JP2016521975A - 遺伝的状態の処置のための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

例えば、疾患の処置のためまたは遺伝子修飾された植物の作出のための、遺伝子修飾のための方法および組成物が開示される。一態様では、細胞において内因性遺伝子を修飾する方法が、本明細書に記載され、この方法は、内因性遺伝子中の標的部位を認識する単一ガイドＲＮＡを含む第１の核酸分子および機能的ドメインをコードする第２の核酸分子をこの細胞に投与するステップを含み、この機能的ドメインは、標的部位上で単一ガイドＲＮＡと会合し、それによって、内因性遺伝子を修飾する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号の利益を主張し、その開示は本明細書においてその全体が参考として援用される。
技術分野
本開示は、ゲノム遺伝子操作の分野にある。
遺伝子療法は、医学における新時代の大きな可能性がある。これらの方法論は、標準的な医療業務によってはこれまで対処できなかった状態に対する処置を可能にする。特に有望な一領域は、細胞を遺伝子操作して、その細胞においてそれまでは産生されなかった産物を細胞に発現させる能力である。この技術の使用の例には、新規治療タンパク質をコードする導入遺伝子の挿入、細胞または個体において失われているタンパク質をコードするコード配列の挿入、突然変異した遺伝子配列を含む細胞における野生型遺伝子の挿入、およびマイクロＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ等の構造的核酸をコードする配列の挿入が含まれる。
食糧生産に対する世界的需要の高まりに関する課題に対応するために、農業の生産性（例えば、増強された収量または遺伝子操作された有害生物抵抗性）を改善するための多くの有効なアプローチは、突然変異育種か、または形質転換による作物種のゲノム中への新規遺伝子の導入のいずれかを利用するものである。いずれのプロセスも、本質的に非特異的であり、比較的非効率的である。例えば、従来の植物形質転換方法は、ランダムな位置でゲノム中に組み込まれる外因性ＤＮＡを送達する。これらの方法のランダムな性質により、望ましい特質を有するトランスジェニック系統を同定および単離するために、構築物１つ当たり数百の特有のランダム組込み事象を生成およびスクリーニングすることが必要となる。さらに、従来の形質転換方法は、（ａ）意図しないゲノム破壊に起因する多面的効果が生じているかどうかを予測することが困難であること；および（ｂ）単一の導入遺伝子候補内の異なる調節エレメントおよび導入遺伝子設計の影響を比較することは、ゲノム中へのランダム組込みによってこうした比較が複雑化するので困難であることを含め、導入遺伝子の評価に関するいくつかの課題を生じる。結果として、従来の植物形質遺伝子操作は、成功の可能性が低い、労力を要する、コスト集約的なプロセスである。
精密な遺伝子修飾は、植物系における従来の業務のロジスティックの課題を克服し、したがって、基礎的な植物の生物学研究および農業バイオテクノロジーの両方において長期にわたるとらえ所のない目標となってきた。しかし、イネにおける陽性−陰性薬物選択を介した「遺伝子標的化」または予め遺伝子操作された制限部位の使用を除くと、モデルおよび作物の両方の全ての植物種における標的化されたゲノム修飾は、最近まで、非常に困難であることが証明されていた。Ｔｅｒａｄａら（２００２年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０巻（１０号）：１０３０頁；Ｔｅｒａｄａら（２００７年）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １４４巻（２号）：８４６頁；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（２００８年）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊ．６巻（１号）：９３頁。
導入遺伝子（または形質）スタッキングは、植物の作出にとって大きな潜在力を有するが、困難であることが証明されている。例えば、Ｈａｌｐｉｎ（２００５年）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ３巻：１４１〜１５５頁を参照されたい。さらに、生物が２またはそれ超の重複した対のセットの染色体（同質倍数性）または関連する対のセットの染色体（異質倍数性）を有する倍数性は、動物よりも植物種においてより頻繁に存在する。例えば、コムギは、二倍体（２セットの染色体）、四倍体（４セットの染色体）および六倍体（６セットの染色体）である系統を有する。さらに、属Ｂｒａｓｓｉｃａの多くの農業的に重要な植物もまた、異質四倍体である。
導入遺伝子は、種々の方法によって細胞に送達され得、その結果、この導入遺伝子は、細胞自身のゲノム中に組み込まれ、そこで維持される。近年、選択されたゲノム遺伝子座中への標的化された挿入のために部位特異的ヌクレアーゼによる開裂を使用する、導入遺伝子組込みのための戦略が開発された（例えば、共同所有された米国特許第７，８８８，１２１号を参照）。標的化される遺伝子に特異的なヌクレアーゼが利用され得、その結果、導入遺伝子構築物が、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）駆動性過程の間の末端捕捉のいずれかによって挿入される。標的化される遺伝子座には、「セーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）」遺伝子座、例えば、ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴおよびＣＣＲ５遺伝子、ならびにマウス細胞におけるＲｏｓａ２６（例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；第７，９７２，８５４号；第７，９１４，７９６号；第７，９５１，９２５号；第８，１１０，３７９号；第８，４０９，８６１号；第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；第２００５０２０８４８９号；第２００５００２６１５７号；第２００６００６３２３１号；第２００８０１５９９９６号；第２０１０００２１８２６４号；第２０１２００１７２９０号；第２０１１０２６５１９８号；第２０１３０１３７１０４号；第２０１３０１２２５９１号；第２０１３０１７７９８３号および第２０１３０１７７９６０号を参照）、ならびに植物におけるＺｐ１５遺伝子座（米国特許第８，３２９，９８６号を参照）が含まれる。ヌクレアーゼ媒介性の組込みは、導入遺伝子のランダム組込みに依存する古典的組込みアプローチと比較して、改善された導入遺伝子発現、増加した安全性および発現持続性の見込みを提供するが、それは、これが、近傍の癌遺伝子の遺伝子サイレンシングまたは活性化のリスクを最小限にするための、正確な導入遺伝子の位置付けを可能にするからである。
ゲノム遺伝子操作には、上記挿入方法に加えて、遺伝子のノックアウトもまた含まれ得る。ドナー核酸の非存在下では、開裂されたゲノムを有する細胞は、切断を治すためにエラープローンＮＨＥＪ経路を用いる。この過程は、多くの場合、標的部位におけるミスセンスまたはナンセンス突然変異の導入をもたらし得る修復過程の間にヌクレオチドを付加または欠失する（「挿入欠失」）。例えば、ＣＣＲ５特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼは、非機能的ＣＣＲ５受容体を生じ、したがってＨＩＶ感染を予防するために、第Ｉ／ＩＩ相試験において使用されている（米国特許第７，９５１，９２５号を参照）。
所望の位置における標的化されたヌクレアーゼ媒介性のゲノム開裂は、遺伝子操作されたヌクレアーゼの使用によって得られ得る。例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等の部位特異的ヌクレアーゼによって生じ得る。例えば、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、Ｕｒｎｏｖら（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ ４３５巻（７０４２号）：６４６〜５１頁；米国特許第８，５８６，５２６号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，５０３，７１７号；第６，６８９，５５８号；第７，０６７，３１７号；第７，２６２，０５４号を参照されたい。
別のヌクレアーゼ系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系として公知の、細菌および古細菌において見出されるいわゆる獲得免疫系の使用を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細菌の４０％および古細菌の９０％において見出され、それらの系は複雑性が異なっている。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）は、外来ＤＮＡの短いセグメントが短いリピート回文配列間に組み込まれる、生物のゲノム内の領域である。これらの遺伝子座は転写され、ＲＮＡ転写物（「ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ」）は、短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へとプロセシングされる。３つの型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が存在し、これらは全て、「Ｃａｓ」タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連）として公知のこれらのＲＮＡおよびタンパク質を取り込む。Ｉ型およびＩＩＩ型は共に、ｃｒＲＮＡへと完全にプロセシングされたときに、このｃｒＲＮＡに相補的な核酸を開裂させることが可能なマルチＣａｓタンパク質複合体をアセンブルするｐｒｅ−ｃｒＲＮＡをプロセシングする、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを有する。
ＩＩ型の系では、ｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ中のリピート配列と相補的なトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）がＣａｓ９タンパク質の存在下での二本鎖特異的ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるプロセシングを誘発する異なる機構を使用して、産生される。次いで、Ｃａｓ９は、成熟ｃｒＲＮＡと相補的な標的ＤＮＡを開裂させることができるが、Ｃａｓ９による開裂は、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合、およびＰＡＭ配列（プロトスペーサー隣接モチーフ）と呼ばれるｃｒＲＮＡ中の短いモチーフの存在の両方に依存する（Ｑｉら（２０１３年）Ｃｅｌｌ １５２巻：１１７３頁を参照）。さらに、その３’末端においてｃｒＲＮＡと塩基対合するので、このｔｒａｃｒＲＮＡもまた存在しなければならず、この会合は、Ｃａｓ９活性を誘発する。
このＣａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有する：一方のヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと類似しているが、他方は、Ｒｕｖエンドヌクレアーゼドメインと似ている。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を開裂させることを担うようであるが、Ｒｕｖドメインは、非相補鎖を開裂させる。
ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の要求は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む遺伝子操作された「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避され得る（Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７巻：８１６頁およびＣｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、遺伝子操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物またはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ会合したＲＮＡと標的ＤＮＡとの間で二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体が形成する場合に、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡを開裂するようにガイドする。Ｃａｓ９タンパク質とＰＡＭ配列を含む遺伝子操作されたｓｇＲＮＡとを含むこの系は、ＲＮＡガイドされるゲノム編集に使用されており（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ同書を参照）、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと類似の編集効率で、ｉｎ ｖｉｖｏでゼブラフィッシュ胚ゲノム編集に有用である（Ｈｗａｎｇら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１巻（３号）：２２７頁を参照）。
米国特許第７，８８８，１２１号明細書 米国特許第７，９７２，８５４号明細書 米国特許第７，９１４，７９６号明細書 米国特許第７，９５１，９２５号明細書 米国特許第８，１１０，３７９号明細書 米国特許第８，４０９，８６１号明細書 米国特許第８，５８６，５２６号明細書 米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書 米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書 米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書 米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書 米国特許出願公開第２０１０／００２１８２６４号明細書 米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書 米国特許第８，３２９，９８６号明細書 米国特許第７，９５１，９２５号明細書 米国特許第８，５８６，５２６号明細書 米国特許第６，５３４，２６１号明細書 米国特許第６，５９９，６９２号明細書 米国特許第６，５０３，７１７号明細書 米国特許第６，６８９，５５８号明細書 米国特許第７，０６７，３１７号明細書 米国特許第７，２６２，０５４号明細書 米国特許第８，６９７，３５９号明細書
Ｕｒｎｏｖら（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ ４３５巻（７０４２号）：６４６〜５１頁 Ｑｉら（２０１３年）Ｃｅｌｌ １５２巻：１１７３頁 Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７巻：８１６頁およびＣｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３ Ｈｗａｎｇら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１巻（３号）：２２７頁
したがって、疾患の処置および／または予防のため、ならびに農業的使用のためを含む、ゲノム編集のための系が、いまだ必要とされている。
例えば、疾患の処置のため、または遺伝子修飾された植物の作出のための、遺伝子修飾のための方法および組成物が、本明細書に開示される。ゲノム編集は、異常な遺伝子を修正するため、野生型遺伝子を挿入するため、または内因性遺伝子の発現を変化させるために使用される。任意の哺乳動物または植物の遺伝子（複数可）を含む、１または複数の内因性遺伝子が、ゲノム編集のために標的化され得る。非限定的な例として、βグロビンをコードする野生型遺伝子が、欠陥のあるβグロビンによって引き起こされるヘモグロビン異常症を処置するために、細胞のゲノム中に挿入され得る。一部の例では、野生型遺伝子は、セーフハーバー遺伝子座中に、または赤血球細胞中のβグロビン遺伝子座等の、目的の組織において高度に発現されることが公知の遺伝子座において、挿入され得る。本明細書に開示される別のアプローチには、欠陥のある内因性遺伝子が標的化され、遺伝子操作されたドナーを使用して突然変異体配列が置き換えられる（例えば、この突然変異体は、機能的配列で置き換えられる）、遺伝子修正の使用を含む。あるいは、別の遺伝子のモジュレーションに関与する１または複数の調節遺伝子が変更され得る、例えば、遺伝子の抑制に関与する調節遺伝子が、変更もしくはノックアウトされ得、その結果、通常は抑制される遺伝子が、今度は発現されもしくは発現されず、または遺伝子の上流の調節結合部位もしくはこの遺伝子座の他の領域中の調節結合部位は、調節因子がこの遺伝子座においてＤＮＡと適切に相互作用することができず、遺伝子発現を調節できないように、変更される。別のアプローチは、ヘモグロビン異常症または他の疾患（例えば、遺伝性疾患）の処置のための、患者中に移植するために次いで使用され得る、修飾された幹細胞（例えば、造血幹細胞または赤血球（ＲＢＣ）前駆体）の使用をさらに含む。
一態様では、ゲノム中の内因性遺伝子（例えば、内因性もしくはセーフハーバー遺伝子、または調節遺伝子もしくはそのＤＮＡ標的）中の目的の領域中の標的部位に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が本明細書に記載され、ここで、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的遺伝子および機能的ドメイン（例えば、転写調節ドメインおよび／またはヌクレアーゼドメイン）を認識する１または複数の遺伝子操作された単一ガイドＲＮＡを含む。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接するコード領域もしくは非コード領域中の目的の領域、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロン等、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内の目的の領域に結合しおよび／またはそれを開裂し得る。ある特定の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、遺伝子に結合しおよび／またはそれを開裂する。他の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、セーフハーバー遺伝子、例えば、哺乳動物細胞中のＣＣＲ５遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても公知）遺伝子またはＲｏｓａ遺伝子、および植物中のＺｐ１５遺伝子座に結合しおよび／またはそれを開裂する。ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃは、そのコード配列中に２２個のエクソンを有し、標的化のための特に好ましい位置は、イントロン１内に存在し（即ち、ｃｈｒ１９：５５６２４１６４〜５５６２４７５９またはその近傍）、プロモーターなしの導入遺伝子の挿入を可能にする。さらに、哺乳動物系における選択を補助するために、ＨＰＲＴ遺伝子座が使用され得る（米国特許出願第１３／６６０，８２１号および第１３／６６０，８４３号を参照）。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、調節エレメントに結合し、調節エレメントにおいて開裂させる。別の態様では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのうちの１または複数を含む組成物が、本明細書に記載される。
一態様では、記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、目的の遺伝子に結合し得および／または目的の遺伝子の発現をモジュレートし得る。一実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＤＮＡ配列に結合し、他の調節因子の結合を防止する。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系融合タンパク質の結合は、標的ＤＮＡの発現をモジュレート（即ち、誘導または抑制）し得る。
別の態様では、本明細書に記載される１または複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドが記載される。このポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡであり得る。一部の態様では、このｍＲＮＡは、化学的に修飾され得る（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎら（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９巻（２号）：１５４〜１５７頁を参照）。
別の態様では、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書に記載される１または複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分をコードするポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系発現ベクターが、記載される。一実施形態では、この発現ベクターは、ウイルスベクターである。別の実施形態では、この発現ベクターは、ＤＮＡミニサークルである。
一態様では、標的ＤＮＡを開裂させるために使用されるＣａｓタンパク質が、本明細書に記載される。
別の態様では、内因性遺伝子を修飾する（例えば、内因性遺伝子の発現をモジュレートする）方法が本明細書に記載され、この方法は、内因性遺伝子中の標的部位を認識する単一ガイドＲＮＡを含む第１の核酸分子および機能的ドメインをコードする第２の核酸分子をこの細胞に投与するステップを含み、この機能的ドメインは、標的部位上で単一ガイドＲＮＡと会合し、それによって、内因性遺伝子を修飾する。第１および第２の核酸は、同じまたは異なるベクター上に存在し得る。ある特定の実施形態では、この内因性遺伝子は、哺乳動物βグロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマグロビン遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、ハンチンチン（Ｈｕｎｇｔｉｎｇｉｎ）（Ｈｔｔ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、サーファクタントタンパク質Ｂ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡ Ｂ遺伝子、ＨＬＡ Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原ペプチド輸送体（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、グルココルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、ＺＰ１５遺伝子、ＫＡＳＩＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子および／またはＥＰＳＰＳ遺伝子からなる群から選択される。
本明細書に記載される方法および組成物のいずれかでは、この細胞は、任意の真核生物細胞（複数可）、例えば、植物細胞もしくは哺乳動物細胞、またはＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）およびｐｅｒＣ６細胞を含む細胞株、ならびに昆虫細胞、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、あるいは真菌細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓであり得る。ある特定の実施形態では、この細胞株は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。線維芽細胞、血液細胞（例えば、赤血球、白血球）、肝臓細胞、腎臓細胞、神経細胞などが含まれるがこれらに限定されない初代細胞もまた、本明細書に記載されるように編集され得る。適切な細胞には、幹細胞、例えば、例として、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞、ニューロン幹細胞および間葉系幹細胞もまた含まれる。他の態様では、遺伝子修飾された血液細胞前駆体（「ＨＳＣ」として公知の造血幹細胞）が、骨髄移植において与えられ、ＨＳＣが、ｉｎ ｖｉｖｏで分化および成熟する。
他の態様では、遺伝子修飾されたＲＢＣ前駆体および／または造血幹細胞（ＨＳＣ）が、骨髄移植において与えられ、ＲＢＣが、ｉｎ ｖｉｖｏで分化および成熟する。一部の実施形態では、これらのＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ誘導された動員の後に末梢血から単離され、他の実施形態では、これらの細胞は、ヒト骨髄または臍帯血から単離される。一部の態様では、これらのＨＳＣは、特定の遺伝子または調節配列をノックアウトするように設計されたヌクレアーゼによる処理によって編集される。他の態様では、これらのＨＳＣは、野生型遺伝子が挿入および発現され、ならびに／または内因性の異常な遺伝子が修正されるように、遺伝子操作されたヌクレアーゼとドナー核酸とで修飾される。一部の実施形態では、遺伝子操作された遺伝子が、挿入および発現される。一部の実施形態では、修飾されたＨＳＣは、穏やかな骨髄破壊的前処理の後に、患者に投与される。他の態様では、移植後に、造血細胞の大部分が、新たに移植された修飾されたＨＳＣ集団に由来するように、これらのＨＳＣは、完全な骨髄破壊後に投与される。
一態様では、本発明は、突然変異したＣａｓヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、これらの突然変異体Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、変更された機能性を有する。一部の実施形態では、このＣａｓ９タンパク質は、ＨＮＨドメインにおいて突然変異しており、それにより、ｃｒＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を開裂させることができなくなっている。他の実施形態では、このＣａｓ９は、Ｒｖｕドメインにおいて突然変異しており、それにより、非相補的ＤＮＡ鎖を開裂させることができなくなっている。これらの突然変異は、Ｃａｓ９ニッカーゼの創出を生じ得る。一部の実施形態では、２つのＣａｓニッカーゼが、ＤＮＡを標的化するために２つの別々のｃｒＲＮＡと共に使用されて、標的ＤＮＡ中に、特定の距離離れた２つのニックを生じる。他の実施形態では、ＨＮＨおよびＲｖｕエンドヌクレアーゼドメインの両方が、Ｃａｓ９タンパク質が標的ＤＮＡを開裂させることができないようにするために変更される。
別の態様では、本発明の方法および組成物は、Ｃａｓ９タンパク質のトランケーションを含む。一実施形態では、このＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９の機能的ドメインのうちの１または複数が除去されるように、トランケートされる。一実施形態では、ヌクレアーゼドメインの一部または１つの除去は、Ｃａｓヌクレアーゼをニッカーゼにする。一実施形態では、このＣａｓ９は、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡとの相互作用を担うドメインのみを含む。
なおさらなる態様では、本発明の方法および組成物は、Ｃａｓ９タンパク質またはそのトランケーションが機能的ドメインに融合した融合タンパク質もまた含む。一部の態様では、この機能的ドメインは、活性化ドメインまたは抑制ドメインである。他の態様では、この機能的ドメインは、ヌクレアーゼドメインである。一部の実施形態では、このヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインである（例えば、Ｔｓａｉ（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２９０８）。一部の実施形態では、このＦｏｋＩドメインは、二量体形成ドメイン中に突然変異を含む。
別の態様では、細胞（例えば、幹細胞）において内因性遺伝子（例えば、セーフハーバー遺伝子）中に配列を挿入するための方法が本明細書に記載され、この方法は、１または複数のヌクレアーゼを使用してこの内因性遺伝子を開裂させるステップおよびこの開裂部位中に配列を挿入するステップを含む。ある特定の実施形態では、任意の標的遺伝子中のゲノム配列は、例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（または前記ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系をコードするベクター）、および標的化された開裂の後に遺伝子中に挿入される「ドナー」配列（「導入遺伝子」としても公知）を使用して、置き換えられる。このドナー配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベクター中に存在し得、別々のベクター（例えば、Ａｄ、ＡＡＶ、ＤＮＡミニサークルまたはＬＶベクター）中に存在し得、またはあるいは、異なる核酸送達機構を使用して細胞中に導入され得る。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡは、エレクトロポレーションによって、所望のｓｇＲＮＡと共に細胞中に導入され得る。標的遺伝子座（例えば、セーフハーバー遺伝子）中へのドナーヌクレオチド配列の斯かる挿入は、標的遺伝子座の遺伝子制御エレメントの制御下での導入遺伝子の発現を生じる。一部の実施形態では、この導入遺伝子は、非コードＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする。幹細胞分化前の導入遺伝子の発現は、目的の非コードＲＮＡを含む誘導体細胞を生じる。
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物は、植物細胞において実施されるおよび／または植物細胞を含む。一部の態様では、これらの植物細胞は、成長点細胞である。一部の実施形態では、これらの植物細胞は、本発明のヌクレアーゼを含む。他の実施形態では、これらの植物細胞は、導入遺伝子をさらに含む。さらに別の態様では、植物細胞のゲノム中に１または複数の外因性配列を導入するための方法が本明細書に記載され、この方法は、（ａ）細胞を１または複数の外因性配列（ドナーベクター、導入遺伝子またはＧＯＩ）と接触させるステップ；および（ｂ）この細胞において、本明細書に記載される１または複数のヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を発現させるステップであって、この１または複数のヌクレアーゼが、染色体ＤＮＡを開裂させる、ステップ、を含み；その結果、ステップ（ｂ）中の染色体ＤＮＡの開裂は、相同組換えによるゲノム中へのドナーベクターの取り込みを刺激する。複数の導入遺伝子が、同時に（並行して）組み込まれ得、またはこれらのステップは、導入遺伝子の逐次的付加（導入遺伝子スタッキング）のために反復され得る。
他の実施形態では、この導入遺伝子は、機能的タンパク質、例えば、グロビン（例えば、野生型ベータおよび／または野生型ガンマ）タンパク質を含む。他の実施形態では、この導入遺伝子は、望ましい品質での新規タンパク質の産生のための遺伝子操作された遺伝子をコードする。一部の実施形態では、内因性遺伝子中への目的の導入遺伝子の挿入は、インタクトな外因性タンパク質配列の発現を生じ、内因性遺伝子によってコードされる任意の配列を欠く。他の実施形態では、発現される外因性タンパク質は、融合タンパク質であり、導入遺伝子によってコードされるアミノ酸および内因性遺伝子（例えば、内因性標的遺伝子座由来）によってコードされるアミノ酸を含む。存在する場合、内因性配列は、外因性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分および／または外因性タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分上に存在し得る。一部の態様では、このセーフハーバーは、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａ、ＨＰＲＴ、Ｚｐ１５またはＣＣＲ５遺伝子座から選択される（米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号；第２００８０１５９９９６号；および第２０１０００２１８２６４号ならびに米国特許出願第１３／６６０，８２１号および第１３／６６０，８４３号ならびに米国特許第８，３２９，９８６号を参照）。
さらに別の態様では、ゲノム修飾された細胞株および／またはトランスジェニック生物、例えば動物モデル（系）が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、このトランスジェニック細胞および／または生物（例えば、動物）は、ヒト遺伝子をコードする導入遺伝子を含む。一部の例では、このトランスジェニック動物は、外因性導入遺伝子に対応する内因性遺伝子座においてノックアウトを含み、それによって、ヒトタンパク質が単離状態で研究され得るｉｎ ｖｉｖｏ系の開発を可能にする。斯かるトランスジェニックモデルは、小分子もしくは大きい生体分子または目的のヒトタンパク質と相互作用し得るもしくは目的のヒトタンパク質を修飾し得る他の実体を同定するために、スクリーニング目的で使用され得る。一部の実施形態では、本発明の細胞株は、医薬品開発における活性スクリーニングのための細胞ベースのアッセイにおいて使用されるが、他の実施形態では、これらの細胞株は、診断アッセイにおいて使用される。一部の態様では、この導入遺伝子は、本明細書に記載される方法のいずれかによって得られた幹細胞（例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞等）または動物胚中に、選択された遺伝子座（例えば、セーフハーバー）中に組み込まれ、次いで、この胚は、生きた動物が出生するように移植される。次いで、この動物は、性的成熟になるまで育てられ、子孫を生じるようになり、ここで、子孫の少なくとも一部は、編集された内因性遺伝子配列または組み込まれた導入遺伝子を含む。
なおさらなる態様では、本明細書に記載される方法のいずれかに従って得られた細胞（例えば、植物細胞または哺乳動物細胞）もまた提供される。
別の態様では、本明細書に記載される細胞（例えば、植物または動物）を含む生物（例えば、植物または動物）が、本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書に記載されるように得られた植物細胞を含む植物由来の種子が、本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書に記載されるように得られた植物細胞を含む植物から得られる果実が、本明細書で提供される。
本明細書に記載される組成物（細胞または植物）または方法のいずれかでは、この植物細胞は、単子葉植物細胞または双子葉植物細胞を含み得る。ある特定の実施形態では、この植物細胞は、作物植物、例えば、コムギ、トマト（または他の果実作物）、ジャガイモ、トウモロコシ、ダイズ、アルファルファ等である。
なおさらなる態様では、染色体の内因性遺伝子座（例えば、セーフハーバー遺伝子）中への、例えば、胚の染色体中への核酸配列の部位特異的組込みのための方法が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、この方法は、（ａ）（ｉ）組み込まれる核酸配列に隣接する上流配列および下流配列を含む、少なくとも１つのＤＮＡベクターと、（ｉｉ）標的遺伝子座（例えば、グロビンまたはセーフハーバー遺伝子座）中の組込みの部位を認識するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子とを胚に注射するステップ、および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼの発現を可能にするために胚を培養するステップを含み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼによって組込みの部位中に導入された二本鎖切断は、染色体中に核酸配列を組み込むように、このＤＮＡベクターとの相同組換えを介して修復される。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、このポリヌクレオチドは、プラスミドを含む。他の実施形態では、このヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含むキットもまた提供される。このキットは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子または適切な発現ベクター中に含まれるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系コード遺伝子）、またはヌクレアーゼタンパク質のアリコート、ドナー分子、適切な宿主細胞株、本発明の方法を実施するための指示書などを含み得る。
これらおよび他の態様は、全体としての開示を踏まえて、当業者に容易に明らかとなる。
疾患を研究および処置するため、または望ましい形質を有する植物の創出のためのゲノム遺伝子操作を含む、ゲノム遺伝子操作のための方法および組成物が、本明細書に開示される。本発明は、それを必要とする対象における疾患の処置または望ましい植物の作出を次いで生じる、１または複数の遺伝子の発現における好ましい変化が生じるような、任意の標的細胞のゲノム編集を記載する。疾患の非限定的な例には、遺伝性疾患（例えば、ヘモグロビン異常症、血友病、リソソーム蓄積症、嚢胞性線維症等）、感染性疾患（例えば、ＨＩＶ）、神経学的疾患（例えば、ＰＤ、ＨＤ等）、がんなどが含まれる。さらに、所望のタンパク質産物を発現するように変更された移植片における変更された幹細胞の送達は、疾患において同様に有益であり得る。変更された遺伝子発現を有する細胞株および生物（例えば、植物または動物）もまた記載される。本発明のｓｇＲＮＡを使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって標的化される遺伝子が、以下に記載される。記載されるような哺乳動物の遺伝子位置は、ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ ＵＣ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚによって作成されたＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｅｒ、ソフトウェア著作権ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに対してのものである。ヒトゲノム座標は、ヒトゲノムのＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリにおいて提供され、二本鎖ＤＮＡ上の数字に対応する。したがって、ゲノム座標によって記載される任意の位置は、（＋）鎖もしくはＷａｔｓｏｎ鎖のいずれかに対応するか、またはその対応する（−）鎖もしくはＣｒｉｃｋ鎖を特定し得る。
例示的な標的には、ヘモグロビン異常症に関与する遺伝子が含まれる。ヘモグロビンは、２つのα様グロビン鎖および２つのβ様グロビン鎖および４つのヘム基を含むヘテロ四量体である。成人では、α２β２四量体は、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）または成人ヘモグロビンと呼ばれる。典型的には、アルファグロビン鎖およびベータグロビン鎖は、およそ１：１の比で合成され、この比は、ヘモグロビンおよびＲＢＣの安定化に関して重要なようである。実際、１つの型のグロビン遺伝子が不適切に発現されるいくつかの場合には（以下を参照）、他の型のグロビンの発現を低下させて（例えば、特異的ｓｉＲＮＡを使用する）、この１：１の比を回復することは、突然変異体の細胞表現型の一部の態様を軽減する（Ｖｏｏｎら（２００８年）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９３巻（８号）：１２８８頁を参照）。発生中の胎児では、異なる形態のヘモグロビン、ヘモグロビンＡよりも酸素に対する高い結合親和性を有する胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）が産生され、その結果、酸素は、母親の血流を介して乳児の系に送達され得る。胎児ヘモグロビンもまた、２つのαグロビン鎖を含むが、成人β−グロビン鎖の代わりに２つの胎児γ−グロビン鎖を有する（α２γ２）。妊娠期間のおよそ３０週において、胎児におけるγ−グロビンの合成は低下し始めるが、β−グロビンの産生は増加する。およそ１０カ月齢までに、新生児のヘモグロビンは、ほぼ全てα２β２であるが、一部のＨｂＦは、成人期まで持続する（総ヘモグロビンのおよそ１〜３％）。γの産生からβの産生への切り替えの調節は、全く複雑であり、主に、β−グロビン発現の同時の上方調節と共に、γ−グロビンの発現下方調節を含む。
ヘモグロビン鎖をコードする配列における遺伝的欠損は、鎌状赤血球貧血およびサラセミアを含む、ヘモグロビン異常症として公知のいくつかの疾患の原因であり得る。ヘモグロビン異常症を有する患者の大部分では、γ−グロビンをコードする遺伝子は存在したままであるが、発現は、上記のような出産周辺で生じる正常な遺伝子抑制に起因して比較的低い。
米国において５０００人に１人が鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を有すると推定され、ほとんどがサハラ以南のアフリカの家系の人々である。マラリアに対する保護にとって鎌状赤血球ヘテロ接合性の利益が存在するようであり、したがって、この形質は、経時的に選択されてきた可能性があり、その結果、サハラ以南のアフリカでは、集団の３分の１が鎌状赤血球形質を有すると推定される。鎌状赤血球症は、バリンがアミノ酸番号６においてグルタミン酸を置換した（ＤＮＡレベルでは、ＧＡＧからＧＴＧ）β−グロビン遺伝子中の突然変異によって引き起こされ、得られたヘモグロビンは、「ヘモグロビン（ｈｅｍｏｂｌｏｂｉｎ）Ｓ」または「ＨｂＳ」と呼ばれる。低酸素条件下では、ＨｂＳのデオキシ形態は、ＥヘリックスとＦヘリックスとの間でタンパク質上に疎水性パッチを露出させる。ヘモグロビン中のベータ鎖の６位におけるバリンの疎水性残基は、この疎水性パッチと会合することができ、ＨｂＳ分子を凝集させ、線維状沈殿物を形成させる。これらの凝集物は、次いで、ＲＢＣの異常または「鎌状化」を引き起こし、細胞の柔軟性の損失を生じる。鎌状化しているＲＢＣは、毛細血管床中に押し込められることがもはやできず、鎌状赤血球患者において血管閉塞性のクライシスを生じ得る。さらに、鎌状化したＲＢＣは、正常なＲＢＣよりも脆弱であり、溶血に向かう傾向があり、最終的に患者において貧血をもたらす。
サラセミアもまた、ヘモグロビンに関連する疾患であり、典型的には、グロビン鎖の低下した発現が関与する。これは、遺伝子の調節領域における突然変異を通じて、または低下した発現を生じるグロビンコード配列における突然変異から生じ得る。アルファサラセミアは、西アフリカおよび南アジアの家系の人々と関連し、マラリア抵抗性を付与し得る。ベータサラセミアは、典型的にはギリシャならびにトルコおよびイタリアの沿岸地域からの地中海家系の人々と関連する。サラセミアの処置は、通常、輸血および鉄キレート療法を含む。骨髄移植もまた、適切なドナーが同定できる場合には、重症サラセミアを有する人々の処置に使用されているが、この手順は、顕著なリスクを有し得る。
ベータグロビンをコードするヒトＨＢＢ遺伝子の修正は、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いて達成され得る。開裂の好ましい位置は、ＨＢＢ遺伝子配列を標的化することを含む（即ち、ｃｈｒ１１：５２４６６９６〜５２４８３０１またはその近傍）。鎌状アレルの遺伝子修正を達成するために、ＨＢＳアレル中のＨＢＢの領域を標的化することが、特に好ましい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９系の使用のためには、鎌状アレルの修正のための、ＰＡＭ部位が第１１染色体：５２４８１１０、５２４８１０６、５２４８１００、５２４８０９０、５２４８１２２、５２４８１１２上の位置またはその近傍にある配列を標的化することが、特に好ましい。ベータサラセミア（ｔｈａｌｅｓｓｅｍｉａ）と関連するベータ−グロビンアレルの遺伝子修正のために、多くの潜在的標的が存在する。ベータサラセミアと関連する１つの周知の突然変異は、いわゆるＩＶＳ１．１突然変異であり、好ましい標的化領域は、ＨＢＢ遺伝子配列のヌクレオチド１０９３〜１１９２周辺である。ＰＡＭ部位が第１１染色体：５２４８１７０〜５２４８１７１、５２４８１６８〜５２４８１６９、５２４８１６７〜５２４８１６８、５２４８１６４〜５２４８１６５、５２４８１６３〜５２４８１６４、５２４８１５５〜５２４８１５６および５２４８１４７〜５２４８１４８上の位置またはその近傍にある配列を標的化することが、最も好ましい。
提唱されたＳＣＤおよびベータサラセミアの両方の処置のための１つのアプローチは、異常な成人ヘモグロビンをＨｂＦに機能的に置き換えさせることを目的として、γ−グロビンの発現を増加させることである。上述のように、ヒドロキシウレアによるＳＣＤ患者の処置は、増加するγ−グロビン発現に対するその影響に一部起因して、成功すると考えられる。ＨｂＦ再活性化活性に影響を与えることが発見された化合物の第１の群は、細胞傷害性薬物であった。薬理学的操作によるガンマ−グロビンのｄｅ ｎｏｖｏ合成を引き起こす能力は、実験動物において５−アザシチジンを使用して最初に示された（ＤｅＳｉｍｏｎｅ（１９８２年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９巻（１４号）：４４２８〜３１頁）。引き続く研究により、５−アザシチジンが、β−サラセミアおよび鎌状赤血球症を有する患者においてＨｂＦを増加させる能力が確認された（Ｌｅｙら（１９８２年）Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３０７巻：１４６９〜１４７５頁およびＬｅｙら（１９８３年）Ｂｌｏｏｄ ６２巻：３７０〜３８０頁）。さらに、短鎖脂肪酸（例えば、ブチレートおよび誘導体）は、実験系において、ＨｂＦを増加させることが示されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｏｕｌａｋｉｓら（１９８８年）Ｂｌｏｏｄ ７２巻（６号）：１９６１〜１９６７頁）。上昇した量のＨｂＦが成人期において持続する（ＨＰＦＨヘテロ接合体において１０〜４０％（Ｔｈｅｉｎら（２００９年）Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ １８巻（Ｒ２号）：Ｒ２１６〜Ｒ２２３頁を参照））、「遺伝性高胎児ヘモグロビン血症」（ＨＰＦＨ）として公知の状態を有するヒト集団の区分が存在する。これは稀な状態であるが、任意の関連するベータグロビン異常の非存在下では、個体のヘモグロビンの１００％がＨｂＦである場合であっても、任意の顕著な臨床所見とは関連しない。ベータサラセミアを有する個体が、同時発生的ＨＰＦＨもまた有する場合、ＨｂＦの発現は、疾患の重症度を低下させ得る。さらに、鎌状赤血球症の天然過程の重症度は、患者毎に顕著に変動し得、この可変性は、一部、より軽度の疾患を有する一部の個体が、より高いレベルのＨｂＦを発現するという事実に端を発し得る。
ＨｂＦの発現を増加させるための１つのアプローチは、その産物がγ−グロビン発現の調節において役割を果たす遺伝子の同定を含む。１つの斯かる遺伝子は、リンパ球発生におけるその役割に起因して最初に同定された、ＢＣＬ１１Ａである。ＢＣＬ１１Ａは、γ−グロビン発現の段階特異的調節に関与すると考えられるジンクフィンガータンパク質をコードする。ＢＣＬ１１Ａは、成人赤血球前駆体細胞において発現され、その発現の下方調節は、γ−グロビン発現における増加をもたらす。Ｓａｎｋａｒａｎら（２００８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２巻、１８３９頁を参照されたい。このタンパク質は、β−グロビン遺伝子座と相互作用してその立体配置およびしたがって、異なる発生段階におけるその発現を変更するようである。さらに、別の調節タンパク質ＫＬＦ１（ｃｈｒ１９：１２９９５２３７〜１２９９８０１７においてコードされる）が、γ−グロビン発現の調節に関与するようである。ＫＬＦ１レベルは、ＢＣＬ１１Ａレベルと正比例し、両方とも、ＫＬＦ１遺伝子のヘテロ接合性突然変異を有するＨｂＦの持続性の発現を有するマルタ島の家族では、γ−グロビンレベルと反比例することが見出されている（Ｂｏｒｇら（２０１１年）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９６巻（５号）：６３５〜６３８頁）。ＫＬＦ１遺伝子産物は、ｉｎ ｖｉｖｏでＢＣＬ１１Ａ遺伝子と直接結合するようであり、したがって、その上方調節を担い得る（Ｂｏｒｇら（２０１０年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４２巻（９号）：８０１〜８０５頁；Ｂｉｅｋｅｒ（２０１０年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４２巻（９号）：７３３〜７３４頁；Ｚｈｏｕら（２０１０年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４２巻（９号）：７４２〜７４４頁を参照）。したがって、ＫＬＦ１がＢＣＬ１１Ａ発現を刺激する場合、ＢＣＬ１１Ａの作用は、γ−グロビンおよびＨｂＦの産生の抑制を生じる。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子へと標的化された阻害的ＲＮＡの使用が提唱されてきたが（例えば、米国特許出願公開第２０１１０１８２８６７号を参照）、この技術は、いくつかの潜在的な欠点を有する、即ち、完全なノックダウンが達成されない可能性があり、斯かるＲＮＡの送達に問題があり得、これらのＲＮＡが継続的に存在しなくてはならず、生涯にわたって複数回の処置を必要とする。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがＫＬＦ１遺伝子またはＢＣＬ１１ａ遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＳＣＤおよびヘモグロビン異常症を処置するために使用され得る。二本鎖開裂を介したＫＬＦ１遺伝子のノックアウトは、本発明のＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系を介して達成され得る。標的化のための好ましい部位は、遺伝子の所望のノックアウトを得るために、エクソン１、エクソン２およびエクソン３中に存在する。１２９９４２３９〜１２９９９０１７、１２９９７８６８〜１２９９８０１７および１２９９６１３１〜１２９９６９５６またはその近傍における第１９染色体上の領域が、特に好ましい。１２９９７８７７〜１２９９７９１２またはその近傍における第１９染色体の領域を標的化することが、特に好ましい。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
二本鎖開裂を介したＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックアウトは、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびｓｇＲＮＡを使用して達成され得る。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（ｃｈｒ２：６０６８４３２９〜６０７８０６３３）を標的化することが好ましい。エクソン配列（例えば、第２染色体：６０７８０３５１〜６０７８０６３３（エクソン１）、６０７７３１０６〜６０７７３４３５、特に６０７７３３６２〜６０７７３４００（エクソン２）、６０６９５８６７〜６０６９５９６８（エクソン３）、６０６８７８１７〜６０６８９５５９（エクソン４）、６０６７８３０２〜６０６７９８０１（エクソン５）またはその近傍）においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子を開裂させることもまた好ましい。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のエンハンサー配列を標的化することが、特に好ましい（Ｂａｕｅｒら（２０１３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２巻（６１５５号）：２５３〜７頁を参照）。したがって、第２染色体６０７２５３１７〜６０７２５６８２、６０７２２１２５〜６０７２２６７７および６０７１８０３１〜６０７１８３８２またはその近傍の配列を標的化することが、特に好ましい。
ガンマグロビンの発現を変更させるための別のアプローチは、ガンマグロビンをコードする遺伝子（ＨＢＧ１、第１１染色体：５２６８５０１〜５２７２０８７上に位置する）上の調節部位を標的化することである。第１１染色体：５２７１０８６〜５２７１０８７またはその近傍における転写開始部位を標的化することが好ましい。遺伝性高胎児ヘモグロビン血症を有する患者に起因して公知のいわゆる「ＨＰＦＨ」領域を標的化することが、特に好ましい（Ｔｈｅｉｎら（２００９年）Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ １８巻（Ｒ２号）：Ｒ２１６〜Ｒ２２３頁を参照）。したがって、第１１染色体：５２７２２８６〜５２７２２９０、５２７２２６３〜５２７２２６３および５２７２１９８〜５２７２２０５またはその近傍の配列を標的化することが、特に好ましい。
アルファサラセミアもまた、特にアジアにおけるヒト集団において蔓延しており、ある型のアルファグロビン異常は、ヒトにおいて最も一般的な遺伝性障害であると考えられる。世界の熱帯および亜熱帯地域では、アルファグロビン障害は、集団の８０〜９０％において見出される（ＨａｒｔｅｖｅｌｄおよびＨｉｇｇｓ（２０１０年）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５巻：１３頁を参照）。
ヒトは、第１６染色体上にタンデムで２コピーのアルファグロビン遺伝子（α１およびα２）を有しており、したがって、正常な二倍体細胞には、全て合わせて４コピーが存在する。α２遺伝子は通常、α１遺伝子よりも２〜３倍多くのα−グロビンｍＲＮＡを占める。これら２つの遺伝子のタンデムの組織化は、アルファサラセミア患者におけるアルファグロビン遺伝子の大きい欠失の高い蔓延と関連し得、ここで、一般に、非機能的なアルファグロビン遺伝子の数は、任意のアルファサラセミアの重症度と直接関連する（Ｃｈｕｉら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ １０１巻（３号）：７９１頁を参照）。１コピーの欠失は、かなり一般的なようであり（アフリカ系アメリカ人の３０％、ならびにサウジアラビア、インドおよびタイに生きる人々の６０〜８０％）、一般に、遺伝子検査が実施されない限り、個体において明白ではない。同じ染色体上（シス）であれ各染色体からの一方上（トランス）であれ、２コピーの欠失は、罹患患者に軽度の貧血を有させ得る。３つのα−グロビン遺伝子が欠失される場合、その結果、個体は、機能しているα−グロビン遺伝子を１つだけ有し、中程度の貧血が見出されるが、より重要なことに、重要なαグロビン対βグロビンの比が破壊される。４つのベータ−グロビン鎖を含むβ４四量体は、多くの場合、ＨｂＨとして公知の状態、１つだけの機能的アルファ−グロビン遺伝子を有する患者において観察される。これらのβ４四量体は、酸素と結合できるが、末梢に酸素を放出せず、ＨｂＨ疾患として公知の疾患を引き起こす。ＨｂＨ疾患を有する個体は、短縮された半減期を有して溶血を容易に受けるＲＢＣを有し、増加した貧血をもたらす。４つ全てのα−グロビン遺伝子の損失は、通常は子宮内で致死である。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがアルファグロビン遺伝子の調節領域を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてサラセミアを処置するために使用され得る。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
他の例示的な標的には、受容体、例えばウイルス受容体をコードする遺伝子が含まれる。ＨＩＶは、ヒトＴ細胞に感染する場合、細胞中への侵入を獲得するために、Ｔ細胞受容体ＣＤ４および２つの共受容体ケモカイン受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のうちの１つとの会合に依存する。特にホモ接合性の情況でＨＩＶ感染に対して抵抗性であるように見えるヒト集団において、天然のＣＣＲ５バリアント（「ＣＣＲ５−デルタ３２」）が同定された。したがって、ＨＩＶがＴ細胞に感染しないようにし、最終的に、ＨＩＶ感染患者においてＴ細胞死および減少した免疫機能をもたらさないようにするために、共受容体の一方または両方の破壊が、細胞をウイルスに対して抵抗性にするために達成され得る（米国特許第７，９５１，９２５号を参照）。現在、ＣＣＲ５遺伝子をノックアウトするためにｅｘ ｖｉｖｏでＣＣＲ５遺伝子座においてＨＩＶ患者のＴ細胞が編集される臨床治験が、進行中である。次いで、これらの細胞は、ＨＩＶを処置するために、患者中に再導入される。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがヒトＣＣＲ５遺伝子（ｃｈｒ３：４６４１１６３３〜４６４１７６９７）、特にエクソン領域（ｃｈｒ３：４６４１４３９４〜４６４１５４５２）またはその近傍を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＣＣＲ５アレルを破壊するために使用され得る。ノックアウトのためにＣＣＲ５遺伝子を標的化するための１つの特に好ましい領域は、デルタ−３２突然変異領域近く（ｃｈｒ３：４６４１４９２３〜４６４１５０２０またはその近傍）の領域である。別の特に好ましい領域は、ＣＣＲ５タンパク質の２番目の細胞外ループの一部をコードする、ｃｈｒ３：４６４１４５２２〜４６４１４６４３周辺にある。ＡＴＧタンパク質翻訳開始部位またはその近傍（ｃｈｒ３：４６４１４３４７〜４６４１４４６６またはその近傍）の領域もまた、ゲノム修飾、例えば、抗ＨＩＶ療法のための標的化された組込みによるＣＣＲ５のＮ末端へのＣ３４ペプチドの融合のために、特に好ましい。類似の研究が、ＣＸＣＲ４が選択的に破壊されるか、またはＴ細胞のＨＩＶ感染を予防するためにＣＣＲ５とタンデムで破壊される、ＣＸＣＲ４依存的ＨＩＶの動物モデルにおいて、進行中である（米国特許出願公開第２０１００２９１０４８号を参照）。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがヒトＣＸＣＲ４遺伝子（ｃｈｒ２：１３６８７１９１９〜１３６８７５７２５）、特にエクソン２領域（ｃｈｒ２：１３６８７２４３９〜１３６８７３４８２）またはその近傍、および小さいエクソン１を囲む領域（ｃｈｒ２：１３６８７５６１６〜１３６８７５６３０）を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＣＸＣＲ４アレルを破壊するために使用され得る。ノックアウトのためにＣＸＣＲ４遺伝子を標的化するための１つの好ましい領域は、ＣＣＲ５遺伝子中のデルタ−３２突然変異領域と類似したｃｈｒ２：１３６８７２８６３〜１３６８７２９８２またはその近傍の領域である。エクソン１のＡＴＧタンパク質翻訳開始部位に近いｃｈｒ２：１３６８７５５４０〜１３６８７５６８７またはその近傍の領域が特に好ましく、エクソン２のスプライシング部位に近いｃｈｒ２：１３６８７３３８９〜１３６８７３５５８またはその近傍の領域が、遺伝子修飾、例えば、抗ＨＩＶ療法のための標的化された組込みによるＣＸＣＲ４のＮ末端へのＣ３４ペプチドの融合に、特に好ましい。したがって、ｓｇＲＮＡは、これらの好ましい標的化領域のうちの１または複数中の配列が含まれるがこれらに限定されない、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４遺伝子座中のいずれかの場所の配列に結合するように設計され得る。
目的の別の受容体は、グルココルチコイド受容体である（米国特許出願公開第２００８０１８８０００号を参照）。特定の治療的処置におけるこの受容体のノックアウトは、グルココルチコイド受容体によって通常取り込まれるステロイドの使用を可能にする。したがって、この受容体は、第５染色体：１４２６４６２５４〜１４２７８３２５４またはその近傍を標的化するために本発明のｓｇＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって標的化され得る。例えば、第５染色体の１４２６４６２５５〜１４２７８３２５４（エクソン１）、１４２７８２７７６〜１４２７８３２５４（エクソン２）、１４２７７９２２１〜１４２７８０４１７、および特に有用な１４２６５７４９６〜１４２６５８９７６（エクソン３）、１４２６９３５６７〜１４２６９３７３３（エクソン４）、１４２６８９６６２〜１４２６８９７７８（エクソン５）、１４２６８００５０〜１４２６８０３２８（エクソン６）、１４２６７８２３３〜１４２６７８３７７（エクソン７）、１４２６７５０２５〜１４２６７５１５５（エクソン８）、１４２６６２１３３〜１４２６６２２９０（エクソン９）またはその近傍のエクソン配列を標的化することが、特に好ましい。
特異的ヌクレアーゼもまた、Ｔ細胞のＨＩＶ感染を予防するためにＨＩＶ受容体にペプチド融合インヒビターを挿入するように遺伝子操作され得（共同所有された米国特許出願公開第２０１２００９３７８７号を参照）、斯かるペプチド融合インヒビターの一例は、Ｃ３４またはフゼオンである。同様に、ＨＩＶは、ウイルスと闘うために細胞内のセーフハーバー遺伝子座中に抗ＨＩＶ導入遺伝子を挿入するために遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用することによって処置され得る。斯かる抗ＨＩＶ遺伝子の例は、ＨＩＶポリタンパク質を抑制するジンクフィンガー転写因子をコードする配列、ＨＩＶ受容体の発現を抑制するジンクフィンガー転写因子をコードする配列、ＣＣＲ５リボザイム、ＨＩＶポリタンパク質へと標的化されたｓｉＲＮＡ配列、Ｔｒｉｍ５アルファ（Ｔｒｉｍ５α）制限因子をコードする配列、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ制限因子をコードする配列、ＲｅｖＭ１０タンパク質をコードする配列、Ｃ４６をコードする配列、他の抗ＨＩＶ遺伝子、自殺カセットおよびそれらの組合せからなる群から選択され得る。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡが適切な抗ＨＩＶ導入遺伝子の組込みのためにＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４遺伝子を標的化する配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＨＩＶを処置または予防するために使用され得る。標的化に適切な配列のさらなる非限定的な例を、表１に示す。
本明細書に記載されるゲノム編集は、任意の内因性標的に対して実施され得る。ある特定の実施形態では、ゲノム修飾（例えば、導入遺伝子組込み）は、「セーフハーバー」遺伝子においてである。ゲノム中の特定の「セーフハーバー」位置は、そのセーフハーバー遺伝子座において見出されるプロモーターを利用し得るかまたは挿入前に導入遺伝子に融合された外因性プロモーターによる導入遺伝子の発現調節を可能にし得るかのいずれかの導入遺伝子組込みのために、利用され得る。ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃとしても公知）およびＣＣＲ５遺伝子、Ｒｏｓａ２６およびアルブミン（共同所有された米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号、第２００８０１５９９９６号および第２０１０００２１８２６４号ならびに米国特許出願第１３／６２４，１９３号および第１３／６２４，２１７号を参照）、ならびに植物におけるＺｐ１５（米国特許第８，３２９，９８６号を参照）を含む、いくつかの斯かる「セーフハーバー」遺伝子座が記載されている。外因性核酸または導入遺伝子の配列は、例えば、１もしくは複数の遺伝子またはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、ならびに１もしくは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、この外因性核酸配列は、１または複数のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。この外因性核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、第１９染色体、即ち、ｃｈｒ１９：５５６０２８４０〜５５６２４８５８上に存在するＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子）中に組み込まれるように、細胞中に導入される。外因性配列の組込みは、相同性依存的機構および相同性非依存的機構の両方を通じて進行し得る。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがセーフハーバー遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてセーフハーバー遺伝子座中に導入遺伝子を挿入するために使用され得る。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
上記のように、このセーフハーバーに特異的なヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）は、ＨＤＲ駆動性の過程またはＮＨＥＪ駆動性の過程のいずれかによって導入遺伝子構築物が挿入されるように、利用され得る。ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）は、ＨＰＲＴ１遺伝子（ｃｈｒＸ：１３３５９４１７５〜１３３６３４６９８）によってコードされる、プリン代謝に関与する酵素である。ＨＰＲＴ１は、Ｘ染色体上に位置し、したがって、雄性においては単一コピーで存在する。ＨＰＲＴ１は、５−ホスホリボシル １−ピロホスフェートから５−ホスホリボシル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｂｏｓｙｌ）基をプリンに転移させることによって、ヒポキサンチンのイノシン一リン酸への変換およびグアニンのグアノシン一リン酸への変換を触媒するトランスフェラーゼをコードする。この酵素は、新たなプリン合成における使用のために、分解されたＤＮＡからプリンをサルベージするように、主に機能する。６−ＴＧの存在下では、ＨＰＲＴは、細胞中のＤＮＡおよびＲＮＡ中への６−ＴＧの組込みを担う酵素であり、適切なポリヌクレオチドの合成および代謝の遮断を生じる。したがって、６−ＴＧは、機能的ＨＰＲＴ酵素を用いて細胞を殺滅するための選択剤として使用され得、さらに、６−ＴＧは、それを必要とする対象において軽度の免疫除去（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｏｎ）を引き起こすために与えられ得る。幹細胞移植片（例えば、造血幹細胞または前駆幹細胞）を受けている患者では、目的の導入遺伝子が、ＨＰＲＴ遺伝子座中に組み込まれ得、ＨＰＲＴ１遺伝子をノックアウトする。斯かる細胞集団は、６−ＴＧ毒性に対して抵抗性となる。したがって、導入遺伝子（＋）／ＨＰＲＴ１（−）細胞が患者に注入される場合、穏やかな過程の６−ＴＧは、細胞の生着を増加させ得、生着する細胞は、より大きいパーセンテージの導入遺伝子組込みを有することになる。
ＨＰＲＴは、導入遺伝子組込みのためのセーフハーバーとして伝統的に標的化されてきた（例えば、Ｊａｓｉｎら（１９９６年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３巻、８８０４頁を参照）。ＨＰＲＴは、低レベルで構成的に発現され、このＨＰＲＴ遺伝子の破壊は、６−ＴＧを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で選択され得る。しかし、ランダム組込みによるＨＰＲＴ遺伝子座中への組込みは、困難であり得、低頻度でのみ生じる。特異的ヌクレアーゼの使用は、ＨＰＲＴ遺伝子座の改善された標的化を可能にする。したがって、本発明の方法および組成物は、本発明の単一ガイドＲＮＡがセーフハーバー遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＨＰＲＴ遺伝子座中に導入遺伝子を挿入するために使用され得る。ＨＰＲＴ遺伝子（ｃｈｒＸ：１３３５９４１７５〜１３３６３４６９８）を標的化することが好ましい。イントロン１中の配列（Ｘ染色体：１３３５９７６６０〜１３３５９７６６２、１３３６０３５４４〜１３３６０３５４６および１３３６０４２８２〜１３３６０４２８４またはその近傍）を標的化することが、特に好ましい。エクソン３、特にｘ染色体：１３３６０９２４０〜１３３６０９２４２またはその近傍において、開裂することもまた好ましい。別の好ましい位置は、Ｘ染色体：１３３６２７５５２〜１３３６２７５５４またはその近傍において、酵素の活性ドメイン中に存在する。したがって、ｓｇＲＮＡは、これらの好ましい標的化領域のうちの１または複数中の配列が含まれるがこれらに限定されない、ＨＰＲＴ遺伝子座中のいずれかの場所の配列に結合するように設計され得る。標的化に適切な配列のさらなる非限定的な例を、表１に示す。
本発明の方法および組成物を用いて標的化する別の有用な遺伝子は、ＩＬ２受容体共通ガンマ鎖（ＩＬ２ＲＧ遺伝子によってコードされる、ｃｈｒＸ：７０３２７２５４〜７０３３１４８１またはその近傍）。ＩＬ２ＲＧタンパク質は、いくつかのサイトカイン受容体における共通受容体鎖であり、この遺伝子における突然変異は、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（「Ｘ−ＳＣＩＤ」）と関連する。したがって、遺伝子修正を容易にするために本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびｓｇＲＮＡを用いてこの遺伝子を標的化することは、Ｘ−ＳＣＩＤ患者にとって有益である。エクソン１の末端近く（Ｃｈｒｘ：７０３３１２７４〜７０３３１２７６またはその近傍）を標的化することが好ましい。ｘ染色体：７０３３１１９６〜７０３３１１９８もしくはその近傍のイントロン１、またはｘ染色体：７０３２９１５８〜７０３２９１６０もしくはその近傍のエクソン５を標的化することが、特に好ましい。
アルブミン遺伝子は、肝臓において高度に発現される。したがって、特異的ヌクレアーゼを使用した内因性アルブミン遺伝子座中への導入遺伝子の挿入は、その導入遺伝子によってコードされるタンパク質または遺伝子産物の高レベルの発現を生じ、これらはまた、血流中に分泌され得る。この導入遺伝子は、治療的利益を提供するものを含む、任意のタンパク質またはペプチドをコードし得る。例えば、この導入遺伝子は、血液の障害、例えば凝固障害、および種々の他の一遺伝子性疾患に関与するタンパク質をコードし得る。この導入遺伝子は、導入遺伝子の発現がアルブミンの発現制御エレメントによって制御されるように、内因性アルブミン遺伝子座中に挿入され得、導入遺伝子がコードするタンパク質の高濃度での肝臓特異的発現を生じる。発現され得るタンパク質には、凝固因子、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、ｖＷＦなど、抗体、リソソーム蓄積（ｌｙｏｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ）に関連するタンパク質、インスリン、アルファ１−アンチトリプシン、およびそうして発現された場合に利益を提供する実際に任意のペプチドまたはタンパク質が含まれ得る。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがアルブミン遺伝子（ｃｈｒ４：７４２６９９７２〜７４２８７１２９またはその近傍）を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてアルブミン遺伝子中に導入遺伝子を挿入するために使用され得る。好ましい標的は、例えば、ｃｈｒ：４ ７４２７００７３〜７４２７０８８３またはその近傍（エクソン１、特に好ましい、最も好ましくは第４染色体：７４２７０３８５〜７４２７０４８５）、７４２７０８４０〜７４２７２３９６（エクソン２、特に好ましくは第４染色体：７４２７０８４０〜７４２７２３９６またはその近傍）、７４２７２４２８〜７４２７４３６１（エクソン３）、７４２７４４７２〜７４２７５１２２（エクソン４）、７４２７５１５４〜７４２７６０７９（エクソン５）、７４２７６０７６〜７４２７７７６３（エクソン６）、７４２７７７９２〜７４２７９１８７（エクソン７）、７４２７９３０１〜７４２８０８０２（エクソン８）、７４２８０８３４〜７４２８２０２３（エクソン９）、７４２８２０２０〜７４２８３２９８（エクソン１０）、７４２８３３３６〜７４２８３８５５（エクソン１１）、７４２８３９７８〜７４２８５２７４（エクソン１２、特に好ましい）、７４２８５３０６〜７４２８６０２１（エクソン１３、特に好ましい）および７４２８５９８８〜７４２８６８５９（エクソン１４、特に好ましい）におけるエクソン配列中の標的である。したがって、ｓｇＲＮＡは、これらの好ましい標的化領域のうちの１または複数中の配列が含まれるがこれらに限定されない、アルブミン遺伝子座中のいずれかの場所の配列に結合するように設計され得る。標的化に適切な配列のさらなる非限定的な例を、表１に示す。
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、老廃脂質、糖タンパク質およびムコ多糖の分解に通常は関与する機能的な個々のリソソームタンパク質の欠如を特徴とする稀な代謝性一遺伝子性疾患の群である。これらの疾患は、細胞におけるこれらの化合物の集積を特徴とするが、それは、特異的酵素の誤機能に起因して、リサイクルのためにそれらをプロセシングすることができないからである。最も一般的な例は、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ欠損症−遺伝子名：ＧＢＡ）、ファブリー病（αガラクトシダーゼ欠損症−ＧＬＡ）、ハンター病（イズロン酸−２−スルファターゼ欠損症−ＩＤＳ）、ハーラー病（アルファ−Ｌイズロニダーゼ欠損症−ＩＤＵＡ）およびニーマン・ピック病（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠損症−ＳＭＰＤ１）である。全てを一緒にまとめた場合、ＬＳＤは、７０００の出生中約１人の、集団における発生率を有する。これらの疾患は、これらに罹患した者に対して破壊的な影響を有する。これらは、特徴的な顔面および身体の成長パターンを有し得、中程度から重度までの精神遅滞を有し得る乳児において、通常は最初に診断される。処置選択肢には、通常は大用量で静脈内注射を通じて失われている酵素が患者に与えられる、酵素補充療法（ＥＲＴ）が含まれる。斯かる処置は、これらの症状を処置するだけであって治癒的ではなく、したがって、患者は、その残りの人生にわたってこれらのタンパク質の反復投薬を与えられなければならず、潜在的に、注射されたタンパク質に対する中和抗体を発達させ得る。多くの場合、これらのタンパク質は、短い血清半減期を有し、したがって、患者は、このタンパク質の頻繁な注入にも耐えなければならない。例えば、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）製品（イミグルセラーゼ）を受けているゴーシェ病患者は、１週間に３回の注入を有さなければならない。酵素の産生および精製にも問題があり、したがって、これらの処置は、非常に費用がかかる（患者１人当たり年間＞１００，０００ドル）。したがって、本発明の特異的ヌクレアーゼは、発現およびＬＳＤの処置のために、アルブミンなどのセーフハーバー遺伝子座中に、リソソーム蓄積症に関与するタンパク質の失われている野生型バージョンをコードする遺伝子を挿入するために、使用され得る。
血友病Ｂは、関節および軟組織中への出血、ならびに外傷を受けているまたは手術を受けている任意の部位中への過剰な出血を特徴とする、血液凝固系の遺伝性障害である。血友病Ｂは、血友病Ａから臨床的に識別不可能であるが、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、血友病Ａにおいて欠損しているかまたは存在せず、第ＩＸ因子（ＦＩＸまたはＦ．ＩＸ）は、血友病Ｂを有する患者において欠損しているかまたは存在しない。第ＩＸ因子は、凝固系に関与するセリンプロテアーゼの１つをコードし、野生型第ＩＸ因子タンパク質の正常な循環レベルの３％の回復であっても、自発的出血を予防できることが示されている。
機能的ＦＩＸタンパク質をコードするプラスミドおよび他のベクター（例えば、ＡＡＶ）の導入を含む、肝臓指向性の遺伝子療法プロトコールおよび直接的筋内注射を含む遺伝子療法が、血友病Ｂの処置のために記載されてきた。例えば、米国特許第６，９３６，２４３号；Ｌｅｅら（２００４年）Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ７巻：１２２９〜１２３２頁；Ｇｒａｈａｍら（２００８年）Ｇｅｎｅｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｔｈｅｒ． ３巻：６〜９頁を参照されたい。しかし、これらのプロトコールでは、阻害的抗第ＩＸ因子（抗ＦＩＸ）抗体および送達ビヒクルに対する抗体の形成が、依然として、血友病ＢのためのＦＩＸタンパク質補充ベースの処置の主要な合併症である。したがって、内因性第ＶＩＩＩ因子もしくは第ＩＸ因子遺伝子を修正するためまたはセーフハーバー遺伝子座中にこの遺伝子の野生型コピーを導入するための、設計されたヌクレアーゼおよび関連技術の使用は、処置された患者において凝固活性を回復できる。第ＶＩＩＩ因子遺伝子のための好ましい標的化領域は、ｃｈｒＸ：１５４０６４０６４〜１５４２５０９９８に位置する遺伝子配列またはその近傍にある。第ＶＩＩＩ因子遺伝子を標的化するために特に好ましいのは、イントロン２２の領域であり、ここは、ｃｈｒＸ：１５４０９１５０３〜１５４１２４３５１またはその近傍に位置する、重症血友病Ａ患者におけるＦＶＩＩＩ突然変異の最大５０％を占める一般的な逆位事象の部位である。第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）遺伝子について、標的化に好ましいのは、ｃｈｒＸ：１３８，６１２，８９５〜１３８，６４５，６１７またはその近傍に位置する遺伝子配列である。例えば、ｃｈｒＸ：１３８６１３７６０〜１３８６１３８１６、ｃｈｒＸ：１３８６１８８３２〜１３８６１８８８７および／もしくはｃｈｒＸ：１３８６１３８１５〜１３８６１３８７２またはその近傍における、イントロン１中の領域中の標的が、特に好ましい。したがって、ｓｇＲＮＡは、これらの好ましい標的化領域のうちの１または複数中の配列が含まれるがこれらに限定されない、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の遺伝子座中のいずれかの場所の配列に結合するように設計され得る。
パーキンソン病（ＰＤ）は、世界中でおよそ４００万〜６００万人に罹患する神経変性疾患である。米国では、１００，０００人当たりおよそ１００〜２００人が、ＰＤを有する。ＰＤの有病率は、高齢集団において増加し、８０歳を超える人々のおよそ４％がこの疾患に罹患しているが（Ｄａｖｉｅ（２００８年）Ｂｒｉｔ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ ８６巻（１号）１０９頁）、患者の１０％は、４０歳未満である（Ｋｕｍａｒｉ（２００９年）ＦＥＢＳ Ｊ． ２７６巻（２２号）６４５５頁）。
多くの因子が、ＰＤの疾患発症および／または進行において役割を果たし得るようである。例えば、ロイシンリッチリピートキナーゼ２遺伝子（ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ８としても公知）における遺伝子突然変異は、ＰＤの家族性形態および孤発性形態の両方に関与することが同定されている。実際、研究により、ＬＲＲＫ２突然変異が、家族性ＰＤの５〜１３％の間、および孤発性ＰＤの１〜５％を担い得ることが示唆されている。このタンパク質自体は、以下の公知のドメインを含む大きい（＞２８０ｋＤ）マルチドメインタンパク質である：アルマジロ（ＡＲＭ）、アンキリン（ＡＮＫ）、ＬＲＲ、複合体タンパク質のＲａｓ（Ｒａｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＲＯＣ）、ＲＯＣのＣ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｆ ＲＯＣ）（ＣＯＲ）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼおよびＷＤ４０。したがって、ＬＲＲＫ２は、いくつかのタンパク質−タンパク質相互作用的ドメイン（ＡＲＭ／ＡＮＫ、ＬＲＲおよびＷＤ４０）を含み、これは、ＬＲＲＫ２が、タンパク質複合体形成において役割を果たすことを示唆する（Ｋｕｍａｒｉ、同書）。突然変異のいくつかのクラスターが、遺伝子のその長さにわたって同定されており、病理学的突然変異の大部分は、このタンパク質の酵素ドメインにおいてクラスター化する。
具体的には、ＬＲＲＫ２突然変異Ｇ２０１９Ｓは、いくつかの民族性においてＰＤにおいて重要な役割を果たすことが示唆されている。この突然変異は、常染色体優性であり、この突然変異についての生涯浸透率は、３１．８％であると推定されている。患者におけるこのミスセンス突然変異を担うＳＮＰは、ヒトゲノムにおいてｒｓ３４６３７５８４とアノテーションされ、ゲノムレベルではＧからＡへの置換（６０５５Ｇ＞Ａ）である。このＬＲＲＫ２突然変異は、Ｇ２０１９Ｓまたは６０５５Ｇ＞Ａのいずれかと呼ばれ得、ｃｈｒ１２：４０７３４２０２またはその近傍において見出される。このＧ２０１９Ｓ突然変異は、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性を増加させることが示されており、このタンパク質の活性化ドメインまたはタンパク質キナーゼ様ドメイン内に見出される（Ｌｕｚｏｎ−Ｔｏｒｏ（２００７年）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １６巻（１７号）２０３１頁）。したがって、特異的ヌクレアーゼが、ＰＤの処置のために、ＬＲＲＫ２遺伝子中の突然変異を修正するために使用され得る。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがＬＲＲＫ２遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＬＲＲＫ２遺伝子を修正するために使用され得る。ｃｈｒ１２：４０７３４２０２〜４０７３４２０２またはその近傍を標的化するように設計されたｓｇＲＮＡが、特に好ましい。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
三塩基リピート伸長障害は、１９９０年代初めに最初に特徴付けられた（Ｄｉ ＰｒｏｓｐｅｒｏおよびＦｉｓｃｈｂｅｃｋ（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６巻：７５６〜７６５頁を参照）。これらの障害は、３ヌクレオチドのセットの不安定なリピートの局在的伸長を含み、このリピートが存在する遺伝子の機能損失、毒性機能の獲得、またはそれら両方を生じ得る。三塩基リピートは、非コード遺伝子領域およびコード遺伝子領域を含む、遺伝子の任意の部分に位置し得る。コード領域内に位置するリピートは、典型的に、反復されたグルタミンコードトリプレット（ＣＡＧ）またはアラニンコードトリプレット（ＣＧＡ）のいずれかを含む。非コード配列内の伸長されたリピート領域は、遺伝子の異常な発現をもたらし得、コード領域内の伸長されたリピート（コドン反復障害としても公知）は、ミスフォールディングおよびタンパク質凝集を引き起こし得る。
ハンチントン舞踏病としても公知のハンチントン病（ＨＤ）は、運動障害、認知障害および精神医学的障害の、進行性の障害である。この疾患の発症の平均年齢は、３５〜４４歳であるが、症例の約１０％では、発症は２１歳前に生じ、この疾患の診断後の平均寿命は、１５〜１８年である。有病率は、西欧の家系の１００，０００人のうち約３〜７人である。この疾患は、内因性ハンチンチン（Ｈｕｎｔｉｎｔｉｎ）遺伝子（Ｈｔｔ、ｃｈｒ４：３０７６２３７〜３２４５６８７）中のＣＡＧリピート領域の伸長と関連する。正常なＨｔｔアレルは、１５〜２０のＣＡＧリピートを含むが、３５またはそれ超のリピートを含むアレルは、潜在的にＨＤ原因アレルとみなされ得、疾患を発達させるリスクを与える。３６〜３９リピートを含むアレルは、不完全に浸透性とみなされ、これらのアレルを有する個体は、この疾患を発達させてもさせなくてもよい（または、高齢期に症状を発達させ得る）が、４０またはそれ超のリピートを含むアレルは、完全に浸透性とみなされ、この多くのリピートを有するＨＤアレルを含む無症候性の個人は報告されていない。若年発症型ＨＤ（＜２１歳）を有する個体は、多くの場合、６０またはそれ超のＣＡＧリピートを有することが見出されている。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡが伸長されたＨｔｔ遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＨｔｔアレルを破壊するために使用され得る。３０７１６０４〜３０８１６６０またはその近傍で第４染色体を標的化することが、特に好ましい。本発明の方法および組成物は、抑制ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系融合タンパク質を使用して、突然変異体Ｈｔｔアレルを選択的に抑制するためにも使用され得る。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
網膜色素変性症（ＲＰ）とは、不治の盲目をもたらす、世界中で２００万人に罹患する遺伝性疾患の多様な群を指す。ＲＰは、遺伝性網膜変性の最も一般的な形態の１つであり、その突然変異がＲＰをもたらし得る複数の遺伝子が存在する。杆体光受容体において発現される４４の遺伝子において１００よりも多い突然変異がこれまでに同定されており、これは全ての型の網膜変性の１５％を占め、そのほとんどはミスセンス突然変異であり、通常は常染色体優性である。
ロドプシンは、光の知覚における最初の事象に関与する網膜の色素である。これは、網膜補因子に共有結合したタンパク質部分オプシンで構成される。ロドプシンは、ＲＨＯ遺伝子（ｃｈｒ３：１２９２４７４８２〜１２９２５４１８７）によってコードされ、このタンパク質は、およそ４０ｋＤの分子量を有し、杆体細胞の膜を貫通する。この網膜補因子は、光が網膜に入る際に光を吸収し、光励起され、分子立体配置における変化を受けて、オプシンから解離する。この変化は、最終的に、電気インパルスを視神経に沿って脳に送る過程を開始させる。ＲＰに関して、ヒトにおける全ての常染色体優性網膜色素変性症（ＡＤＲＰ）の３０％を占めるロドプシン遺伝子中の８０よりも多い突然変異が同定されている（Ｄｒｙｊａら（２０００年）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４１巻：３１２４〜３１２７頁）。ヒトロドプシン遺伝子中の３つの点突然変異（タンパク質配列においてＰ２３Ｈ、Ｑ６４ＸおよびＱ３４４Ｘをもたらす）が、ヒトにおいてＡＤＲＰを引き起こすことが公知である。例えば、Ｏｌｓｓｏｎら（１９９２年）Ｎｅｕｒｏｎ ９巻（５号）：８１５〜３０頁を参照されたい。Ｐ２３Ｈ突然変異は、米国において最も一般的なロドプシン突然変異である。タンパク質フォールディングに関する問題に起因して、Ｐ２３Ｈロドプシンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで網膜と部分的にのみ再構成し（Ｌｉｕら（１９９６年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３巻：４５５４〜４５５９頁）、トランスジェニックにおいて発現される突然変異体ロドプシンは、網膜変性を引き起こす（Ｇｏｔｏら（１９９５年）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３６巻：６２〜７１頁）。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがヒトＲＨＯ遺伝子（ｃｈｒ３：１２９２４７４８２〜１２９２５４１８７またはその近傍）を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＲＨＯアレルを破壊するために使用され得る。特定の位置でＲＨＯを標的化することは、遺伝子修正を容易にするために有用である。好ましい標的位置には、エクソン１（Ｐ２３ＨまたはＱ６４Ｘ突然変異と関連する配列を修正するために、ｃｈｒ３：１２９２４７５７７〜１２９２４７９３７またはその近傍）およびエクソン５（ｃｈｒ３：１２９２５１３７６〜１２９２５１６１５またはその近傍）が含まれる。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
嚢胞性線維症（ＣＦ）およびサーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）欠損症などの遺伝性障害を含む肺疾患は、小児集団において、いまだ問題となっている。ＳＰ−Ｂ欠損症は、タンパク質および脂肪分子が肺の遠位部分に蓄積し、呼吸に影響を与える稀な肺疾患である。この疾患は、出生後の肺機能およびホメオスタシスにとって不可欠な両親媒性サーファクタントタンパク質である肺関連サーファクタントＢタンパク質（ＳＰＢ）をコードするＳＦＴＰＢ遺伝子（ｃｈｒ２：８５８８４４４０〜８５８９５３７４またはその近傍に位置する）における欠損に主に起因した、肺サーファクタントタンパク質Ｂの欠損によって引き起こされる。ＳＰ−Ｂ欠損症における最も一般的な突然変異は、「ＧＡＡ」へと変換されるｍＲＮＡ中の１３１位におけるヌクレオチド「Ｃ」（ゲノム配列中、これは、３７５Ｃ−ＧＡＡに対応し、エクソン４中に位置する）をもたらす、「１２１ｉｎｓ２」と称される突然変異である。したがって、本発明の方法および組成物は、ｃｈｒ２：８５８８４４４０〜８５８９５３７４またはその近傍のＳＦＴＰＢ遺伝子、最も好ましくは、エクソン４（ｃｈｒ２：８５８９３７４０〜８５８９３８６５またはその近傍）へと、本発明のｓｇＲＮＡを使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を標的化するために使用され得る。
ＣＦは、１５００〜４０００の生児出生中１人に罹患する常染色体劣性障害であり、最も一般的な遺伝性小児障害の１つである。ＣＦにおける主な欠損は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子（ｃｈｒ７：１１７１２００１７〜１１７３０８７１８に位置する）によってコードされるクロライドチャネルタンパク質によって輸送される上皮クロライドの調節における欠損である。例えば、Ｋｅｒｅｍら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５巻：１０７３〜１０８０頁；Ｋｒｅｄａら（２００５年）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １６巻：２１５４〜２１６７頁を参照されたい。ＣＦ患者において観察される突然変異の約７０％は、ＣＦＴＲのヌクレオチド配列における３塩基対の欠失から生じ、このタンパク質中の５０８位に位置するアミノ酸フェニルアラニンの損失を生じる（ΔＦ５０８と呼ばれる突然変異、（エクソン１１中に位置する）。野生型ゲノムでは、アミノ酸５０７は、イソロイシンであり、Ｇが遺伝子中のヌクレオチド１６５２であるコドンＴＡＧによってコードされる。アミノ酸５０８は、ＡＡＡによってコードされるフェニルアラニンである。Δ５０８突然変異では、５０７コドンからのＧは、５０８コドンの最初の２つのＡと共に欠失され、その結果、この突然変異は、欠失された５０７〜５０８コード位置において配列ＴＡＡを有する。ＴＡＡは、イソロイシンもまたコードするが、野生型５０８位におけるフェニルアラニンは損失される。ΔＩ５０７欠失について、５０６位または５０７位のいずれかのイソロイシンが欠失される。この突然変異について、１６４８〜１６５０もしくは１６５１〜１６５３におけるヌクレオチドが損失され、またはそのいくつかの組合せは、得られたタンパク質中にイソロイシンを１つだけ生じる。複合（ヘテロ接合性）突然変異（ΔＦ５０８およびΔＩ５０７）もまた報告されている。例えば、Ｏｒｏｚｃｏら（１９９４年）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ． ５１巻（２号）：１３７〜９頁を参照されたい。複合ヘテロ接合性ΔＩ５０７／ΔＦ５０８またはホモ接合性ΔＦ５０８／ΔＦ５０８のいずれかのＣＦ患者は、完全にグリコシル化されたＣＦＴＲタンパク質を発現できず、部分的にグリコシル化されたタンパク質は、ＣＦＴＲ機能に必要とされるようには細胞表面上で発現されない（例えば、Ｋｒｅｄａら（２００５年）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １６巻：２１５４〜２１６７頁；Ｃｈｅｎｇら（１９９０年）Ｃｅｌｌ ６３巻：８２７〜８３４頁を参照）。１つのアレルのみにおいてΔＩ５０７またはΔＦ５０８ ＣＦＴＲ突然変異のいずれかを有する個体（即ち、ｗｔ／ΔＩ５０７またはｗｔ／ΔＦ５０８）は、ＣＦキャリアであり、肺細胞機能における欠損を示さない。例えば、Ｋｅｒｅｍら（１９９０年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７巻：８４４７〜８４５１頁を参照されたい。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがヒトＣＦＴＲ遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＣＦＴＲアレルを破壊または修正するために使用され得る。ｃｈｒ７：１１７２２７７９３〜１１７２２７８８７またはその近傍が、標的化に特に好ましい。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
筋ジストロフィーは、筋肉群の進行性の変性および衰弱を特徴とする疾患である。１つの周知の筋ジストロフィーは、３５００人の少年のうち１人に罹患するＸ連鎖疾患である、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。これは、個々の筋肉細胞におけるタンパク質ジストロフィンの欠如によって引き起こされ、症状は、小児がおよそ３歳のときに最初に出現し、疾患の重症度に依存して、患者が２０代になったときに死が生じ得る。ジストロフィン、ＤＭＤをコードする遺伝子（ｃｈｒＸ：３１１３７３４５〜３３２２９６７３またはその近傍に位置する）は、非常に大きく、１４ｋｂのｍＲＮＡをコードする７９個のエクソンを含む２．４メガベースのＤＮＡをカバーする。機能的ジストロフィンを欠く患者では、およそ４０％が、コード配列中のフレームシフトを引き起こす点突然変異を有し、その結果、翻訳の間に、未成熟な停止が起こると、トランケートされたタンパク質または非機能的タンパク質の産生を生じることになる。残りの６０％は、フレームの変更も生じ、同様に非機能的タンパク質の産生を生じる、大きな挿入または欠失を有する（ＮｏｗａｋおよびＤａｖｉｅｓ（２００４年）ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５巻（９号）：８７２〜８７６頁）。非機能的ジストロフィンを有する患者は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）としても公知の最も重症な疾患を有する。その突然変異が、野生型と比較して機能の低いジストロフィンタンパク質を生じる、ジストロフィンの内部部分をコードする領域の遺伝子欠失を特徴とする他の患者は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）と呼ばれるあまり重症でない疾患を有し得る。ＢＭＤ患者は、５０代まで生存することが知られている。ＤＭＤ遺伝子を標的化することは、点突然変異の遺伝子修正のためまたはｍＲＮＡ転写物のスプライシングパターンを変化させるために有用であり得、細胞に機能的ジストロフィンタンパク質を産生させる。したがって、ｓｇＲＮＡは、ｃｈｒＸ：３１１３７３４５〜３３２２９６７３またはその近傍において、ＤＭＤ遺伝子座中のいずれかの場所の配列に結合するように設計され得る。養子免疫治療は、腫瘍抗原に対し高アビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）ＴＣＲを保有するＣＴＬのある特定の亜集団の高度に特異的なＴ細胞刺激の達成と、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるその刺激および増大と、続く患者へのその導入を実施することである。養子免疫治療は、腫瘍特異的細胞の注入前に患者から天然のリンパ球を取り出す場合に特に有効である。この種類の治療法を支える考えとは、高アビディティーＣＴＬの導入が成功すれば、腫瘍が排除されると、これらの細胞の一部が、がんが再出現する場合に備えてメモリーＴ細胞として残り、患者中に存続することである。しかし、宿主Ｔ細胞に何らかのＴＣＲ導入遺伝子を移入すると、それに伴いほとんどの遺伝子移入方法に関連する懸念、即ち、ＴＣＲ導入遺伝子発現カセットの調節されない予測不可能なゲノム挿入がしばしば低レベルでも発生する。このような所望の導入遺伝子の十分に制御されない挿入は、周囲の遺伝子における導入遺伝子の効果と共に、隣接遺伝子からの効果による導入遺伝子のサイレンシングを引き起こす可能性がある。加えて、導入されたＴＣＲ導入遺伝子と共に遺伝子操作されたＴ細胞において共発現される内因性ＴＣＲ遺伝子は、内因性ＴＣＲにより認識される抗原によるＴ細胞の不要な刺激や、新規認識特性を有する新規ＴＣＲ複合体を生じる内因性ＴＣＲサブユニットとＴＣＲ導入遺伝子との誤対合による、意図されない抗原によるＴ細胞の不要な刺激を引き起こし得る、あるいは内因性ＴＣＲタンパク質と導入遺伝子コードＴＣＲサブユニットとのヘテロ二量体形成による不活性ＴＣＲの生成による目的の抗原に対する最適以下の刺激をもたらし得る。実際には、内因性および外因性の鎖の誤対合による自己反応性ＴＣＲの形成に起因する重篤な自己免疫性毒性のリスクは、近年、マウスモデル（Ｂｅｎｄｌｅら（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６巻：５６５〜５７０頁）およびヒト細胞（ｖａｎ Ｌｏｅｎｅｎら（２０１０年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０７巻：１０９７２〜７頁）で取り上げられている。その上、腫瘍特異的ＴＣＲは、細胞表面における複合体の発現に必要とされるＣＤ３分子をめぐって内因性および誤対合したＴＣＲと競合するため、細胞表面に最適以下のレベルで発現され得る。低いＴＣＲ発現は、トランスジェニックＴ細胞のアビディティーおよび有効性に影響を与える。Ｔ細胞中への導入のための高親和性ＴＣＲを作製するために使用され得る標的の例は、ＷＴ１およびＮＹＥｓｏである。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがヒトＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣまたはＴＣＲＡ、ｃｈｒ６：４２８８３７２７〜４２８９３５７５またはその近傍に位置する）またはベータ（ＴＲＢＣまたはＴＣＲＢ、ｃｈｒ７：１４２１９７５７２〜１４２１９８０５５またはその近傍に位置する）遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いて内因性ＴＣＲ遺伝子を破壊または修正するために使用され得る。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
プログラム死受容体（ＰＤ１またはＰＤ−１、ＰＤＣＤ１としても公知）は、Ｔ細胞活性化と慢性抗原に応答したＴ細胞寛容との間のバランスを調節することに関与することが示されている。Ｔ細胞活性化に際して、ＰＤ１発現が、Ｔ細胞において誘導される。ＰＤ１受容体に対するリガンドは、ＰＤ１リガンド（Ｂ７−Ｈ１およびＣＤ２７２としても公知のＰＤＬ１）およびＰＤＬ２（Ｂ７−ＤＣおよびＣＤ２７３としても公知）であり、通常は、抗原提示細胞および末梢において発現される。ＰＤ１−ＰＤＬ（ＰＤ１リガンド）カップリングは、Ｔ細胞の不活性化を引き起こし、Ｔ細胞寛容の誘導に関与する（Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２年）Ｎａｔ Ｒｅｖ １２巻：２５２頁を参照）。ＨＩＶ１感染の間に、ＰＤ１の発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において増加することが見出されており、ＰＤＬ１発現は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で増加され、Ｔ細胞阻害とＴ細胞刺激との間のバランスをＴ細胞阻害に向けて傾ける（Ｆｒｅｅｍａｎら（２００６年）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０３巻（１０号）：２２２３〜２２２７頁を参照）。ＰＤ１の上方調節は、Ｔ細胞機能不全がＨＩＶ感染の場合と同様の慢性抗原曝露の存在下で観察される場合、Ｔ細胞疲弊（重要なエフェクター機能の進行性の損失として規定される）に何らかの形で縛られると考えられる。ＰＤ１の上方調節は、慢性ウイルス感染の間にこれらの同じセットの細胞における増加したアポトーシスとも関連し得る（Ｐｅｔｒｏｖａｓら（２００９年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８３巻（２号）：１１２０〜３２頁を参照）。ＰＤ１は、免疫監視からの腫瘍特異的逃避においても役割を果たし得る。ＰＤ１は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の両方において、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）において高度に発現されることが実証されている。ＰＤ１はまた、メラノーマ浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）において上方調節される（Ｄｏｔｔｉ（２００９年）Ｂｌｏｏｄ １１４巻（８号）：１４５７〜５８頁を参照）。腫瘍は、ＰＤ１リガンドＰＤ−Ｌ１を発現することが見出されており、または、より稀には、ＣＴＬにおけるＰＤ１の上方調節と組み合わせた場合にＴ細胞機能性における損失およびＣＴＬが有効な抗腫瘍応答を媒介できないことにおける寄与因子であり得るＰＤ１リガンドＰＤＬ２を発現することが見出されている。研究者は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に慢性に感染したマウスでは、抗ＰＤ１抗体の投与がＰＤ１−ＰＤＬ相互作用を遮断し、あるＴ細胞機能性（増殖およびサイトカイン分泌）を回復でき、ウイルス負荷における減少をもたらしたことを示している（Ｂａｒｂｅｒら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ ４３９巻（９号）：６８２〜６８７頁）。さらに、完全ヒトＰＤ−１特異的ＩｇＧ４モノクローナル抗体が、種々の疾患背景（進行メラノーマ、腎細胞癌、非小細胞肺がん、結腸直腸がんまたは前立腺がん）を有する患者に対して、腫瘍学設定においてクリニックで検査されてきた。臨床活性は、メラノーマ、腎細胞がんおよび非小細胞肺がんの患者において観察され、予備的データは、処置前の腫瘍によるＰＤ１リガンド発現の検出が、臨床成績と相関することを示唆した（Ｗｏｌｆｅ（２０１２年）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｒｅｖｉｅｗ、７月；およびＰａｒｄｏｌｌ、同書を参照）。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがヒトＰＤ１遺伝子（ｃｈｒ２：２４２７９２０３３〜２４２８０１０５８）を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＰＤ１アレルを破壊するために使用され得る。ノックアウトのためにＰＤ１遺伝子を標的化するための１つの好ましい領域は、そのＡＴＧタンパク質翻訳開始部位に近い領域またはその近傍にある。これは、ＰＤ１遺伝子のヌクレオチドｃｈｒ２：２４２８００９８１〜２４２８００９８２に対応する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９についてのＰＡＭ位置が、２４２８００９８０位〜２４２８００９８１位、２４２８００９７５位〜２４２８００９７６位、２４２８００９７１位〜２４２８００９７２位、２４２８００９７０位〜２４２８００９７１位、２４２８００９６７位〜２４２８００９６８位および２４２８００９６５位〜２４２８００９６６位において第２染色体またはその近傍に位置する、ＰＤ１遺伝子の標的部位が、特に好ましい。別の特に好ましい標的化位置は、ＰＤ−１リガンド結合ドメイン（第２染色体、ヌクレオチド２４２７９４８３４〜２４２７９４８３５および２４２７９４８２８〜２４２７９４８２９）の近くの領域周辺である。標的化のための別の好ましい領域は、免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（例えば、第２染色体２４２７９３３４９〜２４２７９３３５０、２４２７９３３３８〜２４２７９３３３９、２４２７９３３３０〜２４２７９３３３１または２４２７９３３２７〜２４２７９３３２８）の近くの領域またはその近傍にある。この領域中の突然変異は、ＰＤ１機能を無効にする。第２染色体：２４２８００９５３〜２４２８００９７９、２４２７９４９７６〜２４２７９５００５、２４２７９４４１６〜２４２７９４４４４および２４２７９３４０５〜２４２７９３４３３またはその近傍の位置におけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質のための標的部位が、特に好ましい。第ＶＩＩＩ因子遺伝子のための好ましい標的化領域は、ｃｈｒＸ：１５４０６４０６４〜１５４２５０９９８に位置する遺伝子配列またはその近傍にある。第ＶＩＩＩ因子遺伝子を標的化するために特に好ましいのは、イントロン２２の領域であり、ここは、ｃｈｒＸ：１５４０９１５０３〜１５４１２４３５１またはその近傍に位置する、重症血友病Ａ患者におけるＦＶＩＩＩ突然変異の最大５０％を占める一般的な逆位事象の部位である。第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）遺伝子について、標的化のために好ましいのは、ｃｈｒＸ：１３８，６１２，８９５〜１３８，６４５，６１７またはその近傍に位置する遺伝子配列である。例えば、ｃｈｒＸ：１３８６１３７６０〜１３８６１３８１６、ｃｈｒＸ：１３８６１８８３２〜１３８６１８８８７および／またはｃｈｒＸ：１３８６１３８１５〜１３８６１３８７２またはその近傍において、イントロン１中の領域中の標的が、特に好ましい。したがって、ｓｇＲＮＡは、これらの好ましい標的化領域のうちの１または複数中の配列が含まれるがこれらに限定されない、ＰＤ１遺伝子座中のいずれかの場所の配列に結合するように設計され得る。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
Ｔ細胞活性の別のモジュレーターは、ＣＴＬＡ−４受容体である。Ｔ細胞受容体ＣＤ２８と同様に、ＣＴＬＡ−４は、抗原提示細胞上でＣＤ８０およびＣＤ８６リガンドと相互作用する。しかし、これらの抗原とＣＤ２８との相互作用は、Ｔ細胞の活性化を引き起こし、ＣＤ８０またはＣＤ８６とＣＴＬＡ−４との相互作用は、ＩＬ−２分泌およびＩＬ−２受容体発現を妨害することによって、ならびに重要な細胞周期構成成分の発現を阻害することによって、Ｔ細胞活性化と拮抗する。ＣＴＬＡ−４は、ほとんどの休止Ｔ細胞の表面上では見出されないが、Ｔ細胞活性化後に一過的に上方調節される。したがって、ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性を活性化することおよび阻害することのバランスにも関与する（Ａｔｔｉａら（２００５年）Ｊ ＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．２３巻（２５号）：６０４３〜６０５３頁を参照）。転移性メラノーマを有する対象におけるＣＴＬＡ４抗体の使用を含む初期の臨床研究は、疾患の退縮を見出したが（Ａｔｔｉａ、同書）、後の研究は、抗体で処置した対象が、自己寛容の中断に関連すると思われる療法の副作用（免疫関連有害事象：発疹、大腸炎、肝炎等）を示すことを見出した。このデータの分析により、抗ＣＴＬＡ４抗体の結果としてのより高い腫瘍退縮は、免疫関連有害事象のより高い重症度と直接相関することが示唆された（Ｗｅｂｅｒ（２００７年）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １２巻（７号）：８６４〜８７２頁）。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがｃｈｒ２：２０４７３２５１１〜２０４７３８６８３またはその近傍に位置するヒトＣＴＬＡ−４遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＣＴＬＡ−４遺伝子を破壊するために使用され得る。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞表面上に発現された特異的分子標的に免疫細胞を標的化するように設計された分子である。その最も基本的な形態では、これらは、細胞の内側のシグナル伝達経路に細胞の外側で発現される特異性ドメインを結びつける、細胞に導入される受容体であり、その結果、特異性ドメインがその標的と相互作用する場合、この細胞は活性化される。多くの場合、ＣＡＲは、特異性ドメイン、例えばｓｃＦｖまたはある型の受容体がＴＣＲのシグナル伝達ドメインに融合されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のバリアントから構成される。次いで、これらの構築物は、標的抗原を発現する細胞の存在下でＴ細胞が活性化されるようにＴ細胞中に導入され、非ＭＨＣ依存的様式で、活性化されたＴ細胞による標的化された細胞に対する攻撃を生じる（Ｃｈｉｃａｙｂａｍら（２０１１年）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０巻：２９４〜３１１頁を参照）。現在、種々の腫瘍抗原を標的化する腫瘍特異的ＣＡＲが、種々の異なるがんの処置のためにクリニックにおいて検査されている。標的化されているこれらのがんおよびそれらの抗原の例には、濾胞性リンパ腫（ＣＤ２０またはＧＤ２）、神経芽腫（ＣＤ１７１）、非ホジキンリンパ腫（ＣＤ２０）、リンパ腫（ＣＤ１９）、膠芽腫（ＩＬ１３Ｒα２）、慢性リンパ性白血病またはＣＬＬおよび急性リンパ性白血病またはＡＬＬ（共にＣＤ１９）が含まれる。ウイルス特異的ＣＡＲは、ＨＩＶなどのウイルスを有する細胞を攻撃するために開発されてきた。例えば、臨床治験は、ＨＩＶの処置のために、Ｇｐ１００に特異的なＣＡＲを使用して開始された（Ｃｈｉｃａｙｂａｍ、同書）。
Ｔ細胞の注意をがん細胞などの特定の細胞へと再び向けさせる技術を開発することは有用であるが、これらの標的細胞は、多くの場合、ＰＤ−１リガンドを発現するという問題が残っている。したがって、ＰＤ１−ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２相互作用は、Ｔ細胞を不活性化することならびにアポトーシスおよび細胞疲弊を増加させることによって、ＣＡＲによって標的化されたＴ細胞による作用を腫瘍が逃れることを可能にする。さらに、ＰＤ１−ＰＤＬ相互作用は、ＨＩＶに対するＴ細胞応答の抑制にも関与し、このとき、ＰＤ１およびＰＤＬの両方の発現の増加は、Ｔ細胞疲弊をもたらす。活性化したＴ細胞上でのＣＴＬＡ−４発現の誘導は、免疫応答を減衰させるための最初のステップの１つでもあり、したがって、ＣＡＲを装備したＴ細胞は、Ｔ細胞活性化とＴ細胞阻害とのバランスをとるように設計されたこの系の関与に起因して、不活性になり得る。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣＡＲを含むＴ細胞においてＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ１をノックアウトするために、上記本発明のｓｇＲＮＡと共に使用され得る。
ＭＨＣ抗原は、移植反応において主要な役割を果たすタンパク質として最初に特徴付けられた。拒絶は、移植された組織の表面上の組織適合抗原と反応するＴ細胞によって媒介され、これらの抗原の最も大きな群は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）である。ＭＨＣタンパク質は、２つのクラスＩおよびＩＩのものである。クラスＩ ＭＨＣタンパク質は、２つのタンパク質、α鎖およびβ２ミクログロブリン鎖のヘテロ二量体であり、このα鎖は、ＭＨＣ１遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質であり、β２ミクログロブリン鎖は、ＭＨＣ遺伝子クラスター内には存在しない遺伝子によってコードされる小さい細胞外タンパク質である。このα鎖は、３つの球状ドメインへとフォールディングし、β２ミクログロブリン鎖が会合した場合、この球状構造複合体は、抗体複合体と類似する。外来ペプチドは、最も可変性でもある２つの最もＮ末端側のドメイン上に提示される。クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質もまたヘテロ二量体であるが、このヘテロ二量体は、ＭＨＣ複合体内の遺伝子によってコードされる２つの膜貫通タンパク質を含む。クラスＩ ＭＨＣ：抗原複合体は、細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用するが、クラスＩＩ ＭＨＣは、ヘルパーＴ細胞に対して抗原を提示する。さらに、クラスＩ ＭＨＣタンパク質は、ほぼ全ての有核細胞および血小板（およびマウスでは赤血球）において発現される傾向があるが、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質は、より選択的に発現される。典型的には、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質は、Ｂ細胞、一部のマクロファージおよび単球、ランゲルハンス細胞、ならびに樹状細胞上で発現される。
ヒトにおけるクラスＩ ＨＬＡ遺伝子クラスターは、３つの主要な遺伝子座Ｂ、ＣおよびＡ、ならびにいくつかのマイナーな遺伝子座を含む。ＨＬＡ−Ａ、Ｈ：Ａ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃは、ＨＬＡクラスＩ重鎖パラログである。クラスＩ分子は、ＭＨＣアルファ重鎖（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃ）および軽鎖（ベータ−２ミクログロブリン）からなるヘテロ二量体である。重鎖は、膜アンカーされている。クラスＩ分子は、小胞体内腔由来のペプチドを提示することによって、免疫系において中心的役割を果たす。重鎖は、およそ４５ｋＤａであり、その遺伝子は８つのエクソンを含む。エクソン１は、リーダーペプチドをコードし、エクソン２および３は、アルファ１ドメインおよびアルファ２ドメインをコードし、これらは共にペプチドに結合し、エクソン４は、アルファ３ドメインをコードし、エクソン５は、膜貫通領域をコードし、エクソン６および７は、細胞質側末端をコードする。エクソン２およびエクソン３内の多型は、各クラスＩ分子のペプチド結合特異性を担う。ＨＬＡ−Ａ、ＢまたはＣにおいてｓｇＲＮＡを標的化するために好ましい領域は、遺伝子配列内に存在する（例えば、ＨＬＡ−Ａについてはｃｈｒ６：２９９１０２４７〜２９９１２８６８、ＨＬＡ−Ｂについてはｃｈｒ６：３１２３６５２６〜３１２３９９１３、およびＨＬＡ−Ｃについてはｃｈｒ６：３１２３６５２６〜３１２３９１２５）。リーダー配列（例えば、ＨＬＡ−Ｂについてはｃｈｒ６：３１３２４９３６〜３１３２４９８９またはその近傍）、アルファ１ドメインおよびアルファ２ドメイン（例えば、ＨＬＡ−Ｂについては、それぞれ、ｃｈｒ６：３１３２４８６３〜３１３２４９３５およびｃｈｒ６：３１３２４７３５〜３１３２４８６２またはその近傍）ならびにアルファ３ドメイン（例えば、ＨＬＡ−Ｂについてはｃｈｒ６：３１３２４４６５〜３１３２４７３４またはその近傍）内の配列を標的化することが、特に好ましい。
クラスＩＩ ＨＬＡクラスターは、３つの主要な遺伝子座ＤＰ、ＤＱおよびＤＲもまた含み、クラスＩおよびクラスＩＩの両方の遺伝子クラスターは、集団内のクラスＩ遺伝子およびクラスＩＩ遺伝子の両方のいくつかの異なるアレルが存在するという点で、多型である。ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１およびＨＬＡ−ＤＲＡは、ＨＬＡクラスＩＩアルファ鎖パラログに属する。このクラスＩＩ分子は、両方とも膜アンカーされたアルファ（ＤＰＡ）鎖およびベータ（ＤＰＢ）鎖からなるヘテロ二量体である。これらは、細胞外タンパク質由来のペプチドを提示することによって、免疫系において中心的な役割を果たす。クラスＩＩ分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ：Ｂリンパ球、樹状細胞、マクロファージ）において発現される。アルファ鎖は、およそ３３〜３５ｋＤａであり、それらの遺伝子（ＨＬＡ−ＤＲＡについてはｃｈｒ６＿ｓｓｔｏ＿ｈａｐ７：３，７５４，２８３〜３，７５９，４９３、ＨＬＡ−ＤＱについてはｃｈｒ６：３２６０５１８３〜３２６１１４２９、およびＨＬＡ−ＤＰＡについてはｃｈｒ６：３３０３２３４６〜３３０４８５５５）は、５つのエクソンを含む。エクソン１（例えば、ＨＬＡ−ＤＰＡ１についてはｃｈｒ６：３３０４１２４８〜３３０４１３４７またはその近傍）は、リーダーペプチドをコードし、エクソン２および３（例えば、ＨＬＡ−ＤＰＡ１についてはｃｈｒ６：３３０３７４１８〜３３０３７６６３およびｃｈｒ６：３３０３６７９６〜３３０３７０７７またはその近傍）は、２つの細胞外ドメインをコードし、エクソン４（例えば、ＨＬＡ−ＤＰＡ１についてはｈｒ６：３３０３６４２７〜３３０３６５８１またはその近傍）は、膜貫通ドメインおよび細胞質側末端をコードする。したがって、本発明のＣＲＩＰＳＲ−Ｃａｓ系を用いて標的化するために特に好ましい領域は、エクソン１、２および３内に存在する。ＤＰ分子内で、アルファ鎖およびベータ鎖の両方が、ペプチド結合特異性を特定する多型を含み、最大４つの異なる分子を生じる。したがって、ｓｇＲＮＡは、これらの好ましい標的化領域のうちの１または複数中の配列が含まれるがこれらに限定されない、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＱ１またはＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子座中のいずれかの場所の配列に結合するように設計され得る。
ＨＬＡ機能において同様に役割を果たすいくつかのアクセサリータンパク質もまた存在する。Ｔａｐ１（ｃｈｒ６：３２８１２９８６〜３２８２１７４８においてコードされる）サブユニットおよびＴａｐ２（ｃｈｒ６：３２７９３１８７〜３２８０６５４７においてコードされる）サブユニットは、クラスＩ ＨＬＡ複合体上にペプチド抗原を負荷する際に不可欠なＴＡＰ輸送体複合体の一部であり、ＬＭＰ２およびＬＭＰ７プロテアソームサブユニットは、ＨＬＡ上でのディスプレイのためのペプチドへの抗原の、タンパク質分解性分解において役割を果たす。ＬＭＰ７（ｃｈｒ６＿ｄｂｂ＿ｈａｐ３：４０８９８７２〜４０９３０５７）における低下は、おそらくは安定化の欠如を介して、細胞表面におけるＭＨＣクラスＩの量を低下させることが示されている（Ｆｅｈｌｉｎｇら（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５巻：１２３４〜１２３７頁を参照）。ＴＡＰおよびＬＭＰに加えて、タパシン遺伝子（ｃｈｒ６：３３２７１４１０〜３３２８２１６４）が存在し、その産物は、ＴＡＰ複合体とＨＬＡクラスＩ鎖との間に架橋を形成し、ペプチド負荷を増強する。タパシンにおける低下は、障害されたＭＨＣクラスＩアセンブリ、ＭＨＣクラスＩの低下した細胞表面発現および障害された免疫応答を有する細胞を生じる（Ｇｒａｎｄｅａら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３巻：２１３〜２２２頁およびＧａｒｂｉら（２０００年）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １巻：２３４〜２３８頁を参照）。クラスＩＩ ＭＨＣ発現の調節は、ＭＨＣＩＩエンハンセオソーム複合体の活性に依存する。エンハンセオソームの構成成分（エンハンセオソーム複合体の最も高度に研究された構成成分のうちの１つは、ＲＦＸ５遺伝子産物である（Ｖｉｌｌａｒｄら（２０００年）ＭＣＢ ２０巻（１０号）：３３６４〜３３７６頁を参照））は、ほぼ普遍的に発現され、これらの構成成分の発現は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の組織特異的発現またはそれらのＩＦＮ−γ誘導される上方調節を制御しないようである。その代り、非ＤＮＡ結合タンパク質であるＣＩＩＴＡ（クラスＩＩトランス活性化因子）として公知のタンパク質は、ＭＣＨＩＩ発現のためのマスター制御因子として機能するようである。他のエンハンセオソームのメンバーとは対照的に、ＣＩＩＴＡは、組織特異的発現を示し、ＩＦＮ−γによって上方調節され、ＭＨＣクラスＩＩ発現の下方調節（免疫監視を逃れるための細菌の試みの一部であると考えられる（Ｌｅｉｂｕｎｄ Ｇｕｔ−Ｌａｎｄｍａｎｎら（２００４年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４巻：１５１３〜１５２５頁を参照））を引き起こし得るいくつかの細菌およびウイルスによって阻害されることが示されている。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがヒトＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ調節遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ調節遺伝子を破壊するために使用され得る。ｓｇＲＮＡは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡ−ＤＲＡをコードする遺伝子配列が含まれるがこれらに限定されない、ＨＬＡ遺伝子座中のいずれかの場所の配列、および上で議論したこれらの遺伝子内の好ましい標的化領域に結合するように設計され得る。さらに、ｓｇＲＮＡは、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７およびタパシンを含む、その産物がＭＨＣタンパク質と相互作用する遺伝子中の配列、またはＭＨＣＩＩエンハンセオソーム複合体（ＲＦＸ５（ｃｈｒ１：１５１３１３１１６〜１５１３１９７６９）およびＣＩＩＴＡ（ｃｈｒ１６：１０９７１０５５〜１１００２７４４）中のものを含む、その産物がこれらの遺伝子の発現を調節する遺伝子中の配列に結合するように、設計され得る。標的化に適切な配列の非限定的な例を、表１に示す。
植物における遺伝子、特に植物におけるパラロガス遺伝子の発現のモジュレーションならびに標的化された開裂および変更のために有用な組成物および方法が、本明細書に開示される。パラロガス遺伝子の調節は、例えば、遺伝子操作された転写因子を使用すること、または遺伝子調節領域を修飾することによって、モジュレートされ得る。遺伝子は、例えば、標的化された開裂とその後の染色体内相同組換えとによって、または標的化された開裂とその後の外因性ポリヌクレオチド（遺伝子ヌクレオチド配列と相同性の１または複数の領域を含む）とゲノム配列との間の相同組換えとによって、変更され得る。植物におけるパラロガス遺伝子の非限定的な一例は、ＥＰＳＰＳ遺伝子である。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡが植物ＥＰＳＰＳ遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＥＰＳＰＳ遺伝子を破壊するために使用され得る。
本開示は、植物細胞においてＺｐ１５遺伝子中に組み込まれた外因性核酸配列（即ち、タンパク質またはＲＮＡ分子）の１または複数の産物を発現させるための方法および組成物を提供する。共同所有された米国特許第８，３２９，９８６号に示されるように、Ｚｐ１５遺伝子座またはその近傍における１または複数の外因性配列の組込みは、宿主植物が再生し、開花し、または種子を作出し、および任意選択で世代を超えた外因性配列（複数可）の遺伝性の伝達を可能にする能力を障害しないようである。これらの外因性核酸配列は、例えば、１もしくは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、ならびに１もしくは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。例えば、除草剤耐性遺伝子が、所望の除草剤抵抗性を有する作物植物を作出するために、この遺伝子座中に組み込まれ得る。Ｚｐ１５遺伝子座またはその近傍において外因性核酸を含む細胞は、配偶体（生殖系列）にも寄与し得、したがって、引き続く世代において後代に伝達され得る。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡが植物ＺＰ１５遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＺｐ１５遺伝子を破壊するために使用され得る。
本開示は、脂肪酸生合成に関与する１または複数の植物遺伝子の、植物全体または植物細胞における発現をモジュレートするためおよび標的化された変更のための、組成物および方法を提供し、それによって、植物全体または植物細胞における脂肪酸組成を変更する。植物全体または植物細胞は、一部の特定の実施形態では油産生植物を含む単子葉（ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ／ｍｏｎｏｃｏｔｓ）または双子葉（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ／ｄｉｃｏｔｓ）植物種由来であり得、これには、培養細胞、任意の発生段階にある植物中の細胞、および植物全体から取り出された植物細胞もまた含まれ、これらの細胞（またはそれらの子孫）は、植物へと再生される。植物細胞は、１または複数の相同なまたはパラロガスな遺伝子配列を含み得、それらの任意の数またはそれらの全てが、本明細書に開示される方法による修飾のために標的化され得る。
一態様では、植物脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質）が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、この遺伝子は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ遺伝子である。一部の特定の実施形態では、このＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ遺伝子は、アセチル−ＣＯＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、β−ケトアシル−ＡＣＰシンテターゼ（ＫＡＳ、例えば、ＫＡＳ Ｉ〜ＫＡＳ ＩＶ）、脂肪酸チオエステラーゼＢ（ＦＡＴＢ、例えば、ＦＡＴＢ１〜ＦＡＴＢ５または他の色素体チオエステラーゼ）、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、脂肪酸エロンガーゼ（ｅｌｏｎｇａｓｅ）（ＦＡＥ、例えば、ＦＡＥ１）、脂肪酸チオエステラーゼＡ（ＦａｔＡ）、脂肪酸デサチュラーゼ（Ｆａｄ２、Ｆａｄ３）、色素体Ｇ−３−Ｐデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）、グリセロキナーゼ（ＧＫ）、ステアロイル−アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼ（Ｓ−ＡＣＰ−ＤＥＳ）およびオレオイル−ＡＣＰヒドロラーゼをコードし得る。一部の特定の実施形態では、この遺伝子は、他の油産生植物種におけるこれらの遺伝子のオルソログまたはホモログであり得る。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡが脂肪酸合成遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いて、脂肪酸生合成に関与する遺伝子を破壊するために使用され得る。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）は、植物および哺乳動物の両方において中心的代謝およびオルガネラ区画間の酸化還元ホメオスタシスに関与する可逆的ＮＡＤ＋依存的デヒドロゲナーゼ反応を触媒する。植物組織は、ＮＡＤプールの還元または酸化に共役されたマレートおよびオキサロアセテート（ＯＡＡ）の相互変換を触媒するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌ−リンゴ酸−ＮＡＤ−オキシドレダクターゼ［ＭＤＨ］；ＥＣ １．１．１．３７）の複数のアイソフォームを含む。特に、ＯＡＡは、この有機酸に対して本質的に不透過性である哺乳動物ミトコンドリアとは対照的に、単離された植物ミトコンドリアの内側へおよび外側への両方で、容易に輸送される。ＭＤＨ突然変異体植物は、明らかな表現型を示さないか、またはより緩徐な成長速度および変更された光呼吸特徴を示すかのいずれかである。以下を参照されたいが、例えば、Ｔｏｍａｚら（２０１０年）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １５４巻（３号）：１１４３〜１１５７頁、Ｇｏｏｄｍａｎ， Ｍ．Ｍ．、Ｎｅｗｔｏｎ Ｋ．Ｊ．およびＳｔｕｂｅｒ， Ｃ．Ｗ．（１９８１年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８巻：１７８３〜１７８５頁またはＩｍｓａｎｄｅ， Ｊ．ら（２００１年）Ｊ． Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ９２巻：３３３〜３３８頁ならびに米国特許出願公開第２００９０１２３６２６号は、アスパラギンレベルを低下させるためのＭＤＨアンチセンスの使用を記載しており、これは次いで、植物および植物産物の加工関連の加熱の際に蓄積するアクリルアミドのレベルを低下させる。したがって、本発明の方法および組成物は、単一ガイドＲＮＡがＭＤＨ遺伝子を標的化するための配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）を破壊するために使用され得る。
このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノム中の所望の位置を標的化するための遺伝子操作されたｓｇＲＮＡ（またはその相当部分）を含む。このガイドＲＮＡの１２塩基対およびＰＡＭ配列の２塩基対のみ（合計１４塩基対）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性に重要であるようである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構築物がこれら１４塩基対に対して絶対的に特異的であると仮定して、本発明者らは、斯かる構築物がヒトゲノムにおいておよそ２０回開裂すると予測するが、それは、所与の１４ヌクレオチド配列が、２６８，４３５，４５６（４１４）ヌクレオチド毎におよそ１回出現し、一倍体ヒトゲノムがおよそ３，０００，０００，０００ヌクレオチドを含み、１４ヌクレオチド配列が、ゲノムの２つの鎖のいずれか上に存在し得るからである。この数字は、認識の絶対的特異性もまた必要とする。したがって、オフターゲット開裂部位の実際の数は、より高い可能性がある。本発明は、その特異性を増加させるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の標的サイズを増加させるための方法および組成物を提供する。このＣａｓヌクレアーゼは、それぞれ、標的ＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を開裂させるための、２つのヌクレアーゼドメインＨＮＨおよびＲｕｖＣ様を含む。したがって、このＣａｓヌクレアーゼは、これらのヌクレアーゼドメインのうちの一方だけが機能的になるように遺伝子操作され得、そうして、Ｃａｓニッカーゼを生じる（Ｊｉｎｅｋら、同書を参照）。ニッカーゼは、この酵素の触媒ドメイン中のアミノ酸の特異的突然変異によって、またはこのニッカーゼがもはや機能的でなくなるような、ドメインの一部もしくは全てのトランケーションによって、生成され得る。Ｃａｓは、２つのヌクレアーゼドメインを含むので、このアプローチは、いずれのドメインに対しても行われ得る。二本鎖切断は、斯かる２つのＣａｓニッカーゼの使用によって、標的ＤＮＡにおいて達成され得る。これらのニッカーゼは、各々ＤＮＡの一方の鎖を開裂させ、２つのニッカーゼの使用は、二本鎖切断を生じる。したがって、この系の特異性は、２つのＣａｓニッカーゼタンパク質を使用することによって大きく増加されるが、それは、標的の長さが、１２〜１４ヌクレオチドから２４〜２８ヌクレオチド（２つのサブ標的間にスペーサーを含まない）に増加されるからである。このアプローチを使用して、ヒトゲノム中の完璧にマッチしたオフターゲット部位の予測される数は、約２０（上記の通り）から約＜１０−７（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ二量体によって認識される２８塩基対のＤＮＡを仮定する）まで、４１４倍低下する。
概要
本明細書に開示される方法、ならびに組成物の調製および使用の実施は、特に示さない限り、本技術分野の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期的更新；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ． ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションの、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対合する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１または複数のアミノ酸が、対応する天然起源のアミノ酸の化学的アナログまたは修飾された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間、または２つの核酸の間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。斯かる相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指す：増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関する。
用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、相互交換可能に使用され、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」とは、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内の約１０〜３０（１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）塩基対の配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と相互交換可能に使用され得る。用語「ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列」はまた、用語「ダイレクトリピート（複数可）」と相互交換可能に使用され得る。
「相補性」とは、伝統的Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型または他の非伝統的型のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０が、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）と水素結合（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合）を形成し得る核酸分子中の残基のパーセンテージを示す。「完璧に相補的」は、核酸配列の連続する残基が全て、第２の核酸配列中の同数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用する場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれ超のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。「結合タンパク質」は、別の分子と結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合できる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、それ自体と結合でき（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）および／または異なるタンパク質（単数もしくは複数）の１もしくは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、１つよりも多い型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインであり、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１または複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。これらのリピートドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも呼ぶ）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の遺伝子操作（１または複数のアミノ酸を変更する）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作され」得る。したがって、遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然起源のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が合理的基準から主に生じる、天然起源でないタンパク質である。設計のための合理的基準には、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計および結合データの情報を記憶するデータベース中の情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；および第６，５３４，２６１号を参照されたい；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６もまた参照されたい。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験過程から主に生じる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；ならびにＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の過程を指す。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性指向性の修復機構を介した細胞における二本鎖切断の修復の間に行われる、斯かる交換の特殊化された形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「標的」分子（即ち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすので、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に公知である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、斯かる移入は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／もしくは標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、ならびに／または関連する過程に関与し得る。斯かる特殊化されたＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、標的分子の配列の変更をもたらす。
本開示の方法では、本明細書に記載される１または複数の標的化されたヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）は、所定の部位において標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖切断を生じ、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが、細胞中に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを容易にすることが示されている。このドナー配列は、物理的に組み込まれ得、またはあるいは、このドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、ドナーと同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は、変更され得、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へと変換され得る。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による１つのヌクレオチド配列の置き換え（即ち、情報的な意味での配列の置き換え）を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも必要としない。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、さらなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび／またはジンクフィンガーもしくはＴＡＬＥＮタンパク質のさらなる対は、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖開裂に使用され得る。
細胞クロマチン中の目的の領域中の配列の標的化された組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。斯かる相同組換えは、切断の領域と相同な配列が存在する場合、細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、目的の領域中のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含み得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列と相同なドナー配列の一部分は、置き換えられるゲノム配列に対して、約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は、例えば、１ヌクレオチドのみが１００個を超える連続する塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の場合、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含み得る。これらの例では、非相同配列には、一般に、目的の領域中の配列と相同または同一な、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）または１，０００よりも大きい任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の実施形態では、このドナー配列は、第一の配列とは非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム中に挿入される。
本明細書に記載される方法のいずれかは、目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化された組込みによる、細胞中の１または複数の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株もまた、提供される。
さらに、本明細書に記載される標的化された組込みの方法は、１または複数の外因性配列を組み込むためにも使用され得る。この外因性核酸配列は、例えば、１もしくは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、ならびに１もしくは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、この外因性核酸配列は、１または複数のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。
「開裂」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの個別の一本鎖開裂事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化された二本鎖ＤＮＡ開裂に使用される。
「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）と協同して、開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。用語「第１および第２の開裂ハーフドメイン」；「＋および−の開裂ハーフドメイン」ならびに「右および左の開裂ハーフドメイン」は、相互交換可能に使用されて、二量体形成する開裂ハーフドメインの対を指す。
「遺伝子操作された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の遺伝子操作された開裂ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された開裂ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、第２００７／０２１８５２８号、第２００８／０１３１９６２号および第２０１１／０２０１０５５号もまた参照されたい。
用語「配列」は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく；直鎖状であっても環状であっても分枝状であってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい、いずれかの長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、いかなる長さであってもよく、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間もしくはそれを超えるいずれかの整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間のいずれかの整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチドの間の長さとなり得る。
「相同非同一配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列が第２の配列と同一ではない第１の配列を指す。例えば、突然変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異体遺伝子の配列と相同かつ非同一である。ある特定の実施形態において、２種の配列の間の相同性の程度は、正常な細胞機序を利用して、その間の相同組換えを可能にするために十分なものである。２種の相同非同一配列は、いかなる長さであってもよく、それらの非相同性の程度は、単一のヌクレオチドほどに小さくても（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点突然変異の修正のため）、１０キロベースまたはそれを超えるほどに大きくてもよい（例えば、染色体の所定の異所性部位における遺伝子の挿入のため）。相同非同一配列を含む２種のポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の間の外因性ポリヌクレオチド（即ち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技法は、本技術分野において公知である。典型的には、斯かる技法は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定および／またはそれにコードされるアミノ酸配列の決定、ならびに第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列とのこのような配列の比較を含む。この様式でゲノム配列を決定および比較することもできる。一般に、同一性は、それぞれ２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド−対−ヌクレオチドまたはアミノ酸−対−アミノ酸の一致を指す。２種またはそれを超える配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することにより比較することができる。核酸であれアミノ酸配列であれ、２種の配列のパーセント同一性は、２種の整列した配列の間の正確なマッチの数を短い方の配列の長さで割り、１００を乗じたものである。核酸配列のおよそのアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２巻：４８２〜４８９頁（１９８１年）の局所的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ編、５巻、追補３号：３５３〜３５８頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡにより開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４巻（６号）：６７４５〜６７６３頁（１９８６年）により規格化されたスコアリング行列を使用することにより、アミノ酸配列に適用することができる。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実行は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおけるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により提供される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための適したプログラムは、一般に、本技術分野において公知であり、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用したＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメータを使用して使用することができる：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；選別＝高スコアによる；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネット上に見出すことができる。本明細書に記載されている配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、およそ８０％〜１００％およびその間のいずれかの整数値である。典型的には、配列間のパーセント同一性は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％配列同一性である。
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間に安定的二重鎖の形成を可能にする条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）による消化および消化した断片のサイズ決定により決定することができる。上述の方法を使用して決定される通り、配列が、定義される長さの分子にわたり少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を提示する場合、２種の核酸または２種のポリペプチド配列は、互いに実質的に相同である。本明細書において、実質的に相同とは、指定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対し完全な同一性を示す配列も指す。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、このような特定の系に定義されるストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記参照；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、編集者Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８５年）Ｏｘｆｏｒｄ； Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
２種の核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、次の通り決定することができる。２種の核酸分子間の配列同一性の程度は、斯かる分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を与える。部分的に同一の核酸配列は、標的分子への完全に同一の配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、本技術分野において周知のハイブリダイゼーションアッセイを使用して評価することができる（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションその他、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照）。斯かるアッセイは、変動する程度の選択性を使用して、例えば、低から高ストリンジェンシーに変動する条件を使用して行うことができる。低ストリンジェンシーの条件が用いられる場合、非特異的結合の非存在は、非特異的結合事象の非存在下で二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的な程度の配列同一性さえも欠く二次プローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価することができる。
ハイブリダイゼーションに基づく検出系を利用する場合、参照核酸配列に相補的な核酸プローブが選択され、続いて適切な条件の選択により、プローブおよび参照配列は、互いに選択的にハイブリダイズまたは結合して、二重鎖分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、典型的に、選択された核酸プローブの配列と少なくともおよそ７０％配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的に、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％を超える配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする。特異的な程度の配列同一性を有するプローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、本技術分野において公知の通りに決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、編集者Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８５年）Ｏｘｆｏｒｄ； Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照）。
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知のものである。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を嫌う程度を指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチしたハイブリッドに対するより低い耐容能と相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える因子は、当業者に周知のものであり、その例として、温度、ｐＨ、イオン強度ならびに例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の濃度が挙げられるがこれらに限定されない。当業者に公知の通り、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度により増加する。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、多数の均等な条件を用いて、例えば、次の因子を変動させることにより、特定のストリンジェンシーを確立することができることが本技術分野において周知である：プローブ配列の長さおよび性質、様々な配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液構成成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液におけるブロッキング剤の有無（例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータならびに変動する洗浄条件。ハイブリダイゼーション条件の特定のセットの選択は、本技術分野における標準方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照）。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、各々２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含む：リンカーＤＮＡ（生物に依存して変動する長さのもの）が、ヌクレオソームコア間に延びる。１分子のヒストンＨ１が、一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方の、全ての型の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを構成する全ての染色体のコレクションであるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１または複数の染色体を含み得る。
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製性の核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。
「到達できる領域」は、核酸に存在する標的部位が、該標的部位を認識する外因性分子に結合され得る、細胞クロマチンにおける部位である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、到達できる領域が、ヌクレオソーム構造へとパッケージされない領域であることが考えられる。到達できる領域の明確な構造は、多くの場合、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性により検出することができる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。
「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しない分子であるが、１または複数の遺伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞中に導入され得る。「細胞中での通常の存在」は、特定の発生段階または細胞の環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックされていない細胞に関して、外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能障害性内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の機能障害性バージョンを含み得る。
外因性分子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアルケミストリー過程によって生成されるような小分子、または巨大分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾された誘導体、あるいは上記分子のうちの１または複数を含む任意の複合体であり得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得；直鎖状、分枝状または環状であり得；任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能な核酸、ならびに三重鎖形成性核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。したがって、この用語は、「導入遺伝子」または細胞中に導入された外因性配列である「目的の遺伝子」を含む。
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ型の分子であり得るが、細胞が由来するのとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株中に導入され得る。植物細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、プロトプラスト形質転換、シリコンカーバイド（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃（例えば、「遺伝子銃」を使用する）、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。
対照的に、「内因性」分子は、特定の発生段階で特定の環境条件下で特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然起源のエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
本明細書で使用する場合、用語「外因性核酸の産物」には、ポリヌクレオチド産物およびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）が含まれる。
「融合」分子は、２つまたはそれ超のサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって連結された分子である。これらのサブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと１または複数の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるがこれらに限定されない。第２の型の融合分子の例には、三重鎖形成性核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が含まれるがこれらに限定されない。「融合ポリペプチド」は、異種ポリペプチドに融合または結合されたポリペプチドまたはその一部（例えば、１または複数のドメイン）を含むポリペプチドである。融合ポリペプチドの例には、Ｃａｓタンパク質の一部分を免疫グロブリン配列と組み合わせるイムノアドヘシン、および「タグポリペプチド」に融合したＣａｓタンパク質、例えば、またはその一部分を含み得るエピトープタグ化ポリペプチドが含まれる。このタグポリペプチドは、それに対する抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、Ｃａｓのヌクレアーゼ活性を妨害しないように十分に短い。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常は、約６〜６０の間のアミノ酸残基を有する。
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、このポリヌクレオチドは転写され、この転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生じる。トランス−スプライシング、ポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達のための方法は、本開示の他の場所に示される。
「遺伝子」には、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、ならびに斯かる調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接してもしなくても、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域が含まれる。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。「遺伝子操作された遺伝子」とは、野生型遺伝子と同一でないように、何らかの方法で変更された遺伝子を指す。変更は、標的化された欠失、挿入およびトランケーションの形態であり得る。遺伝子操作された遺伝子は、２つの異種遺伝子由来のコード配列を含み得るか、または合成遺伝子配列を含み得る。遺伝子操作された遺伝子はまた、タンパク質配列においてサイレントな（例えば、コドン最適化）変化をコード配列中に含み得る。遺伝子操作された遺伝子は、変更された調節配列を有する遺伝子もまた含み得る。
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などの過程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質もまた含まれる。
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変更、不活性化、ランダム突然変異）が、発現をモジュレートするために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較して、遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。
「植物」細胞には、単子葉（ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ／ｍｏｎｏｃｏｔｓ）または双子葉（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ／ｄｉｃｏｔｓ）植物の細胞が含まれるがこれらに限定されない。単子葉の非限定的な例には、穀物植物、例えば、トウモロコシ、イネ、オオムギ、カラスムギ、コムギ、ソルガム、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、タマネギ、バナナおよびココナツが含まれる。双子葉の非限定的な例には、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、サトウダイコン、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズ、キャノーラ（ナタネ）およびアルファルファが含まれる。植物細胞は、植物の任意の部分由来および／または植物の任意の発生段階由来であり得る。
「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望まれる、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接した非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ開裂および／または標的化された組換えを目的とすることができる。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小ささもしくは最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
「真核生物」細胞には、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるがこれらに限定されない。
「赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）」（ＲＢＣ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、造血幹細胞由来の高分化型細胞である。これらは、ヌクレアーゼおよびほとんどの細胞オルガネラを欠いている。ＲＢＣは、肺から末梢組織に酸素を運搬するためのヘモグロビンを含む。実際、個々のＲＢＣの３３％が、ヘモグロビンである。これらはまた、代謝の間に細胞によって組織から生成されるＣＯ２を運搬し、息を吐く間の放出のために肺に戻る。ＲＢＣは、腎臓によるエリスロポエチン（ＥＰＯ）の放出によって媒介されて、血液低酸素に応答して骨髄において産生される。ＥＰＯは、前赤芽球の数の増加を引き起こし、完全なＲＢＣ成熟に必要な時間を短縮させる。およそ１２０日後、ＲＢＣは、核も任意の他の再生能も含まないので、これらの細胞は、肝臓、脾臓およびリンパ節におけるマクロファージの食作用活性（約９０％）、または血漿における溶血（約１０％）のいずれかによって、循環から除去される。マクロファージの貪食後、ＲＢＣの化学的構成成分は、リソソーム酵素の作用に起因して、マクロファージの液胞内で分解される。
「分泌組織」は、個々の細胞から、典型的には上皮由来のある型の内腔へと産物を分泌する、動物中の組織である。胃腸管に局在する分泌組織の例には、腸、膵臓および胆嚢を裏打ちする細胞が含まれる。他の分泌組織には、肝臓、眼に関連する組織、ならびに粘膜、例えば、唾液腺、乳腺、前立腺、脳下垂体、および内分泌系の他のメンバーが含まれる。さらに、分泌組織には、分泌が可能な組織型の個々の細胞が含まれる。
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結した（「ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ」または「ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ」）」は、２つまたはそれ超の構成成分（例えば、配列エレメント）の並置に関して相互交換可能に使用され、ここで、これらの構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能をこれらの構成成分のうちの少なくとも１つが媒介し得る可能性を許容するように、配置される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、１または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動可能に連結されるが、このコード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、エンハンサーとコード配列とが連続していない場合であっても、コード配列に作動可能に連結した転写調節配列である。
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結した」とは、構成成分の各々が、他の構成成分と連結して、そのように連結されていない場合にそれが果たすのと同じ機能を果たすという事実を指し得る。例えば、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、このＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、この融合ポリペプチド中で、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、活性化ドメインは遺伝子発現を上方調節できる場合に、作動可能な連結状態にある。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合した融合ポリペプチドの場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、この融合ポリペプチド中で、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、開裂ドメインは標的部位の近位においてＤＮＡを開裂できる場合に、作動可能な連結状態にある。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、その全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多い、より少ない、もしくは同じ数の残基を有し得、および／または、１もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、本技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって、決定され得る。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学的および生化学的の両方の補完によって、決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、標的細胞に遺伝子配列を移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好ましくは、慣用的なアッセイにおいてである必要はないが、容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子には、抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、Ｇ４１８抵抗性、ピューロマイシン抵抗性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光もしくは発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１または複数のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために、所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。
用語「対象」および「患者」は、相互交換可能に使用され、哺乳動物、例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物を指す。したがって、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用する場合、本発明の幹細胞が投与され得る任意の哺乳動物の患者または対象を意味する。本発明の対象には、例えば神経毒を含む１または複数の化学的毒素に曝露された対象が含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
説得力のある証拠が、最近、真核生物ＲＮＡｉ経路と並行すると仮定されていた、古細菌および多くの細菌におけるＲＮＡ媒介性ゲノム防御経路の存在について浮かび上がってきた（概説については、ＧｏｄｄｅおよびＢｉｃｋｅｒｔｏｎ、２００６年． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ６２巻：７１８〜７２９頁；Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌら、２００６年． Ａｒｃｈａｅａ ２巻：５９〜７２頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年． Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １巻：７頁；Ｓｏｒｅｋら、２００８年． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６巻：１８１〜１８６頁を参照）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または原核生物ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）としても公知であるが、この経路は、２つの、進化的に、および多くの場合物理的に関連した遺伝子座から生じると提唱されている：この系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年． Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． １巻：ｅ６０頁）。微生物宿主中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸開裂の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含む。個々のＣａｓタンパク質は、真核生物ＲＮＡｉ機械のタンパク質構成成分と顕著な配列類似性を共有しないが、類似した予測された機能（例えば、ＲＮＡ結合、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ等）を有する（Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年． Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １巻：７頁）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、多くの場合、ＣＲＩＳＰＲリピート−スペーサーアレイと関連する。４０よりも多くの異なるＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１は、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の間で遍在するようである。ｃａｓ遺伝子およびリピート構造の特定の組合せは、８つのＣＲＩＳＰＲサブタイプ（Ｅｃｏｌｉ、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、ＡｐｅｒｎおよびＭｔｕｂｅ）を規定するために使用されており、そのうちいくつかは、リピート関連ミステリアスタンパク質（ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＡＭＰ））をコードするさらなる遺伝子モジュールと関連する。１つよりも多いＣＲＩＳＰＲサブタイプが、単一のゲノム中に存在し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプの孤発性の分布は、この系が、微生物の進化の間の水平遺伝子移入に供されることを示唆する。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおいて最初に記載されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの逐次的ステップで、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実施する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介し、このとき、プロセシングは、Ｃａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的ＲＮａｓｅ ＩＩＩによって起こる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識のためのさらなる要求、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を介して、標的ＤＮＡにＣａｓ９を指向させる。さらに、このｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端においてｃｒＲＮＡと塩基対合するようにも存在していなければならず、この会合は、Ｃａｓ９活性を誘発する。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトスペーサー内の二本鎖切断を生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップから構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれる過程における、将来の攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイ中への異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後の、（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性の干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能と関連する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、多くの異なる細菌において見出されている。Ｆｏｎｆａｒａら（（２０１３年）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ４２巻（４号）：２３７７〜２５９０頁）によって公に入手可能なゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索は、３４７種の細菌においてＣａｓ９オルソログを見出した。さらに、この群は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａおよびＦ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９オルソログを使用した、ＤＮＡ標的のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ開裂を実証した。したがって、用語「Ｃａｓ９」とは、１つのＤＮＡ結合ドメインおよび２つのヌクレアーゼドメインを含むＲＮＡガイドされるＤＮＡヌクレアーゼを指し、Ｃａｓ９をコードする遺伝子は、任意の適切な細菌に由来し得る。
このＣａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有する：一方のヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと類似するが、他方は、Ｒｕｖエンドヌクレアーゼドメインと似ている。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を開裂させることを担うようであるが、Ｒｕｖドメインは、非相補鎖を開裂させる。このＣａｓ９ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの１つのみが機能的であるように遺伝子操作され得、Ｃａｓニッカーゼを生じる（Ｊｉｎｅｋら、同書を参照）。ニッカーゼは、酵素の触媒ドメイン中のアミノ酸の特異的突然変異によって、またはそれがもはや機能的でなくなるような、ドメインの一部もしくは全てのトランケーションによって、生成され得る。Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメインを含むので、このアプローチは、いずれのドメインに対しても行われ得る。二本鎖切断は、斯かる２つのＣａｓ９ニッカーゼの使用によって、標的ＤＮＡにおいて達成され得る。これらのニッカーゼは、各々ＤＮＡの一方の鎖を開裂させ、２つのニッカーゼの使用は、二本鎖切断を生じる。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一次産物は、侵入者標的化配列を含む短いＲＮＡであるようであり、この経路における仮定されたそれらの役割に基づいて、ガイドＲＮＡまたは原核生物サイレンシングＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ）と称される（Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年． Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １巻：７頁；Ｈａｌｅら、２００８年． ＲＮＡ、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。ＲＮＡ分析は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写物が、個々の侵入者標的化配列および隣接するリピート断片を含む約６０ｎｔ〜７０ｎｔのＲＮＡ中間体を放出するように、リピート配列内で開裂されることを示している（Ｔａｎｇら ２００２年． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９９巻：７５３６〜７５４１頁；Ｔａｎｇら、２００５年． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５５巻：４６９〜４８１頁；Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌら ２００６年． Ａｒｃｈａｅａ ２巻：５９〜７２頁；Ｂｒｏｕｎｓら ２００８年． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１巻：９６０〜９６４頁；Ｈａｌｅら、２００８年． ＲＮＡ、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓでは、これらの中間体ＲＮＡは、豊富で安定な約３５ｎｔ〜４５ｎｔの成熟ｐｓｉＲＮＡへとさらにプロセシングされる（Ｈａｌｅら ２００８年． ＲＮＡ、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の要求は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む遺伝子操作された「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避され得る（Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７巻：８１６頁およびＣｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、遺伝子操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物またはｓｇＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓ関連ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間で形成する場合、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡを開裂するようにガイドする。Ｃａｓ９タンパク質とＰＡＭ配列を含む遺伝子操作されたｓｇＲＮＡとを含むこの系は、ＲＮＡガイドされるゲノム編集に使用されており（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ同書を参照）、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと類似の編集効率で、ｉｎ ｖｉｖｏでゼブラフィッシュ胚ゲノム編集に有用である（Ｈｗａｎｇら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１巻（３号）：２２７頁を参照）。
他のＣａｓタンパク質
「Ｃａｓ１」ポリペプチドとは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質１を指す。Ｃａｓ１（タンパク質分類系のＣｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐ中のＣＯＧ１５１８）は、ＣＲＩＳＰＲ関連系（ＣＡＳＳ）の最良のマーカーである。系統発生学的比較に基づいて、７つの個別のバージョンのＣＲＩＳＰＲ関連免疫系が同定されている（ＣＡＳＳ１〜７）。
本明細書に記載される方法で使用されるＣａｓ１ポリペプチドは、任意の原核生物中に存在する任意のＣａｓ１ポリペプチドであり得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、古細菌微生物のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ微生物のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ微生物のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、細菌のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌のＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓのＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ１〜７のうちの１つのメンバーであるＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ３のメンバーであるＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ７のメンバーであるＣａｓ１ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、ＣＡＳＳ３またはＣＡＳＳ７のメンバーであるＣａｓ１ポリペプチドである。
一部の実施形態では、Ｃａｓ１ポリペプチドは、例えば、ＧｅｎｅＩＤ番号：２７８１５２０、１００６８７４、９００１８１１、９４７２２８、３１６９２８０、２６５００１４、１１７５３０２、３９９３１２０、４３８０４８５、９０６６２５、３１６５１２６、９０５８０８、１４５４４６０、１４４５８８６、１４８５０９９、４２７４０１０、８８８５０６、３１６９５２６、９９７７４５、８９７８３６もしくは１１９３０１８においてＧｅｎＢａｎｋ中に提供されるヌクレオチド配列、および／またはこれらのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸に対して相同性（例えば、８０％よりも高い、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む９０〜９９％）を示すアミノ酸配列によってコードされ、これらのポリペプチドは、Ｃａｓ１ポリペプチドとして機能する。
Ｃａｓ６は、別のＣａｓポリペプチドであり、エンドリボヌクレアーゼ活性は、本明細書では、Ｃａｓ６エンドリボヌクレアーゼ活性と呼ばれる。適切なＣａｓ６ポリペプチドの非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ８１２５５に示される。Ｃａｓ６ポリペプチドは、例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓであるがそれに限定されない、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座およびｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座を有する微生物から、濃縮、単離もしくは精製され得、または組換え技法を使用して生成され得る、または慣用的な方法を使用して化学的もしくは酵素的に合成され得る。一部の態様では、Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を有さない微生物から濃縮、単離もしくは精製され得る。Ｃａｓ６ポリペプチドは、Ｃ末端の近くにＧｈＧｘｘｘｘｘＧｈＧ（配列番号２１６）モチーフ（ここで、「ｈ」は、疎水性アミノ酸を示す）を含み得る。ＡｒｇまたはＬｙｓは、５アミノ酸の中心的ストレッチ内に見出され得、多くの場合、見出される。Ｃａｓ６ポリペプチドは、触媒において役割を果たし得る少なくとも１つの残基またはその保存的置換を含む。Ｃａｓ６ポリペプチドは、触媒においても役割を果たし得る他の残基またはその保存的置換を含み得る。触媒において役割を果たすと予測される残基（複数可）は、タンパク質の３Ｄ構造中にＣａｓ６シグネチャーモチーフを含むＧリッチループの近くに位置し得る。Ｃａｓ６ポリペプチドは、アクセッション番号ＴＩＧＲ０１８７７およびＰＦ０１８８１においてＴＩＧＲＦＡＭデータベース中に存在するドメインを含み得る。このＴＩＧＲＦＡＭデータベースは、機能が保存されるポリペプチドのファミリーを含む（Ｈａｆｔら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００３年、３１巻：３７１〜３７３頁、ＢａｔｅｍａｎおよびＨａｆｔ、２００２年、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３巻：２３６〜２４５頁、ならびにＨａｆｔら、２００５年、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌ．、１巻（６号）：ｅ６０頁）。
本明細書に提供されるＣａｓ６ポリペプチドの他の例には、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座およびｃａｓ遺伝子座を有する原核生物微生物中に存在するものが含まれる。Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含む任意の微生物において容易に同定され得る。Ｃａｓ６ポリペプチドをコードするコード領域は、典型的には、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位に位置するｃａｓ遺伝子座中に存在する。Ｈａｆｔら（２００５年、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌ．、１巻（６号）：ｅ６０頁）は、Ｃａｓタンパク質ファミリーを概説しており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の特定のサブタイプの同定のための規則を作りだした。Ｈａｆｔらは、少なくとも４つの別々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプ（Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、ＡｐｅｒｎおよびＭｔｕｂｅ）と会合して見出され、典型的には、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に対して最も遠位に位置するｃａｓコード領域である、Ｃａｓ６ポリペプチドをコードするコード領域を記載している。Ｃａｓ６ポリペプチドは、ＪＣＶＩ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅにおいて入手可能な資源を使用して同定され得る。したがって、本明細書に記載される方法において有用なＣａｓ６ポリペプチドは、慣用的な方法を使用して当業者によって同定され得る。
Ｃａｓ６ポリペプチドをコードすると予測されるコード領域を含む公知の全ゲノム配列を有する原核生物微生物の例には、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｅｔｕｓ ８２−４０、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ＡＴＣＣ ２５５８６、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＧ １８３１１、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ ＭＢ４（Ｔ）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＡＴＣＣ ３９０７３、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ Ｙ５１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ Ｅ８８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ＳＭ１０１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＱＣＤ−３２ｇ５８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｈａｌｌ Ａ Ｓａｎｇｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｆ Ｌａｎｇｅｌａｎｄ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂ１ Ｏｋｒａ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ３ Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ Ｈａｌｌ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ ＡＴＣＣ １９３９７、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ Ｚ−２９０１、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＲＰ６２Ａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ２７、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９４１３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＯＳ Ｔｙｐｅ Ｂ ｐｒｉｍｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＯＳ Ｔｙｐｅ Ａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ８３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＹＣＨ４６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＮＣＴＣ９３４３、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ９９４１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ（実験室株）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＣＤＣ１５５１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｂｏｖｉｓ ＡＦ２１２２／９７、Ｆｒａｎｋｉａ ａｌｎｉ ＡＣＮ１４ａ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ ＧＳＳ１、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ ＤＳＭ ９７９０、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ ｓｈｉｎｋａｊ ＯＴ３、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ ３６３８、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ＧＥ５、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ ｆｕｓａｒｏ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ Ｃ２Ａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ ＤＳＭ ６２４２、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＤＳＭ２６６１、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ｄｅｌｔａ Ｈ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ＡＴＣＣ ４３０４９、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＤＳＭ４３０４、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ １Ｍ２、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ 株７、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ Ｐ２、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＤＳＭ ６３９、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ Ｋ１が含まれる。Ｃａｓ６ポリペプチドの他の例は、当業者に公知であり、例えば、ＣＯＧ１５８３群のポリペプチドのメンバー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネットサイトを通じて、タンパク質のＣｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ（ＣＯＧ）ウェブページにおいて入手可能、Ｔａｔｕｓｏｖら（１９９７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：６３１〜６３７頁、およびＴａｔｕｓｏｖら（２００３年）、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、４巻（１号）：４１頁もまた参照）、アクセッション番号ＩＰＲＯ１０１５６を有するＩｎｔｅｒＰｒｏファミリーのメンバー、Ｍａｋａｒｏｖａら（２００２年）、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０巻：４８２〜４９６頁およびＨａｆｔら（２００５年）、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．、１巻（６号）：ｅ６０、４７４〜４８３頁）を参照されたい。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然起源のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有することを条件として、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的修飾、およびその融合物の両方を包含する。一部の態様では、機能的誘導体は、天然起源のＣａｓタンパク質の単一の生物学的特性を含み得る。他の態様では、機能誘導体は、天然起源のＣａｓタンパク質の生物学的特性のサブセットを含み得る。
「Ｃａｓ１ポリペプチド」は、全長Ｃａｓポリペプチド、Ｃａｓポリペプチドの酵素的に活性な断片、およびＣａｓポリペプチドまたはその断片の酵素的に活性な誘導体を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合物、共有結合的修飾が含まれるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から取得可能であり得るか、もしくは化学的に合成され得るか、またはこれらの２つの手順の組合せによって、取得可能であり得る。この細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、もしくは外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であり得、この核酸は、内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする。ある場合には、この細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子発現を阻害するためにも使用され得る。Ｌｅｉら（（２０１３年）Ｃｅｌｌ、１５２巻、（５号）：１１７３〜１１８３頁を参照）は、エンドヌクレアーゼ活性を欠く触媒的に死んだＣａｓ９が、ガイドＲＮＡと同時発現される場合、転写的伸長、ＲＮＡポリメラーゼ結合または転写因子結合を特異的に妨害できるＤＮＡ認識複合体を生成することを示している。ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）と呼ばれるこの系は、標的化された遺伝子の発現を効率的に抑制できる。
本発明のＣａｓタンパク質は、機能性を変更するために突然変異され得る。ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；および第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有されたＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＤＮＡ結合ドメインおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第８，５８６，５２６号；第６，１４０，０８１号；第５，７８９，５３８号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
Ｂ．機能的ドメイン
本明細書に記載される系は、標的遺伝子に対して作用するために、単一ガイドＲＮＡと会合する任意の適切な機能的ドメインを含み得る。機能的ドメインの非限定的な例には、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメインおよび／またはヌクレアーゼドメインが含まれる。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号；および第８，４０９，８６１号を参照されたい。
ある特定の実施形態では、この機能的ドメインは、１または複数の開裂ドメインを含む。例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡにとって異種の機能的ドメインなど、この機能的ドメイン（例えば、開裂ドメイン）は、ＤＮＡ結合ドメインにとって異種であり得る。異種開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。開裂ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年カタログ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを開裂するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年もまた参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１または複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの供給源として使用され得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、異種ヌクレアーゼドメインに連結され得る。一部の態様では、このＣａｓタンパク質は、二本鎖開裂がＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの二量体形成に依存するようにＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結された、ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓ９タンパク質である。
同様に、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体形成を必要とする、上記のような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、開裂に必要とされる。あるいは、２つの開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。これら２つの開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質についての標的部位は、好ましくは、互いに関して配置され、その結果、そのそれぞれの標的部位への２つの融合タンパク質の結合は、例えば二量体形成によって開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させる互いに対する空間的配向に、これらの開裂ハーフドメインを置く。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近くの端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離れている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ超）。一般に、開裂の部位は、標的部位間に存在する。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在しており、（認識部位における）ＤＮＡへの配列特異的結合が可能であり、結合の部位またはその近傍でＤＮＡを開裂させることが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り出された部位においてＤＮＡを開裂させ、分離可能な結合ドメインおよび開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所において、ＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、遺伝子操作されてもされなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１または複数のジンクフィンガー結合ドメイン由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）を含む。
その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示の目的のため、開示された融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、開裂ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞配列の標的化された二本鎖開裂および／または標的化された置き換えのために、各々がＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成するために使用され得る。あるいは、１つのＤＮＡ結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子もまた、使用され得る。
開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、機能的開裂ドメインを形成するために、開裂活性を保持するまたは多量体形成する（例えば、二量体形成する）能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第０７／０１４２７５号に記載されている。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合および開裂ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。
ある特定の実施形態では、この開裂ドメインは、例えば、その全ての開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号；および第８，６２３，６１８号に記載されるように、ホモ二量体形成を最小化または防止する１または複数の遺伝子操作された開裂ハーフドメイン（二量体形成ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位および５３８位におけるアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体形成に影響を与えるための標的である。
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な遺伝子操作された開裂ハーフドメインには、第１の開裂ハーフドメインが、ＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基において突然変異を含み、第２の開裂ハーフドメインが、アミノ酸残基４８６および４９９において突然変異を含む、対が含まれる。
したがって、一実施形態では、４９０位における突然変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；５３８位における突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；４８６位における突然変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；４９９位における突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、本明細書に記載される遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、１つの開裂ハーフドメイン中の４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される遺伝子操作された開裂ハーフドメインを産生することによって、および別の開裂ハーフドメイン中の４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される遺伝子操作された開裂ハーフドメインを産生することによって、調製された。本明細書に記載される遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小化または消失される、偏性ヘテロ二量体突然変異体である。ある特定の実施形態では、この遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４８６位、４９９位および４９６位における突然変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える突然変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換える突然変異、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える突然変異（それぞれ、「ＥＬＤ」ドメインおよび「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、この遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位における突然変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える突然変異（それぞれ、「ＫＫＫ」ドメインおよび「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、この遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４９０位および５３７位における突然変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える突然変異（それぞれ、「ＫＩＫ」ドメインおよび「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号を参照）。本明細書に記載される遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、例えば、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位指定突然変異誘発によって、任意の適切な方法を使用して調製できる。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「開裂酵素（ｓｐｌｉｔ−ｅｎｚｙｍｅ）」技術を使用して、核酸標的部位においてｉｎ ｖｉｖｏでアセンブルされ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照）。斯かる開裂酵素の構成成分は、別々の発現構築物のいずれか上に発現され得るか、または、例えば、自己開裂性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分離されて、１つのオープンリーディングフレームで連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載される酵母ベースの染色体系における使用の前に、活性についてスクリーニングされ得る。ヌクレアーゼ発現構築物は、本技術分野で公知の方法を使用して容易に設計され得る。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのＲＮＡ構成成分
Ｃａｓ９関連のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって空間が置かれたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含む、２つのＲＮＡ非コード構成成分：ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを含む。ゲノム遺伝子操作を達成するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ １２３１１４３を参照）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物を介して、または別々のＲＮＡとして、供給される。他の実施形態では、遺伝子操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合されてキメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ぶ）を生じる、キメラＲＮＡが構築される（Ｊｉｎｅｋ同書およびＣｏｎｇ、同書を参照）。
キメラまたはｓｇＲＮＡは、任意の所望の標的に対して相補的な配列を含むように、遺伝子操作され得る。これらのＲＮＡは、形態Ｇ［ｎ１９］とその後の形態ＮＧＧのプロトスペーサー−隣接モチーフ（ＰＡＭ）の、標的に相補的な２２塩基を含む。したがって、１つの方法では、ｓｇＲＮＡは、（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列を、関連ゲノム（ヒト、マウス、または特定の植物種）の参照配列とアラインメントし；（ｉｉ）ＺＦＮハーフ部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）間のスペーサー領域を同定し；（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を同定し（１つよりも多いそのようなモチーフがスペーサーと重複する場合、このスペーサーに対して中心にあるモチーフが選択される）；（ｉｖ）ｓｇＲＮＡのコアとしてそのモチーフを使用することによって、目的の遺伝子中の既知のＺＦＮ標的の利用によって設計され得る。この方法は、有利には、証明されたヌクレアーゼ標的に依存する。あるいは、ｓｇＲＮＡは、Ｇ［ｎ２０］ＧＧ式に従う適切な標的配列を同定することによって、任意の目的の領域を簡単に標的化するために設計され得る。相補性領域に沿って、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分のテイル領域まで延びるさらなるヌクレオチドを含み得る（Ｈｓｕら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７を参照）。テイルは、＋６７〜＋８５ヌクレオチドのもの、またはそれらの間の任意の数のものであり得、＋８５ヌクレオチドが好ましい長さである。トランケートされたｓｇＲＮＡ、「ｔｒｕ−ｇＲＮＡ」もまた使用され得る（Ｆｕら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２巻（３号）：２７９頁を参照）。ｔｒｕ−ｇＲＮＡでは、相補性領域は、１７または１８ヌクレオチド長まで減少される。
さらに、代替的ＰＡＭ配列もまた利用され得、このとき、ＰＡＭ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を使用して、ＮＧＧの代替としてＮＡＧであり得る（Ｈｓｕ ２０１４年、同書）。さらなるＰＡＭ配列には、最初のＧを欠くものも含まれ得る（ＳａｎｄｅｒおよびＪｏｕｎｇ（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２巻（４号）：３４７頁）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓがコードするＣａｓ９のＰＡＭ配列に加えて、他の細菌供給源由来のＣａｓ９タンパク質に特異的な他のＰＡＭ配列が使用され得る。例えば、以下に示すＰＡＭ配列（ＳａｎｄｅｒおよびＪｏｕｎｇ、同書、ならびにＥｓｖｅｌｔら（２０１３年）Ｎａｔ Ｍｅｔｈ １０巻（１１号）：１１１６頁から適応させた）が、これらのＣａｓ９タンパク質に特異的である：
したがって、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系との使用に適切な標的配列は、以下のガイドラインに従って選択され得る：［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９またはｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇ。あるいは、このＰＡＭ配列は、ガイドラインＧ［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、ｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従い得る。非Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌由来のＣａｓ９タンパク質について、代替的ＰＡＭがＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＰＡＭ配列を置換した、同じガイドラインが使用され得る。
潜在的なオフターゲット配列を回避する最も高い尤度の特異性を有する標的配列を選択することが、最も好ましい。これらの望ましくないオフターゲット配列は、以下の特質を考慮することによって同定され得る：ｉ）利用されているＣａｓ９タンパク質と共に機能することが公知のＰＡＭ配列が後に続く標的配列における類似性；ｉｉ）所望の標的配列からの３つよりも少ないミスマッチを有する、同様の標的配列；ｉｉｉ）ｉｉ）のような類似の標的配列であって、ここで、ミスマッチは、ＰＡＭ近位領域ではなくＰＡＭ遠位領域中に全て位置する（「シード」領域（Ｗｕら（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ２８８９）と呼ばれることもある、ＰＡＭに直ぐに隣接するまたはＰＡＭに近位のヌクレオチド１〜５が、認識にとって最も重要であり、したがって、シード領域中に位置するミスマッチを有する推定オフターゲット部位が、ｓｇＲＮＡによって認識される可能性が最も低い可能性があるという、いくつかの証拠が存在する）；ならびにｉｖ）ミスマッチが連続的には離れていない、または４よりも多いヌクレオチド離れた、類似の標的配列（Ｈｓｕ ２０１４年、同書）。したがって、上記これらの基準を使用して、いずれのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系が用いられているかについて、ゲノム中の潜在的なオフターゲット部位の数の分析を実施することによって、ｓｇＲＮＡに適切な標的配列が同定され得る。
ドナー
上述した通り、例えば、変異遺伝子を修正するための、または野生型遺伝子の発現を増加させるための、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも言う）の挿入。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかとなる。ドナー配列は、２つの相同な領域に隣接する非相同配列を含有し、目的の位置での効率的なＨＤＲを可能とする。あるいは、ドナーは、ＤＮＡの標的位置に相同な領域を持っていなくともよく、標的部位での切断に続くＮＨＥＪ依存的末端結合によって組み込まれていてもよい。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の目的の領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに相同ないくつかの不連続な領域を含有することができる。例えば、常態では目的の領域に存在しない標的化された配列を挿入するために、前記配列を、ドナー核酸分子中に存在させることができ、目的の領域中の配列に相同な領域を隣接させることができる。
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一本鎖および／または二本鎖であってもよく、直鎖状または環状の形態で細胞内に導入することができる。米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号および第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。直鎖状の形態で導入される場合、当業者に公知の方法によって、ドナー配列の末端を保護する（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）ことができる。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’端に添加する、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドを一端または両端にライゲーションする。例えば、Ｃｈａｎｇら、１９８７年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８４巻：４９５９〜４９６３頁、Ｎｅｈｌｓら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法としては、末端アミノ基（複数可）の追加、および例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダートやＯ−メチルリボースもしくはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間の結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターや抗生物質耐性をコードしている遺伝子などの追加的な配列を有するベクター分子の部分として、細胞内に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドを、ネイキッド核酸として、リポソームやポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として、導入することができ、また、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。
ドナーは、一般に、組み込み部位の内因性プロモーター、即ちドナーが挿入されている内因性遺伝子（例えば、グロビン、ＡＡＶＳ１など）の発現を駆動するプロモーターによって、発現が駆動されるように挿入される。しかし、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成性のプロモーターまたは誘導可能なもしくは組織特異的なプロモーターを含み得ることが明らかとなる。
ドナー分子は、内因性遺伝子の全てもしくは一部が発現するか、または発現しないように、内因性遺伝子内に挿入されていてもよい。他の実施形態では、導入遺伝子（グロビンをコードする配列があるものまたはないもの）は、任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。例えば、米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号、第２００８０１５９９９６号および第２０１０００２１８２６４号を参照されたい。
さらに、発現を必要としていなくとも、外因性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルも含み得る。
送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されているタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、任意の適当な手段によって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで送達してもよい。
本明細書に記載されているようなヌクレアーゼの送達方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、第６，５０３，７１７号、第６，５３４，２６１号、第６，５９９，６９２号、第６，６０７，８８２号、第６，６８９，５５８号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号および第７，１６３，８２４号に記載されており、それらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。
また、本明細書に記載されているようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を、１種または複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（複数可）をコードする配列を含有するベクターを使用して送達してもよい。以下に限定されないが、プラスミドベクター、ＤＮＡミニサークル、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターなど、ならびにそれらの組合せを含めた任意のベクター系を使用してもよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号および第７，１６３，８２４号、ならびに米国特許出願第１４／２７１，００８号も参照されたい。さらに、任意のこれらのベクターが、処置に求められる１種または複数の配列を含んでもよいことは明らかである。そのため、１種または複数のヌクレアーゼおよびドナー構築物を細胞内に導入する際に、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドを同じベクターまたは異なるベクターに保有させてもよい。複数のベクターを使用する際には、各ベクターは、１種または複数種のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列を含んでもよい。
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、ネイキッド核酸、およびリポソームやポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは細胞へ送達された後に、エピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのどちらかを有する。遺伝子治療の手順については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）、ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：２１１〜２１７頁（１９９３）、ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）、Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）、Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻：３５〜３６頁（１９９５年）、ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）、Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中のＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｈｍ著（１９９５年）およびＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：１３〜２６頁（１９９４年）を参照されたい。
核酸の非ウイルス送達方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、キャップされたＲＮＡ、人工ビリオン、および薬剤で増強されたＤＮＡ取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。
追加的な例示の核酸送達系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ケルン、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド州）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、マサチューセッツ州）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ、（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号、および第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質としては、ＦｅｌｇｎｅｒのＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）、Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）、Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５巻：６４７−６５４（１９９４年）、Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）、Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）、ならびに米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号および第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
追加的な送達方法としては、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）内へのパッケージングを使用することが挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織に対する特異性を有し、かつ他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞の表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれる。細胞内に取り込まれると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻（７号）、６４３頁を参照されたい）。
遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化した過程を利用する。ウイルスベクターは、対象に直接投与（ｉｎ ｖｉｖｏ）することができるか、またはインビトロで細胞を処置するために使用することができ、修飾された細胞は対象に投与される（ｅｘ ｖｉｖｏ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達するための従来のウイルスに基づく系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチン、および単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み入れることによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大させる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高ウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列に用いるパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングには十分であり、それらは、次いで、治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用されて、導入遺伝子の永続的な発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）、Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．、１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
一過性発現が好適な用途では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質移入が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現を得ている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。また、アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療の手順（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照されたい）に用いるために、細胞に標的核酸を形質導入することもできる。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ、８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含めた多数の刊行物に記載されている。
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験の遺伝子移入に利用可能であり、それらは、形質導入薬剤を生成するために、ヘルパー細胞株内に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ、８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）、Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）、Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ、９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓでパッケージされたベクターについて、５０％またはそれ超の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）、Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１巻：１１１〜２頁（１９９７年）。）
組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型および非病原性のパルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５塩基対（ｂｐ）の逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム内への組込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の鍵となる特長である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３５１巻：９１１７号 １７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、ならびにそれらの全てのバリアントを含めた他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターのほとんどは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えて、その後、複製欠損性ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞で増殖するように、遺伝子操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出されるものなど非分裂性の分化細胞を含む、複数の種類の組織をｉｎ ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな保有能力を有する。臨床試験でＡｄベクターを使用する例では、筋肉内注入を用いた抗腫瘍免疫化のポリヌクレオチド治療が含められた（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子移入に用いるアデノウイルスベクターの使用の追加的な例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）、Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）、Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）、Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が挙げられる。
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内に核酸ベクターをパッケージングする生産細胞株によって生成される。これらのベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている他のウイルス配列を含有する。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム内へのパッケージングおよび組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを具える。ウイルスＤＮＡは、細胞株中にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子即ち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠失したヘルパープラスミドを含有する。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠失しているため、有意な量にはパッケージングされない。アデノウイルスによる夾雑は、例えば、ＡＡＶよりも感受性があるアデノウイルスに対する熱処理によって低減することができる。
多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターが、高度な特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選ばれる。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスを修飾して、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現しているある特定のヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質をウイルスが発現する、他のウイルス−標的細胞の対にまで及び得るものである。例えば、線状ファージを遺伝子操作して、事実上いかなる選ばれた細胞受容体にも特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示することができる。上記の記載は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを遺伝子操作して、特異的な標的細胞による取り込みに好都合な特異的な取り込み配列を含有させることができる。
遺伝子治療ベクターは、下記に説明するように、個々の対象への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって、ｉｎ ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）や万能ドナーの造血幹細胞などの細胞に、ベクターをｅｘ ｖｉｖｏで送達し、続いて、通常はベクターを組み入れた細胞を選択した後に、患者への細胞の再移植を行うことができる。
また、ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触の内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかに依り、そのような経路としては、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する適当な方法は、利用可能であり、当業者に周知であり、そして、１つよりも多い経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路は、別の経路よりも速やかかつ有効な反応を提供することができる。
本明細書に記載されているポリヌクレオチドの導入に適したベクターとしては、非組み込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻：１１３８２〜１１３８８頁、Ｄｕｌｌら（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：８４６３〜８４７１頁、Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９８７３〜９８８０頁、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：２１７〜２２２頁、米国特許出願公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。
薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、下記に記載するように、利用可能な医薬組成物の実に様々な適当な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照されたい）。
ヌクレアーゼをコードする配列とドナー構築物とを、同じまたは異なる系を使用して送達することができることが明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドをベクターによって保有することができ、一方、１種または複数のヌクレアーゼをＡＡＶベクターによって保有することができる。さらに、これらの異なるベクターを、同じまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内注射および／または筋肉内注射）によって投与することができる。これらのベクターを、同時にまたは任意の順番で、送達することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｖｏとの両方の投与に用いる製剤としては、液体中懸濁液物または乳濁液が挙げられる。多くの場合、活性成分は、薬学的に許容され、かつ活性成分に適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せが挙げられる。さらに、組成物は、湿潤剤もしくは乳濁剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の効果を高める他の試薬などの微量の補助的な物質を含有していてもよい。
植物の送達
上述したように、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、種々の従来の技法によって、所望の植物宿主（例えば、そのゲノム）内に導入することができる。そのような技法の総説については、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）、第８節、４２１〜４６３頁およびＧｒｉｅｒｓｏｎ ＆ Ｃｏｒｅｙ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８年、第２版）、Ｂｌａｃｋｉｅ、ロンドン、第７〜９章を参照されたい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９０２０５０８３号、第２０１０／０１９９３８９号、第２０１１０１６７５２１号および第２０１１０１８９７７５号も参照されたい。
例えば、ポリヌクレオチドを、植物プロトプラストのエレクトロポレーションやマイクロインジェクションなどの技法を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡへ直接的に導入することができ、または、ポリヌクレオチドを、ＤＮＡ粒子衝撃などの遺伝子銃法を使用して、植物組織に直接的に導入することができる（例えば、Ｋｌｅｉｎら（１９８７年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻：７０〜７３頁を参照されたい）。あるいは、ポリヌクレオチド（複数可）を、ナノ粒子形質転換を介して植物細胞内へ導入することができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９０１０４７００号を参照されたい）。あるいは、ＤＮＡ／ＲＮＡ構築物を、適当なＴ−ＤＮＡ境界／隣接領域と組み合わせて、従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターへ導入することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性トランスフェクション技法は、癌遺伝子の無害化ならびにバイナリーベクターの開発および使用を含めて、科学文献に詳しく記載されている。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３巻：４９６〜４９８頁およびＦｒａｌｅｙら（１９８３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８０巻：４８０３頁を参照されたい。
また、遺伝子移入を、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＧＲ２３４、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｏｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ、ジャガイモＸウイルス、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスならびに／またはタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム細菌またはウイルスを使用して達成することができる。例えば、Ｃｈｕｎｇら（２００６年）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、１１巻（１号）：１〜４頁を参照されたい。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主の病原性機能は、バイナリーＴ−ＤＮＡベクター（Ｂｅｖａｎ（１９８４年）、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１２巻：８７１１〜８７２１頁）または共培養手法（Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７巻：１２２９〜１２３１頁）を使用して細胞を細菌に感染させる際に、構築物および隣接マーカーを含有するＴ鎖が植物細胞のＤＮＡに挿入されるように誘導する。一般に、アグロバクテリウム形質転換系は、双子葉植物を遺伝子操作するために使用される（Ｂｅｖａｎら（１９８２年）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．、１６巻：３５７〜３８４頁、Ｒｏｇｅｒｓら（１９８６年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１８巻：６２７〜６４１頁）。アグロバクテリウム形質転換系はまた、ポリヌクレオチドを単子葉植物および植物細胞に形質転換および移入するために使用することができる。米国特許第５，５９１，６１６号、Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎら（１９８４年）、ＥＭＢＯＪ３巻：３０３９〜３０４１頁、Ｈｏｏｙｋａｓｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１１巻：７６３〜７６４頁、Ｇｒｉｍｓｌｅｙら（１９８７年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２５巻：１６７７〜１７９頁、Ｂｏｕｌｔｏｎら（１９８９年）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１２巻：３１〜４０頁およびＧｏｕｌｄら（１９９１年）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９５巻：４２６〜４３４頁を参照されたい。
代替的な遺伝子移入および形質転換の方法としては、ネイキッドＤＮＡ／ＲＮＡのカルシウム媒介性、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性またはエレクトロポレーション媒介性の取り込みを介したプロトプラストの形質転換（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４年）、ＥＭＢＯＪ３巻：２７１７〜２７２２頁、Ｐｏｔｒｙｋｕｓら（１９８５年）、Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．、１９９巻：１６９〜１７７頁、Ｆｒｏｍｍら（１９８５年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２巻：５８２４〜５８２８頁およびＳｈｉｍａｍｏｔｏ（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３８巻：２７４〜２７６頁を参照のこと）、および植物組織のエレクトロポレーション（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２年）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、４巻：１４９５〜１５０５頁）が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞の形質転換に用いる追加的な方法としては、マイクロインジェクション、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））媒介性ＤＮＡ取り込み（Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０年）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、９巻：４１５〜４１８頁）および微粒子銃（Ｋｌｅｉｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻：４３０５〜４３０９頁およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０年）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２巻：６０３〜６１８頁を参照されたい）が挙げられる。
上記の任意の形質転換技法によって作製された形質転換植物細胞を培養して、形質転換された遺伝子型と、それゆえ所望の表現型とを具えている全植物体を再生することができる。そのような再生技法は、組織培養増殖培地中のある特定の植物ホルモンを操作することに依り、典型的には、所望のヌクレオチド配列と共に導入されている殺生物剤マーカーおよび／または除草剤マーカーに依る。培養プロトプラストからの植物の再生は、Ｅｖａｎｓら、「Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、１２４〜１７６頁、Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９８３年、およびＢｉｎｄｉｎｇ、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、２１〜７３頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９８５年に記載されている。また、再生を、植物のカルス、外植片、器官、花粉、胚またはそれらの一部から得ることもできる。そのような再生技術は、Ｋｌｅｅら（１９８７年）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．、３８巻：４６７〜４８６頁に概ね記載されている。
植物細胞内へ導入される核酸は、本質的に任意の植物に、所望の形質を付与するために使用することができる。実に様々な植物および植物細胞系を、本開示の核酸構築物および上述の様々な形質転換方法を使用して、本明細書に記載されている所望の生理学的および農学的特徴のために遺伝子操作することができる。好適な実施形態では、遺伝子操作のための標的植物および植物細胞としては、穀物作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、アワ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）を含む作物；顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹およびマツ（例えば、マツ、モミ、トウヒ）；ファイトレメディエーションで使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）や実験目的のために使用される植物（例えば、アラビドプシス）などの、単子葉植物および双子葉植物が挙げられるが、これらに限定されない。そのため、開示されている方法および組成物は、以下に限定されないが、アスパラガス属（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、ムカシヨモギ属（Ｅｒｉｇｅｒｏｎ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、キャッサバ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オオアラセイトウ属（Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）、ササゲ属（Ｖｉｇｎａ）およびトウモロコシ属（Ｚｅａ）に由来する種（これらに限定されない）を含めて、広範な植物にわたって使用されている。
植物細胞へ導入された核酸の導入を、本質的に任意の植物に所望の形質を付与するために使用することができる。ある特定の実施形態では、植物細胞中の変更されたＭＤＨ発現／機能は、果実の収量の増加、植物（またはその植物の果実）のバイオマスの増加、より高い果肉含量、着果の集中、より大きな植物体、新鮮重の増加、乾燥重の増加、固体肉質の増加、より高い収穫時総重量、作物の色合いの強度および／または均一性の向上、化学物質（例えば、油、脂肪酸、炭水化物、タンパク質）の特性の変更などを有する植物をもたらす。
当業者は、外因性の配列を植物細胞内へ一過的に組み入れることができることを認識することになる。外因性ポリヌクレオチド配列の導入は、当該配列が導入されている植物細胞の細胞機構を利用することができる。植物細胞内へ一過的に組み入れられたＺＦＮを含む外因性のポリヌクレオチド配列の発現は、標的配列のゲノムＤＮＡを解析することによってアッセイされて、任意のインデル、逆位または挿入を同定し決定することができる。これらの再編成の種類は、ゲノムＤＮＡ配列内の標的部位の切断、およびそれに続くＤＮＡ修復に起因する。さらに、当業者に公知のマーカー遺伝子発現の試験を可能にする方法を使用して、外因性ポリヌクレオチド配列の発現をアッセイすることができる。種々の植物、組織およびＤＮＡ送達系を使用したマーカー遺伝子の一過的発現が、報告されている。一過的解析系としては、目的の任意の植物種を使用した任意の一過的な植物アッセイに際しての、エレクトロポレーションまたは組織の粒子衝撃を介した直接的な遺伝子送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような一過的な系としては、種々の組織源由来のプロトプラストのエレクトロポレーション、または目的の特異的な組織の粒子衝撃が挙げられるが、これらに限定されない。本開示は、部位特異的なエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）を評価するための、およびＭＤＨ標的遺伝子内に変異を導入するための、任意の一過的発現系の使用を包含する。適切な送達系を介した一過的発現体を試験することが想定される植物組織の例としては、葉脚組織、カルス、子葉、根、内胚乳、胚、花組織、花粉および表皮組織が挙げられるが、これらに限定されない。
当業者は、外因性ポリヌクレオチド配列を形質転換植物に安定に組み入れることができるということを認識する。外因性ポリヌクレオチド配列は、作動可能であることが確認されると、雌雄間交配によって他の植物体へ導入することができる。交配させる種に応じて、多くの任意の標準的な育種技法を使用することができる。
形質転換した植物細胞、カルス、組織または植物体は、形質転換しているＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされている形質について、遺伝子操作された植物材料を選択またはスクリーニングすることによって、同定または単離されてもよい。例えば、形質転換している遺伝子構築物が抵抗性を付与する、阻害量の抗生物質または除草剤を含有する培地上に、遺伝子操作した植物材料を増殖させることによって、選択を行うことができる。さらに、形質転換された植物体または植物細胞は、組換え核酸構築物上に存在し得る任意の可視マーカー遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）の活性をスクリーニングすることによって、同定することもできる。そのような選択またはスクリーニングの方法論は、当業者に周知である。
また、物理学的または生化学的な方法を、安定に挿入された遺伝子構築物を含有する植物体もしくは植物細胞の形質転換体、または部位特異的なエンドヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）の一過的発現によって生じる標的遺伝子を変更したゲノムＤＮＡを含有する植物細胞を同定するために、使用することができる。これらの方法としては、１）組換えＤＮＡ挿入物の構造を検出して決定するためのサザン解析またはＰＣＲ増幅、２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出して調べるためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長または逆転写酵素−ＰＣＲ増幅、３）酵素またはリボザイム活性を検出するための、当該遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされている酵素アッセイ、４）遺伝子構築物の産物がタンパク質である、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット技法、免疫沈降または酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色や免疫染色などの追加的な技法もまた、特異的な植物器官および組織での組換え構築物の存在または発現を検出するために、使用することができる。全てのこれらのアッセイを行うための方法は、当業者に周知である。
本明細書に開示されている方法を使用した遺伝子操作の効果は、例えば、目的の組織から単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットによって、観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在するか、またはｍＲＮＡ量が増える場合に、対応の導入遺伝子が発現していることが推察され得る。遺伝子および／またはコードされたポリペプチドの活性を測定する他の方法を使用することができる。使用された基質に応じて、および、反応産物または副産物の増加または減少を検出する方法に応じて、異なる種類の酵素アッセイを使用することができる。発現されているポリペプチドのレベルを、免疫化学的に、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および電気泳動検出アッセイによる（または染色もしくはウェスタンブロッティンングを用いてのどちらか）などの抗体に基づく当業者に周知の他のアッセイなどで測定することもできる。非限定的な一例として、ＥＬＩＳＡアッセイを使用したＡＡＤ−１およびＰＡＴタンパク質の検出が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９００９３３６６に記載されている。導入遺伝子は、植物の一部の組織中でもしくは一部の生育ステージで選択的に発現するか、または、導入遺伝子は、実質的に全ての植物組織中で、実質的に全ての生活サイクルに合わせて、発現する場合がある。しかし、任意の組合せの発現様式もまた利用可能である。
本願の開示は、先に記載されている形質転換植物の種子をも包含し、ここで、種子は導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。本開示は、さらに、先に記載されている形質転換植物の子孫、クローン、細胞株または細胞を包含し、ここでは、前記子孫、クローン、細胞株または細胞は、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。
融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）および融合タンパク質をコードする発現ベクターは、遺伝子調節、標的化された切断および／または組換えに用いる植物に、直接的に投与することができる。ある特定の実施形態では、植物は、複数のパラロガスなＭＤＨ標的遺伝子を含有する。そのため、植物中のこれらの１種または複数のパラロガスな遺伝子を標的化するために、１種または複数の異なる融合タンパク質または融合タンパク質をコードする発現ベクターを、植物に投与することができる。
有効量の投与は、処理する植物細胞に最大に接触させるよう融合タンパク質を導入するために通常使用される任意の経路に依る。ＺＦＰは、任意の適当な方式で、好ましくは許容可能な担体を用いて投与される。そのようなモジュレーターを投与する適当な方法は利用可能であり、当業者に周知であり、そして、特定の組成物を投与するために、１種よりも多い経路を利用することができるものの、多くの場合、特定の経路は、別の経路よりも速やかかつ有効な反応を提供する。
また、担体が使用されてもよく、投与されている特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用する特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、利用可能な担体の実に様々な適当な製剤が存在する。
（実施例１）：ｓｇＲＮＡの設計
所与のＺＦＮに指定された遺伝子座のゲノム編集の際に使用するためのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）の配列は、（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列を、関連ゲノム（ヒト、マウスまたは特定の植物種）の参照配列とアライメントし、（ｉｉ）ＺＦＮ−ハーフ部位間のスペーサー領域を同定し、（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を同定し（１つよりも多いそのようなモチーフがスペーサーと重複する場合、このスペーサーに対して中心にあるモチーフが選択された）、（ｉｖ）ｇＲＮＡのコアとしてそのモチーフを使用することによって同定された。表１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いて使用するための一連のｓｇＲＮＡを示す。目的の細胞を、表１のｓｇＲＮＡと接触させて遺伝子操作する。
（実施例２）：目的遺伝子に対するｓｇＲＮＡおよびｔｒｕ−ＲＮＡ
実施例１に記載されているように、ｓｇＲＮＡの設計は、種々の考慮、即ち（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列を、関連ゲノム（ヒト、マウスまたは特定の植物種）の参照配列とアラインメントし、（ｉｉ）ＺＦＮ−ハーフ部位間のスペーサー領域を同定し、（ｉｉｉ）使用されているＣａｓ９タンパク質に関連し、スペーサー領域に最も近いＰＡＭモチーフ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９を使用している場合のＧ［Ｎ１７−２０］（Ｇ／Ａ）Ｇ）の位置を同定し（１つよりも多いそのようなモチーフがスペーサーと重複する場合、スペーサーに対して中心にあるモチーフが選択された）、（ｉｖ）ｓｇＲＮＡのコアとしてそのモチーフを使用することを通して達成される。
下記の表２に示されているのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と本発明のｓｇＲＮＡとを用いた標的化のための遺伝子例である。また標示しているのは、これらの遺伝子に関連するｃＤＮＡの代表例のアクセッション番号である。
次いで、標的遺伝子を修飾するため、単鎖ガイドＲＮＡを、１つまたは複数の機能ドメインをコードするポリヌクレオチドおよび任意選択でドナー配列と併せて、細胞内へ導入する。
本明細書にて言及されている全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
開示は、理解を明確にする目的で、説明および例によっていくらか詳細に提供されているが、本開示の精神または範囲を逸脱することなく様々な変形および改変が実践され得ることは、当業者にとって明らかである。したがって、前出の記載および実施例は、限定として解釈されるべきものではない。

Claims (15)

  1. 細胞において内因性遺伝子の発現を修飾する方法であって、前記方法が、前記内因性遺伝子中の標的部位を認識する単一ガイドＲＮＡを含む第１の核酸分子および機能的ドメインをコードする第２の核酸分子を前記細胞に投与するステップを含み、前記機能的ドメインが、前記標的部位上で前記単一ガイドＲＮＡと会合し、それによって、前記内因性遺伝子の発現を修飾する、方法。
  2. 前記機能的ドメインが、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメインおよびヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記機能的ドメインが、ＩＩＳ型制限酵素ヌクレアーゼドメインまたはＣａｓタンパク質である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記機能的ドメインが転写活性化ドメインであり、前記内因性遺伝子の発現が増加される、請求項２に記載の方法。
  5. 前記機能的ドメインが転写抑制ドメインであり、前記内因性遺伝子の発現が阻害される、請求項２に記載の方法。
  6. 前記機能的ドメインがヌクレアーゼであり、前記内因性遺伝子が開裂される、請求項２に記載の方法。
  7. 前記ヌクレアーゼドメインが、前記Ｃａｓタンパク質によって含まれる、請求項６に記載の方法。
  8. 前記Ｃａｓタンパク質が、もう１つのヌクレアーゼ開裂ドメインを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記細胞が、哺乳動物細胞または植物細胞である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記哺乳動物細胞が幹細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記内因性遺伝子が、哺乳動物βグロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマグロビン遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、ハンチンチン（Ｈｕｎｇｔｉｎｇｉｎ）（Ｈｔｔ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、サーファクタントタンパク質Ｂ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡ Ｂ遺伝子、ＨＬＡ Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原ペプチド輸送体（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、グルココルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子およびＲＦＸ５遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  12. 前記内因性遺伝子が、植物ＦＡＤ２遺伝子、植物ＦＡＤ３遺伝子、植物ＺＰ１５遺伝子、植物ＫＡＳＩＩ遺伝子、植物ＭＤＨ遺伝子および植物ＥＰＳＰＳ遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  13. 哺乳動物βグロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマグロビン遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、ハンチンチン（Ｈｔｔ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、サーファクタントタンパク質Ｂ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡ Ｂ遺伝子、ＨＬＡ Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原ペプチド輸送体（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、グルココルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子およびＲＦＸ５遺伝子からなる群から選択される内因性遺伝子に結合する、単一ガイドＲＮＡ。
  14. 植物ＦＡＤ２遺伝子、植物ＦＡＤ３遺伝子、植物ＺＰ１５遺伝子、植物ＫＡＳＩＩ遺伝子、植物ＭＤＨ遺伝子および植物ＥＰＳＰＳ遺伝子からなる群から選択される内因性遺伝子に結合する、単一ガイドＲＮＡ。
  15. 配列番号１４９〜２１５からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の単一ガイドＲＮＡ。
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