WO2019026976A1 - 改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途 - Google Patents

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WO2019026976A1
WO2019026976A1 PCT/JP2018/028926 JP2018028926W WO2019026976A1 WO 2019026976 A1 WO2019026976 A1 WO 2019026976A1 JP 2018028926 W JP2018028926 W JP 2018028926W WO 2019026976 A1 WO2019026976 A1 WO 2019026976A1
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sequence
mutation
arginine
protein according
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理 濡木
弘志 西増
真理 山田
哲也 山形
ユアンバウ シン
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国立大学法人 東京大学
エディジーン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • the present invention relates to a modified Cas9 protein having higher activity and its use.
  • CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (Crisps), together with Cas (Crisps-Associated) Genes, Provide Adaptive Resistance to Acquired Resistance to Invasive Foreign Nucleic Acids in Bacteria and Archaea It is known to construct a system.
  • the CRISPR consists of a short, stored repetitive sequence of 24-48 bp, often attributed to phage or plasmid DNA, with a unique variable DNA sequence in between, called a similar size spacer. Also, in the vicinity of the repeat and spacer sequences, genes encoding the Cas protein family are present.
  • RNA referred to as pre-crRNA
  • tracrRNA partially complementary RNA
  • Cas9-crRNA-tracrRNA complex binds to foreign RNA complementary to crRNA, and Cas9 protein, an enzyme (nuclease) that cleaves DNA, invades DNA from the outside by cleaving foreign invasive DNA Suppress and eliminate the function of
  • the Cas9 protein recognizes PAM sequences in foreign invasive DNA and cleaves double-stranded DNA into blunt ends upstream of it.
  • Francisella novicida F.
  • NGR A / C / T / G
  • R A / G
  • V A / G / C
  • R A / G
  • Y T / C
  • M A / C
  • RNA-guided nuclease RNA-guided nuclease: RGN
  • type I, II, and III the type II CRISPR-Cas system is used exclusively in genome editing, and the type II Cas9 protein is used as RGN in type II.
  • the method using the CRISPR-Cas system only needs to synthesize a short gRNA homologous to the DNA sequence of interest, and genome editing can be performed using Cas9 protein, which is a single protein. Therefore, there is no need to synthesize large proteins that differ from one DNA sequence to another, such as zinc finger nuclease (ZFN) and transactivator-like agonist (TALEN), which have been conventionally used, and genome editing can be performed simply and quickly.
  • ZFN zinc finger nuclease
  • TALEN transactivator-like agonist
  • Patent Document 1 describes S.I. A genome editing technology utilizing the CRISPR-Cas system derived from pyogenes is disclosed.
  • Patent Document 2 includes S.I. A genome editing technology utilizing the CRISPR-Cas system derived from thermophilus is disclosed.
  • Patent Document 2 discloses that D31A or N891A mutant of Cas9 protein functions as nickase, which is a DNA cleaving enzyme that inserts nick into only one DNA strand. Furthermore, it has been shown that the rate of occurrence of non-homologous end bonds susceptible to mutations such as insertion deletions by the repair mechanism after DNA cleavage remains low, and has similar homologous recombination efficiency to that of the wild-type Cas9 protein.
  • Non-patent document 1 describes S.I.
  • the complex of the D10A variant of each Cas9 protein and the target-specific guide RNA creates only one nick in the DNA strand complementary to the guide RNA.
  • the pair of guide RNAs are shifted by about 20 bases and recognize only the target sequence located on the opposite strand of the target DNA.
  • Patent Document 3 includes S.I. Various variants of Cas9 protein derived from pyogenes are disclosed in Patent Document 4 by F. Various variants of Cas9 protein from Novicida have been disclosed. C. For the Cas9 protein derived from jejuni, Non-Patent Document 2 discloses crystal structures and various variants, and Non-Patent Document 3 discloses orthologs.
  • the Cas9 (also referred to herein as CjCas9) protein from Campylobacter jejuni is expected to be used because of its small size, but its binding activity to the guide RNA is S. coli. It is known that it is weaker than Cas9 derived from pyogenes (herein also referred to as SpCas9), and consequently the cleavage activity is weaker. As described above, the conventional Cas9 protein has a problem that its activity in prokaryotes and eukaryotes is relatively low in the Cas9 family, and sufficient editing efficiency can not be obtained.
  • An object of the present invention is to provide a Cas9 protein having improved ability to bind to a guide RNA and its use.
  • the present inventors focused on CjCas9 protein as Cas9 protein, and studied earnestly in order to solve the above-mentioned subject. As a result, by substituting an amino acid at a predetermined position of the CjCas9 protein with a specific amino acid (introducing a mutation), the ability to bind to the guide RNA is improved, and the cleavage activity is successfully improved. It came to complete.
  • the Cas9 protein before introducing a mutation may be referred to as a wild type Cas9 protein
  • the Cas9 protein after introducing a mutation may be referred to as a modified Cas9 protein or a mutated Cas9 protein. That is, the present invention is as follows.
  • a protein comprising a sequence comprising an amino acid sequence having a mutation at at least one site selected from the group consisting of positions 911, 920 and 946, and having a binding ability to a guide RNA.
  • the mutation at position 911 is a substitution of alanine for arginine;
  • the mutation at position 920 is a substitution of isoleucine for arginine;
  • the mutation at position 946 is a substitution of glutamate for arginine, glycine, cysteine, isoleucine, methionine, proline, threonine, valine, asparagine or aspartic acid;
  • [5] The protein according to [4] above, wherein the mutation at position 946 is a substitution of glutamate for arginine.
  • [6] The protein according to any one of the above [1] to [5], further having a mutation at position 801 and / or 869.
  • the mutation at position 801 is a substitution of serine for arginine or histidine;
  • the protein according to [6] above, wherein the mutation at position 869 is a substitution of lysine for arginine.
  • the protein according to [7] above, wherein the mutation at position 801 is a substitution of serine for arginine.
  • Glutamate at position 946 replaces arginine, It consists of a sequence containing an amino acid sequence in which alanine at position 911 is substituted with arginine, serine at position 801 is substituted with arginine or histidine, or lysine at position 869 is substituted with arginine, and binding to a guide RNA Functional protein.
  • the mutation at position 8 is a substitution of aspartic acid to alanine; the mutation at position 559 is a substitution of histidine to alanine; the mutation at position 582 is a substitution of asparagine to alanine
  • the protein described in. [16] The protein according to the above [14] or [15], which has a transcription regulator protein or domain linked thereto. [17] The protein according to the above-mentioned [16], wherein the transcription control factor is a transcription activation factor. [18] The protein of the above-mentioned [16], wherein the transcription control factor is a transcription silencer or a transcription repressor.
  • [19] A nucleic acid encoding the protein of any one of the above-mentioned [1] to [18].
  • [20] From the base according to any one of the above [1] to [18] and the PAM (Proto-spacer Adjacent Motif) sequence in the target double-stranded polynucleotide from 20 bases or more to 24 bases or less upstream
  • a guide RNA comprising a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of [21]
  • the target double-stranded polynucleotide has a PAM sequence consisting of NNGNNN (N stands for any base, and G stands for guanine, respectively),
  • the protein is a protein according to any one of the above [1] to [18],
  • the method wherein the guide RNA comprises a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to a base sequence from one base upstream to 20 bases to 24 bases upstream of the PAM sequence in the target double-stranded polynucleotide.
  • a Cas9 protein having an improved ability to bind to a guide RNA can be obtained.
  • FIG. 1A is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of the DNA cleavage activity measurement test in Example 1.
  • "AGAAACCC” was used as a PAM sequence, and EcoRI was used as a restriction enzyme.
  • FIG. 1B is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of the DNA cleavage activity measurement test in Example 1.
  • "AGAAACCC” was used as a PAM sequence, and EcoRI was used as a restriction enzyme.
  • FIG. 1C is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of the DNA cleavage activity measurement test in Example 1.
  • "AGAAACCC” and “AGGGACCC” were used as PAM sequences, and EcoRI was used as a restriction enzyme.
  • 2A shows three guide RNAs of J1-J3 and dCjCas9 designed in the transcriptional control region of MyD88 gene, a molecule in which KRAB is linked to dCjCas9 (dCjCas9-KRAB), and a molecule in which KRAB is linked to mutant dCjCas9 (dCjCas9- It is the figure which showed the result of expression suppression of MyD88 gene using each of ER-KRAB).
  • Each column of the graph shows the results of guide RNA alone, guide RNA and dCjCas9, guide RNA and dCjCas9-KRAB, and guide RNA and dCjCas9-ER-KRAB from the left side.
  • J1 and J3 were performed twice each (J1-1, J1-2, J3-1, J3-2), and J2 was performed once (J2-1).
  • Mutant dCjCas9 also referred to as dCjCas9-ER
  • dCjCas9 having a mutation of E946R FIG.
  • 2B shows suppression of expression of MyD88 gene using a molecule (dCjCas9-ER-KRAB) in which KRAB is linked to each of 13 guide RNAs of J1-J13 designed in the transcription control region of MyD88 gene and mutant dCjCas9. It is the figure which showed the result of.
  • the protein of the present embodiment is a Cas9 protein (hereinafter, also simply referred to as a modified Cas9) with improved avidity and cleavage activity to a guide RNA. According to the protein of the present embodiment, it is possible to provide a simple and rapid genome editing technology or gene expression control technology that is site-specific to a target sequence.
  • the “guide RNA” is one that mimics the hairpin structure of tracrRNA-crRNA, and preferably from 20 bases or more to 24 bases or less from one base upstream of the PAM sequence in the target double-stranded polynucleotide. More preferably, the polynucleotide comprises a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence of not less than 22 bases and not more than 24 bases in the 5 'terminal region.
  • the target double-stranded polynucleotide comprises one or more polynucleotides consisting of a base sequence which is non-complementary to the target double-stranded polynucleotide, which is arranged symmetrically to be a complementary sequence with one axis as an axis, and can have a hairpin structure. It may be.
  • the guide RNA has a function of binding to the mutant Cas9 protein of the present invention to guide the protein to a target DNA.
  • the guide RNA has a sequence complementary to the target DNA at its 5 'end, and binds to the target DNA via the complementary sequence to guide the mutant Cas9 protein of the present invention to the target DNA.
  • the DNA can be cleaved at the site where the target DNA is present, for example, the function of the target DNA can be specifically lost.
  • Guide RNA is designed and prepared based on the sequence information of the target DNA to be cleaved or modified. Specifically, sequences as used in the examples can be mentioned.
  • mutant Cas9 protein of the present embodiment which has an endonuclease activity, has an enzyme activity that is induced by the guide RNA and cleaves at the middle of the DNA strand.
  • polypeptide As used herein, “polypeptide”, “peptide” and “protein” refer to a polymer of amino acid residues and is used interchangeably. It also refers to amino acid polymers in which one or more amino acids are chemical analogues or modified derivatives of the corresponding naturally occurring amino acids.
  • sequence means a nucleotide sequence of any length, which is a deoxyribonucleotide or ribonucleotide, linear, cyclic or branched, single stranded or double stranded. It is a chain.
  • PAM sequence means a sequence which is present in a target double-stranded polynucleotide and is recognizable by Cas9 protein, and the length and base sequence of PAM sequence differ depending on bacterial species.
  • a sequence that can be recognized by the modified Cas9 of the present invention can be represented by "5'-NNNVRYM-3 '".
  • N means any one base selected from the group consisting of adenine, cytosine, thymine and guanine
  • A is adenine
  • G is guanine
  • C is Cytosine
  • T is thymine
  • R is a base having a purine backbone (adenine or guanine)
  • Y is a base having a pyrimidine backbone (cytosine or thymine)
  • V is adenine, guanine and cytosine Any one base selected from the group consisting of: "M” means adenine or cytosine.
  • polynucleotide refers to a deoxyribonucleotide or ribonucleotide polymer in linear or circular conformation, either single stranded or double stranded form, and the length of the polymer It is not to be construed as limiting in terms of Also included are known analogs of natural nucleotides, as well as nucleotides that are modified in at least one of the base, sugar and phosphate moieties (eg, a phosphorothioate backbone). Generally, analogs of a particular nucleotide have identical base pairing specificity, eg, an analog of A base pairs with T.
  • the present invention comprises mutations in at least one, two or all three sites selected from the group consisting of position 911, position 920 and position 946 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a protein comprising an amino acid sequence and capable of binding to a guide RNA is provided.
  • the protein of aspect 1 has RNA-inducible DNA endonuclease activity.
  • SEQ ID NO: 2 is the full-length amino acid sequence (984 amino acids) of CjCas9 protein.
  • SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence of a gene encoding a CjCas9 protein.
  • the mutation at position 911 is specifically a substitution of alanine at position 911 with arginine.
  • the mutation at position 920 is specifically a substitution of isoleucine at position 920 for arginine.
  • the mutation at position 946 is specifically a substitution of glutamic acid at position 946 for arginine, glycine, cysteine, isoleucine, methionine, proline, threonine, valine, asparagine or aspartic acid. In the embodiment 1, the following embodiment is more preferable.
  • the glutamic acid at position 946 is substituted with arginine (aspect 1-1) ⁇ Alanine at position 911 is substituted with arginine (aspect 1-2) -Isoleucine at position 920 is substituted with arginine (aspect 1-3) -The glutamic acid at position 946 is substituted with arginine and the alanine at position 911 is substituted with arginine (aspects 1-4) The glutamic acid at position 946 is substituted with arginine, the alanine at position 911 is substituted with arginine, and the isoleucine at position 920 is substituted with arginine (aspects 1-5)
  • the present invention provides a protein further having a mutation at position 801 and / or 869 in addition to the mutation of the above-mentioned aspect 1 and having a binding ability to a guide RNA (aspect 2) to provide.
  • the protein of aspect 2 has RNA-inducible DNA endonuclease activity.
  • the mutation at position 801 is substitution of serine at position 801 with arginine or histidine, preferably substitution of arginine
  • mutation at position 869 specifically includes arginine at lysine at position 869. Substitution of In the second embodiment, the following embodiment is more preferable.
  • the present invention in addition to the mutation of the aforementioned aspect 1 or 2, the present invention further comprises (i) the position of position 8, and / or (ii) the group consisting of positions 559 and 582
  • a protein (aspect 3) having a mutation at a selected position and having the ability to bind to a guide RNA.
  • Embodiment 3 preferably has mutations at the position 8 and the positions 559 or 582, and more preferably at the positions 8 and 559.
  • the mutation at position 8 is specifically substitution of aspartic acid at position 8 with alanine or asparagine.
  • the mutation at position 559 is specifically a substitution of histidine at position 559 with alanine, asparagine or tyrosine.
  • the mutation at position 582 is specifically a substitution of asparagine at position 582 with aspartate, serine or histidine.
  • Preferred embodiment 3 is a protein in which aspartic acid at position 8 is substituted by alanine and histidine at position 559 is substituted by alanine.
  • the protein of embodiment 3 having the mutation of (i) or the mutation of (ii) has a nickase activity.
  • the protein of aspect 3 having the mutation of (i) and the mutation of (ii) binds to the guide RNA and is transported to the target DNA, but the endonuclease activity is inactivated.
  • the present invention provides a protein (Aspect 4) functionally equivalent to the protein of Aspects 1 to 3 above.
  • a sequence of 80% or more at a site other than the position where the mutation is applied in the above embodiment 1-3 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 It has the same identity and the ability to bind to the guide RNA.
  • the "site other than the position where the mutation is applied” can be understood as "a site other than the position corresponding to the position where the mutation is applied”.
  • the identity is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 99% or more.
  • Amino acid sequence identity can be determined by a method known per se. For example, amino acid sequence identity (%) can be determined by using conventional programs in the art (eg, BLAST, FASTA, etc.) by default. Also, in another aspect, the percent identity (%) can be determined using any algorithm known in the art, eg, Needleman et al. (1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453), Myers and Miller (CABIOS, 1988, 4: 11-17) or the like. The algorithm of Needleman et al.
  • the percent identity is, for example, BLOSUM 62 matrix or PAM250 matrix, as well as gap weight: 16, It can be determined by using any of 14, 12, 10, 8, 6 or 4 and length weights: 1, 2, 3, 4, 5 or 6. Also, the Myers and Miller algorithm is incorporated into the ALIGN program which is part of the GCG sequence alignment software package. When using the ALIGN program to compare amino acid sequences, for example, PAM120 weight residue table, gap length penalty 12, and gap penalty 4 can be used.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 1 to several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a protein functionally equivalent to the protein of the above-mentioned embodiment 1 to 3 Is a substitution, deletion, insertion and / or addition, and a protein (Aspect 5) capable of binding to a guide RNA is provided.
  • the "site other than the position where the mutation is applied” can be understood as "a site other than the position corresponding to the position where the mutation is applied”.
  • a method for artificially performing "amino acid substitution, deletion, insertion and / or addition” for example, conventional site-directed mutagenesis is performed on a DNA encoding a predetermined amino acid sequence, and then this The method of expressing DNA by a conventional method is mentioned.
  • a site-directed mutagenesis method for example, a method using an amber mutation (Gapped duplex method, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)), a method using PCR using a primer for mutation introduction Etc.
  • the number of amino acids to be modified above is at least one residue, specifically one or several or more. Among the above substitutions, deletions, insertions or additions, substitution of amino acids is particularly preferred.
  • substitution is more preferably substitution with an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, pK, and structural features.
  • substitution include: i) glycine, alanine; ii) valine, isoleucine, leucine; iii) aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine; iv) serine, threonine; v) lysine, arginine; Substitutions within groups of tyrosine are included.
  • glutamic acid at position 946 in SEQ ID NO: 2 is substituted with arginine (E946R), Contains an amino acid sequence in which alanine at position 911 is substituted with arginine (A911R), or serine at position 801 is substituted with arginine or histidine (S801R or S801H), or lysine at position 869 is substituted with arginine (K869R)
  • glutamic acid at position 946 is substituted with arginine (E946R)
  • Alanine at position 911 is replaced with arginine (A911R)
  • Examples include a protein comprising an amino acid sequence in which isoleucine at position 920 is substituted with arginine (I920R) or serine at position 801 is substituted with arginine (S801R).
  • Glutamate at position 946 is substituted for arginine (E946R)
  • Alanine at position 911 is replaced with arginine (A911R)
  • a protein comprising an amino acid sequence in which isoleucine at position 920 is substituted with arginine (I920R) can be mentioned.
  • glutamic acid at position 946 in SEQ ID NO: 2 is substituted with arginine (E946R)
  • a protein comprising an amino acid sequence in which aspartic acid at position 8 is substituted with alanine (D8A) and histidine at position 559 is substituted with alanine (H559A) or where asparagine at position 582 is substituted with alanine (N582A).
  • the alphabet displayed on the left of the numbers representing the number of amino acid residues up to the substitution site indicates the one-letter code of the amino acid before substitution, and the alphabet displayed on the right indicates the one-letter code of the amino acid after substitution ing.
  • the modified Cas9 of the present invention can be prepared, for example, by the following method. First, a host is transformed using a vector containing a nucleic acid encoding the modified Cas9 of the present invention. Subsequently, the host is cultured to express the protein.
  • the conditions such as the composition of the medium, the temperature and time of culture, and the addition of an inducer can be determined by those skilled in the art according to known methods so that the transformant grows and the protein is efficiently produced. Also, for example, when an antibiotic resistance gene is incorporated into an expression vector as a selection marker, transformants can be selected by adding an antibiotic to the medium.
  • the host is not particularly limited, and includes animal cells, plant cells, insect cells, or microorganisms such as E. coli, Bacillus subtilis, and yeast.
  • the present invention provides a protein shown in ⁇ Cas9 protein having enhanced ability to bind to and cleave guide RNA as described above, and PAM (Proto-spacer Adjacent Motif) in a target double-stranded polynucleotide.
  • a guide RNA comprising a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to a base sequence from 1 base upstream to 20 bases to 24 bases upstream of the sequence.
  • the protein-RNA complex of the present embodiment it is possible to edit a target double-stranded polynucleotide conveniently and rapidly in a site-specific manner to a target sequence.
  • the protein and the guide RNA can form a protein-RNA complex by mixing under mild conditions in vitro and in vivo. Mild conditions indicate a temperature and pH at which the protein is not decomposed or denatured.
  • the temperature is preferably 4 ° C. or more and 40 ° C. or less, and the pH is preferably 4 or more and 10 or less.
  • the time for mixing and incubating the protein and the guide RNA is preferably 0.5 hours or more and 1 hour or less.
  • the complex of the protein and the guide RNA is stable, and can remain stable even after standing at room temperature for several hours.
  • the present invention provides a first vector comprising a gene encoding a protein shown in ⁇ Cas9 protein with improved ability to bind to guide RNA and cleavage activity>, and a target double-stranded polynucleotide
  • a second vector comprising a guide RNA comprising a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence from 1 base upstream to 20 bases to 24 bases upstream of the PAM sequence in provide.
  • the guide RNA consists of a base sequence complementary to a base sequence of preferably 20 bases or more and 24 bases or less, more preferably 22 bases or more and 24 bases or less from 1 base upstream of the PAM sequence in the target double stranded polynucleotide
  • a polynucleotide containing a polynucleotide in the 5 'terminal region may be appropriately designed.
  • the target double-stranded polynucleotide comprises one or more polynucleotides consisting of a base sequence which is non-complementary to the target double-stranded polynucleotide, which is arranged symmetrically to be a complementary sequence with one axis as an axis, and can have a hairpin structure. It may be.
  • the vector of the present embodiment is preferably an expression vector.
  • the expression vector is not particularly limited.
  • a plasmid derived from E. coli such as pBR322, pBR325, pUC12, pUC13; a plasmid derived from Bacillus subtilis such as pUB110, pTP5, pC194; a yeast derived plasmid such as pSH19, pSH15; Bacteriophages such as: adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, vaccinia virus, baculovirus and other viruses; and vectors modified from these.
  • the Cas9 protein and the promoter for guide RNA expression are not particularly limited.
  • a promoter for such as can be used.
  • These promoters can be appropriately selected according to the type of the Cas9 protein, the guide RNA, or the Cas9 protein, and the cells expressing the guide RNA.
  • the above-mentioned expression vector may further have a multiple cloning site, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selective marker, an origin of replication and the like.
  • the present invention is a method for site specific modification of a target double stranded polynucleotide, Mixing and incubating the target double-stranded polynucleotide, the protein and the guide RNA, and modifying the target double-stranded polynucleotide at a binding site located upstream of the PAM sequence by the protein.
  • the above-mentioned protein is a protein shown in ⁇ Cas9 protein having improved ability to bind to guide RNA and cleavage activity as described above,
  • the guide RNA provides a method comprising a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to a base sequence from 1 base upstream to 20 bases to 24 bases upstream of the PAM sequence in the target double stranded polynucleotide. .
  • target double-stranded polynucleotide can be conveniently, rapidly and site-specifically to the target sequence. It can be modified.
  • the protein and the guide RNA are as described above in ⁇ Cas9 protein having enhanced ability to bind to and cleavage with guide RNA>.
  • the method for site-specifically modifying target double stranded polynucleotides is described in detail below.
  • the protein and the guide RNA are mixed under mild conditions and incubated. Mild conditions are as described above.
  • the incubation time is preferably 0.5 hours or more and 1 hour or less.
  • the complex of the protein and the guide RNA is stable, and can remain stable even after standing at room temperature for several hours.
  • the protein and the guide RNA form a complex.
  • the protein recognizes the PAM sequence and binds to the target double stranded polynucleotide at a binding site located upstream of the PAM sequence.
  • the protein When the protein has endonuclease activity, it cleaves the polynucleotide at the site.
  • the Cas9 protein recognizes a PAM sequence, and the double helix structure of the target double-stranded polynucleotide is detached from the PAM sequence, and a base complementary to the target double-stranded polynucleotide in the guide RNA By annealing to the sequence, the double helix structure of the target double stranded polynucleotide is partially loosened.
  • the Cas9 protein cleaves the phosphodiester bond of the target double-stranded polynucleotide at a cleavage site located upstream of the PAM sequence and at a cleavage site upstream of the sequence complementary to the PAM sequence.
  • a protein shown in ⁇ Cas9 protein whose binding ability and cleavage activity with the guide RNA are further improved as described above using the above-mentioned CRISPR-Cas vector system It may comprise an expression step of expressing RNA.
  • Cas9 protein and guide RNA are expressed using the above-mentioned CRISPR-Cas vector system.
  • a host is transformed using an expression vector containing a gene encoding a Cas9 protein and an expression vector containing a guide RNA.
  • the host is cultured to express Cas9 protein and guide RNA.
  • Conditions such as the composition of the medium, the temperature and time of culture, and the addition of an inducer can be determined by those skilled in the art according to known methods so that the transformant grows and the fusion protein is efficiently produced.
  • an antibiotic resistance gene is incorporated into an expression vector as a selection marker, transformants can be selected by adding an antibiotic to the medium.
  • Cas9 protein expressed by the host and guide RNA are purified by an appropriate method to obtain Cas9 protein and guide RNA.
  • the present invention is a method for site specific modification of a target double stranded polynucleotide, Mixing and incubating the target double-stranded polynucleotide, the protein and the guide RNA, and binding the protein to the target double-stranded polynucleotide at a binding site located upstream of the PAM sequence; Obtaining the modified target double stranded polynucleotide in a region determined by the complementary binding of the guide RNA and the target double stranded polynucleotide,
  • the above-mentioned protein is a protein shown in ⁇ Cas9 protein having improved ability to bind to guide RNA and cleavage activity as described above,
  • the guide RNA provides a method comprising a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to a base sequence from 1 base upstream to 20 bases to
  • RNA-inducible DNA endonuclease having improved ability to bind to guide RNA and cleaving activity, it is simple, quick, and two target-specific targeting to the target sequence.
  • Stranded polynucleotides can be modified.
  • the above-mentioned ⁇ Cas9 protein having improved binding ability and cleavage activity with guide RNA>, and ⁇ target double-stranded polynucleotide site-specifically ⁇ Method for Altering to>
  • the method for site-specifically modifying target double stranded polynucleotides is described in detail below.
  • the steps up to site-specific binding to the target double-stranded polynucleotide are the same as the steps described above in ⁇ Method for specifically cleaving target double-stranded polynucleotide>. Subsequently, it is possible to obtain a target double-stranded polynucleotide modified according to the purpose in a region determined by the complementary binding of the guide RNA and the double-stranded polynucleotide.
  • altered means that the base sequence of the target double stranded polynucleotide is changed.
  • cleavage of the target double-stranded polynucleotide alteration of the base sequence of the target double-stranded polynucleotide by insertion of the exogenous sequence after cleavage (insertion by physical insertion or replication through homologous-directed repair), non-cleavage after cleavage
  • NHEJ homologous end ligation
  • changes in the base sequence of the target double-stranded polynucleotide by addition of a functional protein or base sequence, and the like can be mentioned.
  • the modification of the target double-stranded polynucleotide in this embodiment can introduce a mutation into the target double-stranded polynucleotide, or disrupt or modify the function of the target double-stranded polynucleotide.
  • a protein shown in ⁇ Cas9 protein whose binding ability and cleavage activity with the guide RNA are further improved as described above using the above-mentioned CRISPR-Cas vector system It may comprise an expression step of expressing RNA.
  • Cas9 protein and guide RNA are expressed using the above-mentioned CRISPR-Cas vector system.
  • a specific method for expression is the same as the method exemplified in the above-mentioned ⁇ Method for site-specifically modifying target double-stranded polynucleotide> in the second embodiment.
  • the present invention is a method for site-specifically modifying a target double stranded polynucleotide in a cell, comprising An expression step of introducing the above-mentioned CRISPR-Cas vector system into cells, and expressing the protein shown in ⁇ Cas9 protein with improved binding ability and cleavage activity to the guide RNA> and the guide RNA; Binding the protein to the target double stranded polynucleotide at a binding site located upstream of a PAM sequence; Obtaining the modified target double-stranded polynucleotide in a region determined by the complementary binding of the guide RNA and the target double-stranded polynucleotide;
  • the guide RNA provides a method comprising a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to a base sequence from 1 base upstream to 20 bases to
  • Cas9 protein and guide RNA are expressed in cells using the above-mentioned CRISPR-Cas vector system.
  • Examples of organisms from which cells to which the method of the present embodiment is applied are derived include prokaryotes, yeasts, animals, plants, insects and the like.
  • the animal is not particularly limited, and examples thereof include, but are not limited to, humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice, rats and the like.
  • the type of organism from which cells are derived can be arbitrarily selected according to the type of target double-stranded polynucleotide desired, purpose and the like.
  • Examples of cells derived from animals to which the method of the present embodiment is applied include germ cells (sperm, eggs, etc.), somatic cells constituting a living body, stem cells, progenitor cells, cancer cells separated from living bodies, living bodies Cells (cell lines) which are isolated from cells and acquired immortalization ability and stably maintained in vitro, cells isolated from living organisms, artificially genetically modified cells, cells isolated from living organisms and artificially nuclear-exchanged And the like, without being limited thereto.
  • somatic cells constituting a living body include skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, bladder, prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, Examples include, but are not limited to, cells collected from any tissue such as bone, cartilage, blood vessel tissue, blood, heart, eye, brain, nerve tissue and the like.
  • somatic cells more specifically, for example, fibroblasts, bone marrow cells, immune cells (eg, B lymphocytes, T lymphocytes, neutrophils, macrophages, monocytes, etc.), red blood cells, platelets, osteocytes Bone marrow cells, pericytes, dendritic cells, keratinocytes, adipocytes, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells, endothelial cells, endothelial cells, endothelial cells, lymphatic endothelial cells, hepatocytes, pancreatic islet cells (eg, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, PP cells etc.), chondrocytes, cumulus cells, glial cells, neurons (neurons), oligodendrocytes, microglia, astrocytes, cardiomyocytes, esophageal cells, muscle cells (For example, smooth muscle cells, skeletal muscle cells and the like), melan
  • Stem cells are cells that have the ability to replicate themselves and to differentiate into cells of multiple other lineages.
  • Examples of stem cells include embryonic stem cells (ES cells), embryonic tumor cells, embryonic germ stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells), neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells Muscle stem cells, germ stem cells, enteric stem cells, cancer stem cells, hair follicle stem cells and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • Cancer cells are cells derived from somatic cells and having acquired infinite proliferation ability.
  • cancers from which cancer cells are derived include, for example, breast cancer (eg, invasive ductal carcinoma, non-invasive ductal carcinoma, inflammatory breast cancer, etc.), prostate cancer (eg, hormone-dependent prostate) Cancer, hormone-independent prostate cancer, etc.), pancreatic cancer (eg, pancreatic duct cancer), stomach cancer (eg, papillary adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, adenosquamous carcinoma), lung cancer (eg, Non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, malignant mesothelioma, etc., colon cancer (eg, gastrointestinal stromal tumor, etc.), rectal cancer (eg, gastrointestinal stromal tumor, etc.), colon cancer (eg, Familial colorectal cancer, hereditary non-polyposis colorectal cancer, digestive tract stromal tumor etc), small intestine cancer (eg non-
  • a cell line is a cell which has acquired infinite proliferation ability by artificial manipulation in vitro.
  • Examples of cell lines include HCT116, Huh7, HEK293 (human fetal kidney cells), HeLa (human cervical cancer cell line), HepG2 (human hepatoma cell line), UT7 / TPO (human leukemia cell line), CHO (Chinese hamster ovary cell line), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT-29, AE-1, 3D9, Ns0 / 1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, S2, Sf9, Sf21, High Five, Vero, etc. Is not limited to these.
  • the method for introducing the CRISPR-Cas vector system into cells may be any method suitable for the living cells to be used, such as electroporation, heat shock method, calcium phosphate method, lipofection method, DEAE dextran method, microinjection method , Particle gun method, method using virus, FuGENE (registered trademark) 6 Transfection Reagent (manufactured by Roche), Lipofectamine 2000 Reagent (manufactured by Invitrogen), Lipofectamine LTX Reagent (manufactured by Invitrogen), Lipofectamine 3000 Reagent (manufactured by Invitrogen) Methods using commercially available transfection reagents such as It is possible.
  • FuGENE registered trademark 6 Transfection Reagent
  • Lipofectamine 2000 Reagent manufactured by Invitrogen
  • Lipofectamine LTX Reagent manufactured by Invitrogen
  • Lipofectamine 3000 Reagent manufactured by Invitrogen
  • the subsequent modification step is the same as the method described in the above-mentioned ⁇ First embodiment of ⁇ Method for site-specifically modifying target double-stranded nucleotide>.
  • modification of the target double-stranded polynucleotide in this embodiment it is possible to obtain a mutation into the target double-stranded polynucleotide or a cell in which the function of the target double-stranded polynucleotide is disrupted or modified.
  • the protein is the target double-stranded polynucleotide at the binding site located upstream of the PAM sequence. It can be tied to, but can not stay there and cut. Therefore, for example, when a labeled protein such as a fluorescent protein (eg, GFP) is fused to the protein, the labeled protein can be bound to the target double-stranded polynucleotide via the guide RNA-mutated Cas9 protein.
  • a labeled protein such as a fluorescent protein (eg, GFP)
  • the labeled protein can be bound to the target double-stranded polynucleotide via the guide RNA-mutated Cas9 protein.
  • a transcriptional regulator protein or domain can be linked to the N-terminus or C-terminus of the mutant Cas9 protein.
  • the transcriptional regulator or domain thereof includes a transcriptional activator or domain thereof (eg, VP64, NF- ⁇ B p65) and a transcriptional silencer or domain thereof (eg, heterochromatin protein 1 (HP1)) or a transcriptional repressor or domain thereof (Eg, Kruppel associated box (KRAB), ERF repressor domain (ERD), mSin3A interaction domain (SID)).
  • a transcriptional activator or domain thereof eg, VP64, NF- ⁇ B p65
  • a transcriptional silencer or domain thereof eg, heterochromatin protein 1 (HP1)
  • HP1 heterochromatin protein 1
  • Eg Kruppel associated box
  • ERF repressor domain ERF repressor domain
  • SID mSin3A interaction domain
  • Enzymes that modify the methylation status of DNA eg, DNA methyltransferase (DNMT), TET
  • enzymes that modify histone subunits eg, histone acetyltransferase (HAT), histone deacetylase (HDAC), histone methyltransferase , Histone demethylase
  • DNMT DNA methyltransferase
  • TET DNA methyltransferase
  • HAT histone acetyltransferase
  • HDAC histone deacetylase
  • Histone demethylase Histone demethylase
  • the invention provides methods and compositions for performing genome editing and treating genes.
  • the method of the present embodiment is efficient and inexpensive to perform and is adaptable to any cell or organism. Any segment of double-stranded nucleic acid of a cell or an organism can be modified by the gene therapy method of this embodiment.
  • the gene therapy method of this embodiment utilizes both the homologous recombination process and the non-homologous recombination process that are endogenous to all cells.
  • gene editing refers to specificity by performing targeted genetic recombination or targeted mutations by techniques such as the CRISPR / Cas9 system or the Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN). It means a new gene modification technology that performs gene disruption, reporter gene knock-in, etc.
  • the invention also provides gene therapy methods for targeted DNA insertion or targeted DNA deletion.
  • the gene therapy method involves transforming a cell with a nucleic acid construct comprising donor DNA.
  • the scheme for DNA insertion and DNA deletion after target gene cleavage can be determined by those skilled in the art according to known methods.
  • the present invention provides gene therapy methods that are utilized in both somatic and germ cells to perform genetic manipulation at specific loci.
  • the invention also provides gene therapy methods for disrupting genes in somatic cells.
  • the gene overexpresses products harmful to cells or organisms and expresses products harmful to cells or organisms.
  • Such genes can be overexpressed in one or more cell types that occur in disease. Disruption of the overexpressed gene by the gene therapy method of the present embodiment can provide better health to an individual suffering from a disease caused by the overexpressed gene. That is, destruction of a small percentage of genes in cells works, reducing expression levels and producing a therapeutic effect.
  • the invention also provides gene therapy methods for disrupting genes in germ cells.
  • Cells in which a specific gene is disrupted can be utilized to create an organism that does not have the function of the specific gene.
  • the gene can be completely knocked out. The loss of function in this particular cell may have a therapeutic effect.
  • the invention also provides gene therapy methods for inserting donor DNA encoding a gene product.
  • This gene product has a therapeutic effect when constitutively expressed.
  • a method of inserting the donor DNA into an individual suffering from diabetes to cause insertion of donor DNA encoding active promoter and insulin gene in a population of pancreatic cells can be mentioned.
  • the population of pancreatic cells containing the donor DNA can then produce insulin to treat diabetic patients.
  • the donor DNA can be inserted into the crop to produce a drug related gene product.
  • Genes of protein products eg, insulin, lipase or hemoglobin
  • regulatory elements consisttitutively active promoters or inducible promoters
  • Transgenic plants or transgenic animals use nucleic acid transfer technology (McCreath, KJ et al. (2000) Nature 405: 1066-1069; Polejaeva, I. A. et al., (2000) Nature 407: 86-90). It can be produced by a method. Tissue-type specific or cell-type specific vectors can be used to provide gene expression only in selected cells.
  • donor DNA can be inserted into the target gene, and all subsequent cell division can generate cells with designed genetic alterations.
  • the target of application of the gene therapy method of the present embodiment includes, for example, any organism, cultured cells, cultured tissue, cultured nucleus (cultured cells, cultured tissue, or cultured nucleus intact can be used to regenerate an organism.
  • any organisms insects, fungi, rodents, cattle, sheep, goats, chickens, and other agriculturally important animals, and other animals
  • mammals such as, but not limited to, dogs, cats, and humans are included.
  • the gene therapy method of the present embodiment can be used in plants.
  • the plant to which the gene therapy method of the present embodiment is applied is not particularly limited, and can be applied to any of various plant species (eg, monocotyledonous plants or dicotyledonous plants).
  • Example 1 Preparation of wild type and mutant CjCas9 (1) Design of construct A wild type or mutant CjCas9 gene whose codons were optimized by gene synthesis was incorporated into pESUMO vector (Novagen). Furthermore, a TEV recognition sequence was added between the His tag and the CjCas9 gene. The N-terminus of Cas9 expressed from the completed construct is designed to have 6 residues of histidine (His-tag) continuous and a TEV protease recognition site added.
  • the nucleotide sequence of the CjCas9 gene used is as follows.
  • Nucleotide sequence of mutant CjCas9 gene (K869R): Sequence or mutation of AAA at position 2605 to 2607 in C.I.
  • CjCas9 gene (E946R / S801H): A sequence in which GAG at positions 2836 to 2838 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is converted to CGT, TCT at positions 2401 to 2403 is converted to CAT, and variant CjCas9 gene (E946R / Nucleotide sequence of S801R): Sequence number Sequence obtained by converting GAG at position 2836-2838 in the nucleotide sequence of No. 1 into CGT and TCT in position 2401-2403 into CGT.
  • Nucleotide sequence of mutant CjCas9 gene (E946R / T802R): in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 Sequence in which GAG at positions 2836 to 2838 is converted to CGT, and TAC at positions 2404 to 2406 to CGT.
  • Nucleotide sequence of mutant CjCas9 gene (E946R / N827R): GAG at positions 2836 to 2838 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the nucleotide sequence of the mutant CjCas9 gene (E946R / K869R) in which AAC at positions 2479 to 2481 is converted to CGT in CGT, and the mutant CjCas9 gene (E946R / K869R): GAG at positions 2836 to 2838 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to CGT CG AAA 2607
  • Nucleotide sequence of the mutated CjCas 9 gene (E946R / A911R / T913R) converted to each: GAG at positions 2836 to 2838 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as CGT, GCC at positions 2731 to 2733 as CGT,
  • Nucleotide sequence of mutant CjCas9 gene (E946R / A911R / S801H): GAG of positions 2836 to 2838 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence in which GCC at positions 2731 to 2733 is converted to CGT at position 2731 to 2733, and TCT at positions 2401 to 2403 to CAT.
  • Nucleotide sequence of mutant CjCas9 gene (K816R): position 2446 to 2448 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • Sequence of AAG converted to CGT-Nucleotide sequence of mutant CjCas9 gene (E946R / K816R): Converting GAG at positions 2836 to 2838 into CGT and AAG at positions 2446 to 2448 to CGT in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • Sequence ⁇ dCjCas9 gene (D8A + N559A): A sequence obtained by converting 22-24 GAC into GCG, and 1675-1677 CAC into GCC in the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Mutant dCjCas9 gene (E946R + D8A + N559A): 2836-2838 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 Sequence of GAG converted to CGC, 22 to 24 GAC to GCG, and 1675 to 1677 CAC converted to GCC
  • the prepared vector was transformed into E. coli Escherichia coli rosetta2 (DE3) strain. Thereafter, the cells were cultured in LB medium containing 20 ⁇ g / ml kanamycin. At the time of culture to an OD of 0.8, isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) (final concentration 0.5 mM) is added as an expression inducer, The cells were cultured at 20 ° C. for 20 hours. After culture, E. coli was recovered by centrifugation (8,000 g, 10 minutes).
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • buffer E 2 M NaCl 7.5%
  • buffer E is changed from 15% to 100%.
  • the target protein was eluted with a linear gradient (NaCl concentration from 300 mM to 1 M).
  • the TEV protease was added to the eluted protein and the TEV protease recognition site was cleaved at 4 ° C. while dialysis against buffer A overnight. After the cleavage treatment, it was mixed with buffer A equilibrated with Ni-NTA Superflow resin (QIAGEN), and the flow-through fraction was recovered. This operation separated His tag and TEV protease. Thereafter, washing was performed with 2 column volumes of buffer A.
  • the washed fraction was separated and mixed with the flow-through fraction to give a sample solution.
  • gel filtration chromatography was performed using a gel filtration column equilibrated with buffer solution F to separate the target protein fraction.
  • the compositions of buffers A to E are shown below.
  • Buffer A 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole Buffer solution B: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl, 20 mM imidazole Buffer C: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole Buffer D: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 Buffer solution E: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2000 mM NaCl Buffer F: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl
  • RNA sequence of interest ( ggaaattaggtgcgcttggc gttttagtccctgaaaagggactaaaataaagagtttgcgggactctgcggttacaatcccctaaaccgctt; SEQ ID NO: 3) was inserted was prepared.
  • the underlined part shows a guide sequence of 20 bases, and the rest corresponds to a scaffold.
  • the T7 promoter sequence was added upstream of the guide RNA sequence and incorporated into the linearized pUC119 vector (TaKaRa). Based on the prepared vector, PCR was used to prepare a template DNA for in vitro transcription reaction.
  • an in vitro transcription reaction with T7 RNA polymerase was performed at 37 ° C. for 4 hours.
  • An equal volume of phenol chloroform was added to the reaction solution containing the transcript, mixed, and then centrifuged (10,000 g, 2 minutes) at 20 ° C. to recover the supernatant.
  • To the supernatant was added 1/10 volume of 3 M sodium acetate and 2.5 volumes of 100% ethanol, and centrifuged (10,000 g, 3 minutes) at 4 ° C. to precipitate the transcript. The supernatant was discarded, 70% ethanol was added, centrifuged at 4 ° C. (10,000 g, 3 minutes), and the supernatant was discarded again.
  • the precipitate was air dried, resuspended in TBE buffer and purified by 7 M Urea denaturing 10% PAGE.
  • the band located at the molecular weight of the target RNA was cut out, and the RNA was extracted by Elutrap electroelution system (GE Healthcare). Thereafter, the extracted RNA was passed through a PD-10 column (GE Healthcare), and the buffer solution was exchanged with buffer H (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl).
  • Plasmid DNA Cleavage Activity Measurement Test In order to use the DNA cleavage activity measurement test, a vector into which a target DNA sequence and PAM sequence were inserted was prepared. Each PAM sequence was added to the target DNA sequence and incorporated into a linearized pUC119 vector. The target sequences and PAM sequences 1 and 2 are shown in Table 1.
  • E. coli Mach1 strain (Life Technologies) was transformed with the prepared vector, and cultured at 37 ° C. in LB medium containing 20 ⁇ g / mL ampicillin. After culture, cells were collected by centrifugation (8,000 g, 1 minute), and plasmid DNA was purified using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Cleavage experiments were performed using the target plasmid DNA to which the purified PAM sequence was added. The plasmid DNA was linearized into one by restriction enzyme. Cleavage of the target DNA sequence in this linearized DNA by wild-type or mutant CjCas9 produces cleavage products of about 1,000 bp and about 2,000 bp.
  • cleavage buffer B As a buffer for cleavage, cleavage buffer B having the following composition was used. Composition of cleavage buffer B ( ⁇ 10) 200 mM HEPES 7.5 1000 mM KCl 50% glycerol 10 mM DTT 5 mM EDTA 20 mM MgCl 2 The reacted sample was subjected to electrophoresis using a 1% agarose gel to confirm the bands of cleavage products. The results are shown in FIG. In the figure, “substrate” indicates a substrate, and “product” indicates a cleavage product. PAM sequences and reaction conditions are shown in the figure.
  • mutant CjCas9 improves restriction of cleavage activity for target plasmid DNA. From the above, it was revealed that the cleavage efficiency of CjCas9 of the mutant type is improved, and site-specific cleavage of the target double-stranded polynucleotide can be rapidly carried out with respect to the target sequence.
  • Example 2 Target gene transcription repression in eukaryotic cells (GNDMi) assay (1) Design of constructs Wild type or mutant CjCas9 gene whose codons are optimized by gene synthesis, BglII / XhoI site of CP-LvC9NU-09 vector (Genocopia) Built in. A gene designed to link the transcriptional repressor KRAB to the mutant CjCas9 was similarly incorporated into the vector. In addition, the guide RNA sequences shown in Table 2 were respectively incorporated into the BsmB1 site of the p CRISPR-Lv SG03 (Genocopia) vector to obtain a guide RNA expression plasmid.
  • GNDMi eukaryotic cells
  • the present invention it is possible to obtain a mutant CjCas9 protein which has improved binding ability to a target double-stranded polynucleotide and further has enhanced endonuclease activity.
  • the nuclease activity deletion mutation of the Cas9 protein is introduced, and linked and used with a gene regulatory protein, it is possible to provide an effect of controlling the expression of a target gene conveniently and rapidly.

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Abstract

配列番号２で表されるアミノ酸配列において、 ９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、 ９１１位のアラニンがアルギニンに置換し、 ９２０位のイソロイシンがアルギニンに置換している アミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質等の改変型ＣｊＣａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡとの結合能が向上しており、遺伝子編集におけるツールとして有用である。

Description

改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途
　本発明は、より高い活性を有する、改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途に関する。
　クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子と共に、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成することが知られている。ＣＲＩＳＰＲは、ファージまたはプラスミドＤＮＡに起因することが多く、大きさの類似するスペーサーと呼ばれる独特の可変ＤＮＡ配列が間に入った、２４～４８ｂｐの短い保存された反復配列からなる。また、リピート及びスペーサー配列の近傍には、Ｃａｓタンパク質ファミリーをコードする遺伝子群が存在する。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて、外来性のＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質ファミリーによって３０ｂｐ程度の断片に切断され、ＣＲＩＳＰＲに挿入される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ１及びＣａｓ２タンパク質は、外来性ＤＮＡのｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）と呼ばれる塩基配列を認識して、その上流を切り取って、宿主のＣＲＩＳＰＲ配列に挿入し、これが細菌の免疫記憶となる。免疫記憶を含むＣＲＩＳＰＲ配列が転写されて生成したＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡと呼ぶ。）は、一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対合し、Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ９タンパク質に取り込まれる。Ｃａｓ９に取り込まれたｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡはＲＮａｓｅＩＩＩにより切断され、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡｓ：ｃｒＲＮＡｓ）となり、Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体はｃｒＲＮＡと相補的な外来侵入性ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断する酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓ９タンパク質が、外来侵入性ＤＮＡを切断することよって、外から侵入したＤＮＡの機能を抑制及び排除する。
　Ｃａｓ９タンパク質は外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によってさまざまであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）では「ＮＧＧ」（Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｔ/Ｇ）の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」（Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｔ/Ｇ）又は「ＮＮＡＧＡＡ」（Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｔ/Ｇ）の５～６塩基をＰＡＭ配列として認識する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）では「ＮＧＲ」（Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｔ/Ｇ；Ｒ＝Ａ/Ｇ）の３塩基を認識する。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）では「ＮＮＮＶＲＹＭ」（Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｔ/Ｇ；Ｖ＝Ａ/Ｇ/Ｃ；Ｒ＝Ａ/Ｇ；Ｙ＝Ｔ/Ｃ；Ｍ＝Ａ/Ｃ）の７塩基を認識する。ＰＡＭ配列の上流の何ｂｐのところを切断するかも細菌種によって異なるが、大部分のＣａｓ９オルソログはＰＡＭ配列の３塩基上流を切断する。
　近年、細菌でのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、ゲノム編集に応用する技術が盛んに開発されている。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合させて、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラ（以下、ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ：ｇＲＮＡ）と呼ぶ。）として発現させ、活用している。これによりｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ　ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＲＧＮ）を呼び込み、目的の部位でゲノムＤＮＡを切断する。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムには、ｔｙｐｅＩ、ＩＩ、ＩＩＩがあるが、ゲノム編集で用いるのはもっぱらｔｙｐｅＩＩ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであり、ｔｙｐｅＩＩではＲＧＮとしてＣａｓ９タンパク質が用いられている。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた方法は、目的のＤＮＡ配列と相同な短いｇＲＮＡを合成するだけでよく、単一のタンパク質であるＣａｓ９タンパク質を用いてゲノム編集ができる。そのため、従来用いられていたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）やトランス活性化因子様作動体（ＴＡＬＥＮ）のようにＤＮＡ配列ごとに異なる大きなタンパク質を合成する必要がなく、簡便かつ迅速にゲノム編集を行うことができる。
　特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。
　特許文献２には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。さらに、特許文献２には、Ｃａｓ９タンパク質のＤ３１Ａ又はＮ８９１Ａ変異体が、一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素であるｎｉｃｋａｓｅとして機能することが開示されている。さらに、ＤＮＡ切断後の修復メカニズムで挿入欠失などの変異を起こしやすい非相同末端結合の発生率は少ないままで、野生型Ｃａｓ９タンパク質と同程度の相同組み換え効率を有することが示されている。
　非特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９を使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであって、２つのＣａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体と、該Ｄ１０Ａ変異体と複合体を形成する１対の標的特異的ガイドＲＮＡを利用するダブルニッカーゼシステムが開示されている。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体は、ガイドＲＮＡと相補するＤＮＡ鎖に１つだけニックを作る。一対のガイドＲＮＡは約２０塩基程度ずれており、標的ＤＮＡの反対鎖に位置する標的配列のみを認識する。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体によって作られた２つのニックはＤＮＡ二本鎖切断（ＤＮＡ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋ：ＤＳＢ）を模倣する状態になり、一対のガイドＲＮＡを利用することで高レベルの効率を維持しつつ、Ｃａｓ９タンパク質媒介型遺伝子編集の特異性を改善できることが示されている。
　特許文献３には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質の各種変異体が、特許文献４には、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９タンパク質の各種変異体が開示されている。
　Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９タンパク質については、非特許文献２に結晶構造及び各種変異体が開示され、非特許文献３にオルソログが開示されている。
ＷＯ２０１４／０９３６６１ 特表２０１５－５１０７７８号公報 ＷＯ２０１６／１４１２２４ ＷＯ２０１７／０１０５４３
Ran, F. A., et al., Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity, Cell, vol.154, p1380-1389, 2013. Yamada et al., Crystal Structure of the Minimal Cas9 from Campyrobacter jejuni Reveals the Molecular Diversity in the CRISPER-Cas9 Systems, Molecular Cell, vol.65, p1109-1121, 2017 Kim et al., In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campyrobacter jejuni, Nature Communications, 8, 14500, 2017
　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９（本明細書中、ＣｊＣａｓ９とも称する）タンパク質は、そのサイズの小ささゆえにその活用が期待されているが、ガイドＲＮＡとの結合活性がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（本明細書中、ＳｐＣａｓ９とも称する）に比べて弱く、結果的に切断活性が弱いことが知られている。
　このように従来のＣａｓ９タンパク質には、原核生物や真核生物での活性がＣａｓ９ファミリーの中で比較的低く、十分な編集効率が得られないという問題点があった。
　本発明は、ガイドＲＮＡとの結合能を向上したＣａｓ９タンパク質及びその用途を提供することを目的とする。
　本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質として、ＣｊＣａｓ９タンパク質に着目し、上記課題を解決すべく鋭意検討した。結果、ＣｊＣａｓ９タンパク質の所定の位置のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換する（変異を導入する）ことによって、ガイドＲＮＡとの結合能を向上し、また切断活性を向上することに成功し、本発明を完成するに至った。
　本明細書中、変異を導入する前のＣａｓ９タンパク質を野生型Ｃａｓ９タンパク質、変異を導入した後のＣａｓ９タンパク質を改変されたＣａｓ９タンパク質あるいは変異型Ｃａｓ９タンパク質と称する場合がある。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
９１１位、９２０位及び９４６位からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位に変異を有するアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
［２］９１１位、９２０位及び９４６位からなる群より選ばれる少なくとも２つの部位に変異を有する、上記［１］記載のタンパク質。
［３］９１１位、９２０位及び９４６位全ての部位に変異を有する、上記［１］記載のタンパク質。
［４］９１１位の変異が、アラニンのアルギニンへの置換であり；
　９２０位の変異が、イソロイシンのアルギニンへの置換であり；
　９４６位の変異が、グルタミン酸のアルギニン、グリシン、システイン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、バリン、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換である；
上記［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質。
［５］９４６位の変異が、グルタミン酸のアルギニンへの置換である、上記［４］記載のタンパク質。
［６］さらに、８０１位及び／又は８６９位の変異を有する、上記［１］～［５］のいずれかに記載のタンパク質。
［７］８０１位の変異が、セリンのアルギニン又はヒスチジンへの置換であり；
　８６９位の変異が、リジンのアルギニンへの置換である
上記［６］に記載のタンパク質。
［８］８０１位の変異が、セリンのアルギニンへの置換である、上記［７］記載のタンパク質。
［９］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、
９１１位のアラニンがアルギニンに置換するか、８０１位のセリンがアルギニン又はヒスチジンに置換するか、８６９位のリジンがアルギニンに置換しているアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
［１０］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、
９１１位のアラニンがアルギニンに置換し、
９２０位のイソロイシンがアルギニンに置換している
アミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
［１１］配列番号２の変異が施された位置以外の部位において８０％以上の同一性を有する、上記［１］～［１０］のいずれかに記載のタンパク質。
［１２］配列番号２の変異が施された位置以外の部位において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加された、上記［１］～［１０］のいずれかに記載のタンパク質。
［１３］ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のタンパク質。
［１４］さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、８位、５５９位及び／又は５８２位に変異を有する、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のタンパク質。
［１５］８位の変異がアスパラギン酸のアラニンへの置換であり；５５９位の変異がヒスチジンのアラニンへの置換であり；５８２位の変異がアスパラギンのアラニンへの置換である、上記［１４］に記載のタンパク質。
［１６］転写制御因子タンパク質又はドメインを連結した、上記［１４］又は［１５］記載のタンパク質。
［１７］転写制御因子が転写活性化因子である、上記［１６］記載のタンパク質。
［１８］転写制御因子が転写サイレンサー又は転写抑制因子である、上記［１６］記載のタンパク質。
［１９］上記［１］～［１８］のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
［２０］上記［１］～［１８］のいずれかに記載のタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Proto-spacer Adjacent Motif）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質－ＲＮＡ複合体。
［２１］標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、
　前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
　前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＮＧＮＮＮ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有し、
　前記タンパク質は、上記［１］～［１８］のいずれかに記載のタンパク質であり、
　前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。
［２２］改変が、標的二本鎖ポリヌクレオチドの部位特異的な切断である、上記［２１］記載の方法。
［２３］改変が、標的二本鎖ポリヌクレオチドにおける部位特異的な、１以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加である、上記［２１］記載の方法。
［２４］細胞の標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記細胞内で上記［１７］に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
［２５］細胞の標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、前記細胞内で上記［１８］に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
［２６］細胞が真核細胞である、上記［２４］又は［２５］に記載の方法。
［２７］細胞が酵母細胞、植物細胞又は動物細胞である、上記［２４］又は［２５］に記載の方法。
　本発明によれば、ガイドＲＮＡとの結合能が向上したＣａｓ９タンパク質を得ることができる。また、前記Ｃａｓ９タンパク質を利用した簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術あるいは遺伝子発現制御技術を提供することができる。
図１Ａは、実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。ＰＡＭ配列として「ＡＧＡＡＡＣＣＣ」を用い、制限酵素としてＥｃｏＲＩを用いた。 図１Ｂは、実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。ＰＡＭ配列として「ＡＧＡＡＡＣＣＣ」を用い、制限酵素としてＥｃｏＲＩを用いた。 図１Ｃは、実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。ＰＡＭ配列として「ＡＧＡＡＡＣＣＣ」及び「ＡＧＧＧＡＣＣＣ」を用い、制限酵素としてＥｃｏＲＩを用いた。 図２Ａは、ＭｙＤ８８遺伝子の転写制御領域にデザインされたＪ１－Ｊ３の３つのガイドＲＮＡとｄＣｊＣａｓ９、ｄＣｊＣａｓ９にＫＲＡＢを連結した分子（ｄＣｊＣａｓ９－ＫＲＡＢ）、変異型ｄＣｊＣａｓ９にＫＲＡＢを連結した分子（ｄＣｊＣａｓ９－ＥＲ－ＫＲＡＢ）のそれぞれを用いてＭｙＤ８８遺伝子の発現抑制の結果を示した図である。グラフの各カラムは、それぞれ左側よりガイドＲＮＡのみ、ガイドＲＮＡとｄＣｊＣａｓ９、ガイドＲＮＡとｄＣｊＣａｓ９－ＫＲＡＢ、及びガイドＲＮＡとｄＣｊＣａｓ９－ＥＲ－ＫＲＡＢの結果を示す。Ｊ１及びＪ３についてはそれぞれ２回ずつ実施した（Ｊ１－１、Ｊ１－２、Ｊ３－１、Ｊ３－２）、Ｊ２については1回実施した（Ｊ２－１）。ｄＣｊＣａｓ９；ヌクレアーゼ活性欠失変異が導入されたＣｊＣａｓ９。変異型ｄＣｊＣａｓ９（ｄＣｊＣａｓ９－ＥＲとも称する）；Ｅ９４６Ｒの変異を有するｄＣｊＣａｓ９。 図２Ｂは、ＭｙＤ８８遺伝子の転写制御領域にデザインされたＪ１－Ｊ１３の１３個のガイドＲＮＡのそれぞれと変異型ｄＣｊＣａｓ９にＫＲＡＢを連結した分子（ｄＣｊＣａｓ９－ＥＲ－ＫＲＡＢ）を用いてＭｙＤ８８遺伝子の発現抑制の結果を示した図である。
　以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質＞
　本実施形態のタンパク質は、ガイドＲＮＡへの結合力及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質（以下、単に改変型Ｃａｓ９とも称する）である。本実施形態のタンパク質によれば、簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術あるいは遺伝子発現制御技術を提供することができる。
　本明細書中において、「ガイドＲＮＡ」とは、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡのヘアピン構造を模倣したものであり、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的二本鎖ポリヌクレオチドと非相補的な塩基配列からなり、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
　ガイドＲＮＡは、本発明の変異型Ｃａｓ９タンパク質と結合して、該タンパク質を標的ＤＮＡに導く機能を有する。ガイドＲＮＡは、その５’末端に標的ＤＮＡに相補的な配列を有し、該相補的な配列を介して標的ＤＮＡに結合することにより、本発明の変異型Ｃａｓ９タンパク質を標的ＤＮＡに導く。変異型Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能する場合には、標的ＤＮＡが存在する部位でＤＮＡを切断し、例えば、標的ＤＮＡの機能を特異的に喪失させることができる。
　ガイドＲＮＡは、切断あるいは修飾すべき標的ＤＮＡの配列情報に基づき設計され調製される。具体的には実施例で用いられるような配列が挙げられる。
　本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の途中を切断する酵素を意味する。よって、エンドヌクレアーゼ活性を有する、本実施形態の変異型Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡにより誘導され、ＤＮＡ鎖の途中を切断する酵素活性を有する。
　本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味し、互換的に使用される。また、１つ若しくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーを意味する。
　本明細書中において、「配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味しており、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、線状、環状、又は分岐状であり、一本鎖又は二本鎖である。
　本明細書中において、「ＰＡＭ配列」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Ｃａｓ９タンパク質により認識可能な配列を意味し、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によって異なる。本発明の改変型Ｃａｓ９により認識可能な配列は、「５’－ＮＮＮＶＲＹＭ－３’」で表すことができる。
　なお、本明細書において、「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン及びグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味し、「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミン、「Ｒ」はプリン骨格を有する塩基（アデニン又はグアニン）、「Ｙ」はピリミジン骨格を有する塩基（シトシン又はチミン）、「Ｖ」は、アデニン、グアニン、及びシトシンからなる群から選択された任意の１塩基、「Ｍ」はアデニン又はシトシンを意味する。
　本明細書中において、「ポリヌクレオチド」とは、線状又は環状配座であり、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。また、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含する。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、例えば、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
　一実施形態において、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、９１１位、９２０位及び９４６位からなる群より選ばれる少なくとも１つ、２つ又は３つ全ての部位に変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様１）を提供する。加えて、態様１のタンパク質はＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
　配列番号２は、ＣｊＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列（９８４アミノ酸）である。配列番号１は、ＣｊＣａｓ９タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。
　９１１位における変異は、具体的には、９１１位のアラニンのアルギニンへの置換である。
　９２０位における変異は、具体的には、９２０位のイソロイシンのアルギニンへの置換である。
　９４６位における変異は、具体的には、９４６位のグルタミン酸のアルギニン、グリシン、システイン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、バリン、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換である。
　態様１において以下の態様がより好ましい。
・９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換している（態様１－１）
・９１１位のアラニンがアルギニンに置換している（態様１－２）
・９２０位のイソロイシンがアルギニンに置換している（態様１－３）
・９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、９１１位のアラニンがアルギニンに置換している（態様１－４）
・９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、９１１位のアラニンがアルギニンに置換し、９２０位のイソロイシンがアルギニンに置換している（態様１－５）
　本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１の変異に加えて、さらに８０１位及び／又は８６９位に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様２）を提供する。加えて、態様２のタンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
　８０１位における変異は、具体的には、８０１位のセリンの、アルギニン又はヒスチジンへの置換、好ましくはアルギニンへの置換であり、８６９位における変異は、具体的には８６９位のリジンのアルギニンへの置換である。
　態様２において以下の態様がより好ましい。
・９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、８０１位のセリンがヒスチジンに置換している（態様２－１）
・９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、８０１位のセリンがアルギニンに置換している（態様２－２）
・９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、８６９位のリジンがアルギニンに置換している（態様２－３）
・９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、８０１位のアラニンがアルギニンに置換し、９２０位のイソロイシンがアルギニンに置換している（態様２－４）
・９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、９１１位のアラニンがアルギニンに置換し、８０１位のセリンがヒスチジンに置換している（態様２－５）
　本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１又は２の変異に加えて、さらに、（ｉ）８位の位置、及び／又は（ｉｉ）５５９位及び５８２位からなる群より選択される位置に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様３）を提供する。態様３は好ましくは、８位の位置、及び５５９位又は５８２位の位置に変異を有し、より好ましくは８位の位置及び５５９位の位置に変異を有する。
　該８位における変異は、具体的には、８位のアスパラギン酸のアラニン又はアスパラギンへの置換である。
　該５５９位における変異は、具体的には、５５９位のヒスチジンのアラニン、アスパラギン又はチロシンへの置換である。
　該５８２位における変異は、具体的には、５８２位のアスパラギンのアスパラギン酸、セリン又はヒスチジンへの置換である。
　態様３として好ましくは、８位のアスパラギン酸がアラニンに置換し、５５９位のヒスチジンがアラニンに置換したタンパク質である。
　（ｉ）の変異又は（ｉｉ）の変異を有する態様３のタンパク質は、ニッカーゼ活性を有する。
　（ｉ）の変異及び（ｉｉ）の変異を有する態様３のタンパク質は、ガイドＲＮＡと結合し標的ＤＮＡへと運ばれるがエンドヌクレアーゼ活性が失活している。
　本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１～３のタンパク質と機能的に同等なタンパク質（態様４）を提供する。前記態様１～３のタンパク質と機能的に同等であるためには配列番号２で表されるアミノ酸配列において、前記態様１～３で変異が施された位置以外の部位において、８０％以上の配列同一性を有し、且つガイドＲＮＡとの結合能を有する。変異によりアミノ酸に増減があった場合には、該「変異が施された位置以外の部位」は「変異が施された位置に相当する位置以外の部位」と解することができる。係る同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。アミノ酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、アミノ酸配列同一性（％）は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら(1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453)、Myers及びMiller (CABIOS, 1988, 4: 11-17)のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Needlemanらのアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、BLOSUM 62 matrix又はPAM250 matrix、並びにgap weight: 16、14、12、10、8、6若しくは4、及びlength weight: 1、2、3、4、5若しくは6のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Myers及びMillerのアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、例えば、PAM120 weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4を用いることができる。
　前記態様１～３のタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、前記態様１～３で変異が施された位置以外の部位において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加され、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様５）が提供される。変異によりアミノ酸に増減があった場合には、該「変異が施された位置以外の部位」は「変異が施された位置に相当する位置以外の部位」と解することができる。
　「アミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加」を人為的に行う場合の手法としては、例えば、所定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
　前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも1残基、具体的には1若しくは数個、またはそれ以上である。また前記置換、欠失、挿入または付加のうち、特にアミノ酸の置換が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、pK、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、i)グリシン、アラニン；ii)バリン、イソロイシン、ロイシン；iii)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；iv)セリン、スレオニン；v)リジン、アルギニン；vi)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
　本発明の改変型Ｃａｓ９として、好ましくは、配列番号２において
９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換（Ｅ９４６Ｒ）し、
９１１位のアラニンがアルギニンに置換（Ａ９１１Ｒ）するか、８０１位のセリンがアルギニン又はヒスチジンに置換（Ｓ８０１Ｒ又はＳ８０１Ｈ）するか、８６９位のリジンがアルギニンに置換（Ｋ８６９Ｒ）しているアミノ酸配列を含むタンパク質、または
配列番号２において
９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換（Ｅ９４６Ｒ）し、
９１１位のアラニンがアルギニンに置換（Ａ９１１Ｒ）し、
９２０位のイソロイシンがアルギニンに置換（Ｉ９２０Ｒ）するか８０１位のセリンがアルギニンに置換（Ｓ８０１Ｒ）しているアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
　特に好ましくは、
９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換（Ｅ９４６Ｒ）し、
９１１位のアラニンがアルギニンに置換（Ａ９１１Ｒ）し、
９２０位のイソロイシンがアルギニンに置換（Ｉ９２０Ｒ）しているアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
　本発明の改変型Ｃａｓ９として、配列番号２において
９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換（Ｅ９４６Ｒ）し、
８位のアスパラギン酸がアラニンに置換（Ｄ８Ａ）し、且つ５５９位のヒスチジンがアラニンに置換（Ｈ５５９Ａ）しているか５８２位のアスパラギンがアラニンに置換（Ｎ５８２Ａ）しているアミノ酸配列を含むタンパク質もまた好ましい。
　本明細書中、置換箇所までのアミノ酸残基数を表わす数字の左側に表示したアルファベットは置換前のアミノ酸の1文字表記を示し、右側に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の1文字表記を示している。
　本発明の改変型Ｃａｓ９は、例えば次のような方法により作成することができる。まず、本発明の改変型Ｃａｓ９をコードする核酸を含むベクターを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養して前記タンパク質を発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、前記タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現した前記タンパク質を適宜自体公知の方法により精製することにより、本発明の改変型Ｃａｓ９が得られる。
　宿主としては、特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物が挙げられる。 
＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質－ガイドＲＮＡ複合体＞
　一実施形態において、本発明は、上述の＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ　Ａｄｊａｃｅｎｔ　Ｍｏｔｉｆ）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質－ＲＮＡ複合体を提供する。 
　本実施形態のタンパク質－ＲＮＡ複合体によれば、簡便且つ迅速で標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの編集をすることができる。
　前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは、iｎ　ｖｉｔｒｏ及びiｎ　ｖｉｖｏにおいて、温和な条件で混合することで、タンパク質－ＲＮＡ複合体を形成することができる。温和な条件とは、タンパク質が分解又は変性しない程度の温度及びｐＨを示しており、温度は４℃以上４０℃以下が好ましく、ｐＨは４以上１０以下が好ましい。
　また、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡを混合し、インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。 
＜ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステム＞
　一実施形態において、本発明は、上述の＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質をコードする遺伝子を含む第１のベクターと、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡを含む第２のベクターと、を備えるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを提供する。 
　本実施形態のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムによれば、簡便且つ迅速で標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの編集をすることができる。 
　ガイドＲＮＡは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものを適宜設計すればよい。さらに、標的二本鎖ポリヌクレオチドと非相補的な塩基配列からなり、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
　本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。 
　上述の発現ベクターにおいて、前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡ発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＨＳＶ－ｔｋプロモーター等の動物細胞における発現用のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＲＥＦ（ｒｕｂｂｅｒ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）プロモーター等の植物細胞における発現用のプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等の昆虫細胞における発現用のプロモーター等を使用することができる。これらプロモーターは、前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡ、又は前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡを発現する細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
　上述の発現ベクターは、さらに、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞
［第１実施形態］
　一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
　前記タンパク質は、上述の＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質であり、
　前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。
　本実施形態の方法によれば、ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質を用いることで、簡便であって迅速、且つ標的配列に対し部位特異的に標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変することができる。 
　本実施形態において、タンパク質及びガイドＲＮＡについては、上述の＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質＞において示されたとおりである。
　標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法について、以下に詳細を説明する。
　まず、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡを温和な条件で混合し、インキュベートする。温和な条件とは、上述のとおりである。インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。
　次に、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド上において、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは複合体を形成する。前記タンパク質は、ＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する。前記タンパク質がエンドヌクレアーゼ活性を有する場合が当該部位で該ポリヌクレオチドを切断する。前記Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列を起点として、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が引き剥され、前記ガイドＲＮＡ中の前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列とアニーリングすることで、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が部分的にほぐれる。このとき、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位、及びＰＡＭ配列と相補的な配列の上流に位置する切断部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドのリン酸ジエステル結合を切断する。 
［第２実施形態］
　本実施形態において、インキュベート工程の前に、さらに、上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを用いて、上述の＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程を備えていてもよい。 
　本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを用いて、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。発現させる具体的な方法としては、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、及びガイドＲＮＡを含む発現ベクターそれぞれを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養してＣａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡを発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、融合タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現したＣａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡを適宜の方法により精製することにより、Ｃａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡが得られる。 
＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法＞
［第１実施形態］
　一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する工程と、前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、修飾された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
　前記タンパク質は、上述の＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質であり、
　前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。 
　本実施形態の方法によれば、ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いることで、簡便であって迅速、且つ標的配列に対し部位特異的に標的二本鎖ポリヌクレオチドを修飾することができる。 
　本実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチド、タンパク質及びガイドＲＮＡについては、上述の＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質＞、及び＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞において示されたとおりである。 
　標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法について、以下に詳細を説明する。標的二本鎖ポリヌクレオチドに部位特異的に結合するまでの工程は上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞に示された工程と同様である。続いて、前記ガイドＲＮＡと前記二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、目的に応じた修飾が施された標的二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。 
　本明細書中において、「改変」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列が変化することを意味する。例えば、標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断、切断後の外因性配列の挿入（物理的挿入又は相同指向修復を介する複製による挿入）による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化、切断後の非相同末端連結（ＮＨＥＪ：切断により生じたＤＮＡ末端どうしが再び結合すること）に加え、機能的なタンパク質や塩基配列の付加による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化等が挙げられる。
　本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの変異の導入、又は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの機能を破壊、改変することができる。 
［第２実施形態］
　本実施形態において、インキュベート工程の前に、さらに、上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを用いて、上述の＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程を備えていてもよい。 
　本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを用いて、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。発現させる具体的な方法としては、上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞の［第２実施形態］において例示された方法と同様である。 
＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に改変するための方法＞
　一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に改変するための方法であって、
　上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを細胞に導入し、上述の＜ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程と、
　前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する工程と、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、改変された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
　前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。 
　本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを用いて、細胞内において、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。 
　本実施形態の方法の適用対象となる細胞の由来となる生物としては、例えば、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫等が挙げられる。前記動物としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。また、細胞の由来となる生物の種類は、所望の標的二本鎖ポリヌクレオチドの種類、目的等により任意に選択することができる。 
　本実施形態の方法の適用対象となる動物由来の細胞としては、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。 
　生体を構成する体細胞としては、例えば、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられ、これらに限定されない。体細胞として、より具体的には、例えば、線維芽細胞、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、軟骨細胞、卵丘細胞、グリア細胞、神経細胞（ニューロン）、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心筋細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞等）、メラニン細胞、単核細胞等が挙げられ、これらに限定されない。 
　幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられ、これらに限定されない。 
　がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。がん細胞の由来となるがんとしては、例えば、乳がん（例えば、浸潤性乳管がん、非浸潤性乳管がん、炎症性乳がん等）、前立腺がん（例えば、ホルモン依存性前立腺がん、ホルモン非依存性前立腺がん等）、膵がん（例えば、膵管がん等）、胃がん（例えば、乳頭腺がん、粘液性腺がん、腺扁平上皮がん等）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫等）、結腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸がん（例えば、家族性大腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、消化管間質腫瘍等）、小腸がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道がん、十二指腸がん、舌がん、咽頭がん（例えば、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん等）、頭頚部がん、唾液腺がん、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓がん（例えば、原発性肝がん、肝外胆管がん等）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん、腎盂と尿管の移行上皮がん等）、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱がん、尿道がん、皮膚がん（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞がん等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様ガン等）、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形がん（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
　細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株としては、例えば、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＨＴ－２９、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ等が挙げられ、これらに限定されない。 
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムの細胞への導入方法としては、使用する生細胞に適した方法で行うことができ、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、ウイルスを用いた方法や、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ　Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００　Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）などの市販のトランスフェクション試薬を用いた方法などを挙げることができる。 
　続く、修飾工程については、上述の＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞の［第１実施形態］に示された方法と同様である。
　本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの変異の導入、又は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの機能が破壊、改変された細胞を得ることができる。 
　本発明の変異型Ｃａｓ９タンパク質として、エンドヌクレアーゼ活性を有さない態様（例、態様３）を用いた場合には、該タンパク質はＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができるが、そこにとどまって切断することができない。従って、例えば該タンパク質に蛍光タンパク質（例、ＧＦＰ）等の標識タンパク質を融合させておくと、ガイドＲＮＡ－変異型Ｃａｓ９タンパク質を介して標識タンパク質を標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合させることができる。変異型Ｃａｓ９タンパク質に結合させる物質を適宜選択することによって多様な機能を標的二本鎖ポリヌクレオチドに与えることが可能となる。
　さらに、変異型Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端あるいはＣ末端に転写制御因子タンパク質又はドメインを連結することができる。転写制御因子又はそのドメインとしては、転写活性化因子又はそのドメイン（例、ＶＰ６４、ＮＦ－κＢ ｐ６５）及び転写サイレンサー又はそのドメイン（例、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１））又は転写抑制因子又はそのドメイン（例、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ））が挙げられる。
　ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素（例、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ＴＥＴ）やヒストンサブユニットを修飾する酵素（例、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ）を連結することもできる。
＜遺伝子治療＞
　一実施形態において、本発明は、ゲノム編集を実行し、遺伝子を治療するための方法及び組成物を提供する。以前に知られている標的化された遺伝子組換えの方法と対照的に、本実施形態の方法は、実行が、効率的かつ安価であり、そして任意の細胞または生物に適応可能である。細胞又は生物の二本鎖核酸の任意のセグメントは、本実施形態の遺伝子治療方法により改変することができる。本実施形態の遺伝子治療方法は、全ての細胞に内在性である相同組換えプロセス及び非相同組換えプロセスの両方を利用する。 
　本明細書において、「ゲノム編集」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムやＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）等の技術により標的化された遺伝子組換えまたは標的化された変異を実行することにより、特異的な遺伝子破壊やレポーター遺伝子のノックイン等を行う新しい遺伝子改変技術を意味する。
　また、一実施形態において、本発明は、標的化されたＤＮＡ挿入又は標的化されたＤＮＡ欠失を行う遺伝子治療方法を提供する。この遺伝子治療方法は、ドナーＤＮＡを含む核酸構築物を用いて、細胞を形質転換する工程を包含する。標的遺伝子切断後のＤＮＡ挿入およびＤＮＡ欠失に関するスキームについては、公知の方法に従って当業者が決定できる。 
　また、一実施形態において、本発明は、体細胞及び生殖細胞の両方で利用され、特定の遺伝子座で遺伝子操作を行う遺伝子治療方法を提供する。 
　また、一実施形態において、本発明は、体細胞において遺伝子を壊すための遺伝子治療方法を提供する。ここで、遺伝子は、細胞又は生物に対して有害な産物を過剰発現し、細胞又は生物に対して有害な産物を発現する。このような遺伝子は、疾患において生じる１つ以上の細胞型において過剰発現され得る。本実施形態の遺伝子治療方法による、前記過剰発現した遺伝子の破壊は、前記過剰発現した遺伝子に起因する疾患を被る個体に、より良い健康をもたらすることができる。すなわち、細胞のほんの小さな割合の遺伝子の破壊が働き、発現レベルを減少し、治療効果を生じさせる。 
　また、一実施形態において、本発明は、生殖細胞において遺伝子を壊すための遺伝子治療方法を提供する。特定の遺伝子が破壊された細胞は、特定の遺伝子の機能を有さない生物を作製するために活用することができる。前記遺伝子が破壊された細胞において、遺伝子は完全にノックアウトさせることができる。この特定の細胞における機能の欠損は、治療効果を有し得る。 
　また、一実施形態において、本発明は、遺伝子産物をコードするドナーＤＮＡを挿入する遺伝子治療方法を提供する。この遺伝子産物は、構成的に発現された場合、治療効果を有する。例えば、膵細胞の個体群において、活性プロモーター及びインシュリン遺伝子をコードするドナーＤＮＡの挿入を引き起こすために、前記ドナーＤＮＡを、糖尿病を被る個体に挿入する方法が挙げられる。次いで、前記ドナーＤＮＡを含む膵細胞の前記個体群は、インシュリンを生成し、糖尿病患者を治療することができる。さらに、前記ドナーＤＮＡは作物に挿入され、薬剤的関連遺伝子産物を生成させることができる。タンパク質産物の遺伝子（例えば、インシュリン、リパーゼまたはヘモグロビン）は、制御エレメント（構成的活性プロモーター、または誘導性プロモーター）と一緒に植物に挿入され、植物中で大量の医薬品を生成することができる。次いで、このようなタンパク質産物は、植物から単離することができる。
　トランスジェニック植物又はトランスジェニック動物は、核酸移入技術（ＭｃＣｒｅａｔｈ，Ｋ．Ｊ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ　４０５：１０６６－１０６９；Ｐｏｌｅｊａｅｖａ，Ｉ．Ａ．ら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ　４０７：８６－９０）を用いる方法で作製することができる。組織型特異的ベクター又は細胞型特異的ベクターは、選択した細胞内でのみ遺伝子発現を提供するために利用することができる。 
　また、上記の方法を生殖細胞に用いた場合、標的遺伝子にドナーＤＮＡを挿入させて、後の全ての細胞分裂により、設計された遺伝的変更を有する細胞を生成することができる。 
　本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象としては、例えば、任意の生物、培養細胞、培養組織、培養核（培養細胞、培養組織、又は培養核インタクトには、生物を再生するために使用可能な細胞、組織又は核を含む）、配偶子（例えば、発達の様々な段階の卵又は精子）等が挙げられ、これらに限定されない。
　本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象となる細胞の由来としては、任意の生物（昆虫、真菌、げっ歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、及び他の農業上重要な動物、並びに他の哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。
　さらに、本実施形態の遺伝子治療方法は、植物において使用することができる。本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象となる植物としては、特別な限定はなく、任意の様々な植物種（例えば、単子葉植物又は双子葉植物等）において適用することができる。 
　以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
１．野生型及び変異型ＣｊＣａｓ９の調製
（１）コンストラクトの設計
　遺伝子合成によりコドンが最適化された野生型あるいは変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子を、ｐＥＳＵＭＯ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込んだ。さらに、ＨｉｓタグとＣｊＣａｓ９遺伝子の間にＴＥＶ認識配列を付加した。完成したコンストラクトから発現するＣａｓ９のＮ末端には６残基のヒスチジンが連続し（Ｈｉｓタグ）、ＴＥＶプロテアーゼ認識サイトが付加される設計になっている。
　使用したＣｊＣａｓ９遺伝子の塩基配列は以下の通り。
・野生型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号１
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ａ９１１Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２７３１～２７３３位のＧＣＣをＣＧＴに変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｔ９１３Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２７３７～２７３９位のＡＣＧをＣＧＴに変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｉ９２０Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２７５８～２７６０位のＡＴＴをＣＧＴに変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ａ９１１Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２７３１～２７３３位のＧＣＣをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ｔ９１３Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２７３７～２７３９位のＡＣＧをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ｉ９２０Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２７５８～２７６０位のＡＴＴをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｓ８０１Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２４０１～２４０３位のＴＣＴをＣＧＴに変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｓ８０１Ｈ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２４０１～２４０３位のＴＣＴをＣＡＴに変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｔ８０２Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２４０４～２４０６位のＴＡＣをＣＧＴに変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｎ８２７Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２４７９～２４８１位のＡＡＣをＣＧＴに変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｋ８６９Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２６０５～２６０７位のＡＡＡをＣＧＴに変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ｓ８０１Ｈ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２４０１～２４０３位のＴＣＴをＣＡＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ｓ８０１Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２４０１～２４０３位のＴＣＴをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ｔ８０２Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２４０４～２４０６位のＴＡＣをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ｎ８２７Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２４７９～２４８１位のＡＡＣをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ｋ８６９Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２６０５～２６０７位のＡＡＡをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ａ９１１Ｒ／Ｔ９１３Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２７３１～２７３３位のＧＣＣをＣＧＴに、２７３７～２７３９位のＡＣＧをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ａ９１１Ｒ／Ｉ９２０Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２７３１～２７３３位のＧＣＣをＣＧＴに、２７５８～２７６０位のＡＴＴをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ａ９１１Ｒ／Ｓ８０１Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２７３１～２７３３位のＧＣＣをＣＧＴに、２４０１～２４０３位のＴＣＴをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ａ９１１Ｒ／Ｓ８０１Ｈ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２７３１～２７３３位のＧＣＣをＣＧＴに、２４０１～２４０３位のＴＣＴをＣＡＴにそれぞれ変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｋ８１６Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２４４６～２４４８位のＡＡＧをＣＧＴに変換した配列
・変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ／Ｋ８１６Ｒ）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＴに、２４４６～２４４８位のＡＡＧをＣＧＴにそれぞれ変換した配列
・ｄＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｄ８Ａ＋Ｎ５５９Ａ）：配列番号１の塩基配列において２２～２４のＧＡＣをＧＣＧに、１６７５～１６７７のＣＡＣをＧＣＣに変換した配列
・変異型ｄＣｊＣａｓ９遺伝子（Ｅ９４６Ｒ＋Ｄ８Ａ＋Ｎ５５９Ａ）：配列番号１の塩基配列において２８３６～２８３８位のＧＡＧをＣＧＣに、２２～２４のＧＡＣをＧＣＧに、１６７５～１６７７のＣＡＣをＧＣＣに変換した配列
　作成したベクターを大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株へ形質転換した。その後、２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地培養した。ＯＤ＝０．８になるまで培養した時点で、発現誘導剤としてイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）（終濃度０．５ ｍＭ）を添加し、２０℃で２０時間培養した。培養後、大腸菌を遠心（８，０００ｇ、１０分）により回収した。 
（２）野生型及び変異型ＣｊＣａｓ９の精製
　（１）で回収した菌体を緩衝液Ａで懸濁し、超音波破砕した。遠心（２５，０００ｇ，３０分）により上清を回収し、緩衝液Ａで平衡化したＮｉ－ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂 （ＱＩＡＧＥＮ）と混合し、１時間穏やかに転倒混和した。素通り画分を回収した後、４カラム容量の緩衝液Ａ、さらに３カラム容量の高塩濃度緩衝液Ｂで洗浄を行った。その後、再度２カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した後、５カラム容量の高イミダゾール濃度緩衝液Ｃで目的タンパク質を溶出した。
　次いで、粗精製したサンプルをＨｉＴｒａｐＨｅｐａｒｉｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にチャージした。次いで、５カラム容量分の緩衝液Ｄ（０Ｍ　ＮａＣｌ）９２．５％及び緩衝液Ｅ（２Ｍ　ＮａＣｌ）７．５％の混合溶液で洗浄を行った後、緩衝液Ｅを１５％から１００％へ（ＮａＣｌ濃度は３００ｍＭから１Ｍへ）直線勾配をかけて目的タンパク質を溶出した。
　溶出タンパク質にＴＥＶプロテアーゼを添加し、緩衝液Ａで一晩透析しながら４℃でＴＥＶプロテアーゼ認識サイトを切断した。切断処理後、緩衝液Ａで平衡化したＮｉ－ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）と混合し、素通り画分を回収した。この操作によりＨｉｓタグおよびＴＥＶプロテアーゼを分離した。その後２カラム容量のバッファーＡにて洗浄を行った。洗浄画分を分取し、素通り画分と混合してサンプル溶液とした。
　次いで、緩衝液Ｆで平衡化したゲルろ過カラムを用いて、ゲルろ過クロマトグラフィーを行い、目的タンパク質画分を分取した。
　緩衝液Ａ～Ｅの組成を以下に示す。
緩衝液Ａ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole
緩衝液Ｂ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl, 20 mM imidazole
緩衝液Ｃ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole
緩衝液Ｄ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0
緩衝液Ｅ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2000 mM NaCl
緩衝液Ｆ：10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl
２．ガイドＲＮＡの調製
　目的のガイドＲＮＡ配列（ggaaattaggtgcgcttggcgttttagtccctgaaaagggactaaaataaagagtttgcgggactctgcggggttacaatcccctaaaaccgctt;配列番号３）が挿入されたベクターの作製を行った。下線部が２０塩基のガイド配列を示し、残りがscaffoldの部分に相当する。ガイドＲＮＡ配列の上流にＴ７プロモーター配列を付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクター（ＴａＫａＲａ）に組み込んだ。作製したベクターを元に、ＰＣＲを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型ＤＮＡを作製した。この鋳型ＤＮＡを用いて、３７℃、４時間、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写産物を含む反応液に等量のフェノールクロロホルムを加えて混合した後、２０℃にて遠心（１０，０００ｇ、２分）し、上清を回収した。上清に１／１０量の３Ｍ　酢酸ナトリウムおよび２．５倍量の１００％エタノールを添加し、４℃にて遠心（１０，０００ｇ、３分）し、転写産物を沈殿させた。上清を廃棄して７０％エタノールを添加し、４℃にて遠心（１０，０００ｇ、３分）し再び上清を廃棄した。沈殿を風乾後、ＴＢＥ緩衝液に再懸濁し、７Ｍ　Ｕｒｅａ変性１０％ＰＡＧＥにより精製した。目的ＲＮＡの分子量に位置するバンドを切り出し、Ｅｌｕｔｒａｐ電気溶出システム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＲＮＡを抽出した。その後、抽出したＲＮＡをＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、緩衝液を緩衝液Ｈ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に交換した。
３．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
　ＤＮＡ切断活性測定試験に用いるために、標的ＤＮＡ配列およびＰＡＭ配列が挿入されたベクターの作製を行った。標的ＤＮＡ配列に各ＰＡＭ配列をそれぞれ付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクターに組み込んだ。標的配列およびＰＡＭ配列１及び２を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　作製したベクターを用いて、大腸菌Ｍａｃｈ１株（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換し、２０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃にて培養した。
　培養後、菌体を遠心（８，０００ｇ、１分）により回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
　精製したＰＡＭ配列が付加した標的プラスミドＤＮＡを用いて切断実験を行った。プラスミドＤＮＡは、制限酵素により１本に線状化した。この線状化ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列を野生型、又は変異型のＣｊＣａｓ９が切断すると、約１，０００ｂｐと約２，０００ｂｐの切断産物ができる。切断の際のバッファーとしては下記の組成のcleavage buffer Ｂを用いた。
cleavage buffer Ｂ(×１０）の組成
　200 mM HEPES 7.5
　1000 mM KCl
　50% glycerol
　10 mM DTT
　5 mM EDTA
　20 mM MgCl2
　反応後のサンプルについて、１％濃度のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、切断産物のバンドを確認した。結果を図１に示す。図中、「ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」とは基質を示し、「ｐｒｏｄｕｃｔ」とは切断産物を示す。ＰＡＭ配列及び反応条件を図中に示す。
　野生型ＣｊＣａｓ９では、標的プラスミドＤＮＡに対し制限された切断活性を有することに対し、変異型ＣｊＣａｓ９では、標的プラスミドＤＮＡに対する切断活性の制限が改善されることが確かめられた。
　以上から、変異型のＣｊＣａｓ９では切断効率性が向上しており、迅速に標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断を行えることが明らかとなった。 
実施例２
１．真核細胞におけるターゲット遺伝子転写抑制（ＧＮＤＭｉ）アッセイ
（１）コンストラクトの設計
　遺伝子合成によりコドンが最適化された野生型あるいは変異型ＣｊＣａｓ９遺伝子を、ＣＰ－ＬｖＣ９ＮＵ－０９　ｖｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｏｃｏｐｉａ）のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩサイトに組み込んだ。変異型ＣｊＣａｓ９に転写抑制因子であるＫＲＡＢが連結するよう設計した遺伝子を同様にベクターに組み込んだ。またｐＣＲＩＳＰＲ－ＬｖＳＧ０３（Ｇｅｎｏｃｏｐｉａ）ベクターのＢｓｍＢ１サイトに表２に示されるガイドＲＮＡ配列をそれぞれ組み込んでガイドＲＮＡ発現プラスミドとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）ＨＥＫ細胞での発現
　作成した３種類のＣｊＣａｓ９発現ベクター（ＣＰ－ＬｖｄＣｊＣａｓ９－０９プラスミド、ＣＰ－ＬｖｄＣｊＣａｓ９－ＫＲＡＢ－０９プラスミド又はＣＰ－ＬｖｄＣｊＣａｓ９（Ｅ９４６Ｒ）－ＫＲＡＢ－０９）２５０ｎｇとガイドＲＮＡ発現プラスミド（ｐＣＲＩＳＰＲ－ＬｖＳＧ０３　ｓｇＲＮＡ（Ｊ１－Ｊ３））を２４ウェルプレートにてＨＥＫ株へ形質転換した。１日培養後、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを培地に添加し、３日目にトータルＲＮＡをＱｉａｇｅｎ　Ｒｎｅａｓｙ　ｋｉｔにて抽出した。
（３）転写抑制アッセイ
　ＭＹＤ８８遺伝子を例として用い、遺伝子の発現抑制効果の検証をＱＰＣＲ法で行った。その際に発現の規格化にはＨＰＲＴ遺伝子の発現を用いた。
　結果を図２に示す。
　本発明によれば、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を向上し、さらにエンドヌクレアーゼ活性を向上した、変異型ＣｊＣａｓ９タンパク質を得ることができる。また、前記Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性欠失変異を導入し、遺伝子制御タンパクと連結して利用した場合には簡便且つ迅速で標的遺伝子の発現を制御する効果を提供することができる。
　本出願は、米国で出願された米国仮特許出願第６２／５３９，８０４号（出願日：２０１７年８月１日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (27)

  1. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
    ９１１位、９２０位及び９４６位からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位に変異を有するアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
  2. 　９１１位、９２０位及び９４６位からなる群より選ばれる少なくとも２つの部位に変異を有する、請求項１記載のタンパク質。
  3. 　９１１位、９２０位及び９４６位全ての部位に変異を有する、請求項１記載のタンパク質。
  4. 　９１１位の変異が、アラニンのアルギニンへの置換であり；
    　９２０位の変異が、イソロイシンのアルギニンへの置換であり；
    　９４６位の変異が、グルタミン酸のアルギニン、グリシン、システイン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、バリン、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換である；
    請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. 　９４６位の変異が、グルタミン酸のアルギニンへの置換である、請求項４記載のタンパク質。
  6. 　さらに、８０１位及び／又は８６９位の変異を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  7. 　８０１位の変異が、セリンのアルギニン又はヒスチジンへの置換であり；
    　８６９位の変異が、リジンのアルギニンへの置換である
    請求項６に記載のタンパク質。
  8. 　８０１位の変異が、セリンのアルギニンへの置換である、請求項７記載のタンパク質。
  9. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
    ９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、
    ９１１位のアラニンがアルギニンに置換するか、８０１位のセリンがアルギニン又はヒスチジンに置換するか、８６９位のリジンがアルギニンに置換しているアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
  10. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
    ９４６位のグルタミン酸がアルギニンに置換し、
    ９１１位のアラニンがアルギニンに置換し、
    ９２０位のイソロイシンがアルギニンに置換している
    アミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
  11. 　配列番号２の変異が施された位置以外の部位において８０％以上の同一性を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
  12. 　配列番号２の変異が施された位置以外の部位において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加された、請求項１～１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
  13. 　ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１～１２のいずれか1項に記載のタンパク質。
  14. 　さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、８位、５５９位及び／又は５８２位に変異を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  15. 　８位の変異がアスパラギン酸のアラニンへの置換であり；５５９位の変異がヒスチジンのアラニンへの置換であり；５８２位の変異がアスパラギンのアラニンへの置換である、請求項１４に記載のタンパク質。
  16. 　転写制御因子タンパク質又はドメインを連結した、請求項１４又は１５記載のタンパク質。
  17. 　転写制御因子が転写活性化因子 である、請求項１６記載のタンパク質。
  18. 　転写制御因子が転写サイレンサー 又は転写抑制因子 である、請求項１６記載のタンパク質。
  19. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
  20. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載のタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Proto-spacer Adjacent Motif）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質－ＲＮＡ複合体。
  21. 　標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
    　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、
    　前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
    　前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＮＧＮＮＮ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有し、
    　前記タンパク質は、請求項１～１８のいずれか１項に記載のタンパク質であり、
    　前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。
  22. 　改変が、標的二本鎖ポリヌクレオチドの部位特異的な切断である、請求項２１記載の方法。
  23. 　改変が、標的二本鎖ポリヌクレオチドにおける部位特異的な、１以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加である、請求項２１記載の方法。
  24. 　細胞の標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記細胞内で請求項１７に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
  25. 　細胞の標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、前記細胞内で請求項１８に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
  26. 　細胞が真核細胞である、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 　細胞が酵母細胞、植物細胞又は動物細胞である、請求項２４又は２５に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019194320A1 (ja) * 2018-04-06 2019-10-10 国立大学法人東京大学 エンジニアリングされたＢｌＣａｓ９ヌクレアーゼ

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016021973A1 (ko) * 2014-08-06 2016-02-11 주식회사 툴젠 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정
JP2018143208A (ja) * 2017-03-08 2018-09-20 国立大学法人 東京大学 標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016021973A1 (ko) * 2014-08-06 2016-02-11 주식회사 툴젠 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정
JP2018143208A (ja) * 2017-03-08 2018-09-20 国立大学法人 東京大学 標的二本鎖ポリヌクレオチドへの塩基置換の導入方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GenBank [O] 4 March 2015 (2015-03-04), "Campylobacter jejuni subsp. jejuni strain C12-5524 contig019, whole genome shotgunsequence", XP055573079, Database accession no. JYDZ01000019 *
DATABASE Nucleotide [O] 12 January 2010 (2010-01-12), "Campylobacter jejuni subsp. jejuni 414 contig00002, whole genome shotgun sequence", XP055573088, retrieved from NCBI Database accession no. ADGM01000002 *
DATABASE UniprotKB/TrEMBL [o] 27 May 2015 (2015-05-27), ANONYMOUS: "CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1", XP055575337, retrieved from Uniprot Database accession no. AOAOD7V4T2 *
DATABASE UniprotKB/TrEMBL [o] 5 July 2017 (2017-07-05), ANONYMOUS: "CRISPR-associated endonuclease Cas9", XP055575341, retrieved from Uniprot Database accession no. D2MWB9 *
SPENCER, JM. ET AL.: "Characterizing the Mutational Limits of S. pyogenes Cas9", MOL. THER., vol. 25, no. 5, May 2017 (2017-05-01) *
YAMADA, M. ET AL.: "Crystal Structure of the Minimal Cas9 from Campylobacter jejuni Reveals the Molecular Diversity in the CRISPR-Cas9 Systems", MOL. CELL, vol. 65, no. 6, March 2017 (2017-03-01), pages 1109 - 1121, XP029959270 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019194320A1 (ja) * 2018-04-06 2019-10-10 国立大学法人東京大学 エンジニアリングされたＢｌＣａｓ９ヌクレアーゼ

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