JP2020530307A - 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
[0001]本出願は、2017年6月30日に出願された米国仮特許出願第62/527,937号、2018年4月18日に出願された米国仮特許出願第62/659,472号、および2018年5月1日に出願された米国仮特許出願第62/665,256号の利益を主張する。これらの出願は、参照により本明書に組み込まれる。
配列表
[0002]本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2018年6月29日に作製された前記ASCIIコピーの名称は、47533−726_601_SL.txtであり、サイズは5,955,965バイトである。
参照による組み込み
[0005]本明細書のすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的におよび個別に示されているのと同程度に参照により組み込まれる。本明細書の用語と組み込まれた参照の用語との間に矛盾がある場合では、本明細書の用語が支配する。
[0013]本明細書では、配列番号1〜配列番号19の核酸配列のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性または類似性を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)核酸配列である。配列同一性は、約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%から最大約100%であり得る。
[0017]本明細書では、操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子が開示される。
[0019]本明細書では、組成物を含む容器が開示される。
[0037]本明細書では、ガイド核酸の配列を細胞に導入するステップを含む、操作された細胞を作製する方法が開示される。
[0049]本明細書では、操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子が開示される。
[0051]本明細書では、AAV4 VP1およびVP2ヌクレオチド配列と、AAV6 VP3ヌクレオチド配列とを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)ヌクレオチド配列が開示される。
[0065]本明細書では、操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子が開示される。
[0067]本明細書では、野生型AAVヌクレオチド配列と比較して、VP1領域に第1の突然変異、およびVP3領域に第2の突然変異を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ヌクレオチド配列を含む、単離された天然に存在しない核酸が開示され、複数の細胞への導入時に、単離された天然に存在しない核酸は、野生型AAV核酸と比較して複数の細胞におけるAAV形質導入効率の増加をもたらす。場合によっては、AAVは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびそれらの任意の組み合わせのものであり得る。場合によっては、AAVは、AAV6であり得る。核酸は、DNAまたはRNAの少なくとも1つであり得る。場合によっては、核酸はDNAであり得る。場合によっては、突然変異は、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長の少なくとも1つを含むことができる。突然変異は、点突然変異であり得る。場合によっては、VP1領域の第1の突然変異は、FからLへの突然変異を含む。場合によっては、VP1領域の第1の突然変異は、AAVヌクレオチド配列の129位で生じ得る。場合によっては、VP3領域の第2の突然変異は、HからN、DからN、DからN、VからL、およびVからIからなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を含むことができる。VP3領域における第2の突然変異は、前記AAVヌクレオチド配列によってコードされるAAVポリペプチド配列の418、462、584、598、または642位で生じ得る。場合によっては、核酸は、F129L、H642N、およびD418Nの少なくとも1つを含むことができる。場合によっては、核酸は、F129L、H642N、およびL584Nの少なくとも1つを含むことができる。場合によっては、核酸は、F129L、H462N、またはV598Lの少なくとも1つを含むことができる。場合によっては、核酸は、F129L、H462N、またはV598Iの少なくとも1つを含むことができる。場合によっては、複数の細胞は、初代細胞であり得る。AAVヌクレオチド配列は、外因性受容体配列の少なくとも一部をコードすることができる。場合によっては、核酸を医薬組成物に製剤化することができる。場合によっては、野生型AAV核酸は、配列番号55と少なくとも60%の配列同一性を含むことができる。
[0073]本明細書では、配列番号1〜配列番号19のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性または類似性を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)核酸配列が開示される。場合によっては、配列の同一性は、約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%から最大約100%であり得る。
[0077]本明細書では、第1のVP1領域の第1の突然変異および第1のVP3領域の第2の突然変異;ならびに第2のVP1、第1のVP2、および第2のVP3配列、の少なくとも1つを含む複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子が開示され、第2のVP1、第1のVP2、および第2のVP3配列のうちの2つは第1のAAV血清型に由来し、第2のVP1、第1のVP2、および第2のVP3配列の1つは第2のAAV血清型に由来し、AAV粒子が細胞を形質導入する場合、AAV粒子は、複数の野生型AAV粒子と比較して増加した形質導入効率を付与する。場合によっては、第1および第2のAAV血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびそれらの任意の組み合わせから選択することができる。場合によっては、第1のAAV血清型および第2のAAV血清型は、AAV4およびAAV6、AAV5およびAAV6、AAV11およびAAV6、AAV12およびAAV6、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。第1のAAV血清型および第2のAAV血清型は、AAV4およびAAV6であり得る。第1のAAV血清型および第2のAAV血清型は、AAV5およびAAV6であり得る。第1のAAV血清型および第2のAAV血清型は、AAV11およびAAV6であり得る。第1のAAV血清型および第2のAAV血清型は、AAV12およびAAV6であり得る。場合によっては、第1および第2の突然変異は、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長からなる群から選択することができる。場合によっては、第1の突然変異と第2の突然変異は点突然変異である。点突然変異は、FからL、HからN、DからN、DからN、VからL、およびVからIからなる群から選択することができる。第1のVP1領域の第1の突然変異は、前記AAVヌクレオチド配列によってコードされるAAVポリペプチド配列の129位で生じ得る。第1のVP3領域における第2の突然変異は、前記AAVヌクレオチド配列によってコードされるAAVポリペプチド配列の418、462、584、598、および642からなる群から選択される位置で生じ得る。第1の突然変異および第2の突然変異は、F129L、H642N、およびD418N;F129L、H642N、およびL584N;F129L、H462N、およびV598L;F129L、H462N、およびV598Iからなる群から選択される少なくとも2つの突然変異であり得る。第1のVP1領域の第1の突然変異および第1のVP3領域の第2の突然変異は、F129L、H642N、およびD418Nから選択される少なくとも2つの突然変異であり得る。場合によっては、第1のVP1領域の第1の突然変異および第1のVP3領域の第2の突然変異は、F129L、H642N、およびL584Nから選択される少なくとも2つの突然変異であり得る。場合によっては、第1のVP1領域の第1の突然変異および第1のVP3領域の第2の突然変異は、L584N、F129L、およびH462Nから選択される少なくとも2つの突然変異であり得る。場合によっては、第1のVP1領域の第1の突然変異および第1のVP3領域の第2の突然変異は、F129L、H642N、およびV598Iから選択される少なくとも2つの突然変異であり得る。場合によっては、第1のVP1領域の第1の突然変異および第1のVP3領域の第2の突然変異は、ウイルスキャプシド配列の少なくとも一部で生じ得る。場合によっては、第1のVP1領域の第1の突然変異および第1のVP3領域の第2の突然変異は、AAVヌクレオチド配列のN末端またはC末端に生じる。場合によっては、細胞は哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞はヒト細胞であり得る。場合によっては、ヒト細胞は初代細胞であり得る。場合によっては、AAV粒子は、約200GC/mLから最大約1×108GC/mLの感染多重度(MOI)でAAV粒子を細胞に導入され得る。場合によっては、MOIは1×106GC/mLであり得る。場合によっては、MOIは、約2.77×1012GC/mlから2.80×1014GC/mlであり得る。場合によっては、形質導入率は、細胞の約30%、40%、50%、60%から最大100%であり得る。形質導入率は、フローサイトメトリーで測定することができる。場合によっては、AAV粒子は、外因性受容体の少なくとも一部をコードすることができる。AAV粒子は凍結保存することができる。場合によっては、AAV粒子は、細胞に導入する前に解凍することができる。AAV粒子は、適正製造基準(GMP)に適合し得る。
[0083]本明細書では、操作された細胞を作製する方法であって、CRISPRシステムを用いて遺伝子の少なくとも一部をゲノム破壊するステップ;およびキャプシドタンパク質または血清学的にキメラなキャプシドタンパク質の突然変異の少なくとも1つを含む複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を細胞に導入し、細胞を拡大するステップを含む方法が開示される。細胞は初代細胞であり得る。遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子であり得る。AAV粒子はAAV6であり得る。突然変異は、F129L、H642N、およびD418N;F129L、H642N、およびL584N;F129L、H462N、およびV598L;ならびにF129L、H462N、およびV598Iからなる群から選択することができる。血清学的にキメラなキャプシドタンパク質は、AAV4およびAAV6、AAV5およびAAV6、AAV11およびAAV6、AAV12およびAAV6、ならびにそれらの任意の組み合わせ由来のキャプシドの少なくとも一部を含むことができる。AAV粒子は、少なくとも1つの導入遺伝子をコードすることができる。導入遺伝子は、外因性受容体をコードすることができる。場合によっては、方法は、それを必要とする対象に、操作された細胞を投与することをさらに含むことができる。場合によっては、対象は、癌を有し得る。
[0085]本明細書では、AAV核酸配列中に突然変異F129LおよびL584Dを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)核酸配列が開示される。
[0087]本明細書では、AAV核酸配列中に突然変異F129LおよびL584Hを含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)核酸配列が開示される。
定義
[00129]「AAV」、「AAV構築物」、もしくは「組換えAAV」または「AAV」という用語は、AAV−1、AAV−2、AAV−3、AAV−4、AAV−5、AAV−6、AAV−7、AAV−8、AAV−9、AAV−10、AAV−11、またはAAV−12、scAAV、rh10、キメラもしくはハイブリッドAAV、あるいはその任意の組み合わせ、誘導体、または変異体を含む公知の血清型のいずれかのアデノ随伴ウイルスを指す。AAVは、エンベロープを持たない小さな一本鎖DNAウイルスである。それらは、非病原性パルボウイルスであり、複製にはアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、CMVなどのヘルパーウイルスが必要である。野生型AAVは、一般集団において通常であり、いずれもの公知の病理とは関連付けられない。ハイブリッドAAVは、1つのAAV血清型のキャプシドタンパク質および別のAAV血清型からのゲノム物質を含むAAVである。キメラAAVは、2つ以上のAAV血清型に由来する遺伝的および/またはタンパク質配列を含み、それらの2つ以上のAAV血清型の遺伝子配列に対して行われた突然変異を含むことができる。例示的なキメラAAVは、キメラAAVキャプシド、例えば、2つ以上のAAV血清型に由来するアミノ酸の1つ以上の領域を有するキャプシドタンパク質を含むことができる。AAV変異体は、その親AAVと比較してそのゲノムまたはタンパク質に1つ以上のアミノ酸突然変異、例えば、その親AAVと比較してそのキャプシドタンパク質に1つ以上のアミノ酸突然変異を含むAAVである。AAVには、本明細書で使用するとき、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV、およびヒツジAAVが含まれ、霊長類AAVは、非霊長類に感染するAAVを指し、非霊長類AAVは、鳥類動物に感染する鳥類AAVなどの非霊長類動物に感染するAAVを指す。場合によっては、野生型AAVは、repおよびcap遺伝子を含み、rep遺伝子はウイルスの複製に必要であり、cap遺伝子はキャプシドタンパク質の合成に必要である。本明細書で使用するとき、「組換えAAV」および「rAAV」という用語は、交換可能である。
[00139]本明細書で使用される「癌」という用語およびその文法的同等物は、その独特の特性−正常な制御の喪失−が無秩序な増殖、分化の欠如、局所的な組織浸潤、および転移をもたらす細胞の過剰増殖を指すことができる。本発明の方法に関して、癌は、任意の癌であり得、例えば、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門癌、肛門管、直腸、目の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、首、胆嚢、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液体腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、大網、および腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、および/または膀胱癌が挙げられる。本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、例えば、悪性型もしくは良性型の細胞または組織の異常な増殖を指す。
[00145]本明細書で使用される「チェックポイント遺伝子」という用語およびその文法的同等物は、免疫応答、例えば、有害な応答の制御されない伝播を軽減する免疫抑制フィードバックループの振幅を調節するように作用する阻害性プロセス(例えば、フィードバックループ)に関与する任意の遺伝子を指すことができる。これらの応答には、感染に対する免疫応答応および/または末梢自己寛容の維持中に発生する可能性のある付随的な組織損傷から保護する分子シールドへの貢献が含まれ得る。チェックポイント遺伝子の非限定的な例には、受容体の拡大CD28ファミリーおよびそれらのリガンドのメンバー、ならびに共阻害経路に関与する遺伝子(例えば、CTLA−4およびPD−1)が含まれ得る。「チェックポイント遺伝子」という用語は、免疫チェックポイント遺伝子を指す場合もある。
[00161]本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語およびその文法的同等物は、生物に移入される遺伝子または遺伝物質を指すことができる。例えば、導入遺伝子は、生物に導入される遺伝子を含むDNAのストレッチまたはセグメントであり得る。導入遺伝子が生物に導入された場合、その生物は、トランスジェニック生物と呼ばれる。導入遺伝子は、トランスジェニック生物でRNAまたはポリペプチド(例えば、タンパク質)を産生する能力を保持することができる。導入遺伝子は、RNAやDNAなどの様々な核酸で構成され得る。導入遺伝子は、TCR導入遺伝子などの操作されたT細胞受容体をコードすることができる。導入遺伝子はTCR配列であり得る。導入遺伝子は受容体であり得る。導入遺伝子は組換えアームを含み得る。導入遺伝子は、操作された部位を含むことができる。
概要
[00168]本明細書では、細胞内ゲノム移植を行うに有用な修飾されたアデノ随伴ウイルスベクター組成物および方法が開示される。細胞内ゲノム移植は、修飾されたアデノ随伴ウイルスベクターを利用する治療用途のための遺伝子的に修飾された細胞および核酸を含むことができる。全体にわたって記載されている組成物および方法は、操作された細胞の生理学的および免疫学的効力を改善する方法で外因性の細胞受容体を送達するために、突然変異されたまたはキメラなアデノ随伴ウイルスベクターを使用することができる。修飾されたアデノ随伴ウイルスベクターは、例えば、癌(例えば、転移性癌)対象を含む様々な適応症を治療するのに有用であり得る。例えば、自己末梢血リンパ球(PBL)は、アデノ随伴ウイルス法を使用して修飾され、癌細胞上の固有の突然変異、新抗原を認識する外因性の細胞受容体を発現させることができ、細胞内ゲノム移植の開示された組成物および方法で使用することができる。場合によっては、アデノ随伴ベクター修飾細胞はまた、少なくとも1つの遺伝子またはその一部のゲノム破壊を含むことがある。突然変異されたおよびキメラなアデノ随伴ウイルスベクターを利用するこれらの組成物、および細胞内ゲノム移植のために前記AAVベクターを利用する方法は、多くの利点を備えた癌治療を提供することができる。例えば、高効率の遺伝子導入、発現、細胞生存率の増加、組換え二本鎖切断の効率的な導入、および非相同末端接続(NHEJ)メカニズムよりも相同性指向修復(HDR)を優先するプロセス、ならびに相同組換え体の効率的な回収および拡大を提供することができる。
修飾されたアデノ随伴ウイルスベクター
[00180]場合によっては、ウイルスベクターを利用して、導入遺伝子を細胞に導入することができる。ウイルスベクターは、限定されないが、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノ随伴ウイルスであり得る。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターであり得る。場合によっては、アデノ随伴ウイルスを使用して、細胞受容体などの外因性導入遺伝子を導入することができる。場合によっては、ウイルスベクターは、場合によっては同質遺伝子であり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、場合によっては公知のSNPを有するゲノムの一部に組み込まれ得る。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、公知のSNPを有するゲノムの一部に組み込まれない。例えば、AAVは、対象自身のゲノムDNAと同質または相同になるように設計することができる。場合によっては、同質遺伝子ベクターは、相同組換えの効率を改善することができる。場合によっては、gRNAは、公知のSNPを有する領域を標的にしないに設計して、組み込みしたベクター導入遺伝子の発現を改善することができる。PD−1、CISH、AAVS1、CTLA−4などのチェックポイント遺伝子でのSNPの頻度を決定することができる。場合によっては、内因性TCR遺伝子でのSNPの頻度を決定することができる。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、非病原性の一本鎖DNAパルボウイルスであり得る。AAVは、約26nm径のキャプシドを有することができる。キャプシドの径はまた、場合によっては約20nmから約50nmであり得る。AAV一本鎖DNAゲノムの各末端は、ゲノム複製およびパッケージングに必要とされる唯一のシス作用要素であり得る逆方向末端反復配列(ITR)を含むことができる。ITRは任意のAAV血清型に由来し得る。例えば、ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはAAV12由来であり得る。場合によっては、ITRはAAV2由来である。ゲノムは、repとcapという2つのウイルス遺伝子を保有する。ウイルスは、2つのプロモーターおよび選択的スプライシングを利用して、複製に必要とされる4つのタンパク質(Rep78、Rep 68、Rep 52およびRep 40)を生成し、一方、第3のプロモーターは、3つの構造ウイルスキャプシドタンパク質1、2および3(VP1、VP2およびVP3)を、選択的スプライシングおよび選択的翻訳開始コドンの組み合わせを介して生成する。本明細書で使用するとき、VP1uは、VP1の固有配列(すなわち、VP2および/またはVP3と重複しない配列)である。3つのキャプシドタンパク質は、同じC末端533アミノ酸を共有し、一方、VP2およびVP1は、それぞれ65アミノ酸および202アミノ酸の追加のN末端配列を含む。AAVビリオンは、T=1の正二十面体対称に配置された、計60個のVP1、VP2、およびVP3のコピーを1:1:20の比率で含めることができる。場合によっては、REPタンパク質(例えば、Rep78、Rep 68、Rep 52またはRep 40)またはキャプシドタンパク質を修飾し、開示された組成物および方法で利用することができる。場合によっては、キャプシドは、3つのVP:VP1、VP2、およびVP3で構成される。VP1は、固有の137アミノ酸N末端領域(VP1u)に加えて、VP2配列全体を含み、VP2タンパク質は、65アミノ酸N末端領域(VP1/2共通地域)に加えて、VP3配列全体を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供されるAAVは、アセンブリ活性化タンパク質(AAP)を含む。特定の実施形態では、AAPは、キャプシドアセンブリを促進する。場合によっては、AAVは、例えば、キャプシドアセンブリを改善することによって、AAVキャプシドの構造および機能を増大させるために修飾されたAAPポリペプチドを含むことができる。
修飾されたAAVを製造する方法
[00215]本出願は、細胞内で1つ以上の目的のタンパク質を発現することができる組換えAAVを生成するための方法および材料を提供する。本明細書に記載されるように、本明細書に開示される方法および材料は、インビボで治療効果を達成するレベルで目的のタンパク質の高生産または生産を可能にする。目的のタンパク質の例は外因性受容体である。外因性受容体はTCRであり得る。
導入遺伝子
[00247]場合によっては、本明細書に開示される方法は、核酸(例えば、第1の核酸および/または第2の核酸)を含むことができる。場合によっては、核酸は導入遺伝子をエンコードすることができる。一般的に、導入遺伝子は、複数のヌクレオチドサブユニットを含む線状ポリマーを指し得る。導入遺伝子は、任意の数のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、約100個未満のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約100個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約200個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約300個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約400個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約500個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約1000個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約5000個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約10,000個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約20,000個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約30,000個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約40,000個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、少なくとも約50,000個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、約500〜約5000個のヌクレオチドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、約5000〜約10,000ヌクレオチドを含むことができる。本明細書に開示されるいずれの場合においても、導入遺伝子は、DNA、RNA、またはDNAとRNAのハイブリッドを含むことができる。場合によっては、導入遺伝子は、一本鎖であり得る。場合によっては、導入遺伝子は二本鎖であり得る。
CRISPRシステム
[00272]本明細書に記載される方法は、CRISPRシステムを利用することができる。少なくとも5種類のCRISPRシステムがあり、これらはすべてRNAおよびCasタンパク質を組み込む。タイプI、III、およびIVは、crRNAに相補的である核酸を切断することができるマルチCasタンパク質複合体をアセンブルする。タイプIとIIIはともに、処理されたcrRNAをマルチCasタンパク質複合体にアセンブルする前に、cr−RNA前処理を必要とする。タイプIIおよびVのCRISPRシステムは、少なくとも1つの誘導RNAと複合化した単一のCasタンパク質を含む。
であり得る。
[00297]ガイドRNAをコードするDNA配列はまた、ベクターの一部であり得る。ベクターのいくつかの例には、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工/ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクターが含まれる。例えば、RNA誘導型エンドヌクレアーゼをコードするDNAは、プラスミドベクターに存在する。適切なプラスミドベクターの他の非限定的な例には、pUC、pBR322、pET、pBluescript、およびそれらの変異体が含まれる。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列(例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など)、選択可能なマーカー配列(例えば、抗生物質耐性遺伝子)、複製起点などを含むことができる。
細胞膜へのベクター送達
[00317]ヌクレアーゼおよび転写因子、それをコードするポリヌクレオチド、および/および任意の導入遺伝子ポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の適切な手段により標的細胞に送達させることができる。
医薬組成物および製剤
[00347]全体にわたって記載される組成物は、薬学的な医薬に製剤化され得、それを必要とする、疾患、例えば癌と診断されたヒトまたは哺乳動物を治療するために使用することができる。これらの薬剤は、1つ以上の化学療法剤または化学療法化合物と併せて、1つ以上のT細胞(例えば、操作されたT細胞)とともにヒトまたは哺乳動物に同時に投与することができる。
レニウムRe 186エチドロネート;リゾキシン;リボザイム;RIIレチンアミド;ログレチミド;ロヒツカイン;ロムルチド;ロキニメックス;ルビジノンB1;ルボキシル;サフィンゴール;サントピン;SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスティム;Sdi 1模倣物;セムスチン;老化由来阻害剤1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シグナル伝達変調器;単鎖抗原結合タンパク質;シゾフィラン;ソブゾキサン;ボロカプテン酸ナトリウム;フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロール;ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン;スパルフォス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン;スポンギスタチン1;スクアラミン;幹細胞阻害剤;幹細胞分裂阻害剤;スチピアミド;ストロメリシン阻害剤;スルフィノシン;超活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト;スラディスタ;スラミン;スワインソニン;合成グリコサミノグリカン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム;テガフール;テルラピリリウム;テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テモゾロミド;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;タリブラスチン;チオコラリン;トロンボポエチン;トロンボポエチン模倣薬;チマルファシン;チモポエチン受容体アゴニスト;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;エチルエチオプルプリン錫;チラパザミン;チタノセンビクロライド;トップセンチン;トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキサート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼ阻害剤;チルホスチン;UBC阻害剤;ウベニメクス;泌尿生殖洞由来の増殖阻害因子;ウロキナーゼ受容体拮抗薬;バプレオチド;バリオリンB;ベクターシステム、赤血球遺伝子治療;ベラレソル;ベラミン;ベルジン;ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンサルチン;ビタキシン;ヴォロゾール;ザノテロン;ゼニプラチン;ジラスコルブ;およびジノスタチン刺激因子。一実施形態では、抗癌薬は、5−フルオロウラシル、タキソール、またはロイコボリンである。
キット
[00368]本明細書では、組成物を含むキットが開示され得る。また、本明細書には、癌、病原体感染、免疫障害もしくは同種異系移植の治療または予防用のキットが開示され得る。一実施形態では、キットは、有効量のCRISPRおよびAAV修飾された細胞の組成物を単位剤形で含む、治療用または予防用の組成物を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、操作されたT細胞の治療組成物を含むことができる滅菌容器を含む。このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、または当該技術分野において公知である他の適切な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネートペーパー、金属箔、または薬剤を保持するのに適した他の材料で作製することができる。場合によっては、CRISPRおよびAAV修飾された細胞は、癌、病原体感染、免疫障害もしくは同種異系移植を有するかまたは発症するリスクのある対象に細胞を投与するための説明書とともに提供することができる。説明書には、一般的に、癌、病原体感染、免疫障害、もしくは同種異系移植の治療または予防のための組成物の使用に関する情報を含めることができる。場合によっては、キットには、約1×104細胞から約1×1012細胞を含めることができる。場合によっては、キットは、少なくとも約1×105細胞、少なくとも約1×106細胞、少なくとも約1×107細胞、少なくとも約4×107細胞、少なくとも約5×107細胞、少なくとも約6×107細胞、少なくとも約6×107細胞、少なくとも約8×107細胞、少なくとも約9×107細胞、少なくとも約1×108細胞、少なくとも約2×108細胞、少なくとも約3×108細胞、少なくとも約4×108細胞、少なくとも約5×108細胞、少なくとも約6×108細胞、少なくとも約6×108細胞、少なくとも約8×108細胞、少なくとも約9×108細胞、少なくとも約1×109細胞、少なくとも約2×109細胞、少なくとも約3×109細胞、少なくとも約4×109細胞、少なくとも約5×109細胞、少なくとも約6×109細胞、少なくとも約6×109細胞、少なくとも約8×109細胞、少なくとも約9×109細胞、少なくとも約1×1010細胞、少なくとも約2×1010細胞、少なくとも約3×1010細胞、少なくとも約4×1010細胞、少なくとも約5×1010細胞、少なくとも約6×1010細胞、少なくとも約6×1010細胞、少なくとも約8×1010細胞、少なくとも約9×1010細胞、少なくとも約1×1011細胞、少なくとも約2×1011細胞、少なくとも約3×1011細胞、少なくとも約4×1011細胞、少なくとも約5×1011細胞、少なくとも約6×1011細胞、少なくとも約6×1011細胞、少なくとも約8×1011細胞、少なくとも約9×1011細胞、または少なくとも約1×1012細胞を含むことができる。例えば、約5×1010細胞をキットに含めることができる。別の例では、キットには、3×106細胞を含めることができる。細胞は、約5×1010細胞に拡大され、対象に投与することができる。
ヒトT細胞のAAV/CRISPRゲノム修飾
3日目:回復および刺激
[00371]10%ヒト血清をX−VIVO15培地に添加し、37℃で予め加温した。ヒトPBMCを水浴中で解凍した。解凍後すぐに、細胞を再懸濁し、300gで5〜10分間回転させた。細胞をPBSで洗浄し、血球計でカウントした。次に、細胞をX−VIVO15+10%ヒト血清+300U/mlのIL−2+5ng/mlのIL−7およびIL−15に1mlあたり100万個の細胞で再懸濁した。抗CD3および抗CD28 Dynabeadsを約1〜2の比率の細胞:ビーズ刺激するために添加した。細胞を3日間培養した。
[00372]細胞をPBSで洗浄し、約1分間、DynaMag15に入れた。ビーズを2回洗い流し、次に、細胞を1mlあたり100万個の細胞で、X−VIVO15+血清+IL−2+IL−7+IL−15に再懸濁し、ペレット化した。その後、細胞をトランスフェクション前に37℃で2時間培養した。
1日目:培地交換
[00375]形質導入の24時間後に、細胞を形質導入培地から取り出し、フェノールレッドおよびゲンタマイシンを含む培地(赤色培地)−血清およびIL−2+IL−7+IL−15−に移した。細胞を37℃で培養した。代表的なプロトコールの概略図、図11。
フローサイトメトリーによるTCR発現の決定
[00376]CTLA−4、PD−1、AAVS1、およびCISHでのCRISPRによるエレクトロポレーション後、およびrAAV6での形質導入後の3日目以降(典型的には3、7および14日目)に、フローサイトメトリーにより細胞をTCR導入遺伝子の発現について評価した。細胞のアリコートを培養物から回収し、洗浄し、ペレット化し、PBS+0.5%FBSで希釈されたAb(eBioscience Anti−Mouse TCRベータPE)1/100−試料あたり50〜100μl−に再懸濁した。再懸濁された細胞は、約50〜100μlのAbに含まれた。細胞を4℃で30分間インキュベートした。また、製造元の指示に従って、生存率染料eFluor780またはSYTOX Blue生存率染色を追加した。インキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄し、分析のために100〜200μlのPBSに再懸濁した。
ベクター構築およびウイルス生産を標的とするAAV
[00378]標的化ベクターは、相同性アームのDNA合成およびmTCR発現カセットのPCR増幅により生成された。合成された断片およびmTCRカセットは、制限酵素消化およびAAV2逆方向末端反復(ITR)配列の2つのコピー間のpAAV−MCS骨格プラスミド(Agilent)への連結によってクローニングされ、ウイルスパッケージングを促進した。図8。連結されたプラスミドをOne Shot TOP10の化学的にコンピテントな大腸菌(Thermo fisher)に形質転換した。各ベクターについて1mgのプラスミドDNAをEndoFree Plasmid Maxiキット(Qiagen)を使用して細菌から精製し、感染性AAVを生産するためにVigene Biosciences、MD USAに送付した。1mlあたり1×1013ウイルスゲノムコピーを超える精製されたウイルスの力価を決定し、表11、凍結ストックを作製した。
AAV修飾されたT細胞の臨床的拡大
[00379]多数の形質導入されたT細胞を生成するために、急速拡大プロトコール(REP)を使用して、T細胞が増殖するように誘導する。REPで使用される前に、T細胞は、抗CD3、抗CD28およびIL−2とともに培養が開始され、上で詳述したように培養開始後の2日目に形質導入される。細胞を75cm2フラスコで37℃、5%CO2で培養する。細胞をカウントし、培養中に保持される残りの時間、2日ごとに300IU/mLのIL−2を含む新鮮なT細胞培地に0.5×106細胞/mLの濃度で懸濁する。
AAVスクリーン:GFP滴定
[00380]細胞に導入した場合、形質導入の増加および結果として生じる発現を付与する推定AAV突然変異体およびキメラを同定および単離するために、スクリーンを行った。4つのAAV6突然変異体が生成された:F129L、H642N、およびD418N;F129L、H642N、およびL584N;F129L、H462N、またはV598L;およびF129L、H462N、またはV598I。OKT3および抗CD28活性化ヒトT細胞をCRISPR/Cas9でゲノム修飾し、AAVS1遺伝子をノックアウトした。CRISPR修飾の2時間後、各突然変異体のウイルス上清を使用して、1×106GC/mLから200GC/mLに下げたMOIでノックアウト細胞を形質導入した。
臨床試験
[00382]評価可能な癌を有する対象は、末梢血単核細胞を単離するためにアフェレーシスを受ける。リンパ球を単離し、外因性TCRをコードする組換えAAV6でウイルスによって形質導入し、拡大し、免疫学的試験のためにアリコートを採取する。T細胞投与の−7および−6日目に、対象は、1時間にわたって60mg/kg/日×2日のIVでシクロホスファミドの調製レジメンを受ける。細胞投与の−7および−3日目に、対象は、5日間、30分間にわたって毎日、フルダラビン25mg/m2/日のIVPBの調製レジメンを受ける。調製レジメン中、対象は毎日、全血球カウント(CBC)試験を受ける。
実施例6
定量的PCR
[00385]定量的PCR(qPCR)を使用して、T細胞注入の前および後の異なる時間点で回収したPBMC中のTCR導入遺伝子を検出することにより、組換えAAV6およびCRISPR修飾されたTリンパ球のAAV被積分を定量する。QIAamp DNA血液ミキキット(Qiagen)でDNAを抽出した後、ABI PRISM 7900HT配列検出システム(Applied Biosystems)を使用して、γδTCR導入遺伝子に特異的なプライマーおよびTaqManプローブ(Applied Biosystems)を用いてDNAを3重に増幅する。ベースライン範囲はサイクル6〜15に設定され、閾値はベースライン蛍光より10SD高い。DNA標準を生成するために、TCR導入遺伝子カセットをコードするDNAプラスミドの連続希釈を使用する。
修飾された組換えAAV6ウイルスの品質管理アッセイ
[00386]組換えAAV6ウイルスは、109個のHek293細胞から産生され、イオジキサノール勾配超遠心分離により精製された。得られたウイルスは500μlに濃縮され、ウイルス力価は1013vp/ml以上であった。品質管理アッセイを実施した:ウイルスの力価および純度を評価するために、qPCRおよび銀染色により決定される物理的力価(vg/ml)。AAV粒子はF68/PBSに保存された
組換えAAV6変異ウイルス産生および細胞形質導入
ウイルス産生
[00387]20個のウイルス変異体は、AAV6タンパク質のキャプシド配列に一重、二重、または三重の突然変異を含むように設計された(表1)。HEK293細胞は、組換えAAV6(表12のウイルス変異体のいずれか1つに特異的なap配列を含むプラスミド)、CMV−GFP、およびpヘルパープラスミドで同時トランスフェクトされた。トランスフェクションの72時間後、ウイルス粒子を回収し、AAVanced濃縮試薬で精製した。ウイルス力価は、CMVプロモーター標準曲線(Taqman)、y=−1.054ln(x)+36.685に基づいて計算された。R2=0.9755。細胞形質導入:20キャプシド変異体
[00388]細胞培養物は、形質導入前の3日間、抗CD3および抗CD28 Dynabeads(Gibco)で刺激された。0日目に、4×104のCD3+T細胞に、MOIが1×104GC/mLでウイルスを感染させた。ウイルス11、12、および18を形質導入した細胞は力価が低く、したがって、6000、800、および7300GC/mLなどの低いMOIをそれぞれ使用した。形質導入後の1日目に、培地(X−Vivo 15培地+10%ヒト血清(Sigma)、IL−2(3000U/ml)、IL−7(5ng/mL)、およびIL−15(5ng/mL)(Peptrotech))を交換した。形質導入後の7日目に、GFP発現をフローサイトメトリーにより測定し、図17A、図17B、および図17Cに要約した。
組換えAAV6変異体およびCRISPR
[00389]細胞培養物は、CRISPRによる編集前の3日間、抗CD3および抗CD28 Dynabeads(Gibco)で刺激された。0日目に、3×106個のCD3+T細胞は、パラメータ:パルス電圧1400、パルス幅10ms、3パルスを用いたNeonエレクトロポレーションシステムを使用して、Cas9 mRNA(15μg)、AAVS1 gRNA(10μg)をエレクトロポレートされた。細胞をエレクトロポレーション後に2時間インキュベートし、次に、組換えAAV6変異ウイルスと接触させた。
組換えAAV6変異スプライスアクセプターGFP滴定
[00392]4つの三重突然変異体(ウイルス番号:15、17、19、および20)をGFP発現パーセントに基づいて選択し、滴定アッセイで利用して、突然変異体(mutant variant)がより低いMOIでWT AAV6より優れているかどうかを決定した。細胞培養物は、CRISPRによる編集前に、抗CD3および抗CD28 Dynabeads(Gibco)で3日間刺激された。0日目に、3×106個のCD3+T細胞は、パルス電圧1400、パルス幅10ms、3パルスのエレクトロポレーションパラメータでNeonシステムを使用して、Cas9 mRNA(15μg)およびAAVS1 gRNA(10μg)でトランスフェクトされた。細胞は、エレクトロポレーション後の2時間、CRISPRでインキュベートされた。
スプライスアクセプターNanoLuc変異体
[00394]4つの三重突然変異体(ウイルス番号15、17、19、および20)を使用して、AAVS1スプライスアクセプターNanoLuc(CMV−NanoLuc)を含む組換えAAV6ウイルス粒子を生成した。NanoLucは、それが使用される実験の範囲および感受性を向上させる高度に発現されたレポーターである。細胞培養物は、CRISPRのよる編集前に、抗CD3および抗CD28 Dynabeads(Gibco)で3日間刺激された。0日目に、3×106個のCD3+T細胞は、パルス電圧1400、パルス幅10ms、3パルスのエレクトロポレーションパラメータでNeonシステムを使用して、Cas9 mRNA(15μg)およびAAVS1 gRNA(10μg)でトランスフェクトされた。細胞は、エレクトロポレーション後の2時間、CRISPRでインキュベートされた。
変異rAAV6
キメラNanoLuc滴定
[00397]細胞培養物は、CRISPRによる編集前の3日間、抗CD3および抗CD28 Dynabeads(Gibco)で刺激された。0日目に、3×106個のCD3+T細胞は、パルス電圧1400、パルス幅10ms、3パルスのエレクトロポレーションパラメータでNeonシステムを使用して、表16の核酸由来のCas9 mRNA(15μg)、およびAAVS1 gRNA(10μg)でトランスフェクトされた。細胞は、エレクトロポレーション後の2時間、CRISPRでインキュベートされた。
AAVスクリーン
[00400]新規なAAV血清型を同定するために、図25Bに示されるようにAAVシグネチャー領域の領域を増幅するゲノムDNAにおいてPCR反応を行った。対照プライマー1〜4は、領域AV1NS、19s、18as、およびAV2Casに対応する(Gaoら,2002年)。
CD34+細胞およびT細胞のAAVキメラ形質導入
CD34細胞
[00405]複数の細胞型におけるAAVキメラの相同組換えの有効性を評価するために、CD34+細胞は、10,000GC/mLのMOIでWT AAV6またはAAVキメラ3、5もしくは6(CMV NanoLucウイルス)で形質導入された。AAV6ウイルスおよびCRISPR(gRNA+Cas9)を対照として使用した。形質導入後の7日目に、細胞を発光(RLU)についてアッセイした。
キメラ3、5、または6で形質導入されたT細胞
[00407]細胞におけるAAVキメラの相同組換えの有効性を評価するために、T細胞は、10,000GC/mLのMOIでWT AAV6またはAAVキメラ3、5もしくは6(CMV NanoLucウイルス)で形質導入された。AAV6ウイルスおよびCRISPR(gRNA+Cas9)を対照として使用した。CRISPR編集は、TIDEによって88%の編集効率を有することが確認された。形質導入後の7日目および14日目に、細胞を発光(RLU)についてアッセイした。
キメラ6で形質導入されたT細胞
[00409]キメラ6(1e4 GC/mLのMOI ODで)が1e6 GC/mLのMOIでWT AAV6と比較する方法を決定するために、T細胞は、1e6または1e4 GC/mLのMOIでWT AAV6およびキメラ6(CMV NanoLucウイルス)に感染された。
Claims (232)
- 野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)ヌクレオチド配列と比較して、VP1領域に第1の突然変異、およびVP3領域に第2の突然変異を含むAAVキャプシドヌクレオチド配列を含む単離された天然に存在しない核酸であって、前記単離された天然に存在しない核酸は、複数の細胞と接触すると、野生型AAV核酸、または同等の複数の細胞における前記キャプシドタンパク質のVP領域における単一の突然変異を有するAAVヌクレオチド配列と比較して、前記複数の細胞におけるトランスフェクションまたは形質導入後の導入遺伝子の発現が増加している核酸。
- 野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)ヌクレオチド配列と比較して、VP1領域に第1の突然変異、およびVP2領域に第2の突然変異を含むAAVキャプシドヌクレオチド配列を含む単離された天然に存在しない核酸であって、前記単離された天然に存在しない核酸は、複数の細胞と接触すると、野生型AAV核酸、または同等の複数の細胞における前記キャプシドタンパク質のVP領域における単一の突然変異を有するAAVヌクレオチド配列と比較して、前記複数の細胞におけるトランスフェクションまたは形質導入後の導入遺伝子の発現が増加している核酸。
- 前記AAVヌクレオチド配列が、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびそれらの任意の組み合わせのものである、請求項1または2に記載の核酸。
- 前記AAVヌクレオチド配列がAAV6血清型のものである、請求項3に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸が、DNAまたはRNAの少なくとも1つである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸がDNAである、請求項5に記載の核酸。
- 前記第1の突然変異および前記第2の突然変異が、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長の少なくとも1つを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第1の突然変異および前記第2の突然変異が点突然変異である、請求項7に記載の核酸。
- 前記第1の突然変異が、前記VP1領域内のフェニルアラニン(F)コード配列の突然変異である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第1の突然変異が、前記核酸によってコードされるポリペプチドの129位のFコード配列にある、請求項9に記載の核酸。
- 前記突然変異が、前記ポリペプチドの129位のFから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする、請求項10に記載の核酸。
- 前記非極性脂肪族アミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、およびバリン(V)から選択される、請求項11に記載の核酸。
- 前記非極性脂肪族アミノ酸がLである、請求項12に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、前記ポリペプチドのロイシン(L)コード配列にある、請求項1および3〜8のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドの584位のLコード配列にある、請求項14に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、前記ポリペプチドの584位のLから極性アミノ酸への突然変異をコードする、請求項15に記載の核酸。
- 前記極性アミノ酸が、アスパラギン(N)およびグルタミン(Q)から選択される、請求項16に記載の核酸。
- 前記極性アミノ酸がNである、請求項17に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、584位のLから正に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする、請求項14〜18のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記正に帯電したアミノ酸がヒスチジン(H)である、請求項19に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、前記ポリペプチドの584位のLから負に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする、請求項14〜20のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記負に帯電したアミノ酸が、アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)から選択される、請求項21に記載の核酸。
- 前記負に帯電したアミノ酸がDである、請求項22に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、前記ポリペプチドのバリン(V)コード配列にある、請求項1および3〜8のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドの598位のVコード配列にある、請求項24に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、前記ポリペプチドの598位のVから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする、請求項25に記載の核酸。
- 前記非極性脂肪族アミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、およびバリン(V)から選択される、請求項26に記載の核酸。
- 前記非極性脂肪族アミノ酸がLである、請求項27に記載の核酸。
- 前記非極性脂肪族アミノ酸がIである、請求項27に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、前記ポリペプチドのヒスチジン(H)コード領域にある、請求項1および3〜8のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、前記ポリペプチドの642位のHコード領域にある、請求項30に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、前記ポリペプチドの642位のHから極性アミノ酸をコードする、請求項31に記載の核酸。
- 前記極性アミノ酸が、アスパラギン(N)およびグルタミン(Q)から選択される、請求項32に記載の核酸。
- 前記極性アミノ酸がNである、請求項33に記載の核酸。
- 前記第1の突然変異が、前記第2の突然変異の前の核酸の芳香族アミノ酸コード配列にあり、前記第2の突然変異が、前記核酸によってコードされるポリペプチドの非極性脂肪族アミノ酸をコードする、請求項1〜34のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記芳香族アミノ酸が、前記VP1領域によってコードされるVP1ポリペプチドの129位にある、請求項35に記載の核酸。
- 前記第1の突然変異が、前記第2の突然変異の前の前記配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が高いアミノ酸をコードする配列にある、請求項1〜36のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が、正に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸、負に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異をコードする、請求項1〜37のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異が保存的突然変異をコードする、請求項1〜38のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記保存的突然変異が、非極性脂肪族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から極性アミノ酸、正に帯電したアミノ酸から正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸から負に帯電したアミノ酸、および芳香族アミノ酸から芳香族アミノ酸からなる群から選択される、請求項39に記載の核酸。
- 前記第1の突然変異が、前記第2の突然変異の前の前記配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が低いアミノ酸をコードする配列にある、請求項1〜36のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記第2の突然変異がVP3領域にある場合、前記第2の突然変異が、HからN、DからN、DからN、VからL、およびVからIからなる群から選択される少なくとも1つの突然変異をコードする、請求項1〜41のいずれか一項に記載の核酸。
- VP3領域における前記第2の突然変異が、前記AAVヌクレオチド配列によってコードされるAAVポリペプチド配列の418、462、584、598、または642位で生じる、請求項42に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸が、F129L、H642N、およびD418N突然変異の少なくとも1つをコードする、請求項1〜43のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸が、F129L、H642N、およびL584N突然変異の少なくとも1つをコードする、請求項1〜43のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸が、F129L、H462N、およびV598L突然変異の少なくとも1つをコードする、請求項1〜43のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸が、F129L、H462N、およびV598I突然変異の少なくとも1つをコードする、請求項1〜43のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記複数の細胞が複数の初代細胞である、請求項1〜47のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸が、外因性受容体配列の少なくとも一部をコードする、請求項1〜48のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸が医薬組成物に製剤化される、請求項1〜49のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記野生型AAV核酸が、配列番号55と少なくとも60%の配列同一性を含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の核酸。
- F129L、H642N、およびD418Nからなる群から選択される少なくとも2つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- F129L、H642N、およびD584Nからなる群から選択される少なくとも2つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- F129L、H462N、およびV598Lからなる群から選択される少なくとも2つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- F129L、H642N、およびV598Iからなる群から選択される少なくとも2つの突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- 請求項52〜55のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列から生成された、単離および精製されたタンパク質。
- 配列番号1〜配列番号19の核酸配列のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性または類似性を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記配列同一性が、約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%から最大約100%である、請求項57に記載の単離および精製されたAAV核酸配列。
- VP1、VP2、およびVP3配列を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列を含む単離された天然に存在しない核酸であって、前記VP1、VP2、およびVP3配列のうちの2つは第1のAAV血清型に由来し、前記VP1、VP2、およびVP3配列の1つは第2のAAV血清型に由来し、前記単離された天然に存在しない核酸は、複数の細胞に導入すると、野生型AAV核酸と比較して、トランスフェクションまたは形質導入後の導入遺伝子の発現の増加を付与する核酸。
- 前記第1のAAV血清型および前記第2のAAV血清型が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項59に記載の核酸。
- 前記第1のAAV血清型および前記第2のAAV血清型が、AAV4およびAAV6、AAV5およびAAV6、AAV11およびAAV6、AAV12およびAAV6、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項59または60に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸が、DNAまたはRNAの少なくとも1つである、請求項59〜61のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸がDNAである、請求項62に記載の核酸。
- 前記細胞が初代細胞、不死化細胞、または組換え細胞である、請求項59〜63のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記導入遺伝子が外因性受容体配列の少なくとも一部をコードする、請求項59〜64のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記単離された天然に存在しない核酸が医薬組成物に製剤化される、請求項59〜65のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記VP1、VP2、およびVP3領域が、キャプシドの少なくとも一部の中に含まれる、請求項59〜66のいずれか一項に記載の核酸。
- 配列番号195〜配列番号213のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性または類似性を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記配列同一性が、約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%から最大約100%である、請求項68に記載の単離および精製されたAAV核酸配列。
- 請求項1〜67のいずれか一項に記載の単離および精製されたAAV核酸配列で細胞をトランスフェクトすることにより生成された、操作された細胞。
- 請求項70に記載の操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子。
- 単位剤形で請求項71に記載のアデノ随伴ウイルス粒子を含む組成物。
- 前記組成物が凍結保存されている、請求項72に記載の組成物。
- 請求項72または73に記載の組成物を含む容器。
- 複数の細胞を請求項71に記載の複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子と接触させるステップを含む、操作された細胞を作製する方法。
- 前記複数の細胞が哺乳動物細胞である、請求項75に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項76に記載の方法。
- 前記ヒト細胞がリンパ球である、請求項77に記載の方法。
- 前記細胞が、前記複数のAAV粒子との前記接触の前に刺激される、請求項75〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記刺激が、抗CD3、抗CD28、およびインターロイキンの少なくとも1つで実施される、請求項79に記載の方法。
- 前記接触が、前記刺激の前、後、または同時に実施される、請求項79または80に記載の方法。
- 前記複数の細胞と前記複数のAAV粒子との前記接触が、前記刺激の後に実施される、請求項81に記載の方法。
- 前記刺激が、前記複数の細胞と前記複数のAAV粒子との前記接触の4日前から24時間前に実施される、請求項79〜82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記刺激が、前記複数の細胞と前記複数のAAV粒子との前記接触の3日前に実施される、請求項83に記載の方法。
- 前記複数の細胞のゲノムにゲノム破壊を導入するステップをさらに含む、請求項75〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム破壊が、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート(CRISPR)システムを含む、請求項85に記載の方法。
- 前記ゲノム破壊が、前記複数の細胞と前記複数のAAV粒子との前記接触の前に実施される、請求項85または86に記載の方法。
- 前記操作された細胞を拡大させるステップをさらに含む、請求項75〜87のいずれか一項に記載の方法。
- それを必要とする対象に、単位剤形で前記操作された細胞を投与するステップをさらに含む、請求項75〜88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与が注入である、請求項89に記載の方法。
- 前記操作された細胞の前記投与が、それを必要とする前記対象の疾患または状態を少なくとも部分的に改善する、請求項89または90に記載の方法。
- 前記疾患または状態が癌を含む、請求項91に記載の方法。
- 前記改善が、コンピューター断層撮影(CT)スキャンにより測定した場合、少なくとも約30%の前記癌の減少を含む、請求項91または92に記載の方法。
- 前記改善が、コンピューター断層撮影(CT)スキャンにより測定した場合、腫瘍病変の径のベースライン測定で10%未満の変化により測定される腫瘍サイズの安定化を含む、請求項91または92に記載の方法。
- 複数の操作されたアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子をスクリーニングする方法であって、
a.突然変異または外因性AAVゲノムの少なくとも1つをアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列のゲノムに導入して、操作されたAAV粒子を形成するステップ;
b.aからの複数の前記操作されたAAV粒子を複数の細胞ゲノムに導入するステップ;および
c.前記複数の細胞ゲノム中の前記複数のAAV粒子によってコードされる導入遺伝子の発現レベルを定量化するステップであって、前記発現レベルは、aからの異なる突然変異または外因性AAVゲノムを導入した第2のAAV粒子から得られる第2の発現レベルと比較されるステップ
を含む方法。 - 前記突然変異が、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、挿入、欠失、複製、フレームシフト、または反復伸長の少なくとも1つを含む、請求項95に記載の方法。
- 前記突然変異が点突然変異を含む、請求項96に記載の方法。
- 前記アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列のゲノムが血清型AAV6のものである、請求項95〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外因性AAVゲノムが、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはAAV12のものである、請求項95〜98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外因性AAVゲノムがAAV4である、請求項99に記載の方法。
- 前記外因性AAVゲノムがAAV5である、請求項99に記載の方法。
- 前記外因性AAVゲノムがAAV11である、請求項99に記載の方法。
- 前記外因性AAVゲノムがAAV12である、請求項99に記載の方法。
- 前記複数の細胞ゲノムが、初代細胞、不死化細胞、または組換え細胞に由来する、請求項95〜103のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現レベルの前記定量化が、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、またはPCRによって決定される、請求項95〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作されたAAV粒子が、前記複数の細胞ゲノムに導入された場合、操作されていないAAV粒子と比較して、形質導入後の導入遺伝子の発現の増加を付与する、請求項95〜105のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発現の増加が、前記aからの異なる突然変異または外因性AAVゲノムを導入した第2のAAV粒子から得られる第2の発現レベルと比較して、約30%、40%、50%、60%から最大約100%である、請求項106に記載の方法。
- 前記定量化が、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、またはPCRによって測定される、請求項95〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、キャプシドタンパク質のVP1領域の第1の突然変異およびVP3領域の第2の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記操作された細胞の形質導入後の導入遺伝子の発現は、野生型AAV粒子、または前記キャプシドタンパク質のVP領域に単一の突然変異を含むAAV粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して増加する方法。
- 操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、キャプシドタンパク質のVP1領域の第1の突然変異およびVP3領域の第2の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞の形質導入後の導入遺伝子の発現は、200,000GC/mLの平均感染力(MOI)で、野生型AAV粒子、または前記キャプシドタンパク質のVP領域に単一の突然変異を含むAAV粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して、前記MOIで約10倍〜300倍増加する方法。
- 操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、導入遺伝子をコードし、キャプシドタンパク質のVP1領域の第1の突然変異およびVP3領域の第2の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞における前記導入遺伝子の発現は、野生型AAV粒子、または前記キャプシドタンパク質のVP領域に単一の突然変異を含むAAV粒子と接触した細胞と比較して増加し、前記野生型AAV粒子、または前記キャプシドタンパク質のVP領域に単一の突然変異を含むAAV粒子はまた前記導入遺伝子をコードする方法。
- 前記導入遺伝子が細胞受容体またはその一部をコードする、請求項109〜111のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞受容体またはその一部がT細胞受容体である、請求項112に記載の方法。
- 前記細胞受容体またはその一部がキメラ抗原受容体(CAR)である、請求項113に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記核酸によってコードされるポリペプチドの129位のFコード配列にある、請求項109〜114のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記ポリペプチドの129位のFから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする、請求項115に記載の方法。
- 前記非極性脂肪族アミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、およびバリン(V)から選択される、請求項116に記載の方法。
- 前記非極性脂肪族アミノ酸がLである、請求項117に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記ポリペプチドのロイシン(L)コード配列にある、請求項109〜118のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドの584位のLコード配列にある、請求項119に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記ポリペプチドの584位のLから極性アミノ酸への突然変異をコードする、請求項119または120に記載の方法。
- 前記極性アミノ酸が、アスパラギン(N)およびグルタミン(Q)から選択される、請求項121に記載の方法。
- 前記極性アミノ酸がNである、請求項122に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、584位のLから正に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする、請求項109〜123のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正に帯電したアミノ酸がヒスチジン(H)である、請求項124に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記ポリペプチドの584位のLから負に帯電したアミノ酸への突然変異をコードする、請求項109〜123のいずれか一項に記載の方法。
- 前記負に帯電したアミノ酸が、アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)から選択される、請求項126に記載の方法。
- 前記負に帯電したアミノ酸がDである、請求項127に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記ポリペプチドのバリン(V)コード配列にある、請求項109〜128のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドの598位のVコード配列にある、請求項129に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記ポリペプチドの598位のVから非極性脂肪族アミノ酸への突然変異をコードする、請求項130に記載の方法。
- 前記非極性脂肪族アミノ酸が、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、およびバリン(V)から選択される、請求項131に記載の方法。
- 前記非極性脂肪族アミノ酸がLである、請求項132に記載の方法。
- 前記非極性脂肪族アミノ酸がIである、請求項132に記載の方法。
- 前記第2の突然変異が、前記ポリペプチドのヒスチジン(H)コード領域にある、請求項110〜134のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の突然変異が、前記ポリペプチドの642位のHコード領域にある、請求項135に記載の方法。
- 前記突然変異が、前記ポリペプチドの642位のHから極性アミノ酸への突然変異をコードする、請求項136に記載の方法。
- 前記極性アミノ酸が、アスパラギン(N)およびグルタミン(Q)から選択される、請求項137に記載の方法。
- 前記極性アミノ酸がNである、請求項138に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記第2の突然変異の前の核酸の芳香族アミノ酸コード配列にあり、前記第2の突然変異が、前記核酸によってコードされるポリペプチドの非極性脂肪族アミノ酸をコードする、請求項109〜139のいずれか一項に記載の方法。
- 前記芳香族アミノ酸が、前記VP1領域を含むポリペプチドの129位にある、請求項140に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記第2の突然変異の前の前記配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が高いアミノ酸をコードする配列にある、請求項109〜141のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の突然変異が、正に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸、負に帯電したアミノ酸から極性アミノ酸アミノ酸からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異をコードする、請求項110〜142のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の突然変異が保存的突然変異をコードする、請求項110〜143のいずれか一項に記載の方法。
- 前記保存的突然変異が、非極性脂肪族アミノ酸から非極性脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から極性アミノ酸、正に荷電したアミノ酸から正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸から負に帯電したアミノ酸、および芳香族アミノ酸から芳香族アミノ酸からなる群から選択される、請求項144に記載の方法。
- 前記第1の突然変異が、前記第2の突然変異の前の前記配列の位置でコードされるアミノ酸よりも疎水性が低いアミノ酸をコードする配列にある、請求項109〜145のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キャプシドタンパク質のVP領域における前記第1の突然変異が、前記キャプシドタンパク質のVP1またはVP3領域における単一の突然変異である、請求項109〜146のいずれか一項に記載の方法。
- VP1領域における前記第1の突然変異がFからLへの突然変異を含む、請求項147に記載の方法。
- VP1領域における前記第1の突然変異が、前記AAVヌクレオチド配列によってコードされるAAVポリペプチド配列の129位で生じる、請求項148に記載の方法。
- 前記第2の突然変異がVP3領域にある場合、前記第2の突然変異が、HからN、DからN、DからN、VからL、およびVからIからなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む、請求項110〜149のいずれか一項に記載の方法。
- VP3領域における前記第2の突然変異が、前記AAVヌクレオチド配列によってコードされるAAVポリペプチド配列の418、462、584、598、または642位で生じる、請求項150に記載の方法。
- VP3領域における前記第2の突然変異が、F129L、H642N、D418N、L584N、V598L、V598Iの少なくとも1つを含む、請求項151に記載の方法。
- 前記複数の細胞をクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート(CRISPR)システムと接触させ、それによりゲノム破壊を含む複数の操作された細胞を生成するステップをさらに含む、請求項109〜152のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触が、前記AAV粒子との前記接触の前、同時、または後である、請求項153に記載の方法。
- 前記ゲノム破壊が免疫チェックポイント遺伝子の少なくとも一部を含む、請求項153または154に記載の方法。
- 免疫チェックポイント遺伝子の前記ゲノム破壊が、前記免疫チェックポイント遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の減少をもたらす、請求項155に記載の方法。
- 前記CRISPRシステムが、ガイドRNA(gRNA)およびエンドヌクレアーゼを含む、請求項153〜156のいずれか一項に記載の方法。
- 前記gRNAが、前記免疫チェックポイント遺伝子の少なくとも一部に結合する、請求項157に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼがCasである、請求項157または158に記載の方法。
- 前記Casが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1またはCsx12としても公知である)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、それらの相同体、およびそれらの修飾バージョンからなる群から選択される、請求項159に記載の方法。
- 前記CRISPRシステムが、前記複数の細胞にエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションされる、請求項153〜160のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CRISPRシステムが、DNA、RNA、またはこれらの組み合わせによってコードされる、請求項153〜161のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CRISPRシステムがRNAによってコードされる、請求項162に記載の方法。
- 前記操作された細胞を拡大させるステップをさらに含む、請求項109〜163のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作された細胞が少なくとも約1×108個の細胞に拡大される、請求項164に記載の方法。
- 前記AAVがAAV6である、請求項109〜165のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異F129LおよびH642Nをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記AAVキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異F129LおよびL584Dをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記AAVキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異F129LおよびD418Nをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記AAVキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異F129LおよびL584Hをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記AAVキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異F129L、H642NおよびD418Nをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記AAVキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異F129L、H642NおよびL584Dをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記AAVキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異F129L、H642NおよびL584Nをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記AAVキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異F129L、H642NおよびL584Hをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記AAVキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異F129L、H642NおよびV598Lをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 前記AAVキャプシド核酸配列の少なくとも突然変異F129L、H642NおよびV598Iをコードする単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシド核酸配列。
- 請求項167〜176のいずれか一項に記載の単離および精製されたアデノ随伴ウイルスキャプシド核酸配列を含む細胞。
- 外因性細胞受容体配列をコードするポリ核酸をさらに含む、請求項177に記載の細胞。
- 操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、VP1配列、VP2配列、およびVP3配列を含む有効量のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子であって、前記VP1配列、VP2配列、およびVP3配列のうちの2つは第1のAAV血清型に由来し、前記VP1配列、VP2配列、およびVP3配列の1つは第2のAAV血清型に由来するAAV粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記操作された細胞の形質導入またはトランスフェクション後の導入遺伝子の発現は、野生型AAV粒子、または野生型VP1、VP2、またはVP3配列を含むAAV粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して増加する方法。
- 操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、VP1配列、VP2配列、およびVP3配列を含む有効量のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子であって、前記VP1配列、VP2配列、およびVP3配列のうちの2つは第1のAAV血清型に由来し、前記VP1配列、VP2配列、およびVP3配列の1つは第2のAAV血清型に由来するAAV粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞の形質導入またはトランスフェクション後の導入遺伝子の発現は、200,000GC/mLの平均感染力(MOI)で、野生型AAV粒子、または野生型VP1、VP2、またはVP3配列を含むAAV粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して、前記MOIで約10倍〜300倍増加する方法。
- 操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、導入遺伝子をコードし、VP1配列、VP2配列、およびVP3配列を含む有効量のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子であって、前記VP1配列、VP2配列、およびVP3配列のうちの2つは第1のAAV血清型に由来し、前記VP1配列、VP2配列、およびVP3配列の1つは第2のAAV血清型に由来するAAV粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞における前記導入遺伝子の発現は、野生型AAV粒子または野生型VP配列を含むAAV粒子と接触した細胞と比較して増加し、前記野生型AAV粒子または前記キャプシドタンパク質の野生型VP配列を含むAAV粒子はまた前記導入遺伝子をコードする方法。
- 前記導入遺伝子が細胞受容体またはその一部をコードする、請求項179〜181のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞受容体またはその一部がT細胞受容体である、請求項182に記載の方法。
- 前記細胞受容体またはその一部がキメラ抗原受容体である、請求項182に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV5 VP1uヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3ヌクレオチド配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV4 VP1およびVP2ヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP3ヌクレオチド配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV5 VP1およびVP2ヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3ヌクレオチド配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV11 VP1およびVP2ヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP3ヌクレオチド配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV12 VP1およびVP2ヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP3ヌクレオチド配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV1 VP1uヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3ヌクレオチド配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV12 VP1uヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3ヌクレオチド配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV5 VP1u配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV4 VP1およびVP2配列、ならびにAAV6 VP3配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV5 VP1およびVP2配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV11 VP1およびVP2配列、ならびにAAV6 VP3配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV12 VP1およびVP2配列、ならびにAAV6 VP3配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV1 VP1u配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAV粒子が、AAV12 VP1u配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3配列を含む、請求項179〜184のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞をクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート(CRISPR)システムと接触させ、それによりゲノム破壊を含む複数の操作された細胞を生成するステップをさらに含む、請求項179〜198のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触が、前記AAV粒子との前記接触の前、同時、または後である、請求項199に記載の方法。
- 前記ゲノム破壊が免疫チェックポイント遺伝子の少なくとも一部を含む、請求項179〜200のいずれか一項に記載の方法。
- F129L、H642N、およびL584D突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- F129L、H642N、およびD418N突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- F129L、H642N、およびL584N突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- F129L、H642N、およびL584D突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- F129L、H462N、およびV598L突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- F129L、H642N、およびV598I突然変異をコードする、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- 請求項202〜207のいずれか一項に記載の単離および精製されたAAVキャプシドヌクレオチド配列で細胞をトランスフェクトすることにより生成された、操作された細胞。
- 請求項208に記載の操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子。
- 請求項209に記載の複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を含む容器。
- AAV4 VP1およびVP2ヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP3ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV5 VP1およびVP2ヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV11 VP1およびVP2ヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP3ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV12 VP1およびVP2ヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP3ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV1 VP1uヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV12 VP1uヌクレオチド配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3ヌクレオチド配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV5 VP1u配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV4 VP1およびVP2配列、ならびにAAV6 VP3配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV5 VP1およびVP2配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV11 VP1およびVP2配列、ならびにAAV6 VP3配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV12 VP1およびVP2配列、ならびにAAV6 VP3配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV1 VP1u配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- AAV12 VP1u配列、ならびにAAV6 VP2およびVP3配列を含む、単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- 請求項211〜223のいずれか一項に記載の単離および精製されたAAVヌクレオチド配列で細胞をトランスフェクトすることにより生成された、操作された細胞。
- 請求項224に記載の操作された細胞から単離された複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子。
- 請求項225に記載の複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を含む容器。
- 操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、キャプシドタンパク質のVP1領域の第1の突然変異およびVP2領域の第2の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞の形質導入後の導入遺伝子の発現は、200,000GC/mLの平均感染力(MOI)で、野生型AAV粒子、または前記キャプシドタンパク質のVP領域に単一の突然変異を含むAAV粒子と接触した同等の複数の細胞と比較して、前記MOIで約10倍〜300倍増加する方法。
- 操作された細胞を作製する方法であって、複数の細胞を、導入遺伝子をコードし、キャプシドタンパク質のVP1領域の第1の突然変異およびVP2領域の第2の突然変異を含む有効量のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子と接触させ、それにより複数の操作された細胞を生成するステップを含み、前記複数の細胞における前記導入遺伝子の発現は、野生型AAV粒子、または前記キャプシドタンパク質のVP領域に単一の突然変異を含むAAV粒子と接触した細胞と比較して増加し、前記野生型AAV粒子、または前記キャプシドタンパク質のVP領域に単一の突然変異を含むAAV粒子はまた前記導入遺伝子をコードする方法。
- 前記第2の突然変異がVP2領域にある場合、前記第2の突然変異が、HからN、DからN、DからN、VからL、およびVからIからなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む、請求項110〜149のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キャプシドヌクレオチド配列がVP1ヌクレオチド配列である、請求項202〜207のいずれか一項に記載の単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- 前記AAVがAAV6である、請求項230に記載の単離および精製されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドヌクレオチド配列。
- 前記核酸がAAV6 VP1ポリペプチド(polupeptide)をコードする、請求項44〜47のいずれか一項に記載の核酸。
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