺伝子がCMVプロモーター(図1)の調節下にある、C.ジェジュニCAS9発現カセットを構築した。
C.ジェジュニcrRNA:tracrRNA複合体が、他の細菌種からのものよりも短いループ構造を含むであろうことを予想し、改変されたステムまたはループ構造が、例1において構築されたC.ジェジュニRGENのsgRNAを構造的に安定化するように設計された(表5)。
標的配列を認識するC.ジェジュニcrRNAのスペーサー配列は、文献において20bpの長さであるものと報告された。いずれのスペーサーの長さが最適であるかを決定するために、表6において示されるとおり、様々な長さを有するスペーサー、および追加のヌクレオチドを5’末端において有するsgRNA変異体構造(図5A〜5C)を使用して、ヒトAAVS1遺伝子座におけるCj Cas9の4つの標的部位についてゲノム編集試験が行われた。この実験において使用された方法について、Genome Res. 2014 Jan; 24(1):132-41に対して参照がなされた。
本開示において、C.ジェジュニCas9のPAM配列は、既存の文献におけるデータに基づき「NNNNACA」を含むことが推定され、実験が行われた。5種のゲノム部位について構築された34種のC.ジェジュニCRISPR/Cas9システムのうち、3種のみが活性を示した。特に、当該3種の活性なシステムにおける部位をカバーする配列の追加の分析は、ヌクレオチド「C」が、すべての3種の部位におけるPAM配列(NNNNACA)のすぐ後に同定されたことを示した(表8)。
AAVS1−CJ1遺伝子座におけるC.ジェジュニCRISPR/CAS9の切断部位は、Digenome−seq(本発明者によって開発され、特許保護のために提出された、CRISPR/Cas9オフターゲットアッセイ)を使用してゲノムレベルで分析された。実験はNat Methods. 2015 Mar; 12(3):237-43に記載された方法を使用して実施された。
C.ジェジュニのPAM配列は、例5における「NNNNRYAC」ならびに「NNNNACAC」であることが見出され、初めの2つの位置における縮重を示した。縮重を裏付けるために、sgRNAは、ヒトAAVS1遺伝子座のC.ジェジュニの7種のPAM標的配列(初めの2つの位置においてGまたはT残基を有する(表10))についてそれぞれ構築され、HEK293細胞における変異効率について分析された。
ゲノム編集が用途を見出す有望な分野間で代表的なものは、遺伝子および細胞治療のためのゲノム編集技術である。ゲノム編集の実際的な治療への用途は、操作されたヌクレアーゼおよびドナーDNAを標的細胞へインビトロまたはインビボで効果的に送達するための臨床的に適用可能なベクターを必要とする。2種の最も広く使用された操作されたヌクレアーゼプラットフォームであるTALENおよびRGENは、それらの大きな大きさのために、確立された遺伝子治療ベクターに対する用途に限定されている。対照的に、本開示のC.ジェジュニRGENは、これまで開発されたRGEN間で最小のCAS9タンパク質およびsgRNAからなる。その小さい大きさのおかげで、C.ジェジュニRGENは、大きな大きさの遺伝子治療ベクターをゲノム操作において使用することができる。例えば、遺伝子治療のための最も重要なベクターの1つとして働くAAV(アデノ随伴ウイルス)は、これにより運ばれるDNAの大きさについて厳格な限定を課し、したがって、S.ピオゲネス(S. pyogenes)、S.サーモフィルス(S. thermophilus)、もしくはN.メニンギティディス(N. meningitidis)に由来するRGENまたは現在使用されている操作されたヌクレアーゼプラットフォームTALENを適用することは困難である。対照的に、C.ジェジュニRGENは、AAVベクターに適用され得る。
さらに、標的DNAは、ストレプトコッカス・ピオゲネスに由来する不活性化されたCas9タンパク質およびガイドRNAからなるRGEN(dCas9:gRNA複合体)を使用して単離され、濃縮された。
Claims (22)
- ゲノムを改変する方法であって、NNNNRYAC(配列番号1)のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を認識するCasタンパク質、または当該Casタンパク質をコードする核酸;およびNNNNRYAC(配列番号1)のPAM配列に隣接する標的DNA配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列およびCasタンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含むガイドRNA、または当該ガイドRNAをコードする核酸を、ゲノムを含む細胞中に導入し、それによって標的DNA配列でゲノムを改変することを含み
ここでCasタンパク質は、カンピロバクター・ジェジュニCas9タンパク質であり、
およびここで細胞は、ヒトインビボ(human in vivo)細胞ではない、前記方法。 - ガイドRNAが、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含むデュアルRNAである、請求項1に記載の方法。
- ガイドRNAが、1本鎖ガイドRNA(sgRNA)である、請求項1に記載の方法。
- sgRNAが、標的DNA配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含有する第一領域、およびCas9タンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含有する第二領域を含む、請求項3に記載の方法。
- sgRNAが、標的DNA配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含有するcrRNAの一部、およびCas9タンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含有するtracrRNAの一部を含む、請求項3に記載の方法。
- Cas9タンパク質が、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- (i)NNNNRYAC(配列番号1)のPAM配列と隣接した標的DNA配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列およびNNNNRYAC(配列番号1)のPAM配列を認識するカンピロバクター・ジェジュニCas9タンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含む単離されたガイドRNAを発現するための発現カセット、または、前記単離されたガイドRNAをコードするDNA、および
(ii)NNNNRYAC(配列番号1)のPAM配列を認識する前記Cas9タンパク質を発現するための発現カセット、または当該Cas9タンパク質をコードする核酸、
ここで、標的DNA配列は、NNNNRYAC(配列番号1)のPAM配列と隣接している、
を含む、組み換えウイルスベクター
を含む、標的DNA配列でゲノムを改変するための組成物。 - 単離されたガイドRNAが、crRNAおよびtracrRNAを含むデュアルRNAである、請求項7に記載の組成物。
- 単離されたガイドRNAが1本鎖ガイドRNA(sgRNA)である、請求項7に記載の組成物。
- sgRNAが、標的DNA配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含有する第一領域、およびCas9タンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含有する第二領域を含む、請求項9に記載の組成物。
- sgRNAが、標的DNA配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含有するcrRNAの一部、およびCas9タンパク質と相互作用することが可能な第二配列を含有するtracrRNAの一部を含む、請求項9に記載の組成物。
- 標的DNA配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列が、17〜23ntの長さを有する、請求項7〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- 単離されたガイドRNAが、標的DNA配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列の5’末端の前に1〜3の追加のヌクレオチドをさらに含む、請求項7〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 追加のヌクレオチドがグアニン(G)を含む、請求項13に記載の組成物。
- 組み換えウイルスベクターであって、ここで、ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)である、請求項7に記載の組成物。
- 前記ゲノムが真核生物ゲノムである、請求項1に記載の方法。
- ガイドRNAが、標的DNA配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含む第一領域、およびステムが13〜18bpの長さであるステム−ループ構造を含む第二領域を含む、請求項1〜6および16のいずれか一項に記載の方法。
- ステムが、配列番号2(5’−GUUUUAGUCCCUUGUG−3’)の配列およびその相補鎖を含む、請求項17に記載の方法。
- ガイドRNAが、標的DNA配列の相補鎖と二本鎖を形成することが可能な第一配列を含む第一領域、および5〜10ntの長さのループを含むステム−ループ構造を含む第二領域を含む、請求項1〜6および16〜18のいずれか一項に記載の方法。
- ループが配列番号3(5’−AUAUUCAA−3’)のヌクレオチド配列を含む、請求項19に記載の方法。
- ゲノムの改変が、ゲノム編集である、請求項1〜6および16〜20のいずれか一項に記載の方法。
- ゲノム改変が、標的DNAの切断である、請求項1〜6および16〜20のいずれか一項に記載の方法。
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