WO2022045169A1 - エンジニアリングされたＣｊＣａｓ９タンパク質 - Google Patents

Abstract

以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質。　（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９００位のアスパラギン酸の、リジン、又はアルギニンへの置換を少なくとも含むアミノ酸配列　（ｂ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９００位以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列　（ｃ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９００位以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列

Description

エンジニアリングされたＣｊＣａｓ９タンパク質

　本発明は、エンジニアリングされたＣｊＣａｓ９タンパク質、及びその使用に関する。
　本願は、２０２０年８月２５日に、日本に出願された特願２０２０－１４１８２５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

　クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子と共に、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成することが知られている。ＣＲＩＳＰＲは、ファージ又はプラスミドＤＮＡに起因することが多く、大きさの類似するスペーサーと呼ばれる独特の可変ＤＮＡ配列が間に入った、２４～４８ｂｐの短い保存された反復配列からなる。また、リピート及びスペーサー配列の近傍には、Ｃａｓタンパク質ファミリーをコードする遺伝子群が存在する。

　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて、外来性のＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質ファミリーによって３０ｂｐ程度の断片に切断され、ＣＲＩＳＰＲに挿入される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ１及びＣａｓ２タンパク質は、外来性ＤＮＡのプロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ：ＰＡＭ）と呼ばれる塩基配列を認識して、その上流を切り取って、宿主のＣＲＩＳＰＲ配列に挿入し、これが細菌の免疫記憶となる。免疫記憶を含むＣＲＩＳＰＲ配列が転写されて生成したＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡと呼ぶ。）は、一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対合し、Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ９タンパク質に取り込まれる。Ｃａｓ９に取り込まれたｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡはＲＮＡａｓｅＩＩＩにより切断され、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡｓ：ｃｒＲＮＡｓ）となり、Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体はｃｒＲＮＡと相補的な外来侵入性ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断する酵素（ヌクレアーゼ）であるＣａｓ９タンパク質が、外来侵入性ＤＮＡを切断することよって、外から侵入したＤＮＡの機能を抑制及び排除する。

　Ｃａｓ９タンパク質は外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によってさまざまであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）では「ＮＧＧ」の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２種のＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」の５～６塩基をＰＡＭ配列として認識する (Ｎは任意の塩基を表す)。ＰＡＭ配列の上流の何ｂｐのところを切断するかも細菌種によって異なり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを含め多くのＣａｓ９オルソログはＰＡＭ配列の３塩基上流を切断する。

　近年、細菌でのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、ゲノム編集に応用する技術が盛んに開発されている。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合させて、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラ（以下、ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ：ｇＲＮＡ）と呼ぶ。）として発現させ、活用している。これによりヌクレアーゼ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ　ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＲＧＮ）を呼び込み、目的の部位でゲノムＤＮＡを切断する。

　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムには、ｔｙｐｅＩ、ＩＩ、ＩＩＩがあるが、ゲノム編集で用いるのはもっぱらｔｙｐｅＩＩ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであり、ｔｙｐｅＩＩではＲＧＮとしてＣａｓ９タンパク質が用いられている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質はＮＧＧという３つの塩基をＰＡＭ配列として認識するため、グアニンが２つ並んだ配列がありさえすればその上流を切断できる。

　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた方法は、目的のＤＮＡ配列に対応する配列を有する短いｇＲＮＡを合成するだけでよく、単一のタンパク質であるＣａｓ９タンパク質を用いてゲノム編集ができる。そのため、従来用いられていたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）やトランス活性化因子様作動体（ＴＡＬＥＮ）のようにＤＮＡ配列ごとに異なる大きなタンパク質を合成する必要がなく、簡便かつ迅速にゲノム編集を行うことができる。

　特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。

　特許文献２には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。さらに、特許文献２には、Ｃａｓ９タンパク質のＤ３１Ａ又はＮ８９１Ａ変異体が、一方のＤＮＡ鎖のみにニック（ｎｉｃｋ）を入れるＤＮＡ切断酵素であるニッカーゼとして機能することが開示されており、ＤＮＡ切断後の修復メカニズムで挿入欠失などの変異を起こしやすい非相同末端結合の発生率は少ないままで、野生型Ｃａｓ９タンパク質と同程度の相同組み換え効率を有することが示されている。

　非特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９を使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであって、２つのＣａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体と、該Ｄ１０Ａ変異体と複合体を形成する１対の標的特異的ガイドＲＮＡを利用するダブルニッカーゼシステムが開示されている。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体は、ガイドＲＮＡと相補するＤＮＡ鎖に１つだけニックを作る。一対のガイドＲＮＡの標的位置同士は約２０塩基程度ずれており、標的ＤＮＡの反対鎖に位置する標的配列のみを認識する。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体によって作られた２つのニックは、ＤＳＢ（ＤＮＡ二本鎖切断）を模倣する状態になり、一対のガイドＲＮＡを利用することで高レベルの効率を維持しつつ、Ｃａｓ９タンパク質媒介型遺伝子編集の特異性を改善できることが示されている。

　また、近年、医療応用等の観点から、より分子量の小さいＣａｓ９に注目が集まっている。非特許文献２には、現在判明している中で構成アミノ酸数が最小のＣａｓ９である、９８４アミノ酸残基からなるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）を、ｉｎ　ｖｉｖｏのゲノム編集に用いたことが開示されている。また、非特許文献３では、結晶構造解析を行いＣｊＣａｓ９の詳細な構造を明らかにしている。

国際公開第２０１４／０９３６６１号 特表２０１５－５１０７７８号公報

Ｒａｎ，　Ｆ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　２０１３．　Ｄｏｕｂｌｅ　ｎｉｃｋｉｎｇ　ｂｙ　ＲＮＡ―ｇｕｉｄｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｃａｓ９　ｆｏｒ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．　Ｃｅｌｌ　１５４：　１３８０－１３８９． Ｋｉｍ，　Ｅ．，　Ｋｏｏ，　Ｔ．，　Ｐａｒｋ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ａ　ｓｍａｌｌ　Ｃａｓ９　ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ．　Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　８，　１４５００　（２０１７）　ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４５００ Ｙａｍａｄａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｃａｓ９　ｆｒｏｍ　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　Ｒｅｖｅａｌｓ　ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９　Ｓｙｓｔｅｍｓ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ．　２０１７　Ｍａｒ　１６；６５（６）：１１０９－１１２１

　Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９タンパク質（ＣｊＣａｓ９）の認識可能なＰＡＭ配列は、非特許文献２においては「ＮＮＮＮＡＣＡＣ」又は「ＮＮＮＮＲＹＡＣ」であると報告されている。一方、非特許文献３においてより詳細な解析を行ったところ、ＰＡＭ配列の４番目の塩基が「Ｔ」の場合には切断活性が無く、４番目の「Ｎ」（任意の塩基）は、実際は「Ｖ」（Ｔ以外の塩基）であることが判明した。非特許文献３においては、ＣｊＣａｓ９のＰＡＭ配列は「ＮＮＮＶＲＹＭ」であると報告されている。いずれの報告からも、野生型ＣｊＣａｓ９には認識可能なＰＡＭ配列に制限があるため、編集可能な標的配列が制限されることが理解できる。
　また、ＣｊＣａｓ９には、ゲノム編集ツールとして汎用されているＳｐＣａｓ９と比較してゲノムの認識・切断活性が低いという問題点もあった。

　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を提供することを目的とする。

　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質。
　（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９００位のアスパラギン酸の、リジン、又はアルギニンへの置換を少なくとも含むアミノ酸配列
　（ｂ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９００位以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
　（ｃ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９００位以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９００位がリジンである、［１］に記載のタンパク質。
［３］更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５８位のロイシンが、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はイソロイシンである、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
［４］更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５８位のロイシンが、チロシンである、［１］～［３］のいずれか一つに記載のタンパク質。
［５］更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、少なくとも以下のいずれか一つの変異を含む、［１］～［４］のいずれか一つに記載のタンパク質。
　（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９１１位のアラニンが、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンである
　（ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンである
［６］ニッカーゼ活性を有する、［１］～［５］のいずれか一つに記載のタンパク質。
［７］［１］～［６］のいずれか一つに記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
［８］［７］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［９］［１］～［６］のいずれか一つに記載のタンパク質、［７］に記載のポリヌクレオチド、又は［８］に記載のベクターと、ガイドＲＮＡと、を含む、組成物。
［１０］［９］に記載の組成物を用いる、単離された細胞中のゲノム編集方法。
［１１］単離された細胞中の標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、［１］～［５］のいずれか一つに記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
　前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出し、
　前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する、方法。
［１２］単離された細胞中の標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、［１］～［５］のいずれか一つに記載のタンパク質と核酸塩基変換酵素との複合体と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
　前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、ここで、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断し、
　前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する、方法。
［１３］単離された細胞中の遺伝子の発現を調節するための方法であって、
　前記遺伝子に関連する標的二本鎖ポリヌクレオチドと、［１］～［５］のいずれか一つに記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡと、エフェクター分子とを接触させる工程を含み、　前記タンパク質は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠如しており、
　前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、それにより前記エフェクター分子が前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって前記遺伝子の発現を調節する、方法。

［１４］以下の（ｆ）～（ｈ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質。
　（ｆ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５８位のロイシンの、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はイソロイシンへの置換を少なくとも含むアミノ酸配列
　（ｇ）前記（ｆ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５８位以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
　（ｈ）前記（ｆ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５８位以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
［１５］配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５８位がチロシンである、［１４］に記載のタンパク質。
［１６］更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンである、［１４］又は［１５］に記載のタンパク質。
［１７］更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７９０位がフェニルアラニンである、［１４］～［１６］のいずれか一つに記載のタンパク質。
［１８］更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９１１位のアラニンが、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンである、［１４］～［１７］のいずれか一つに記載のタンパク質。
［１９］更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９１１位のアラニンが、フェニルアラニンである、［１４］～［１８］のいずれか一つに記載のタンパク質。

［２０］以下の（ｉ）～（ｋ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質。
　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸の、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンへの置換を少なくとも含むアミノ酸配列
　（ｊ）前記（ｉ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７９０位以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
　（ｋ）前記（ｉ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７９０位以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
［２１］配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７９０位がフェニルアラニンである、［２０］に記載のタンパク質。

［２２］下の（ｌ）～（ｎ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質。
　（ｌ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９１１位のアラニンの、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンへの置換を少なくとも含むアミノ酸配列
　（ｍ）前記（ｌ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９１１位以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
　（ｎ）前記（ｌ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９１１位以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
［２３］配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９１１位がフェニルアラニンである、［２２］に記載のタンパク質。

［２４］以下の（ｏ）～（ｑ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質。
　（ｏ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、以下の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列：
　・アミノ酸番号５８位のロイシンの、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はイソロイシンへの置換
　・アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸の、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンへの置換
　・アミノ酸番号９００位のアスパラギン酸の、リジン、又はアルギニンへの置換、
　・アミノ酸番号９１１位のアラニンの、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンへの置換
　（ｐ）前記（ｏ）で表されるアミノ酸配列の、前記（ｏ）に規定するアミノ酸番号以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
　（ｑ）前記（ｏ）で表されるアミノ酸配列の前記（ｏ）に規定するアミノ酸番号以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
［２５］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、以下の置換の組合せの少なくともいずれか一つを含む、［２４］に記載のタンパク質。
　・アミノ酸番号５８位のロイシンのチロシンへの置換
　・アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸のフェニルアラニンへの置換
　・アミノ酸番号９００位のアスパラギン酸のリジンへの置換、
　・アミノ酸番号９１１位のアラニンのフェニルアラニンへの置換

［２６］［１４］～［２５］のいずれか一つに記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
［２７］［２６］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［２８］［１４］～［２５］のいずれか一つに記載のタンパク質、［２６］に記載のポリヌクレオチド、又は［２７］に記載のベクターと、ガイドＲＮＡと、を含む、組成物。
［２９］［２８］に記載の組成物を用いる、単離された細胞中のゲノム編集方法。

　本発明によれば、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を提供することができる。

各ＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた結果である。 各ＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを用いて、変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた結果である。 各ＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを用いて、変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた結果である。 各ＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型及び変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた結果である。 各ＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型及び変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた結果である。 各ＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型及び変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた結果である。 各ＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型及び変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた結果である。 各ＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型及び変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた結果である。 野生型及び変異型ＣｊＣａｓ９におけるＰＡＭ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ａｓｓａｙの結果である。 野生型ＣｊＣａｓ９のＰＡＭプロファイルの結果である。 Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９のＰＡＭプロファイルの結果である。 野生型及び変異型ＣｊＣａｓ９の培養細胞におけるｉｎｄｅｌ解析の結果である。 図１０Ａにおけるゲノム編集効率の要約である。 ＨＥＫ２９３Ｔａ細胞における内在性標的部位での野生型ＣｊＣａｓ９、変異型ＣｊＣａｓ９、及びＳｐＣａｓ９によるＩｎｄｅｌ形成結果である。 ＨＥＫ２９３Ｔａ細胞における内在性標的部位での野生型ＣｊＣａｓ９－ＡＩＤ、及び変異型ＣｊＣａｓ９－ＡＩＤによるシトシン－チミン変換の結果である。 図１１Ａにおける塩基編集効率の要約である。

　以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。

≪タンパク質≫
　野生型ＣｊＣａｓ９タンパク質は、９８４個のアミノ酸残基からなるｔｙｐｅＩＩ　Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。野生型ＣｊＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号１に示す。

　本発明者らは、ＣｊＣａｓ９タンパク質の結晶構造解析データをもとに、ガイドＲＮＡや標的ＤＮＡと相互作用する可能性のある領域に変異を導入したＣｊＣａｓ９タンパク質を作製し、無細胞系及び細胞系での標的ポリヌクレオチドの切断活性を評価することで、ＰＡＭ配列の認識が広範化され、標的ポリヌクレオチドへの切断活性が向上したＣａｓ９タンパク質を見出した。
　本明細書において、Ｃａｓ９タンパク質の「ＰＡＭ配列の認識が広範化」されたこととは、野生型ＣｊＣａｓ９タンパク質を対照として評価され、野生型ＣｊＣａｓ９タンパク質と比較して、認識可能なＰＡＭ配列の種類の増加や、認識可能なＰＡＭ配列の認識頻度の向上を含む概念である。ここで、認識可能なＰＡＭ配列の種類の増加は、例えば、確認対象のＰＡＭ配列を含む標的ポリヌクレオチドの切断活性の有無により確認できる。認識可能なＰＡＭ配列の認識頻度の向上は、例えば、確認対象のＰＡＭ配列を含む標的ポリヌクレオチドの切断活性が向上したことにより確認できる。

　本明細書において、塩基配列を表す場合、「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミンをそれぞれ意味する。「Ｒ」は、アデニン又はグアニンを意味し、「Ｙ」は、シトシン又はチミンを意味し、「Ｍ」は、アデニン又はシトシンを意味し、「Ｈ」は、アデニン、チミン、又はシトシンを意味し、「Ｖ」は、アデニン、グアニン又はシトシンを意味し、「Ｄ」は、アデニン、グアニン又はチミンを意味し、「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン、又はグアニンを意味する。

　本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味し、互換的に使用される。また、１つ若しくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーを意味する。本明細書においては、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｊｏｉｎｔ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従い定義されるようなアミノ酸の一文字表記及び三文字表記を使用する。

　本明細書において、アミノ酸配列における置換変異を表す場合、元のアミノ酸の一文字表記、続いて１～４桁の数字による位置番号、次に置換されたアミノ酸の一文字表記により表現することがある。例えば、アミノ酸番号１０２２位においてアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に置換される変異が生じている場合、「Ｄ１０２２Ｎ」と表され、これは、「アミノ酸番号１０２２位のＡｓｐのＡｓｎへの置換」と同義である。
　以下、本発明の一実施形態のタンパク質として、野生型のＣｊＣａｓ９タンパク質を基準とした以下の変異を有するタンパク質を提供する。

＜アミノ酸番号９００位のアスパラギン酸に変異を有するＣｊＣａｓ９タンパク質＞
　一実施形態において、本発明は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質を提供する。
　（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９００位のアスパラギン酸の、リジン、又はアルギニンへの置換を少なくとも含むアミノ酸配列
　（ｂ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９００位以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
　（ｃ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９００位以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列

　配列番号１で表されるアミノ酸配列とは、野生型ＣｊＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列である。（ａ）において、アミノ酸番号９００位の置換は、リジン、又はアルギニンであり、リジンが好ましい。

　（ｂ）において、欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１～２００個が好ましく、１～１５０個が好ましく、１～１００個がより好ましく、１～５０個がより好ましく、１～４０個がより好ましく、１～３０個がより好ましく、１～１５個がより好ましく、１～１０個が更に好ましく、１～５個が最も好ましい。

　（ｃ）において、同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。

　本明細書において、「ガイドＲＮＡと複合体を形成する」とは、実施形態のタンパク質がガイドＲＮＡとの結合能を有することを意味する。ガイドＲＮＡは、その５’末端に標的ＤＮＡに相補的な配列を有し、係る配列を介して標的ＤＮＡに結合することにより、本発明の一実施形態のタンパク質を標的ＤＮＡに導く。

　本実施形態のタンパク質は、更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５８位のロイシンが、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はイソロイシンであることが好ましく、チロシンであることがより好ましい。

　本実施形態のタンパク質は、更に、（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９１１位のアラニンが、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンであり、及び／又は（ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンであることが好ましい。
　更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９１１位のアラニンが、フェニルアラニンであることがより好ましい。
　更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸が、フェニルアラニンであることがより好ましい。

　実施例にて後述するように、アミノ酸番号９００位のアスパラギン酸がリジンに置換されたＤ９００Ｋ、及び、更にアミノ酸番号５８位のロイシンが、チロシンに置換されたＬ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋは、「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」のＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡに対して野生型と比較して、無細胞系及び細胞系において、優れた切断活性を示した。特に、Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋは、野生型と比較して、細胞内で標的遺伝子におけるＩｎｄｅｌ頻度及び変異頻度に優れている。
　更に、Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋの認識可能なＰＡＭ配列は、実施例で後述するように、「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」以外に、「ＮＮＮＴＡＣＡＣ」や「ＮＮＮＡＡＣＡＤ」といった野生型が認識できない配列も認識できており、認識の嗜好性が大幅に緩和されている。

　また、本実施形態のタンパク質は、ニッカーゼ活性を有していてもよい。ニッカーゼ活性を有するタンパク質としては、上記変異に加えて、アミノ酸番号８位のアスパラギン酸がアラニンであるか、又は、アミノ酸番号５５９位のヒスチジンがアラニンである、若しくは、アミノ酸番号５８２位のアスパラギンがアラニンであることが好ましい。

　また、本実施形態のタンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性が失活していてもよい。エンドヌクレアーゼ活性が失活しているタンパク質としては、上記変異に加えて、アミノ酸番号８位のアスパラギン酸がアラニンであり、アミノ酸番号５５９位のヒスチジンがアラニンであり、及び／又は、アミノ酸番号５８２位のアスパラギンがアラニンであることが好ましい。

　ニッカーゼ活性を有している、又はエンドヌクレアーゼ活性が失活しているＣａｓ９タンパク質は、例えば後述するような、個々の塩基を一塩基単位で高精度に改変するゲノム編集（一塩基編集）や、遺伝子の発現を調節する方法等での使用において、特に有利である。

＜アミノ酸番号５８位のロイシンに変異を有するＣｊＣａｓ９タンパク質＞
　一実施形態において、本発明は、以下の（ｆ）～（ｈ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質を提供する。
　（ｆ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５８位のロイシンの、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はイソロイシンへの置換を少なくとも含むアミノ酸配列
　（ｇ）前記（ｆ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５８位以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
　（ｈ）前記（ｆ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５８位以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列

　（ｆ）において、アミノ酸番号５８位の置換は、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はイソロイシンであり、チロシンが好ましい。

　（ｇ）において、欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１～２００個が好ましく、１～１５０個が好ましく、１～１００個がより好ましく、１～５０個がより好ましく、１～４０個がより好ましく、１～３０個がより好ましく、１～１５個がより好ましく、１～１０個が更に好ましく、１～５個が最も好ましい。

　（ｈ）において、同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。

　本実施形態のタンパク質は、更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンであることが好ましく、フェニルアラニンであることがより好ましい。

　本実施形態のタンパク質は、更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９１１位のアラニンが、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンであることが好ましく、フェニルアラニンであることがより好ましい。

＜アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸に変異を有するＣｊＣａｓ９タンパク質＞
　一実施形態において、本発明は、以下の（ｉ）～（ｋ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質を提供する。
　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸の、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンへの置換を少なくとも含むアミノ酸配列
　（ｊ）前記（ｉ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７９０位以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
　（ｋ）前記（ｉ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７９０位以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列

　（ｉ）において、アミノ酸番号７９０位の置換は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンであり、フェニルアラニンが好ましい。

　（ｊ）において、欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１～２００個が好ましく、１～１５０個が好ましく、１～１００個がより好ましく、１～５０個がより好ましく、１～４０個がより好ましく、１～３０個がより好ましく、１～１５個がより好ましく、１～１０個が更に好ましく、１～５個が最も好ましい。

　（ｋ）において、同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。

　本実施形態のタンパク質は、更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９１１位のアラニンが、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンであることが好ましく、フェニルアラニンであることがより好ましい。

＜アミノ酸番号９１１位のアラニンに変異を有するＣｊＣａｓ９タンパク質＞
　一実施形態において、本発明は、以下の（ｌ）～（ｎ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質を提供する。
　（ｌ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９１１位のアラニンの、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンへの置換を少なくとも含むアミノ酸配列
　（ｍ）前記（ｌ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９１１位以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
　（ｎ）前記（ｌ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９１１位以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列

　（ｌ）において、アミノ酸番号９１１位の置換は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンであり、フェニルアラニンが好ましい。

　（ｍ）において、欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１～２００個が好ましく、１～１５０個が好ましく、１～１００個がより好ましく、１～５０個がより好ましく、１～４０個がより好ましく、１～３０個がより好ましく、１～１５個がより好ましく、１～１０個が更に好ましく、１～５個が最も好ましい。

　（ｎ）において、同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。

　実施例にて後述するように、アミノ酸番号５８位のロイシンがチロシンに置換されたＤ９００Ｋ、アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸がフェニルアラニンに置換されたＥ７９０Ｆ、アミノ酸番号９１１位のアラニンがフェニルアラニンに置換されたＡ９１１Ｆ、及びこれらの変異の組み合わせは、「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」のＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡに対して野生型と比較して、無細胞系において、優れた切断活性を示した。特に、３重変異である、Ｌ５８Ｙ／Ｅ７９０／Ａ９１１Ｆは、野生型と比較して、無細胞系において、特に優れた切断活性を示した。
　更に、Ｌ５８Ｙ／Ｅ７９０／Ａ９１１Ｆの認識可能なＰＡＭ配列は、「ＮＮＮＮＲＹＤＮ」であって、認識の嗜好性が大幅に緩和されている。

　一実施形態において、本発明は、以下の（ｏ）～（ｑ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質を提供する。
　（ｏ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、以下の置換からなる群から選ばれる少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列：
　・アミノ酸番号５８位のロイシンの、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はイソロイシンへの置換
　・アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸の、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンへの置換
　・アミノ酸番号９００位のアスパラギン酸の、リジン、又はアルギニンへの置換、及び
　・アミノ酸番号９１１位のアラニンの、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンへの置換
　（ｐ）前記（ｏ）で表されるアミノ酸配列の、前記（ｏ）に規定するアミノ酸番号以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
　（ｑ）前記（ｏ）で表されるアミノ酸配列の前記（ｏ）に規定するアミノ酸番号以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列

　（ｐ）において、欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１～２００個が好ましく、１～１５０個が好ましく、１～１００個がより好ましく、１～５０個がより好ましく、１～４０個がより好ましく、１～３０個がより好ましく、１～１５個がより好ましく、１～１０個が更に好ましく、１～５個が最も好ましい。

　（ｑ）において、同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。

　また、本実施形態のタンパク質は、ニッカーゼ活性を有していてもよい。ニッカーゼ活性を有するタンパク質としては、上記変異に加えて、アミノ酸番号８位のアスパラギン酸がアラニンであるか、又は、アミノ酸番号５５９位のヒスチジンがアラニンである、若しくは、アミノ酸番号５８２位のアスパラギンがアラニンであることが好ましい。

　また、本実施形態のタンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性が失活していてもよい。エンドヌクレアーゼ活性が失活しているタンパク質としては、上記変異に加えて、アミノ酸番号８位のアスパラギン酸がアラニンであり、アミノ酸番号５５９位のヒスチジンがアラニンであり、及び／又は、アミノ酸番号５８２位のアスパラギンがアラニンであることが好ましい。

　また、本実施形態のタンパク質は、野生型のＣｊＣａｓ９タンパク質よりもＰＡＭ配列の認識が広範化される範囲において、任意のタンパク質や、ペプチド、タグ、糖鎖等の修飾物が付加されていてもよく、複合体が形成されていてもよい。

≪タンパク質をコードするポリヌクレオチド≫
　一実施形態において、本発明は、上述したＣｊＣａｓ９タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

　係るポリヌクレオチドとしては、例えば、以下の（ｏ１）～（ｓ９）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。

　（ｏ１）配列番号３で表される塩基配列（Ｌ５８Ｙ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列）（ｐ１）配列番号３で表される塩基配列の塩基配列番号１７２位～１７４位以外の部位において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換若しくは付加されている塩基配列、
　（ｑ１）配列番号３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１７２位～１７４位以外の部位において、同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
　（ｒ１）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
　（ｓ１）前記（ｏ１）～（ｒ１）の塩基配列の縮重異性体

　（ｏ２）配列番号４で表される塩基配列（Ｅ７９０Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列）　（ｐ２）配列番号４で表される塩基配列の塩基配列番号２３６８位～２３７０位以外の部位において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換若しくは付加されている塩基配列
　（ｑ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２３６８位～２３７０位以外の部位において、同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
　（ｒ２）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
　（ｓ２）前記（ｏ２）～（ｒ２）の塩基配列の縮重異性体

　（ｏ３）配列番号５で表される塩基配列（Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列）　（ｐ３）配列番号５で表される塩基配列の塩基配列番号２６９８位～２７００位以外の部位において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換若しくは付加されている塩基配列
　（ｑ３）配列番号５で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９８位～２７００位以外の部位において、同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
　（ｒ３）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
　（ｓ３）前記（ｏ３）～（ｒ３）の塩基配列の縮重異性体

　（ｏ４）配列番号６で表される塩基配列（Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列）　（ｐ４）配列番号６で表される塩基配列の塩基配列番号２７３１位～２７３３位以外の部位において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換若しくは付加されている塩基配列
　（ｑ４）配列番号６で表される塩基配列の塩基配列番号２７３１位～２７３３位以外の部位において、同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
　（ｒ４）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
　（ｓ４）前記（ｏ４）～（ｒ４）の塩基配列の縮重異性体

　（ｏ５）配列番号７で表される塩基配列（Ｌ５８Ｙ／Ｅ７９０Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列）
　（ｐ５）配列番号７で表される塩基配列の塩基配列番号１７２位～１７４位及び２３６８位～２３７０位以外の部位において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換若しくは付加されている塩基配列
　（ｑ５）配列番号７で表される塩基配列の塩基配列番号１７２位～１７４位及び２３６８位～２３７０位以外の部位において、同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
　（ｒ５）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
　（ｓ５）前記（ｏ５）～（ｒ５）の塩基配列の縮重異性体

　（ｏ６）配列番号８で表される塩基配列（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列）
　（ｐ６）配列番号８で表される塩基配列の塩基配列番号１７２位～１７４位及び２６９８位～２７００位以外の部位において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換若しくは付加されている塩基配列
　（ｑ６）配列番号８で表される塩基配列の塩基配列番号１７２位～１７４位及び２６９８位～２７００位以外の部位において、同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
　（ｒ６）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
　（ｓ６）前記（ｏ６）～（ｒ６）の塩基配列の縮重異性体

　（ｏ７）配列番号９で表される塩基配列（Ｌ５８Ｙ／Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列）
　（ｐ７）配列番号９で表される塩基配列の塩基配列番号１７２位～１７４位及び２７３１位～２７３３位以外の部位において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換若しくは付加されている塩基配列
　（ｑ７）配列番号９で表される塩基配列の塩基配列番号１７２位～１７４位及び２７３１位～２７３３位以外の部位において、同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
　（ｒ７）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
　（ｓ７）前記（ｏ７）～（ｒ７）の塩基配列の縮重異性体

　（ｏ８）配列番号１０で表される塩基配列（Ｅ７９０Ｆ／Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列）
　（ｐ８）配列番号１０で表される塩基配列の塩基配列番号２３６８位～２３７０位及び２７３１位～２７３３位以外の部位において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換若しくは付加されている塩基配列
　（ｑ８）配列番号１０で表される塩基配列の塩基配列番号２３６８位～２３７０位及び２７３１位～２７３３位以外の部位において、同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列
　（ｒ８）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
　（ｓ８）前記（ｏ８）～（ｒ８）の塩基配列の縮重異性体

　（ｏ９）配列番号１１で表される塩基配列（Ｌ５８Ｙ／Ｅ７９０Ｆ／Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列）
　（ｐ９）配列番号１１で表される塩基配列の塩基配列番号１７２位～１７４位、２３６８位～２３７０位、及び２７３１位～２７３３位以外の部位において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換若しくは付加されている塩基配列
　（ｑ９）配列番号１１で表される塩基配列の塩基配列番号１７２位～１７４位、２３６８位～２３７０位、及び２７３１位～２７３３位以外の部位において、同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
　（ｒ９）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
　（ｓ９）前記（ｏ９）～（ｒ９）の塩基配列の縮重異性体

　（ｐ１）～（ｐ９）において、欠失、挿入、置換若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１～５９０個が好ましく、１～４４０個がより好ましく、１～２９０個が更に好ましく、１～１４０個が特に好ましく、１～７０個が特に好ましく、１～３０個が最も好ましい。

　（ｒ１）～（ｒ９）において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５～７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。

　メチオニンとトリプトファン以外のアミノ酸は、１つのアミノ酸に対して複数のコドンが対応する。このことを遺伝暗号の縮重という。（ｓ１）～（ｓ９）において、塩基配列の縮重異性体とは、ある塩基配列がコードするアミノ酸に対応する他の塩基配列を意味する。

≪ベクター≫
　一実施形態において、本発明は、上記実施形態のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
　ベクターとしては、特に限定されず、プラスミドベクター、ウイルスベクター等、従来公知のものを用いることができる。プラスミドベクターとしては、例えば、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＨＳＶ－ｔｋプロモーター等の動物細胞における発現用のプロモーター等を有するベクターが挙げられる。
　ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴（ＡＡＶ）ベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター等が挙げられる。本発明の一実施形態のタンパク質は、ＳｐＣａｓ９と比較して、分子量が小さいため、そのポリヌクレオチドをＡＡＶ等に効率よく組み込むことができる。

　本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列は、真核生物細胞等の特定の細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。真核生物細胞としては、特定の生物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、又は非ヒト霊長類等が挙げられ、これらに限定されない。

≪組成物≫
　一実施形態において、本発明は、上述したＣｊＣａｓ９タンパク質変異体である実施形態のタンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターと、ガイドＲＮＡと、を含む組成物を提供する。

　本実施形態の組成物を使用することにより、広範な配列から選択された標的配列において、標的配列特異的なゲノム編集及び遺伝子発現調節を簡便且つ迅速に行うことができる。

　本明細書中において、「標的配列」の「配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味しており、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、線状、環状、又は分岐状であり、一本鎖又は二本鎖である。

　本明細書中において、「ポリヌクレオチド」とは、線状又は環状配座であり、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味する。また、ポリヌクレオチドには、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチエート骨格）も包含される。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、元のヌクレオチドと同一の塩基対合特異性を有し、例えば、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。

　本明細書中において、「ガイドＲＮＡ」とは、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡのヘアピン構造を模倣したものであり、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２１塩基以上２３塩基以下まで、さらに好ましくは２１塩基又は２２塩基、最も好ましくは２２塩基の標的塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的二本鎖ポリヌクレオチドと非相補的な塩基配列からなり、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。

　前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、温和な条件で混合することで、タンパク質－ＲＮＡ複合体を形成することができる。温和な条件とは、温度及びｐＨが、タンパク質が分解又は変性しない程度の温度及びｐＨである条件を示しており、温度は４℃以上４０℃以下が好ましく、ｐＨは４以上１０以下が好ましい。

　本実施形態において、組成物が、改変されたＣｊＣａｓ９をコードする遺伝子を含む場合、遺伝子は、線状（直鎖状）の遺伝子断片として提供されてもよいし、ベクターに組み込まれた状態で提供されてもよい。改変されたＣｊＣａｓ９をコードする遺伝子がベクターに組み込まれて提供される場合、Ｃａｓ９をコードする遺伝子と、ガイドＲＮＡをコードする遺伝子は、同一のベクターとして提供されてもよいし、複数の別個のベクターとして提供されてもよい。

　本実施形態の組成物は、医薬用であることが好ましく、薬学的に許容される担体を含むことがより好ましい。本実施形態の医薬用組成物は、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。

　薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。

　本実施形態の組成物は、更に添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。添加剤は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。

　本実施形態の組成物は、一種又は複数の疾患又は症状を治療及び／又は予防するために用いられる。好ましくは、前記疾患又は症状は、遺伝子疾患又は遺伝子の異常に起因する症状である。

≪標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法≫
　一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法であって、標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明の一実施形態のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する、方法を提供する。
　係る方法は、単離された細胞中の標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法であることが好ましい。

　本実施形態の方法によれば、広範な配列から選択された標的配列において、部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断を簡便且つ迅速に行うことができる。

　標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための本実施形態の方法について、以下に詳細に説明する。

　まず、本実施形態のＣａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとを接触させる。接触させる工程は、例えば、前記Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとを温和な条件で混合し、インキュベートすることによって行ってもよい。
　温和な条件とは、温度及びｐＨが、タンパク質が分解又は変性しない程度の温度及びｐＨである条件を示しており、温度は４℃以上４０℃以下が好ましく、ｐＨは４以上１０以下が好ましい。インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記Ｃａｓ９タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。

　本実施形態の標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法において用いる実施形態のＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有しているものである。

　本実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチドは、５’→３’の方向で記載される、「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」、又は「ＮＮＮＮＲＹＤＮ」のＰＡＭ配列を含む配列が好ましい。

　次に、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド上において、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは複合体を形成する。前記タンパク質は、「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」、又は「ＮＮＮＮＲＹＤＮ」のＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する。

　より詳細には、前記Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列を起点として、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が引き剥され、前記ガイドＲＮＡ中の前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列とアニーリングすることで、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が部分的にほぐれる。このとき、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドのリン酸ジエステル結合を切断し、平滑末端を作出する。

　本実施形態において、切断部位は、例えば、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０塩基上流である。好ましくは、切断部位は、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の３塩基上流である。

　本実施形態の方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏの任意の環境で行うことができる。一実施形態において、本実施形態の方法は、生体外、すなわちｅｘ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで行われる。

≪標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に修飾するための第１の方法≫
　一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明の一実施形態のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出し、前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾される、方法を提供する。
　係る方法は、単離された細胞中の標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であることが好ましい。

　本実施形態によれば、広範な配列から選択された標的配列において、部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾を簡便且つ迅速に行うことができる。

　標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に修飾するための本実施形態の方法について、以下に詳細に説明する。

　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、実施形態のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程は、上記＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞と同様に行うことができる。

　本実施形態において用いる標的二本鎖ポリヌクレオチド、Ｃａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡについては、上述のとおりである。

　標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法について、以下に詳細を説明する。標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するまでの工程は上述のとおりである。続いて、前記ガイドＲＮＡと前記二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、目的に応じた修飾が施された標的二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。

　本明細書中において、「修飾」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列が変化することを意味する。例えば、標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断、切断後の外因性配列の挿入（物理的挿入又は相同指向修復を介する複製による挿入）による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化、切断後の非相同末端連結（ＮＨＥＪ：切断により生じたＤＮＡ末端同士が再び結合すること）による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化等が挙げられる。本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの変異の導入、又は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの機能を破壊することができる。

　本実施形態の方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏの任意の環境で行うことができる。一実施形態において、本実施形態の方法は、生体外、すなわちｅｘ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで行われる。

≪標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための第２の方法≫
　一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明の一実施形態のタンパク質と核酸塩基変換酵素との複合体と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、ここで、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断し、前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾される、方法を提供する。
　係る方法は、単離された細胞中の標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であることが好ましい。

　本実施形態によれば、部位特異的かつ一塩基単位の正確な標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾を簡便且つ迅速に行うことができる。特に、標的配列が広範化した本発明の実施形態のタンパク質を使用することにより、自由にガイドＲＮＡを設計することができるため、編集する塩基を自由に選択することができる。そのため、実施形態の改変されたＣｊＣａｓ９タンパク質は、本実施形態の方法における使用に関して特に有利である。

　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、実施形態のタンパク質と核酸塩基変換酵素との複合体と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程は、上記＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞と同様に行うことができる。

　本実施形態において用いる標的二本鎖ポリヌクレオチド及びガイドＲＮＡについては、上述のとおりである。本実施形態の標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための第２の方法において用いるＣａｓ９タンパク質は、上記＜Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ切断活性＞に記載している、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠如している改変体である。

　標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的にかつ正確に修飾するための方法について、以下に詳細を説明する。各構成成分を上述のとおり接触させると、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとが複合体を形成し、標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する。ここで、Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断して、すなわち、二本鎖切断を起こすことなく、標的ポリヌクレオチド内の塩基配列を修飾する。「修飾」とは、上で定義したとおりである。本実施形態において、修飾は、好ましくは一塩基単位で行われ、例えば、Ｃ－Ｇ塩基対をＴ－Ａ塩基対へ変えること、又はその逆を行うことを意味する。

　本実施形態において、上記の一塩基単位の特異的かつ正確な修飾（一塩基編集）は、好ましくは、複合体中の核酸塩基変換酵素を用いて行われる。核酸塩基変換酵素としては、デアミナーゼ（脱アミノ化酵素）が挙げられる。デアミナーゼとしては、例えば、シトシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ等を使用することができる。本実施形態における複合体は、係る核酸塩基変換酵素に加えて、Ｉｎｄｅｌ形成を阻害するため、ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （ＵＧＩ）といったＩｎｄｅｌ形成阻害因子を含んでいてもよい。

　本実施形態の方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏの任意の環境で行うことができる。一実施形態において、本実施形態の方法は、生体外、すなわちｅｘ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで行われる。

≪遺伝子の発現を調節するための方法≫
　一実施形態において、本発明は、遺伝子の発現を調節するための方法であって、前記遺伝子に関連する標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明の実施形態のタンパク質と、ガイドＲＮＡと、エフェクター分子とを接触させる工程を含み、前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、それにより前記エフェクター分子が前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって前記遺伝子の発現を調節する、方法を提供する。係る方法は、単離された細胞中の遺伝子の発現を調節するための方法であることが好ましい。

　本実施形態によれば、広範な配列から選択された標的配列において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系による標的二本鎖ポリヌクレオチド認識を利用した遺伝子発現の調節を簡便且つ迅速に行うことができる。特に、標的配列が広範化した本発明の実施形態のタンパク質を使用することにより、自由にガイドＲＮＡを設計することができるため、遺伝子発現の調節を最も効果的に行うことができる領域（ホットスポット）にエフェクター分子を正確に送達することができる。そのため、実施形態の改変されたＣｊＣａｓ９タンパク質は、本実施形態の方法における使用に関して特に有利である。

　本明細書において、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡへと転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが、ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを意味する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来のポリヌクレオチドである場合、発現は、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

　本明細書において、「遺伝子の発現」とは、遺伝子中に含有される情報の、遺伝子産物への変換を意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって改変されたタンパク質もまた含まれる。

　本明細書において、遺伝子の発現の「調節」とは、遺伝子の活性における変化を意味する。発現の調節は、例えば遺伝子の活性化及び抑制、より具体的には転写の活性化又は抑制であるが、これらに限定されない。

　実施形態のＣａｓ９タンパク質を用いて遺伝子の発現を調節するための本実施形態の方法について、以下に詳細に説明する。

　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、実施形態のＣａｓ９タンパク質と、ガイドＲＮＡと、エフェクター分子とを接触させる工程は、上記＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞と同様に行うことができる。

　本実施形態において用いる標的二本鎖ポリヌクレオチド及びガイドＲＮＡについては、上述のとおりである。本実施形態において用いるＣａｓ９タンパク質は、上記＜Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ切断活性＞に記載している、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方、好ましくは両方の鎖を切断する能力を欠如している改変体である。

　本明細書において、「エフェクター分子」とは、細胞において局在化した効果を発揮することが可能な、タンパク質又はタンパク質ドメイン等の分子を意味する。エフェクター分子は、例えば生物学的活性を調節するために、タンパク質またはＤＮＡに選択的に結合するものを含む、種々の異なる形態を取り得る。エフェクター分子の作用には、ヌクレアーゼ活性、酵素活性の増大又は低減、遺伝子発現の増大又は低減、細胞シグナル伝達に影響を与えること等が含まれるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において用いることができるエフェクター分子の具体的な例には、例えば、ＶＰ６４又はＮＦ－κＢ　ｐ６５等の転写活性因子又はドメイン、ＫＲＡＰ、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）等の転写抑制因子又はドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素等のクロマチンリモデリング因子が含まれるが、これらに限定されない。

　本実施形態において、エフェクター分子は、実施形態のタンパク質とガイドＲＮＡとの複合体が標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合することによって、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドへと導かれる。好ましくは、エフェクター分子は、場合によりリンカーを介して、実施形態のＣａｓ９タンパク質に作動可能に連結されている。

　本実施形態において、エフェクター分子は、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに関連する遺伝子の発現を調節する。標的とする二本鎖ポリヌクレオチドには、発現を調節しようとする遺伝子自身の塩基配列のポリヌクレオチドを選択してもよいし、あるいは、例えば、発現を調節しようとする遺伝子の発現を直接又は間接に、正又は負に制御している上流の遺伝子の塩基配列のポリヌクレオチドを選択することもできる。

　本実施形態の方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏの任意の環境で行うことができる。一実施形態において、本実施形態の方法は、生体外、すなわちｅｘ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで行われる。

≪ゲノム編集及び遺伝子治療方法≫
　一実施形態において、本発明は、上述のタンパク質又は組成物を用いて、ゲノム編集を実行するための方法を提供する。以前に知られている標的化された遺伝子組換えの方法と対照的に、実施形態の方法ではゲノム編集を効率的かつ安価に行うことができ、また任意の細胞又は生物に適応可能である。細胞又は生物の二本鎖核酸の任意のセグメントは、実施形態の方法により改変され得る。この方法は、全ての細胞に内在性である相同組換えプロセス及び非相同組換えプロセスの両方を利用する。

　一実施形態において、本発明は、本発明の一実施形態の改変されたＣｊＣａｓ９タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、又は該遺伝子を含むベクターと、ガイドＲＮＡとを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、遺伝子治療方法を提供する。

　本実施形態における医薬組成物の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与される。

　本実施形態における医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば１日あたり０．１μｇ～１ｇ、例えば１日あたり０．００１～２００ｍｇの有効成分を投与すればよい。

　本明細書において、「ゲノム編集」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムやＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）等の技術により標的化された遺伝子組換え又は標的化された変異を実行することにより、特異的な遺伝子破壊やレポーター遺伝子のノックイン等を行う新しい遺伝子改変技術である。本実施形態において、変異は、標的化可能な任意の標的ゲノムＤＮＡの領域に生じさせることが可能であり、例えば、標的ゲノムＤＮＡの遺伝子領域又は標的ゲノムＤＮＡの発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じる。

　また、一実施形態において、本発明は、標的化されたＤＮＡ挿入又は標的化されたＤＮＡ欠失を行う方法を提供する。この方法は、ドナーＤＮＡを含む核酸構築物を用いて、細胞を形質転換する工程を包含する。標的遺伝子切断後のＤＮＡ挿入及びＤＮＡ欠失に関するスキームについては、公知の方法に従って当業者が決定できる。

　また、一実施形態において、本発明は、体細胞及び生殖細胞の両方で利用され、特定の遺伝子座で遺伝子操作を提供する。

　また、一実施形態において、本発明は、体細胞において遺伝子を破壊するための方法を提供する。ここで、遺伝子は、細胞又は生物に対して有害な産物を過剰発現し、細胞又は生物に対して有害な産物を発現する。このような遺伝子は、疾患において生じる１つ以上の細胞型において過剰発現され得る。本発明の実施形態の方法による、前記過剰発現した遺伝子の破壊は、前記過剰発現した遺伝子に起因する疾患を被る個体に、より良い健康をもたらし得る。すなわち、細胞のほんの小さな割合の遺伝子の破壊が働き、発現レベルを減少し、治療効果を生じ得る。

　また、一実施形態において、本発明は、生殖細胞において遺伝子を破壊するための方法を提供する。特定の遺伝子が破壊された細胞は、特定の遺伝子の機能を有さない生物を作製するために選択され得る。前記遺伝子が破壊された細胞において、遺伝子は完全にノックアウトされ得る。この特定の細胞における機能の欠損は、治療効果を有し得る。

　また、一実施形態において、本発明は、遺伝子産物をコードするドナーＤＮＡの挿入をさらに提供する。この遺伝子産物は、構成的に発現された場合、治療効果を有する。例えば、膵細胞の個体群において、活性プロモーター及びインシュリン遺伝子をコードするドナーＤＮＡの挿入を引き起こすために、前記ドナーＤＮＡを、糖尿病を被る個体に挿入する方法が挙げられる。次いで、外因性ＤＮＡを含む膵細胞の前記個体群は、インシュリンを生成し、糖尿病患者を治療することができる。さらに、前記ドナーＤＮＡは植物に挿入され、薬剤的関連遺伝子産物の生成を引き起こし得る。タンパク質産物の遺伝子（例えば、インシュリン、リパーゼ又はヘモグロビン）は、制御エレメント（構成的活性プロモーター、又は誘導性プロモーター）と一緒に植物に挿入され、植物中で大量の医薬品を生成し得る。

　次いで、このようなタンパク質産物は、植物から単離され得る。トランスジェニック植物又はトランスジェニック動物は、核酸移入技術を用いる方法で作製され得る。組織型特異的ベクター又は細胞型特異的ベクターは、選択した細胞内でのみ遺伝子発現を提供するために利用され得る。

　あるいは、上記の方法は、生殖細胞内で利用され、計画された様式で挿入が生じ、後の全ての細胞分裂が、設計された遺伝的変更を有する細胞を生成する細胞を選択し得る。

　実施形態の方法は、すべての生物に対してか、又は培養細胞、培養組織又は培養核（インタクトな生物を再生するために使用され得る細胞、組織又は核を含む）においてか、又は配偶子（例えば、それらの発達の様々な段階の卵又は精子）適用され得る。実施形態の方法は、任意の生物［昆虫、真菌、げっ歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、及び他の農業上重要な動物、ならびに他の哺乳動物（イヌ、ネコ及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない］に由来する細胞に適用され得る。

　さらに、実施形態の組成物及び方法は、植物において使用され得る。組成物及び方法が、任意の様々な植物種（例えば、単子葉植物又は双子葉植物等）において使用され得る。

　以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
　野生型ＣｊＣａｓ９、及び変異型ＣｊＣａｓ９をそれぞれコードする遺伝子（野生型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号２、Ｌ５８Ｙ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号３、Ｅ７９０Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号４、Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号５、Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号６、Ｌ５８Ｙ／Ｅ７９０Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号７、Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号８、Ｌ５８Ｙ／Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号９、Ｅ７９０Ｆ／Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号１０、Ｌ５８Ｙ／Ｅ７９０Ｆ／Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の塩基配列：配列番号１１）をそれぞれ、ｐＥ－ＳＵＭＯ　ｖｅｃｔｏｒ（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ）に組み込んだ。
　さらに、ＳＵＭＯタグとＣｊＣａｓ９遺伝子の間にＴＥＶ認識配列を付加した。完成したコンストラクトから発現するＣａｓ９のＮ末端には６残基のヒスチジンが連続し、続いてＳＵＭＯタグ（Ｈｉｓ_６－ＳＵＭＯタグ）、ＴＥＶプロテアーゼ認識サイトが付加される設計になっている。

　作製したベクターを大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｒｏｓｅｔｔａ２　（ＤＥ３）株へ形質転換した。その後、２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地で培養した。ＯＤ＝０．８になるまで培養した時点で、発現誘導剤としてイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）（終濃度０．１ｍＭ）を添加し、２０℃で２０時間培養した。培養後、大腸菌を遠心分離（８，０００　ｇ，１０分間）により回収した。

　回収した菌体を緩衝液Ａで懸濁し、超音波破砕した。遠心（２５，０００ｇ，３０分間）により上清を回収し、緩衝液Ａで平衡化したＮｉ－ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）と混合し、この混合物を、Ｐｏｌｙ－Ｐｒｅｐカラム （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に詰めた。
　緩衝液Ｂで目的タンパク質を溶出した。Ｈｉｓ_６－ＳＵＭＯタグを除去するために、溶出したタンパク質を、ＳＵＭＯプロテアーゼと混ぜ、緩衝液Ｃを用いて４℃で２時間透析した。このタンパク質を、緩衝液Ｃで平衡化したＮｉ－ＮＴＡカラムに素通りさせ、緩衝液Ｄで平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にチャージした。０．３から２Ｍのリニアグラジエントでタンパク質を溶出し、使用まで－８０℃で保存した。

　緩衝液Ａ～Ｄの組成について、表１に示す。

　目的のガイドＲＮＡ配列（配列番号１２：5’-ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＡＧＧＴＧＣＧＣＴＴＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＧＴＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＧＧＴＴＡＣＡＡＴＣＣＣＣＴＡＡＡＡＣＣＧＣ-３’）が挿入されたベクター作製を行った。ガイドＲＮＡ配列の上流にＴ７プロモーター配列を付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクターに組み込んだ。作製したベクターを基に、ＰＣＲを用いてプライマー同士をアニールさせて伸長反応を起こしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型ＤＮＡを作製した。この鋳型ＤＮＡを用いて、３７℃、４時間、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写産物を含む反応液に１／１０量の３Ｍ　酢酸ナトリウム及び２．５倍量の１００％エタノールを添加し、４℃にて遠心（８，０００ｇ、３分）し、転写産物を沈殿させた。上清を廃棄して７０％エタノールを添加し、４℃にて遠心（８，０００ｇ、３分）し再び上清を廃棄した。沈殿を風乾後、ＴＢＥ緩衝液に再懸濁し、７Ｍ　Ｕｒｅａ変性１０％ＰＡＧＥにより精製した。目的ＲＮＡの分子量に位置するバンドを切り出し、Ｅｌｕｔｒａｐ電気溶出システム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＲＮＡを抽出した。その後、抽出したＲＮＡをＰＤ－１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、緩衝液を緩衝液Ｈ（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に交換した。

　ＤＮＡ切断活性測定試験に用いるために、標的ＤＮＡ配列及びＰＡＭ配列が挿入されたベクターの作製を行った。標的ＤＮＡ配列にＰＡＭ配列１～１２をそれぞれ付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクターに組み込んだ。標的ＤＮＡの配列及びＰＡＭ配列１～１２を表２に示す。

　作製したベクターを用いて、大腸菌Ｍａｃｈ１株（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換し、２０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃にて培養した。

　培養後、菌体を遠心（８，０００ｇ、１分）により回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。

　精製した１２種類のＰＡＭ配列が付加した標的プラスミドＤＮＡを用いて切断実験を行った。プラスミドＤＮＡは、制限酵素により線状化した。この線状化ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列を野生型、又は変異型のＣｊＣａｓ９が切断すると、約１，０００ｂｐと約２，０００ｂｐの切断産物が生じる。切断の際に用いたバッファー（ｃｌｅａｖａｇｅ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ（１０×）の組成を表３に示す。

　反応後のサンプルについて、ＭｕｌｔｉＮＡキャピラリー泳動装置（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を用いて電気泳動を行い、切断産物のバンドを確認した。切断活性は、切断されたＤＮＡ断片（約２，０００ｂｐ）の濃度と未切断の線状化ＤＮＡ（約３，０００ｂｐ）の濃度の合計に対する、切断ＤＮＡ断片の濃度の割合（％）として表される。

　まず、ＰＡＭ配列１～１２を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた。結果を図１に示す。ＰＡＭ配列４，８，１１，１２において、切断活性が低いことが確認された。野生型ＣｊＣａｓ９は、「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」共通配列のＰＡＭの中でも、「ＮＮＮＶＡＹＡＣ」と比較して、「ＮＮＮＶＧＹＡＣ」（特に「ＮＮＮＣＧＹＡＣ」）を有するＰＡＭの認識活性が減少することが確認された。

　野生型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性の低かったＰＡＭ配列４，８，１２において、Ｌ５８Ｙ変異型、Ｄ９００Ｋ変異型、Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた。結果を図２に示す。これらすべての変異型において、特にＬ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型において、切断活性の向上が確認された。

　更に、ＰＡＭ配列１～１２を含む標的ＤＮＡを用いて、Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた。結果を図３に示す。野生型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性の低かったＰＡＭ配列４，８，１１，１２全てにおいて、切断活性の向上が確認された。

　更に、ＰＡＭ配列４，１２を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型，Ｌ５８Ｙ変異型，Ｄ９００Ｋ変異型，Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９，Ｅ７９０Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた。結果を図４に示す。全ての変異型において、切断活性の向上が確認された。

　更に、ＰＡＭ配列１２を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型（ｗｔ），Ｌ５８Ｙ変異型（ｍｔ１），Ｅ７９０Ｆ変異型（ｍｔ２），Ａ９１１Ｆ変異型（ｍｔ３），これら変異型を組み合わせた変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた。結果を図５に示す。全ての変異型において、特にＬ５８Ｙ／Ｅ７９０Ｆ／Ａ９１１Ｆ変異型において、切断活性の向上が確認された。
　また、ＰＡＭ配列１～１２を含む標的ＤＮＡを用いて、ｗｔ，Ｌ５８Ｙ／Ｅ７９０Ｆ／Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた。結果を図６に示すＰＡＭ配列全てにおいて、Ｌ５８Ｙ／Ｅ７９０Ｆ／Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９による切断活性の向上が確認された。

　更に、表４に示すＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを用いて、ｗｔ，Ｌ５８Ｙ／Ｅ７９０Ｆ／Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を調べた。結果を図７に示す。野生型と比較して、すべてのＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡにおいて、切断活性の向上が確認された。Ｌ５８Ｙ／Ｅ７９０Ｆ／Ａ９１１Ｆ変異型ＣｊＣａｓ９の認識可能なＰＡＭ配列は、「ＮＮＮＮＲＹＤＮ」であり、ｗｔと比較して認識の嗜好性が大幅に緩和されたことが確認された。
　また、Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９について、同様の実験を行った。結果を図８に示す。図７に記載の野生型ＣｊＣａｓ９と異なり、Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９は、「ＮＮＮＴＡＣＡＣ」や「ＮＮＮＡＡＣＡＤ」といった、「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」でないＰＡＭも認識することが確認された。

［実施例２］
　実施例１において調整した野生型及びＬ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＰＡＭ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ａｓｓａｙ（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ, Ｈ. ｅｔ ａｌ. Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐａｃｅ. Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６１, １２５９－１２６２ （２０１８）.参照。）を行った。ランダム化された８ｂｐ配列に近接した標的配列を含むＤＮＡライブラリーは、配列番号２２で表されるガイドｓｇＲＮＡを備えた野生型又はＬ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９により切断され、切断産物はディープシークエンスされる。
　図９Ａに示すように、ランダム化された８ｂｐ配列の配列ロゴは、野生型及びＬ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ともに、同様に「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」を示した。しかし、Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９は、５番目、７番目、８番目のＰＡＭにより緩和された認識の嗜好性を示した。
　更に、得られたシークエンスデータを、ＰＡＭの４位から８位における２Ｄプロファイルとして表したところ、野生型ＣｊＣａｓ９のＰＡＭプロファイルは、同様に「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」を示した（図９Ｂ参照。）。
　Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型ＣｊＣａｓ９は、「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」－ＰＡＭと、「ＮＮＮＶＡＹＴＣ」や「ＮＮＮＶＡＹＧＣ」といった「ＮＮＮＶＲＹＡＣ」でない配列も効率よく認識した（図９Ｃ参照。）。

［実施例３］
　哺乳動物細胞における野生型ＣｊＣａｓ９、及び変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型；ｅｎＣｊＣａｓ９ともいう。）の活性を調べるために、２９３Ｔａ細胞での最適化されたＮＮＮＶＡＣＡＣ－ＰＡＭ、サブに最適化されたＮＮＮＶＧＣＡＣ－ＰＡＭ、並びにＮＮＮＶＲＹＡＣでない（ＮＮＮＴＡＣＡＣ及びＮＮＮＡＡＣＡＤ）ＰＡＭを有する３８種類の内在性標的部位における、野生型ＣｊＣａｓ９、及び変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型）によってもたらされるＩｎｄｅｌ形成を測定した。　具体的には、野生型ＣｊＣａｓ９、及び変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型）をそれぞれコードする遺伝子が組み込まれたプラスミド（１２０ｎｇ）とｓｇＲＮＡプラスミド（４０ｎｇ）をＨＥＫ２９３Ｔａ細胞へトランスフェクトした。トランスフェクト３日後に回収した細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行い、Ｉｎｄｅｌ頻度を解析した。結果を図１０に示す。

　野生型ＣｊＣａｓ９は、最適化されたＮＮＮＶＡＣＡＣ－ＰＡＭ、サブに最適化されたＮＮＮＶＧＣＡＣ－ＰＡＭ、並びにＮＮＮＶＲＹＡＣでない（ＮＮＮＴＡＣＡＣ及びＮＮＮＡＡＣＡＤ）ＰＡＭを有する内在性標的部位に、それぞれ４４．０～５３．６％（平均４８．５％）、１０．１～２０．７％（平均１６．４％）、３．１～２０．８％（平均１２．９％）の頻度でＩｎｄｅｌを誘導した（図１０Ａ及び図１０Ｂ参照。）。
　一方、変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型）は、最適化されたＮＮＮＶＡＣＡＣ－ＰＡＭ、サブに最適化されたＮＮＮＶＧＣＡＣ－ＰＡＭ、並びにＮＮＮＶＲＹＡＣでない（ＮＮＮＴＡＣＡＣ及びＮＮＮＡＡＣＡＤ）ＰＡＭを有する内在性標的部位に、それぞれ５８．４～６８．７％（平均６４．８％）、２０．２～３９．８％（平均３２．３％）、１４．８～４１．０％（平均２９．０％）の頻度でＩｎｄｅｌを誘導した（図１０Ａ及び図１０Ｂ参照。）。
　これらの結果から、野生型ＣｊＣａｓ９と比較して、変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型）は、ヒト細胞内において、高い切断活性及びより広範な標的範囲を示すことを示した。
　次いで、ＣｊＣａｓ９ （ＮＮＮＶＲＹＡＣ ＰＡＭ）及びＳｐＣａｓ９（ＮＧＧ ＰＡＭ）の両方によって認識可能なＮＧＧＡＡＣＡＣ－ＰＡＭを有する二つの標的部位における、野生型ＣｊＣａｓ９及び変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型）のゲノム編集効率と、ＳｐＣａｓ９のゲノム編集効率を比較した。
　野生型ＣｊＣａｓ９、変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型）、及びＳｐＣａｓ９は、この二つの標的部位に、それぞれ、７０．３～８６．６％（平均７８．４％）、７９．７～８７．５％（平均８３．６％）、５５．８～６２．６％（平均５９．２％）の頻度でＩｎｄｅｌを誘導した（図１０Ｃ参照。）。

［実施例４］
　野生型ＣｊＣａｓ９、及び変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型）のＤ８Ａニッカーゼそれぞれに、Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ １（ＰｍＣＤＡ１） 及び ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （ＵＧＩ）を融合させた野生型ＣｊＣａｓ９－ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、及び変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型）－ＡＩＤ（ｅｎＣｊＣａｓ９－ＡＩＤともいう。）が、ＨＥＫ２９３細胞において、３８種類の内在性の標的部位のシトシンからチミンへの変換を仲介するかを調べた。
　具体的には、野生型ＣｊＣａｓ９、及び変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型）をそれぞれコードする遺伝子が組み込まれた塩基編集プラスミド（１２０ｎｇ）とｓｇＲＮＡプラスミド（４０ｎｇ）をＨＥＫ２９３Ｔａ細胞へトランスフェクトした。トランスフェクト３日後に回収した細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行い、変異を解析した。結果を図１１に示す。
　野生型ＣｊＣａｓ９－ＡＩＤは、試した標的部位においてシトシンからチミンへの変換を仲介しなかった。
　一方、変異型ＣｊＣａｓ９（Ｌ５８Ｙ／Ｄ９００Ｋ変異型）－ＡＩＤは、最適化されたＮＮＮＶＡＣＡＣ－ＰＡＭ、サブに最適化されたＮＮＮＶＧＣＡＣ－ＰＡＭ、並びにＮＮＮＶＲＹＡＣでない（ＮＮＮＴＡＣＡＣ及びＮＮＮＡＡＣＡＤ）ＰＡＭを有する内在性標的部位に、それぞれ１５．８～２５．１％（平均２１．５％）、４．３～１３．２％（平均８．０％）、１．２～１２．４％（平均６．２％）の頻度で、２０種類の内在性の標的部位のシトシンからチミンへの変換を誘導した（図１１Ａ及び図１１Ｂ参照。）。

　本発明によれば、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を提供することができる。

Claims (13)

1. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡと複合体を形成することができる、タンパク質。
   　（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９００位のアスパラギン酸の、リジン、又はアルギニンへの置換を少なくとも含むアミノ酸配列
   　（ｂ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９００位以外の部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
   　（ｃ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９００位以外の部分において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
2. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９００位がリジンである、請求項１に記載のタンパク質。
3. 　更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５８位のロイシンが、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はイソロイシンである、請求項１又は２に記載のタンパク質。
4. 　更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５８位のロイシンが、チロシンである、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質。
5. 　更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、少なくともいずれか一つの変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質。
   　（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号９１１位のアラニンが、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンである
   　（ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号７９０位のグルタミン酸が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、又はメチオニンである
6. 　ニッカーゼ活性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質。
7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
8. 　請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
9. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項７に記載のポリヌクレオチド、又は請求項８に記載のベクターと、ガイドＲＮＡと、を含む、組成物。
10. 　請求項９に記載の組成物を用いる、単離された細胞中のゲノム編集方法。
11. 　単離された細胞中の標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
    　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
    　前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出し、
    　前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する、方法。
12. 　単離された細胞中の標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
    　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質と核酸塩基変換酵素との複合体と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
    　前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、ここで、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断し、
    　前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する、方法。
13. 　単離された細胞中の遺伝子の発現を調節するための方法であって、
    　前記遺伝子に関連する標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡと、エフェクター分子とを接触させる工程を含み、　前記タンパク質は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠如しており、
    　前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、それにより前記エフェクター分子が前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって前記遺伝子の発現を調節する、方法。

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