JP2001517454A

JP2001517454A - 組換えアデノ随伴ウイルスの産生に有用な方法および細胞株

Info

Publication number: JP2001517454A
Application number: JP2000512974A
Authority: JP
Inventors: ウイルソン，ジエイムズ・エム; ガオ，グアング−ピング
Original assignee: ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-18
Publication date: 2001-10-09
Also published as: US7238526B2; EP1015619A1; CA2304168A1; WO1999015685A1; US6475769B1; AU9397098A; US20030040101A1

Abstract

(57)【要約】組換えＡＡＶの効率的産生のための方法は、細胞の染色体内に安定に組み込まれているＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む宿主細胞を利用し、そしてこのＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は各々、ヘルパーウイルス、ヘルパー遺伝子、およびヘルパー遺伝子産物での細胞の感染によりｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物の発現を指令することができるようになる調節配列に操作的に連結されている。組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生するための方法は、ヘルパーウイルス、遺伝子、および遺伝子産物でこういった宿主細胞を感染させ、そして複製およびビリオンのカプシド化に必要とされるアデノウイルスシス要素を含む組換えハイブリッドウイルスもしくはプラスミドで感染宿主細胞を感染することを必要とし、ＡＡＶ配列はＡＡＶの５’および３’ＩＴＲを含み、そして選択された遺伝子がその発現を指令する調節配列に操作的に連結されており、そしてその調節配列は先に記載されるＡＡＶ配列によりフランクされる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明は、米国国立予防衛生研究所（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉ
ｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）の助成金番号ＮＩＡＭＳＰ０１ＡＲ／ＭＳ
４３６４８、Ｐ３０ＤＫ４７７５７−０５、Ｐ０１ＨＤ３２６４９−０４、
Ｐ０１ＡＲ／ＮＳ４３６４８−０３、およびＰ０１ＣＡ６６７２６−０３か
らの財政援助を受けてなされた。米国連邦政府は本発明におけるある一定の権利
を有する。

【０００２】

【発明の背景】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損ヒトパルボウイルスであり、そのゲ
ノムの長さは約４．６ｋｂで、１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復配列（ＩＴ
Ｒ）を含む。２つの読み取り枠は一連のｒｅｐおよびｃａｐポリペプチドをコー
ドする。ｒｅｐポリペプチド（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ６２、およびｒｅｐ４０）はＡＡＶゲノムの複製、救済、および組込みに必要とされる。ｃａｐ蛋白質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）はビリオンカプシドを形成する。５’
末端および３’末端でｒｅｐおよびｃａｐ読み取り枠をフランクするのは１４５
ｂｐの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）であり、この配列の最初の１２５ｂｐはＹ
−もしくはＴ−型二重鎖構造を形成することができる。ＡＡＶベクターの開発に
とって重要なのは、全ｒｅｐおよびｃａｐドメインを切り出し、そして治療用も
しくはレポーター導入遺伝子と置換させることができることである［Ｂ．Ｊ．Ｃ
ａｒｔｅｒ、ｉｎ「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」、
ｅｄ、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ｐｐ．１５５−１６８（１９
９０）］。ＩＴＲはＡＡＶゲノムの救済、パッケージング、および組込みにとっ
て必要な最低限の配列を表すことが示されている。

【０００３】野生型の非病原性ヒトウイルスは多種多様の細胞を感染し、そして高頻度で第
１９番染色体の特異的領域内に組み込むプロウイルスを介して不顕性感染を確立
することができる［Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，２２１１−２２１５（１９９０）；Ｓａｍｕｌ
ｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．１０，３９４１−３９５０（１９
９１）］。感染性ウイルスの産生およびそのウイルスの複製は、細胞が例えばア
デノウルスもしくはヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスで同時感染され
ない限り生じない。ヘルパーウイルスでの感染の際には潜伏性ＡＡＶの遺伝子（
すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）は活性化され、その結果ＡＡＶプロウイルスの
救済、ＡＡＶゲノムの複製、およびＡＡＶビリオンの形成、ならびに追加的ヘル
パーウイルスの作成がもたらされる。感染性親ｓｓＤＮＡはｒｅｐ依存様式で二
重鎖複製形態（ＲＦ）ＤＮＡへと拡張される。救済されたＡＡＶゲノムはあらか
じめ形成されていた蛋白質カプシド（直径約２０ｍｍの対称性正二十面体）内に
パッケージングされ、そして細胞溶解後には＋もしくは−ｓｓＤＮＡのいずれか
をパッケージングしてある感染性ビリオンとして放出される。

【０００４】ＡＡＶは外来性ＤＮＡを細胞に移送するためのベクターとしてそれ自体を魅力
的にする独特な特徴を有する。遺伝子療法用の形質導入性ベクターとしてＡＡＶ
を確立する方向の進展はゆっくりしている。遺伝子療法の前臨床モデルにおける
組換え方法により組換え的に産生された組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の評価は、同
じ方法により改良された野生型ＡＡＶの評価の場合を除き多種多様の理由により
制約されており、その主な理由は産生方法が非効率的であり、かつ実質的な量で
複製コンピテントＡＡＶを作成してしまうことが頻繁に起こるためである。ＡＡ
Ｖの複製欠損形態はベクターＤＮＡ（ＡＡＶＩＴＲによりフランクされる導入
遺伝子）をｒｅｐ／ｃａｐ発現プラスミドと共に、アデノウイルス感染と同時に
トランスフェクトすることによるか［Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６１（１０）：３０９６−３１０１（１９８７）］もしくはアデノ
ウイルスヘルパープラスミドでのトランスフェクション［Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｆ．
Ｋ．ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．，３，１２９５−１２９７（１９９７
）］により作成される。一過性トランスフェクションに基づく標準方法は簡単に
は量的拡大ができないため、ウイルスの取得を困難にしている［Ｆｉｓｃｈｅｒ
，Ｋ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５２０−５３２（１９９６）］
。更には、トランスフェクションの過程の間に例えば非相同組換えにより形成さ
れる複製コンピテトＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）による調製物の汚染は不可避である。
シスおよびトランスプラスミドのアデノウイルスヘルパープラスミドとの同時一
過性トランスフェクションに基づいてｒＡＡＶを産生するための別の方法が記載
されている［Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｆ．Ｋ．ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．，
３，１２９５−１２９７（１９９７）］。このアプローチは混入性アデノウイル
スを最低限に抑えるという利点を有するが、ｒｃＡＡＶの創出および量的拡大困
難という欠点がある。特に治療用適応のためのＤＮＡの移入のためのＡＡＶの使
用に対する具体的な障害は、組換えゲノムのカプシド化および感染性ビリオンの
産生についての高効率スキームが存在しないことである［Ｒ．Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，５：７９３−８０１（１９９４）］。

【０００５】ＡＡＶ産生を改善する試みにおける問題には、ベクターおよび／またはｒｅｐ
／ｃａｐを安定に発現する細胞株の使用が含まれる。ｒｅｐおよびｃａｐを安定
に発現する細胞株の作成は困難であり、その理由はｒｅｐ遺伝子産物の細胞毒性
にある。既に記載された数々の細胞株は、ベクターの高力価産生を維持するため
の十分量のｒｅｐもしくはｃａｐを発現しない［Ｔａｍａｙｏｓｅ，Ｋ．ｅｔ
ａｌ．Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａ．７，５０７−５１３（１９９６）；Ｙａ
ｎｇ，Ｑ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４８４７−４８５６（１９９
４）；また、Ｃｌａｒｋ，Ｋ．Ｒ．ｅｔａｌ，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａ．６，１３２９−１３４１および米国特許第５，６５８，７８５号も参照された
い］。ｒｅｐおよびｃａｐを一過性発現し、そして調節する一層効率的な方法を
提供する他の戦略が記載されている［Ｍａｍｏｕｎａｓ，Ｍ．，ｅｔａｌ，ＧｅｎｅＴｈｅｒａ．２，４２９−４３２（１９９５）；ａｎｄＦｌｏｔｔｅ
，Ｔ．Ｒ．ｅｔａｌ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａ．２，２９−３７（１９９５）］
。

【０００６】宿主細胞内へのｒＡＡＶゲノムのトランスフェクション、そしてその後の野生
型ＡＡＶおよびアデノウイルスでの同時感染を利用するｒＡＡＶの産生のための
現行法の欠点には、許容されないほど高レベルの野生型ＡＡＶの産生、貧弱な組
換え遺伝子発現、および不十分な組込みが含まれる。形質導入性ＡＡＶビリオン
を製造するために認知されている別の方法は２つの異なりながらも相補的なプラ
スミドでの同時トランスフェクションを必要とする。これらのプラスミドの内の
一つは、２つのシス作用性ＡＡＶＩＴＲの間にフランクされる（挟まれる）治
療用もしくはレポーター導入遺伝子を含む。子孫組換えゲノムの救済およびその
後のパッケージングに必要となるＡＡＶ構成成分は、ｒｅｐおよびｃａｐ蛋白質
のためのウイルス性読み取り枠をコードする第二プラスミドによりトランスで提
供される。しかしながら、ｒｅｐおよびｃａｐの両方ともが宿主細胞に対して毒
性を示す。この毒性が、有用なｒＡＡＶ遺伝子治療ベクターの構築用にトランス
でこれらの遺伝子を提供する際の難局の主要原因である。

【０００７】以前には達成されなかった、高力価での体細胞遺伝子治療のためのベクターと
しての使用のためのＡＡＶおよび組換えＡＡＶウイルスの効率生産を可能にする
さらなる方法についての必要性が当該技術分野には依然として存在する。

【０００８】

【発明の要約】

本発明は、以下に詳細が記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の
効率的かつ高レベルの産生を可能にし、そして複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡ
ＡＶ）を本質的には含まないｒＡＡＶを産生する新規の方法および新規の細胞株
を提供する。

【０００９】ある態様では本発明は、細胞の染色体内に安定に組み込まれるＡＡＶｒｅｐ
遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含み、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
がそのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の発現を指令することができる調節配列に操作
的に連結され、そしてその細胞がその細胞へのヘルパーの組込みによりｒｅｐお
よびｃａｐ遺伝子の遺伝子産物を発現するようになる細胞を提供する。ヘルパー
は、ヘルパーウイルス、ヘルパー遺伝子、もしくはヘルパー遺伝子産物である。
本発明の細胞株は、コンカテマー形態を取るプロモーター−ｒｅｐ−ｃａｐ−遺
伝子カッセットの多重コピーを宿主染色体内に組み込ませることを特徴とする。
本発明の細胞株もまた、他の安定にｒｅｐ／ｃａｐトランスフェクションされた
細胞からのｒＡＡＶの収率と比較すると、その細胞株へのヘルパーの組込みによ
りｒＡＡＶの高レベル発現（例えば、細胞当たり１×１０³ｒＡＡＶ粒子を上回る）を提供することを特徴とする。本細胞の一つの態様は、内因性ＡＡＶｐ５
プロモーターの制御下でＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を安定に発現するＨ
ｅＬａ細胞、Ｂ−５０［ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１２４０１］に由来の宿主細
胞である。

【００１０】他の態様では本発明は、ヘルパー感染宿主細胞を産生するための方法を提供す
る。この方法は、宿主細胞にヘルパーを組み込ませる段階を含み、その宿主細胞
はその宿主細胞の染色体内に安定に組み込まれているＡＡＶｒｅｐ遺伝子およ
びＡＡＶｃａｐ遺伝子を含み、その際ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は各
々ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の発現を指令することができる調節配列の制御下に
あり、そしてその宿主細胞は宿主細胞へのヘルパーの組込みによりｒｅｐおよび
ｃａｐ遺伝子の産物を発現するようになる。ヘルパーは、ヘルパーウイルス、ヘ
ルパー遺伝子、もしくはヘルパー遺伝子産物を含む。

【００１１】他の態様では本発明は組換えＡＡＶを産生するための方法を提供し、この方法
は、すぐ上に記載されるヘルパーを含む本発明の宿主細胞に組換えハイブリッド
ウイルスを組み込ませる段階を含む。組換えハイブリッドウイルスは、導入遺伝
子発現を制御する調節配列に操作的に連結される選択された導入遺伝子を含む。
調節配列が連結された導入遺伝子は、ＡＡＶの５’および３’ＩＴＲを含むＡＡ
Ｖ配列によりフランクされる。５’ＩＴＲは導入遺伝子の一方の側をフランクし
、そして３’ＩＴＲは他方の側をフランクする。調節配列が連結され、そしてＡ
ＡＶによりフランクされる導入遺伝子は更に、少なくとも一つのアデノウイルス
シスエレメントによりフランクされる。この方法で有用なシスエレメントは、ア
デノウイルスビリオンの複製に必要とされるシスエレメントおよびアデノウイル
スビリオンのカプシド化に必要とされるシスエレメントである。この方法は場合
によっては、ハイブリッド−ウイルス−感染ヘルパー−感染宿主細胞から、その
導入遺伝子を含む組換えＡＡＶを単離する追加段階を含む。この方法は、組換え
ＡＡＶを、その細胞により産生させることを可能にする。

【００１２】本発明の態様の内の一つでは、組換えＡＡＶを産生するための方法はＢ５０／
ハイブリッド法として引用される。この方法は、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ発
現を誘発し、そして必要なヘルパー機能を提供するために本明細書に記載される
宿主細胞の内の一つをヘルパー（例えば、ウイルス、遺伝子、もしくは遺伝子産
物）で感染する段階、および選択された導入遺伝子を保持する組換えアデノウイ
ルス−ＡＡＶハイブリッドウイルスで感染宿主細胞をトランスフェクトする段階
を含む。ある好ましい態様では、ＡＡＶの産生は以下の２段階過程で行われる：
ｒｅｐおよびｃａｐを安定に発現する本発明の宿主細胞（例えば、Ｂ−５０）を
例えば好ましくはＥ２ｂに欠損があるアデノウイルスのようなヘルパーで感染さ
せ、その後に例えばハイブリッドウイルスのような別のウイルスで感染させ、こ
のハイブリッドウイルスの一例はＡｄＡＡＶハイブリッドであり、このハイブリ
ッドでは調節配列の制御下にある導入遺伝子を含むＡＡＶベクターが複製欠損ア
デノウイルスのＥ１領域内にクローン化される。この結果、ＡＡＶゲノムの１０
０倍の増幅および救済がもたらされ、そしてｒｃＡＡＶを含まない組換えＡＡＶ
が高収率でもたらされる。

【００１３】本発明の他の態様および利点は、以下の好ましい態様の詳細な説明において更
に詳しく記載される。

【００１４】

【発明の詳細な記述】

本発明は以下に記載されるように、細胞あたり約１×１０³ウイルス粒子を上回る値から一層高いウイルス粒子収率までの収率での、組換えアデノ随伴ウイル
ス（ｒＡＡＶ）の産生のための方法および組成物を提供する。本発明の方法は、
欠損に関連する症状を軽減もしくは緩和させるために細胞内の欠損を修正するｒ
ＡＡＶ保持導入遺伝子を産生するために好ましい状態で利用することができる。
これらの方法は宿主細胞もしくは組織に導入遺伝子を移転させるのに特に有用で
ある。これらのｒＡＡＶは、研究用試薬として、インビトロでの導入遺伝子産物
の組換え産生のための道具として、そして遺伝子療法試薬の産生のための道具と
して有用である。Ｉ．定義本明細書で用いられる組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶカプシド、必要と
されるＡＡＶシスエレメント、および適切な条件下では遺伝子の産物の発現を指
令する調節配列（例えば、プロモーターおよび／またはレギュレーター配列）の
制御下に置かれる目的の異種遺伝子（すなわち、導入遺伝子）を含む構造として
特定される。適切にはＡＡＶシスエレメントはＡＡＶ５’および３’逆方向末
端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ｒＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子および他のＡＡＶ構造
遺伝子を欠失している。ｒＡＡＶはそれ自体では複製することができない。用語
「ｒＡＡＶ」は、ＡＡＶシスエレメントに対する機能改変物を包含する。

【００１５】複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）は本明細書では例えばアデノウイルス
ヘルパーのようなＡＡＶｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子をトランス活性化すること
ができるヘルパーの存在下で複製することができるいずれかのＡＡＶとして特定
される。ｒｃＡＡＶはｒｅｐおよびｃａｐを保持しているはずである。従って、
ｒｓＡＡＶの例には野生型（ｗｔ）ＡＡＶ、例えば望ましくない相同組換えによ
りもたらされる改変ｗｔＡＡＶ、もしくは例えば望ましくない相同組換えにより
もたされる導入遺伝子の部分を含み、その結果ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を蓄積
する再編成ＡＡＶを含む。

【００１６】用語「ゲノムコピー数」および「粒子数」は互換可能であり、そして本発明の
パッケージング用細胞株の生産性（もしくは収率）の測定値である。これらの用
語は、宿主細胞もしくは産生／パッケージング用細胞株当たりに産生され得るｒ
ＡＡＶウイルス粒子の平均数を意味し、そして感染単位に対応する。ゲノムコピ
ー数もしくは粒子数は、ＡＡＶ粒子が感染性であるかどうかに関係なく、ＡＡＶ
ＤＮＡのみの測定値である。収率（すなわち、ゲノムコピー数）は、濃度もし
くは精製による影響は受けない。細胞株の評価のためには、ゲノムコピー数もし
くは粒子数が多ければ多いほど細胞の生産性は上昇する。本発明の細胞は、１×
１０³を上回るゲノムコピー数を特徴とする。本発明の他の細胞は、５×１０³を
上回るゲノムコピー数を特徴とする。本発明の更に別の細胞は、１×１０⁴を上回るゲノムコピー数を特徴とする。本発明の他の細胞は、５×１０⁴を上回るゲノムコピー数を特徴とする。本発明の細胞は、１×１０⁵を上回るゲノムコピー数を特徴とする。本発明の他の細胞は、５×１０⁵を上回るゲノムコピー数を特徴とする。本発明の更に別の細胞は、１×１０⁶を上回るゲノムコピー数を特徴とする。今後の記載に含まれる際はどんな場合であっても本発明の細胞は、成句
「高収率」もしくは「効率的産生」を特徴とし、このような成句は先のゲノムコ
ピー数により数値にて特定される。

【００１７】本明細書内で具体的に用いられる際には、感染単位（ＩＵ）もしくは感染形成
単位（ＩＦＵ）は、細胞を感染するためのｒＡＡＶ粒子の能力の測定値を提供す
る。１ＩＵは、導入遺伝子ベータ−ガラクトシダーゼを宿すｒＡＡＶにのみ適用
される用語である１ＬａｃＺ形成単位（ＬＦＵ）に等しい。ＩＵは、アデノウイ
ルもしくは他のヘルパーウイルスをｒＡＡＶから分離する精製段階「あり」もし
くは「なし」のいずれかで測定することができる。ＩＵは精製もしくは濃度によ
る影響を受けることがあり得る。ＩＵが小さければ小さいほどＡＡＶ粒子の感染
性は強くなる。本明細書で用いられる際には、１ＩＵもしくは１ＬＦＩは約１×
１０⁶ウイルス粒子を下回る値に等しい。本発明の他の態様では１ＩＵは１×１０⁵ウイルス粒子を下回る値に等しい。一層好ましくは、１ＩＵは１×１０⁴ウイ
ルス粒子数を下回る値に等しい。好ましくは１ＩＵは１×１０³ウイルス粒子数を下回る値に等しい。

【００１８】用語「ゲノム力価」は一般的にはミリリットル当たりのゲノムコピー数もしく
は粒子数を意味する。

【００１９】用語「形質導入用単位］もしくは「形質導入単位」は、感染性ｒＡＡＶで形質
導入した細胞数として本明細書では特定される。この用語はまた、ｒＡＡＶの効
力をも意味する。各感染細胞は１を上回る数の感染性ＡＡＶ粒子を含んでよい。ＩＩ．発明の宿主細胞本発明の細胞もしくは宿主細胞は、細胞の染色体内に安定に組み込まれたＡＡ
Ｖｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む細胞、好ましくは哺乳類細
胞である。この宿主細胞自体は好ましくは、当該技術分野において多くの適切な
種類が知られている哺乳類細胞である。本発明の宿主細胞および宿主細胞株を調
製するのに用いることができる適切な親細胞株は限定されるものではないが、Ｈ
ｅＬａ［ＡＴＣＣＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１８５］
、ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えば、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０、
ＣＣＬ７２］、およびＷＩ−３８［ＣＣＬ７５］細胞を含む。これらの細胞
株は全て、米国、バージニア州（ＶＡ２０１１０−２２０９）、Ｍａｎａｓｓ
ａｓ、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄのｔｈｅＡｍ
ｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能
である。

【００２０】宿主細胞内のＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶの多くの既知の血
清型の中から取得されてよい。両遺伝子は、同一のＡＡＶ血清型からか、もしく
は異なるＡＡＶ血清型から取得されてよい。本発明の宿主細胞中のｒｅｐおよび
ｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の発現を指令することができる調節
配列に操作的に連結される。ｒｅｐ遺伝子はｃａｐ遺伝子の発現を指令するもの
とは異なる調節配列に操作的に連結されてよい。別法では、ｒｅｐおよびｃａｐ
遺伝子は、宿主細胞内の同一の調節配列に操作的に連結されてよい。こういった
調節配列は通常のものであり、そして遺伝子産物の翻訳および発現を調節するプ
ロモーターおよび他の配列を含む。これらの調節配列は宿主細胞に対して外因性
であってよい。

【００２１】調節配列は、ｒｅｐ／ｃａｐの発現を制御することができる構造性プロモータ
ーもしくは調節された（誘導性）プロモーターであってよい。例えば、一つのプ
ロモーターは肝臓特異的アルブミンプロモーターである。別の望ましいプロモー
ターは、サイトメガロウイルス（ＣＮＶ）エンハンサーと組み合わせて用いられ
ることが望ましいβ−アクチンプロモーターである。更に別の非ＡＡＶプロモー
ターは、制限する訳ではないが、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルスＬＴＲプロモ
ーター／エンハンサー、サイトメガロウルスの前初期プロモーター／エンハンサ
ー［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔｅｔａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（
１９８５）］、および誘導性マウスメタロチオネインプロモーターを含む。更に
別のプロモーター／エンハンサー配列が当業者により選択されてよい。

【００２２】しかしながら好ましい態様では調節配列は、例えばＡＡＶｐ５プロモーター
のようなＡＡＶ調節配列を含む。例えばｐ５プロモーターのようなＡＡＶ調節配
列は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を提供するものとは異なるＡＡＶ血清型に由来
してよい。別法では、同一のＡＡＶ血清型が宿主細胞の全ＡＡＶ構成成分を提供
してよい。

【００２３】本発明の細胞は更には、細胞の染色体内に安定に組み込まれた多重コピーとし
てのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の存在を特徴とする。これらの多重コピーはコン
カタマー形態、すなわちヘッド−トゥー−テイル（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）
もしくはヘッド−トゥー−ヘッド（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）の順序で染色体
内に存在してよい。従って本発明の細胞は、細胞の染色体内に安定に組み込まれ
た少なくとも２つのコピーとしてのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の存在を特徴とす
る。本発明の他の細胞は、細胞の染色体内に安定に組み込まれた少なくとも３つ
のコピーとしてのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の存在を特徴とする。本発明の更に
別の細胞は、細胞の染色体内に安定に組み込まれた少なくとも４つのコピーとし
てのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の存在を特徴とする。以下に記載される本発明の
細胞の態様は、細胞の染色体内に安定に組み込まれた５コピーとしてのｒｅｐ／
ｃａｐを含む。これらの多重コピーは更には、ｒｅｐ／ｃａｐの発現を制御する
プロモーター／調節配列の反復コピーを含んでよい。

【００２４】本発明の細胞は、細胞内へのヘルパーの組込みによりｒｅｐおよびｃａｐ遺伝
子の遺伝子産物を発現するようになる。適切なヘルパーは以下の方法の記載によ
り同定される。

【００２５】適切なヘルパーおよびハイブリッドウイルスが本発明の細胞に、以下のパート
ＩＩＩに詳細が記載される方法に従って組み込まれる場合には、本発明の細胞は
、従来の技術のパッケージング細胞の生産性と比較した場合の高収率でのｒＡＡ
Ｖの効率産生を特徴とする。以下に特定される方法でｒＡＡＶを産生するのに用
いる場合には、本発明の細胞の生産性を、細胞当たり１×１０³ゲノムコピーを上回るｒＡＡＶの産生収率として定義してよい。本発明の細胞は更には、細胞当
たり少なくとも３×１０³ゲノムコピーを産生することを特徴とする。本発明の他の細胞は、細胞当たり少なくとも１×１０⁴ゲノムコピーを産生することを特徴とする。本発明の更に他の細胞は、細胞当たり少なくとも５×１０⁴ゲノムコピーを上回る産生を特徴とする。本発明の他の細胞は、細胞当たり１×１０⁵ゲノムコピーを上回る産生収率を特徴とする。本発明の細胞は、細胞当たり５×１
０⁵ゲノムコピーを上回る産生を特徴とする。本発明の細胞は、細胞当たり１× １０⁶ゲノムコピーを上回る数のゲノムコピー数を特徴とする。

【００２６】本発明の宿主細胞の一つの例示的態様はＢ−５０である。このＢ−５０細胞株
は、１９９７年９月１８日、特許手続きを目的とするための微生物の寄託の国際
承認に関するブダペスト条約（ＴｈｅＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙｏｎ
ｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｔｈ
ｅＤｅｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｆｏｒｔ
ｈｅＰｕｒｐｏｓｅｓｏｆＰａｔｅｎｔＰｒｏｃｅｄｕｒｅ）の要件に
従い、受託番号ＣＲＬ１２４０１として、米国、バージニア州（ＶＡ２０１
１０−２２０９）、Ｍａｎａｓｓａｓ、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢ
ｏｕｌｅｖａｒｄのｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された。Ｂ−５０はＨｅＬａ細胞株であり、これはヘ
ルパーの組込みにより安定にＡＡＶタイプ２ｒｅｐおよびｃａｔ遺伝子を相同性
ｐ５プロモーターの制御下で発現する。Ｂ−５０はコンカタマー形態のＰ５−ｒｅｐ −ｃａｐ遺伝子カセットの多重コピー（少なくとも５コピー）の宿主染色体
内への組込みを特徴とする。Ｂ−５０は、アデノウイルス感染により、ｒｅｐお
よびｃａｐの安定、効率的、かつ高収率の発現を示す。Ｂ−５０は、ｒｅｐおよ
びｃａｐ遺伝子産物を非凡かつ思いがけなく高いレベルで発現するため、米国特
許第５，６５８，７８５号に記載されるもののような、他の安定なｒｅｐ／ｃａｐ発現細胞株をしのぐ改良物である。アデノウイルスヘルパーで感染したＢ−５
０細胞内でのｒｅｐ／ｃａｐの発現レベルおよび蛋白質の特徴は、ｐ５プロモー
ターを含む全ＡＡＶコーディング配列を含み［Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９）］そして古
典的トランスフェクション法によるｒＡＡＶ産生に広く用いられているプラスミ
ド構築物であるｐＡｄ／ＡＡＶでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のもの
よりも５倍〜１０倍良好となる。

【００２７】例えばＢ−５０細胞を含む本発明の宿主細胞は、以下に詳細が記載される本発
明の方法を通してのｒＡＡＶの大量産生ばかりにでなく、目的の遺伝子を有する
ｒＡＡＶプロデューサー細胞株を産生するためにも用いることができる。それに
加え本発明の細胞は、例えば感染性センターアッセイ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
ＣｅｎｔｅｒＡｓｓａｙ）［Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．ｅｔａｌ，”Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ”ｉｎＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１，（ｅｄｓ．Ｄｒａｃｏ
ｐｏｌｉ，Ｎ．ｅｔａｌ．）ｐｐ１−２４（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ，ＮＹ１９９６）］のようなアッセイにおけるｒＡＡＶ調製物の力価測定
、およびｒｅｐ／ｃａｐ蛋白質の生物学的機能、プロモーターの影響、および細
胞周期調節などを研究する目的の研究用の道具としての多くの適用法を有する。
ＩＩＩ．発明の方法本発明は更には、ヘルパー感染宿主細胞を産生するための方法、および本発明
の感染宿主細胞を用いることにより既述の高収率のｒＡＡＢを産生するための方
法をも提供する。本発明のこれらの方法は、高収率で効率よく産生することがあ
ってよく、かつ実質的に精製されている遺伝子移入用ベクターに対する必要性に
答えるものである。本発明の方法は一過性トランスフェクションは必要としない
が、その代わり本発明の細胞株へのヘルパーの組込みを利用する。

【００２８】これらの方法によるとヘルパーは、先に記載される宿主細胞、すなわち宿主細
胞の染色体内に安定に組み込まれているＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含み、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が各々ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
の発現を指令することができる調節配列の制御下にある哺乳類細胞内に組み込ま
れる。ヘルパーの存在下では宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の遺伝子産
物を発現する。

【００２９】ヘルパーはヘルパーウイルスもしくはプラスミドの形態を取ることがあってよ
いか；あるいは、ヘルパー遺伝子もしくはヘルパー遺伝子産物、または幾つかの
他の構築物として移入されてよい。ヘルパーは、いずれの形態でもヘルパー機能
を提供することができる（すなわち、宿主細胞内でのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
の発現を活性化させることができる）。本出願における用語「ヘルパーウイルス
」の使用は、ヘルパー機能を提供することができるこれらの要素の内のいずれか
を意味する。従ってある事例では、ヘルパーはアデノウイルスＥ１遺伝子もしく
は遺伝子産物を含む。Ｅ１遺伝子は、例えば野生型のＥ１含有性アデノウイルス
か、もしくはそうでなければ改変させたＥ１含有性アデノウイルス、または組換
えアデノウイルスもしくはＥ１を含むプラスミドのようなＥ１含有性アデノウイ
ルスでの感染により細胞内に移入されてよい。この遺伝子産物は細胞に直接移入
されてよい。別法では、トランス活性化用ヘルパーは、アデノウイルスＥ１遺伝
子および細胞株にＡｄＥ１遺伝子を移入するための機能を含む他のウイルス（ア
デノウイルスでないもの）であってよい。そういった他のウイルスは、外因性遺
伝子を細胞の方向に向けさせるのに一般的に利用される多数の既知のウイルス内
から選択されてよい。

【００３０】更に別のトランス活性化用ヘルパーはヘルペスウイルスであり、これも更には
他の中でもＡＡＶＰ５プロモーターからのｒｅｐ／ｃａｐ発現を活性化させる
能力を有する。このヘルパーは、野生型ヘルペスウイルス、組換えヘルペスウイ
ルス、ヘルペスウイルス遺伝子、もしくはヘルペスウイルス遺伝子産物であって
よい。この遺伝子産物は、細胞に直接移入されてよい。中でも、単純疱疹ウイル
ス１型（ＨｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘＩ）および単純疱疹ウイルス２型（Ｈ
ｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘＩＩ）が適切なヘルペスウイルスである。また、
ワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）およびサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇ
ａｌｏｖｉｒｕｓ）も適切なトランス活性化用ヘルパーウイルスである。

【００３１】別法では、ヘルパーウイルスは、許容されない温度で自己複製欠損であり、そ
して従ってｒＡＡＶ産生のために必要なヘルパー機能を提供するのみである温度
感受性突然変異ウイルスであってよい。

【００３２】従来の技術において報告されるように、最大ＡＡＶ産生レベルに必要なこれら
のアデノウイルス遺伝子は、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡＩを含むように思
われる［Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒａ．５，７９３−８
０１（１９９４）］。ｒＡＡＶ産生に必要なこういった他のヘルパー遺伝子は、
先に記載されるＥ１と同一の様式、すなわち同一のヘルパー構築物もしくはウイ
ルス内で細胞に組み込まれてよい。別法では、例えばＥ１のようなトランス活性
化用ヘルパー以外のヘルパー遺伝子は、追加的ヘルパーを細胞内に組み込ませる
ことによりトランス活性化用ヘルパーの後のいずれかの時期に移入されてよい。
例えばＥ１以外の、ヘルパー遺伝子は、他のヘルパーの中でも複製欠損アデノウ
イルスを介して宿主細胞に移入されてよい。

【００３３】いったんヘルパーもしくは少なくともトランス活性化用ヘルパーが細胞に組み
込ませれば、それは組換えＡＡＶを産生するための方法で利用されてよい。本発
明の方法は、本発明のヘルパー含有性ｒｅｐ／ｃａｐ発現細胞株を、ｒＡＡＶの
収率を実質的に増加させ、かつ規模拡大を簡素化させる例えばＡｄ−ＡＡＶハイ
ブリッドウイルスのような組換えハイブリッドウイルスで感染させてｒＡＡＶの
単一調製物からの複数の検体の検査を可能にすることに基づく。組換えハイブリ
ッドウイルスは、導入遺伝子発現を制御する調節配列に操作的に連結される選択
された導入遺伝子を含み、調節配列が連結される導入遺伝子はＡＡＶの５’およ
び３’ＩＴＲを含むＡＡＶ配列によりフランクされ、この場合、５’ＩＴＲはそ
の導入遺伝子の一つの側をフランクし、そして３’ＩＴＲはもう一方の側をフラ
ンクする。調節配列が連結しており、かつＡＡＶ配列によりフランクされる導入
遺伝子は、少なくとも一つのアデノウイルスシス−エレメントによりフランクさ
れる。このシス−エレメントは、アデノウイルスビリオンの複製に必要とされる
シスエレメントおよびアデノウイルスビリオンのカプシド化に必要とされるシス
エレメントの中から選択される。

【００３４】本発明の方法に用いることができるハイブリッドＡｄＡＡＶウイルスの一つの
態様は１９９６年５月９日に公開され、そして本明細書に引用として取り込まれ
る国際公開第ＷＯ９６／１３５９８号に、その詳細が記載される。本質的には、
先に記載されるＡｄＡＡＶハイブリッドウイルスもしくはハイブリッドウイルス
ベクター（プラスミド）はシスの状態でのミニ遺伝子を提供し、このミニ遺伝子
は宿主細胞内での発現を指令する調節配列の制御下にある選択された異種導入遺
伝子を含む。ハイブリッドウイルスもしくはベクターの宿主細胞内への組込みは
既知の技術を用いて達成される。救済および複製の以前にＡＡＶＤＮＡを実質
的に増幅させるハイブリッドウイルスの使用は、本発明の方法により産生される
ｒＡＡＶを高収率で取得する際の一助になると思われる。

【００３５】本発明の安定なｒｅｐ／ｃａｐ発現細胞株におけるｒｅｐ／ｃａｐ発現をトラ
ンス活性化し（例えば、細胞内のｒｅｐ／ｃａｐの発現を制御するプロモーター
を活性化させる）、そしてＡＡＶ複製のためのヘルパー機能を提供するヘルパー
の組込み、およびその後のＡｄ−ＡＡＶハイブリッドウイルスの組込みにより、
ｒＡＡＶ産生に必要とされる構成成分が提供される。

【００３６】導入遺伝子を含む組換えＡＡＶはその細胞により産生され、かつ先に詳細に記
載される高収率でその細胞から単離される（例えば、組換えＡＡＶは細胞当たり
１×１０³ゲノムコピーを上回るレベルで産生される）。また、例えばｒＡＡＶは細胞あたり１×１０⁶ゲノムコピーを上回るレベルで産生されてもよい。これらの組換えＡＡＶは本質的には同種であり、すなわち本発明の方法により産生さ
れるｒＡＡＶは本質的には複製コンピテントＡＡＶを含まない。以下の実施例４
で検討される態様を参照されたい。

【００３７】本明細書に記載される方法では、ｒｅｐ／ｃａｐ誘導と、ＡＡＶ救済および複
製ならびに感染用量、すなわちヘルパーおよびＡｄＡＡＶハイブリッドウイルス
の多重感染度（ＭＯＩ）との間の時間的関係は、ｒＡＡＶ産生を最大にさせるよ
うに容易に調節することができ、それは用いられる細胞株、ヘルパー（一つもし
くは複数）、およびＡｄＡＡＶハイブリッドに依存する。こういった調節は、ヘ
ルパー組込み（一つもしくは複数）の時期、ハイブリッドウイルス感染の時期、
ならびにヘルパー（一つもしくは複数）およびハイブリッドのＭＯＩを変化させ
る実験を実施することにより達成される。例えば、これまでに記載され、かつ図
２Ａおよび２Ｂ、ならびに以下の実施例に報告される実験を参照されたい。例え
ば図２Ａに記載される態様では、例えば野生型とハイブリッドウイルスの感染の
間の時間が変化させてあり、このことによりヘルパーを細胞に組み込ませた後１
２〜３６時間の間にハイブリッドウイルスで本発明の細胞を感染する際に得られ
るｒＶＶＡ産生は最大収量に関しては実質的に増加することが示される。図２Ａ
のこの特別な態様では、ヘルパーの組み込み後２４時間目にハイブリッドウイル
スの組込みが極大となった。均衡用量およびこれらの方法の時間側面は日常的な
プロトコールであり、そしてこの発明のパラメーターについての最善条件を決定
するために実施されてよい。以下の実施例に記載されるようなプロトコールは当
該技術分野ではよく知られる技術である。

【００３８】Ｂ−５０／ハイブリッド法として引用される本発明の方法の一つの特別な態様
では、内因性ＡＡＶからのｒｅｐ／ｃａｐの安定発現が可能であるＢ−５０細胞
株は、ｒｅｐ／ｃａｐを活性化し、そしてヘルパー機能を提供する目的でヘルパ
ーウイルス、好ましくはＥ１発現性Ｅ２ｂ欠損アデノウイルスで、そしてＡＡＶ
ベクター配列を効率的に移転および複製させるＡｄ−ＡＡＶハイブリッドウイル
スで連続的に感染させる。好ましくはヘルパーアデノウイルスはアデノウイルス
Ｅ１遺伝子産物を発現する。その後には、ヘルパー感染宿主細胞を組換えＡｄＡ
ＡＶハイブリッドウイルスで感染させるが、この組換えＡｄＡＡＶハイブリドウ
イルスは、（１）複製およびビリオンカプシド化に必要とされるアデノウイルス
シスエレメント；（２）ＡＡＶの５’および３’ＩＴＲを含むＡＡＶ配列（これ
らのＡＡＶ配列は（１）のアデノウイルス配列によりフランクされる）；ならび
に（３）発現を指令する調節配列に操作的に連結される選択された遺伝子（前記
遺伝子および調節配列は（２）のＡＡＶ配列によりフランクされる）、を含む。
好ましくは、ベクター複製に関連する配列およびそれに関連するヘルパーウイル
スの作用によるＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ誘導のタイミングのバランスは、ハイブ
リッドウイルスでの感染以前にハルパーウイルスで細胞株を感染することにより
取られる。量的拡大を行ったある態様では、感染は懸濁物での成長に適応させた
Ｂ５０細胞を含む生物反応噐内で実施される。ヘルパーウイルスでの感染および
ハイブリッドウイルスもしくはベクターでのトランスフェクションの後には、宿
主細胞を例えばＦ．Ｌ．ＧｒａｈａｍおよびＬ．Ｐｒｅｖｅｃ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１０９−１２８（１９９１）に記載されるものを一
例とする標準条件下で培養する。好ましくは、いったんｒＡＡＶを通常の方法で
同定してからそれを回収および精製してよい。

【００３９】この方法に従うインビボ適用のためのｒＡＡＶ産生の重要な態様は、産物の精
製および特徴決定である。可能性として考えられる混入物には、ｒｃＡＡＶ、細
胞性ＤＮＡ、ヘルパー（一つもしくは複数）、および／またはハイブリッドウイ
ルスが含まれる。本発明の方法は最も問題となる混入物、すなわちｒｃＡＡＶを
回避する。混入する細胞性ＤＮＡは、ＤＮａｓｅでのベクターの予備処理により
最低限に抑える。アデノウイルスの除去は、複数段階の組み合わせにより好まし
い様式で達成される。セシウムを介する沈降を伴う熱変性は効率的に機能性アデ
ノウイルスを除去し（＜１ｐｆｕＡｄ／１０¹¹ ｒＡＡＶゲノム）、そして本
発明の方法で用いる場合には実質的に混入性アデノウイルスゲノムを低下させる
（全ＤＮＡの＜０．００００４％）。例えばカラムクロマトグラフィーのような
大容量産生に一層適する方法も有用である。

【００４０】以下の実施例に記載されるように、この方法により調製されるＡＡＶの生物学
的効力は、容易に検出され、かつ定量された分泌蛋白質としてのエリスロポイエ
チン（Ｅｐｏ）および容易に検出される組織化学マーカーとしてのベータ−ガラ
クトシダーゼ（ｌａｃＺ）を用い、マウスにて評価した。本発明の方法の態様に
より産生される組換えＡＡＶは、マウスにおいて検査する場合には、２９３／同
時トランスフェクションの通常の手法により作成されたｒＡＡＶよりも効力が高
くなった（すなわち感染性が高かった）。その上、この方法により産生されたｒ
ＡＡＶによる導入遺伝子発現はベクター用量に比例して増加した。例えば以下の
実施例５を参照されたい。

【００４１】以下の実施例は本発明の幾つかの好ましい方法を詳細に説明する。以下の実施
例ではＢ５０細胞株およびヘルパーとしての野生型アデノウイルスを利用するも
のの、当業者は、先に記載される要素を有するいずれかの細胞はＢ５０細胞株の
代用となることがあってよく、そして既述のヘルパー機能を満たす（すなわち、
ｒｅｐ／ｃａｐ発現を活性化する）いずれかのヘルパーは野生型アデノウイルス
の代用となってよいことを理解する。従ってこれらの実施例は説明としてのみの
ものであって、本発明の範囲を制限することを意図するのではない。

【００４２】

【実施例】

実施例１Ｂ−５０ＲＥＰ／ＣＡＰ相補用細胞株の構築および特徴決定発明者らは多数の細胞株内に、誘導性プロモーターからｒｅｐおよびｃａｐが
発現されるｒｅｐ／ｃａｐ含有性プラスミドを安定にトランスフェクトした。こ
れらには、アデノウイルスのＥ１ａにより誘導されるＡＡＶの内因性Ｐ５プロモ
ーター、ならびに二価カチオンによる誘導されるマウスメタロチオネイン遺伝子
からの異種プロモーター、およびグルココルチコイドによる誘導されるマウス乳
腺癌ウイルスの長い末端反復構造が含まれる。ヘルパーアデノウイルス感染と組
み合わされるシスおよびトランスプラスミドのトランスフェクションを必要とす
る通常のｒＡＡＶ産生方法に関連する問題を克服する目的では、３つのプラスミ
ドベクターをｒｅｐ／ｃａｐ細胞株を産生するために構築した。

【００４３】各プラスミドベクターはネオマイシン選択性マーカー遺伝子を含み、そして固
有のＰ５プロモーター（ｐＰ５−Ｒｅｐ／Ｃａｐ）もしくは亜鉛誘導性ヒツジメ
タロチオネインプロモーター（ｐＭＴＲｅｐ／Ｃａｐ）、もしくはデキサメサゾ
ン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター（ｐＭＭ
ＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐ）のいずれかにより稼働されるＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝
子を発現した。これらのｒｅｐ／ｃａｐ発現性プラスミドは、ｐＳｕｂ２０１の
Ｐ５ｒｅｐ／ｃａｐ断片をｏｒｆ６で置換したＡｄＥ４−ｏｒｆ６細胞株を作
成するのに用いられた既に発表されている構築物から取得された。具体的にはｐ
ＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐの構築には、ＯＲＦ６配列をＢａｍＨＩ消化によりｐＭＴ
Ｅ４ＯＲＦ６プラスミド［Ｇ．Ｐ．Ｇａｏｅｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９６）］から除去し、そして鋳型としてのｐＳｕ
ｂ２０１プラスミド［Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９）］を用いるＰＣＲ増幅により調製
された４．１ｋｂのｒｅｐ／ｃａｐ断片で置換した。

【００４４】ｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐを、ｐＭＭＴＶＥ４ＯＲＦ６プラスミドをベクタ
ー主鎖として用いた以外はｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐと同一の様式で構築した。Ｐ
５−Ｒｅｐ／Ｃａｐの構築には、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化によるｐＭＴＥ４
０ＯＲＦプラスミドからＭＴプロモーターおよびＯＲＦ６配列を除去し、そしてＸｂａＩ消化によりｐＳｕｂ２０１プラスミドから単離された４．３ｋｂのＰ５
−Ｒｅｐ／Ｃａｐ断片で置換した。プラスミド構築は、先に引用されるＳａｍｂ
ｒｏｏｋｅｔａｌ．内に記載されるもののような通常の遺伝子工学的方法を
必要とした。

【００４５】まず第一に、これら構築物の機能性を、野生型アデノウイルスタイプ５および
適切なインデューサー、すなわちｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐについては１５０μＭ
ＺｎＳＯ₄そしてｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐについては１０μＭのデキサメサゾンの存在もしくは非存在下でＡｄＥ４−ＯＲＦ６およびｒＡＡＶＬａｃＺ遺
伝子組込み形態を含む２９３−塩基対細胞株である１０−３−ｒＡＡＶＬａｃＺ
細胞［ＪａｍｅｓＭ．Ｗｉｌｓｏｎ’ｓｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＴｈｅＵ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ］内への一過性トランス
フェクションにより確認した。１０−３−ｒＡＡＶＬａｃＺ細胞内への３つ全て
の構築物のトランスフェクションにより、細胞からのｒＡＡＶＬａｃＺの救済が
もたらされた。このことにより、３つ全ての構築物が機能性ｒｅｐ／ｃａｐ蛋白
質を産生したことが示された。

【００４６】第二に、３つ全ての構築物は、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから商品として入手可能であるＨｅＬａおよび
Ａ５４９細胞の両方の中に安定にトランスフェクトされた。安定なトランスフェ
クタントコロニーを２週間、抗生物質Ｇ４１８（ゲネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｉｎ））を含む培養培地の存在下で選択し、そして個別に拡張させた。

【００４７】これらのコロニーを、Ａｄ５Ｗｔおよび適切なインデューサーの存在下、ＤＯ
ＴＡＰを介して、ＡＡＶＩＴＲによりフランクされるＣＭＶ−β−ガラクトシ
ダーゼ−ＳＶ４０ポリＡミニ遺伝子カセット［ＦｉｓｈｅｒＫ．Ｊ．ｅｔａ
ｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９６）］を含むｒＡＡＶ
ＬａｃＺを産生するためのシスプラスミドであるｐｒＡＡＶＬａｃＺで細胞を
一過性トランスフェクトすることによりｒＡＡＶＬａｃＺの産生の際にトラン
ス補足（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）する能力についての評価を行った。
ｐＭＴ−Ｒｅｐ／Ｃａｐでトランスフェクトしたクローンについては、１５０μ
ＭＺｎＳＯ₄をＭＯＩが５でのアデノウイルス感染前２４時間目に培養培地に添加した。ｐＭＭＴＶ−Ｒｅｐ／Ｃａｐでトランスフェクトしたクローンについ
ては、１０μＭデキサメサゾンを、ＭＯＩが５でのアデノウイルス感染前２４時
間目に培養培地に添加した。Ａｄ５での感染によりＰ５プロモーターからの発現
が誘導される。トランスフェクション／感染後７２時間目には感染クローンを、
十分なＣＰＥが示された段階で回収した。各クローンのウイルス溶解物を３回周
期の凍結および解凍により作成した。各ウイルス溶解物の１０分の１を５６℃で
３０分間加熱インキュベートし、そしてＥ１／Ｅ４−二重補足細胞株である８４
−３１細胞［Ｇａｏｅｔａｌ、先に引用されるもの］を感染するのに用いた
。感染後２４時間目には、β−ガラクトシダーゼ発現のために細胞を５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）で
染色し［例えば、Ｊ．Ｐｒｉｃｅｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４：１５６−１６８（１９８７）を参照されたい］、そ
して青色細胞のパーセンテージを評点した。陽性と評点されたクローンを野生型
Ａｄ５での感染後のＥ１ａ、ｒｅｐ、およびｃａｐについてのＤＮＡハイブリダ
イゼーション、免疫細胞化学法、ならびにウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析を
含む多数の追加的調査に供した。

【００４８】結果は以下のようにまとめられる：合計７０８個のＧ４１８^Rコロニーを採取した。ここから６１８個のコロニーをサブカルチャーした。この６１８個のコロ
ニーの内の５１５個のは拡張およびスクリーニングをくぐり抜けて生き延びた。
スクリーニングからは僅か８個の陽性コロニーのみがｒｅｐ／ｃａｐのトランス
補足を行うことができた。これら８つのコロニーの内の一つでＢ−５０と称され
るものが（Ｐ５−ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドのＨｅＬａ細胞内へのトランスフェ
クションにより作成された）が高レベルでｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を発現
することが見いだされた。これら８クローンについては更に遺伝子構築、誘導の
によるｒｅｐ／ｃａｐ蛋白質発現、およびｒＡＡＶ産生についての特徴決定を行
った。

【００４９】Ｂ−５０は、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子配列がＢａｍＨＩで消化される細胞株から
のゲノムＤＮＡのサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロットにより検出された唯一の
クローンであった。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子のコピー数および細胞内の遺伝子の形
態（エピソーム対組み込まれた形態）は、全ゲノムＤＮＡおよびＢ−５０細
胞から調製されたＨｉｒｔのＤＮＡ（Ｈｉｒｔ’ｓＤＮＡ）との両方でのサザ
ンブロット（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ）を反復することにより確認した。Ｄ
ＮＡハイブリダイゼーション分析により、ヘッド−トゥ−テイルコンカタマー内
に配置された５コピーのプラスミドが示された（データ非公開）。Ｂ−５０細胞
ではｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子はゲノム内に安定に組み込まれ、かつサザン（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ）ブロットにより検出可能なｒｅｐ／ｃａｐ配列のエピソーム形態は
全く存在しない。

【００５０】それに加え、高レベルのｒｅｐ／ｃａｐ蛋白質発現がウエスタン（Ｗｅｓｔｅ
ｒｎ）ブロットによりＢ−５０内に検出された（すなわち、他のものと比較する
と１００倍多いベクター）。ＡｄＥ１ｂ初期蛋白質もしくは後期蛋白質およびｒ
ｅｐ／ｃａｐ蛋白質についてのアデノウイルス感染Ｂ−５０細胞の二重免疫蛍光
染色により、Ｂ−５０は同種細胞株であることが示された。Ｂ−５０細胞株の安
定性は、第５継代物から第１５継代物までについてそのｒＡＡＶ生産性を比較す
ることにより示された。

【００５１】実施例２Ｂ５０細胞でのＲＥＰ／ＣＡＰ誘導の速度Ｂ５０細胞でのｒｅｐ／ｃａｐ誘導の速度はアデノウイルスでの感染の後に決
定した。Ｂ５０細胞を１０でのＭＯＩの野生型Ａｄ５で感染させ、そして全細胞
性蛋白質を感染後の異なる時間に調製した。試料（５０μｇ）を１０％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル上で分画し、そしてニトロセルロース膜上に電気的に転移させた
。ｒｅｐおよびｃａｐ蛋白質を、各々マウスモノクローナル抗体クローン２５９
．５およびＢ１（ＡｍｅｒｉｃａｎＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉ
ｎｃ．社）を用いるＥＣＬシステム（ＡｍｅｒｉｃａｎＬｉｆｅＳｃｉｅｎ
ｃｅ社）で検出した。アデノウイルスＥ１蛋白質をＡｄ２Ｅ１ａ（Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ社）に対するマウスモノクローナル抗体により検出した
。Ｅ１ａ、ｒｅｐ蛋白質、およびｃａｐ蛋白質の発現は感染時間の関数としてゲ
ル上に観察され（データ非公開）、そしてそれを以下にまとてある。

【００５２】アデノウイルスの非存在下では、ｒｅｐ／ｃａｐ蛋白質は発現されない。アデ
ノウイルスでの感染により、２０〜２４時間目にＥ１ａ蛋白質のピークを伴う遺
伝子発現の一過性調節プログラムがもたらされ、その後には全てのｒｅｐおよび
ｃａｐ蛋白質の実質量の誘導が生じ、この量は４４時間目間でには最大レベルに
達し、そして６２時間目までに完全な細胞病理特性に細胞が達するまではそれが
維持される。ｒｅｐ／ｃａｐ発現のレベルは野生型のＡＡＶ感染に続いて観察さ
れるものに等しいものの、その特性は、ｒｅｐ５２／４０はｒｅｐ７８／６８と
比較すると比例的に増加して発現され、そして野生型感染の特性と比較すると、
ＶＰ３の発現は、ＶＰ１およびＶＰ２のものよりも増加する。

【００５３】実施例３Ｂ−５０細胞株における組換えＡＡＶ産生Ｂ−５０によるｒＡＡＶ発現の生産性は、細胞を異なるＭＯＩで、（ａ）組換
えハイブリッドＡｄＡＡＶウイルスおよび野生型アデノウイルスタイプ５（Ａｄ
５Ｗｔ）で同時に；または（ｂ）Ａｄ５Ｗｔ単独でのいずれかで、ハイブリッド
ＡｄＡＡＶウイルスでの感染８、１２、１６、２０、および２４時間前に感染す
ることにより評価した。

【００５４】Ａ．ハイブリッドウイルス構築ハイブリッドＡｄＡＡＶベクターを構築するための手順が記載されている［Ｆ
ｉｓｈｅｒｅｔａｌ，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：２０７９−２０８
７（１９９６）］。簡潔に述べると、目的の遺伝子を含むミニ遺伝子およびフラ
ンク用ＡＡＶＩＴＲを含むｒＡＡＶゲノムを、ｐｒＡＡＶシスプラスミドからＰｖｕＩＩ制限エンドヌクレアーゼ消化により単離し、そしてシャトルプラスミ
ドｐＡｄＢｇ／ＩＩのＥｃｏＲＶ部位内にクローン化した。導入遺伝子は、緑色
蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ＬａｃＺ、および下垂体からのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲに
より単離されたアカゲザルからのエリスロポイエチンをコードするｃＤＮＡを含
んでいた。各々のベクターは、サイトメガロウイルスの前初期プロモーターから
の導入遺伝子を発現した。得られる構築物は、Ａｄの５’配列（マップユニット
０〜１）、ｒＡＡＶゲノムのコピー、およびマップユニット９〜１６．１に広が
るＡｄ配列からできている。アデノウイルスＤＮＡは、ＣｌａＩでの消化により
同時トランスフェクション用に調製した。ｐＡｄＡＡＶの超コイル構造をとるプ
ラスミドＤＮＡを、標準リン酸カルシウム沈降用プロトコールを用いる同時トラ
ンスフェクション用に用い、そして組換えハイブリッドウイルスを先に引用され
るＦｉｓｈｅｒに記載される要領で単離した。

【００５５】一例として、ハイブリッドウイルスＨ５．０１０ｒＡＡＶＬａｃＺ（Ａｄ．Ａ
Ｖ．ＣＭＶＬａｃＺでもある）を、Ａｄ５を基本とするウイルス内でＥ１の位置
にｒＡＡＶゲノムをクローニングすることにより作成した。このハイブリッドウ
イルスはその詳細が先に引用されており、かつ引用により本明細書にとりこまれ
る国際公開第ＷＯ９６／１３５９８号の実施例１に記載される。これはＡＡＶタ
イプ２からの５’ＡＡＶＩＴＲ（ｂｐ１〜１７３）、ＣＭＶ前初期エンハンサ
ー／プロモーター［Ｂｏｓｈａｒｔｅｔａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５
３０（１９８５）］、ＳＶ４０イントロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベータ−
ガラクトシダーゼｃＤＮＡ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、および一端をア
デノウイルスタイプ５マップユニット０〜１に、そして他方を実質的にはマップ
ユニット９〜１００の全てによりフランクされるＡＡＶ２からの３’ＡＡＶＩ
ＴＲを含む。

【００５６】Ｂ．実験プロトコールＢ５０細胞は、プレート当たり２×１０⁵細胞の密度で６０ｍｍ²プレート内で
一晩播種させた。この細胞を野生型Ａｄ５およびハイブリッドＡｄ．ＡＶ．ＣＭ
ＶＬａｃＺで同時に感染させた。別法では、細胞を野生型タイプＡｄ５で、１０
でのＭＯＩでのハイブリッドＡｄ．ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺでの感染前８、１２、
１６、２０、および２４時間目に感染させた。

【００５７】全細胞溶解物を、３回周期の凍結／解凍および５６℃、１時間の熱不活化によ
りハイブリッドＡｄ．ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ感染後４８時間目に調製した。各試
料におけるｒＡＡＶＬａｃＺの産生を、ｒＡＡＶ形質導入に対して寛容を示すＥ
１／Ｅ４二重補足細胞株である８４−３１を２０時間、限界稀釈液中でその細胞
溶解物で感染させることにより決定した。感染後２４時間目に、細胞を、Ｘ−ｇ
ａｌで組織学的に染色し、そしてＬａｃＺ形成単位（ＦｏｒｍｉｎｇＵｎｉｔ
（ＬＦＵ））、すなわち青色細胞を計数した。

【００５８】異なる条件下でのｒＡＡＶの産生を図２Ａに示し、ここではｒＡＡＶはＹ軸上
の細胞当たりのｌａｃＺ形成単位として、ヘルパーおよびハイブリッド感染の間
の間隔に対して示されている。これらの実験を２回反復したところ、同一の結果
が得られた。

【００５９】Ｃ．実験プロトコール他の実験ではＢ５０細胞を先に記載される要領で播種し、そして１０でのＭＯ
ＩでのＡｄ．ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ感染前２４時間目に野生型Ａｄ５で感染させ
た。全細胞性溶解物を、３回周期の凍結／解凍によりハイブリッドウイルス感染
後２〜７２時間目に調製した。各試料の二重検定用試料は、５６℃で１時間処理
したか、または処理を行わなかったかのいずれかにし、そして先のようにＬＦＵ
についてアッセイした。

【００６０】結果を図２Ｂに示す。点線は、熱不活化後に測定された形質導入として特定さ
れるハイブリッドの成長速度を示す。直線は、ｒＡＡＶゲノムの切り出しおよび
増幅、ならびに熱不活化の後の形質導入により測定されたベクターの産生を示す
。

【００６１】Ｄ．実験プロトコール他の実験ではＢ−５０細胞を、Ａｄ５ｗｔ感染（ＭＯＩは２０）の後、０、８
、１２、１６、２０、および２４時間目に、ｒＡｄ．ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで感
染させた。細胞溶解物を、８４−３１細胞についてのＬＦＵアッセイのために実
施例２に記載されるハイブリッドＡｄＡＡＶベクターにより感染させた後、２４
、４８、および７２時間目に調製した。

【００６２】このデータは図１に示され、そしてＢ−５０細胞を２０のＭＯＩでＡｄ５ｗｔ
で２４時間予備感染させ、そしてその後にｒＡＡＶで４８時間感染させると、Ｂ
−５０細胞は細胞当たり少なくとも１０ＬＦＵのｒＡＡＶＬａｃＺを産生するこ
とができることを示す。

【００６３】Ｅ．実験プロトコール更に他の実験では、６０ｍｍプレート中のＢ−５０細胞（プレート当たり約１
．５×１０⁶細胞）を１、２、５、および１０のＭＯＩでのＡｄ５ｗｔで２４時間感染させ、そしてその後に対応するＭＯＩでのＨ５．０１０ｒＡＡＶＬａｃＺ
で重感染させた。細胞を、Ｈ５．０１０ｒＡＡＶＬａｃＺ感染の後、１８、２４
、３６、４８、および６０時間目に回収し、そしてその溶解物を用いて８４−３
１細胞でＬＦＵを決定した。こうしたＬＦＵアッセイの結果は以下の表１に示さ
れる。第３欄に示される数値は１．５×１０⁶細胞を含む試料から得られる総計ＬＦＵである。

【００６４】

【表１】

【００６５】Ｆ．実験プロトコール本発明のｒＡＡＶ産生の方法は、細胞株としてＢ−５０を、そしてヘルパーと
してＡｄ５ｗｔを用いて〜１０⁹細胞（１００×１５ｃｍ²プレート）にまで拡張
した。この方法を、アデノウイルス感染と同時に行うベクターおよびｒｅｐ／ｃ
ａｐプラスミドの２９３細胞内への一過性トランスフェクションに基づくｒＡＡ
Ｖ産生の標準方法（２９３／同時トランスフェクション方と称される）［先に引
用されるＦｉｓｈｅｒ（１９９６）］の成績と比較した。ＡＡＶ発現性緑色蛍光
蛋白質（ＧＦＰ）もしくはアカゲザルエリスロポイエチン（ｒｈＥｐｏ）の大用
量産生は更には、細胞株としてＢ−５０を、そしてヘルパーとしてＥ２ｂ欠損ア
デノウイルスｓｕｂ１００ｒ［ＪｅｒｏｍｅＳｃｈａａｃｋ、ＵＣＨＳＣによ
り提供された；Ｓｃｈａａｃｋ，Ｊ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：４０
７９−４０８５（１９９５）］を用いる本発明の方法でも試みた。これらの結果
を、同一のハイブリッドＡＡＶプラスミド、およびヘルパーとしての複製欠損ベ
ータガラクトシダーゼ発現性組換えアデノウイルス（ΔＥ１ｌａｃＺ）を用いる
標準的２９３／同時トランスフェクション法と比較した。

【００６６】表２は、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるｒＡＡＶ発現性ＧＦＰ（ＡＡＶＣ
ＭＶＧＦＰ）およびＣＭＶプロモーターの制御下にあるｒＡＡＶ発現性ｒｈＥｐ
ｏ（ＡＡＶＣＭＶｒｈＥｐｏ）の結果をまとめてある。精製された調製物を、ｒ
ＡＡＶゲノムおよび形質転換について分析した。表２はｒＡＡＶ産生の比較を示
し、ここではｒＡＡＶの総計収率が、１０⁹細胞の産生に基づいて示される（すなわち、１００×１５ｃｍ²プレート）。第３欄の総計形質転換単位（すなわち感染細胞数）は、限界稀釈後のレポーター遺伝子発現のインサイチュー分析によ
り決定したものが示されている。第４欄の総計ゲノムコピー数（すなわち、ウイ
ルス粒子数／１０⁹細胞）はＤＮＡハイブリダイゼーションにより決定される。第５欄の略語「Ｔｕ／ＧＣ」は、形質転換単位／平均値でのゲノムコピー数を示
す。

【００６７】

【表２】

【００６８】標準法では、ＧＦＰを含むｒＡＡＶについては３．３×１０⁸形質転換単位および１０⁹細胞あたり６．４×１０¹²ゲノムコピーという値がもたらされ、これは発表されている結果に一致する［Ｆｉｓｈｅｒ（１９９６）、先に引用］。本
発明の方法では形質導入力価に基づくと、ＧＦＰ含有性ｒＡＡＶの収率は１００
倍高くなっており、そして形質導入単位に対するゲノムコピー数の比率の減少に
より測定すると、感染性ｒＡＡＶによる形質転換を受けた細胞の効力もしくは数
では２８倍の改善が見られた。ＧＦＰベクターの収率は、ｓｕｂ１００ｒを用い
ると、野生型Ａｄを用いて取得されたものを上回って上昇したが（形質転換単位
は２倍上昇し、そしてゲノムコピー数は２５倍上昇した）、形質転換単位に対す
るベクターゲノムの比率により測定される効率は１１倍減少した。ＡＡＶ粒子数
と感染単位数の総計収率は全体的に上昇した。

【００６９】ｓｕｂ１００ｒＡｄヘルパーを用いる本発明の産生方法を標準的２９３／ト
ランスフェクション方法に比較し際には、ＡＡＶベクター発現性アカゲザルＥｐ
ｏに関してゲノムコピー数の６倍の増加が得られた。一般的には本発明の産生方
法では、ベクターが同一のＡＡＶＣＭＶ主鎖を含むが中でも例えば成長ホルモン
およびオルニチントランスカルバミラーゼのような異なる導入遺伝子を含む他の
ＡｄＡＡＶハイブリッドベクターを検査するための標準的２９３／同時トランス
フェクション方法を用いて取得されるものと比較すると、ゲノム力価（すなわち
、ｍｌ当たりのゲノムコピー数）が２０倍〜１００倍の増加を示した（データ非
公開）。

【００７０】多数の複製欠損Ｅ１発現性アデノウイルスを、ハイブリッドベクターからのＡ
ＡＶ−ＧＦＰの産生の際の野生型Ａｄ５ヘルパーについての可能な置換物として
評価した（データ非公開）。予想されるようにｒＡＡＶの産生はＥ２ａもしくは
Ｅ４（この両方共がＡＡＶ複製に必要である）における欠損を示すヘルパーウイ
ルスを用いると実質的に減少した［Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａ．５，７９３−８０１（１９９４）］。しかしながらＥ２ｂ遺伝子にお
ける温度感受性突然変異体［すなわち、ｔｓ１４９［Ｍｙｅｒｓ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５，６５−７５（１９８０）］およびｓｕｂ１００
ｒはｒＡＡＶの収率減少をもたらさなかった。従来の技術に報告されるように、
最大ＡＡＶ産生レベルに必要とされるアデノウイルス遺伝子はＥ１、Ｅ２ａ、Ｅ
４、およびＶＡＩを含むようである。

【００７１】Ｇ．実験プロトコール本発明の産生方法に関連する追加実験では、対照実験での野生型ＡＡＶをヘル
パーとして用いる標準的２９３／同時トランスフェクションを用いて取得される
ものを上回る高レベルのｒＡＡＶが示された。先に記載されるこういった高収率
は対照の収率の２倍〜２０倍以上にまたがる（例えば、細胞当たり１×１０³ウイルス粒子を上回るゲノムコピー数から１×１０⁶粒子／細胞を上回る値まで。先を参照されたい）。本発明の細胞、すなわちＢ−５０細胞を野生型Ａｄヘルパ
ーでの感染後２４時間目にｌａｃＺハイブリッドウイルス（Ａｄ．ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ）で感染させ、そして溶解物をその後に回収し、そしてｌａｃＺＡｄ．
ＡＡＶハイブリッドウイルスの増幅に対するｌａｃＺ−含有性ＡＡＶの産生につ
いての分析を行った。特定の測定値は熱変性以前のｌａｃＺ形質導入（これはハ
イブリッドウイルスおよびｒＡＡＶを含む）ならびに熱変性以後のもの（これは
ｒＡＡＶを示す）を含む。形質導入に対するハイブリッドウイルスの寄与は２つ
の形質導入力価の間（すなわち、熱変性以前とそれ以後）での違いとなる。

【００７２】これらの実験の代表的速度が図２Ｂに示されており、この図では、ハイブリッ
ドは播種の後、約１２時間目と約２４時間目との間に指数関数的である１００倍
の増幅を受けたことが示され、このハイブリッドはそのすぐ後には第２ラウンド
の同一比率でのＡＡＶ増幅にまわされる。このハイブリッドウイルスは、ｒＡＡ
Ｖゲノムの救済および増幅前もしくは増幅と同時にＢ５０細胞中で数倍に増幅さ
れる。

【００７３】Ｈ．実験結果のまとめ例えばＢ−５０細胞のような本発明の安定なｒｅｐ／ｃａｐ発現細胞株中での
ｒｅｐ／ｃａｐ発現をトランス活性化し（例えば、細胞中のｒｅｐ／ｃａｐの発
現を制御するプロモーターを活性化する）、かつＡＡＶ複製のためのヘルパー機
能を提供することができるヘルパーの組込み、およびその後のＡｄ−ＡＡＶハイ
ブリッドウイルスの組込みにより、ｒＡＡＶ産生に必要とされる構成成分が供給
される。当然のことながら、ＧＦＰを発現するＡＡＶベクターを含むがトランス
活性化用アデノウイルスＥ１遺伝子の提供なしの状態でのハイブリッドウイルス
でのＢ５０の感染では検出可能なｒＡＡＶはもたらされなかった。更には、既に
記載されているように、アデノウイルスＥ１遺伝子であり得るか（Ｅ１−発現性
野生型もしくは改変アデノウイルスの使用による、または別のウイルスベクター
内でＡｄＥ１遺伝子を提供することによる）、あるいは他のウイルストランス
活性化剤の供給によることができる（例えば、ヘルペス、ＣＭＶ、ワクシニア）
、ＡｄＡＡＶハイブリッドベクターの組込み以前のトランス活性化用試薬供給の
タイミングはｒＡＡＶの収率に影響を及ぼし得る。

【００７４】Ｂ−５０細胞をＡｄ５ＷｔおよびＨ５．０１０ｒＡＡＶＬａｃＺで同時に感染
させる場合には、ｒＡＡＶＬａｃＺは全く産生されず、これは恐らくは、Ａｄ５
Ｗｔの存在下でのＨ５．０１０ｒＡＡＶＬａｃＺの複製がｒＡＡＶＬａｃＺの産
生を上回ったためと思われる。ｒＡＡＶゲノムは、細胞がＨ５．０１０ｒＡＡＶ
ＬａｃＺ感染以前にＡｄ５Ｗｔに感染した場合にのみＨ５．０１０ｒＡＡＶＬａ
ｃＺ−感染Ｂ−５０細胞から救済され得る。Ｂ−５０細胞を最初にＡｄ５Ｗｔで
感染させた場合には、ｒｅｐ／ｃａｐ蛋白質発現の開始によりアデノウイルス性
ベクター複製が阻害され、かつｒＡＡＶＬａｃＺ産生が促進され、このことによ
り均衡点がＨ５．０１０ｒＡＡＶＬａｃＺ複製の代わりにｒＡＡＶ産生の側に押
しやられた。ｒｅｐ蛋白質発現は完全な細胞病理的効果（ＣＰＥ）に到達するま
で持続するものの、ｃａｐ蛋白質発現は感染後２０時間目には検出可能となり、
感染後４０時間目にはピークに達し、そしてその後にはプラトーに達する。これ
らの条件下でのｒＡＡＶＬａｃＺの収率はＢ−５０細胞あたり約１×１０³〜５ ×１０³ウイルス粒子（すなわち、１〜５ＬＦＵ）となる。

【００７５】従って本発明の方法の一つの態様のこういった分析により、Ａｄ５Ｗｔおよび
ＡｄＡＡＶハイブリッドウイルスで感染させたＢ−５０細胞のｒＡＡＶ生産性か
ら、ｒＡｄＡＡＶ感染の前にＢ−５０細胞をＡｄ５ｗｔ感染させると高収率の（
すなわち、１×１０³ウイルス粒子を上回る値〜１×１０⁶ウイルス粒子を上回る
値）感染性ｒＡＡＶが産生されることが示された。こういった収率は、従来の技
術による方法について報告される収率の２倍を上回る値〜２０倍を上回る値にな
る。

【００７６】ｒｅｐ／ｃａｐ誘導とＡＡＶ救済および複製ならびに感染用量、すなわちヘル
パーおよびＡｄＡＡＶハイブリッドウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）との間の時
間的関係は、用いられる細胞株、ヘルパー、およびＡｄＡＡＶハイブリッドに依
存して、ｒＡＡＶ産生を至適化するように容易に調節することができる。こうい
った調節は、先に記載されている要領、そして図２Ａおよび２Ｂに記載されるよ
うに感染のタイミングおよびＭＯＩを変化させる実験を実施することにより達成
される。図２Ａに記載される態様では例えば、野生型とハイブリッドウイルスの
感染の間のタイミングを変化させる実験により、Ｂ５０細胞がヘルパー感染の後
２４時間目にハイブリッドウイルスで感染を受ける場合には、得られる最大収率
を伴うｒＡＡＶ産生の実質的増加が示された（例えば、図２Ａを参照されたい）
。

【００７７】Ｅ１発現性ヘルパーアデノウイルスと組み合わせて宿主細胞株内で内因性ＡＡ
Ｖプロモーターを利用する本発明の方法は、野生型ＡＡＶ感染の生物学的仕組み
（ｂｉｏｌｏｇｙ）を刺激する。今日では、Ｂ−５０細胞株、野生型アデノウイ
ルス、およびシス作用性ベクターとしてのＡｄ．ＡＡＶＣＭＶＬａｃＺハイブリ
ッドウイルスを用いるｒＡＡＶ産生のための好ましい条件は以下のものを含む：（ａ）少なくとも５のＭＯＩでのＡｄ５ｗｔでＢ−５０細胞を感染させること
。１０のＭＯＩも好ましいが、この方法では野生型アデノウイルスの利用が少な
くなればなるほど、１２時間〜２４時間の間でのヘルパーからのｒＡＡＶの精製
が容易になる。この態様について先に示したように、２４時間はｒＡＡＶ収率を
向上させるためには最も好ましいように思われる；（ｂ）更に追加的な３６時間の間、少なくとも５のＭＯＩでハイブリッドＡｄ
．ＡＡＶＣＭＶＬａｃＺウイルスで細胞を感染させること。本発明の教示が与え
られた当業者は、こういった用量および感染タイミングパラメーターを容易に調
節することで、Ｂ−５０以外の細胞株、別のハイブリッドウイルス、および他の
ヘルパーを利用する本発明の他の態様についての至適条件を提供することができ
る。至適産生条件を決定するためのこの検査を実施するにあたり、いずれかの程
度の過度な実験は必要とされない。

【００７８】実施例４ハイブリッドウイルスにより産生される組換えＡＡＶは複製コンピテントなＡＡＶを含まないｒＡＡＶを産生するための通常の方法では、一過性トランスフェクションの間
に生じる非相同組換えを通して複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）がもたら
されることがよくある。この例により、ｒｃＡＡＶの形成は本発明の産生方法を
用いることにより減少され、それは本発明の細胞株の染色体ＤＮＡ内にあってト
ランスフェクトを受けたｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子がアデノウイルスによりコードさ
れるハイブリッドウイルスＡＡＶベクターＤＮＡから隔離されているためである
ことが示される。

【００７９】Ａ．ｒＡＡＶの産生および精製ｒＡＡＶは、Ｆｉｓｈｅｒら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．３：３０６−３１２（
１９９６）、により記載される要領で、Ｅ１欠失アデノウイルスで感染させ、そ
してその後に熱変性およびＣｓＣｌ密度勾配精製により単離した２９３細胞内で
のシスプラスミド（すなわち、ＡＡＶカセットを保持するもの）およびトランス
プラスミド（すなわち、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を保持するもの）のプラスミドト
ランスフェクションにより作成した。別法ではｒＡＡＶを本発明の方法に従い、
Ｂ５０細胞株およびＡｄＡＡＶハイブリッドウイルスを用いて作成した。プレー
ト当たり１×１０⁷細胞の密度で１５０ｍｍ²プレートに播種させたＢ５０細胞を
、１０のＭＯＩで２４時間、野生型Ａｄ５もしくはｓｕｂ１００ｒウイルス［Ｓ
ｃｈａａｋ、先に引用されるもの；すなわち、Ｅ２ｂ３０における温度感受性突
然変異体］のいずれかで感染させ、そしてその後には同一のＭＯＩで更に４８時
間ＡｄＡＡＶハイブリッドベクターで感染させた。この細胞を、先に引用される
Ｆｉｓｈｅｒに記載される要領で、ｒＡＡＶ調製物およびＣｓＣｌ密度勾配精製
用に回収した。

【００８０】熱変性およびＣｓＣｌ遠心分離の後にはｒＡＡＶを数々の分析に供した。ｒＡ
ＡＶゲノムの総量を、先に引用されるＦｉｓｈｅｒにより記載される要領でＤＮ
Ａハイブリダイゼーションにより定量した。形質導入力価は、ＡＡＶ許容細胞株
８４−３１をｒＡＡＶの限界希釈物に露出させ、そして２４時間後に形質遺伝子
発現性細胞の細胞増殖巣について単層を分析することにより決定した。混入性ア
デノウイルスを、１アデノウイルス／１０¹¹ｒＡＡＶゲノムでのプラーク形成ア
ッセイにより評価した。混入性Ａｄはこれらのレベルで全く検出されなかった。

【００８１】Ｂ．混入性ｒｃＡＡＶについてのアッセイ複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）についてのアッセイは、２継代を介す
るアデノウイルスの存在下での２９３細胞の増幅、およびその後の特異的ハイブ
リダイゼーションによるｒｅｐＤＮＡについて得られる溶解物の分析に基づく。
簡潔に述べると、ｒＡＡＶ調製物（１０¹⁰〜１０¹¹ゲノム）を、１００ｍｍ²プレート内で５×１０⁶の２９３細胞と共にインキュベートしたＭＯＩが５の野生型アデノウイルスの存在もしくは非存在下で様々な量の野生型ＡＡＶ（０〜１０ ⁴ ゲノム）と混合する。この細胞を回収し、そして全ＤＮＡをハイブリダイゼーション用に単離するか、もしくは清澄化させた未精製溶解物を第２ラウンドの増
幅用に調製した。５６℃、１時間のアデノウイルスの熱不活化の後、その未精製
溶解物の１０分の１を第２ラウンドの増幅用にアデノウイルスの存在下もしくは
非存在下で２９３細胞の新鮮なプレートに接種した。この細胞を７２時間後に回
収し、そして全ＤＮＡを第一増幅物として調製した。第一および第二増幅物から
の全ＤＮＡ（１０μｇ）を、ＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼでの消化後のＤ
ＮＡハイブリダイゼーションによりｒｅｐ配列について分析した。このブロット
をｐＡｄ／ＡＡＶ含有性ｃａｐ配列の³²Ｐ−ラベル化２．７ｋＢＨｉｎｄＩＩ
Ｉ／ＸｂａＩ断片に対してハイブリダイズさせた。

【００８２】感受性の高い混入アッセイを開発して、ｒｃＡＡＶを増幅させるアデノウイル
スの存在下で低レベルのｒｃＡＡＶを検出した。１００ｍｍ²プレート内の２９３細胞を、５のＭＯＩでの野生型Ａｄ５の存在もしくは非存在下で７２時間、１
０¹、１０²、１０³、および１０⁴ゲノムコピーの野生型ＡＡＶ２で感染させた。
更にはアッセイを、アッセイ中に可能と思われる干渉について評価するため、２
９３細胞溶解物の存在下でも実施した。全ＤＮＡは感染細胞の２／３から調製し
た。残りの１／３の細胞を、３回周期の凍結／解凍により感染培地中で溶解し、
そして各溶解物の１／５を更に７２時間、２９３細胞中の第二増幅用に熱不活化
させた。この第二処理の後に全ＤＮＡを再度抽出した。この溶解物を以下のよう
にサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロットハイブリダイゼーションによりｒｅｐＤ
ＮＡについて評価した：ＨｉｎｄＩＩＩで消化させた全ＤＮＡ（１０μｇ）を分
画化し、ブロットし、そして２．７ｋｂＣａｐ特異的断片で探索した。第一お
よび第二増幅後のＤＮＡの分析が、得られるオートラジオグラムとして示された
（非公開）。ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでのトランスプラスミドの消化により、
増幅されかつ制限消化を受けたｒｃＡＡＶと共に同時移動する断片が放出される
。このアッセイは１０という少数の野生型ＡＡＶゲノムを検出する。類似レベル
のｒｃＡＡＶ混入はトランスプラスミドを改変させて組換えを最低限に抑えてあ
るトランスフェクション実験か、もしくはアデノウイルスヘルパーがＡｄプラス
ミドで置換されている場合に観察された（データ非公開）。

【００８３】大量産生ロットでのｒｃＡＡＶの検出は以下のように行われた：２つの精製ｒ
ＡＡＶ保存物の各２×１０¹⁰、２×１０⁹、および２×１０⁸ゲノムコピーを２９
３細胞内での１周期の増幅用に用いた。ｒＡＡｖｌａｃＺは２９３／同時トラン
スフェクションにより産生した一方で、ｒＡＡＶＧＦＰはＢ５０ハイブリッド系
により産生した。第１回目周期の増幅溶解物の分析はオートラジオグラムで行っ
た（非公開）。２９３／同時トランスフェクション法により産生されたｒＡＡＶ
の分析により、全ｒＡＡＶ調製物の１／１０³〜１０⁶に匹敵するレベルでのｒｃ
ＡＡＶが一貫して示され；Ｂ５０細胞株およびハイブリッドＡｄＡＡＶを利用す
る本発明の方法によって作成されたｒＡＡＶ調製物からはｒｃＡＡＶは全く検出
されなかった（＜１／１０⁹）。ｒｃＡＡＶはもう一周期行った増幅の後にも全く観察されなかった。

【００８４】ベクターの存在下での混入アッセイの感度を、Ｂ−５０および限られた量の野
生型ＡＡＶを用いる本発明の方法により産生されたｒＡＡＶの保存物を添加（ｓ
ｐｉｋｉｎｇ）することにより評価した。ｒｃＡＡＶの決定におけるｒＡＡＶゲ
ノムの介入の可能性を決定するため、野生型ＡＡＶの１、１０¹，１０²，１０³ 、および１０⁴ゲノムを２回の周期の増幅用に、Ｂ５０／シャトルウイルス系により産生されたｒＡＡＶＧＦＰの各２×１０¹⁰もしくは２×１０¹¹ゲノムのいず
れかに添加した。全ＤＮＡを第２周期の増幅の感染細胞（１０μｇ）から抽出し
、そしてサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロット分析の前にＨｉｎｄＩＩＩで消化
した。１０という少数の野生型ＡＡＶゲノムを２×１０¹⁰ｒＡＡＶゲノム内に検
出することができたものの、混入性ｒｃＡＡＶの検出のためのアッセイの感度は
１０倍多いＡｄＡＡＶベクターの存在下では減少する。最終調製物は、１０¹¹Ａ
ＡＶゲノム当たり１を下回る数の形質導入用アデノウイルス粒子を含んでいた。

【００８５】実施例５ハイブリッドウイルスにより産生されるｒＡＡＶのインビボ使用ｒＡＡＶ調製物の比較研究は、アカゲザルＥｐｏもしくはｌａｃＺのいずれか
を発現するＡＡＶをマウスの骨格筋内に組み込ませることにより実施した。この
実験ではマウス骨格筋内へのエリスロポイエチンをコードするベクターの筋肉内
注射により、発色を呈し、かつ赤血球増加症を生じている血清中に生理学的レベ
ル以上のホルモンがもたらされた。

【００８６】一層具体的には、アカゲザルＥｐｏもしくはＣＭＶプロモーターからのｌａｃＺを発現する組換えＡＡＶを、免疫欠損マウス（すなわち、ＲａｇＩ^-/-）もしくは免疫コンピテントマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）のいずれかで、以下の要領で分
析した。Ｃ５７ＢＬ／６もしくはＲａｇＩ^-/-マウス（４匹／グループ）の前脛骨筋に１×１０¹¹ゲノムコピー／５０μｌのｒＡＡＶ−Ｅｐｏを注射した。ｒＡ
ＡＶ−Ｅｐｏは、標準２９３／同時トランスフェクション法に従ってか、もしく
はＢ５０細胞株およびＡｄＡＡＶハイブリッドを利用する本発明の方法に従って
産生された。

【００８７】ｒＡＡＶ−Ｅｐｏを注射した動物からの血清を回収し、そしてアカゲザルＥｐ
ｏと交差反応する商品として入手可能なＥＬＩＳＡ（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＩ
ＶＤ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）を使用してウイルス由来のＥｐｏについて分
析した。組換えヒトエリスロポイエチンを標準として利用した。ヘマトクリット
は、毛細管テーブル、およびその後にＩＥＣＭｉｃｒｏ−ＭＢ遠心機中での遠
心分離を用いて決定した。等用量（１×１０¹¹ゲノム）の各ｒＡＡＶ−Ｅｐｏ調
製物によりヘマトクリットに関しては類似する評価がもたらされたが、Ｂ５０／
ハイブリッドｒＡＡＶ−Ｅｐｏベクターによっては２９３／同時トランスフェク
ションから得られたｒＡＡＶ−Ｅｐｏベクターと比較すると４倍高い血清Ｅｐｏ
がもたらされた。例えば図３Ａおよび図３Ｂを参照されたい。Ｂ５０／ハイブリ
ッドより産生されたｒＡＡＶ−Ｅｐｏは通常の方法により産生されたｒＡＡＶ−
Ｅｐｏと比較すると感染性が高かった。

【００８８】マウスの前脛骨には直接注射によりｒＡＡＶ−ｌａｃＺの様々な調製物、すな
わち２９３／同時トランスフェクション（１．７×１０¹⁰ゲノムコピー）および
Ｂ５０／ハイブリッド（１．７×１０¹⁰ゲノムコピーもしくは３．８×１０¹⁰ゲ
ノムコピーもしくは１．７×１０¹¹ゲノムコピー）からの調製物を投与した。５
週間後に骨格筋を回収し、そしてＸ−ｇａｌ組織化学法を用いてβ−ガラクトシ
ダーゼ発現についての評価を行った。前脛骨内のＸ−ｇａｌ染色のレベルは、免
疫コンピテントマウスにＢ５０／ハイブリッドおよび２９３／同時トランスフェ
クション法から得られたベクターの１．７×１０¹⁰ゲノムを注射した４週間後に
は同じであった。Ｂ５０／ハイブリッド法により産生されたｌａｃＺベクターの
用量を増加させると、炎症の証拠は得られないままβ−ガラクトシダーゼ染色は
相対的に増加した（データ非公開）。例えば、１．７×１０¹¹ゲノムコピーでの
感染によってはゲルを肉眼で検査したところ約５％の染色筋肉線維がもたらされ
た。それと比較して、１．７×１０¹¹ゲノムコピーでの感染によってはゲルを肉
眼で検査したところ約５０％の染色筋肉線維がもたらされた。同様に、５％のベ
ースラインからのゲノムコピー数の３倍の増加によっては約１５％の染色筋肉線
維がもたらされた。

【００８９】先に引用される全ての書類は引用により本明細書に取り込まれる。本発明の多
数の改変法および変法が先に詳細が示される明細書中に含まれており、そして当
業者には明白であることが予期される。本発明の方法に対するこういった改変法
および変法は、本明細書に添付される請求項の範囲内に包含されるものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、野生型アデノウイルスタイプ５（Ａｄ５ｗｔ）で感染させ、そして本
発明の方法に従うハイブリッドウイルスでトランスフェクトしたＢ−５０宿主細
胞内でのＬａｃＺ導入遺伝子を保持するｒＡＡＶの生産性を詳細に説明するグラ
フである。記号はＡｄ５ｗｔ感染後の時間数を表し：０時間（□）；８時間（白
抜きダイヤモンド型）；１２時間（○）；１６時間（△）；２０時間（網かけ四
角）；２４時間（網かけダイアモンド型）。

【図２Ａ】図２Ａは、実施例２に記載される、ハイブリッドシャトルウイルスＡｄ．ＡＶ
ＣＭＶＬａｃＺ（Ａｄ−ＡＡＶｌａｃＺでもある）でのＡＡＶゲノムの増幅およ
びＢ５０細胞内でのベクター産生における感染配列の効果を示す棒グラフである
。異なる条件下でのｒＡＡＶの産生は、ヘルパーウイルスによる感染とハイブリ
ッドウイルスでの感染との間の時間間隔に対する細胞あたりのｌａｃＺ形成単位
（ＬＦＵ）として引用される感染単位により示される。

【図２Ｂ】図２Ｂは、１０の感染多重度（ＭＯＩ）でのＡｄ−ＡＡＶｌａｃＺの前２４時
間目のＡｄ５ｗｔでの感染を受けたＢ５０細胞中のハイブリッドウイルスおよび
ｒＡＡＶの増幅を示すグラフである。実施例２の詳細なプロトコールを参照され
たい。点線は、熱不活化の後に測定された形質導入として特定されるハイブリッ
ドの成長速度を示す。実線は、ｒＡＡＶゲノムの切り出しおよび増幅、ならびに
熱不活化の後の形質導入により測定されたベクターの産生を示す。

【図３Ａ】図３Ａは、実施例５に記載される骨格筋内への、エリスロポイエチン遺伝子を
保持するｒＡＡＶ（ＡＡＶ−Ｅｐｏ）の感染後のマウスの分析を示すグラフであ
る。マウスには、通常の２９３／同時トランスフェクションから得られるＡＡＶ
−Ｅｐｏ（四角）もしくは本発明の細胞株の一つの態様および本発明の方法の使
用から得られるＡＡＶ−Ｅｐｏ（三角）を投与した。Ｅｐｏレベルは１μ／Ｌと
して測定した。

【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例５に記載される要領で処理した動物についての％血液量とし
てのヘマトクリット値を測定するグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ガオ，グアング−ピングアメリカ合衆国ペンシルベニア州19083ハバータウン・ローレンスロード1925・ロビンデイルアパートメントエフ５Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA32 BA51 CA03 DA03 EA04 GA11 HA01 HA17 4B065 AA93X AA95Y AB01 BA02 CA44 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞の染色体内に安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子
およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含んでなる細胞であって、そのＡＡＶｒｅｐ遺
伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子がそれぞれｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の
発現を指令することができる調節配列に操作的に連結され、そしてその細胞への
ヘルパーの組込みによりその細胞がｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の遺伝子産
物を発現するものであり、そのヘルパーが、ヘルパーウイルス、ヘルパー遺伝子
、およびヘルパー遺伝子産物からなる群より選択されるメンバーを含んでなるも
のである細胞。
【請求項２】ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が個別の調節配列に操作的に連結
される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が同一の調節配列に操作的に連結
される、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子がＡＡＶの異なる血清型に由来す
る、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】調節配列がＡＡＶｐ５プロモーターを含む、請求項１〜４
の内のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】ＡＡＶｐ５プロモーターがｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子とし
ての異なるＡＡＶ血清型に由来する、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】調節配列がＡＡＶに由来しないプロモーターを含む、請求項
５に記載の細胞。
【請求項８】ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が細胞の染色体内に安定に組み込
まれた少なくとも２つのコピー内に存在する、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１２４０１を有するＢ−５０細胞
である、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】ヘルパーが、アデノウイルス、組換えアデノウルス、アデ
ノウイルス遺伝子、およびアデノウイルス遺伝子産物からなる群より選択される
メンバーである、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１】ヘルパーが、ヘルペスウイルス、組換えヘルペスウイルス
、ヘルペスウイルス遺伝子、およびヘルペスウイルス遺伝子産物からなる群より
選択されるメンバーである、請求項１に記載の細胞。
【請求項１２】ヘルパー含有性宿主細胞を産生するための方法であって、
（ａ）宿主細胞にヘルパーを組み込ませる段階であって、前記宿主細胞が宿主細
胞の染色体内に安定に組み込まれるＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ
遺伝子を含み、そのＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子はｒｅｐおよびｃａｐ遺
伝子の発現を指令することができる調節配列の制御下に各々置かれ、そして宿主
細胞は宿主細胞へのヘルパーの組込みによりｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の遺伝子
産物を発現するものであり、そしてそのヘルパーがヘルパーウイルス、ヘルパー
遺伝子、およびヘルパー遺伝子産物からなる群より選択されるメンバーを含んで
なるものである段階、を含む方法。
【請求項１３】組換えＡＡＶを産生するための方法であって、（ｂ）請求項１２のヘルパー含有性宿主細胞に組換えハイブリッドウイルスを組
み込ませる段階であって、その組換えハイブリッドウイルスは：（１）導入遺伝子の発現を制御する調節配列に操作的に連結された選択された
導入遺伝子、を含み、調節配列に連結されるその導入遺伝子は、（２）ＡＡＶの５’および３’ＩＴＲを含むＡＡＶ配列、によりフランクされ、その５’ＩＴＲはその導入遺伝子の片側をフランクし、そ
して３’ＩＴＲはもう一方の側をフランクし、そして調節配列が連結され、かつ
ＡＡＶ配列によりフランクされる配列導入遺伝子が、（３）アデノウイルスビリオンの複製に必要とされるシスエレメントおよびア
デノウイルスビリオンのカプシド化に必要とされるシスエレメントからなる群よ
り選択される少なくとも一つのアデノウイルスシスエレメント、によりフランクされるものである段階；組換えＡＡＶがその細胞により産生される、段階を含む方法。
【請求項１４】段階（ｂ）がヘルパーが宿主細胞に組み込まれてから約２
４時間後に実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】（ｃ）ハイブリッドウイルス感染させたヘルパー含有性宿
主細胞から組換えＡＡＶであって、導入遺伝子を含む組換えＡＡＶを単離する、
さらなる段階、を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】段階（ｃ）がヘルパー含有性宿主細胞をハイブリッドウイ
ルスで感染させてから３６時間後に実施する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】組換えＡＡＶが細胞当たり１×１０³ゲノムコピーを上回るレベルで産生される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】組換えＡＡＶが段階（ｃ）では細胞当たり１×１０⁴ゲノムコピーを上回るレベルで産生される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】産生される組換えＡＡＶが本質的には均一であり、かつ複
製コンピテントＡＡＶを本質的には含まない、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】宿主細胞がＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１２４０１を有するＢ
−５０細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】ヘルパーが、アデノウイルス、組換えアデノウイルス、ア
デノウイルス遺伝子、およびアデノウイルス遺伝子産物からなる群より選択され
るメンバーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】ヘルパーがアデノウイルスＥ１遺伝子を含む組換えアデノ
ウイルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】組換えアデノウイルスが複製欠損を示す、請求項２２に記
載の方法。
【請求項２４】ヘルパーがアデノウイルスＥ１遺伝子を含む、請求項１３
に記載の方法。
【請求項２５】ヘルパーが、ヘルペスウイルス、組換えフェルペスウイル
ス、ヘルペスウイルス遺伝子、およびヘルペスウイルス遺伝子産物からなる群よ
り選択されるメンバーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】組換えヘルペスウイルスが複製欠損を示す、請求項２５に
記載の方法。
【請求項２７】ヘルパーが、単純疱疹１型、単純疱疹ウイルス２型、サイ
トメガロウイルス、およびワクシニアからなる群より選択される組換えウイルス
を含む、請求項１３に記載の方法。