JPWO2019194320A1 - エンジニアリングされたBlCas9ヌクレアーゼ - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
Description
[1]以下の(a)〜(f)のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドRNAと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列、
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号100位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号100位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列、
(e)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1022位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(f)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1022位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(g)配列番号13で表されるアミノ酸配列、
(h)配列番号13で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1025位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(i)配列番号13で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1025位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(j)配列番号5で表されるアミノ酸配列において、以下の(1)及び/又は(2)の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
(1)アミノ酸番号52位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、55位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、843位のSerの、Asn、Gln、又はTyrへの置換、997位のLysの、Arg又はHisへの置換、1040位のLysの、Arg又はHisへの置換、959位のLysのAlaへの置換、992位のLysのAlaへの置換、及び904位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
(2)アミノ酸番号72位のHisの、Lys若しくはArgへの置換、93位のGlnの、Lys、Arg、又はHisへの置換、95位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、175位のHisの、Lys、又はArgへの置換、811位のThrの、Lys、Arg、又はHisへの置換、1075位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、及び1076位のAspの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
(k)(j)のアミノ酸配列の、前記(1)及び(2)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(l)(j)のアミノ酸配列の、前記(1)及び(2)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(m)配列番号5で表されるアミノ酸配列において、以下の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
・アミノ酸番号1022位のAspの、Asn、Gln、又はHisへの置換、
・アミノ酸番号1025位のThrのAlaへの置換、
・アミノ酸番号52位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、55位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、843位のSerの、Asn、Gln、又はTyrへの置換、997位のLysの、Arg又はHisへの置換、1040位のLysの、Arg又はHisへの置換、959位のLysのAlaへの置換、992位のLysのAlaへの置換、及び904位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
・アミノ酸番号72位のHisの、Lys若しくはArgへの置換、93位のGlnの、Lys、Arg、又はHisへの置換、95位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、175位のHisの、Lys、又はArgへの置換、811位のThrの、Lys、Arg、又はHisへの置換、1075位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、及び1076位のAspの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
(n)(m)のアミノ酸配列の、(m)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(o)(m)のアミノ酸配列の、(m)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
・アミノ酸番号55位のSerのLysへの置換、アミノ酸番号904位のGluのArgへの置換、及びアミノ酸番号1022位のAspのAsnへの置換、
・アミノ酸番号55位のSerのLysへの置換、アミノ酸番号904位のGluのArgへの置換、アミノ酸番号1025位のThrのAlaへの置換、
・アミノ酸番号55位のSerのLysへの置換、アミノ酸番号904位のGluのArgへの置換、アミノ酸番号1022位のAspのAsnへの置換、及びアミノ酸番号1025位のThrのAlaへの置換
(3)アミノ酸番号8位のAspのAlaへの置換、503位のGluのAlaへの置換、584位のHisのAlaへの置換、598位のAsnのAlaへの置換、607位のAsnのAlaへの置換、及び725位のAspのAlaへの置換から選択される少なくとも一つの置換
(p)配列番号3又は4で表される塩基配列、
(q)配列番号3又は4で表される塩基配列において、1〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
(r)配列番号3又は4で表される塩基配列と同一性が80%以上である塩基配列、
(s)配列番号3又は4で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
(t)配列番号14で表される塩基配列、
(u)配列番号14で表される塩基配列において、1〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
(v)配列番号14で表される塩基配列と同一性が80%以上である塩基配列、
(w)配列番号14で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドRNAとを含む組成物。
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、[1]〜[8]のいずれか一つに記載のタンパク質と、ガイドRNAとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出することを特徴とする、方法。
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、[1]〜[8]のいずれか一つに記載のタンパク質と、ガイドRNAとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の3塩基上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出し、
前記ガイドRNAと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法。
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、[9]に記載のタンパク質と、ガイドRNAとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記ガイドRNAを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、ここで、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断し、
前記ガイドRNAと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法。
前記遺伝子に関連する標的二本鎖ポリヌクレオチドと、[9]に記載のタンパク質と、ガイドRNAと、エフェクター分子とを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記ガイドRNAを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、それにより前記エフェクター分子が前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって前記遺伝子の発現を調節することを特徴とする、方法。
一実施形態において、本発明は、以下の(a)〜(f)のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドRNAと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質を提供する。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列、
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号100位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号100位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列、
(e)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1022位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(f)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1022位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号100位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号100位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(e)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1022位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(f)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1022位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
一実施形態において、本発明は、以下の(g)〜(i)のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドRNAと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質を提供する。
(g)配列番号13で表されるアミノ酸配列、
(h)配列番号13で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1025位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(i)配列番号13で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1025位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(g)配列番号13で表されるアミノ酸配列
(h)配列番号13で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1025位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(i)配列番号13で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1025位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(1)アミノ酸番号52位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、55位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、843位のSerの、Asn、Gln、又はTyrへの置換、997位のLysの、Arg又はHisへの置換、1040位のLysの、Arg又はHisへの置換、959位のLysのAlaへの置換、992位のLysのAlaへの置換、及び904位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換
・E52R
・E52K
・S55K
・S844N
・K997R
・E52R及びS843N
・E52R及びK997R
・E52R及びK1040R
・E52K及びS844N
・E52K及びK997R
・E52K及びK1040R
・S55K及びK997R
・S55K及びK1040R
・S55K、E52R、及びK997R
・S55K、E52K、及びK997R
・E52R、S843N、及びK997R
・E52K、S843N、及びK997R
・K959A
・K992A
・K959A/K992A
・T1025A
・E904R
・S55K/E904R
一実施形態において、本発明は、BlCas9タンパク質の全長アミノ酸配列において、以下の(2)の置換を少なくとも一つ含むことを特徴とする、タンパク質を提供する。
(2)アミノ酸番号72位のHisの、Lys若しくはArgへの置換、93位のGlnの、Lys、Arg、又はHisへの置換、95位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、175位のHisの、Lys、又はArgへの置換、811位のThrの、Lys、Arg、又はHisへの置換、1075位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、及び1076位のAspの、Lys、Arg、又はHisへの置換
(j)配列番号5で表されるアミノ酸配列において、以下の(1)及び/又は(2)の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
(1)アミノ酸番号52位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、55位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、843位のSerの、Asn、Gln、又はTyrへの置換、997位のLysの、Arg又はHisへの置換、1040位のLysの、Arg又はHisへの置換、959位のLysのAlaへの置換、992位のLysのAlaへの置換、及び904位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
(2)アミノ酸番号72位のHisの、Lys若しくはArgへの置換、93位のGlnの、Lys、Arg、又はHisへの置換、95位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、175位のHisの、Lys、又はArgへの置換、811位のThrの、Lys、Arg、又はHisへの置換、1075位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、及び1076位のAspの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
(k)(j)のアミノ酸配列の、前記(1)及び(2)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(l)(j)のアミノ酸配列の、前記(1)及び(2)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(m)配列番号5で表されるアミノ酸配列において、以下の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
・アミノ酸番号1022位のAspの、Asn、Gln、又はHisへの置換、
・アミノ酸番号1025位のThrのAlaへの置換、
・アミノ酸番号52位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、55位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、843位のSerの、Asn、Gln、又はTyrへの置換、997位のLysの、Arg又はHisへの置換、1040位のLysの、Arg又はHisへの置換、959位のLysのAlaへの置換、992位のLysのAlaへの置換、及び904位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
・アミノ酸番号72位のHisの、Lys若しくはArgへの置換、93位のGlnの、Lys、Arg、又はHisへの置換、95位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、175位のHisの、Lys、又はArgへの置換、811位のThrの、Lys、Arg、又はHisへの置換、1075位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、及び1076位のAspの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
(n)(m)のアミノ酸配列の、(m)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(o)(m)のアミノ酸配列の、(m)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
・S55K/E904R/D1022N:この変異の組合せを含むCas9タンパク質は、「5’−NNNNDNDD−3’」というPAM配列を認識することができる。
・S55K/E904R/T1025A:この変異の組合せを含むCas9タンパク質は、「5’−NNNNCNNN−3’」というPAM配列を認識することができる。
・S55K/E904R/D1022N/T1025A:この変異の組合せを含むCas9タンパク質は、「5’−NNNNNNDD−3’」というPAM配列を認識することができる。
一実施形態において、本発明の改変されたBlCas9タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を維持している。本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の内部、すなわち末端でない部分を切断する酵素を意味する。したがって、前記実施形態において、本発明の改変されたBlCas9タンパク質は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断することができる。
(3)アミノ酸番号8位のAspのAlaへの置換、503位のGluのAlaへの置換、584位のHisのAlaへの置換、598位のAsnのAlaへの置換、607位のAsnのAlaへの置換、及び725位のAspのAlaへの置換から選択される少なくとも一つの置換
を含んでいてもよい。
一実施形態において、本発明は、上記[1]〜[9]のいずれか一つに記載のタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
(p)配列番号3又は4で表される塩基配列、
(q)配列番号3又は4で表される塩基配列において、1〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
(r)配列番号3又は4で表される塩基配列と同一性が80%以上である塩基配列、
(s)配列番号3又は4で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
(t)配列番号14で表される塩基配列、
(u)配列番号14で表される塩基配列において、1〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
(v)配列番号14で表される塩基配列と同一性が80%以上である塩基配列、
(w)配列番号14で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
一実施形態において、本発明は、上述の改変されたBlCas9タンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子と、
標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドRNAとを含む組成物を提供する。
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明のCasタンパク質と、ガイドRNAとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出することを特徴とする、方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明のCasタンパク質と、ガイドRNAとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出し、
前記ガイドRNAと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明のCasタンパク質と、ガイドRNAとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記ガイドRNAを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、ここで、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断し、
前記ガイドRNAと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、遺伝子の発現を調節するための方法であって、
前記遺伝子に関連する標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明のCasタンパク質と、ガイドRNAと、エフェクター分子とを接触させる工程を含み、
前記Casタンパク質が、前記ガイドRNAを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、それにより前記エフェクター分子が前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって前記遺伝子の発現を調節することを特徴とする、方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、上述のタンパク質又は組成物を用いて、ゲノム編集を実行するための方法を提供する。以前に知られている標的化された遺伝子組換えの方法と対照的に、本発明は、効率的かつ安価に行うことができ、また任意の細胞又は生物に適応可能である。細胞又は生物の二本鎖核酸の任意のセグメントは、本発明の方法により改変され得る。この方法は、全ての細胞に内在性である相同組換えプロセス及び非相同組換えプロセスの両方を利用する。
1.野生型及び変異型BlCas9の調製
(1)コンストラクトの設計
野生型BlCas9、及び、PAM配列における5番目の塩基の認識をCからD(A、G、T)に変更するD1022N変異を有する改変BlCas9をそれぞれコードするBlcas9遺伝子(野生型Blcas9の塩基配列:配列番号7、D1022N変異型Blcas9の塩基配列:配列番号8)をそれぞれ、pE−SUMO vector(LifeSensors)に組み込んだ。さらに、SUMOタグとBlcas9遺伝子の間にTEV認識配列を付加した。完成したコンストラクトから発現するCas9のN末端には6残基のヒスチジンが連続し(Hisタグ)、続いてSUMOタグ、TEVプロテアーゼ認識サイトが付加される設計になっている。
作製したベクターを大腸菌Escherichia coli rosetta2 (DE3)株へ形質転換した。その後、20μg/mlカナマイシン及び20μg/mlクロラムフェニコールを含むLB培地培養した。OD=0.8になるまで培養した時点で、発現誘導剤としてイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(Isopropyl β−D−1−thiogalactopyranoside;IPTG)(終濃度1mM)を添加し、20℃で18時間培養した。培養後、大腸菌を遠心分離(5,000 g、10分間)により回収した。
(2)で回収した菌体を緩衝液Aで懸濁し、超音波破砕した。遠心(40,000g、30分間)により上清を回収し、緩衝液Aで平衡化したNi−NTA Superflow樹脂(QIAGEN)と混合し、1時間穏やかに転倒混和した。素通り画分を回収した後、5カラム容量の緩衝液A、さらに5カラム容量の高塩濃度緩衝液Bで洗浄を行った。
目的のガイドRNA配列(配列番号9)が挿入された鋳型DNA作製を行った。ガイドRNA配列の上流にT7プロモーター配列を付加したプライマーを用意し、PCRを用いてプライマー同士をアニールさせて伸長反応を起こしてin vitro転写反応の鋳型DNAを作製した。この鋳型DNAを用いて、37℃、4時間、T7 RNAポリメラーゼによるin vitro転写反応を行った。転写産物を含む反応液に1/10量の3M
酢酸ナトリウム及び2.5倍量の100%エタノールを添加し、4℃にて遠心(8,000g、3分)し、転写産物を沈殿させた。上清を廃棄して70%エタノールを添加し、4℃にて遠心(8,000g、3分)し再び上清を廃棄した。沈殿を風乾後、TBE緩衝液に再懸濁し、7M Urea変性10%PAGEにより精製した。目的RNAの分子量に位置するバンドを切り出し、Elutrap電気溶出システム(GE Healthcare)によりRNAを抽出した。その後、抽出したRNAをPD−10カラム(GE Healthcare)に通し、緩衝液を緩衝液H(10 mM Tris−HCl(pH8.0)、150mM NaCl)に交換した。
DNA切断活性測定試験に用いるために、標的DNA配列及びPAM配列が挿入されたベクターの作製を行った。標的DNA配列にPAM配列1〜4をそれぞれ付加し、線状化したpUC119ベクターに組み込んだ。標的DNAの配列及びPAM配列1〜4を表2に示す。
1.変異型BlCas9の調製
実施例1と同様の方法により、PAM配列における5番目の塩基の認識をCからGに改変するD1022N/K1040E変異を有する改変BlCas9を調製した。
ガイドRNA、PAM配列、及び標的DNAは、実施例1と同一のものを用いた。反応溶液は、Cas9タンパク質の濃度を0.05pmol(50nM)にした以外は実施例1と同じ配合(表3)のものを用い、反応時間を10分間又は20分間とした。結果を図6に示す。
1.ガイドRNAの調製
標的塩基配列に相補的な部分の長さが異なる以外は同一の配列及び構造を有する3種類のガイドRNAを調製した。具体的には、標的DNA配列中のPAM配列の1塩基上流から20塩基まで(ガイドRNA(20bp):配列番号9)、1塩基上流から22塩基まで(ガイドRNA(22bp):配列番号11)、及び1塩基上流から24塩基まで(ガイドRNA(24bp):配列番号12)の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを5’末端領域に含むものである。
野生型BlCas9、PAM配列1、及び標的DNAは、実施例1と同一のものを用いた。反応溶液は実施例1と同じ配合(表3)のものを用い、反応時間は2分間又は5分間とした。結果を図7に示す。
1.変異型BlCas9の調製
実施例1と同様の方法により、以下の変異を有する各種改変BlCas9をそれぞれ調製した。
・E52R
・E52K
・S55K
・S844N
・K997R
・E52R及びS843N
・E52R及びK997R
・E52R及びK1040R
・E52K及びS844N
・E52K及びK997R
・E52K及びK1040R
・S55K及びK997R
・S55K及びK1040R
・S55K、E52R、及びK997R
・S55K、E52K、及びK997R
・E52R、S843N、及びK997R
・E52K、S843N、及びK997R
ガイドRNA、PAM配列1、及び標的DNAは、実施例1と同一のものを用いた。反応溶液は実施例1と同じ配合(表3)のものを用い、反応時間は30秒間、1分間、又は2分間とした。2分後の全改変BlCas9の結果を図8に示す。また、特に単変異体(変異を1箇所にのみ有する)について図9に、二重変異体(変異を2箇所に有する)について図10に、30秒後及び1分後における結果も併せて示す。
実施例4で使用したE52R/S843N変異型BlCas9について、PAM配列の8番目の塩基の嗜好性をさらに試験した。
標的DNA及びガイドRNAは、実施例1と同一のものを用いた。実施例1と同様に、標的DNA配列及びPAM配列が挿入されたベクターの作製を行った。使用したPAM配列を以下に示す。
1.変異型BlCas9の調製
実施例1と同様の方法により、実施例4で使用したE52R/S843N/K997R変異に加えて、PAM配列における7番目及び8番目の塩基の認識の嗜好性を緩和する以下の変異を有する各種改変BlCas9をそれぞれ調製した。
・K959A
・K992A
・K959A及びK992A
・T1025A
標的DNA及びガイドRNAは、実施例1と同一のものを用いた。実施例1と同様に、標的DNA配列及びPAM配列が挿入されたベクターの作製を行った。使用したPAM配列を以下に示す。
1.変異型BlCas9の調製
実施例1と同様の方法により、以下の変異を有する各種改変BlCas9をそれぞれ調製した:H72K、Q93K、E95K、H175K、T811K、S1075K、及びD1076K。
ガイドRNA、PAM配列1、及び標的DNAは、実施例1と同一のものを用いた。H72K、Q93K、E95K、及びT811Kについては、Cas9の濃度を0.05pmol(50nM)とし、それ以外は実施例1と同じ配合(表3)のものを用い、反応時間を1分間、2分間、又は10分間とした。H175K、S1075K、及びD1076Kについては、Cas9の濃度を0.02pmol(20nM)とした以外は実施例1と同じ配合(表3)のものを用い、反応時間は2分間、5分間、又は15分間とした。結果を図14及び図15に示す。
1.変異型BlCas9の調製
実施例1と同様の方法により、以下の変異の組合せを有する各種改変BlCas9をそれぞれ調製した。
・S55K/E904R/D1022N(KRN変異)
・S55K/E904R/T1025A(KRA変異)
・S55K/E904R/D1022N/T1025A(KRNA変異)
野生型BlCas9と、実施例1で作製したD1022N変異型BlCas9、並びに上記KRN変異及びKRNA変異の各変異型BlCas9とを用いて、プラスミドDNA切断活性試験を行い、PAM配列の5番目の塩基の認識を評価した。
野生型BlCas9と、実施例3で作製したT1025A変異型BlCas9、並びに上記KRA変異及びKRNA変異の各変異型BlCas9とを用いて、プラスミドDNA切断活性試験を行い、PAM配列の7番目及び8番目の塩基の認識を評価した。
実施例1〜8では、変異型BlCas9のDNA切断活性を、プラスミドDNAを用いたin vitro試験で確認した。本実施例では、変異型BlCas9が実際に哺乳動物細胞において(すなわちin vivoで)染色体ゲノムを編集することができることを確認した。
本実施例においては、ヒトコドン最適化(human codon optimize)したBlCas9を使用した。Cas9タンパク質のヒトコドン最適化は、当業者に周知の手法を用いて行うことができる。例えば、コドン最適化配列の例として国際公開第2014/093622号パンフレット(PCT/US2013/074667号明細書)のSaCas9ヒトコドン最適化配列を参照されたい。
Claims (17)
- 以下の(a)〜(f)のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドRNAと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列、
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号100位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号100位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列、
(e)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1022位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(f)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1022位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号100位がAsnである、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1022位がAsnであることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質。
- 以下の(g)〜(i)のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドRNAと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
(g)配列番号13で表されるアミノ酸配列、
(h)配列番号13で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1025位以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(i)配列番号13で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1025位以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 配列番号13で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1025位がAlaであることを特徴とする、請求項3に記載のタンパク質。
- 以下の(j)〜(l)のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドRNAと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
(j)配列番号5で表されるアミノ酸配列において、以下の(1)及び/又は(2)の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
(1)アミノ酸番号52位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、55位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、843位のSerの、Asn、Gln、又はTyrへの置換、997位のLysの、Arg又はHisへの置換、1040位のLysの、Arg又はHisへの置換、959位のLysのAlaへの置換、992位のLysのAlaへの置換、及び904位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
(2)アミノ酸番号72位のHisの、Lys若しくはArgへの置換、93位のGlnの、Lys、Arg、又はHisへの置換、95位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、175位のHisの、Lys、又はArgへの置換、811位のThrの、Lys、Arg、又はHisへの置換、1075位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、及び1076位のAspの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
(k)(j)のアミノ酸配列の、前記(1)及び(2)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(l)(j)のアミノ酸配列の、前記(1)及び(2)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 配列番号5で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号55位のSerのLysへの置換、及び/又はアミノ酸番号904位のGluのArgへの置換を含む、請求項5に記載のタンパク質。
- 以下の(m)〜(o)のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドRNAと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
(m)配列番号5で表されるアミノ酸配列において、以下の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
・アミノ酸番号1022位のAspの、Asn、Gln、又はHisへの置換、
・アミノ酸番号1025位のThrのAlaへの置換、
・アミノ酸番号52位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、55位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、843位のSerの、Asn、Gln、又はTyrへの置換、997位のLysの、Arg又はHisへの置換、1040位のLysの、Arg又はHisへの置換、959位のLysのAlaへの置換、992位のLysのAlaへの置換、及び904位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
・アミノ酸番号72位のHisの、Lys若しくはArgへの置換、93位のGlnの、Lys、Arg、又はHisへの置換、95位のGluの、Lys、Arg、又はHisへの置換、175位のHisの、Lys、又はArgへの置換、811位のThrの、Lys、Arg、又はHisへの置換、1075位のSerの、Lys、Arg、又はHisへの置換、及び1076位のAspの、Lys、Arg、又はHisへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
(n)(m)のアミノ酸配列の、(m)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、1〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(o)(m)のアミノ酸配列の、(m)に規定するアミノ酸番号以外の部位において、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 配列番号5で表されるアミノ酸配列において、以下の置換の組合せのいずれか一つを含む、請求項7に記載のタンパク質。
・アミノ酸番号55位のSerのLysへの置換、アミノ酸番号904位のGluのArgへの置換、及びアミノ酸番号1022位のAspのAsnへの置換、
・アミノ酸番号55位のSerのLysへの置換、アミノ酸番号904位のGluのArgへの置換、アミノ酸番号1025位のThrのAlaへの置換、
・アミノ酸番号55位のSerのLysへの置換、アミノ酸番号904位のGluのArgへの置換、アミノ酸番号1022位のAspのAsnへの置換、及びアミノ酸番号1025位のThrのAlaへの置換 - (d)〜(o)のいずれかにおいて、前記アミノ酸配列が、以下の(3)の置換を含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質。
(3)アミノ酸番号8位のAspのAlaへの置換、503位のGluのAlaへの置換、584位のHisのAlaへの置換、598位のAsnのAlaへの置換、607位のAsnのAlaへの置換、及び725位のAspのAlaへの置換から選択される少なくとも一つの置換 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の(p)〜(s)のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドRNAと複合体を形成することができるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
(p)配列番号3又は4で表される塩基配列、
(q)配列番号3又は4で表される塩基配列において、1〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
(r)配列番号3又は4で表される塩基配列と同一性が80%以上である塩基配列、
(s)配列番号3又は4で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列 - 以下の(t)〜(w)のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドRNAと複合体を形成することができるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
(t)配列番号14で表される塩基配列、
(u)配列番号14で表される塩基配列において、1〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
(v)配列番号14で表される塩基配列と同一性が80%以上である塩基配列、
(w)配列番号14で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項10〜12のいずれか一項に記載の遺伝子と、
標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドRNAとを含む組成物。 - 標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質と、ガイドRNAとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出することを特徴とする、方法。 - 標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質と、ガイドRNAとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出し、
前記ガイドRNAと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法。 - 標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項9に記載のタンパク質と、ガイドRNAとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記ガイドRNAを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、ここで、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断し、
前記ガイドRNAと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法。 - 遺伝子の発現を調節するための方法であって、
前記遺伝子に関連する標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項9に記載のタンパク質と、ガイドRNAと、エフェクター分子とを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記ガイドRNAを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、それにより前記エフェクター分子が前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって前記遺伝子の発現を調節することを特徴とする、方法。
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